ES2340848T3 - Procedimientos y composiones para la mejora de la crianza de aves de corral para carne. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de crianza de aves de corral para carne, que comprende: alimentar a dichas aves de corral para carne con un pienso de harina de maíz y de soja como dieta para aves de corral, en el que dicha dieta para aves de corral comprende no más del 1% en peso de queratina, comprendiendo además dicho pienso queratinasa en una cantidad efectiva para potenciar el aumento de peso de dichas aves de corral para carne.
Description
Procedimientos y composiciones para la mejora de
la crianza de aves de corral para carne.
La presente solicitud reivindica el beneficio de
la solicitud provisional estadounidense con nº de serie 60/402.228,
presentada el 9 de agosto de 2002, cuya revelación se incorpora en
el presente documento por referencia en su totalidad.
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La investigación dirigida a la presente
invención está subvencionada en parte por la Beca Nº
2002-33610-11850 de Ayuda de
Investigación a la Innovación en Pequeñas Empresas del Ministerio de
Agricultura de EE. UU. El gobierno estadounidense tiene ciertos
derechos sobre esta invención.
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La presente invención versa acerca de
procedimientos para mejora del rendimiento de la cría de animales
inmaduros y en desarrollo que reciben pienso y suplementos de
pienso para lograrlo.
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Las dietas iniciales de pollos tomateros
contienen una cantidad considerable de proteína cruda. La mayor
parte de la proteína cruda se obtiene de ingredientes tradicionales
de los piensos, como la harina de soja. Aproximadamente el 90% de
la proteína cruda presente en la harina de soja (contenido
proteínico crudo del 48%) es muy digestible para las aves de corral
(National Research Council (1994). Nutrient requirements of poultry.
9ª ed. revisada. National Academy Press, Washington, DC). Aunque se
considera que las dietas iniciales tradicionales a base de harina
de maíz y de soja para pollos tomateros son muy digestibles, a
menudo contienen una variedad de proteínas complejas que no son
fáciles de digerir por un pollito debido a la falta de las
necesarias enzimas innatas en las primeras fases de la vida (Uni,
et al. (1999) Poultry Sci. 78: 215-222). Se
ha sugerido la inclusión de proteasas en las dietas para pollos
tomateros, pero gran parte de los primeros experimentos de adición
de proteasas a las dietas basadas en cereales no resultó en ninguna
mejora en el rendimiento aviar (Jensen, et al. (1957)
Poultry Sci. 36: 919-921).
Más recientemente, el suplemento enzimático de
las dietas de aves de corral con mezclas de enzimas, incluyendo
proteasas y amilasas, ha producido algunas mejoras en el rendimiento
del desarrollo (Creenwood, et al. (2002) Poultry Sci.
81(Suppl. 1): 25; Burrows, et al. (2002) Poultry Sci.
81(Suppl. 1): 29; Short, et al. (2002) Poultry Sci.
81(Suppl. 1): 136). Complementar una dieta inicial de maíz y
soja para pollos tomateros con un preparado enzimático que contenía
una mezcla de xilanasa, proteasa y amilasa dio como resultado
mejoras en el peso corporal a los 14 y los 42 días de vida, sin
efectos significativos en el coeficiente de conversión del pienso
(Greenwood, et al. (2002) supra). Tras complementar
dietas para patos basadas en maíz y soja con la misma mezcla
enzimática, la complementación enzimática dio como resultado mejoras
en aumento del peso corporal y en el índice de conversión del
pienso (Burrows et al. (2002) supra).
El pienso para aves de corral contiene además
algunos compuestos complejos antinutritivos y/o indigeribles.
Algunos de estos compuestos, como los polisacáridos no almidonosos,
absorben agua y se transforman en una masa viscosa en forma de
quimo cuyos nutrientes no se absorben fácilmente (Odetallah, 2000;
Odetallah, et al. (2002) supra). Al aumentar la
viscosidad del quimo, disminuye la tasa de difusión de las enzimas
digestivas y de los nutrientes, impidiendo así la absorción de
nutrientes por los enterocitos. La formación y la absorción de
micelas grasas también disminuyen al aumentar la viscosidad del
quimo, perjudicando así la absorción de muchos compuestos
liposolubles, incluyendo las vitaminas liposolubles, los pigmentos y
los lípidos (Ferket and Veldkamp (1999) en: Proceedings of the 1998
World Poultry Science Association, páginas 43-52).
Por lo tanto, la reducción de viscosidad lograda por la actividad
de las enzimas endolíticas puede desempeñar un papel en la mejora
vista en los pollitos alimentados con cereales de viscosidad
elevada, y la relativa efectividad de las diversas enzimas parece
estar relacionada con su capacidad reductora de la viscosidad
(Rotter, et al. (1990) J. Sci. Food Agric.
50:19-27).
La queratinasa PWD-1 es una
enzima que se purificó en un primer momento a partir del medio de
cultivo del Bacillus licheniformis PWD-1
(Williams, et al. (1990) Appl. Environ. Microbiol.
56:1509-1515; Lin, et al. (1992) Appl. Environ.
Microbiol. 58: 3271-3275). La queratinasa
PWD-1 hidroliza una amplia gama de sustratos
proteínicos, incluyendo la caseína, el colágeno, la elastina y la
queratina (Shih (2001) en: Proceedings International Conference of
Agricultural Science and Technology, Pekín, China, páginas
244-247). La queratinasa PWD-1 se
viene usando para producir harina de plumas hidrolizada incubando
durante la noche harina de plumas comercial con queratinasa libre
de células (Carter (1998) Bacterial Keratinase: Assay development
and nutritional application. Tesis doctoral, North Carolina State
University, Raleigh, NC). Véanse también las patentes
estadounidenses n^{os} 4.908.220, 5.186.961 y 5.063.161,
otorgadas a Shih et al.
A pesar de lo anterior, persiste la necesidad de
procedimientos adicionales para mejorar el rendimiento de la cría
de pollos tomateros y de suplementos de pienso que lo logren.
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La presente invención proporciona procedimientos
y composiciones que mejoran el rendimiento de la cría de animales
inmaduros y en desarrollo que reciben pienso.
Un aspecto de la invención se relaciona con el
procedimiento de cría de aves de corral de carne, que comprende:
alimentar a dichas aves de corral de carne con un pienso de harina
de maíz y de soja como dieta de las aves de corral, en el que dicha
dieta de las aves de corral comprende no más del 1% en peso de
queratina, comprendiendo además dicho pienso queratinasa en una
cantidad efectiva para potenciar el aumento de peso de dichas aves
de corral de
carne.
carne.
Otro aspecto de la invención se relaciona con un
uso de un pienso de harina de maíz y de soja para complementar una
dieta de aves de corral en el que dicho pienso comprende además
queratinasa en una cantidad efectiva para potenciar el aumento de
peso de dichas aves de corral de carne, en el que dicho pienso
comprende no más del 1% en peso de queratina.
Un aspecto adicional de la invención se
relaciona con un uso de un pienso de harina de maíz y de soja para
mejorar la eficiencia de la utilización del pienso de un pienso en
las aves de corral para carne, comprendiendo dicho uso suministrar
dicho pienso como dieta para aves de corral, en el que dicho pienso
comprende además queratinasa en una cantidad efectiva para mejorar
la eficiencia de la utilización del pienso de un pienso en dichas
aves de corral para carne, en el que dicho pienso comprende no más
del 1% en peso de queratina.
Un aspecto adicional de la invención se
relaciona con un uso de un pienso de harina de maíz y de soja para
aumentar la digestibilidad de un pienso en aves de corral para
carne, comprendiendo dicho uso suministrar dicho pienso como dieta
para aves de corral, en el que dicho pienso comprende además
queratinasa en una cantidad efectiva para aumentar la
digestibilidad de un pienso en dichas aves de corral para carne, en
el que dicho pienso comprende no más del 1% en peso de
queratina.
Otro aspecto de la invención se relaciona con un
uso de un pienso de harina de maíz y de soja para reducir la
mortalidad en aves de corral para carne, comprendiendo dicho uso
suministrar dicho pienso como dieta para aves de corral, en el que
dicho pienso comprende además queratinasa en una cantidad efectiva
para reducir la mortalidad en dichas aves de corral para carne, en
el que dicho pienso comprende no más del 1% en peso de
queratina.
Un aspecto adicional de la invención se
relaciona con un pienso que consiste esencialmente en harina de
soja, harina de maíz y queratinasa, en el que dicho pienso
comprende no más del 1% en peso de queratina.
\vskip1.000000\baselineskip
Lo que antecede y otros aspectos de la presente
de la presente invención se describirá a continuación con más
detalle con respecto a otras realizaciones descritas en el presente
documento. Debería apreciarse que la invención puede plasmarse de
formas diferentes y no debiera interpretarse que esté limitada a las
realizaciones expuestas en el presente documento. Antes bien, se
proporcionan estas realizaciones para que esta revelación sea
rigurosa y completa y para que transmita plenamente el alcance de la
invención a las personas expertas en la técnica.
La terminología usada en la descripción de la
invención en el presente documento tiene el propósito de describir
realizaciones particulares únicamente y no tiene el propósito de
limitar la invención. Tal como se usan en la descripción de la
invención y en las reivindicaciones adjuntas, se entiende que las
formas singulares "un", "una" y "el", "la"
incluyen también las formas plurales, a no ser que el contexto
indique claramente lo contrario.
A no ser que se defina lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen el mismo significado entendido normalmente por una persona
con un dominio normal de la técnica a la que pertenece la presente
invención.
Todas las publicaciones, solicitudes de patente
estadounidense, patentes estadounidenses y otras referencias
citadas en el presente documento se incorporan por referencia en su
totalidad.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "aves de corral de carne" se refiere a cualquier
especie aviar que se produzca o use para su consumo cárnico, tal
como lo entiende una persona experta en la técnica. Ejemplos de
tales especies aviares incluye, sin limitación, pollos, pavos,
patos, gansos, codornices, faisanes, ratites y similares.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "ave inmadura" se refiere a un miembro de la especie
aviar que carece de crecimiento, diferenciación o desarrollo
completos. Tales miembros pueden tener la capacidad potencial de
lograr una forma o un estado maduro definido. Un ave inmadura puede
tener entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 días de vida,
preferentemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 21 días de
vida, y más preferentemente entre aproximadamente 1 y
aproximadamente 5 días de vida, o puede tener un peso corporal
comparable al de las aves dentro de estos intervalos.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "ave en desarrollo" se refiere a un miembro de la
especie aviar que es de más edad o pesa más que un ave
inmadura.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "ave madura" se refiere a un miembro de la especie
aviar que es de más edad o pesa más que un ave en desarrollo.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "pollo tomatero" se refiere a cualquier pollo
inmaduro producido o usado finalmente para el consumo cárnico.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "dieta de aves de corral" se refiere a una dieta que
puede ser administrada a un miembro de la especie aviar para
promover o mantener el crecimiento del ave. Una dieta de aves de
corral contiene fuentes de proteínas, vitaminas, minerales, energía,
como grasa, hidratos de carbono y proteína adicional, antibióticos
y otras sustancias u otros compuestos que se sabe que se incluyen
en los piensos, en particular en los piensos para aves de corral. La
dieta de aves de corral incluye, sin estar limitada a ellas, una
dieta de desarrollo, una dieta inicial y una dieta de finalización.
Una "dieta inicial" se refiere a una dieta que puede
administrarse a un animal a partir del nacimiento o la eclosión
hasta que se llegue a la edad y/o al peso deseados. Una "dieta de
desarrollo" se refiere a una dieta que puede ser administrada a
un animal tras la terminación de la fase de dieta inicial. Una
"dieta de finalización" se refiere a una dieta que puede ser
administrada a un animal durante el periodo de desarrollo hasta el
momento del sacrificio.
Tal como se usan en el presente documento, las
expresiones "cría" y "rendimiento de la cría" se refieren
a aumento ya sea en peso, en tamaño (por ejemplo, altura, anchura,
diámetro, circunferencia, etc.) o en ambos con respecto al que se
daría en todo caso sin la implementación de los procedimientos y/o
la administración de las composiciones de la presente invención. El
desarrollo puede referirse a un aumento en la masa (por ejemplo, el
peso o el tamaño) de todo el animal o de un tejido particular (por
ejemplo, el tejido muscular en general o de un músculo específico).
Alternativamente, el desarrollo puede indicar un aumento relativo
en la masa de un tejido en relación con otro, en particular, un
aumento en el tejido muscular con respecto a otros tejidos (por
ejemplo, el tejido adiposo). El desarrollo se relaciona además con
el estado nutricional y la resistencia a las enfermedades, en los
que la mejora del estado nutricional y/o el aumento de la
resistencia a las enfermedades también son indicativos de un
rendimiento mejorado de la cría.
En vista de lo que antecede, las realizaciones
conforme a la presente invención se relacionan con procedimientos
de cría de aves de corral para carne, que comprenden alimentar a
aves de corral para carne con una dieta de pienso para aves de
corral en la que el pienso comprende además queratinasa y que se
añade a la dieta para aves de corral en una cantidad efectiva para
potenciar el aumento de peso de las aves de corral para carne. La
dieta de las aves de corral puede ser un pienso que incluya fuentes
de proteína, por ejemplo harina de soja, harina de pescado, harina
de sangre, subproductos procedentes de aves de corral (menudillos de
aves de corral molidos), harina de carne, harina de trigo, colza,
canola y combinaciones de los mismos. El pienso incluye además
hidratos de carbono, por ejemplo maíz, avena, cebada, sorgo o
combinaciones de los mismos, que pueden molerse para crear una
harina para su uso en piensos. Además, el pienso puede incluir
vitaminas, minerales, grasa, antibióticos y otras sustancias o
compuestos, según se precise o se desee. Ejemplos no limitantes de
dietas de pienso para aves de corral incluyen piensos basados en
cereales, que incluyen cereales como la cebada, el maíz, la soja,
el trigo, el triticale y el centeno. Maíz-soja,
trigo-soja y
trigo-maíz-soja,
sorgo-soja y
maíz-sorgo-soja representan otros
ejemplos no limitantes de piensos adecuados conforme a la presente
invención. Cuando la dieta de las aves de corral es un pienso de
harina de maíz y de soja, el pienso de harina de maíz y de soja
comprende entre aproximadamente el 60 y aproximadamente el 70% de
maíz en peso y entre aproximadamente el 20 y aproximadamente el 30%
de soja en peso.
La dieta para aves de corral puede además
catalogarse como una dieta inicial, una dieta de desarrollo o una
dieta de finalización. La composición precisa y las características
físicas del pienso, y, por ende, de la dieta de las aves de corral,
dependerá de la especie para que esté previsto el pienso, de la edad
y/o del peso del animal, y de la duración del cebado, y puede ser
determinada fácilmente por las personas expertas en la técnica.
Conforme a realizaciones de la presente
invención, los procedimientos de cría de aves de corral para carne
no requieren proporcionar concurrentemente un sustrato específico
que contenga queratina junto con la queratinasa. Por ejemplo, en
realizaciones de la presente invención, la queratinasa puede
complementar directamente una dieta para aves de corral como
aditivo del pienso, en vez de producir una harina de plumas
hidrolizada, como se describe en Carter, 1998.
Una queratinasa adecuada para practicar la
presente invención se obtiene a partir de la cepa
PWD-1 del Bacillus licheniformis, lo que se
describe en las patentes estadounidenses n^{os} 4.908.220 y
4.959.311 (las revelaciones de todas las referencias a patentes
citadas en el presente documento han de incorporarse a este por
referencia). Esta bacteria se depositó en la Colección
Estadounidense de Cultivos Tipo (ATCC) de Rockville, Maryland, EE.
UU. conforme al Tratado de Budapest de 23 de marzo de 1988 y se le
asignó el Nº de Acceso 53757. Otras queratinasas que pueden usarse
para practicar la presente invención están disponibles en una
variedad de fuentes bacterianas, como el Streptomyces
fradiae. Véase en general la patente estadounidense Nº
2.988.487, otorgada a Nickerson; véanse también Goktan, D.,
"Decomposition Rates of Keratinous Material Used by Certain
Microorganisms", (Resumen Nº 207369b), Microbial Biochem. 101,
333 (1984); Daniels, G.; "The Digestion of Human Hair Keratin by
Microsporum Canis", J. Gen. Microbiol. 8, 289 (1953);
Koh, W. et al., "Keratinolytic Enzymes from Aspergillus
flavus and Aspergillus niger", Bacillus. Aust. J.
Biol. Sci. 274 (1959); Molyneaux, G. S., "The Digestion of Wool by
a Keratinolytic Bacillus", Aust. J. Biol. Sci. 274 (1959);
Noval, J. y Nickerson, W., "Decomposition of Native Keratin by
Streptomyces Fradfae". J. Bacteriol. 77, 251 (1959);
Kapica, L. and Blank, F., "Growth of Candida Parapsilosis with
Keratin as Sole Source of Nitrogen", Dermatologica 117,433
(1958); Kapica, L. and Blank, F., "Growth of Albicans on Keratin
as Sole Source of Nitrogen", Dermatologica 115, 81 (1957).
La queratinasa para practicar la presente
invención puede obtenerse cultivando una célula anfitriona que
contiene secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen una
queratinasa bajo condiciones que permitan la expresión de la
queratinasa codificada, filtrando el medio para eliminar las células
y recoger y concentrar el sobrenadante remanente mediante
ultrafiltración para obtener la queratinasa.
Aunque en el presente documento se ejemplifican
cepas de B. licheniformis, se contempla que también otros
microbios eucarióticos y procarióticos que contengan secuencias de
ácidos nucleicos que codifiquen una queratinasa puedan resultar
útiles para producir un suplemento para pienso de la presente
invención. Los microbios eucarióticos y procarióticos que contengan
secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen una queratinasa pueden
incluir aquellos que producen la enzima de modo natural, al igual
que las cepas modificadas genéticamente para que expresen
queratinasa. En general, la producción recombinante de una proteína
puede requerir la incorporación de secuencias de ácidos nucleicos
que codifican dicha proteína en un vector de expresión recombinante
en una forma adecuada para la expresión de la proteína en una
célula anfitriona. Una forma adecuada para la expresión permite que
el vector de expresión recombinante incluya una o más secuencias
reguladoras ligadas operativamente a los ácidos nucleicos que
codifican una proteína de queratinasa de una manera que permite la
transcripción de los ácidos nucleicos en ARNm y la traducción del
ARNm a la proteína. Las secuencias reguladoras pueden incluir
promotores, potenciadores y otros elementos de control de la
expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales
secuencias reguladoras resultan conocidas para las personas expertas
en la técnica y se describen en Goeddel D. D., ed., Gene Expression
Technology, Academic Press, San Diego, California (1991). Debería
entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de
factores tales como la elección de la célula anfitriona que ha de
ser transfectada y/o del nivel de expresión requerido. Las
secuencias de ácidos nucleicos o los vectores de expresión que
albergan secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína
de queratinasa pueden introducirse en una célula anfitriona, que
puede ser de origen eucariótico o procariótico, mediante técnicas
estándar para la transformación de células. Pueden encontrarse
procedimientos adecuados para transformar células anfitrionas en
Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª
edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000)) y en otros
manuales de laboratorio. El número de células anfitrionas
transformadas con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica
una proteína de queratinasa dependerá, al menos en parte, del tipo
de vector de expresión recombinante usado y del tipo de técnica de
transformación usada. Los ácidos nucleicos pueden introducirse en
una célula anfitriona de forma transitoria, o, más habitualmente,
para la expresión a largo plazo de una proteína de queratinasa, la
secuencia de ácidos nucleicos se integra de forma estable en el
genoma de la célula anfitriona o se queda como un episoma estable en
la célula anfitriona. Una vez producida, puede recuperarse una
proteína de queratinasa del medio de cultivo como un polipéptido
segregado, aunque también puede recuperarse de lisatos de la célula
anfitriona cuando se expresa directamente sin señal
secretora.
secretora.
Los microbios eucariotas, como los cultivos de
levadura, pueden ser transformados con vectores que portan
secuencias de ácidos nucleicos que codifican una queratinasa. Véase,
por ejemplo, la patente estadounidense Nº 4.745.057. Entre los
microorganismos anfitriones eucariotas inferiores, el de uso más
común es Saccharomyces cerevisiae, aunque hay disponibles
habitualmente varias cepas distintas. Los vectores de levadura
pueden contener un origen de replicación desde el plásmido de
levadura de 2 micrómetros o una secuencia replicante autónoma
(ARS), un promotor, ADN que codifica una queratinasa, como el
proporcionado en la patente estadounidense Nº 5.712.147, secuencias
de poliadenilación y terminación de la transcripción y un gen de
selección. Un plásmido ejemplar es YRp7 (Stinchcomb, et al.
(1979) Nature 282:39; Kingsman, et al. (1979) Gene 7:141;
Tschemper, et al. (1980) Gene 10:157). Secuencias promotoras
adecuadas en vectores de levaduras incluyen los promotores de la
metalotioneína, 3-fosfogliceratoquinasa (Hitzeman,
et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:2073) u otras enzimas
glicolíticas (Hess, et al. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149;
Holland, et al. (1978) Biochemistry 17:4900). Los vectores y
los promotores adecuados para su uso en la expresión de levaduras se
describen adicionalmente en la publicación EPO Nº 73.657. Además,
las cepas fúngicas como las de Trichoderma (por ejemplo,
T. longibrachiatum, T. reesei o T. viride) son
particularmente útiles en la expresión de enzimas segregadas.
Las células anfitrionas procariotas que pueden
usarse para producir una queratinasa incluyen organismos
gramnegativos o grampositivos; por ejemplo, Escherichia coli
(E. coli) o bacilos. Células anfitrionas ejemplares son
E. coli W3110 (ATCC 27.325), E. coli B, E. coli
X1776 (ATCC 31.537), E. coli 294 (ATCC 31.446). Hay
disponible una amplia variedad de vectores procarióticos y
microbianos adecuados. Típicamente, E. coli se transforma
usando pBR322. Los promotores usados más comúnmente en los vectores
de expresión microbianos recombinantes incluyen los sistemas
promotores de beta-lactamasa (penicilinasa) y
lactosa (Chang, et al. (1978) Nature 275:615; Goeddel, et
al. (1979) Nature 281:544), un sistema promotor del triptófano
(trp) (Goeddel, et al. (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057;
Publicación Nº 36.776) y el promotor tac (De Boer, et al.
(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21). El promotor y la secuencia
Shine-Delgarno (para la expresión en anfitriones
procariotas) están ligados operativamente al ADN que codifica la
queratinasa, es decir, están colocados para promover la
transcripción del ARN mensajero de la queratinasa a partir del ADN.
Preferentemente, se usa una especie de bacilo en la producción de
una queratinasa. Los vectores de expresión recombinantes para el
bacilo son bien conocidos para las personas con dominio de la
técnica. Las cepas de Bacillus pueden ser B.
alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. brevis,
B. circulans, B. coagulans, B. firmus, B.
lautus, B. lentus, B. licheniformis, B.
megaterium, B. pumilus, B. stearothermophilus,
B. subtilis, y B. thuringiensis. En una realización
preferida, se utilizan cepas de B. licheniformis. En algunas
realizaciones, se utilizan las cepas T399D o PWD-1
del B. licheniformis.
Tal como se contempla en el presente documento,
una enzima de queratinasa puede producirse cultivando una célula
anfitriona como se ha descrito más arriba bajo condiciones que
permitan la expresión de la queratinasa codificada y recogiendo la
queratinasa expresada. La célula anfitriona puede cultivarse bajo
condiciones en las que la célula crece, y luego cultivarse bajo
condiciones que causen la expresión de la queratinasa codificada, o
puede hacerse que las células crezcan y expresen la queratinasa
codificada a la vez. Tales condiciones son bien conocidas para una
persona con dominio de la técnica y pueden variar con la célula
anfitriona y la cantidad del nivel de expresión deseado de la
enzima.
En algunas realizaciones, el medio usado para
cultivar las células anfitrionas transformadas puede ser cualquier
medio adecuado para la producción de queratinasa. La queratinasa se
recupera del medio mediante técnicas convencionales, incluyendo la
separación de las células del medio mediante centrifugación, o
filtración, y concentración de las proteínas en el sobrenadante o
filtrado mediante ultrafiltración o evaporación, seguido por la
desecación mediante liofilización o deshidratación por
aspersión.
Alternativamente, el sobrenadante del cultivo
puede deshidratarse por aspersión o liofilizarse después de la
separación, sin ser concentrado.
La queratinasa debería estar presente en una
cantidad al menos suficiente para lograr el efecto deseado, pero el
límite superior de la cantidad de queratinasa puede determinarse en
base al logro del efecto deseado. En algunas realizaciones, el
pienso comprende desde aproximadamente el 0,01% hasta
aproximadamente el 20% en peso de queratinasa del Bacillus
licheniformis PWD-1. Además, las queratinasas
usadas en la práctica de la presente invención pueden estar en
forma cruda o en forma pura. Las queratinasas en forma cruda pueden
prepararse, por ejemplo, separando de sus medios líquidos de cultivo
las células bacterianas que producen la queratinasa, comprendiendo
queratinasa cruda los medios líquidos de cultivo. Alternativamente,
las células pueden ser lisadas (de forma química o física) en un
medio de cultivo líquido para producir un extracto crudo libre de
células. Otros medios de preparación de un extracto tal serán
evidentes para las personas versadas en la técnica. La queratinasa
cruda puede incluirse en el pienso en cualquier forma compatible con
él, como en una forma acuosa o en forma liofilizada. En algunas
realizaciones, la queratinasa cruda está en la forma
liofilizada.
Pueden obtenerse queratinasas puras (o
sustancialmente puras) separando la queratinasa cruda descrita
anteriormente en sus constituyentes individuales conforme a
técnicas conocidas. Véase en general W. Jakoby, Ed., Enzyme
purification and Related Techniques, Methods in Enzymology, tomo 22
(1971) y tomo 104, parte C (1984), Academic Press, Nueva York. Las
personas expertas en la técnica conocen números procedimientos de
separación adecuados, como la cromatografía en columna. Puede
estudiarse la capacidad de las proteínas constituyentes individuales
para degradar el material queratináceo, y ese constituyente que
mejor degrade el material queratináceo comprende la queratinasa.
Como la queratinasa cruda, la queratinasa pura puede emplearse de
cualquier forma adecuada, incluyendo la forma acuosa y la forma
liofilizada.
Las realizaciones de la presente invención
tienen relación además con procedimientos de mejora de la eficiencia
de la utilización del pienso de un pienso en aves de corral para
carne que comprende alimentar aves de corral para carne con una
dieta de pienso para aves de corral en el que el pienso comprende
además queratinasa en una cantidad efectiva para mejorar la
eficiencia de la utilización del pienso de un pienso proporcionado a
aves de corral para carne. El pienso puede incluir los piensos
según se ha descrito en lo que antecede y, en realizaciones
particulares, puede ser harina de maíz y de soja. La queratinasa
puede incluir queratinasas según se ha descrito en lo que antecede,
incluyendo, sin limitación, la queratinasa del Bacillus
licheniformis PWD-1. Tal como se ha descrito
anteriormente, la queratinasa puede ser un extracto crudo o la
enzima en forma pura.
La mejora de la eficiencia de la utilización del
pienso se refiere a la reducción del Coeficiente de Conversión del
Pienso (CCP) en comparación con el que se daría en todo caso sin la
implementación de los procedimientos y/o la administración de las
composiciones de la presente invención. El CCP es la proporción de
la cantidad de pienso consumida en relación con el aumento de peso
de un animal. En una realización de la presente invención, la
eficiencia mejorada de la utilización del pienso puede ocurrir
aumentando la absorción gastrointestinal de nutrientes sin un
aumento concomitante en el gasto de energía intestinal. En otra
realización de la presente invención, la eficiencia mejorada de la
utilización del pienso puede ocurrir aumentando la digestibilidad
del pienso. En otra realización de la presente invención, la
eficiencia mejorada de la utilización del pienso puede ocurrir
disminuyendo la viscosidad del pienso. En realizaciones
particulares, la presente invención se relaciona con procedimientos
de aumento de la digestibilidad de un pienso en aves de corral para
carne que comprende alimentar aves de corral para carne con una
dieta de pienso para aves de corral en la que el pienso comprende
además queratinasa del Bacillus licheniformis
PWD-1 en una cantidad efectiva para aumentar la
digestibilidad de un pienso en aves de corral para carne. El pienso
puede incluir los piensos según se ha descrito en lo que antecede
y, en realizaciones particulares, puede ser harina de maíz y de
soja. La queratinasa puede incluir queratinasas según se ha
descrito en lo que antecede, incluyendo, sin limitación, la
queratinasa del Bacillus licheniformis
PWD-1. Tal como se ha descrito anteriormente, la
queratinasa puede ser un extracto crudo o la enzima en forma pura.
El aumento de la digestibilidad de un pienso se refiere al aumento
de la disponibilidad de los nutrientes absorbidos desde el
intestino del animal sin un aumento concurrente en la ingesta de
pienso o en la ingesta de nutrientes. En algunas realizaciones de la
presente invención, se reduce la viscosidad de los materiales
presentes en el intestino del animal o la viscosidad del contenido
digestivo. En otras realizaciones, se reduce la captura de
nutrientes, haciendo que dejen de ser nutricionalmente disponibles
para el
animal.
animal.
En otras realizaciones, la presente invención se
relaciona con procedimientos de reducción de la mortalidad en aves
de corral de carne que comprenden alimentar aves de corral para
carne con una dieta de pienso para aves de corral en la que el
pienso comprende además una queratinasa en una cantidad efectiva
para reducir la mortalidad de aves de corral para carne, por
ejemplo aves inmaduras y, más específicamente, pollo tomatero. El
pienso puede incluir los piensos según se ha descrito en lo que
antecede y, en realizaciones particulares, puede ser harina de maíz
y de soja. La queratinasa puede incluir queratinasas según se ha
descrito en lo que antecede, incluyendo, sin limitación, la
queratinasa del Bacillus licheniformis PWD-1.
Tal como se ha descrito anteriormente, la queratinasa puede ser un
extracto crudo o la enzima en forma pura. La reducción de la
mortalidad se refiere al aumento de la capacidad de supervivencia o
a la disminución del índice de mortalidad en animales después de su
nacimiento o eclosión, en comparación con la que ocurriría en todo
caso en ausencia de la implementación de los procedimientos y/o la
administración de las composiciones de la presente invención. La
mortalidad puede ser por cualquier causa, en particular, estrés,
atrofia, infraalimentación y enfermedad. En algunas realizaciones,
la presente invención reduce la mortalidad en aves inmaduras. En
otras realizaciones, las aves tienen aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25, 26, 27, 25, 29, 31, 32, 33, 34 o 35 días de vida,
preferentemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 21 días
de vida, y más preferentemente entre aproximadamente 1 y
aproximadamente 5 días de vida.
En algunas realizaciones, la presente invención
se relaciona con un pienso que comprende proteínas, hidratos de
carbono y queratinasa como componentes fundamentales. La queratinasa
es un componente fundamental que complementa el pienso. El pienso
puede incluir los piensos según se ha descrito en lo que antecede y,
en realizaciones particulares, puede ser harina de maíz y de soja.
La queratinasa puede incluir queratinasas según se ha descrito en
lo que antecede, incluyendo, sin limitación, la queratinasa del
Bacillus licheniformis PWD-1. Tal como se ha
descrito anteriormente, la queratinasa puede ser un extracto crudo o
la enzima en forma pura.
El suplemento de pienso proporcionado por la
presente invención puede mezclarse directamente con el pienso, como
uno que comprenda cebada, para preparar el pienso final.
Alternativamente, el suplemento de pienso puede mezclarse con uno o
más suplementos de pienso, como un suplemento vitamínico para el
pienso, un suplemento mineral para el pienso y un suplemento de
aminoácidos para el pienso. El suplemento resultante para el pienso,
que incluye varios tipos diferentes de componentes, puede mezclarse
entonces en una cantidad apropiada con el pienso.
El pienso de la presente invención comprende
queratinasa en una cantidad al menos suficiente parar lograr el
efecto deseado, en el que el límite superior a la cantidad de
queratinasa puede determinarse en base al logro del efecto deseado.
Los efectos deseados incluyen, sin limitación, la potenciación del
rendimiento de la cría del animal, tal como el aumento de peso, la
mejora de la eficiencia en la utilización del pienso, el aumento de
la digestibilidad del pienso y el descenso de la mortalidad. El
suplemento para pienso añadido al pienso puede comprender hasta el
100% de queratinasa en peso. El pienso que comprende el suplemento
comprende desde aproximadamente el 0,01% hasta aproximadamente el
5% de queratinasa en peso. En algunas realizaciones, la queratinasa
es queratinasa del Bacillus licheniformis
PWD-1.
Cualquier animal, incluyendo vacas, ovejas,
cerdos, gatos, perros, hurones y aves, es un candidato adecuado
para la presente invención; sin embargo, la presente invención se
emplea preferentemente con animales monogástricos. Los candidatos
adecuados pueden estar en cualquier intervalo de edad, incluyendo
animales neonatos, animales en desarrollo y animales maduros. En
algunas realizaciones, el candidato adecuado puede ser un ave,
preferentemente un pollo, y más preferentemente un pollo tomatero.
En otras realizaciones, el candidato adecuado puede ser un pollo.
En otras realizaciones adicionales, el candidato adecuado puede ser
un ave inmadura, en desarrollo o madura. En otras realizaciones, el
candidato adecuado puede ser un pollo que tenga 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,
25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,
42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,
59, 60, 61, 62, 63, 64, o 65 días de vida, o que esté dentro de
cualquier intervalo de estos números. Así, la presente invención
proporciona una variedad de piensos diferentes, incluyendo pienso
para mascotas, pienso para aves de corral y pienso para cerdos.
El suplemento para pienso de la presente
invención también puede permitir que un pienso convencional se
modifique su contenido energético y/o proteínico y/o de
aminoácidos, mientras que se mantienen simultáneamente los mismos
niveles nutricionales de energía, proteínas y de aminoácidos
disponibles para el animal. En consecuencia, las cantidades de
costosos suplementos de energía y proteínas que se incluyen
típicamente en un pienso pueden reducirse en comparación con los
piensos convencionales.
\newpage
Se proporcionan los siguientes Ejemplos para
ilustrar la presente invención, y no deberían interpretarse como
una limitación de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñó una estrategia de fermentación con
ampliación de escala para la producción de queratinasa usando la
cepa PWD-1 del B. licheniformis de tipo
salvaje.
Cultivo en matraz en un medio LB. El
cultivo en matraz se llevó a cabo en un medio
Luria-Bertani (LB), que se preparó según la
especificación del fabricante, que contenía: 1,0 L de agua
destilada, 15 g de agar BACTO®, 10 g de NaCl, 10 g de triptona
BACTO® y 5,0 g de extracto de levadura. Se raspó B.
licheniformis de la cepa PWD-1 de glicerol
madre sobre una placa LB y se cultivo a 50ºC durante
8-12 horas. Acto seguido, se transfirió una única
colonia de la cepa WPD-1 del B. licheniformis
desde la placa LB a un matraz que contenía 500 ml del medio LB, y
se cultivó a 50ºC durante 6 horas.
Cultivos de semillas. Se llevaron a cabo
cultivos de semillas de la cepa PWD-1 del B.
licheniformis en un medio que contenía: 0,7 g/L de
KH_{2}PO_{4}, 1,4 g/L de K_{2}HPO_{4}, 0,1 g/L de
MgSO_{4}\bullet7H_{2}O, 10 g/L de harina de soja desgrasada y
0,1 g/L de agente antiespumante. El pH inicial del cultivo de
semillas se ajustó a 7,0 añadiendo HCl o NaOH
1M.
1M.
El cultivo del matraz de 500 ml se transfirió a
un fermentador de semillas de primera etapa de entre aproximadamente
10 L y 20 L que contenía el medio de cultivo de las semillas, y se
cultivó en su interior a 50ºC durante 8-12 horas
para alcanzar un tamaño de inóculo del 2,5% al 5%. El cultivo de
semillas de primera etapa se transfirió a continuación a un
fermentador de semillas de segunda etapa de 100 L, 250 L u 800 L, y
se cultivó en su interior a 50ºC durante 8 horas y luego se pasó a
37ºC.
Para el cultivo de semillas, la densidad celular
alcanzó al menos 3 \times 10^{8} UFC/mL a aproximadamente las 8
o 10 horas del procedimiento de cultivo.
Medios de producción. El medio de cultivo
de producción usado para la cepa PWD-1 del B.
licheniformis contenía 0,7 g/L de KH_{2}PO_{4}, 1,4 g/L de
K_{2}HPO_{4}, 0,1 g/L de MgSO_{4}\bullet7H_{2}O, 10 g/L
de harina de soja desgrasada y 0,1 g/L de agente antiespumante. El
pH inicial del cultivo de semillas se ajustó a 7,0 añadiendo HCl o
NaOH 1M.
El cultivo de semillas de segunda etapa se
transfirió a un fermentador de producción que contenía el medio de
cultivo de producción para la etapa final del cultivo. La etapa
final del cultivo se llevó a cabo a 50ºC durante 8 horas,
alcanzando un tiempo total de cultivo de aproximadamente 24 a 30
horas antes de la recolección.
Durante las anteriores etapas de cultivo, el pH
inicial del medio de cultivo se ajustó a 7,0, pero no se proporcionó
ningún control del pH durante el procedimiento de cultivo. El nivel
óptimo del oxígeno disuelto fue de aproximadamente el 20% para la
cepa PWD-1 del B. licheniformis. El tamaño
del inóculo fue aproximadamente del 2,5% al 5%, y la edad del
inóculo fue de aproximadamente 8-12 horas.
Para el cultivo de producción, la densidad
máxima de las células alcanzó 1,2 \times 10^{9} UFC/mL a
aproximadamente las 20 o 24 horas del procedimiento de cultivo. La
máxima actividad enzimática, según la medición del ensayo de
azocaseína, alcanzó 35-40 A_{450} por mL a
aproximadamente 24 a 30 horas del procedimiento de cultivo. El
valor pH del medio de cultivo de producción cambió de 7,0 a 8,3,
pero la actividad enzimática y la producción se mantuvieron a
niveles elevados, lo que indicaba que no era necesario ningún
control del pH.
Recuperación y tratamiento ulterior. Se
comprobó la actividad enzimática en el cultivo de producción antes
de la recolección. Se separó el sobrenadante del cultivo de la masa
celular mediante centrifugación, y a continuación se concentró
mediante ultrafiltración o evaporación. Acto seguido, la enzima
líquida concentrada se deshidrató por aspersión.
Alternativamente, el sobrenadante del cultivo se
deshidrató por aspersión directamente después de la separación de
la masa celular, sin ser concentrado.
Producción de enzimas y actividad
enzimática. Para un cultivo de producción de 100 L, la actividad
enzimática medida mediante el ensayo de azocaseína fue de 3.000 a
3.500 U/mL, y el número de células fue de 1,3 \times 10^{9}
UFC/mL. El peso seco total del cultivo de producción de 100 L fue de
9,12 g/L, que incluía 2,15 g/L de peso seco insoluble y 6,88 g/L de
peso seco soluble.
La producción de enzima cruda fue de
aproximadamente 1,75-2,0 g/L. La enzima cruda se
preparó por concentración del sobrenadante de la fermentación
mediante filtración Pellicon con un límite de peso molecular de 5
kDa, y, a continuación, se secó por congelación. La actividad
enzimática de la enzima seca cruda estuvo entre aproximadamente
1.000.000 y aproximadamente 1.400.000 U/g, según la medición del
ensayo de azocaseína. El contenido total en proteínas de la enzima
seca cruda fue de aproximadamente el 30-36%, del
cual aproximadamente el 14-20% consistía en
queratinasa pura.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñó una estrategia de fermentación con
ampliación de escala para la producción de queratinasa usando una
cepa T399D recombinante del B. licheniformis (en lo sucesivo,
"cepa T1 del Bacillus licheniformis").
Cultivo en matraz en un medio LB. El
cultivo en matraz se llevó a cabo en un medio LB, que se preparó
según la especificación del fabricante, que contenía: 1,0 L de agua
destilada, 15 g de agar BACTO®, 10 g de NaCl, 10 g de triptona
BACTO® y 5,0 g de extracto de levadura. Se raspó B.
licheniformis de la cepa T1 de glicerol madre sobre una placa
LB y se cultivo a 37ºC durante 18 horas. Acto seguido, se transfirió
una única colonia de la cepa T1 del B. licheniformis desde
la placa LB a un matraz que contenía 500 ml del medio LB, y se
cultivó a 37ºC durante 6 horas. El crecimiento celular se monitorizó
midiendo la densidad óptica a 660 nm (espectrofotómetro Beckman DU
serie 660, Fullerton, California). Después de 6 horas de cultivo, el
OD_{660} medía por encima de 1,0.
Cultivos de semillas. Se realizaron
cultivos de semillas de la cepa T1 del B. licheniformis en un
medio que contenía: 0,7 g/L de KH_{2}PO_{4}, 1,4 g/L de
K_{2}HPO_{4}, 0,1 g/L de MgSO_{4}\bullet7H_{2}O, 10 g/L
de harina de soja desgrasada y 0,1 g/L de agente antiespumante. El
pH inicial del cultivo de semillas se ajustó a 7,0 añadiendo HCl o
NaOH 1M.
El cultivo del matraz de 500 ml se transfirió a
un fermentador de semillas de primera etapa de entre aproximadamente
10 L y 20 L que contenía el medio de cultivo de las semillas, y se
cultivó en su interior a 37ºC durante 8 horas para alcanzar un
tamaño de inóculo del 2,5% al 5%. El cultivo de semillas de primera
etapa se transfirió a continuación a un fermentador de semillas de
segunda etapa de 100 L, 250 L u 800 L, y se cultivó en su interior
a 37ºC durante 8 horas.
Medios de producción. El medio de cultivo
de producción usado para la cepa T1 del B. licheniformis
contenía 0,7 g/L de KH_{2}PO_{4}, 1,4 g/L de K_{2}HPO_{4},
0,1 g/L de MgSO_{4}\bullet7H_{2}O, 13 g/L de harina de soja
desgrasada, 40 g/L de almidón, 13 g/L de harina de plumas y 0,1 g/L
de agente antiespumante. El pH inicial del cultivo de semillas se
ajustó a 7,0 añadiendo HCl o NaOH 1M.
El cultivo de semillas de segunda etapa se
transfirió a un fermentador de producción que contenía el medio de
cultivo de producción para la etapa final del cultivo. La etapa
final del cultivo se llevó a cabo a 37ºC durante 48 horas antes de
la recolección.
Durante las anteriores etapas de cultivo, el pH
inicial del medio de cultivo se ajustó a 7,0, pero no se proporcionó
ningún control del pH durante el procedimiento de cultivo. El nivel
óptimo del oxígeno disuelto fue de aproximadamente el 30% para la
cepa T1 del B. licheniformis. El tamaño del inóculo fue
aproximadamente del 2,5% al 5%, y la edad del inóculo fue de
aproximadamente 12 horas.
Recuperación y tratamiento ulterior. Se
comprobó la actividad enzimática en el cultivo de producción antes
de la recolección. Se separó el sobrenadante del cultivo de la masa
celular mediante centrifugación, y a continuación se concentró
mediante ultrafiltración o evaporación. Acto seguido, la enzima
líquida concentrada se deshidrató por aspersión.
Alternativamente, el sobrenadante del cultivo se
deshidrató por aspersión directamente después de la separación de
la masa celular, sin ser concentrado.
Producción de enzimas y actividad
enzimática. Para un cultivo de producción de 100 L, la actividad
enzimática medida mediante el ensayo de azocaseína antes de la
recolección fue de 30.000 a 35.000 U/mL, y el número de células fue
de 6 \times 10^{9} UFC/mL. El peso seco total del cultivo de
producción de 100 L fue de 40 g/L, que incluía 15 g/L de peso seco
insoluble y 25 g/L de peso seco soluble. La producción de enzima
cruda fue de aproximadamente 20 g/L, mientras que la producción de
enzima cruda a partir de un concentrado del cultivo, según se
obtuvo mediante filtración Pellicon con un límite de peso molecular
de 10 kDa, fue de 16 g/L. La actividad enzimática de la enzima seca
cruda fue mayor de 1.000.000 U/g, según la medición del ensayo de
azocaseína.
\vskip1.000000\baselineskip
Aves e instalaciones. Se llevaron a cabo
tres experimentos. En cada experimento, se pesaron pollitos
tomateros de 192 días de vida y fueron asignados aleatoriamente a
gallineros de 24 jaulas en un diseño completamente aleatorio a dos
baterías de Alternate Design (Wilveco, Billerica, Massachusetts).
Las aves fueron pesadas, se les ataron las alas y se las empezó a
someter a los tratamientos experimentales a los cinco (experimentos
uno y dos) o un (experimento tres) días de vida. Cada tratamiento se
replicó cinco veces con ocho aves por gallinero. Las aves
estuvieron albergadas en una habitación con temperatura, ventilación
e iluminación controladas (24 horas/día). Durante el periodo
experimental, las aves se alimentaron ad libitum mediante
comederos y tomaron agua mediante bebederos de pezón.
La enzima queratinasa
PWD-1. Se produjo la enzima queratinasa
PWD-1 con un fermentador de 150 L usando
procedimientos estándar (Wang and Shih (1998) J. Indust. Microb.
Biotech. 22:608-616). En pocas palabras, se cultivó
Bacillus licheniformis PWD-1 (Williams,
et al. (1990) supra) en el fermentador a 50ºC durante
48 horas. Los medios libres de células se concentraron mediante
ultrafiltración por membrana y se secaron con un secador por
congelación. Típicamente, la producción de la enzima cruda fue de
2,0 g/L. La queratinasa cruda tenía una actividad de 300.000 U/g
según la medición mediante la hidrólisis de azoqueratina (Lin, et
al. (1992) supra).
Tratamientos dietéticos. Todas las dietas
se formularon usando software de programación lineal de bajo
coste y se presentan en la Tabla 1.
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Todo el pienso se suministró en forma de pasta a
lo largo de los experimentos. Las aves recibieron una dieta basal
con un día de vida y, subsiguientemente, pasaron a las
correspondientes dietas experimentales a los cinco días de vida. En
el experimento uno, la dieta basal suministrada durante los primeros
cinco días fue de aproximadamente el 93% de las recomendaciones de
proteína cruda ((1994) supra) del National Research Council
(NRC) de EE. UU., pero aportaba el 100% del contenido en aminoácidos
esenciales, energía, calcio y fósforo. En los experimentos dos y
tres, la dieta basal suministrada durante los primeros cinco días
fue de aproximadamente el 95% de las recomendaciones del NRC
((1994) supra) en cuanto a contenido energético y del 100%
de calcio y fósforo, pero aportaba un 105% de contenido proteínico
crudo. Subsiguientemente, un gallinero de pollitos tomateros fue
sometido a uno de cinco tratamientos dietéticos hasta el final de
cada experimento (21 días en los experimentos uno y tres, 26 días
en el experimento dos). Los cinco tratamientos dietéticos en los
experimentos uno y dos fueron: 1) dieta de control sin suplementos
(C, 21,39% de proteína cruda); 2) dieta pobre en proteínas (PP, 18%
de proteína cruda); 3) dieta pobre en proteínas complementada con
una preparación enzimática al 0,05% (p/p) (PP+0,05E); 4) dieta pobre
en proteínas complementada con una preparación enzimática al 0,10%
(p/p) (PP+0,10E); y 5) dieta pobre en proteínas complementada con
una preparación enzimática al 0,15% (p/p) (PP+0,15E). La dieta de
control era la misma dieta basal suministrada a las aves durante
los primeros cinco días de vida en el experimento uno. Las aves del
tratamiento uno siguieron recibiendo la misma dieta después de los
cinco días de vida, mientras que el resto de los tratamientos
cambiaron a las dietas experimentales a los cinco días de vida. Los
tratamientos dietéticos del experimento tres fueron: 1) dieta de
control sin suplementos (C, 21,39% de proteína cruda); 2) dieta de
control complementada con una preparación enzimática al 0,10% (p/p)
(C+0,10E); 3) dieta pobre en proteínas (PP, 18% de proteína cruda);
4) dieta pobre en proteínas complementada con una preparación
enzimática al 0,10% (p/p) (PP+0,10E); y 5) igual que el tratamiento
dos, pero suministrado a aves a partir del primer día de vida, en
vez de a los cinco días de vida.
La dosis de enzima se disolvió en una solución
de carbonato sódico 0,10 N en una proporción de 1 gramo de
enzima/10 ml de solución antes de la aplicación al pienso. Después,
la solución enzimática se roció encima del pienso usando una
botella a pulverización en una proporción de 10 ml de preparación de
enzima/kg de dieta, y se mezcló usando una batidora con tazón de
mezcla (The Hobart Manufacturing Company, Troy, Ohio).
Viscosidad del contenido digestivo. Al
final de cada experimento, todas las aves del gallinero, salvo dos,
fueron sometidas a eutanasia usando gas CO_{2}. Las dos aves
restantes por gallinero se mantuvieron hasta el día siguiente. Al
comienzo del día siguiente, se retiraron los comederos de los
gallineros para producir un periodo de 2 horas sin acceso al
pienso. Después de las 2 horas, se volvió a permitir que las aves
tuvieran acceso al pienso ad libitum. Una hora más tarde, se
sacaron las aves, de dos en dos, y subsiguientemente fueron
sometidas a eutanasia usando gas CO_{2}. Se llevó a cabo la
necropsia inmediatamente después de la eutanasia, y se vació el
contenido del yeyuno en tubos Eppendorf de 1 ml. Se obtuvieron dos
muestras por ave. Los tubos fueron centrifugados inmediatamente a
12.000 \times g durante 5 minutos y colocados inmediatamente en
hielo hasta que se midió la viscosidad usando un viscosímetro de
tipo comercial (Brookfield Digital Viscometer, Modelo
DV-II Versión 2.0, Brookfield Engineering
Laboratories, Inc., Stoughton, Massachusetts). La lectura de la
viscosidad se realizó bajo condiciones que evitaban cualquier
desarrollo bacteriano en la solución.
Análisis de los datos. Se registraron los
pesos corporales y el consumo de pienso a intervalos de cinco días
a partir de un día de vida y hasta el final de cada experimento. Se
calculó el coeficiente de conversión del pienso (ganancia en peso
con respecto al pienso), corregido por la mortalidad y ejemplares
desechados. La mortalidad se registró diariamente. El peso
corporal, el consumo de pienso, el coeficiente de conversión del
pienso y las lecturas de viscosidad de cada experimento se
analizaron por separado usando análisis de un factor de los
procedimientos generales de modelo lineal del software SAS
(SAS Institute (1996) SAS/STAT User's Guide: Statistics. Release
6.11. SAS Institute, Inc., Cary, Carolina del Norte). Los datos
porcentuales fueron sometidos a ANOVA después de la transformación
del porcentaje de la raíz cuadrada del arco seno. Las medias se
separaron usando la diferencia menos significativa. Las
declaraciones de significación se basaban en P \leq
0,05.
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 2 se presentan el peso corporal
final, el consumo acumulado de pienso y los coeficientes de
conversión del pienso.
Por lo general, los tratamientos con enzimas
mejoraban el peso corporal con un valor de probabilidad de P
> 0,05. El tratamiento pobre en proteínas + 0,10% de enzima tuvo
un peso corporal mayor que el tratamiento pobre en proteínas (700
frente a 668 gramos para el tratamiento pobre en proteínas + 0,10%
de enzimas frente al tratamiento pobre en proteínas,
respectivamente, P = 0,08). El tratamiento pobre en proteínas
+ 0,10% de enzima tuvo el mayor peso corporal entre los
tratamientos con enzimas y no fue diferente del tratamiento de
control (700 frente a 709 gramos para el tratamiento pobre en
proteínas + 0,10% de enzima frente al control,
respectivamente).
No hubo diferencias significativas entre los
tratamientos en cuanto al consumo de pienso, salvo entre el
tratamiento pobre en proteínas + 0,15% de enzima y el de control
(826 frente a 901 gramos para el tratamiento pobre en proteínas +
0,15% de enzima frente al tratamiento de control, respectivamente,
P < 0,05). No hubo diferencias significativas en el
consumo de pienso entre los grupos de tratamientos con enzimas.
En todo el experimento murió una sola ave. El
peso de esta ave muerta y de los ejemplares desechados se incluyó
en el cálculo del coeficiente de conversión del pienso, que se
presenta en la Tabla 2. El complemento enzimático dietético tuvo
efectos marginales en el coeficiente de conversión del pienso.
Acumulativamente, el tratamiento pobre en proteínas + 0,10% de
enzima tuvo el menor coeficiente de conversión del pienso (1,51
frente a 1,57 para el tratamiento pobre en proteínas + 0,10% de
enzima frente al tratamiento pobre en proteínas, respectivamente,
P > 0,05).
Los resultados del primer experimento revelaron
una tendencia en la respuesta al tratamiento enzimático. Para
analizar adicionalmente el efecto positivo de la enzima durante un
lapso mayor, se llevó a cabo un segundo experimento criando las
aves 5 días más (hasta los 26 días de vida).
\vskip1.000000\baselineskip
Este experimento fue una repetición del
experimento 1 salvo en que las aves fueron criadas 5 días más (hasta
los 26 días de vida). En la Tabla 3 se presentan el peso corporal
final, el consumo acumulado de pienso y el coeficiente de
conversión del pienso.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Hubo una mejora en peso corporal (P <
0,05) tras complementar la dieta pobre en proteínas con los tres
niveles de la enzima a los 26 días de vida. El tratamiento pobre en
proteínas + 0,10% de enzima dio la mayor mejora en peso corporal
(1.032 y 1.025 frente a 954 gramos para el tratamiento pobre en
proteínas + 0,15% de enzima y el tratamiento pobre en proteínas +
0,10 frente al tratamiento pobre en proteínas, respectivamente,
P < 0,05). Sin embargo, todos los tratamientos con enzima
tenían un peso corporal menor (P < 0,05) que el
tratamiento de control (1.032, 1.025 y 1.016 frente a 1.089 gramos
para el tratamiento pobre en proteínas + 0,15% de enzima, el
tratamiento pobre en proteínas + 0,10% de enzima y el tratamiento
pobre en proteínas + 0,05% de enzima frente al tratamiento de
control, respectivamente).
Todas las aves que recibieron la dieta pobre en
proteínas consumieron más pienso que el grupo de control (P
< 0,05). Los grupos con tratamiento de enzimas también
consumieron más pienso que con la dieta pobre en proteínas
(P < 0,05; Tabla 2). No hubo diferencias significativas en
el consumo de pienso entre los tratamientos con enzimas. El
complemento con enzimas a niveles del 0,05 y el 0,15% dio como
resultado coeficientes de conversión del pienso numéricamente
mejores que los del tratamiento pobre en proteínas, mientras que el
tratamiento pobre en proteínas + 0,10% de enzima mostró un
coeficiente de conversión del pienso significativamente mejor
(P < 0,05) que el del tratamiento pobre en proteínas (2,02
frente a 2,14 para el tratamiento pobre en proteínas + 0,10% de
enzima frente al tratamiento pobre en proteínas, respectivamente).
En este experimento, complementar la dieta pobre en proteínas con
enzimas no mejoró el rendimiento de los pollitos a un nivel
equivalente al de la dieta de control. Sin embargo, complementar la
dieta pobre en proteínas con el nivel del 0,10% de enzima (p/p) sí
mejoró (P < 0,05) el rendimiento de los pollitos con
respecto al de la dieta pobre en proteínas.
Se suministró la dieta de control tanto las aves
del experimento 1 como las del 2 durante los primeros 5 días de
vida antes de someterlas a las dietas de tratamiento. Aunque la
dieta de control proporcionaba energía, calcio, fósforo y
aminoácidos esenciales adecuados, proporcionaba únicamente el 93% de
la recomendación en cuanto a proteína cruda del NRC ((1994)
supra), lo que la hacía marginalmente adecuada y sensible a
la complementación con proteasas.
\vskip1.000000\baselineskip
En el experimento 3, se proporcionó a las aves
una dieta preinicial que aportaba un 105% de la recomendación del
NRC ((1994) supra) en cuanto a proteína cruda y
requerimientos ligeramente más altos para los otros nutrientes,
salvo en energía (95% de las recomendaciones del NRC; Tabla 1). El
experimento 3 se llevó a cabo para determinar si la enzima seguiría
ejerciendo o no su efecto aun después de que los pollitos hubiesen
recibido los requisitos adecuados de nutrientes.
En este experimento, únicamente se usó un nivel
de la enzima (0,10% p/p). Sin embargo, se introdujeron dos nuevos
tratamientos para comprobar la capacidad de la enzima para ejercer
un efecto en el complemento de dietas iniciales para pollos
tomateros marginalmente adecuados. Los dos nuevos tratamientos
consistían en complementar la misma dieta de control (21,39% de
proteína cruda) usada en los experimentos 1 y 2 con 0,10% de enzima
(p/p) y empezar a dar el pienso tratado a los pollitos o bien a los
cinco días de vida (tratamiento 2) o al día (tratamiento 5) de
vida. Esto proporcionó información de si el complemento enzimático
en el primer día de vida supondría alguna mejora adicional en el
rendimiento.
En la Tabla 4 se presentan el peso corporal
final, el consumo acumulado de pienso y el coeficiente de conversión
del pienso.
Aunque los datos de la Tabla 2, la Tabla 3 y la
Tabla 4 muestran únicamente los números del peso corporal final de
las aves en los diferentes experimentos, las aves fueron pesadas
cada 5 días en cada uno de los experimentos. Al contemplar los
números de los intervalos de 5 días para este experimento, resultaba
evidente que complementar la dieta pobre en proteínas con la enzima
en el experimento 3 mostraba un efecto similar en cuanto a aumento
de peso corporal a los de los experimentos 1 y 2. Complementar la
dieta pobre en proteínas con la enzima aumentó el peso corporal de
las aves con 21 días de vida, pero el efecto no pudo detectarse con
P < 0,05 (679 frente a 651 gramos para el tratamiento
pobre en proteínas + 0,10% de enzima frente al tratamiento pobre en
proteínas, respectivamente, P > 0,05). Sin embargo,
complementar la dieta de control con la enzima (control + 0,10% de
la preparación enzimática, tratamientos 2 y 5) mostró un peso
corporal mayor que el tratamiento de control (767 y 764 frente a
695 gramos para los tratamientos 2 y 5 frente al tratamiento de
control, respectivamente, P < 0,05). Inesperadamente, el
complemento de la dieta de control con la enzima mostró mejoras
significativamente más elevadas en peso corporal que cuando la
dieta pobre en proteínas se complementó con la enzima, ya se
complementara la enzima en el primero o a los cinco días de vida
(Tabla 4). Esto puede haberse debido al mayor contenido en
proteínas y/o aminoácidos de la dieta de control con respecto a la
dieta pobre en proteínas. La queratinasa es una enzima proteasa de
amplio espectro que ataca las proteínas de diferentes orígenes y las
reduce a componentes polipéptidos menores. Estos polipéptidos se
hacen más fáciles de degradar por las enzimas digestivas en la luz
de los intestinos. Un contenido más elevado de proteína cruda y/o de
aminoácidos en la dieta (en este caso, la dieta de control)
significa un contenido mayor de sustrato con el que opere la enzima,
liberando más componentes proteínicos y haciéndolo más disponible
para el pollito, lo que, a su vez, se reflejará en un mayor aumento
de peso corporal.
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 5 se presentan las lecturas de
viscosidad (mPa\cdots) del contenido del yeyuno de pollitos
tomateros de 22 días de vida (experimentos 1 y 2) y de 27 días de
vida (experimento 3) de los tres experimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
Complementar con queratinasa tanto la dieta
pobre en proteínas como la de control en todos los experimentos
redujo la viscosidad del contenido del yeyuno. La reducción fue
directamente proporcional al nivel de enzima añadida. Complementar
la dieta pobre en proteínas con un 0,15% de enzima (tratamiento
pobre en proteínas + 0,15% de enzima) redujo la viscosidad del
contenido del yeyuno en los experimentos 1 y 2 (2,27 y 1,08
mPa\cdots frente a 3,59 y 2,36 mPa\cdots para el tratamiento
pobre en proteínas + 0,15% de enzima frente al tratamiento pobre en
proteínas en los experimentos 1 y 2, respectivamente, P <
0,05). El tratamiento pobre en proteínas + 0,15% de enzima también
tuvo una viscosidad del yeyuno menor en comparación con el
tratamiento de control (2,27 y 1,98 mPa\cdots frente a 3,65 y
2,31 mPa\cdots para el tratamiento pobre en proteínas + 0,15% de
enzima frente al tratamiento de control en los experimentos 1 y 2,
respectivamente, P < 0,05).
Cuando se complementó la dieta de control con
queratinasa a los 5 días de vida, también se redujo la viscosidad
del yeyuno (2,18 mPa\cdots frente a 2,55 mPa\cdots para el
tratamiento de control + 0,10% de enzima [experimento 3,
tratamiento 2] frente al tratamiento de control, respectivamente,
P > 0,05). Sin embargo, la reducción fue significativa
únicamente cuando la dieta complementada con la enzima a partir del
primer día de vida (1,99 mPa\cdots frente a 2,55 mPa\cdots para
el tratamiento de control + 0,10% de enzima [experimento 3,
tratamiento 5] frente al tratamiento de control, respectivamente,
P > 0,05).
Los anteriores ejemplos son ilustrativos de la
presente invención, y no deben interpretarse como una limitación de
la misma. La invención se describe mediante las reivindicaciones
siguientes, con equivalentes de las reivindicaciones que han de
incluirse en las mismas.
Claims (31)
1. Un procedimiento de crianza de aves de corral
para carne, que comprende:
- alimentar a dichas aves de corral para carne con un pienso de harina de maíz y de soja como dieta para aves de corral, en el que dicha dieta para aves de corral comprende no más del 1% en peso de queratina,
- comprendiendo además dicho pienso queratinasa en una cantidad efectiva para potenciar el aumento de peso de dichas aves de corral para carne.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que la queratinasa es queratinasa PWD-1 del
Bacillus licheniformis.
3. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o
2 en el que el ave de corral para carne es un ave inmadura.
4. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o
2 en el que el ave de corral para carne es un pollo, un pavo o un
pato.
5. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o
2 en el que el ave de corral para carne es un pollo.
6. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que el pollo tiene de 1 a 65 días de vida.
7. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que el pollo tiene de 1 a 21 días de vida.
8. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que el pollo tiene de 1 a 7 días de vida.
9. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que el pollo es un pollo tomatero.
10. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o
2 en el que la dieta del ave de corral es una dieta inicial.
11. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o
2 en el que la dieta del ave de corral es una dieta de
desarrollo.
12. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o
2 en el que la dieta del ave de corral es una dieta de
finalización.
13. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o
2 en el que el pienso de harina de maíz y de soja comprende del 60
al 70% de maíz en peso.
14. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o
2 en el que el pienso de harina de maíz y de soja comprende del 20
al 30% de soja en peso.
15. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o
2 en el que el pienso de harina de maíz y de soja comprende además
del 0,01 al 0,20% de queratinasa PWD-1 del
Bacillus licheniformis en peso.
16. El procedimiento de la reivindicación 15 en
el que la queratinasa PWD-1 del Bacillus
licheniformis es un extracto crudo o una enzima pura.
17. El uso de un pienso de harina de maíz y de
soja para complementar una dieta para aves de corral para carne,
comprendiendo dicho uso el suministro de dicho pienso como dieta de
aves de corral en el que dicho pienso comprende además queratinasa
en una cantidad efectiva para potenciar el aumento de peso en dichas
aves de corral para carne, en el que dicho pienso comprende no más
del 1% de queratina en peso.
18. El uso de un pienso de harina de maíz y de
soja para mejorar la eficiencia de la utilización de pienso de un
pienso para aves de corral de carne, comprendiendo dicho uso el
suministro de dicho pienso como dieta para aves de corral en el que
dicho pienso comprende además queratinasa en una cantidad efectiva
para mejorar la eficiencia de la utilización de pienso de un pienso
en dichas aves de corral para carne, en el que dicho pienso
comprende no más del 1% de queratina en peso.
19. El uso de un pienso de harina de maíz y de
soja para aumentar la digestibilidad de un pienso en aves de corral
para carne, comprendiendo dicho uso el suministro de dicho pienso
como dieta para aves de corral en el que dicho pienso comprende
además queratinasa en una cantidad efectiva para aumentar la
digestibilidad de un pienso en dichas aves de corral para carne, en
el que dicho pienso comprende no más del 1% de queratina en
peso.
20. El uso de un pienso de harina de maíz y de
soja para reducir la mortalidad en aves de corral para carne,
comprendiendo dicho uso el suministro de dicho pienso como dieta
para aves de corral en el que dicho pienso comprende además
queratinasa en una cantidad efectiva para reducir la mortalidad de
dichas aves de corral para carne, en el que dicho pienso comprende
no más del 1% de queratina en peso.
21. El uso de la reivindicación 20 en el que el
ave de corral para carne es un ave inmadura.
22. El uso de la reivindicación 20 en el que el
ave de corral para carne es un pollo tomatero.
23. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 22 en el que la queratinasa es queratinasa
PWD-1 del Bacillus licheniformis.
24. Un pienso que consiste esencialmente en
harina de soja, harina de maíz y queratinasa, en el que dicho pienso
comprende no más del 1% de queratina en peso.
25. El pienso de la reivindicación 24 en el que
el pienso consiste esencialmente en al menos un 0,01% de queratinasa
en peso.
26. El pienso de la reivindicación 24 en el que
la queratinasa es un extracto crudo o una enzima pura.
27. El pienso de la reivindicación 24 en el que
la queratinasa es queratinasa PWD-1 del Bacillus
licheniformis.
28. El pienso de la reivindicación 27 en el que
el pienso se añade a la dieta inicial.
29. El pienso de la reivindicación 28 en el que
la dieta inicial es una dieta inicial de harina de maíz y de
soja.
30. El pienso de la reivindicación 27 en el que
el pienso es una dieta de desarrollo.
31. El pienso de la reivindicación 27 en el que
el pienso es una dieta de finalización.
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