DE2123707A1

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Publication number: DE2123707A1
Application number: DE19712123707
Authority: DE
Priority date: 1970-05-14
Filing date: 1971-05-13
Publication date: 1971-12-16
Also published as: TR18665A; IL36848A0; CH528592A; PL77194B1; JPS5746357B1; ES391093A1; DE2123707B2; BG25524A3; HU163922B; OA03719A; LU63157A1; IE35176L; AT303649B; AR199545A1; DK144069B; NL7106649A; IT1027006B; CA988445A; DK144069C; CS156497B2

Description

lip tido n/Engla nd

Verfahren zur Herstellung von Substanzen, die eßbares Protein enthalten.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Substanzen, die eßbares Protein enthalten; die Erfindung bezieht sich dabei insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung von Pilzprotein auf mikrobiologischem Wege.

Die auf die gleiche Antnelderin zurückgehende britische Patentanmeldung Nr. 55.312/66, Serial Nr. 1.210.356, bezieht sioh auf ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz, die eßbares Protein enthält; dieses Verfahren besteht darin, unter aeroben Bedingungen einen Organismus, der aus einem nicht-toxischen Stamm eines Mikropilzes des Genus Fungi Imperfecti besteht, in einem Kultur- bzw, Nährmedium brüten und sich vermehren zu lassen, wobei das Nährmedium in wesentlichem Umfang wachs-

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tumsforderq.de Nährstoffe enthält, von. denen Kohlenstoff in der Form eines assimilierbaren Koblenhydrates das Grenzsubstrat bei der Vermehrung bildet, und daß anschließend von einem Medium, von dem assimilierbares Kohlenhydratmedium entfernt ist, der durob Vermehrung entstandene Organismus abgetrennt wird, der die eßbares Protein enthaltende Substanz bildet*

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Pilzmycels zu schaffen, das einen hohen Netto-Protein-Ausnutzungswert bei Hattenversuchen von mindestens hat, und zwar basierend aufcfc-Amino-Stickstoff.

Zur lösung dieser Aufgabe ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer eßbares Protein enthaltenden Substanz dadurch gekennzeichnet, daß eine nicht-toxische Art des Genus Pusarium oder ein Variant oder Mutant davon geimpft und unter aeroben Bedingungen in einem Kultur- bzw. Nährmedium zum Wuchern gebracht wird, das im wesentlichen Umfang wachstumsfördernde Nährstoffe enthält, wobei Kohlenstoff in Jorm assimilierbarer Kohlenhydrate das Grenzsubstrat bei der Vermehrung bzw, dem Wachstum ist, und daß der durch Wucherung entstandene Organismus, der die eßbare proteinhaltige Substanz enthält, abgetrennt wird.

Der abgetrennte, durch Vermehrung entstandene Organismus, der die das eßbare Protein enthaltende Substanz umfaßt, läßt sich in Nahrungsmittel für den menschlichen oder tierischen Verbrauch einarbeiten.

Das ia der Brutstufe verwendete Substrat kann·pflanzlichen Ursprungs sein, beispielsweise Stärke, starkeenthalten.de Stoffe oder Hydrolyseprodukte davon, Saccharose, Saccharose enthaltende Stoffe oder bydrolisierte Saccharose, beispielsweise Invertzucker oder Gemische davon» So kann das Substrat hydrolisierte Kartoffelsubstanzen, Melasse, Glukose, hydrolisierte Bohnenstärke oder Oassava umfassen. Alternativ lassen sich auch Substrate bzw. Extrakte tierischen Ursprungs verwenden, die

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- 3 Molke enthalten.

Die tiicht-toxische ffusarium-Art kann vorzugsweise eine ffuBariumgraminearum-Art sein.

Die bevorzugte Art ist die ffusarium graminearmn Schwabe-Art, die beim Commonwealth Mycologieal Institute hinterlegt und unter der Hummer I.M.I. 145.425 eingetragen ist, oder Varianten und Mutanten von dieser Art.

Es lassen sich ebenfalls folgende neue Varianten verwenden:

I- 7, hinterlegt beim Commonwealth Mycological Institute und eingetragen unter der Nummer

I.M.I. 154.209;
I- 8, Hinterlegt beim Commonwealth Mycological Institute und eingetragen unter der Nummer

I.M.I. 154.211;
I- 9, hinterlegt beim Commonwealth Mycological Institute und eingetragen unter der Nummer

I.M.I. 154.212;
1-15, hinterlegt beim Commonwealth Mycological Institute und eingetragen unter der Nummer

I.M.I. 154.213;
1-16, hinterlegt beim Commonwealth Mycological Institute und eingetragen unter der Nummer I.M.I. 154.210.

Die neue Fusariua graminearum Schwabe-Art, I.M.I. 145*425» ist nicht-pathogen bezüglich Weizen. Sie hat folgende morphologische Cbarakteristika:

Nährmedium Kartoffel-Saccharose-Agar Czapek-Dox

(modifiziert) Agar (Oxoid)

250 Gramm gewaschener und in Stücke geschnittener Kartoffeln werden 15 Minuten lang bei einem Druck von 1,05 atü in ein Druck-Kochgerät gege-

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3,0 cm in 3 Tagen

"ben. Der Absud wird dann durch zwei Schichten Musselin gedruckt. Dem trüben Filtrat werden 2 $> Glukose und 2 $> Agar zugesetzt und das Medium wird dann im Autoklaven behandelt und dispergiert.

Wachstumsbedingungen: mehrere Wochen bei 25 O, Wachstumsgeschwindigkeit: 4jO cm in 3 Tagen

Wachstumscharakter: Flockige, sich ausbreitende Kolonien mit weißem Luftmycel. Substrat auf Kartoffel-Saccharose-Agar (KSA) gräulich-rosa mit karmesinroten bis gelben Flecken. Auf Gzapek-Dox-Agar (ODA) besteht die Neigung zu einer etwas blasseren Farbgebung. Gelegentlich wird ein tiefrotes Pigment erzeugt, insbesondere bei der Alterung. Nach ein bis zwei Wochen hat das luftmycel die Neigung, braun zu werden und zusammenzufallen. Die Kolonie wird dann ziemlich schleimig bzw. schlammartig, wenn Sporodochien gebildet werden, wobei die Farbe auf KSA pink bis braun und auf GDA lachsrosa ist.

Es bildet sich kein Exsudat und die Pigmentbildung neigt dazu, der Mycelfarbe zu folgen. Konidien: Von diesem Organismus werden Mikrokonidien nicht erzeugt. Makrokonidien werden von einzelnen seitlichen Zweigen bzw. Phialiden oder vielverzweigten Konidienträgern mit kürzen Phialiden bzw. Zweigen gebildet. In älteren Kulturen vereinigen sich die Konidienträger zur Bildung von Sporodochien, insbesondere auf GDA. Die Konidien variieren von sichelförmiger Gestalt zu einer gekrümmten dorsi-ventral dickspindeligen Gestalt, wobei

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"V

die Septierung von 3 bis 5 variiert, und zwar in Jüngeren Kulturen allgemein 5. Die Sporengröße variiert von 25 bis 50a»χ 2,5/* bis 4,0/*.

Die Basiszelle ist häufig gestielt, insbesondere bei den längeren 5-fach septierten Sporen. Im Myoel treten geschwollene bzw. aufgequollene Zellen auf, wobei unter Umständen auch eingeschoben, einzeln· oder in Ketten, Chlaraydosporen auftreten können.

Es folgt nunmehr in beispielhafter Weise die Beschreibung der Bildung von Varianten (oder Isolaten) der ffusarium graminearum Schwabe-Art I.M.I. 145.425 und ihrer morphologischen Eigenschaften.

Aus einer kontinuierlich arbeitenden Kultur erhaltene Isolates ffusarium graminearum Schwabe I.M.I. 154.209 bis 154.213 wurde aus Malzextrakt-Agarplatten abgetrennt, die mit Brühe von einer im Fermenter wachsenden Pusarium graminearum Schwabe-Art 145.245 auf einem Glukose-Salzmedium bei 30° 0 unter kontinuierlichen Kulturbedingungen mit einer Kohlenstoffgrenze bei einer Verdünnungsrate von 0,1 bis 0,15 std." geimpft worden waren. Dem Fermenter wurden etwa in Intervallen von 100 Stunden Proben entnommen, um die Population der Varianten festzustellen bzw. zu beurteilen, und die Isolate I.M.I. 154.209 bis 154.213 wurden von den Platten entnommen, die aus der 1.100-Stundenprobe präpariert worden waren. Diese Isolate sind repräsentativ für die Haupttypen des während der Fermentation erzeugten morphologischen Variantes. Unter Zugrundelegung der in diesem Beispiel behandelten Bedingungen beginnen die Varianten auf Platten nach 800 Stunden und mehr zu erscheinen. Sie werden von dieser Zeit an kontinuierlich erzeugt und die Population ändert sich hinsichtlich des Prozentanteiles jedes Types nur langsam. Die Fermenterbedingungen sind wie folgt:

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Lösung 1

Gärmediuro Glukose

Ammoaiumsulfat

Kaliumdihydrogenphosphat

Magnesiumsulfat

Antischaummittel-Polypropylenglykol
2.000; 30 Minuten lang sterilisiert "bei 1,05 atü und pH 3,0

3,0 0,25 0,3 0,025 0,01

LÖsurg 2	MnSO₄ 4H₂O . PeSO₄ 7H₂O	0,0005
	ZnSO₄ 7H₂O	0,0005
	CoCl₂ 6H₂O	0,0005
	CuSO₄ 5H₂O	0,0001
	Fa₂MoO₄ 2H₂O 15 Minuten lang	0,0001
	sterilisiert "bei 1,05 atü	0,0001
	Biotin
Lösung 3	Cholin	0,1 oder 20_yi<g/l
	Methionin	0,1 oder 2 mg/1
	gesondert durch	0,0 oder 600 mg/1
	Filtration sterilisiert

Sämtliche Lösungen wurden, wie erforderlich, aseptisch dem Mediumspeicher zugesetzt, und dann dem 8,5-Liter-Chemostat mit folgenden Wachstumsbedingungen zugeführt: Temperatur 30° C; Belüftung 1vvm (Volumen Luft, pro Volumen Flüssigkeit pro Minute); 800 U/min., eine einzige sechsflügelige Scheibenturbine, 0,5D, völlig mit Leitflächen versehener Permenter. Der Fermenter-pH-Wert wurde durch automatische Zugabe von sterilem Ammoniak bei 5?0 gehalten. Die Lösung 3 wurde zu verschiedenen Zeiten in ihrer Zusammensetzung verändert, um die verschiedenenyUmax-Werte bei den verschiedenen Zusätzen wie

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beispielsweise Biotin allein oder Biotin plus Gholin zu "bestimmen.
Wachstumsgeschwindigkeit 0,1 "bis 0,15 std."* .

Die fünf Isolate haben folgende morphologische Eigenschaften:

Medium Kartoffel-Sacoharose-Agar Czapek Pox

Agar (Oxoid)

250 Gramm gewaschener und in Stücke geschnittener Kartoffeln werden 15 min.

lang bei einem Druck von 1,05 atü in ein Druck-Kochgerät gegeben. Der Absud wird dann durch zwei Schichten Musselin gedrückt. Dem trüben FiItrat werden 2 $ Glukose und 2 $ Agar zugesetzt und das Medium wird dann im Autoklaven

behandelt und dispergiert.
Wachstumsbedingungen: 25° 0.
Wachstumscharakter;

Isolat 1-7

Die Kolonie-Morphologie ist ähnlich derjenigen des Ausgangsstoffes A3/5 mit der Ausnahme, daß der Kolonie-Durchmesser kleiner ist, und zwar 1,5 cm innerhalb von drei Tagen bei 30° G auf GDA. Das flockige Luftmycel weicht von Kolonie zu Kolonie voneinander in der Gradstufe ab, es ist jedoch geringer als 1-8. Ältere Kulturen haben eine braune Verfärbung zu dem Mycel. Umkehrung, gelb-braune bis gräulich-rosa Sektoren mit etwas Pigmentzerstreuung.

Isolat 1-8

Sehr intensives weißes flockiges Luftmycelium. Koloniendurchmesser wieder geringer als bei dem Mutterstoff A3/5, 2,0 cm in drei Tagen bei 30° C auf GDA. Umkehrung, lachsrosa bis gräulich-rosa Segmente.

Isolat 1-9

Makroskopische Erscheinungsform ähnlich von 1-8, jedoch in der Umkehrung heller, lachsfarben bis glasartig.

Isolat 1-15
Kleine gedrängte gewölbte Kolonien. Kurzes Mycel, verschlungen

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und mit der Neigung, sich zusammenzurollen. Viele der gebildeten sporodochia-ähnlichen Strukturen haben zum Zeitpunkt der Strichkultur impf ung eine pinkfarbene Erscheinungsf ora, Pinkfarbige Eiufärbung an der Peripherie. Auf ODA nach 3 Tagen bei 30° G nur ein Koloniedurchmesser von 0,4 cm.

Isolat 1-16

Das Isolat 1-15 ist sehr unstabil und entwickelt sich kontinuierlich zu 1-16. Dieses Isolat hat eine dem Isolat 1-7 ähnliche Erscheinungsform, obwohl die Kolonien dazu neigen, im Durchmesser geringfügig größer zu werden, und zwar 2,4 cm nach 3 Sagen, wobei auch die Erscheinungsform gleichmäßiger ist. 1-16 ist stabiler als 1-15.

Konidien

Isolat 1-7

Es werden in ähnlicher Weise wie bei der Muttersubstanz A3/5 reichlich Makrokonidien erzeugt. In älteren Kulturen entwickeln sich Sporodochien. Die einzelnen Makrokonidien sind in der Form und Größe, 25 bis 50*ix 3,0 bis 5,0^u ähnlich der Muttersubstanz A3/5. In älteren Kulturen werden viele Sporodochien gebildet. In dem Mycel dieses Isolates sind reichlich Chlamydosporen vorhanden, und zwar sowohl eingeschoben als auch terminal. Sie sind kugelig glatt 10 bis 12^t. Eine einzelne Zelle eines Makrokonidiums bildet gelegentlich eine Chlamydospore. Isolat 1-8

Weniger Makrokonidien als bei 1-7 und die vorhandenen sind hauptsächlich kleiner und einfacher, 1 bis 3 Septen, 25 bis 35yttlang. Es werden wenig Sporodochien gebildet, öblamydosporen sind wiederum reichlich vorhanden, und zwar sowohl eingeschoben, terminal, einzeln und in Ketten.
Isolat 1-9

Sehr ähnlich dem Isolat 1-8, wobei jedoch mehr Makrokonidien vorhanden sind, in der Anzahl im wesentlichen äquivalent zum Isolat 1-7.
Isolat 1-15
Sehr wenig Makrokonidien, die Strukturen vom Sporodochia-Typ

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siad eigentlich Chlamydosporenpakete. In. dem Mycel sind außerdem auch viele Chlamydosporen vorhanden. Die Makrokonidien sind kleiner als der Mutterstoff, 30 bis 35u x 4M mit nur 2 Septen bzw. Querwänden.
Isolat 1-16

Sehr ähnlich dem Isolat 1-7 mit reichlich Makrokonidien und Ghlamydosporen. Die Makrokonidien sind typisch, 30 bis 45ytt x 4

Die Inkubationstemperatur bei dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt vorzugsweise zwischen 25 und 34° C, insbesondere bei etwa 30° C.

Das Impfen, durch das der Prozeß eingeleitet wird, erfolgt vorzugsweise mittels einer vorgekeimten Saatstufe, wobei vorzugsweise 2 bis 10 $>, insbesondere 5 bis 10 $> Impfstoff verwendet werden.

Der pH-Wert des Substratmediums während der Inkubation wird vorzugsweise innerhalb eines ein maximales Wachstum gewährleistenden Bereiches, insbesondere zwischen 3,5 und 7, gehalten.

Die Wachstumsdauer beim absatzweisen Betrieb der Kulturen, und zwar unter Berücksichtigung der oben erwähnten Bedingungen, liegt gewöhnlich im Bereich von 20 bis 48 Stunden.

Sowohl bei absatzweise arbeitenden als auch bei kontinuierlichen Prozessen sollte belüftet und umgerührt werden, um eine ausreichende Versorgung mit gelöstem Sauerstoff zu gewährleisten und keinen Sauerstoffmangel aufkommen zu lassen, der ein wachstumshemmender Faktor sein kann.

In dem Substratmedium werden in der üblichen Weise ausreichende Mengen wesentlicher Wuchsstoffe wie Stickstoff, Schwefel, Phosphor und andere Spurenelemente aufrechterhalten, so daß das w/achatum der Substanz bzw. des Stoffes nur durch die für den Fungus verfügbaren Kohlenhydrate begrenzt baw. gehemmt wird.

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- var -.
%

Zusätzlich zu den oben geo.an.aten Nährstoffen kann auch das Vorhandensein eines oder mehrerer Vitamine wie beispielsweise Biotin wünschenswert bzw. vorteilhaft sein, um eine maximale Wachstumsgeschwindigkeit zu erhalten.

Es ist auch wünschenswert bzw. vorteilhaft, dem Substratmedium ein nicht-toxisches Antischaummittel zuzusetzen, um die Schaumbildung während der Fermentation zu regeln.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Substanz kann in der üblichen Weise isoliert werden. So kann das resultierende Mycel durch Fällung, Waschen, Filtern und Trocknen gewonnen werden. In diesem Zusammenhang wurde jedoch herausgefunden, daß, wenn der Feuchtigkeitsgehalt der Substanz durch Filtern unter Druck unter einem kritischen Wert von etwa 50 $> (w/w) (Gewicht in Gewichtskonzentration) reduziert wird, die folgenden Trocknungsverfahren nicht innerhalb scharfer Temperaturgrenzen durchgeführt werden müssen, was für die Wirtschaftlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ein wesentlicher Faktor ist. Die Trocknungsmethode muß nicht eine Beeinträchtigung des Nährwertes des Mycels zur Folge haben, und die Trocknung kann in einem Luftstrom von 75° 0 oder als Gefriertrocknung durchgeführt werden.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Pilzmyoel hat eine sehr gute Wasserbindungskapazität und läßt sich in vorteilhafter Weise als Eindickungs- und Geliermittel verwenden. Da es sich nicht um ein I,solat bandelt, behält es seine Vitamine ebenso wie zu Ernährungsζweckeη geeignete Stoffe wie Lipoide und einige Kohlenhydrate. Das Pilzmycel hat hervorragende Backeigenschaften, die bei der Herstellung von mit Protein angereichertem Brot, FrühStücksnahrung und Imbissen von besonderem Wert sind. Das Pilzmycel kann infolge seiner faserigen bzw. fadenförmigen Struktur gebacken oder gebraten werden oder es kann bei der Herstellung von unter Verwendung von Treibmitteln hergestellten Backwaren benutzt werden und der Bevölkerung in vielfältiger Weise als Nahrungsmittel zugeteilt werden, das in

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seinen] Aussehen, und in seiner Eignung den Nahrungsmitteln vergleichbar ist, an die die jeweiligen Bevölkerungskreise gewöhnt sind.

Es folgt nunmehr in beispielhafter Weise eine Beschreibung von Methoden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Bei den Beispielen 1 bis 4 handelt es sich um absatzweise arbeitende Kulturen.

Beispiel 1

10 Liter des im folgenden angegebenen Kultur- bzw. Nährmediums wurden in der beschriebenen Weise in einem mit einem Rührwerk versehenen Fermenter-Behälter präpariert und sterilisiert.

Rohrzuckermelasse zur

Bildung von 6 # w/v Zucker

Ammoniumsulfat 1,2 ?δ

NaH₂PO₄ ' 0,25 #

30 min. sterilisiert 1,05 atü CaGO₃ 0,5 9έ w/v

3 std. sterilisiert 1,05 atü (w/v gleich Gewicht je Volumenkonzentration) Die Mediumkomponenten wurden aseptisch zugesetzt und auf 30° C erwärmt. Ein entweder auf einem Glukose-Maiswasser-Medium oder anderen geeigneten Medien hergestellter Impfstoff in einer Menge von 5 bis 10 $, bezogen auf das Volumen des Kulturmediums, wurde mit einer Sporensuspension des die neue ffusarium graminearum Schwabe-Art I.M.I. 145.425 enthaltenden Organismus geimpft und 18 bis 24 std. bei 30° 0 in einem rotierenden Schüttelapparat wachsen gelassen und aseptisch dem Fermenter zugesetzt.

Der bei 30° G inkubierte Permenter wurde dann bei 800 U/min, umgerührt, und zwar unter Verwendung einer sechsflügeligen Scheibenturbine (0,5D) in einem völlig mit Schikanen versehenen Behälter, und 1 wm sterile luft wurde durch den Fermenter geblasen. Nach 35 std. wurde das gewachsene bzw. gebildete

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Mycel aus dem Fermenter entnommen, zentrifugiert, mit Wasser gewaschen und bei einer Lufttemperatur von 75 Warmluft-Bandtrockner getrocknet.

C auf einem

Das getrocknete Produkt hatte die folgende Zusammensetzung:

G-esamt-Stiekstoff 8,0 96

Asche . 5,3 #

Lipoid 2,7 $

• HOTop. 52 basierend

auf dem Gesamt-Stickstoff

Beispiel 2

10 Liter des folgenden Kultur- bzw. Nährmediums wurden in der beschriebenen Weise in einem 14-Liter-lTew Brunswick-Mikroferm-Permenter präpariert und sterilisiert.

endgültig (#)

Lösung 1 Glukose pH 3,0 3,0

Lösung 2 Ammoniumsulfat 0,7

Lösung 3 Kaliumdihydrogenphosphat Lösung 4 PeSO.

MnSO, 4H₉O

Lösung 5

Cool, OaOl₂ Lösung 6 KaOH

OuSO. 5H₂O ₄ 7H₂O

Fa₂MoO₄ 2H₂O 6H₂O 2H₂O

pH 5,0	1,0
pH -2,5	0,001
	0,0005
	0,0001
	0,025
	0,0001
	0,0001
	0,0015
	0,1

Die oben beschriebenen Lösungen wurden unter Hitze 15 min. bei 1,05 atü sterilisiert.

Lösung 7 Vitamine und/oder Aminosäuren, die in der unten beschriebenen Weise durch Filtrieren sterilisiert wurden.

Die Lösungen wurden aseptisch dem Behälter zugesetzt.

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Es wurde ein Impfstoff hergestellt bzw. wachsen, gelassen und wie in Beispiel 1 zugesetzt, jedoch mit der Ausnahme, daß die endgültige Konzentration im Ferraenter so eingestellt wurde, daß 0,5 g/l Trockengewicht des Mycels vorlag.

Die Wachstumsbedingungen waren wie folgt: !Temperatur 30° C; Belüftung 1 wm, die Rührgeschwindigkeit wurde so eingestellt, daß der Wert des gelösten Sauerstoffes über 25 % des Sättigungswertes im Kultur- bzw. Nahrmedium lag, und zwar gemessen mittels einer New Brunswick Inc. DO-Sonde. Als steriles Antischaummittel wurde Polypropylenglykol 2.000 in der notwendigen Menge zugesetzt, um die Schaumbildung zu unterdrücken, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von steriler Kaliumhydroxydlösung zwischen 6,0 und 6,3 gebalten.

Wachstumsgeschwindigkeiten (std.""¹)

(i) zu vernachlässigende Lösung 7

(Minimalwert) sehr langsam

(ii) Lösung 7 in der Weise, daß

die endgültige Konzentration
des ipiotins in dem Kulturmedium. 50y»g/l betrug 0,2

(iii) Lösung 7 in der Weise, daß die
endgültige Konzentration des
Biotin 50a g/l, des Cholinchlorids 30 mg/1 und des Methionin 300 mg/1 in dem Kulturmedium betrug 0,25

Beispiel 3

Das Medium und die Bedingungen waren wie in Beispiel 2, wobei jedoch die Glukose durch Maltose ersetzt war.

(i) Lösung 7 wie Beispiel 2 (ii) ' 0,18 (ii) Lösung 7 wie Beispiel 2 (iii) 0,21

109851/1021'

Beispiel 4

100 Liter des folgenden Kulturmediums wurden in der "beschriebenen Weise in einem aus korrosionsbeständigem Stahl bestehenden 130-Liter-]?ermenter präpariert und sterilisiert.

endgültige Konzentration (fo)

Glukose 4,0

Maiswasser (50 f Gesamtfeststoff) 0,8 Ammoniumsulfat 0,2

Kaliumdihydrogenphosphat 0,2

Mg SO₄ 7H₂O . 0,025

Zn SO, 7H₂O 0,0005

Pe SO, 7H₂O 0,0005

Mn SO, 4H₂O 0,0001

Das Medium wurde 30 min. lang bei 1 ,05 atü und einem pH-Wert von 3>0 sterilisiert und bei der Abkühlung auf 30° 0 durch sterilen Zusatz von Ammoniak auf einen pH-Wert von 5»0 eingestellt.

Biotin, das durch Piltrierung sterilisiert wurde, um 40/</g/l endgültige Konzentration zu ergeben, wurde aseptisch zugesetzt.

Der Behälter wurde mit 10 Liter einer Kultur geimpft, die in einem Aufgußbehälter während einer Zeit von 18 std. bei 30° G auf einem Medium gewachsen war, das folgende Stoffe enthielt: Glukoae 2 %; Trypton (oxoid) 0,4 #; Hefeextrakt (oxoid) 0,1 #; Ammoniumsulfat 0,15 $, Kaliumdihydrogenphosphat 1 $; Natriumhydroxid 0,1 #; Magnesiumsulfat 0,025 ⁰M Ferrosulfat 0,001 #; Zinksulfat 0,001 #; Mangansulfat 0,0005 °h Kupfersulfat 0,001$; 0,05 i° Polypropylenglykol 2.000 als Antischaummittel, das 45 min. lang bei 1,05 atü sterilisiert worden ist, und mit einer Sporensuspension der neuen ffusarium graminearum Schwabe-Art I.M.I. 145.425 geimpft worden ist.

Die Temperatur beim Wachstum betrug 30° C, während die Belüftung so eingestellt war, daß die Konzentrationen an gelö-

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stem Sauerstoff über 10 $ des Sättigimgswertes für die Kulturbrühe lagen. Steriles Antischaummittel, Polypropylenglykol 2.000, wurde zur Unterdrückung der Schaumbildung zugesetzt und der pH-Wert wurde durch Zusätze von sterilem Ammoniak auf 5,0 gehalten. Myeelproben, die während der Wachstumsdauer entnommen wurden, enthielten auf l'rockengewichtsbasis: Gesamtstickstoff 8,0 bis 8,6 ^j^-Araino-Stickstoff 6,4 bis 6,6 fo. Die Anfangswachstumsgeschwindigkeit in diesem komplexen Medium, das sowohl von dem absatzweise arbeitenden Kulturmedium und dem Impfstoff abgeleitet wurde, betrug etwa 0,3 std.~ .

Die folgenden Beispiele 5 und 6 beziehen sich auf kontinuierlich arbeitende Kulturen.

Beispiel 5

Es wurde ein Kulturmedium folgender Zusammensetzung präpariert:

!lösung 1 Glukose Ammoniumsulfat Kaliumdihydrogenphosphat Magnesiumsulfat

Antischaummittel, Polypropylenglykol 2.000 30 min. lang bei 1,05 atü und einem

pH-Wert von 3,0 sterilisiert.

abschließend fo 3,0

0,25 0,3

0,025 0,01

Lösung 2 MnSO

₄
₄
ZnSO₄ 7H₂O

7H₂O

CoGl₂ 6H₂O

CuSO₄ 5H₂O

Na₂MoO₄ 2H₂O

15 min. lang bei 1,05 atü sterilisiert.

0,0005 0,0005 0,0005 0,0001 0,0001 0,0001

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Lösung 3 In der unten beschriebenen Weise durch Filtrierung sterilisierte Vitamine und/oder Aminosäure.

Sämtliche Lösungen wurden in der notwendigen Weise aseptisch zugesetzt. In einem 8,5-Liter-Cheraostat waren die Wachstumsbedingungen wie folgt:

Temperatur 30° G; .Belüftung 1 vvm; 800 U/min, mit einer einzigen, sechsflügeligen Scheibenturbine, 0,5 D, in einem völlig mit Schikanen versehenen Behälter. Als Organismus wurde die neue Art bzw. der neue Stamm ffusarium gramineartim Schwabe I.M.I. 145.425 benutzt. Der pH-Wert wurde durch automatische Zugabe von sterilem Ammoniak bei 5,0 gehalten.

M- max Aus- Myeel

basierend

std."¹ faktor

beute- auf

(i) Lösung 3 0,17-0,19 0,5 7,2 bis 7,9 6,3 bis 6,8 54 in der Weise, daß die endgültige Biotinkonzen- tration in dem Kulturmedium betrug.

(ii) Lösung 3 0,20-0,21 0,5 7,7 bis 8,6 6,1 bis 6,5 59 in der Weise, daß die endgültige Βίοιinkonzentration in dem Kulturmedium 20/1 g/l und die Methioninkonzentration 600 mg/l betrug

Beispiel 6

Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung präpariert:

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Bohnenstärke (behandelt mitd^-Amyläse) 3,0 Kohlenhydrat

Maiswasser 1,33

Ammoniumsulfat 0,25

Kaliumdihydrogenphosphat 0,15

Magnesiumsulfat 0,025

Antischaummittel

Polypropylenglykol 2.000 (v/w) 0,025

30 min. lang bei 1,05 atü

und einem pH-Wert von 4,0 sterilisiert.

Das Medium wurde dem 8,5-liter-Chemostat unter den gleichen Bedingungen zugeführt wie in Beispiel 5, jedoch mit der Ausnahme, daß der pH-Wert zwischen 3,5 und 6,0 variiert wurde
und die Wachstumsgeschwindigkeit während der ganzen Zeit bei 0,1 std.~ lag. Es wurde folgendes Ergebnis erhalten:

TN^ AN^ NPU basie- HPU basierend auf ΤΪΓ rend auf AU

Produkt, gewachsen bei pH 4,0

Il Il Il Il

4,0	7,8	6,6	54	⁶7
5,0	8,6	7,1	57	71
6,0	7,7	5,9	61	80
Beispiel	6(D)

Das Kulturmedium und die Bedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 6, jedoch mit der Ausnahme, daß der pH-Wert während der ganzen Zeit auf 5,0 gehalten und die Temperatur zwischen 26 und 34° G variiert wurde. Als optimale Temperatur stellte sich der Bereich zwischen 30 und 32° G heraus.

Die Beispiele 7 bis 12 beschreiben die Fermentation von fünf Varianten oder Isolaten von ffusartum graminearum Schwabe
I.M.I. 145.245.

Beispiel 7

Es wurden doppelte Schüttelkolben mit einem Aufnahmevermögen von 1 Liter präpariert, die 200 ml des folgenden Mediums
enthielten:

109851/1021 '

endgültige Konzentration

Lösung 1 Glukose (10 min. lang -^*-

gesondert bei
0,7 atü und
einem pH-Wert
von 3_?0 sterilisiert) 3,0

Lösung 2 Amraoniumsulfat 0,565

Kaliumdibydrogenphosphat 1,0

MgSO₄; 7H₂O 0,'025

PeSO,:(NH,)₂S0,:6H₂0 0,0005

MnSO₄:4H₂O 0,0005

GuSO₄:5H₂O 0,0001

CoCl₂ ^EC₂O 0,0001

CaCl₂:2H₂O 0,0015

Fa₂MoO₄ 2H₂O 0,00001

NaQH 0,2

Die Salze wurden 15 min, lang bei 1,05 atü sterilisiert.
Abschließender pH-Wert 6,0. Lösung 3 in der unten beschriebenen Weise durch Filtrierung sterilisierte Vitamine.

Die Lösungen wurden aseptisch zugesetzt, um ein endgültiges Volumen von 200 ml zu ergeben, und die Kolben wurden mit gewaschenen Sporen der Art ffusarium graminearum 1-7 I.M.I. 154.209 geimpft, um eine Konzentration von 8 χ 10^; /ml. zu ergeben.

Wachstumsbedingungen: Temperatur 30° C; 140 U/min, auf einer Rotations-Schüttelmaschine mit einem Hub von 50 mm.

Das Wachstum wurde in Abständen von .jeweils einer Stunde gemessen, indem die optische Dichte bzw. Schwärzung einer Probe bei 600 m^a festgestellt wurde. Aus den erhaltenen Ergebnissen ließen sich folgende. Wachstumsgeschwindigkeiten ableiten:

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(i) Lösung 3» übergangen
(Mindestwert)

(ii) lösung 3 in der Weise, daß
die abschließende Biotin-Konzentration in dem Kulturmedium 5Oitg/l betrug

(iii) Lösung 3 in der Weise, daß
die abschließende Biotin-Konzentration in dem Kulturmedium 50/*g/l und die
Cholinchlorid-Konzentration 50 mg/1 betrug.

Waebstumsgeschwindigkeit std.

sehr langsam

0,22

0,27

Beispiel 8

Das Verfahren gemäß Beispiel 7 wurde wiederholt, wobei jedoch die Art 1-7 durch die Art ffusarium graminearum Schwabe 1-8 ersetzt wurde. Es wurden folgende Wachstumsgeschwindigkeiten erhalten:

(i) As 7(i)
(ii) As 7(ii)
(iii) As 7(iü)

Wachstumsgeschwindigkeit std.

sehr langsam 0,22 0,27

Beispiel 9

Das Verfahren gemäß Beispiel 7 wurde wiederholt, wobei jedoch
die Art 1-7 durch die Art ffusarium graminearum Schwabe 1-9 ersetzt wurde. Es wurden folgende Wachstumsgeschwindigkeiten erhalten: '

(i)	As	7(	i)
(ii)	Ar	7(	Ü)
(iii)	An	7(	iii)

Wachstumsgeschwindigkeit std.

sehr langsam 0,21 0,27

1 09851 /1021

21237G7

- 20 Beispiel 10

Das Verfahren gemäß Beispiel 7 wurde wiederholt, wobei jedoch die Art 1-7 durch die Art ffusarium graminearum Schwabe 1-15 ersetzt wurde. Es wurden folgende Wachstumsgeschwindigkeiten erhalten:

Wachstums- * geschwindigkeit std.~

sehr langsam 0,21 0,27

Beispiel 11

Das Verfahren von Beispiel 7 wurde wiederholt, wobei jedoch die Art 1-7 ersetzt wurde durch die Art ffusarium graminearum Schwabe 1-16. Es wurden folgende Wachstumsgeschwindigkeiten erhalten:

Wachstums- _^ geschwindigkeit std.

(i)	As	7(	i)
(ii)	As	7(	ii)
(iii)	. As	7(	iii)

(i)	As	7(1)	Beispiel 12	sehr	langsam
(ii)	As	7(11)	0,21
(iii)	As	7(111)	0,27

Das Verfahren von Beispiel 7 wurde wiederholt, wobei jedoch die Art 1-7 ersetzt wurde durch die Mutterart ffusarium graminearum Schwabe I.M.I. 145.4-25. Es wurden folgende Wachs tumsgeschwindigkeiten erhalten:

Wachstums- _-j geschwindigkeit std.

(i) As 7(i) sehr langsam

(ii) As 7(ii) 0,22

(iii) As 7(iit) ' 0,27

In den Beispielen 13 und 14 ist die Fermentation unter Verwendung von anderen ffusarium-Arten als der Art Pusarium

10 9 8 5 1/10 2 1

- 21 graainearum beschrieben.

Beispiel 13

Eine Sporensuspeasion der ffu.sariu.tn solani-Art A7-16 (I.M.I. 154.217) wurde in einen Saatfermenter mit einem Inhalt von 80 1 geimpft, der ein Glukose-Maiswassermedium enthielt. Nachdem der Saatfermenter auf 10 bis 20 Gramm pro Liter angewachsen war, wurde der Inhalt in zwei Teile von jeweils 40 Liter, aufgeteilt auf zwei 400-Liter-Behälter, geteilt. Die Saat wurde in ein Medium folgender Zusammensetzung geimpft:

Stärke 6,00

KH₂PO₄ 0,20

(M₄)₂S0₄ 0,25

Maiswasser 0,50

(50 $> Gesamt-ffeststoff-Anteil)

Der pH-Wert wurde durch Zugabe von sterilem Ammoniak auf 5,5 gehalten; Temperatur 30° ö; 2,1 atu; Luftdurchsatz 1,0 wm. Die Drehzahl des Rührwerkes wurde kontinuierlich von 92 auf 184 U/min, erhöht, um in dem Behälter eine ausreichende Menge an gelöstem Sauerstoff zu gewährleisten. Das Rührwerk bestand aus zwei Turbinen mit 0,4D. Nachdem das Kohlenhydrat ausgenutzt worden war, wurde das gewachsene Mycel aus dem ffermenter herausgenommen, gefiltert, mit Wasser gewaschen, zentrifugiert und bei 75° 0 auf einem Warmluft-Bandtrockner getrocknet. Das getrocknete Produkt hatte die folgende Zusammensetzung:

Gesamt-Stickstoff 9,1 i»

Asche 8,3 $

Wenn dieses Produkt an Ratten verfüttert wurde, ergab sich ein NPUop von 41, basierend-auf Gesamt-Stickstoff.

Beispiel 14

Die Art ffuaarium oxvsporum A9-23 (I.M.I. 154.214) wurde in der im vorangegangenen Beispiel beschriebenen Weise zum Wachsen ge-

109851/1021 '

bracht, jedoch mit der Ausnahme, daß die Stärke durch Rohrzuckermelasse mit einer solchen Konzentration ersetzt wurde, daß 6 °/o Zucker erzeugt wurde.

Das getrocknete Produkt hatte folgende Zusammensetzung: Gesamt-Stickstoff 9,9 ^

Asche 10,8 fo

NPUop 47,0 basierend auf dem

Gesamt-Stickstoff

Die Analysemethoden für den Gesamt-Stickstoff (TH) basieren auf Automatic Kjeldahl digestor (Technicon). A. Ferrari, Ann. ΙΓ.Ϊ. Sei. 87, 792 (1960).

Aminostickstoff (ΑΉ) ¹SlTBS (modifiziert). M.A. Pinnegar, Technicon Symposium 1965, Seite 80.

109851/1021

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer eßbaren, Protein enthaltenden Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß eine nicht-toxische Art des Genus ffusarium oder ein Variant oder Mutant davon geimpft und unter aeroben Bedingungen in einem Kulturbsw. Nährmedium zum Wuchern gebracht wird, das im wesentlichen Umfang wachstumsfördernde Nährstoffe enthält, wobei Kohlenstoff in Form assimilierbarer Kohlenhydrate das Grenzsubstrat bei der Vermehrung bzw. dem Wachstum ist, und daß der durch Wucherung entstandene Organismus, der die eßbare proteinhaltige Substanz enthält, abgetrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der abgetrennte, durch Wucherung entstandene Organismus, der die eßbare proteinhaltige Substanz enthält, einem Nahrungsmittel für den menschliche oder tierischen Verbrauch zugesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Grenzsubstrat Stärke, Stärke enthaltende Stoffe oder Hydrolyseprodukte davon, Saccharose, Saccharose enthaltende Stoffe, hydrolisierte Saccharose oder Mischungen davon umfaßt .

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Hemmsubstrat hydrolisierte Kartoffelprodukte, Melasse, Glukose, Maltose, hydrolisierte Bohnenstärke oder Molke umfaßt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4> dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubationstemperatur zwischen 25 und 34° C liegt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Substratmediums während der

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- 24 Impfung zwischen. 3,5 and 7 liegt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 Ms 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Substratmedium ein nicht-toxisches Antischaummittel enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die den Vermehrungs- bzw. Wachstumsprozeß einleitende Beimpfung mittels einer vorgekeimten Saatstufe erfolgt·, die 2 bis 10 f> Impfstoff enthält.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch· gekennzeichnet, daß es in einer kontinuierlich arbeitenden Kultur durchgeführt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer absatzweise bzw. chargenweise arbeitenden Kultur durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Wachstumsdauer zwischen 20 und 48 Stunden liegt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekenn- f zeichnet, daß in dem Kultur- bzw. Nährmedium ein oder mehrere Vitamine vorhanden sind.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Vitamin Biotin ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Vitamin Cholin ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht-toxische Art des Genus ffusarium eine ffusarium graminearum-Art ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekenn-

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BAD ORJGiNAt.

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zeichnet, daß die nicht-toxische Art des Genus Fusarium die Art Fusarium graminearum Schwabe ist, die beim Commonwealth Mycological Institut hinterlegt und unter der Nummer I.M.I. 145.425 eingetragen ist.

17.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht-toxische Art des Genus Fusarium einer der Varianten 1-7, 1-8, 1-9, 1-15 oder 1-16 der Mutterart Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 145.425 ist, die "beim Commonwealth Mycological Institut hinterlegt und unter den Nummern IrM.I. 154.209, I.M.I. 154.211, I.M.I. 154.212, I.M.I. 154.213 bzw. I.M.I. 154.210 eingetragen sind.

18.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht-toxische Art des Genus Fusarium ^eine Fusarium solani bzw. Fusarium oxysporum-Art ist.

19.Nicht-toxisches Pilzmycel, welches mittels des Verfahrens nach Anspruch 1 hergestellt ist und einen hohen Netto-Protein-Ausnutzungswert von mindestens 70, basierend auf -Aminostickstoff, hat.

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ORIGINAL