DE69908132T2

DE69908132T2 - Mucoralespilze zur verwendung bei der herstellung von nahrungsmitteln

Info

Publication number: DE69908132T2
Application number: DE69908132T
Authority: DE
Inventors: Andre De Haan; Godefridus Sigbertus GERAATS; Johannes Fredericus KRUYSSEN; Louis Hendrik BIJL
Original assignee: DSM NV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1998-09-15
Filing date: 1999-09-15
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2019-09-16
Also published as: EP1094719B1; EP0986960A1; WO2000015045A1; GB2357421B; ATE240660T1; CA2336037C; ZA200007697B; CA2336037A1; EP1094719A1; NZ509053A; AU6202499A; PT1094719E; GB0105231D0; AU764133B2; JP2002524097A; DK1094719T3; DE69908132D1; ES2198151T3; US7045160B1; GB2357421A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von essbaren (proteinartigen) Stoffen unter der Verwendung von Pilzzellen der Ordnung Mucorales und die Verwendung dieser Stoffe in Nahrungsmitteln, im Besonderen als Fleischersatz.
Einführung
Von tierischem Fleisch wird angenommen, dass es ein wünschenswerter Bestandteil der menschlichen Ernährung ist, nicht nur wegen der Vitamine und Nährstoffe, die es bereitstellt, sondern auch wegen seines Geschmacks (besonders nach dem Kochen) und, sehr wichtig, seiner Textur. Eine steigende Anzahl an Menschen wendet sich jedoch vegetarischer oder veganischer Ernährung zu, von denen keine Fleisch oder fleischstämmige Produkte beinhalten darf. Solche Arten der Ernährung können auf einer Vielzahl von Faktoren beruhen, aber sie beruhen oft entweder auf einer Abneigung gegen Fleisch (entweder hinsichtlich der Textur oder des Geschmacks) oder auf ethischen oder moralischen Erwägungen (zum Beispiel dem Glauben, dass es falsch ist, Tiere zu töten, um Menschen zu ernähren).
Die Bewegung in Richtung vegetarischer/veganischer Ernährung ist in den letzten Jahren durch das Auftreten von BSE (bovine spongiforme Encephalopathie) gestiegen, auch bekannt als „Rinderwahn", eine Krankheit, die auf das Nervensystem von Kühen wirkt und von der man denkt, dass sie das Ergebnis des Fütterns von Rindern mit Teilen von Schafen ist, die mit einer ähnlichen Krankheit, bekannt als „Scrapie", infiziert sind. BSE ist mit einem Krankheitszustand bei Menschen in Verbindung gebracht worden, der als CJD (Creutzfeld-Jacob-Krankheit) bekannt ist.
Abgesehen von bestimmten essbaren Pilzen (z. B. Champignons) sind proteinartige Nahrungsmittel bekannt, die Pilze enthalten. Ein Beispiel ist das traditionelle, indonesische, fermentierte Nahrungsmittel Tempeh. Diese wird üblicherweise durch die Fermentation von Rhizopus-Pilzen auf Sojabohnen (und Bestandteilen davon), die als feuchtes, festes Substrat dienen, hergestellt. Die Bohnen (oder ein anderes pflanzliches Substrat) werden mit dem Pilz beimpft und die Fermentation wird für 24 bis 36 Stunden zugelassen. Die Bohnen werden durch das produzierte Pilzmyzel-Protein gebunden, wodurch ein festes Produkt entsteht, das anschließend vor dem Essen geschnitten werden kann (üblicherweise wird vor dem Verzehr keine weitere Verarbeitung durchgeführt). Auf diese Weise werden die Pilze verwendet, um ein ansonsten nicht essbares Substrat zu hydrolysieren und, abgesehen davon, dass ihm von Natur aus viel Geschmack oder Aroma fehlt, ist Tempeh ziemlich trocken und besitzt nicht die mit Fleisch assoziierte faserige und saftige Textur. Die Pilze stellen nur eine kleine Menge des Produktes dar und daher ist der Gehalt an Pilzprotein niedrig. Es ist daher nicht sehr attraktiv als Fleischersatz, zumindest für Menschen aus der westlichen Hemisphäre.
Eine Anzahl von essbaren Fleischersatzstoffen sind in den letzten Jahren vorgeschlagen worden. Auf Soja basierende Produkte, im Besonderen gepresstes Soja, werden besonders durch amerikanische und japanische Firmen vertrieben, aber diese besitzen keinen besonders fleischähnlichen Geschmack oder Textur (tatsächlich können sowohl Soja als auch Gluten einen unangenehmen oder strengen Geschmack besitzen).
GB-A-2007077 und US 4,265,915 (Maclennan/BioEnterprises) schlagen ein ähnliches Verfahren zur Herstellung von Tempeh vor, außer, dass anstelle von Sojabohnen ein Stärke enthaltendes Nahrungsmittel wie Sago, Getreide oder Kartoffeln als festes Substrat dient. Eine Voraussetzung jedoch für diese Nahrungsmittel (und Tempeh) ist, dass feste Nahrungsmittel oder Zutaten als Substrat für die fermentierenden Mikroorganismen benötigt werden. US 3,885,048 (Liggett) bezieht sich ebenfalls auf ein fermentiertes Nahrungsmittel, das unter der Verwendung eines auf Stärke basierenden, festen Substrats hergestellt wurde.
Vor kurzer Zeit haben Wissenschaftler die Produktion von essbaren, Protein enthaltenden Stoffen durch die Verwendung der Produktion von Myzel-Protein durch den Pilz Fusarium graminearum vorgeschlagen. Diese Stoffe sind in steigendem Maße als Fleischersatz verwendet worden und sind in in dem vereinigten Königreich und anderen europäischen Ländern verkauften Nahrungsmitteln beinhaltet. WO 97/36996 (Gist-Brocades B.V.) bezieht sich auf Granula getrockneter mikrobieller Biomasse, aus der wertvolle Verbindungen wie mehrfach ungesättigte Fettsäuren extrahiert werden können.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Dem ersten Aspekt der Erfindung entsprechend wird ein Verfahren zur Herstellung eines essbaren (z. B. proteinartigen) Stoffes bereitgestellt, geeignet zur Verwendung in Nahrungsmitteln, enthaltend Pilzzellen, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

(a) Fermentieren von Pilzzellen der Ordnung Mucorales in einer wässrigen Flüssigkeit in einem Fermentiergefäß, wobei die Flüssigkeit eine assimilierbare Stickstoff(N)-Quelle und eine assimilierbare Kohlenstoff(C)-Quelle umfasst, und Mischen (und vorzugsweise Belüften) der Flüssigkeit und der Zellen während der Fermentation;
(b) Reduzieren des RNA-Gehaltes der Pilzzellen auf unter 4,0 Gew.-%;
(c) vor oder nach Schritt (b): Entfernen zumindest eines Teils des Wassers aus dem Gemisch von Pilzzellen und wässriger Flüssigkeit; und
(d) Verarbeiten der Pilzzellen zu einem essbaren Stoff.

Durch die Verwendung (nicht-toxischer) Mucorales-Pilze (z. B. die in asiatischen, fermentierten Nahrungsmittelprodukten verwendeten) kann man jegliche Mycotoxine vermeiden, die durch andere (z. B. Stand der Technik) Organismen produziert werden können. Daher kann wenig oder kein Überprüfen von Organismen, die sicher für die Aufnahme in Nahrungsmittel sind, benötigt werden. Das bedeutet, dass die durch die Erfindung hergestellten Produkte für die Nahrungsaufnahme und die Verwendung in Nahrungsmitteln geeigneter sind. Die Mucorales-Organismen produzieren im Allgemeinen keine Mycotoxine (oder eine unbedeutende Menge oder unter der Nachweisgrenze), was ein klarer Vorteil ist, da diese Organismen als Ganzes in ein Nahrungsmittel aufgenommen werden, und was bedeuten kann, dass die Verarbeitungstechniken effizienter sein können, da die Mycotoxine nicht entfernt werden müssen. Das kann ein Problem mit Fusarium-Organismen lösen, die unerwünschte Mycotoxine produzieren können (Desjardins et al., Mirobiological Reviews, 57(3):595–604, September 1993).
Die hier erwarteten Mycotoxine sind solche wie Aflatoxin, Mevinolin, Terrein und Trochothecene (letztere produziert durch einige Fusarium-Arten). Es ist unwahrscheinlich, dass ein Pilz, der irgendeines dieser Mycotoxine produziert, in irgendeiner Form der Nahrungsmittelproduktion verwendet werden darf, selbst wenn der Hersteller Maßnahmen ergreift, um die Mycotoxine zu entfernen. Es ist daher besonders wichtig, Pilze auszuwählen, die diese Mycotoxine in keinem Stadium des Verfahrens produzieren werden.
Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung von Mucorales-Pilzen ist, dass eine relativ große Vielfalt von Mikroorganismen erhältlich ist, in Abhängigkeit von den in dem proteinartigen Stoff erwünschten Merkmalen. Das kann Unterschiede bei den physikalischen Merkmalen (wie bei der faserigen Natur oder dem Gefühl im Mund) oder bei den chemischen Merkmalen (Geschmack usw.) zulassen. Es ist festgestellt worden, dass die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Pilze verbesserte fleischähnliche Eigenschaften aufweisen, zum Beispiel eine faserigere und/oder saftigere Textur. Diese Pilze können auch hinsichtlich ihrer Textur und Saftigkeit variieren und erlauben es so sich selbst, in einer weiten Vielfalt von Nahrungsmitteln verwendet zu werden. Dadurch kann man durch die Auswahl des Mikroorganismus die verschiedenen wünschenswerten Merkmale bereitstellen, die dem endgültig herzustellenden Nahrungsmittel entsprechen (durch die Verwendung verschiedener Verarbeitungstechniken). Darüber hinaus können verschiedene Mikroorganismen verschiedene Farben vermitteln und genau so, wie man einen weißen Stoff herstellen kann, kann man Stoffe mit verschiedenen Farben erzeugen, wie ein gelbes bis braunes oder sogar ein grünes Aussehen, was für einige Nahrungsmittel wünschenswert sein kann.
Die Pilze können zu der Familie der Choanephoraceae gehören, wie zu der Gattung Blakeslea oder Gilbertella, zum Beispiel zu der Art Blakeslea trispora oder Gilbertella persicaria. Die anderen drei in der Ordnung Mucorales eingeschlossenen Familien sind Cunninghamellaceae, Mortierellaceae (wie Pilze der Art Mortierella und im Besonderen die Art Mortierella alpina) und besonders Mucoraceae. Geeignete Pilze sind üblicherweise durch Menschen und Tiere essbar (und verdaulich).
Bevorzugte Pilze sind eher saprophytisch (sozusagen einfache Pilze) als parasitisch (die komplexer sind). Die „einfachen" Pilze werden üblicherweise bevorzugt, weil sie besser an hyphales Wachstum angepasst sind, wohingegen sich parasitische Organismen auf die Aufnahme von Nährstoffen von ihrem „Wirts"-Organismus konzentrieren.
Die Pilzzellen gehören vorzugsweise zu der Gattung Rhizopus, Rhizomucor, Mucor oder Mortierella, die alle zu der Familie der Mucoraceae gehören. Geeignete Pilze der Gattungen Rhizopus, Mucor oder Rhizomucor schließen Rhizopus stolonifer, Rhizopus miehei, Rhizopus pusillus, Rhizopus oligosporus und besonders Rhizopus oryzae ein; Mucor hiemalis und Mucor rouxii; und Rhizomucor miehei. Andere bevorzugte Stämme schließen die der Gattung Absidia oder Phycomyces ein, wie Absidia pseudocylindrospora oder Phycomyces blakesleeanus.
Bevorzugte Pilze können eine Zellwand aufweisen, die enthält oder in erster Linie besteht aus Chitin und Chitosan. Die Zellwände können einen oder mehrere der Zucker Glucosamin (wie D-Glucosamin) und/oder Fucose; wie L-Fucose, enthalten und können im Wesentlichen frei von Galactose sein.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Pilze besitzen vorzugsweise keine Septen, was im Gegensatz zu den Pilzen der Gruppe Fusarium steht. Weiterhin weisen zum Gebrauch in der Erfindung bevorzugte Pilze Verzweigungen auf, wiederum anders als Fusarium-Organismen, die wenige oder keine Verzweigungen (in ihren Hyphen) aufweisen. Tatsächlich befürwortet das Fachgebiet den Gebrauch unverzweigter Mutanten (EP-A-0,123,434). Die Hyphen der in der Erfindung verwendeten Pilze können einen Durchmesser von 1 bis 20 μm aufweisen, wie zum Beispiel von 2 bis 10 μm, optimalerweise von 2 bis 8 μm.
Der Pilz kann ein natürlich vorkommender sein, er kann unter der Verwendung bekannter Techniken hinsichtlich bestimmter erwünschter Eigenschaften ausgewählt worden sein oder er kann genetisch manipuliert worden sein.
Pilze der Ordnung Mucorales werden eingesetzt werden, die im Allgemeinen auch zu der Gruppe der perfecti (in anderen Worten, nicht zu der Klasse imperfecti) gehören und die zur sexuellen Reproduktion befähigt sind. In der Erfindung verwendete Pilze können auch filamentös sein.
Es wird erkannt werden, dass das Verfahren des ersten Aspektes eine Flüssigfermentation ist, in anderen Worten dient eine wässrige Flüssigkeit (z. B. eine Lösung) als Kulturmedium. Dies steht im Gegensatz zu Verfahren nach dem Stand der Technik, bei denen die Pilze auf einem festen Substrat gezüchtet werden, wobei das Substrat zum Beispiel Reis, Sojabohnen oder Stärke enthaltende Produkte wie Getreide oder Kartoffeln sind. Innerhalb der Erfindung wird das Flüssigfermentationsverfahren in (a) vorzugsweise in Abwesenheit eines festen Substrats, wie zum Beispiel eines, das selbst ein essbares Nahrungsmittel ist, durchgeführt (dies schließt nicht nur pflanzliches Material oder Gemüse ein, sondern auch Fleisch und natürliche, feste Stärke oder Kohlehydrate enthaltende Substanzen wie Getreide, Sojabohnen, Sesamsamen oder Schrot).
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit einen essbaren (z. B. proteinartigen) Stoff, der für den Gebrauch in Nahrungsmitteln geeignet ist und der Pilzzellen der Ordnung Mucorales mit einem RNA-Gehalt unter 4,0 Gew.-% enthält. Dieser Stoff kann durch ein Verfahren des ersten Aspektes herstellbar sein. Er kann Biomasse oder ein Filterkuchen sein oder eine solche Biomasse oder Filterkuchen, die gemahlen und/oder gestürzt wurden.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines essbaren (texturierten) Produktes, wobei das Verfahren das Mischen eines oder mehrerer essbarer Bestandteile mit einem essbaren proteinartigen Stoff umfasst, der Pilzzellen der Ordnung Mucorales mit einem RNA-Gehalt von weniger als 4,0 Gew.-% enthält, und (nötigenfalls) das Texturieren des Gemisches.
Ein dritter Aspekt schließt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines essbaren (texturierten) Produktes ein, wobei das Verfahren das Mischen eines oder mehrerer essbarer Bestandteile mit einem essbaren proteinartigen Stoff umfasst, der Pilzzellen der Ordnung Mucorales mit einem RNA-Gehalt von weniger als 4,0 Gew.-% enthält, und das Texturieren zur Erzeugung eines Produktes, von dem Pilzzellen auf der Basis des Trockenmassegewichtes mindestens 5% ausmachen.
Die Pilzzellen werden vorzugsweise unversehrt (oder ganz) bleiben, nicht nur während des Fermentationsprozesses, sondern auch während der nachfolgenden Verarbeitungsschritte, einschließlich des Entfernens des Wassers, der Reduktion des RNA-Gehaltes und jeglicher Texturierung. Somit wird der Stoff (oder das texturierte Produkt) unversehrte (aber tote oder abgetötete) Pilzzellen enthalten und während der meisten, wenn nicht aller Stadien der Herstellung des Stoffes oder des Produktes werden Schritte unternommen werden, um die Zerstörung und die Lyse der Zellen oder der Zellmembranen zu minimieren. Während der Verarbeitung können jedoch einige Verbindungen aus der Zelle entweichen (sodass die Zellmembran ein bisschen „auslaufen" kann). Es ist natürlich beabsichtigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren das Entfernen von RNA (und nötigenfalls auch von Wasser) aus den Pilzzellen beinhaltet.
Der Stoff (und damit auch das texturierte Produkt) enthält durch die Pilzzellen produziertes Pilzprotein. Üblicherweise befindet sich das Protein intrazellulär und/oder innerhalb der Zellmembran. Extrazelluläres Protein kann vorhanden sein, aber es wird oft während der Verarbeitung entfernt (z. B. während des Entfernens des Wassers, da extrazelluläres Protein in der wässrigen Flüssigkeit vorhanden sein kann). Somit kann der proteinartige Stoff, zum Beispiel eine Biomasse, ein solcher sein, der durch das Verfahren des ersten Aspektes herzustellen ist.
Der proteinartige Stoff weist vorzugsweise mindestens 40%, z. B. mindestens 50% oder sogar 60% oder mehr an Pilzzellen auf. Diese Mengen können jedoch viel größer sein und die Zellen können mindestens 70%, so wie mindestens 80% und im besten Fall mindestens 90% oder 95% des proteinartigen Stoffes ausmachen (auf Basis des Trockenmassegewichtes). Mit einem solch hohen Gehalt an Pilzzellen kann man einen Stoff erhalten (und später auch ein texturiertes Produkt), das saftiger, faseriger und besser im Geschmack ist. Sogar nach dem Texturieren kann das resultierende essbare (z. B. texturierte) Produkt den gleichen Gehalt an Pilzzellen aufweisen, wie der für den proteinartigen Stoff genannte. Diese Prozentangaben beruhen auf dem Gewicht der Zellen in der Trockenmasse, in anderen Worten trocknet man zuerst den Stoff oder das Produkt und berechnet auf der Basis der erhaltenen Trockenmasse den Prozentsatz des Masse, der aus Pilzzellen besteht.
Der Stoff kann daher im wesentlichen nur aus den Pilzzellen bestehen (was das durch (z. B. innerhalb) diese Zellen produzierte Protein einschließen kann). Es wird daher während der Fermentation üblicherweise keine Extraktion oder Isolierung von bestimmten Verbindungen oder Stoffen geben, die entweder in den Pilzen bzw. Pilzzellen enthalten sind oder von diesen produziert wurden. Tatsächlich ist es in den erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, dass RNA (oder irgendein Abbauprodukt davon oder irgendeine während der Verarbeitung unerwünschte Verbindung) die einzige Verbindung sein wird, die aus den Zellen entfernt wird. Extrazelluläres Protein kann von den Zellen weggewaschen werden und auf diese Weise nicht vorhanden sein.
Der proteinartige Stoff des dritten Aspektes und das texturierte Produkt des vierten Aspektes sind in dem Sinn essbar, dass sie in Nahrungsmittel aufgenommen werden können oder dass sie mit dem Gebrauch in Nahrungsmitteln oder Futter vereinbar sind. Obwohl der proteinartige Stoff als solcher gegessen werden kann, ist es die Absicht, dass dieser eigentlich ein Zwischenprodukt bei der Herstellung des texturierten Produktes ist.
Der proteinartige Stoff kann als einzig essbares Material die Pilzzellen aufweisen und kann somit außer den Pilzzellen frei von essbaren Stoffen sein. Es können jedoch anschließend verschiedene essbare Bestandteile mit dem proteinartigen Stoff des dritten Aspektes gemischt oder zu diesem gegeben werden, um das texturierte Produkt des vierten Aspektes herzustellen. Weitere oder zusätzliche essbare Bestandteile können bei der Herstellung des Nahrungsmittels zu dem texturierten Produkt gegeben werden.
Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist also das texturierte Produkt. Dieses ist für die Aufnahme in ein Nahrungsmittel geeignet (es kann essbar und geeigneterweise für Menschen oder Tiere verdaulich sein) und kann Zellen der Ordnung Mucorales enthalten, entweder mit einem RNA-Gehalt von unter 4,0 Gew.-% oder wobei die Pilzzellen mindestens 40% des Produktes (auf der Basis des Trockenmassegewichtes) ausmachen. Der Prozentsatz an Pilzzellen (auf der Basis des Trockenmassegewichtes) kann der gleiche sein wie der vorstehend für den proteinartigen Stoff (des zweiten Aspektes) erwähnte. Da jedoch das Produkt des vierten Aspektes durch die Zugabe essbarer Bestandteile zu dem proteinartigen Stoff des zweiten Aspektes hergestellt werden kann, wird einem bewusst werden, dass der Gehalt an Pilzzellen des Erstgenannten oft niedriger ist als der des Letztgenannten. Das texturierte Produkt kann Pellets, Granula oder Schichten enthalten, es kann durch ein Verfahren, das Pressen beinhaltet, hergestellt werden (und daher ein Extrudat sein), es kann einen Teig, eine Paste oder ein fleischähnliches Stück enthalten oder es kann in der Form einer Rolle vorliegen (so wie durch das Rollen des Stoffes, wenn er in der Form einer Schicht vorliegt).
Ein fünfter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Nahrungsmitteln, welches das Erzeugen eines Nahrungsmittels mit oder die Aufnahme in ein bestehendes Nahrungsmittel von einem dem zweiten Aspekt entsprechenden, essbaren Stoff (zum Beispiel durch ein Verfahren des ersten Aspektes herzustellen) oder von einem texturierten Produkt des vierten Aspektes (zum Beispiel durch ein Verfahren des dritten Aspektes herzustellen) beinhaltet. Dies kann die Zugabe von einem oder mehreren zusätzlichen essbaren Bestandteilen zu dem Stoff oder dem Produkt einschließen oder es kann eine weitere Texturierung enthalten. Dieses Verfahren schließt daher nicht nur die Herstellung eines Nahrungsmittels unter der Verwendung des Stoffes oder des Produktes ein, sondern es sieht auch das Ersetzen eines Nahrungsmittels durch den Stoff oder das Produkt vor.
Ein sechster Aspekt der vorliegenden Erfindung wird also durch das Nahrungsmittel bereitgestellt. Dies kann entweder den Stoff des zweiten Aspektes oder das Produkt des vierten Aspektes enthalten. Das Nahrungsmittel ist durch das Verfahren des fünften Aspektes herstellbar.
Das Nahrungsmittel kann eine Wurst, eine Pastete, ein Burger, ein Brotaufstrich oder Tierfutter sein oder es kann essbare Arzneimittel wie Tabletten enthalten.
Das Nahrungsmittel enthält vorzugsweise mindestens 5%, zum Beispiel mindestens 8 oder 10% und im besten Fall mindestens 15 oder 20% an Pilzzellen (auf der Basis des Trockenmassegewichtes). Der Pilzgehalt kann ebenso hoch wie der für das texturierte Produkt beschriebene sein, aber da das Nahrungsmittel aus dem Produkt hergestellt werden kann, kann der Pilzgehalt niedriger sein, zum Beispiel kann das Nahrungsmittel nur zu mindestens 25 oder 30% aus Pilzzellen bestehen (wiederum auf der Basis der Berechnung des Trockenmassegewichtes).
Genaue Beschreibung der Erfindung
Das Fermentationsverfahren des ersten Aspektes wird geeigneterweise in einem für das Enthalten der wässrigen Flüssigkeit umgebauten Fermentiergefäß, wie einem Fass, durchgeführt und diese Gefäß kann unter Druck gesetzt werden. Es kann auch umgebaut worden sein, um die ständige und kontinuierliche Versorgung mit den assimilierbaren Stickstoff- und/oder Kohlenstoffquellen zu erlauben. Stadium (a) und spätere Stadien werden daher vorzugsweise aseptisch durchgeführt. Obwohl die Fermentation ein kontinuierliches Verfahren mit regelmäßigem Ernten oder Entfernen der Pilzzellen (und der begleitenden Proteine) sein kann, kann das Verfahren, wenn erwünscht, ein Batch-Verfahren, wie ein Batch-Verfahren mit wiederholter Fütterung, sein (eine oder mehrere Zugaben von C- und/oder N-Quellen nach dem Beginn der Fermentation). Somit kann das Fermentationsverfahren gestoppt oder angehalten und die Pilzzellen aus dem Gefäß entfernt werden, bevor eine andere oder neue Fermentation begonnen wird.
Das Gefäß kann darüber hinaus umgebaut worden sein, um die Belüftung und/oder das Mischen der Zellen und der Flüssigkeit durchzuführen, wie eine Bewegung der Lösung, welche ein Rühren sein kann, das zum Beispiel durch mechanische Mittel erreicht wird.
Die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können in getrennten Zusammensetzungen bereitgestellt werden. Dies ist der Fall, weil die verschiedenen Quellen Gegenstand unterschiedlicher Sterilisationsbedingungen sein können, und darüber hinaus erlaubt es eine Variation der relativen Mengen von Kohlenstoff und Stickstoff während der Fermentation.
Die Stickstoff- und/oder Kohlenstoffquellen können getrennt oder gleichzeitig oder als eine kombinierte Zubereitung zugeführt (oder zugegeben) werden. Sie können also in der gleichen Zusammensetzung (wenn für notwendig erachtet) vorhanden sein, die vorzugsweise eine Flüssigkeit ist. Die C- und/oder N-Quellen können (dem Fermentiergefäß) entweder bevor die Pilzzellen (dem Gefäß) zugegeben werden, in anderen Worten vor dem Animpfen, oder während der Fermentation zugegeben werden.
Wenn die Zufuhr kontinuierlich (oder periodisch) ist, ist es bevorzugt, dass für jeden Fall der Zufuhr (z. B. „Schüsse" oder Zugaben) die Zugabe von Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquellen die gleiche ist.
Bevorzugte C : N(Gewichts)-Verhältnisse sind mindestens 6 : 1, können aber variieren von 10 : 1 bis 150 : 1, wie von 15 : 1 bis 50 : 1, im besten Fall von 25 : 1 bis 40 : 1.
Bei einer kontinuierlichen Zufuhr ist vorzugsweise die Zeit, während der die Stickstoff- und/oder Kohlenstoffquellen zugeführt werden, länger als die Zeit, in der sie nicht zugeführt werden. Während einer Fermentation ist also eine Zufuhr für mindestens 50% der Zeit vorteilhaft. Wenn die Zufuhr einer oder beider Quellen periodisch ist, dann sollte es mindestens 2, vorzugsweise mindestens 5 und im besten Fall mindestens 10 Zugaben von Stickstoff- und/oder Kohlenstoffquellen zu der wässrigen Flüssigkeit geben. Bei einer kontinuierlichen Zufuhr oder weiteren Zugaben wird bevorzugt, dass das C : N-Verhältnis in den Quellen bei (etwa) dem gleichen Verhältnis beibehalten wird, wie am Anfang der Fermentation.
Die Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquellen können komplexe Quellen oder individuelle oder isolierte Verbindungen sein. Nicht-komplexe Quellen werden bevorzugt (sie können weniger Mycotoxine aufweisen oder produzieren) und in den letzteren beiden Fällen können sie in einem hohen Reinheitsgrad zugegeben werden und sie können verbreitete (oder im Handel erhältliche) Chemikalien sein. Vorzugsweise sind C- und/oder N-Quellen nicht fest und geeigneterweise sind beide Flüssigkeiten.
Geeignete Stickstoffquellen schließen Ammoniak oder Ammoniumionen ein. Der Vorteil hierbei ist, dass Ammoniak als ein pH-regulierendes Mittel wirken kann. Dieses kann in der Form eines Ammoniumsalzes, wie Nitrat, Sulfat oder Phosphat oder in der Form von Ammoniumionen selbst zugeführt werden, zum Beispiel eine wässrige Ammoniumhydroxid-Lösung.
Andere anorganische Stickstoffquellen können ebenfalls verwendet werden, wie zum Beispiel Natriumnitrat, Harnstoff oder eine Aminosäure wie Asparagin oder Glutamin.
Andere komplexe Quellen schließen Hefe-Hydrolysate, primäre Hefe, Sojabohnenschrot, Casein-Hydrolysate, Hefe, Hefeextrakt oder Reiskleie ein.
Die Kohlenstoffquelle kann (komplexe Quellen wie) Maltodextrin, Hafermehl, Haferschrot, Molasse, pflanzliches (z. B. Sojabohnen-) Öl, Malzextrakt oder Stärke enthalten. Bevorzugte (nicht-komplexe) Kohlenstoffquellen schließen Kohlehydrate oder Zucker, wie Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Mannit, Glucose, Lactose, Citrat, Acetat, Glyzerin oder Ethanol ein.
Bevorzugte Stickstoff- und/oder Kohlenstoffquellen sind wasserlöslich oder mit Wasser mischbar.
Die wässrige Flüssigkeit kann zusätzlich andere, in der Fermentation helfende Substanzen enthalten, zum Beispiel ein chelatierendes Mittel (z. B. Zitronensäure), ein antischaumbildendes Mittel (z. B. Sojabohnenöl), ein Vitamin (z. B. Thiamin und/oder Riboflavin), jegliche notwendigen katalytischen Metalle (zum Beispiel Erdalkalimetalle wie Magnesium oder Calcium, oder Zink oder Eisen und/oder andere Metalle wie Cobalt und Kupfer), Phosphor (z. B. Phosphat) und/oder Schwefel (z. B. Sulfat). Vorzugsweise wird die wässrige Flüssigkeit einen niedrigen Schwefel-Gehalt aufweisen, zum Beispiel weniger als 3,0 g, vorzugsweise weniger als 2,0 g oder 1,0 g Schwefel pro Liter wässriger Flüssigkeit.
Vorzugsweise wird der pH-Wert, die Temperatur und/oder der Sauerstoff-Gehalt (der wässrigen Flüssigkeit) während der Fermentation kontrolliert. Das kann geschehen, um den pH-Wert, die Temperatur und/oder den O₂-Gehalt konstant oder innerhalb eines erwünschten Bereichs zu halten. In dieser Hinsicht kann das Fermentationsgefäß Sensoren für den pH-Wert, die Temperatur und/oder den O₂-Gehalt aufweisen.
Der pH-Wert der wässrigen Flüssigkeit kann während der Fermentation von 2 bis 8, wie von 3 bis 7, im besten Fall von 4 bis 6 sein.
Die Temperatur der wässrigen Flüssigkeit während der Fermentation ist nicht besonders kritisch, aber kann von 20 bis 50°C, wie von 25 bis 40°C, im besten Fall von 30 bis 35°C sein.
Es ist wichtig, dass während der Fermentation ein Mischen stattfindet. In anderen Worten werden die wässrige Flüssigkeit und die Pilzzellen geeigneterweise entweder gemischt oder bewegt. Dies kann erreicht werden, wenn Belüftung bereitgestellt wird, in anderen Worten durch das Blasen von Luft in die wässrige Flüssigkeit. Dies kann dem zusätzlichen Zweck des Bereitstellens von Sauerstoff für die Pilzzellen dienen: daher ist die Fermentation vorzugsweise aerob.
Andere Mittel zur Bewegung oder zum Mischen schließen das Rühren ein, zum Beispiel unter Verwendung eines Magnetrührers. Dieser kann einer von der „hydrofoil axial flow"-Konstruktion sein oder kann so konstruiert sein, dass das wässrige Medium vom Magnetrührer radial nach außen getrieben wird (wie von einer Turbine). Selbst wenn kein Rühren stattfindet, ist es bevorzugt, dass die Pilze während der Fermentation mit Sauerstoff versorgt werden und daher ist hierbei eine Belüftung (z. B. durch Einblasen von Luft, O₂ oder anderen Sauerstoff-enthaltenden Gasen) von Vorteil. Die Belüftung kann von 0,1 bis 2,0, wie von 0,5 bis 1,0 vvm sein.
Einer der Vorteile der Belüftung und/oder Bewegung ist, dass der Sauerstoff Gehalt der wässrigen Flüssigkeit relativ hoch gehalten werden kann. Dieser kann mindestens 10%, so wie mindestens 15%, im besten Fall mindestens 20% (hinsichtlich der Sättigung mit Luft) sein. Dies erlaubt ein wirksameres Erzeugungsverfahren und kann daher zu einem schnelleren und/oder höheren Gehalt an Pilzzellen und/oder Pilzproteinen führen. Dies ist für die in der Erfindung verwendeten Pilzzellen besonders von Vorteil, da diese ausreichend robust sind, um eine Bewegung und/oder ein Mischen während der Fermentation zuzulassen. Dies ist jedoch mit den (sensitiveren) Pilzzellen der Gruppe Fusarium nicht immer möglich, da das Fachgebiet bei solchen Organismen die Verwendung von Airlift-Fermentern, die keine mechanischen Rührer besitzen, lehrt. Man muss also mit den meisten Mucorales-Organismen keine teure Ausrüstung wie Airlift-Fermenter, die für andere (weniger robuste) Organismen entwickelt wurden, verwenden, was bedeutet, dass der essbare Stoff billiger produziert werden kann.
Die Fermentation kann 1 bis 12 Tage, wie 2 bis 6 oder 7 bis 10 Tage und im besten Fall 2 bis 4 Tage benötigen. Eine kürzere Fermentation eignet sich selbst mehr für ein Batch-Verfahren, als für ein kontinuierliches Fermentationsverfahren.
Wenn die Fermentation beendet ist oder gestoppt werden muss, kann das Wasser aus der Kombination von Pilzzellen und der produzierten, umgebenden Flüssigkeit entfernt werden. Im Fachgebiet wird diese Kombination von wässriger Flüssigkeit und Pilzzellen oft als „Brühe" bezeichnet. Während der Fermentation sollte das Gefäß nur diese Brühe enthalten und diese ist vorzugsweise vollständig flüssig (und somit frei von jeglichem festen Material). Die Zellen können vor oder nach diesem Stadium des Entfernens des Wassers mit einer wässrigen Flüssigkeit, wie z. B. Wasser, gespült werden und eine oder beide dieser Vorgehensweisen kann, wenn erwünscht, zu einer Abtrennung der Zellen von extrazellulärem Material (z. B. Protein) führen. Nötigenfalls kann vor dem Entfernen des Wassers eine Depelletierung (das Auflösen oder Minimieren jeglicher Pellets in der Flüssigkeit) durchgeführt werden (zum Beispiel durch Behandlung mit Ultraschall oder Scheeren).
Das Entfernen des Wassers wird vorzugsweise mit Hilfe mechanischer Mittel oder Techniken durchgeführt. Diese schließen verschiedene Fest/Flüssig-Trennungstechniken wie mechanisches Entwässern, Filtration, Zentrifugation (bevorzugt), Absetzen (in anderen Worten, man lässt das Material sich unter Verwendung der Schwerkraft absetzen), Erhitzen oder Trocknen ein.
Nach dieser Entwässerung kann der Wasser-Gehalt von 50 bis 90%, wie von 60 bis 87%, im besten Fall von 75 bis 85% betragen.
Im Anschluss an diese (optionale) Entwässerung kann dann der RNA-Gehalt der Pilzzellen auf unter 4,0 Gew.-% reduziert werden. Dies kann durch chemische und/oder physikalische Verfahren erreicht werden. Das bevorzugte Verfahren ist es, eines oder mehrere bereits innerhalb der Pilzzellen vorhandene Enzyme zu verwenden und zu nutzen, um die RNA zu spalten. Dies erlaubt es jeglichen resultierenden (kleinen) RNA-Molekülen (oder Abbauprodukten davon), die Zellemembran zu durchdringen und nach außen zu gelangen. Geeigneterweise werden die (unerwünschten) Nucleotide innerhalb der Zelle in 2er-, 3er- und 5er-Nucleotide gespalten; es können also diese Nucleotide sein, die durch die Zellmembran transportiert werden. Eine Entwässerung kann ebenfalls andere, während der weiteren Verarbeitung nicht erwünschte Verbindungen entfernen, wie Glucose (zum Beispiel wegen einer späteren Hitzebehandlung).
Ein bevorzugtes Verfahren des Entfernens von RNA ist die Hitzebehandlung, in anderen Worten das Erhitzen der Pilzzellen. Das kann zwei Wirkungen haben. Erstens werden die Zellen durchlässiger, was der RNA und anderen Molekülen erlaubt, die Zelle nach außen zu durchdringen. Es kann auch die Aktivität von Nucleasen wie RNAsen innerhalb der Pilzzellen erhöhen. Ein weiterer Vorteil einer solchen Hitzebehandlung ist, dass sie jegliche unerwünschten Enzyme innerhalb der Pilzzellen inaktivieren kann. Als andere Möglichkeit oder zusätzlich können (Ribo)nucleasen und/oder RNAsen bereitgestellt oder zugegeben werden, eher als sich nur auf die Enzyme innerhalb der Zellen zu verlassen.
Die bevorzugte RNA-Reduktionstechnik beinhaltet daher den Transfer der RNA vom Inneren zum Äußeren der Pilzzelle, zum Beispiel in die umgebende wässrige Flüssigkeit (z. B. die Brühe). Die Zellen können später von dieser wässrigen Flüssigkeit abgetrennt oder entfernt werden.
Wenn eine Hitzebehandlung zur RNA-Reduktion angewendet wird, können die Pilzzellen auf eine Temperatur von 40 bis 80°C, vorzugsweise von 50 bis 70°C, im besten Fall von 55 bis 65°C erhitzt werden. Das kann für eine Zeit von 20 bis 50 Minuten, vorzugsweise von 25 bis 40 Minuten, im besten Fall von 25 bis 35 Minuten geschehen. Die Temperatur der Hitzebehandlung, um die RNA-Reduktion zu ermöglichen, und die Länge der Zeit, in der diese Temperatur aufrecht erhalten wird, können wichtig sein. Wenn die Temperatur zu niedrig ist, kann das die Enzyme innerhalb der Zelle nicht aktivieren, die den RNA-Gehalt reduzieren werden. Wenn, in ähnlicher Weise, die Temperatur zu hoch ist, dann wird das zur Denaturierung oder auf andere Weise zur Inaktivierung solcher Enzyme führen. Daher muss eine Balance gefunden und eine Temperatur zwischen diesen zwei Extremen ausgewählt werden. Die Bedingungen sind also vorzugsweise so, dass die Enzyme innerhalb der Zelle aktiviert werden oder zugelassen wird, dass sie den RNA-Gehalt dieser Zellen reduzieren. Es kann nicht ausreichend sein, einfach die Temperatur von zum Beispiel 30 auf 100°C zu erhöhen, da sich auf diese Weise die Zellen nicht lange genug bei einer Zwischentemperatur befinden können, die es den Enzymen innerhalb der Zellen erlaubt, den RNA-Gehalt zu reduzieren. Daher wird in Abhängigkeit von dem fraglichen Organismus eine solche Temperatur und Zeit ausgewählt, dass eine RNA-Reduktion stattfindet: obwohl es frühere Offenbarungen hinsichtlich der Erhitzung von Pilzzellen gibt, können diese Bedingungen nicht geeignet sein, um eine RNA-Reduktion zu bewirken (da entweder die Temperatur oder die Zeit bei dieser Temperatur es den Enzymen innerhalb der Zellen nicht erlauben, den RNA-Gehalt zu reduzieren).
Ein anderes Verfahren des Entfernens von RNA ist es, die Pilzzellen einem sauren oder alkalischen pH-Wert auszusetzen. Wenn ein saurer pH-Wert bereitgestellt wird, kann dieser von 3 bis 4,5, wie von 3,5 bis 4,2 sein. Diese Säurebehandlung kann 15 bis 120 Minuten, wie 30 bis 60 Minuten dauern. Sie kann nötigenfalls mit einer Hitzebehandlung kombiniert werden, wie von 40 bis 60°C, wie von 50 bis 60°C. Geeignete Säuren schließen anorganische Säuren wie Salzsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und/oder Schwefelsäure ein. Anstelle von oder zusätzlich zu den erwähnten Verfahren kann auch ein Fungizid verwendet werden, um die Zellen abzutöten.
Wenn ein alkalischer pH-Wert bereitgestellt wird, kann dieser von einem pH von 8 bis 12, wie von 9 bis 11, im besten Fall von einem pH von 8 bis 10 sein. Das Alkali kann durch Ammoniak, Alkali- oder Erdalkalimetalloxide, -hydroxide oder -carbonate bereitgestellt werden. Die Behandlung mit Alkali kann für den gleichen Zeitraum sein wie für die Säurebehandlung angegeben und kann gegebenenfalls auch durch eine Hitzebehandlung begleitet werden, wie für die Säurebehandlung beschrieben. In einigen Fällen jedoch kann eine weniger angehobene Temperatur geeigneter sein, zum Beispiel von 40 bis 80°C, wie von 60 bis 70°C, im besten Fall von 62 bis 68°C.
Die Pilzzellen können sowohl einer Säure- als auch einer Alkalibehandlung unterzogen werden, von denen jede mit einer Hitzebehandlung kombiniert werden kann. Dennoch ist die RNA-Reduktion vorzugsweise ein Ein-Schritt-Verfahren. Die saure oder alkalische Lösung, die zur Kontaktierung der Pilzzellen verwendet wurde, kann verworfen, wieder verwendet oder wieder gewonnen werden.
Nötigenfalls kann dem Entfernen der RNA eine Pasteurisierung oder eine Hitzeschock-Behandlung folgen. Das kann besonders hohe Temperaturen, wie von 100 bis 150°C oder 40 bis 120°C, im besten Fall von 130 bis 140°C oder 40 bis 60°C beinhalten. Das kann nur 30 bis 200 Sekunden, wie von 80 bis 120 Sekunden dauern. Für die höheren Temperaturbereiche: es kann von 5 bis 120 Minuten sein, z. B. 20 bis 50 Minuten für die niedrigeren Temperaturen. Diese Hitzeschock-Behandlung kann nach der Säure- und/oder Alkalibehandlung bereitgestellt werden.
Somit kann Hitzebehandlung und/oder Pasteurisierung zusätzlich zu Erhitzen bei dem Entfernen der RNA durchgeführt werden. Dies kann notwendig sein, wenn das Entfernen der RNA nicht alle Zellen abtötet. In einer anderen Ausführungsform könnte man sich dieses Stadium als die Sterilisation oder die Inaktivierung von unerwünschten Proteinen oder Enzymen, wie zum Beispiel Proteasen, Lipasen, Amylasen, Phospholipasen und/oder Lipoxygenasen vorstellen. Dieser Schritt kann (wie bei der RNA-Reduktion) entweder durchgeführt werden, wenn sich die Pilzzellen noch in einer wässrigen Flüssigkeit (zum Beispiel in der Brühe, z. B. während sie noch im Fermentiergefäß sind) befinden oder (vorzugsweise) wenn sie einem oder mehreren Schritten des Entfernen des Wassers unterzogen wurden. In diesem Fall kann die Hitzebehandlung entweder den Wasser-Gehalt reduzieren und/oder die Pilzzellen wasserunlöslicher machen.
Was für Techniken zur Reduktion des RNA-Gehaltes auch immer angewendet werden, es ist wünschenswert, dass die Pilzzellen unversehrt oder ganz bleiben, in anderen Worten nicht lysiert werden. Die Zellen sollten also unversehrt, aber nicht lebendig sein (z. B. abgetötet oder nicht lebensfähig).
Die Pilzzellen besitzen nach der RNA-Reduktion einen RNA-Gehalt von unter 4,0% oder 2,0%, wie von 0,1 bis 2,0%, vorzugsweise von 0,5 bis 1,5%. Im besten Fall ist der RNA-Gehalt von 0,4 bis 0,8%. Diese Prozentangaben beruhen auf dem Trockengewicht der Zellen. Zellen mit einem reduzierten RNA-Gehalt können also einen Gehalt unter dem natürlich vorkommender oder dem der in dem Fermentationsverfahren verwendeten Pilze aufweisen (Stadium (a) des ersten Aspektes).
Das produzierte Protein kann in verschiedenen Teilen der Pilzzelle lokalisiert sein. Es kann bis zu 30%, wie bis zu 40% und im besten Fall bis zu 50% der Pilzzelle selbst ausmachen (basierend auf dem Trockengewicht). Das Pilzprotein kann sich innerhalb der Zelle (intrazellulär) oder innerhalb der Zellwand befinden. Das Erstere kann zwei verschiedene „Typen" von Proteinen einschließen, zum Beispiel Strukturproteine (diejenigen, die DNA; Ribosomen; Membranen usw. betreffen) und katalytische Proteine (zum Beispiel Enzyme). Zellwandproteine schließen nicht nur diejenigen ein, die innerhalb oder Teil der Zellwand sind, sondern können auch außerhalb der Zellwand, aber immer noch gebunden an die Zellwand sein. Dies steht im Gegensatz zu sekretierten (z. B. extrazellulären) Proteinen, die nicht an die Zelle gebunden sind und üblicherweise verworfen oder auf andere Weise während der Verarbeitung verloren werden. Das die Pilzzellen enthaltende Material kann dann nötigenfalls einem (weiteren) Schritt des Entfernen des Wassers oder einer Entwässerung unterzogen werden. Dies wird den Wasser-Gehalt vorzugsweise auf 50 bis 90%, wie auf 60 bis 85%, im besten Fall auf 75 bis 85% reduzieren. Dies kann nach einem oder mehreren Spül- oder Waschschritten (zum Beispiel mit Wasser, z. B. Wasser aus dem Hahn) geschehen. Das resultierende Material kann einen Gehalt an Trockenmasse von 10 bis 40%, vorzugsweise von 15 bis 35%, im besten Fall von 20 bis 30% aufweisen.
Die in diesem Stadium vorzugsweise entfernte Flüssigkeit enthält die RNA, RNA-Abbauprodukte oder irgendwelche anderen, unerwünschten Stoffe, die in den vorhergehenden Stadien der RNA-Reduktion oder der Erhitzung aus den Zellen entfernt oder von der inneren zur äußeren Seite der Zellen transferiert wurden. Die hier verwendeten Verfahren zum Entfernen des Wassers sind die gleichen wie die für den früheren, auf die Fermentation folgenden, optionalen Schritt des Entfernens beschriebenen. Jedoch wird in diesem Stadium eine Filtration, wie eine Vakuumfiltration, bevorzugt.
In diesem Stadium des Verfahrens kann man den proteinartigen Stoff produziert haben, der Gegenstand des dritten erfindungsgemäßen Aspektes ist. Er kann in der Form einer (z. B. wässrigen) Paste, einer Biomasse oder eines Filterkuchens vorliegen. Eine weitere Verarbeitung, besonders das Texturieren, zum Beispiel unter der Verwendung mechanischer Verfahren, kann dann durchgeführt werden, um das essbare (proteinartige), texturierte Produkt des vierten Aspektes zu produzieren. Andere Verarbeitungstechniken können chemische, physikalische und/oder enzymatische Behandlungen einschließen.
Zu dem Stoff des zweiten Aspektes kann man eine oder mehrere essbare Komponenten hinzugeben oder hinzumischen. Bevorzugte Komponenten schließen Hydrocolloide, zum Beispiel Pektin, Stärke, Carrageenan oder Alginat ein. Dies kann vor oder nach mechanischen Verarbeitungsschritten wie Mahlen, Zerkrümeln, Schneiden, Kneten und/oder Homogenisieren stattfinden.
Ebenfalls berücksichtigt werden Proteine, zum Beispiel Milchprotein wie Casein, Ovoprotein wie Eier-Albumin oder Eier selbst (Eigelb und/oder Eiweiß), pflanzliche Proteine wie Soja, oder Getreideproteine, wie Gluten, oder Enzyme (z. B. Proteasen, Phosphodiesterasen).
Andere essbare Bestandteile schließen Geschmacksverstärker wie Salz, Zucker, IMP und/oder GMP (obwohl in diesem Fall bevorzugt werden wird, dass die RNA-Menge die früher für die Pilzzellen erwähnte nicht übersteigt), Aromastoffe wie Gewürze, Kräuter, Proteine (z. B. von 2 bis 5% wie ein Milchprotein, z. B. Casein, ein pflanzliches Protein, ein Ovoprotein, z. B. Albumin), Hydrocolloide (z. B. von 5 bis 20% wie Pektin, Carageenan, Agar, Xanthan, Gellan, Galacturon- oder Mannuronsäure oder Salze davon), Mehl, Alginat (wie 0,2 bis 1,0%), essbare Polymere (z. B. Cellulose, Methylcellulose), gelierende Mittel (wie Eier-Albumin, Molkeprotein und Alginat), Polysaccharide (wie von 0 bis 10%, zum Beispiel Stärke oder Pektin), Färbemittel, Pflanzenmaterial wie Gemüse (Zwiebeln, Karotten, Soja, Erbsen, Bohnen oder Getreide wie Weizen, Hafer, Gerste) und Emulgatoren ein. Es kann auch fleisch-ähnliche Aromen, wie Aromen von Rind, Schwein oder Geflügel (Huhn oder Truthahn), oder andere nicht-Fleisch-Produkte einschließen. Zusätzliche Bestandteile können bereitgestellt werden, um den Geschmack (organoleptische Eigenschaften) und die Wasserbindung, die Fettbindung, die Emulgationseigenschaften, die Textur, das Volumen, die Viskosität, den Geschmack, das Aroma und/oder die Farbe (Farbstoffe, Carotinoide usw.) zu verbessern. Eier-Albumin kann eingeschlossen werden, um die Biegsamkeit und die Färbung zu verbessern oder als ein Bindemittel anderer Proteine. Eigelb kann für die Emulgation, Farbe oder Geschmack verwendet werden. Sojaprotein kann für die Wasserbindung und Fettbindung angewendet werden und, um die Textur zu verbessern. Gelatine kann eingeschlossen werden, um die Gelierung zu verbessern. Milchprotein oder Salze davon für die Wasserbindung und Fettbindung, Geschmack oder Textur und Weizen-Gluten für die Wasserbindung, Textur oder Geschmack. Das essbare proteinartige Produkt kann daher verwendet werden, um einen oder mehrere der folgenden Stoffe zu ersetzen oder zusätzlich zu diesen bereitgestellt zu werden: pflanzliche Proteine, Eiweiß, Gelatine, essbare, proteinartige, schäumende Mittel und Milchproteine. Faseriges Material kann ebenfalls eingeschlossen werden (z. B. Gemüse wie Zwiebeln).
Das Texturieren hat die Absicht, dem Produkt Textur zu vermitteln, sodass es eine fleischähnliche Textur aufweist und/oder sich im Mund ähnlich wie Fleisch anfühlt. Es kann also eine faserige oder fleischähnliche Erscheinung aufweisen.
Das Texturieren wird vorzugsweise durch eines oder mehrere mechanische Mittel erreicht. Diese schließen Mahlen, Zerkrümeln, Hacken, in Scheiben schneiden, Schneiden (z. B. in Stücke, Scheiben oder Lagen), Kneten, in Lagen schneiden, Rollen, in Schichten schneiden und/oder Pressen. Vorzugsweise führt das zu der Ausrichtung der Pilzproteine in Fasern, was helfen kann, um dem Produkt die Erscheinung von Fleisch zu geben.
Das Texturieren kann jedoch physikalische Verfahren, zum Beispiel Erhitzen und/oder Einfrieren, enthalten. Beide dieser Techniken können auch zu einem weiteren Entfernen des Wassers führen. Besonders das Einfrieren kann bei der Ausrichtung der Pilzzellen in eine faserige Erscheinung helfen.
Das mechanische Formen kann das Platzieren des Gemisches aus Pilzzellen und essbaren Bestandteilen in eine Gussform oder in einen anderen Behälter mit der gewünschten Form einschließen und anschließend das Kühlen (wie Einfrieren) und/oder Erhitzen (zum Beispiel 70 bis 100°C, um zum Beispiel Gelieren hervorzurufen) durch verschiedene Verfahren wie Dämpfen, Kochen und/oder Braten. Nötigenfalls kann Druck angewendet werden. Das Material kann dann von der Gussform oder dem Behälter entfernt werden und kann die Form dieses Behälters beibehalten.
Das geformte Produkt kann zum Beispiel die Form von Tieren, Vögeln oder Fischen, Buchstaben des Alphabets, Zahlen usw. aufweisen, was besonders für Nahrungsmittel für Kinder geeignet sein kann.
Das texturierte Produkt kann auch in der Form von getrocknetem Pulver vorliegen, welches in einem Nahrungsmittel enthalten sein kann, um das Gefühl im Mund oder die Viskosität zu verbessern.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren des Texturierens beinhaltet Granulierung, zum Beispiel um körnige Teilchen herzustellen. Vor jeglichem Texturieren können die kombinierten Pilzzellen und Pilzproteine einen durchschnittlichen Wasser-Gehalt von 15 bis 85% aufweisen. Nach dem Texturieren (z. B. Granulieren) können die resultierenden Granula einen durchschnittlichen Wasser-Gehalt von unter 30%, z. B. von weniger als 20%, im besten Fall von weniger als 10% aufweisen.
Granulierung wird vorzugsweise durch Pressen erreicht. Dies wird bevorzugt, da die Bedingungen des Pressens angepasst werden können, um das Aufbrechen der Pilzzellen zu minimieren. Das Pressen kann daher ohne Erhitzen, zum Beispiel bei 15 bis 85°C, durchgeführt werden. Während des Pressens können sich die Granula auf natürliche Weise bilden, indem sie unter ihrem eigenen Gewicht abfallen (durch die Schwerkraft von der Gussformplatte), oder man kann eine Schneidevorrichtung, wie eine rotierende Klinge, verwenden, um die langen „Spaghetti"-Stränge, die durch das Pressen produziert wurden, zu schneiden. Nach dem Pressen weisen die Granula vorzugsweise einen Wasser-Gehalt von weniger als 15%, wie weniger als 10%, und im besten Fall von 3 bis 7% auf. Die Granula können einen Durchmesser von 0,3 bis 10 mm, wie von 0,7 bis 5 mm, im besten Fall von 1 bis 3 mm haben.
Das Pressen kann also verwendet werden, um längliche, „Spaghetti"-ähnliche Produkte zu erzeugen (diese können zylindrisch und/oder mit einem runden Querschnitt sein), wenn sie durch eine geeignete Gussformplatte (z. B. mit runden oder quadratischen Löchern) passagiert wurden. Eine Erzeugung zum Beispiel in Schichten oder Lagen kann jedoch durch die Passage (z. B. durch Anwendung des Pressens) durch einen oder mehrere Schlitze erreicht werden. Diese Formen können auch durch die Verwendung von einer oder mehreren beweglichen Oberflächen, wie Walzen und/oder Zylindern, hergestellt werden. Diese können sich in die gleiche Richtung oder gegenläufig bewegen und es kann eine, zwei oder bis zu fünf solcher Oberflächen geben.
Das proteinartige Produkt kann daher in einer Vielzahl von Formen vorliegen. Zum Beispiel kann es in der Form von Stücken, zum Beispiel fleischähnlichen Stücken, von Teig, Schichten, Granula, Extrudat, Scheiben oder Lagen vorliegen. Diese Formen können getrocknet oder eingefroren sein. Das Produkt kann ohne oder mit zusätzlicher Verarbeitung in dem Nahrungsmittel enthalten sein. Es kann als Stücke in dem Nahrungsmittel erkennbar sein und kann die Erscheinung von Fleisch haben.
Sie können also in Nahrungsmitteln als Fleischersatz enthalten sein und betroffene Nahrungsmittel schließen Pies, Mikrowellenmahlzeiten, pikante Snacks, Würste, Pastetchen, Burger, Brotaufstriche, Pastete und getrocknetes Pulver (z. B. für Suppen) ein.
Das texturierte Produkt kann in der Form von Pellets oder Granula vorliegen und diese können auch getrocknet oder eingefroren sein. Sie können für eine Entwässerung vor dem Verbrauch angepasst werden. Diese Produkte können in Suppen oder Saucen enthalten sein. Das Produkt (z. B. Pellets oder Granula) kann in Burgern oder Würsten zum Beispiel mit einem (z. B. essbaren) Bindemittel enthalten sein. Ein geeignetes Wurstzubereitungsverfahren und eine Wurstherstellungsmaschine sind in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP99/02795, das am 26. April 1999 im Namen der Gist-brocades B.V. eingereicht wurde, beschrieben.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren der vorliegenden Erfindung kann daher umfassen:

1. das Fermentieren von Pilzzellen der Ordnung Mucorales, zum Beispiel in einer in einem Fermentiergefäß enthaltenen, wässrigen Flüssigkeit, wobei die Flüssigkeit assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthält. Die Flüssigkeit und die Zellen können gemischt und/oder belüftet werden und nötigenfalls kann eine Depelletierung durchgeführt werden;
2. gegebenenfalls das Entfernen des Wassers, zum Beispiel das Entfernen des Wassers von oder eines Teiles des Wassers von der wässrigen Flüssigkeit, vorzugsweise unter der Verwendung von mechanischen Techniken wie Filtration, Zentrifugation (z. B. ein- oder zweimal), Absetzen und/oder Trocknen;
3. das Reduzieren des RNA-Gehaltes der Pilzzellen, zum Beispiel durch physikalische, chemische und/oder enzymatische Behandlungen, aber vorzugsweise durch Hitzebehandlung (z. B. 60 bis 75°C für 25 bis 35 Minuten);
4. Hitzebehandlung, Pasteurisieren oder Abtöten der Zellen oder auf andere Weise (z. B. chemisch) die Inaktivierung unerwünschter Proteine oder Enzyme innerhalb der Pilzzellen;
5. gegebenenfalls das Entfernen des Wassers (z. B. wenn nicht in Punkt 2 durchgeführt), um den essbaren (z. B. proteinartigen) Stoff bereitzustellen;
6. die Zugabe von einem oder mehreren essbaren Bestandteilen zu den Pilzzellen (oder dem essbaren Stoff);
7. das Texturieren der Pilzzellen (entweder vor (z. B. Mahlen oder Zerkrümeln) oder nach (z. B. Kneten oder Pressen) der Zugabe des essbaren Bestandteils in Punkt 6), zum Beispiel unter der Anwendung von mechanischer Verarbeitung;
8. das Aussetzen der Pilzzellen gegenüber physikalischen Behandlungen wie Erhitzen (z. B. Kochen, Dämpfen, Braten) und/oder Einfrieren oder dem Entfernen des Wassers auf andere Weise;
9. gegebenenfalls vor oder nach Punkt 8 das Formen und/oder (nötigenfalls) das mechanische Verarbeiten auf andere Weise, um ein texturiertes Produkt zu erhalten; und
10. das Aufnahmen oder Verarbeiten des essbaren Produktes in ein Nahrungsmittel oder das Ergänzen des Nahrungsmittels mit dem Produkt.

Das Nahrungsmittel kann entweder ein texturiertes, essbares Produkt des vierten Aspektes oder eines, das durch ein Verfahren des dritten Aspektes herstellbar ist, enthalten. Wie zu erwarten sein wird, kann das Nahrungsmittel zusätzlich zu den Pilzzellen einen oder mehrere zusätzliche, essbare Bestandteile oder Zutaten enthalten. Diese können die gleichen sein, wie diejenigen, die vorstehend in Bezug auf das proteinartige Produkt beschrieben wurden.
Das texturierte Produkt kann in das Nahrungsmittel aufgenommen werden, so wie es ist, in anderen Worten es kann einfach verwendet werden, um ein bestehendes Nahrungsmittel zu ergänzen, oder es kann bei der Herstellung eines Nahrungsmittels verwendet werden. Es kann zunächst erhitzt werden, um einen besseren Geschmack zu generieren oder um das Produkt zu bräunen.
Bevorzugte Nahrungsmittel können Fertiggerichte oder Mikrowellenmahlzeiten, Burger, Pies, Pasteten, Würste und Suppen einschließen. Das Produkt kann als ein Ersatz für Fleisch wie Schwein, Rind, Geflügel, Wild, Schinken, Kalb oder sogar Fisch verwendet werden.
Diese Nahrungsmittel sind natürlich für den Verbrauch durch Menschen vorgesehen, obwohl Nahrungsmittel für Tiere, besonders Haustiere (wie Hunde und Katzen), wie Dosennahrungsmittel, oder Tiere auf dem Bauernhof (Schweine, Kühe, Schafe usw.), auch bedacht sind.
Andere Nahrungsmittel können als Bestandteile oder Zutaten aufgenommen werden, zum Beispiel Reis und Nudeln.
Bevorzugte Eigenschaften und Merkmale eines erfindungsgemäßen Aspektes sind für einen anderen Aspekt mit kleinen Abweichungen anwendbar.
Die Erfindung wird nun beispielhaft mit Bezug auf die begleitenden Beispiele beschrieben werden, die ausschließlich zum Zweck der Illustration bereitgestellt werden und nicht als einschränkend angesehen werden sollen.
BEISPIELE
Vergleichendes Beispiel 1: Auswahl geeigneter Mikroorganismen
Der Mikroorganismus muss die Güte eines Nahrungsmittels aufweisen und der Stoff sollte „wertvolle" Proteine enthalten. Die im Fleisch enthaltenen essentiellen Nährstoffe sollten vorzugsweise ebenfalls vorhanden sein. Die Morphologie/Struktur der Biomasse muss geeignet sein, um ein mit Mycoprotein angereichertes Produkt mit „Biss" und einer organoleptischen Wahrnehmung wie fleischähnliche Produkte herzustellen.
Die Beispiele zeigen, dass das Herstellen von Nahrung aus Mucorales-Pilzen machbar ist und dass die „primitiveren" Familien innerhalb der Ordnung Mucorales vorzuziehen sind.
Vorteile der Mucorales-Pilze schließen ein:

1. geringe oder nicht vorhandene Produktion von Mycotoxinen;
2. einfache und billige Herstellung von Biomasse: gutes Wachstum bis zu hohen Konzentrationen in klaren Medien (zusammengesetzt aus Salzen, einer gut definierten, komplexen N-Quelle und Glucose oder Oligosacchariden);
3. Aufarbeitungsverfahren sind annehmbar für Nahrungsmittel; und
4. gute Qualität des Endprodukts.

Schüttelkolbenexperimente
In Schüttelkolbenexperimenten wurden verschiedene Stämme, die zu der Mucorales-Familie der Choanephoraceae, Mucoraceae und Mortierellaceae gehören, getestet, um ihr Wachstum in einfachem und klarem Medium zu überprüfen.

Das Wachstum wurde in einigen, verschiedenen Medien, einschließlich der zwei halbdefinierten Medien getestet:

Verbindung	Konzentration
Hefeextrakt oder Pepton	5 g/kg
Glucose	30 g/kg
Kaliumphosphat	0,10 M
Animoniumsulfat	0,1 M
Magnesiumsulfat	1,25 mM
Zinksulfat	0,03 mM
Mangansulfat	0,2 mM
Eisenchlorid	0,09 mM
Kupfersulfat	0,03 mM

Die Bestandteile wurden in deionisiertem Wasser gelöst und für 20 Minuten bei 120°C sterilisiert: die Glucose wurde getrennt sterilisiert. Der pH-Wert nach der Sterilisation betrug 6,0.
Die Experimente wurden in Erlenmayerkolben (100/500 ml) durchgeführt. Das Beimpfen fand mit einer Sporensuspension statt, die frisch hergestellt wurde, indem die Stämme für einige Tage auf einer Malzagaroberfläche angezogen wurden, die Sporen von der Oberfläche abgespült und in einem Gefrierschrank gelagert wurden. Die Kolben wurden für 2 bis 4 Tage bei 25 bis 35°C auf einem Rundschüttler inkubiert (mit einem 2,5 cm- Ausstrich bei 250 U/min). Die folgenden Stämme wurden getestet:
Alle Stämme wuchsen innerhalb einiger Tage gut an, üblicherweise in einer gemischten Form von sowohl filamentösem Myzel als auch Pellets. In allen Fällen war es möglich, mindestens 5g Biomasse/Liter Brühe im Verlauf der Inkubation zu erhalten, was gemessen wurde, indem die Biomasse filtriert und nach dem Trocknen für 24 Stunden bei 105°C auf einem vorher gewogenen Filterpapier gewogen wurde. Das Vorhandensein von Pellets wurde visuell bestimmt.
Vergleichendes Beispiel 2: Fermenterexperimente
Als Teil des Scale-Up-Verfahrens wurden alle Stämme von Beispiel 1 Fermenterexperimenten im Labormaßstab unterzogen. Das Ziel war es, sie hinsichtlich ihres Wachstums in einfachen Medien, ihres Wachstums zu einer hohen Konzentration der Biomasse, die weitere Scale-Ups erlaubt, und ihres Wachstums in einer Form, die die Aufnahme in ein Nahrungsmittel erlaubt, getestet.
Der experimentelle Aufbau war wie folgt, beginnend mit der Herstellung des Animpfmaterials.

Die Sporensuspension wurde hergestellt wie in dem vorherigen Beispiel beschrieben. Mit dieser Sporensuspension wurde eine Animpfkultur gestartet, unter Verwendung eines auf Sojabohnenschrot basierenden Mediums, um das hyphale Wachstum zu fördern (Sojamehl 15 g/kg, Hefeextrakt 5 g/kg, KHP₂O₄ 1 g/kg und Glucose·H₂O 20 g/kg). Das Medium wurde für 45 Minuten bei 120°C in Erlenmayerkolben bei einem pH-Wert von 6 sterilisiert. Sobald das volle Wachstum erreicht wurde, wurde die Kultur in einen Laborfermenter transferiert, der Medium enthielt, das unter der Verwendung folgender Bestandteile hergestellt wurde:

Bestandteil	Konzentration (g/kg)
Hefeextrakt	1
Glucose	20
Ammoniumsulfat	6
Magnesiumsulfat·7H₂O	2
Calciumchlorid	0,5
Kaliummonophosphat	3
Zinksulfat·7H₂O	0,0144
Eisensulfat·7H₂O	0,15
Mangansulfat·1H₂O	0,0228
Kupfersulfat·5H₂O	0,0024
Cobaltsulfat·7H₂O	0,0038
Thiamin·HCl	0,004
Nikotinsäure	0,002

Alle Bestandteile wurden in deionisiertem Wasser gelöst und gemischt, außer die Glucose und das Phosphat, die getrennt hergestellt wurden. Der pH-Wert wurde unter der Verwendung von NaOH auf 6,0 oder 4,5 eingestellt und das Medium wurde im Fermenter für 45 Minuten bei 121°C in einem Autoklav sterilisiert. Die Glucose- und die Phosphatlösung wurden nach einer getrennten Sterilisation für 20 Minuten bei 120°C zugegeben, Erstere nach einer Ansäuerung mit Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 5.
Neben dem Batch-Medium wurde für eine Kohlehydratquelle, die aus Glucose in einer Konzentration von ca. 500 g/kg bestand, gesorgt. Die Herstellung war wie für die Glucoselösung des Batch-Mediums beschrieben.
Der Fermenter wurde mit Kontrollgeräten für Temperatur, pH-Wert und Schaum ausgestattet. Um den pH-Wert einzustellen wurden Ammoniak- und Schwefelsäurelösungen verwendet. Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs und die Zusammensetzung des freigesetzten Gases wurden gemessen. Die Kultur wurde unter der Verwendung von ca. 1 Volumen Luft pro Volumen Brühe pro Minute belüftet. Das Mischen war intensiv unter der Verwendung von Rushton-Turbinen und Schikanen. Die Glucosezufuhr wurde mit einer Geschwindigkeit von 1 bis 5 g Glucose/kg Brühe/Stunde angelegt und begann, als die Glucose-Konzentration in der Brühe auf eine Konzentration unter 5 g/kg gesunken war.
Zweimal jede 24 Stunden wurden zur Offline-Analyse der Konzentration des unverbrauchten Substrats, der Biomasse und der Nebenprodukte Proben genommen. Eine mikroskopische Untersuchung wurde ebenfalls durchgeführt.
Die folgenden Stämme, somit in Kolben für die Experimente in Fermentern im Labormaßstab getestet, wurden ausgewählt:
Rhizopus oryzae, Mortierella alpina, Blakeslea trispora, Gilbertella persicaria und Absidia pseudocylindrospora.
In allen Fällen häufte sich die Biomasse innerhalb einer Züchtung von 80 Stunden auf Konzentrationen von 20 bis 50 g/kg an.
Alle Stämme deuteten also ihr Potential an, zur Produktion von Biomasse in einem einfachen Medium und bei niedrigen Kosten bei einem Scale-up des Verfahrens befähigt zu sein.
Vergleichendes Beispiel 3: Analyse der Morphologie
Verschiedene Mikroorganismen wurden entsprechend der in Beispiel 1 angegebenen Verfahren in Schüttelkolben gezüchtet. Die Morphologie der Biomasse wurde durch lichtmikroskopische Verfahren untersucht. Die gefundenen Merkmale sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Morphologie des Mucorales-Organismus war unterschiedlich zu der der Fusarium-Art. TABELLE 1
Beispiele 4 und 5 und Vergleichendes Beispiel 6: Fermentation im Labormaßstab und Analyse der Biomasse
In Beispiel 4 wurden Fermenter im Labormaßstab verwendet, um drei Mikroorganismen (Absidia pseudocylindrospora, Gilbertella persicaria und Mortierella alpina) entsprechend der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren gezüchtet und die gleichen Bedingungen wurden angewendet, um Fusarium venenatum (Vergleichendes Beispiel 6) zu züchten.
In Beispiel 5 wurde Rhizopus oryzae im Produktionsmaßstab gezüchtet (für Details siehe Beispiel 8: ein Teil der Brühe wurde für die folgende Analyse verwendet).
Das folgende Zurückgewinnungsverfahren wurde verwendet, um zuerst einen Biomasse-Filterkuchen herzustellen:

– Zentrifugation und Waschen der Biomasse (um überschüssige Medienbestandteile wie Glucose zu entfernen);
– Hitzebehandlung bei 65°C, um die enzymatische Aktivität und RNA zu reduzieren;
– Hitzebehandlung bei 90°C, um die Brühe zu pasteurisieren;
– Filtration durch eine Laborfilterpresse, einschließlich Waschen mit Wasser aus dem Hahn; und
– Verpacken und Lagerung.

Zentrifugation: Portionen von 1 Liter der Biomasse wurden in einer Beckmann-Zentrifuge (Typ J-6M/E) für 5 Minuten bei 5000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde umgefüllt und verworfen. Das Pellet wurde in Wasser aus dem Hahn resuspendiert und wiederum zentrifugiert. Der Überstand wurde wieder umgefüllt. Das Pellet wurde in Wasser aus dem Hahn resuspendiert.
Hitzebehandlung (Reduktion der RNA): die Brühe wurde auf 65°C erhitzt und für 30 Minuten bei dieser Temperatur gehalten.
Hitzebehandlung (zur Abtötung der Enzyme): die Brühe wurde weiter auf 90°C erhitzt und für 30 Minuten bei dieser Temperatur gehalten.
Filtration: die erhitzte Brühe wurde durch eine 2-Liter-Filterpresse (Typ Seitz Enzinger Noll, Deutschland), versehen mit einem Polypropylenfiltertuch, bei einem Anfangsdruck von 50 KPa (0,5 bar) filtriert.
Der resultierende Kuchen wurde mit dem 10-fachen Kuchen-Volumen an Wasser aus dem Hahn gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Kuchen mit Luft bei 200 KPa (2 bar) für 15 Minuten trocken geblasen. Der Kuchen wurde für die weitere Behandlung gesammelt. Der Kuchen wurde hinsichtlich seiner Trockenmasse, RNA, Rohprotein (Kjeldahl-N) und Fettes analysiert. Die aus der Analyse resultierenden Daten sind in den Tabellen 2 und 3 angegeben. TABELLE 2
TABELLE 3 (berechnet auf Trockenmasse)
Beispiel 7: Herstellung in der Versuchsanlage
Fermentationen des in Beispiel 2 verwendeten Rhizopus oryzae-Stammes wurden im Maßstab von den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen auf Fermenter der Versuchsanlage mit einem Arbeitsvolumen von 3 m³ vergrößert. Nach der Fermentation wurde die Brühe auf 5–10°C gekühlt und geerntet.
Ein Teil der Brühe (100 Liter) würde nach der Verdünnung mit Wasser aus dem Hahn auf 500 Liter in einem Westfalia NA7-Abscheider zentrifugiert. Die Zentrifuge war mit 4 Düsen versehen, jede mit einem Durchmesser von 1 mm. Zwei Flüssigkeitsströme wurden erhalten. Der Überstand (400 Liter) wurde verworfen und ein konzentrierter Strom, der die Biomasse (Pilzzellen) enthielt, blieb zurück. Das Konzentrat wurde mit einer 100 mM K₂HP₂O₄-Lösung auf das ursprüngliche Volumen verdünnt.
Das Gemisch wurde wiederum zentrifugiert und der Überstand verworfen.
Die gewaschene, konzentrierte Biomasse wurde dann für 30 Minuten auf 65°C erhitzt. Die konzentrierte Biomasse wurde weiter auf 90–95°C erhitzt und für 30 Minuten bei dieser Temperatur gehalten.
Ein Teil der resultierenden Brühe (1,35 m³) wurde in einer Schule-Membranfilterpresse mit einer Filtrationsfläche von 6 m² und einem Druck von 30–200 KPa (0,3–2 bar) gefiltert. Der erhaltene Filterkuchen wurde mit kaltem Wasser aus dem Hahn (5– 10°C) gewaschen. Der Filterkuchen wurde bei einem Druck von 600 KPa (6 bar) durch die Membranen gepresst. Dies resultierte in einem Filterkuchen von 73 kg mit einer Trockenmasse von 24,8%.
Beispiel 8A: Herstellung der essbaren Biomasse
Drei Produktionsfermentationen des in Beispiel 2 verwendeten Rhizopus oryzae-Stammes wurden in einem Standard-Produktionsfermenter mit einem Arbeitsvolumen von 30 m³ durchgeführt. Der Fermenter hatte eine pH-Kontrolle, eine Rushton-Turbine mit einstellbarer Geschwindigkeit, Luftzufuhr, Schaumkontrolle und Temperaturkontrolle. Bei der Ernte wurde der Produktionsorganismus abgetötet und der RNA-Gehalt reduziert, indem die Biomasse mit einem direkten Strom in Anwesenheit von 1 g/l Benzoesäure bei einem pH-Wert von 4,5–5,0 auf 50–55°C erhitzt wurde. Nach dem Erreichen von 50–55°C wurde die Brühe auf unter 20°C abgekühlt. Die Brühe wurde in ein anderes Gefäß transferiert, mit kaltem Wasser aus dem Hahn verdünnt und weiter auf 4–6°C gekühlt. Die gekühlte Brühe wurde dann durch eine Schenk-Membranfilterpresse mit einem Arbeitsvolumen des Kuchens von 2,5 m³ gefiltert und der Kuchen mit 20 m³ kaltem Wasser aus dem Hahn gewaschen. Der Kuchen wurde durch die Anwendung von unter Druck stehendem Wasser in einem Membransystem (400 bis 900 KPa (4–9 bar)) gepresst. Der Kuchen wurde aus der Filterpresse entlassen und ein Teil davon wurde zerkrümelt, in Säcke verpackt und in einem Kältelager bei –15 bis –20°C eingefroren. Ein Teil der gefrorenen Biomasse wurde in Partikel mit einer Größe von 1–3mm geschnitten und zwei oder drei Proben von jeder der drei Fermentationen wurden für die folgende Analyse (Tabelle 4) verwendet. TABELLE 4
Die Proben wurden weiterhin chemisch analysiert (hinsichtlich RNA, Rohprotein (als Kjeldahl-N), Fett, Mycotoxine und andere Bestandteile) und ergaben die folgenden Ergebnisse (Tabelle 5). TABELLE 5

nd: nicht bestimmt

Beispiel 8B: Getrocknete Biomasse
Die verbliebene, in Partikel geschnittene Biomasse für Beispiel 8A wurde in Portionen von 30–50 kg in einem Aeromatic T4-Flüssigbetttrockner mit einer Bodenplattenfläche von 0,26 m² durch Trockenluft mit einer Temperatur von 55–65°C getrocknet. Das Trocknen endete bei einer Betttemperatur von 38–40°C. Proben der getrockneten Biomasse hatten die folgenden Gehalte an Trockenmasse (Tabelle 8). TABELLE 7
Beispiele 9A, 9B und 9C: Schichtung, Stapelung, Rollen
Der Filterkuchen von Beispiel 8A wurde durch einen Lödige-Hochschermixer für 5 Minuten in Portionen von etwa 25 kg gemahlen und zerkrümelt. Zu dem zerkrümelten Kuchen wurde 1 kg Eier-Albumin (Beispiel 9A) gegeben und das Gemisch geknetet. Das Verfahren wurde mit etwas Wasser und Gewürzen wiederholt, die zuerst mit dem Eier-Albumin gemischt worden waren (Beispiel 9B).
Das Gemisch wurde durch eine Walze in Schichten von 1 mm geformt.
Die Schichten wurden in einem belüfteten Ofen oder Röhre auf 80°C erhitzt. Die Schichten wurden gestapelt und in der Form einer „Swiss roll" gerollt und die Rolle wurde unter Verwendung von flüssigem Kohlendioxid bei –20°C eingefroren.
Das gleiche Verfahren wurde wiederholt, außer dass das Eier-Albumin durch 1 kg Pektin ersetzt wurde (Beispiel 9C).
Beispiele 10A bis D: Burger
Zu der Biomasse von den Beispielen 8A und 8B wurden Farbzusätze und geschmacksverstärkende Produkte (Gewürze, Gemüse und Zwiebeln) hinzugegeben. Das Gemisch wurde anschließend in einem Knetrührer homogenisiert und das homogenisierte Gemisch in Burger geformt, pasteurisiert und verpackt. Beide Prozeduren wurden mit Eier-Albumin wiederholt, das zuerst mit den Geschmacksverstärkern gemischt wurde.
Beispiele 11A bis D: Würste
Zu der Biomasse von den Beispielen 8A und 8B wurden Farbzusätze, Gewürze und Gemüse (Zwiebeln) hinzugegeben. Das Gemisch wurde in einem Knetrührer homogenisiert. Das homogenisierte Gemisch wurde in ein durchgehendes Rohr gepresst (sodass es das Innere der Würste bildete), wobei gleichzeitig ein (vegetarisches) eine Haut erzeugendes Material unter der Verwendung eines Wurstherstellungssystems (Stork) hineingepresst wurde, um Würste herzustellen. Beide Prozeduren wurden mit Eier-Albumin wiederholt, das zuerst mit den Farbzusätzen und Gewürzen gemischt wurde.
Beispiele 12A und B: Granula
Der Filterkuchen von Beispiel 8A wurde durch einen Lödige-Hochschermixer für 5 Minuten in Portionen von etwa 25 kg gemahlen und zerkrümelt. Zu dem zerkrümelten Kuchen wurde 1 kg Eier-Albumin gegeben und das Gemisch geknetet. Das geknetete Gemisch wurde mit einer Einzelschraubenpresse durch eine Gussformplatte mit Löchern von 1 mm gepresst. Das Extrudat wurde durch ein Band transportiert und in einem gefluteten Betttrockner (Lufttemperatur von 50°C) getrocknet, um Granula zu erzeugen. Für das Beispiel 12B wurde Pektin in der gleichen Menge anstelle von Eier-Albumin verwendet.
Beispiele 13A bis D: Burger
Eine Ladung von 25 kg des getrockneten Extrudats von jedem der Beispiele 12A und 12B wurde mit 60 kg Wasser aus dem Hahn vermischt. Zu diesem Gemisch wurden die in Beispiel 10 verwendeten Nahrungsmittelzusätze (mit und ohne Eier-Albumin) hinzugegeben und das Gemisch geknetet und in Burger geformt, pasteurisiert, verpackt und eingefroren.
Beispiele 14A bis D: Würste
Eine Ladung von 25 kg des getrockneten Extrudats von jedem der Beispiele 12A und 12B wurde mit 60 kg Wasser aus dem Hahn vermischt. Zu diesem Gemisch wurden die in Beispiel 11 verwendeten Nahrungsmittelzusätze (mit und ohne Eier-Albumin) hinzugegeben und das Gemisch in Würste verarbeitet, wie in Beispiel 11 beschrieben.
Beispiele 15A und B: Burger
Zu der Biomasse (25 kg) von jedem der Beispiele 8A und 8B wurden Farbzusätze und geschmacksverstärkende Produkte (Gewürze, Gemüse, Zwiebeln) hinzugegeben. Zu dem Gemisch wurden 1 kg pflanzliche Fasern (Cellulosefasern mit einer durchschnittlichen Faserlänge von 300–1000 μm) hinzugegeben und in einem Knetrührer homogenisiert. Das homogenisierte Gemisch wurde in Burger geformt, verpackt, pasteurisiert und eingefroren.
Beispiele 16A und B: Würste
Zu der Biomasse (25 kg) von jedem der Beispiele 8A und 8B wurden Farbzusätze, Gewürze, Gemüse und Zwiebeln hinzugegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 1 kg pflanzliche Fasern (Cellulosefasern mit einer durchschnittlichen Faserlänge von 300–1000 μm) hinzugegeben und in einem Knetrührer homogenisiert. Das homogenisierte Gemisch wurde durch Pressen in Würste geformt, bei gleichzeitigem Pressen einer vegetarischen Haut, wie in Beispiel 11 beschrieben.
Beispiele 17A und B: Granula für Suppen
Der Filterkuchen von Beispiel 8A und B wurde durch einen Lödige-Hochschermixer für 5 Minuten in Portionen von etwa 25 kg gemahlen und zerkrümelt. Zu dem zerkrümelten Kuchen wurde ein Gemisch von 1 kg Eier-Albumin und 1 kg pflanzliche Fasern (Cellulosefasern mit einer durchschnittlichen Faserlänge von 300–1000 μm) gegeben. Das Gemisch wurde geknetet und dann mit einer Einzelschraubenpresse durch eine Gussformplatte mit Löchern von 1 mm gepresst. Das Extrudat wurde durch ein Band transportiert und in einem gefluteten Betttrockner (Lufttemperatur von 65 bis 80°C) getrocknet, um Granula zu erzeugen. Diese wurden anschließend einer Suppe zugegeben und getrocknet, um Suppenpulver zu erzeugen (das nach Rehydration Suppe produziert).
Beispiele 18A und B: Burger
Eine Ladung von 25 kg des getrockneten Extrudats von den Beispielen 17A und B wurde mit 60 kg Wasser aus dem Hahn gemischt. Zu dem Gemisch wurden die in Beispiel 15 beschriebenen Nahrungsmittelzusätze gegeben und das Gemisch geknetet und verwendet, um, wie in Beispiel 15 beschrieben, Burger herzustellen.
Beispiele 19A und B: Würste
Eine Ladung von 25 kg des getrockneten Extrudats von den Beispielen 17A und B wurde mit 60 kg Wasser aus dem Hahn gemischt. Zu dem Gemisch wurden die in Beispiel 16 beschriebenen Zutaten gegeben, das Gemisch geknetet und verwendet, um, wie in Beispiel 16 beschrieben, Würste herzustellen.
Beispiel 20 bis 35 und Verbleichende Beispiele 36 bis 38: Pasteten Würste und Miniburger
Durch das Mischen und Schneiden der in den Beispielen 4 und 5 hergestellten Biomasse in einem Nahrungsverarbeiter im Labormaßstab (Braun Combi Typ 700) wurde ein Teig hergestellt. Wasser und verschiedene essbare Zutaten (Mengen nachstehend angegeben) wurden zugegeben und in dem Nahrungsverarbeiter in die Biomasse gemischt. Der Teig wurde in Formen gegeben (Pasteten oder Burger) oder verwendet, um Häute zu füllen (Würste).
Der geformte Teig wurde auf 80°C (Temperatur im Teiginneren) entweder durch Dämpfen (Pasteten), Kochen im Wasserbad (Würste) oder Braten (Miniburger) erhitzt. Die Produkte wurden für 2 Stunden auf 4–7°C gekühlt und dann für eine Woche bei –20°C in einem Gefrierschrank bewahrt.
Die folgenden Teigformulierungen wurden hergestellt (Angaben in Gramm). TABELLE 8
In einigen Fällen wurde zusätzlich Pektin zugegeben:
Pasteten: Mortierella, 1,5 g pro 101 g Teig;
Würste: Mortierella, 1,5 g pro 101 g Teig; und
Burger: Mortierella, 2,5 g pro 102 g Teig.
Verschiedene physikalische Eigenschaften wurden bewertet und sind in den Tabellen 9 bis 11 gezeigt. Die Rhizopus oryzae-Nahrungsmittel wurden als Basislinie verwendet (daher sind die Werte Null) und die anderen Nahrungsmittel im Vergleich dazu bewertet (+ bedeutet mehr, – bedeutet weniger). Für die Körnigkeit bedeutet + körniger (d. h. weniger faserig). Pasteten: Beispiele 20 bis 25 TABELLE 9
Würste: Beispiele 26 bis 30 TABELLE 10
Miniburger: Beispiele 31 bis 35 TABELLE 11
Wie es offensichtlich ist, können verschiedene Nahrungsmittel mit variierenden Texturen unter der Verwendung anderer Mikroorganismen als die der Mucorales-Gruppe hergestellt werden. Zum Vergleich wurden eine Pastete, eine Wurst und ein Miniburger unter Verwendung des gleichen Rezeptes wie vorstehend, aber unter der Verwendung von Fusarium graminearum-Biomasse, hergestellt. Alle drei Produkte wiesen eine schwarze Farbe auf.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines essbaren, proteinartigen Stoffes, geeignet zur Verwendung als Nahrungsmittel, umfassend Pilzzellen, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Fermentieren von Pilzzellen der Ordnung Mucorales in einer wässrigen Flüssigkeit in einem Fermentiergefäß, wobei die Flüssigkeit eine assimilierbare Stickstoff(N)-Quelle und eine assimilierbare Kohlenstoff(C)-Quelle umfasst, und Mischen der Flüssigkeit und der Zellen während der Fermentation; (b) Reduzieren des RNA-Gehalts der Pilzzellen auf unter 4,0 Gew.-%; (c) vor oder nach Schritt (b): Entfernen zumindest eines Teils des Wassers aus dem Gemisch von Pilzzellen und wässriger Flüssigkeit; und (d) Verarbeiten der Pilzzellen zu einem essbaren Stoff.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Flüssigkeit und der Fermenten kein unlösliches Substrat (für die Zellen) besitzen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Pilzzellen mindestens 60% des proteinartigen Stoffes (auf Trockenmassebasis) ausmachen oder die Pilzzellen mindestens 70% des Stoffes ausmachen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Pilzzellen von den Gattungen Rhizopus oder Gilbertella stammen.
Essbarer proteinartiger Stoff, geeignet zur Verwendung in einem Nahrungsmittel, umfassend Pilzzellen der Ordnung Mucorales mit einem RNA-Gehalt unter 4,0 Gew.-%.
Essbarer Stoff nach Anspruch 5, welcher herstellbar ist mit Hilfe eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Essbarer Stoff nach Anspruch 5 oder 6, welcher eine (fakultativ gemahlene und/oder zerkrümelte) Biomasse oder Filterkuchen ist.
Verfahren zur Herstellung eines essbaren texturierten Produktes, umfassend das Mischen einer oder mehrerer essbarer Komponenten mit einem essbaren proteinartigen Stoff, umfassend Pilzzellen der Ordnung Mucorales mit einem RNA-Gehalt unter 4,0 Gew.-%, und mechanisches Texturieren der Mischung.
Verfahren zur Herstellung eines essbaren texturierten Produktes, umfassend das Mischen einer oder mehrerer essbarer Komponenten mit einem essbaren proteinartigen Stoff, umfassend Pilzzellen der Ordnung Mucorales mit einem RNA-Gehalt unter 4,0 Gew.-%, und Texturieren, um ein Produkt zu erzeugen, von dem mindestens 5% (auf einer Trockenmassegewichtsbasis) Pilzzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei der proteinartige Stoff ein Stoff nach Anspruch 5 oder 6 ist, oder durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 herstellbar ist.
Essbares texturiertes Produkt, geeignet zur Verwendung in einem Nahrungsmittel, wobei mindestens 40 Gew.-% (auf einer Trockenmassegewichtsbasis) Pilzzellen der Ordnung Mucorales sind, mit einem RNA-Gehalt unter 4,0%.
Produkt nach Anspruch 11, welches Pellets, Granula oder ein Blatt umfasst, oder ein Extrudat, ein Teig, eine Rolle, eine Paste oder ein fleischähnliches Stück ist.
Texturiertes Produkt nach Anspruch 11 oder 12, welches herstellbar ist gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10.
Verfahren zur Herstellung eines Nahrungsmittels, umfassend das Erzeugen eines Nahrungsmittels mit, oder Einbringen in ein schon existierendes Nahrungsmittel, einem/eines essbaren Stoff/Stoffes nach einem der Ansprüche 5 bis 7 oder einem/eines texturierten Produkt/Produkts gemäß Anspruch 11, 12 oder 13.
Nahrungsmittel, umfassend entweder einen proteinartigen Stoff nach einem der Ansprüche 5 bis 7 oder ein essbares Produkt nach einem der Ansprüche 11 bis 13 oder herstellbar durch ein Verfahren nach Anspruch 14.
Nahrungsmittel nach Anspruch 15, welches eine Wurst, ein Pastetchen, ein Burgen, ein Brotaufstrich, eine Pastete, ein Tierfutter, eine Tafel, eine Pie, ein pikanter Snack oder eine ofenfertige Mahlzeit ist.