MXPA05001601A - Metodos y composiciones para mejorar el crecimiento de aves de corral para consumo de carne. - Google Patents

Abstract

La presente invencion provee metodos para mejorar el rendimiento de crecimiento, mejorar la eficacia de la utilizacion del alimento, incrementar la capacidad de digestion del alimento, y disminuir la mortalidad de animales inmaduros y en desarrollo que reciben alimento animal; tambien se proveen metodos para producir un extracto crudo de enzima de queralinasa y suplementos alimenticios de animal para lograr lo mismo.

Description

METODOS Y COMPOSICIONES PARA MEJORAR EL CRECIMIENTO DE AVES DE CORRAL PARA CONSUMO DE CARNE REFERENCIA RECIPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. número de serie 60/402,228, presentada en agosto 9 de 2002, cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente como referencia.

DECLARACION DE APOYO FEDERAL La investigación dirigida a esta invención es apoyada en parte por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (US Department of Agricultura), Small Business Innovation Research, concesión No. 2002-33610-11850. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a métodos para mejorar la eficacia de crecimiento de animales inmaduros y en desarrollo que reciben pienso y complementos del pienso para lograr la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las dietas de inicio para pollos tiernos contienen una cantidad considerable de proteína cruda. La mayor parte de la proteína cruda se obtiene de ingredientes alimenticios tradicionales tales como la harina de soya. Aproximadamente 90% de la proteína cruda presente en la harina de soya (contenido de proteína cruda de 48%) es altamente digerible para las aves de corral (National Research Council (1994). Nutrient requirements of poultry, novena edición revisada, National Academy Press, Washington, DC). Aunque se considera que las dietas de inicio de harina de soya-maíz tradicionales para pollos tiernos son altamente digeribles, contienen con frecuencia una variedad de proteínas complejas que no son fácilmente digeridas por un pollo joven debido a la falta de enzimas innatas necesarias en las primeras etapas de vida (Uni, et al. (1999) Poultry Sci. 78: 215-222). Se ha sugerido la inclusión de proteasas en las dietas para pollos tiernos, pero muchos de los primeros trabajos sobre la adición de proteasas a las dietas basadas en cereales, no produjeron mejora alguna en el rendimiento de las aves (Jensen, et al. (1957) Poultry Sci. 36: 919-21 ). Más recientemente, la complementación de las dietas para aves de corral con mezclas de enzimas, incluyendo proteasas y amilasas, ha producido algunas mejoras en la eficacia de crecimiento (Greenwood, et al. (2002) Poultry Sci. 81 (Supl. 1 ): 25; Burrows, et al. (2002) Poultry Sci. 81 (Supl. 1): 29; Short, et al. (2002) Poultry Sci. 81 (Supl. 1): 136). La complementación de una dieta de inicio de soya-maíz para pollos tiernos con una preparación de enzimas que contiene una mezcla de xilanasa, proteasa y amilasa, dio como resultado mejoras en el peso corporal a 14 y 42 días de nacidas las aves, sin efectos significativos sobre la relación de conversión de alimento (Greenwood, et al. (2002), citado anteriormente). Después de la complementación de dietas para patos basadas en soya-maíz con la misma mezcla de enzimas, la complementación con enzimas resultó en mejoras en aumento de peso corporal y relación de conversión de alimento (Burrows, et al. (2002), citado anteriormente). El pienso avícola contiene además algunos compuestos antinutricionales y/o indigestibles complejos. Algunos de estos compuestos, tales como polisacáridos libres de almidón, absorben agua en una masa viscosa dentro del quimo del cual los nutrientes no son fácilmente absorbidos (Odetallah, 2000; Odetallah, et al. (2002), citado anteriormente). Conforme la viscosidad del quimo aumenta, la velocidad de difusión de nutrientes y enzimas digestivas disminuye, impidiendo de esta manera la absorción de nutrientes por el enterocito. La absorción y formación de micelas de grasa disminuye también conforme aumenta la viscosidad del quimo, deteriorando de esta manera la absorción de muchos de los compuestos liposolubles, incluyendo vitaminas liposolubles, pigmentos y lípidos (Ferket y Veldkamp (1999) en: Proceedings of the 1998 World Poultry Science Association, páginas 43-52). Por lo tanto, la reducción de viscosidad lograda por la actividad de las enzimas endolíticas puede desempeñar una función en la mejora vista en pollos jóvenes alimentados con cereales de alta viscosidad, y la eficacia relativa de varias enzimas parece estar relacionada con su capacidad para reducir la viscosidad (Rotter, et al. (1990) J. Sci. Food Agrie. 50: 19-27). La PWD-1 queratinasa es una enzima que se purificó originalmente del medio de crecimiento de la cepa PWD-1 de Bacillus licheniformis (Williams, et al. (1990) Appl. Environ. Microbiol. 56: 1509-1515; Lin, et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58: 3271-3275). La PWD-1 queratinasa hidroliza una amplia gama de substratos de proteína que incluyen caseína, colágena, elastina y queratina (Shih (2001 ) en: Proceedings International Conference of Agricultural Science and Technology, Beijing, China, págs. 244-247). La PWD-1 queratinasa se ha usado para producir harina de plumas hidrolizada incubando harina de plumas comercial con queratinasa libre de células durante la noche (Cárter (1998) Bacterial Keratinase: Assay development and nutritional application, tesis doctoral, North Carolina State University, Raleigh, NC). Véase también las patentes de E.U.A. Nos. 4,908,220; 5,186,961 ; y 5,063,161 a Shih et al. A pesar de lo anterior, existe la necesidad de otros métodos para intensificar la eficacia de crecimiento de pollos tiernos, y complementos del pienso que logren el mismo.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee métodos y composiciones que intensifican la eficacia de crecimiento de animales inmaduros y en desarrollo que reciben pienso. Un aspecto de la invención se refiere a un método para criar aves de corral para consumo de carne, el cual comprende alimentar a aves de corral para consumo de carne con un alimento de harina de soya-maíz como una dieta para aves de corral, en donde el alimento comprende además queratinasa en una cantidad efectiva para intensificar el aumento de peso de aves de corral para consumo de carne. Otro aspecto de la invención se refiere a un método para criar aves de corral para consumo de carne, el cual comprende alimentar a aves de corral para consumo de carne con un alimento de harina de soya-maíz como una dieta de inicio, en donde el alimento comprende además queratinasa en una cantidad efectiva para intensificar el aumento de peso de las aves de corral para consumo de carne. Otro aspecto de la invención se refiere a un método para mejorar la eficiencia de uso del alimento como un pienso en aves de corral para consumo de carne, el cual comprende alimentar a aves de corral para consumo de carne con un alimento de harina de soya-maíz como una dieta para aves de corral, en donde el alimento comprende además queratinasa en una cantidad efectiva para mejorar la eficiencia de uso del alimento como un pienso en aves de corral para consumo de carne. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para incrementar la digestibilidad de un pienso en aves de corral para consumo de carne, el cual comprende alimentar a aves de corral para consumo de carne con un alimento de harina de soya-maíz como una dieta para aves de corral, en donde el alimento comprende además queratinasa en una cantidad efectiva para incrementar la digestibilidad de un pienso en aves de corral para consumo de carne. Otro aspecto de la invención se refiere a un método para reducir la mortalidad en aves de corral para consumo de carne, el cual comprende alimentar a aves de corral para consumo de carne con un alimento de harina de soya-maíz como una dieta de inicio, en donde el alimento comprende además queratinasa en una cantidad efectiva para reducir ia mortalidad de aves de corral para consumo de carne. Otro aspecto de la invención se refiere a un pienso que consiste esencialmente de queratinasa, proteína y carbohidrato. Otro aspecto de la invención se refiere a un método para producir extracto crudo de enzima queratinasa. La presente invención se refiere además a mejorar el estado nutricional de un polluelo, y aumentar de esta manera la resistencia a enfermedades y la supervivencia del ave inmadura para lograr un mayor nivel de eficacia de crecimiento en aves de corral para consumo de carne.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Lo anterior y otros aspectos de la presente invención, se describirán ahora en más detalle con respecto a otras modalidades descritas en la presente. Debe apreciarse que la invención puede describirse en formas diferentes, y no debe considerarse que se limita a las modalidades expuestas en la presente. Más bien, estas modalidades se proveen de modo que esta descripción sea completa y exhaustiva, y lleve completamente el alcance de la invención a los expertos en la técnica. La terminología usada en la descripción de la invención en la presente es con el propósito de describir sólo modalidades particulares, y no se pretende que limite la invención. Como se usa en la descripción de la invención y en las reivindicaciones anexas, se pretende que las formas singulares "un", "una" y "la" incluyan también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones, solicitudes de patente de E.U.A., patentes de E.U.A. y otras referencias citadas en la presente, se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Como se usa en la presente, el término "aves de corral para consumo de carne" se refiere a cualquier especie de ave que se produzca o se use para consumo de carne como lo entienden los expertos en la técnica. Ejemplos de dichas especies de ave incluyen, pero no están limitados a, pollos, pavos, patos, gansos, codorniz, faisán, rátidas, y similares. Como se usa en la presente, el término "ave inmadura" se refiere a un miembro de las especies de aves que carece de crecimiento, diferenciación o desarrollo completo. Dichos miembros pueden tener la capacidad potencial de lograr una forma o estado maduro definido. Un ave inmadura puede tener de alrededor de 1 a aproximadamente 50 días, de preferencia de alrededor de 1 a aproximadamente 21 días, y más preferiblemente de alrededor de 1 a aproximadamente 5 días, o puede tener un peso corporal comparable al de las aves dentro de estas escalas. Como se usa en la presente, el término "ave en desarrollo" se refiere a un miembro de las especies de aves que tiene más edad o pesa más que un ave inmadura.

Como se usa en la presente, el término "ave madura" se refiere a un miembro de las especies de aves que tiene más edad o pesa más que un ave en desarrollo. Como se usa en la presente, el término "pollo tierno" se refiere a cualquier pollo inmaduro producido o usado finalmente para consumo de carne. Como se usa en la presente, el término "dieta para aves de corral" se refiere a una dieta que puede administrarse a un miembro de las especies de aves para promover y mantener el crecimiento del ave. Una dieta para aves de corral puede contener fuentes de proteína, vitaminas, minerales, energía tales como grasa, carbohidratos y proteína adicional, antibióticos y otras sustancias o compuestos que se sabe se incluyen en piensos, en particular piensos avícolas. La dieta para aves de corral incluye, pero no está limitada, una dieta de inicio, una dieta tipo producción y una dieta tipo terminación. Una "dieta de inicio" se refiere a una dieta que puede administrarse a un animal partiendo del nacimiento o la salida del cascarón hasta que se obtenga una edad y/o peso deseado. Una "dieta tipo producción" se refiere a una dieta que puede administrarse a un animal después de concluir la fase de crecimiento inicial. Una "dieta tipo terminación" se refiere a una dieta que puede administrarse a un animal durante el período de desarrollo a través del tiempo de matanza. Como se usa en la presente, los términos "crecimiento" o "eficacia de crecimiento" se refieren a incrementos en cualquiera de peso y edad (por ejemplo, altura, ancho, diámetro, circunferencia, etc.), o ambos, sobre los que ocurrirían de otra manera sin la implementación de los métodos y/o la administración de las composiciones de la presente invención. El crecimiento puede referirse a un incremento en la masa (por ejemplo, peso o tamaño) del animal completo o de un tejido particular (por ejemplo, tejido muscular en general o un músculo específico). En forma alternativa, el crecimiento puede indicar un incremento relativo en la masa de un tejido en relación a otro, en particular, un incremento en tejido muscular respecto a otros tejidos (por ejemplo, tejido adiposo). El crecimiento se refiere además al estado nutricional y la resistencia a enfermedades, en donde la mejora del estado nutricional y/o el incremento en la resistencia a enfermedades es también indicativa de eficacia de crecimiento mejorada. En vista de lo anterior, las modalidades de conformidad con la presente invención se refieren a métodos para criar de aves de corral para consumo de carne, que comprenden alimentar a aves de corral para consumo de carne con una dieta para aves de corral como pienso, en donde el alimento comprende además queratinasa y se añade a la dieta para aves de corral en una cantidad efectiva para intensificar el aumento de peso de las aves de corral para consumo de carne. La dieta para aves de corral puede ser un pienso que incluya fuentes de proteína, por ejemplo, harina de soya, harina de pescado, harina de sangre, subproductos de aves de corral (menudos molidos de aves de corral), harina de carne, harina de trigo, colza, cañóla, y combinaciones de los mismos. El pienso incluye además carbohidratos, por ejemplo, maíz, avenas, cebada, sorgo, o combinaciones de los mismos, que puedan molerse en una harina para su uso en el pienso. Además, el pienso puede incluir vitaminas, minerales, grasa, antibióticos, y otras sustancias o compuestos, según sean necesarios o como se desee. Ejemplos no limitativos de dietas para aves de corral como pienso incluyen alimentos basados en cereales que incluyen cereales tales como cebada, maíz, soya, trigo, triticale y centeno. Maíz-soya, trigo-soya y trigo-maíz-soya, sorgo-soya y maíz-sorgo-soya, representan otros ejemplos no limitativos de piensos adecuados de conformidad con la presente invención. Cuando la dieta para aves de corral es un alimento de harina de soya-maíz, el alimento de harina de soya-maíz comprende de alrededor de 60 a aproximadamente 70% de maíz en peso, y de alrededor de 20 a aproximadamente 30% de soya en peso. La dieta para aves de corral puede clasificarse además como una dieta de inicio, una dieta tipo producción o una dieta tipo terminación. La composición precisa y las características físicas del pienso, y de esta manera la dieta para aves de corral, dependerán de la especie para la cual el alimento se usa, la edad y/o el peso del animal, y la duración de la alimentación, y pueden ser determinadas fácilmente por los expertos en la técnica. De conformidad con las modalidades de la presente invención, los métodos para criar aves de corral para consumo de carne no requieren proveer concurrentemente un substrato específico que contenga queratina junto con la queratinasa. Por ejemplo, en modalidades de la presente invención, la queratinasa puede complementar directamente una dieta para aves de corral como un aditivo para el pienso en contraste a producir una harina de plumas hidrolizada como se describe en Cárter, 1998. De esta manera, el pienso puede estar esencialmente libre de queratina (por ejemplo, no más de 1 ó 2% en peso de queratina). Una queratinasa adecuada para poner en práctica la presente invención se obtiene de la cepa PWD-1 de Bacillus licheniformis, que se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 4,908,220 y 4,959,311 (las descripciones de todas las referencias de patente citadas en la presente, se incorporan en la presente como referencia). Esta bacteria fue depositada con la American Type Culture Coilection (ATCC) en Rockville, MD, USA de acuerdo con el tratado de Budapest en marzo 23 de 1988, y se le asignó el número de acceso de ATCC 53757. Otras queratinasas que pueden usarse para poner en práctica la presente invención están disponibles de una variedad de fuentes de bacterias, tales como Streptomyces fradiae. Véase, en general, la patente de E.U.A. No. 2,988,487 a Nickerson; véase también Goktan, D., "Decomposition Rates of Keratinous Material Used by Certain Microorganisms", (resumen No. 207369b), Microbial Biochem. 101 , 333 (1984); Daniels, G., "The Digestión of Human Hair Keratin by Microsporum canis", J. Gen. Microbiol. 8, 289 (1953); Koh, W. et al., "Keratinolytic Enzymes from Aspergillus flavus and Aspergillus niger", Bacillus. Aust. J. Biol. Sci. 274 (1959); Molyneaux, G. S., "The Digestión of Wool by a Keratinolytic Bacillus", Aust. J. Biol. Sci. 274 (1959); Noval, J. y Nickerson, W., "Decomposition of Native Keratin by Streptomyces fradiae", J. Bacteriol. 77, 251 (1959); Kapica, L. y Blank, F., "Growth of Candida parapsilosis with Keratin as Solé Source of Nitrogen", Dermatológica 1 17, 433 (1958); Kapica, L. y Blank, F., "Growth of Albicans on Keratin as Solé Source of Nitrogen", Dermatológica 115, 81 (1957). La queratinasa para poner en práctica la presente invención puede obtenerse desarrollando una célula hospedera que contenga secuencias de ácido nucleico que codifiquen para una queratinasa, bajo condiciones que permitan la expresión de la queratinasa codificada, filtrando el medio para remover las células, y colectando y concentrando el sobrenadante restante mediante ultrafiltración para obtener la queratinasa. Mientras que cepas de B. Hcheniformis se ejemplifican en la presente, se contempla que otros microbios eucarióticos y procarióticos que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican para una queratinasa, pueden ser también útiles para producir un complemento del pienso de la presente invención. Microbios eucarióticos y procarióticos que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican para una queratinasa pueden incluir las que producen la enzima en forma natural, así como cepas modificadas genéticamente que expresan queratinasa. En general, la producción de una proteína recombinante puede requerir la incorporación de secuencias de ácido nucleico que codifiquen para dicha proteína en un vector de expresión recombinante en una forma adecuada para la expresión de la proteína en una célula hospedera. Una forma adecuada para expresión provee que el vector de expresión recombinante incluya una o más secuencias reguladoras enlazadas operablemente a los ácidos nucleicos que codifican para la proteína queratinasa a en una forma que permita la transcripción de los ácidos nucleicos en ARN mensajero, y la traducción del ARN mensajero en la proteína. Secuencias reguladoras pueden incluir promotores, intensificadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras son conocidas por los expertos en la técnica, y se describen en Goeddel D. D., ed., Gene Expression Technology, Academic Press, San Diego, CA (1991 ).

Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que va a ser transfectada, y/o el nivel de expresión requerido. Secuencias de ácido nucleico o vectores de expresión que albergan secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína queratinasa, pueden introducirse en una célula hospedera, la cual puede ser de origen eucariótico o procariótico, mediante técnicas estándar para la transformación de células. Métodos adecuados para la transformación-de células hospederas, pueden encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000)), y otros manuales de laboratorio. El número de células hospederas transformadas con una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína queratinasa dependerá, por lo menos en parte, del tipo de vector de expresión recombinante usado y el tipo de técnica de transformación usada. Pueden introducirse transitoriamente ácidos nucleicos en una célula hospedera, o más típicamente, para expresión a largo plazo de una proteína queratinasa, en donde la secuencia de ácido nucleico es integrada establemente en el genoma de la célula hospedera, o permanece como un episoma estable en la célula hospedera. Una vez producida, una proteína queratinasa puede recuperarse del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque puede recuperarse también de lisados de células hospederas cuando se expresan directamente sin una señal secretoria. Microbios eucarióticos tales como cultivos de levaduras pueden transformarse con vectores que posean secuencias de ácido nucleico que codifican para una queratinasa. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,745,057. Saccharomyces cerevisiae es el microorganismo que se usa más comúnmente entre los microorganismos hospederos eucarióticos inferiores, aunque muchas otras cepas están disponibles comúnmente. Los vectores de levadura pueden contener un origen de replicación del plásmido de levadura de 2 mieras, o una secuencia de replicación autónoma (ARS), un promotor, ADN que codifica para una queratinasa tal como se provee en la patente de E.U.A. No. 5,712,147, secuencias para poliadenilación y término de la transcripción, y un gen de selección. Un ejemplo de plásmido es YRp7 (Stinchcomb, et al. ( 979) Nature 282: 39, Kingsman, et al. (1979) Gene: 7: 141 ; Tschemper, et al. (1980) Gene 10: 157). Secuencias de promotor adecuadas en vectores de levadura, incluyen los promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman, et al. (1980) J. Biol. Chem. 255: 2073), u otras enzimas glucolíticas (Hess, et al. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland, et al. (1978) Biochemistry 17: 4900). Vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en levaduras, se describen además en la publicación EPO No. 73,657. Además, cepas de hongos tales como Tríchoderma (por ejemplo, T. longibrachiatum, T. reesei o T. viríde), son particularmente útiles para expresar enzimas secretadas. Las células hospederas procarióticas que pueden usarse para producir una queratinasa incluyen organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Escherichia coli (E. coli) o Bacillus. Ejemplos de células hospederas son W3110 de E. coli (ATCC 27,325), B de E. cali, X1776 de E. coli (ATCC 31 ,537) y 294 de E. coli (ATCC 31 ,446). Está disponible una amplia variedad de vectores procarióticos y microbianos adecuados. E. coli es transformada típicamente usando pBR322. Los promotores que se usan más comúnmente en vectores de expresión microbiana recombinantes, incluyen los sistemas de promotor de beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang, et al. (1978) Nature 275: 615; Goeddel, et al. (1979) Nature 281: 544), un sistema de promotor de triptófano (trp) (Goeddel, et al. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057; publicación EPO No. 36,776) y el promotor tac (De Boer, et al. (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21). El promotor y la secuencia de Shine-Dalgarno (para expresión en hospederos procarióticos), están enlazados operablemente al ADN que codifica para la queratinasa, es decir, están posicionados para promover la transcripción de ARN mensajero de queratinasa a partir del ADN. Una especie de Bacillus se usa preferiblemente en la producción de una queratinasa. Vectores de expresión recombinante para Bacillus son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las cepas de Bacillus pueden ser B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. brevis, B. circulans, B. coagulans, B. firmus, B. lautus, B. lentus, B. licheniformis, B. megaterium. B. pumilus, B. stearothermophilus, B. subtilis y B. thuríngiensis. En una modalidad preferida, se usan cepas de B. licheniformis. En algunas modalidades, se usan las cepas de B. licheniformis T399D o PWD-1. Como se provee en la presente, puede producirse una enzima queratinasa cultivando una célula hospedera como se describió anteriormente bajo condiciones que permitan la expresión de la queratinasa codificada, y colectando la queratinasa expresada. La célula hospedera puede cultivarse bajo condiciones en las cuales la célula crezca, y puede cultivarse entonces bajo condiciones que causen la expresión de la queratinasa codificada, o puede hacerse que las células crezcan y expresen al mismo tiempo la queratinasa codificada. Dichas condiciones son bien conocidas por los expertos en la técnica, y pueden variar con la célula hospedera y la cantidad del nivel deseado de expresión de la enzima. En algunas modalidades, el medio usado para cultivar las células hospederas transformadas puede ser cualquier medio adecuado para la producción de queratinasa. La queratinasa se recupera del medio mediante técnicas convencionales que incluyen separación de las células del medio mediante centrifugación, o filtración, y concentración de las proteínas en el sobrenadante o filtrado mediante ultrafiltración o evaporación, seguida de secado mediante liofilización o secado por aspersión. En forma alternativa, el sobrenadante de cultivo puede secarse por aspersión o liofilizarse después de separación, sin que sea concentrado. La queratinasa debe estar presente en una cantidad por lo menos suficiente para lograr el efecto deseado, pero puede determinarse el límite superior para la cantidad de queratinasa con base en lograr el efecto deseado. En algunas modalidades, el pienso comprende de alrededor de 0.01 % a aproximadamente 20% de PWD-1 queratinasa de Bacillus ¡icheniformis en peso. Además, las queratinasas usadas para poner en práctica la presente invención, puede estar en forma cruda o en forma pura. Pueden prepararse queratinasas en forma cruda, por ejemplo, separando células bacterianas que producen la queratinasa de su medio de crecimiento líquido, el medio de crecimiento líquido comprendiendo queratinasa cruda. En forma alternativa, las células pueden ser lisadas (químicamente o físicamente) en un medio de crecimiento líquido para producir un extracto crudo libre de células. Otros medios para preparar dicho extracto serán evidentes para los expertos en la técnica. La queratinasa cruda puede incluirse en el alimento en cualquier forma compatible con el mismo, tal como en una forma acuosa o en forma Iiofilizada. En algunas modalidades, la queratinasa cruda está en forma Iiofilizada. Pueden obtenerse queratinasas puras (o sustancialmente puras), separando la queratinasa cruda descrita anteriormente en sus constituyentes individuales, de acuerdo con técnicas conocidas. Véase, en general, W. Jakoby, ed., Enzyme purification and Related Techniques, Methods in Enzymology, vol. 22 (1971) y vol. 104, parte C (1984), Academic Press, NY. Numerosos procedimientos de separación adecuados, tales como cromatografía de columna, son conocidos por los expertos en la técnica. Las proteínas constituyentes individuales pueden seleccionarse para su capacidad para degradar material queratináceo, y ese constituyente que degrada mejor el material queratináceo comprende la queratinasa. Al igual que la queratinasa cruda, la queratinasa pura puede usarse en cualquier forma adecuada, incluyendo las formas acuosa y Iiofilizada.

Las modalidades de la presente invención se refieren además a métodos para mejorar la eficiencia de uso del alimento como un pienso en aves de corral para consumo de carne, los cuales comprenden alimentar a aves de corral para consumo de carne con una dieta para aves de corral como pienso, en donde el alimento comprende además queratinasa en una cantidad efectiva para mejorar la eficiencia de uso del alimento como un pienso provisto a aves de corral para consumo de carne. El pienso puede incluir los piensos descritos anteriormente y, en modalidades particulares, puede ser harina de soya-maíz. La queratinasa puede incluir queratinasas como se describió anteriormente incluyendo, pero no limitadas a, PWD-1 queratinasa de Bacillus licheniformis. Como se describió anteriormente, la queratinasa puede ser un extracto crudo o una enzima en forma pura. La mejora de la eficiencia de uso del alimento se refiere a una reducción en la relación de conversión de alimento (FCR), en comparación con la que de otra manera ocurriría sin la implementación de los métodos y/o la administración de las composiciones de la presente invención. La FCR es la relación de la cantidad de alimento consumido respecto al aumento de peso de un animal. En una modalidad de la presente invención, la eficiencia mejorada de uso del alimento puede ocurrir aumentando la absorción de nutrientes gastrointestinal sin un incremento concomitante en el gasto de energía intestinal. En otra modalidad de la presente invención, la eficiencia mejorada de uso del alimento puede ocurrir aumentando la digestibilidad del pienso. En otra modalidad de la presente invención, la eficiencia mejorada de uso del alimento puede ocurrir disminuyendo la viscosidad del pienso. En modalidades particulares, la presente invención se refiere a métodos para aumentar la digestibilidad de un pienso en un ave de corral para consumo de carne, los cuales comprenden alimentar a aves de corral para consumo de carne con una dieta para aves de corral como pienso, en donde el alimento comprende además PWD-1 queratinasa de Bacillus licheniformis, en una cantidad efectiva para aumentar la digestibilidad de un pienso en aves de corral para consumo de carne. El pienso puede incluir los piensos como se describió anteriormente y, en modalidades particulares, puede ser harina de soya-maíz. La queratinasa puede incluir queratinasas como se describió anteriormente incluyendo, pero no limitadas a, PWD-1 queratinasa de Bacillus licheniformis. Como se describió anteriormente, la queratinasa puede ser un extracto crudo o enzima en forma pura. El aumento de la digestibilidad de un pienso se refiere a aumentar la disponibilidad de nutrientes absorbidos del intestino del animal, sin un incremento concurrente en consumo de alimento o ingestión de nutrientes. En algunas modalidades de la presente invención, se reduce la viscosidad de los materiales presentes en el intestino del animal o la viscosidad del alimento digerido. En otras modalidades, se reduce la captura de nutrientes que los hacen inaccesibles al animal desde el punto de vista nutricional. En otras modalidades, la presente invención se refiere a métodos para reducir la mortalidad en aves de corral para consumo de carne, los cuales comprenden alimentar a aves de corral para consumo de carne con una dieta para aves de corral como pienso, en donde el alimento comprende además una queratinasa en una cantidad efectiva para reducir la mortalidad de aves de corral para consumo de carne, por ejemplo, aves inmaduras, y más específicamente, pollos tiernos. El pienso puede incluir los piensos como se describió anteriormente y, en modalidades particulares, puede ser harina de soya-maíz. La queratinasa puede incluir queratinasas como se describió anteriormente incluyendo, pero no limitada a, PWD-1 queratinasa de Bacillus Hcheniformis. Como se describió anteriormente, la queratinasa puede ser un extracto crudo o enzima en forma pura. La reducción de la mortalidad se refiere a aumentar la supervivencia o disminuir el índice de mortalidad en animales después del nacimiento o salida del cascarón, en comparación con lo que de otra manera ocurriría en ausencia de implementación de los métodos y/o la administración de las composiciones de la presente invención. La mortalidad puede ser de cualquier causa, en particular, por estrés, atrofia, "estado famélico" y enfermedad. En algunas modalidades, la presente invención reduce la mortalidad en aves inmaduras. En otras modalidades, las aves tienen aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 31 , 32, 33, 34 ó 35 días de nacidas, de preferencia de alrededor de 1 a aproximadamente 21 días de nacidas, y más preferiblemente de alrededor de 1 a aproximadamente 5 días de nacidas. En algunas modalidades, la presente invención se refiere a un pienso que comprende proteína, carbohidrato y queratinasa como los componentes principales. La queratinasa es un componente importante que complementa el pienso. El pienso puede incluir los piensos como se describió anteriormente y, en modalidades particulares, puede ser harina de soya-maíz. La queratinasa puede incluir queratinasas como se describió anteriormente incluyendo, pero no limitada a, PWD-1 queratinasa de Bacillus licheniformis. Como se describió anteriormente, la queratinasa puede ser un extracto crudo o enzima en forma pura. El complemento del pienso provisto por la presente invención puede mezclarse directamente con el pienso, tal como uno que comprenda cebada, para preparar el alimento final. En forma alternativa, el complemento del pienso puede mezclarse con uno o más de otros complementos del pienso tales como un complemento del pienso de vitamina, un complemento del pienso de minerales, y un complemento del pienso de aminoácidos. El complemento del pienso resultante que incluya varios tipos diferentes de componentes puede mezclarse entonces en una cantidad adecuada con el pienso. El pienso de la presente invención comprende queratinasa en una cantidad por lo menos suficiente para lograr el efecto deseado, en donde el límite superior para la cantidad de queratinasa puede determinarse con base en lograr el efecto deseado. Los efectos deseados incluyen, pero no están limitados a, intensificar la eficacia de crecimiento del animal, tal como aumento de peso, mejorando la eficiencia de uso del alimento, aumentando la digestibilidad del alimento y disminuyendo la mortalidad. El complemento del pienso añadido al pienso puede comprender hasta 100% de queratinasa en peso. El pienso que comprende el complemento comprende de alrededor de 0.01 % a aproximadamente 5% de queratinasa en peso. En algunas modalidades, la queratinasa es PWD-1 queratinasa de Bacillus licheniformis. Cualquier animal es un sujeto adecuado para la presente invención, incluyendo vacas, ovejas, cerdos, gatos, perros, hurones y aves; sin embargo, la presente invención se usa de preferencia con animales monogástricos. Sujetos adecuados pueden ser de cualquier escala de edades, incluyendo animales neonatos, animales en desarrollo y animales maduros. En algunas modalidades, el sujeto adecuado puede ser un ave, de preferencia un pollo, y más preferiblemente un pollo tierno. En otras modalidades, el sujeto adecuado puede ser un pollo. En otras modalidades, el sujeto adecuado puede ser un ave inmadura, en desarrollo o madura. En otras modalidades, el sujeto adecuado puede ser un pollo que tenga 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64 ó 65 días de nacido, o dentro de cualquier escala de estos números. De esta manera, la presente invención provee una variedad de diferentes alimentos, incluyendo alimento para mascotas, pienso avícola y alimento para cerdos. El complemento del pienso de la presente invención puede permitir también que un pienso convencional sea modificando reduciendo su energía y/o contenido de proteína y/o contenido de aminoácidos, mientras mantiene simultáneamente los mismos niveles nutricionales de energía, proteína y aminoácidos disponibles para el animal. En consecuencia, las cantidades de energía y complementos de proteínas costosos incluidos típicamente en un pienso, pueden reducirse en comparación con los alimentos convencionales. Los siguientes ejemplos se proveen para ilustrar la presente invención, y no debe considerarse que limitan la misma.

EJEMPLO 1 Producción de queratinasa a partir de la cepa PWD-1 de B. ¡icheniformis recombinante Se diseñó una estrategia de aumento en proporción de la fermentación para la producción de queratinasa, usando la cepa PWD-1 de B. ¡icheniformis de tipo silvestre.

Cultivo en matraces en medio de LB Se llevó a cabo cultivo en matraces en medio de Luria-Bertani (LB) que se preparó de acuerdo a la especificación del fabricante, conteniendo: 1.0 L de agua destilada, 15 g de agar BACTO®, 10 g de NaCI, 10 g de triptona BACTO® y 5.0 g de extracto de levadura. Se sembró por estrías la cepa PWD-1 de B. ¡icheniformis a partir de un material de abastecimiento de glicerol sobre una placa de LB, y se cultivó a 50°C durante 8-12 horas. Se transfirió entonces una sola colonia de la cepa PWD-1 de B. licheniformis de la placa de LB en un matraz que contenía 500 mL de medio de LB, y se desarrolló a 50°C durante 6 horas.

Cultivos de siembra Se realizaron cultivos de siembra para la cepa PWD-1 de B. licheniformis en un medio que contenía: 0.7 g/L de KH2P04> 1.4 g/L de K2HP04, 0.1 g/L de MgS04»7H20, 10 g/L de harina de soya desgrasada y 0.1 g/L de agente antiespumante. El pH inicial del cultivo de siembra se ajustó a 7.0 añadiendo NaOH o HCI a M. El cultivo del matraz de 500 mL se transfirió a un fermentador de siembra de la primera etapa de aproximadamente 0 L a 20 L que contenía al medio de cultivo de siembra, y se desarrolló en el mismo a 50°C durante 8-12 horas hasta alcanzar 2.5% a 5% del tamaño del inoculo. El cultivo de siembra de la primera etapa se transfirió entonces a un fermentador de siembra de la segunda etapa de 100L, 250L u 800 L, y se desarrolló en el mismo a 50°C durante 8 horas, y entonces se cambió a 37°C. Para el cultivo de siembra, la densidad de células alcanzó por lo menos 3 X 108 CFU/mL a casi 8 ó 10 horas del procedimiento de cultivo.

Medios de producción El medio de cultivo de producción usado para la cepa PWD-1 de B. licheniformis contenía 0.7 g/L de KH2P04, 1.4 g/L de K2HP04, 0.1 g/L de MgS04«7H2, 10 g/L de harina de soya desgrasada y 0.1 g/L de agente antiespumante. El pH inicial del cultivo de producción se ajustó a 7.0 añadiendo NaOH o HCI a 1M. El cultivo de siembra de la segunda etapa se transfirió a un termentador de producción que contenía al medio de cultivo de producción para cultivo de etapa final. El cultivo de etapa final se llevó a cabo a 50°C durante 8 horas, alcanzando un tiempo de cultivo total de aproximadamente 24 a 30 horas antes de la cosecha. Durante los pasos de cultivo anteriores, el pH inicial del medio de cultivo se ajustó a 7.0, pero no se proveyó control del pH durante el procedimiento de cultivo. El nivel óptimo de oxígeno disuelto fue de aproximadamente 20% para la cepa PWD-1 de B. licheniformis. El tamaño del inoculo fue de alrededor de 2.5 a 5%, y el tiempo de inoculo fue de aproximadamente 8-12 horas. Para el cultivo de producción, la densidad máxima de células alcanzó 1.2 X 109 CFU/mL a casi 20 ó 24 horas del procedimiento de cultivo. La actividad enzimática máxima, medida mediante la prueba de azocaseína, alcanzó una A450 de 35-40 por mL a casi 24 a 30 horas del procedimiento de cultivo. El valor de pH del medio de cultivo de producción cambió de 7.0 a 8.3, pero la actividad enzimática y la productividad se mantuvieron a altos niveles, lo cual indicó que no era necesario el control del pH.

Recuperación v procesamiento corriente abajo Se verificó la actividad enzimática en el cultivo de producción antes de la cosecha. Se separó el sobrenadante de cultivo de la masa de células mediante centrífuga, y se concentró entonces mediante ultrafiltración o evaporación. La enzima líquida concentrada se secó entonces por aspersión. En forma alternativa, el sobrenadante de cultivo se secó por aspersión directamente después de la separación de la masa de células, sin ser concentrado.

Rendimiento de enzimas v actividad enzimática Para cultivo de producción de 100 L, la actividad enzimática medida mediante la prueba de azocaseína antes de la cosecha fue de 3,000 a 3,500 U/mL, y el número de células fue de 1.3 X 109 CFU/mL. El peso seco total del cultivo de producción de 100 L fue de 9.12 g/L, incluyendo 2.15 g/L de peso seco insoluble y 6.88 g/L de peso seco soluble. El rendimiento de enzima cruda fue de aproximadamente 1.75-2.0 g/L. Se preparó la enzima cruda mediante concentración del sobrenadante de fermentación mediante filtración en Pellicon con una separación de peso molecular de 5 kDa, y se deshidrató entonces por congelación. La actividad enzimática de la enzima seca cruda fue de alrededor de 1 ,000,000 a aproximadamente 1 ,400,000 U/g, medida mediante la prueba de azocaseína. El contenido total de proteína de la enzima seca cruda fue de alrededor de 30-36%, de la cual aproximadamente 14 a 20% consistió de queratinasa pura.

EJEMPLO 2 Producción de queratinasa a partir de la cepa T399D de 5. licheniformis recom binante Se diseñó una estrategia de aumento en proporción de la fermentación para la producción de queratinasa, usando la cepa T399D de Bacillus licheniformis recombinante (en lo sucesivo la "cepa T1 de Bacillus licheniformis").

Cultivo en matraces en medio de LB Se llevó a cabo cultivo en matraces en medio de LB que se preparó de acuerdo a la especificación del fabricante, conteniendo 1.0 L de agua destilada, 15 g de agar BACTO®, 10 g de NaCI, 10 g de triptona BACTO® y 5.0 g de extracto de levadura. Se sembró por estrías la cepa T1 de B. licheniformis a partir de un material de abastecimiento de giicerol sobre placas de LB, y se desarrolló a 37°C durante 18 horas. Una sola colonia de la cepa T1 de B. licheniformis se transfirió entonces de la placa de LB en un matraz que contenía 500 mL de medio de LB, y se desarrolló a 37°C durante 6 horas. Se monitoreó el crecimiento de las células midiendo la densidad óptica a 660 nm (espectrofotómetro Beckman DU serie 660, Fullerton, CA). Después de 6 horas de crecimiento, la OD660 midió arriba de 1.0.

Cultivos de siembra Se realizaron cultivos de siembra para la cepa T1 de B. Hcheniformis en un medio que contenía: 0.7 g/L de KH2PO4, 1.4 g/L de K2HP04, 0.1 g/L de MgS04«7H20, 10 g/L de harina de soya desgrasada y 0.1 g/L de agente antiespumante. El pH inicial del cultivo de siembra se ajustó a 7.0 añadiendo NaOH o HCI a M. El cultivo del matraz de 500 mL se transfirió a un fermentador de siembra de la primera etapa de aproximadamente 10 L a 20 L que contenía al medio de cultivo de siembra, y se desarrolló en el mismo a 50°C durante 8 horas hasta alcanzar 2.5% a 5% del tamaño del inoculo. El cultivo de siembra de la primera etapa se transfirió entonces a un fermentador de siembra de la segunda etapa de 100L, 250L u 800 L, y se desarrolló en el mismo a 37°C durante 8 horas.

Medios de producción El medio de cultivo de producción usado para la cepa T1 de B. Hcheniformis contenía 0.7 g/L de KH2P04, 1.4 g/L de K2HP04, 0.1 g/L de MgS04*7H2, 13 g/L de harina de soya desgrasada, 40 g/L de almidón, 13 g/L de harina de plumas y 0.1 g/L de agente antiespumante. El pH inicial del cultivo de producción se ajustó a 7.0 añadiendo NaOH o HCI a 1 . El cultivo de siembra de la segunda etapa se transfirió a un fermentador de producción que contenía al medio de cultivo de producción para cultivo de etapa final. El cultivo de etapa final se llevó a cabo a 37°C durante 8 horas, antes de la cosecha. Durante los pasos de cultivo anteriores, el pH inicial del medio de cultivo se ajustó a 7.0, pero no se proveyó control del pH. El nivel óptimo de oxígeno disueltó fue de aproximadamente 30% para la cepa T1 de fí. licheniformis. El tamaño del inoculo fue de alrededor de 2.5 a 5%, y el tiempo de inoculo fue de aproximadamente 12 horas.

Recuperación y procesamiento corriente abajo Se verificó la actividad enzimática en el cultivo de producción antes de la cosecha. Se separó el sobrenadante de cultivo de la masa de células mediante centrifugación, y se concentró entonces mediante ultrafiltración o evaporación. La enzima líquida concentrada se secó entonces por aspersión. En forma alternativa, el sobrenadante de cultivo se secó por aspersión directamente después de la separación de la masa de células, sin ser concentrado.

Rendimiento de enzimas y actividad enzimática Para cultivo de producción de 100 L, la actividad enzimática medida mediante la prueba de azocaseína antes de la cosecha fue de 30,000 a 35,000 U/mL, y el número de células fue de 6 X 109 CFU/mL. El peso seco total del cultivo de producción de 100 L fue de 40 g/L, incluyendo 15 g/L de peso seco insoluble y 25 g/L de peso seco soluble.

El rendimiento de enzima cruda del sobrenadante de cultivo secado directamente fue de 20 g/L, mientras que el rendimiento de enzima cruda a partir de un concentrado de cultivo, obtenido mediante filtración en Pellicon con una separación de 10 kDa de peso molecular, fue de 16 g/L. La actividad enzimática de la enzima seca cruda fue mayor de 1 ,000,000 U/g, medida mediante la prueba de azocaseína.

EJEMPLO 3 Materiales y métodos de complementación de pienso avícola con queratinasa Aves v alojamiento . Se llevaron a cabo tres experimentos. En cada experimento, se pesaron pollos tiernos de 192 días de nacidos, y se asignaron aleatoriamente a corrales de 24 jaulas en un diseño completamente aleatorizado para dos baterías de diseño alterno (Wilveco, Billerica, MA). Se pesó a las aves, se ataron sus alas, y se introdujeron en los tratamientos experimentales a cinco (experimentos uno y dos) o un (experimento tres) días de nacidos. Cada tratamiento se repitió cinco veces con ocho aves por corral, salvo para el tratamiento control que se repitió cuatro veces con ocho aves por corral. Se alojó a las aves en un sitio con temperatura, ventilación e iluminación controladas (24 horas/día). Durante el período experimental, se alimentó a las aves a voluntad en comederos y agua mediante bebederos.

La enzima PWD-1 queratinasa Se produjo la enzima, PWD-1 queratinasa, con un termentador de 150 L usando métodos estándar (Wang y Shih (1998) J. Indust Microb. Biotech. 22: 608-616). Brevemente, se desarrolló la cepa PWD-1 de Bacillus Hcheniformis (Williams, et al. ( 990), citado anteriormente) en el termentador a 50°C durante 48 horas. Los medios libres de células se concentraron mediante ultrafiltración por membrana, y se secaron usando un secador por congelación. Típicamente, el rendimiento de la enzima cruda fue de 2.0 g/L. La queratinasa cruda tenía una actividad de 300,000 U/g medida mediante la hidrólisis de azo-queratina (Lin, et al. (1992), citado anteriormente).

Tratamientos dietéticos Todas las dietas se formularon usando programación lineal de costo mínimo, y se dan en el cuadro 1.

CUADRO 1 Tratamiento dietético Alto Bajo Ingrediente contenido de Control2 contenido de proteínas1 proteínas Maíz 49.60 59.00 49.00 Harina de soya, 48% de CP 41.44 32.00 26.60 Piedra caliza 1.32 1.40 1.32 Fosfato d ¡calcico 1.75 1.70 1.82 Grasa de aves de corral 5.34 5.00 4.20 DL-metionina 0.15 0.16 0.13 Sal 0.40 0.50 0.42 Cloruro de colina 0.10 0.10 0.08 Minerales3 (TM-90) 0.12 0.12 0.10 Vitaminas4 (NCSU-90) 0.07 0.07 0.06 Premezcla de selenio 0.07 0.07 0.06 Bicarbonato de sodio 0.10 0.10 0.08 Almidón de maíz 0 0 16.60 Total (kg) 100.46 100.22 100.47 CUADRO 1 (CONTINUACION) % de % de % de Análisis6 Análisis Análisis NRC NRC NRC Proteína 25.00 108.70 20.23 88.00 16.80 72.90 cruda, % ME, kcal/kg 3.050 95.31 3.201 100.00 3.257 101.80 Met + Cys, % 0.933 103.67 0.85 99.00 0.70 77.90 Usina, % 1.437 130.60 1.17 106.30 0.97 88.10 Calcio, % 1.00 100.00 1.03 103.30 1.01 100.10 Fosfato 0.45 100.00 0.45 100.70 0.45 100.70 disponible, % Provisto a las aves a voluntad durante los primeros 5 días de nacidas sólo en el experimento tres. 2 Provisto a las aves a voluntad durante los primeros 5 días de nacidas en los experimentos uno y dos. En todos los experimentos, las aves en el tratamiento control continuaron recibiendo la misma dieta después de los primeros 5 días de nacidas, mientras que las otras aves fueron sometidas a tratamientos correspondientes. 3 La premezcla de minerales se obtuvo de Eastern Minerals, Inc., Henderson, NC, y proveyó lo siguiente (por kg de la dieta): 120 mg de Zn de ZnS04; 120 mg de Mn de MnS04; 80 mg de Fe de FeS04C5H20; 10 mg de Cu de CuS04; 2.5 mg de I de Cal0 ; y 1 mg de Co de C0SO4. 4 La premezcla de vitaminas se obtuvo de Roche, Nutley, NJ, y proveyó lo siguiente (por kg de la dieta): 13,200 Ul de vitamina A; 4,000 Ul de vitamina D; 66 Ul de vitamina E; 39.6 mg de vitamina Bi2; 13.2 mg de riboflavina; 110 mg de niacina; 22 mg de d-pantotenato; 0.4 mg de vitamina K; 2.2 mg de ácido fólico; 4.0 mg de tiamina; 7.9 mg de piridoxina; 0.253 mg de biotina; 100 mg de etoxiquina. 5 La premezcla de selenio proveyó 0.2 mg de Se/kg de la dieta como Na2Se03. 6 Análisis calculado.

Todo el alimento se proveyó en forma de amasijo a lo largo de los experimentos. Las aves recibieron una dieta basal a un día de nacidas, y fueron cambiadas subsecuentemente a las dietas experimentales correspondientes a los cinco días de nacidas. En el experimento uno, la dieta basal provista para los primeros cinco días, fue aproximadamente 93% de las recomendaciones del National Research Council (NRC) para proteína cruda ((1994), citado anteriormente), pero proveyó 100% para aminoácidos esenciales, energía y contenido de calcio y fósforo. En los experimentos dos y tres, la dieta basal provista para los primeros 5 días fue aproximadamente 95% de las recomendaciones del NRC ((1994), citado anteriormente) para energía, y 100% del calcio y fósforo, pero proveyó 105% del contenido de proteína cruda. Después, un corral de pollos tiernos fue sometido a uno de cinco tratamientos dietéticos hasta el final de cada experimento (21 días en los experimentos uno y tres, 26 días en el experimento dos). Los cinco tratamientos dietéticos en los experimentos uno y dos fueron: 1) dieta control no complementada (C, 21.39% de proteína cruda); 2) dieta de bajo contenido de proteínas (LP, 18% de proteína cruda); 3) dieta de bajo contenido de proteínas complementada con 0.05% (p/p) de preparación de enzimas (LP + 0.05E); 4) dieta de bajo contenido de proteínas complementada con 0.10% (p/p) de preparación de enzimas (LP + 0.10E); y 5) dieta de bajo contenido de proteínas complementada con 0.15% (p/p) de preparación de enzimas (LP + 0. 5E). La dieta control era ia misma dieta basal provista a las aves para los primeros cinco días de nacidas en el experimento uno. Las aves bajo el tratamiento uno continuaron recibiendo la misma dieta después de cinco días de nacidas, mientras que el resto de los tratamientos cambió a las dietas experimentales a los cinco días de nacidas. Los tratamientos dietéticos en el experimento tres fueron: 1) control no complementado (C, 21.39% de proteína cruda); 2) dieta control complementada con 0.10% (p/p) de preparación de enzimas (C + 0.10E); 3) dieta de bajo contenido de proteínas (LP, 18% de proteína cruda); 4) dieta de bajo contenido de proteínas complementada con 0.10% (p/p) de preparación de enzimas (LP + 0.10E); y 5) igual que el tratamiento dos, pero provista a aves partiendo en el día uno de nacidas, más que a los cinco días de nacidas. La dosificación de enzimas se disolvió en solución de carbonato de sodio a 0.10 N a una relación de 1 g de enzima/10 mL de solución antes de la aplicación del alimento. Después, la solución de enzimas se pulverizó sobre el alimento usando un atomizador a una relación de 10 mL de preparación de enzimas/kg de la dieta, y se mezcló usando un mezclador de tazón pequeño (The Hobart Manufacturing Company, Troy, OH).

Viscosidad de los alimentos digeridos Al final de cada experimento, todas las aves salvo dos por corral fueron sometidas a eutanasia usando CO2 gaseoso. Las dos aves restantes por corral se conservaron para el siguiente día. Tempranamente al siguiente día, se retiraron los comederos de los corrales para producir un período de 2 horas sin acceso a alimento. Después de las 2 horas, se dejó de nuevo que las aves tuvieran acceso al alimento a voluntad. Una hora después, se removieron las aves, dos a la vez, y se sometieron después a eutanasia usando CO2 gaseoso. Se llevó a cabo necropsia inmediatamente después de la eutanasia, y se vaciaron los contenidos yeyunales en tubos Eppendorf de 1 mL. Se obtuvieron dos muestras por ave. Los tubos se centrifugaron de inmediato a 12,000 x g durante 5 minutos, y se pusieron de inmediato en hielo hasta que se midiera la viscosidad usando un viscosímetro tipo comercial (viscosímetro digital Brookfield, modelo DV-II versión 2.0, Brookfield Engineering Laboratories, Inc., Stoughton, MA). Se hizo la lectura de la viscosidad bajo condiciones que evitaran cualquier desarrollo bacteriano en la solución.

Análisis de datos Se registraron los pesos corporales y el consumo de alimento de las aves a intervalos de 5 días partiendo del día uno de nacidas, y a través del final de cada experimento. Se calculó la relación de conversión de alimento (alimento a aumento de peso), corregida para mortalidad y desechos. Se registró diariamente la mortalidad. Las lecturas de peso corporal, consumo de alimento, relación de conversión de alimento y viscosidad de cada experimento, se analizaron por separado usando análisis unidireccional de los procedimientos generales del modelo lineal del programa SAS (SAS Institute (1996) SAS/STAT User's Guide: Statistics. Reléase 6.11. SAS Institute, Inc., Cary, NC). Los datos de porcentaje se sometieron a ANOVA después de transformación del porcentaje de la raíz cuadrada del arco seno. Se separaron las medias usando la diferencia menos significativa. Los informes de significancia se basaron en P = 0.05.

EJEMPLO 4 Complementaron del pienso avícola con queratinasa: experimento 1 El peso corporal final, el consumo de alimento acumulativo y las relaciones de conversión de alimento, se dan en el cuadro 2: CUADRO 2 Relación de Consumo de Tratamiento Peso corporal (g) conversión de alimento (g) alimento Control (C) 709 ± 16 901a ± 26 1.56 ± 0.05 Bajo contenido de proteínas (LP) 668 ± 14 835ab ± 23 1.57 ± 0.04 LP + 0.05 E 691 ± 14 860ab ± 23 1.56 ± 0.04 LP + 0.10 E 700 ± 14 847a ± 23 1.51 ± 0.04 LP + 0.15 E 677 ± 14 826 ± 23 1.54 ± 0.04 a b Las medias dentro de una columna con diferentes subíndices difieren significativamente (P < 0.05), de acuerdo a la función de medias de mínimos cuadrados del programa SAS (SAS Institute (1996), citado anteriormente). 1 Los valores representan medias de cuatro a cinco corrales de ocho pollos tiernos por corral. Los valores representan medias ± error estándar de la media. 2 E = enzima.

Los tratamientos con enzimas mejoraron en general el peso corporal con un valor de probabilidad de P > 0.05. El tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0.10% de enzima, tuvo mayor peso corporal que el tratamiento con bajo contenido de proteínas (700 gramos contra 668 gramos para bajo contenido de proteínas + 0.10% de enzima, contra bajo contenido de proteínas, respectivamente, P = 0.08). El tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0.10% de enzima tuvo el peso corporal más alto entre los tratamientos con enzima, y no fue diferente del tratamiento control (700 gramos contra 709 gramos para el tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0.10% de enzima contra control, respectivamente). No hubieron diferencias significativas entre los tratamientos en consumo de alimento, salvo entre el tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0.15% de enzima y el tratamiento control (826 gramos contra 901 gramos para el tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0.15% de enzima contra control, respectivamente, P < 0.05). No hubo diferencias significativas en consumo de alimento entre los grupos de tratamiento con enzimas. Sólo hubo un ave muerta a lo largo de todo el experimento. El peso de esta ave muerta y los desechos se incluyeron en el cálculo de la relación de conversión de alimento, el cual se muestra en el cuadro 2. La complementación de la dieta con enzimas tuvo efectos marginales sobre la relación de conversión de alimento. Sobre una base acumulativa, el tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0.10% de enzima, tuvo la relación de conversión de alimento más baja (1.51 contra 1.57 para el tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0.10% de enzima contra tratamiento con bajo contenido de proteínas, respectivamente, P > 0.05). Los resultados del primer experimento, revelaron una tendencia en la respuesta para el tratamiento con enzimas. Para analizar mejor el efecto positivo de la enzima para un tiempo más largo, se llevó a cabo un segundo experimento criando a las aves 5 días más (hasta los 26 días de nacidas).

EJEMPLO 5 Complementación del pienso avícola con queratinasa: experimento 2 Este experimento fue una repetición del experimento 1 , salvo que las aves fueron criadas 5 días más (hasta los 26 días de nacidas). El peso corporal final, el consumo de alimento acumulativo y la relación de conversión de alimento, se dan en el cuadro 3.

CUADRO 3 Relación de Consumo de Tratamiento Peso corporal (g) conversión de alimento (g) alimento Control (C) 1089a ± 15 1717° ± 16 1.83a ± 0.04 Bajo contenido de proteínas (LP) 964c ± 13 1734b ± 14 2.14° ± 0.04 LP + 0.05 E 1019b ± 13 1796a ± 14 2.08bc ± 0.04 LP + 0.10 E 1025b ± 13 1764ab ± 14 2.02b ± 0.04 LP + 0.15 E 1032b ± 13 1794a ± 14 2.04bc± 0.04 a,b'c Las medias dentro de una columna con diferentes subíndices difieren significativamente (P < 0.05), de acuerdo a la función de medias de mínimos cuadrados del programa SAS (SAS Institute (1996), citado anteriormente). 1 Los valores representan medias de cuatro a cinco corrales de ocho pollos tiernos por corral. Los valores representan medias ± error estándar de la media. 2 E = enzima.

Hubo una mejora en el peso corporal (P < 0.05) de las aves después de complementar la dieta de bajo contenido de proteínas con los tres niveles de enzima a los 26 días de nacidas. El tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0.10% de enzima y el tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0.15% de enzima, dieron la mejora más alta de peso corporal (1,032 gramos y 1 ,025 gramos contra 964 gramos para el tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0. 5% de enzima y tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0.10 contra tratamiento con bajo contenido de proteínas, respectivamente, P < 0.05). Sin embargo, todos los tratamientos con enzimas tuvieron menor (P < 0.05) peso corporal que el tratamiento control (1,032, 1 ,025 y 1 ,016 gramos contra 1,089 gramos para el tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0.15% de enzima, tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0.10% de enzima y tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0.05% de enzima contra control, respectivamente). Todas las aves que recibieron la dieta de bajo contenido de proteínas, consumieron más alimento que el grupo control (P < 0.05). Los grupos de tratamiento con enzimas consumieron también más alimento que con la dieta de bajo contenido de proteínas (P < 0.05; cuadro 2). No hubo diferencias significativas en consumo de alimento entre los tratamientos con enzimas. La complementación con enzimas a los niveles de 0.05 y 0.15%, dio como resultado relaciones de conversión de alimento numéricamente mejores que el tratamiento con bajo contenido de proteínas, mientras que el tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0.10% de enzima, mostró una relación de conversión de alimento significativamente mejor (P < 0.05) que el tratamiento con bajo contenido de proteínas (2.02 contra 2.14 para el tratamiento con bajo contenido de proteínas + 0.10% de enzima contra tratamiento con bajo contenido de proteínas, respectivamente). En este experimento, la complementación de la dieta de bajo contenido de proteínas con enzima, no mejoró la eficacia de los pollos hasta un nivel equivalente al de la dieta control. Sin embargo, la complementación de la dieta de bajo contenido de proteínas con el nivel de 0.10% de enzima (p/p), mejoró (P < 0.05) la eficacia de los pollos sobre la de la dieta de bajo contenido de proteínas. Se proveyó a las aves en los experimentos 1 y 2 la dieta control para los primeros 5 días de nacidas antes de ser sometidas a las dietas de tratamiento. Aunque la dieta control proveyó energía, calcio y fósforo adecuados y aminoácidos esenciales, sólo proveyó 93% de la recomendación de proteína cruda del NRC ((1994), citado anteriormente), lo cual la hace marginalmente adecuada y sensible a la compiementacion con proteasa.

EJEMPLO 6 Compiementacion del pienso avícola con queratinasa: experimento 3 En el experimento 3, se proveyó a las aves una dieta de pre-inicio de alto contenido de proteínas que proveía 105% de la recomendación del NRC ((1994), citado anteriormente) para proteína cruda, y ligeramente mayor que los requisitos para los otros nutrientes, salvo para energía (95% de las recomendaciones del NRC; véase cuadro 1). Se llevó a cabo el experimento 3 para determinar si la enzima continuaría o no ejerciendo su efecto aún después de que los pollos hubiesen recibido requisitos nutricionales adecuados.

En este experimento, sólo se usó un nivel de la enzima (0.10% p/p). Sin embargo, se introdujeron dos nuevos tratamientos para poner a prueba la capacidad de la enzima para ejercer un efecto sobre la compiementacion para adecuar marginalmente las dietas de los pollos tiernos. Los dos nuevos tratamientos consistieron en complementar la misma dieta control (21.39% de proteína cruda) usada en los experimentos 1 y 2 con 0.10% de enzima (p/p), e introducir el alimento tratado a los pollos a los cinco días (tratamiento 2) o un día (tratamiento 5) de nacidos. Esto proveyó información de si la compiementacion con enzimas en un día de nacidas las aves, tendría alguna mejora adicional en la eficacia de las mismas.

El peso corporal final, el consumo de alimento acumulativo relación de conversión de alimento, se dan en el cuadro 4: CUADRO 4 Relación de i- . . . p, . . Consumo de Tratamiento Peso corporal (g) a|¡mento (g) conversión de alimento C + 0.10 E 767a ± 13 1046a ± 16 1.45a ± 0.03 Bajo contenido de proteínas (LP) 651c ± 13 1043a ± 16 1.71c ± 0.03 Control (C) 695b ± 14 974b ± 18 1.49ab ± 0.03 LP + 0.10% E 679bc± 13 978b ± 16 1.53b ± 0.03 C + 0.10% E3 764a ± 13 1022ab ± 16 1.42a ± 0.03 a,b'c Las medias dentro de una columna con diferentes subíndices difieren significativamente (P < 0.05), de acuerdo a la función de medias de mínimos cuadrados del programa SAS (SAS Institute (1996), citado anteriormente). 1 Los valores representan medias de cuatro a cinco corrales de ocho pollos tiernos por corral. Los valores representan medias ± error estándar de la media. 2 E = enzima. 3 La enzima se añadió en el día 1 de nacidas las aves en este tratamiento. Las demás se añadieron a los cinco días de nacidas.

Aunque los datos en los cuadros 2, 3 y 4 muestran sólo los valores del peso corporal final de las aves en diferentes experimentos, se pesó a las aves cada 5 días en cada uno de los experimentos. Observando los números del intervalo de 5 días para este experimento, fue claro que la complementación de la dieta de bajo contenido de proteínas con la enzima en el experimento 3, mostró un efecto similar sobre el aumento de peso al de los experimentos 1 y 2. La complementación de la dieta de bajo contenido de proteínas con la enzima, aumentó el peso corporal de las aves de 21 días, pero el efecto no pudo detectarse a P < 0.05 (679 gramos contra 651 gramos para la dieta de bajo contenido de proteínas + 0.10% de enzima contra la dieta de bajo contenido de proteínas, respectivamente, P > 0.05). Sin embargo, la complementación de la dieta control con la enzima (preparación control + 0.10% de enzima, tratamientos 2 y 5), mostró mayor peso corporal que el tratamiento control (767 gramos y 764 gramos contra 695 gramos para los tratamientos 2 y 5 contra el tratamiento control, respectivamente, P < 0.05). Inesperadamente, la complementación de la dieta control con la enzima mostró mejoras significativamente mayores en peso corporal, que cuando la dieta de bajo contenido de proteínas fue complementada con la enzima si la enzima fue complementada a uno o cinco días de nacidas las aves (cuadro 4). Esto pudo haberse debido al mayor contenido de proteínas y/o aminoácidos de la dieta control, contra la dieta de bajo contenido de proteínas. La queratinasa es una enzima proteasa de amplio espectro que ataca proteínas de diferentes fuentes, y las degrada en componentes polipeptídicos más pequeños. Estos polipéptidos se hacen más fáciles de degradar por las enzimas digestivas en el lumen de los intestinos. Un mayor contenido de proteína cruda y/o aminoácidos en la dieta (en este caso la dieta control), significa mayor contenido de substrato para que la enzima funcione liberando más componentes de proteína, y haciéndola más disponible a los pollos jóvenes lo cual, a su vez, se reflejará en mayor aumento de peso corporal.

EJEMPLO 7 Complementación del pienso avícola con queratinasa: viscosidad de los alimentos digeridos Las lecturas de viscosidad (mPas) de los contenidos yeyunales de pollos tiernos de 22 días de nacidos (experimentos 1 y 2) y 27 días de nacidos (experimento 3) de los tres experimentos, se dan en el cuadro 5: CUADRO 5 Tratamiento Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Control (C) 3,65b±0.42 2.31b±0.15 2.55ab±0.17 C + 0.10E — — 2.18b±0.15 C + 0.10E3 — — 1.99b±0.15 Bajo contenido de proteínas (LP) 3.59 ±0.38 2.36ab±0.14 2.97a ±0.15 LP + 0.05 E 2.98ab±0.38 2.78a ±0.14 — LP + 0.10E 2.88ab ± 0.38 2.21bc±0.14 2.20b±0.15 LP + 0.15E 2.27a ± 0.38 1.98° ±0.14 — a,b,c Las medias dentro de una columna con diferentes subíndices difieren significativamente (P < 0.05), de acuerdo a la función de medias de mínimos cuadrados del programa SAS (SAS Institute (1996), citado anteriormente). 1 Los valores representan medias de cuatro a cinco corrales (números 16 a 20). Los valores representan medias + error estándar de la media. 2 E = enzima. 3 La enzima se añadió a un día de nacidas las aves en este tratamiento.

Todas las demás se añadieron a los cinco días de nacidas.

La complementación de las dietas de bajo contenido de proteínas y control en todos los experimentos con queratinasa, redujo la viscosidad de los contenidos yeyunales. La reducción fue directamente proporcional al nivel de complementación con enzimas. La complementación de la dieta de bajo contenido de proteínas con 0.15% de enzima (bajo contenido de proteínas + 0.15% de enzima), redujo la viscosidad de los contenidos yeyunales en los experimentos 1 y 2 (2.27 y 1.98 mPas contra 3.59 y 2.36 mPas para la dieta de bajo contenido de proteínas + 0.15% de enzima contra la dieta de bajo contenido de proteínas en los experimentos 1 y 2, respectivamente, P < 0.05). El tratamiento con la dieta de bajo contenido de proteínas + 0.15% de enzima, tuvo también una menor viscosidad yeyunal cuando se comparó con el tratamiento control (2.27 y 1.98 mPas contra 3.65 y 2.31 mPas para la dieta de bajo contenido de proteínas + 0.15% de enzima contra la dieta control en los experimentos 1 y 2, respectivamente, P < 0.05). Cuando se complementó la dieta control con queratinasa a los 5 días de nacidas las aves, la viscosidad yeyunal fue también reducida (2.18 mPas contra 2.55 mPas para el control + 0.10% de enzima [experimento 3, tratamiento 2] contra el control, respectivamente, P > 0.05). Sin embargo, la reducción fue significativa sólo cuando la dieta fue complementada con la enzima partiendo en el día 1 de nacidas las aves (1.99 mPas contra 2.55 mPas para el control + 0.10% de enzima [experimento 3, tratamiento 5] contra el control, respectivamente, P < 0.05). Los ejemplos anteriores son ilustrativos de la presente invención, y no deberán considerarse como limitativos de la misma. La invención se describe mediante las siguientes reivindicaciones, con equivalentes de las mismas que se incluyen en la presente.

Claims (28)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para criar aves de corral para consumo de carne, que comprende: alimentar a dichas aves de corral para consumo de carne con un alimento de harina de soya-maíz como una dieta para aves de corral, dicho alimento comprendiendo además PWD-1 queratinasa de Bacillus Hcheniformis en una cantidad efectiva para intensificar el aumento de peso de dichas aves de corral para consumo de carne.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las aves de corral para consumo de carne son un ave inmadura.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las aves de corral para consumo de carne son un pollo.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el pollo tiene de alrededor de 1 día a 65 días de nacido.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el pollo tiene de alrededor de 1 día a 21 días de nacido.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el pollo tiene de alrededor de 1 día a 7 días de nacido.

7. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el pollo es un pollo tierno.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la dieta para aves de corral es una dieta de inicio.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la dieta para aves de corral es una dieta tipo producción.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la dieta para aves de corral es una dieta tipo terminación.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el alimento de harina de soya-maíz comprende de alrededor de 60 a aproximadamente 70% de maíz en peso.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el alimento de harina de soya-maíz comprende de alrededor de 20 a aproximadamente 30% de soya en peso.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el alimento de harina de soya-maíz comprende además de alrededor de 0.01 a aproximadamente 0.20% de PWD-1 queratinasa de Bacillus licheniformis en peso.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la PWD-1 queratinasa de Bacillus licheniformis es un extracto crudo o enzima pura.

15.- Un método para criar aves de corral para consumo de carne, que comprende: alimentar a dichas aves de corral para consumo de carne con un alimento de harina de soya-maíz como una dieta de inicio, dicho alimento comprendiendo además PWD-1 queratinasa de Bacillus licheniformis en una cantidad efectiva para intensificar el aumento de peso de dichas aves de corral para consumo de carne.

16. - Un método para mejorar la eficiencia de uso del alimento como un pienso en aves de corral para consumo de carne, que comprende: alimentar a dichas aves de corral para consumo de carne con un alimento de harina de soya-maíz como una dieta para aves de corral, dicho alimento comprendiendo además PWD-1 queratinasa de BacHIus licheniformis en una cantidad efectiva para mejorar la eficiencia de uso del alimento como un pienso en dichas aves de corral para consumo de carne.

17. - Un método para incrementar la digestibilidad de un pienso en aves de corral para consumo de carne, que comprende: alimentar a dichas aves de corral para consumo de carne con un alimento de harina de soya-maíz como una dieta para aves de corral, dicho alimento comprendiendo además PWD-1 queratinasa de Bacillus licheniformis en una cantidad efectiva para incrementar la digestibilidad de un pienso en dichas aves de corral para consumo de carne.

18. - Un método para reducir la mortalidad en aves de corral para consumo de carne, que comprende: alimentar a dichas aves de corral para consumo de carne con un alimento de harina de soya-maíz como una dieta de inicio, dicho alimento comprendiendo además PWD-1 queratinasa de Bacillus licheniformis en una cantidad efectiva para reducir la mortalidad de dichas aves de corral para consumo de carne.

19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque las aves de corral para consumo de carne son un ave inmadura.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque las aves de corral para consumo de carne son un pollo tierno.

21. - Un pienso que consiste esencialmente de harina de soya, harina de maíz y queratinasa.

22. - El pienso de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el pienso consiste esencialmente de por lo menos alrededor de 0.01 % de queratinasa en peso.

23. - El pienso de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la queratinasa es un extracto crudo o enzima pura.

24. - El pienso de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la queratinasa es PWD-1 queratinasa de Bacillus licheniformis.

25. - El pienso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el pienso se añade a la dieta de inicio.

26. - El pienso de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la dieta de inicio es una dieta de inicio de harina de soya-maíz.

27. - El pienso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el pienso es una dieta tipo producción.

28. - El pienso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el pienso es una dieta tipo terminación.