BR112014011508B1 - uso de uma protease estável em meio ácido - Google Patents

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Abstract

UTILIZAÇÃO DE PELO MENOS UMA PROTEASE ESTÁVEL EM MEIO ÁCIDO, E, ADITIVO E COMPOSIÇÃO PARA RAÇÃO ANIMAL PARA AVES VACINADAS. A invenção se refere ao uso de pelo menos uma protease estável em meio ácido, na alimentação de aves de capoeira, em combinação com a vacinação anti-coccídica das aves, para aumentar o desempenho dos animais vacinados. Descobriu-se, surpreendentemente , que as adições de pelo menos uma protease estável em meio ácido, de acordo com a invenção,à dieta das aves vacinadas com a vacina anti-cocci, tem como resultado uma melhoria significativa do desempenho dos animais. Os inventores descobriram que, em especial o uso de proteases de serina, melhoram o desempenho de frangos para assar vacinados, em particular o uso de proteases de serina aumenta o ganho de peso e melhora a Razão de Conversão de alimentos (FCR) de aves vacinadas contra a coccidíase.

Description

Domínio técnico
[0001] A presente invenção se refere ao uso de proteases estáveis em meio ácido na alimentação de animais, em combinação com agentes anti- coccídea, em particular ao uso de tais proteases para melhorar o desempenho de animais vacinados.
[0002] O uso de proteases na alimentação de animais é conhecido dos seguintes documentos:
[0003] WO95/28850 revela um aditivo para alimentação animal compreendendo uma fitase e uma enzima proteolítica. Várias enzimas proteolíticas estão especificadas na p. 7.
[0004] WO96/05739 revela um aditivo alimentar enzimático compreendendo xilanase e uma protease. As proteases apropriadas são enumeradas na p. 25. WO95/02044 revela proteases derivadas de Aspergillus aculeatus, bem como o seu uso em alimentação para animais.
[0005] US 3966971 revela um processo para se obter proteína a partir de uma fonte de proteínas vegetais por tratamento com uma fitase ácida e opcionalmente uma enzima proteolítica. As proteases apropriadas estão especificadas na coluna 2.
Antecedentes técnicos
[0006] Coccidia é um nome genérico dado a organismos protozoários unicelulares que são parasitas intestinais que infetam tanto os vertebrados quanto os invertebrados. Os organismos causam coccidiose e geralmente instalam-se no intestino delgado, tal como no cólon. A infecção com coccídea para os animais domésticos pode não somente reduzir gravemente o crescimento, mas pode ser também uma ameaça mortal. Os sintomas da infecção com coccídea inclui a perda de células epiteliais, a privação da infecção com coccídea inclui a perda de células epiteliais, a privação da mucosa intestinal, e diarreia (frequentemente com a perda simultânea de sangue). Para alguns animais domésticos, tais como as aves de capoeira, a infecção por coccídea pode ser fatal, pelo menos prejudica gravemente a saúde dos animais.
[0007] As aves de capoeira são particularmente vulneráveis à cocddiose, por diversos motivos: (1) o ciclo parasitário de 6 a 8 dias atinge-os em uma fase crítica entre as 2 semanas e as 4 semanas, quando o crescimento máximo é geralmente manifesto. Uma vez que os parasitas virtualmente destroem todo o epitélio intestinal, a absorção de nutrientes é reduzida drasticamente, de que resulta uma pronunciada diminuição do crescimento. Até ao abate, às 5 ou 6 semanas, não há tempo suficiente para recuperar. (2) Há 7 espécies de Eiméria que podem infectar as aves, mais do que em qualquer outra categoria de animais, e pelo menos 4 delas são encontradas regularmente em operações comerciais. Deste modo, quando um ciclo infeccioso está concluído, já um outro ciclo pode se encontrar em uma fase inicial, de modo que a coccidiose pode tomar-se crônica. (3) No caso das aves de capoeira são observadas as espécies mais patogênicas (Eimeria tenella, E. necatrix), que provocam hemorragias graves e em certos casos podem causar uma mortalidade até 50%. Um tal caso agudo de coccidiose poderá facilmente arruinar um criador de aves de capoeira. (4) A intensa criação das aves de capoeira (100 000 pintos ou mais em um galinheiro) em camas profundas facilita o acesso das aves de capoeira às fases infecciosas da coccídea nas fezes através da coprofagia e sustenta desta forma uma rápida disseminação da doença através de todo um grupo de aves de capoeira. Se as condições sanitárias não forem rigorosas, a doença também se propagará a outros galinheiros da mesma exploração e permanecerá no local durante largos anos.
[0008] A fim de combater a coccidiose, a alimentação dos animais é muitas vezes complementada com um coccidiostato e/ou os animais são vacinados com um medicamento, como por exemplo com Coccivac®B, uma vacina anticoccídica da Shering-P lough Animal Health Corporation. Os coccidiostatos que foram aprovados pela CEE para utilização com aves de capoeira (galinhas, perus, frangos para assar e aves em postura) incluem sulfonimidas, amprolium, decoquinato e íonóforos.
[0009] É bem conhecido o fato de a vacinação anti-cocci diminuir o desempenho dos frangos para assar. Em particular, a vacinação anti-cocci causa uma redução da alimentação ingerida e a eficiência da alimentação. Habitualmente, 20% de todos os frangos para assar produzidos nos Estados Unidos são vacinados contra a coccidiose. Estima-se que o uso da vacinação anti-cocci aumente para 50% em 2020 na produção de frangos para assar nos Estados Unidos. Em conformidade, o uso da vacinação anti-cocci tem um enorme impacto económico para os produtores dos frangos para assar.
Sumário da Invenção
[00010] Descobriu-se, surpreendentemente, que a adição de pelo menos uma protease estável em meio ácido, tal como será definida adiante, à dieta das aves vacinadas com a vacina anti-cocci resulta numa melhoria significativa do desempenho dos animais. Os inventores descobriram que, em especial, o uso de proteases de serina em combinação com a vacinação anticocci melhora o desempenho dos frangos para assar. Em particular, o uso de proteases de serina aumenta o ganho de peso e melhora a razão de conversão dos alimentos (FCR) das aves com a vacina anti-cocci. Por consequência, o uso de tais proteases pode solucionar o problema causado pelo uso da vacinação anti-cocci.
[00011] O termo "aves" inclui as aves de capoeira, tais como perus, patos e galinhas, incluindo, sem estar limitado a estas, os frangos para assar, pintos e poedeiras.
[00012] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00013] As proteases são classificadas, com base no seu mecanismo catalítico, nos seguintes grupos: proteases de serina (S), proteases de cisteína (C), proteases de ácido aspártico (A), metaloproteases (M), e proteases desconhecidas, ou proteases ainda nào classificadas (U), ver Handbook of Proteolytic Enzymes. A. J. Barrett N. D, Rawlings, J. F. Woessner (eds), Academic Press (1998), em particular a parte introdutória geral.
[00014] As proteases para utilização de acordo com a invenção são proteases estáveis em meio ácido. As proteases preferidas, de acordo com a invenção, são as proteases de serina estáveis em meio ácido. O termo protease de serina refere-se a peptidases de serina e as suas tribos, tal como são definidas no Manual indicado acima. Na versão de 1998 deste manual, as peptidases de serina e as suas tribos são tratadas nos capítulos 1-175. As proteases de serina podem ser definidas como peptidases em que o mecanismo catalítico depende de o grupo hidroxilo de um resíduo de serina atuar como o nucleófilo que ataca a ligação petídica. Os exemplos de proteases de serina para uso de acordo com a invenção são proteases da tribo SA, por exemplo, da Família S2 (estreptogrisina), por exemplo Sub-Família S2A (protease alfa-lítica), como é definida no Manual acima.
[00015] A atividade da protease pode ser medida usando-se um ensaio em que se emprega um substrato que inclui ligações petídicas relevantes para a especificidade da protease em questão. Os pl I de ensaio e temperatura de ensaio devem, analogamente, ser adaptados à protease em questão. Os exemplos de valores de pH de ensaio são pFI 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Os exemplos de temperaturas de ensaio são 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou 70 °C.
[00016] Os exemplos de substratos de proteases são a caseína, e substratos de pNA, tais como Suc-AAPF-NA (disponível, por exemplo, em Sigma S7388). As letras maiusculas neste substrato de pNA referem-se ao código de aminoácidos de uma letra. Um outro exemplo é a Protazyme AK (caseína reticulada corada com corante de azurina, preparada na forma de comprimidos por Megazyme T-PRAK). Para os estudos de atividade de pH e estabilidade de pH é preferido o substrato de pNA, enquanto para os estudos de atividade da temperatura é preferido o substrato Protazyme AK).
[00017] Não há limitações quanto à origem da protease de serina estável em meio ácido, para uso de acordo com a invenção. Deste modo, o termo protease inclui não apenas proteases naturais ou de tipo selvagem, mas também quaisquer dos mutantes, variantes, fragmentos, etc., dos mesmos exibindo atividade de protease, bem como proteases sintéticas, tais como proteases misturadas e proteases de consenso. Tais proteases manipuladas geneticamente podem ser preparadas tal como é conhecido genericamente na técnica, por exemplo, por mutagênese dirigida ao sítio, por PCR (usando um fragmento de PCR contendo a mutação desejada como um dos iniciadores em reações de PCR), ou por mutagênese aleatória. A preparação de proteínas de consenso é descrita, por exemplo, em EP 0 897 985.
[00018] Os exemplos de proteases estáveis em meio ácido, para uso de acordo com a invenção, são: a) as proteases derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, e Nocardiopsis alba; b) proteases de pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com qualquer das proteases de (i); c) proteases de pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou pelo menos 95% de identidade com qualquer das SEQ ID NO: 1, e/ou SEQ ID NO : 2.
[00019] Para se calcular a percentagem de identidade pode ser usado qualquer programa de computador conhecido na técnica. Os exemplos de tais programas de computador são o algoritmo Clustal V (Higgins, D. G., e Sharp, P. M. (1989), Gene (Amsterdam), 73, 237-244; e o programa GAP fornecido na embalagem de programa GCG versão 8 (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S. B. e Wunsch, C. D„ (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453.
[00020] Em uma variante de realização particular, a protease para uso de acordo com a invenção é uma protease microbiana, indicando o termo microbiana que a protease é derivada de um microrganismo ou tem a sua origem no mesmo, ou é um análogo, um fragmento, uma variante, um mutante ou uma protease sintética, derivados de um microrganismo. Pode ser produzida ou expressa na estirpe microbiana, tipo selvagem, original, em uma outra estirpe microbiana, ou em uma planta; ou seja, o termo cobre a expressão de proteases de ocorrência natural, de tipo selvagem, bem como a expressão em qualquer hospedeiro de proteases recombinantes, manipuladas geneticamente ou sintéticas.
[00021] Os exemplos de microrganismos são as bactérias, por exemplo, bactérias do filo Actinobacteria phy. nov., por exemplo, da classe I: Actinobacteria, por exemplo, da Subclasse V: Actinobacteridae, por exemplo, da Ordem I: Actinomicetais, Por exemplo, da subordem XII: Streptosporangineae, por exemplo, da Família II: Nocardiopsaceae, por exemplo, do gênero I: Nocardiopsis, por exemplo. Nocardiopsis sp. NRRL 18262, e Nocardiopsis alba; por exemplo, da espécie Bacillus, ou mutantes ou variantes dos mesmos, exibindo atividade de protease. A taxonomia é baseada no Manual of Systematic Bacteriology, de Berge, 2a edição, 2000, Springer (pre-impressão: Road Map to Bergey's).
[00022] Outros exemplos de microrganismos são os fungos, tais como leveduras ou fungos de filamentos.
[00023] Na utilização de acordo com a invenção, a protease pode ser fornecida ao animal antes, depois ou simultaneamente com a dieta da ave vacinada anti-cocci. É preferido este último caso.
[00024] No presente contexto, o termo estável em meio ácido significa que a atividade de protease da enzima de protease pura, em uma diluição correspondente a A?so = 1.0, e a seguir à incubação durante 2 horas a 37 °C no seguinte tampão: • lOOmM de ácido succínico, 100 mM FEEPES, 100 mM CEIES, • 100 mM CABS, 1 mM CaCh, 150 mM KCI, 0,01% Triton®X-100, pH3,5, é pelo menos de 40% da atividade de referência, medida utilizando-se o ensaio descrito no presente Exemplo 1 (substrato: Suc-AAPF-pNA, pFl 9. 0,25 °C).
[00025] Em formas de realização particulares da definição de estabilidade em meio ácido, dada acima, a atividade de protease é pelo menos de 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou pelo menos 97% da atividade de referência.
[00026] O termo atividade de referência refere-se à atividade de protease da mesma protease, a seguir a uma incubação em forma pura, em uma diluição correspondente a A2so =1,0, durante 2 horas, A 5 °C, no seguinte tampão: .100 mM ácido succínico, 100 mM HEPES, 100 mM CEIES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl2, 150 mM KCI, 0,01% Triton®X-100, pEI 9,0, em que a atividade é determinada como foi descrito acima.
[00027] Por outras palavras, o método para a determinação da estabilidade em meio ácido compreende as seguintes etapas: a) a amostra da protease a ser ensaiada (em forma pura, A2so =1 0) é dividida em duas partes alíquotas (1 e II); b) a parte alíquota I é incubada durante 2 horas a 37 °C e a pEI = 3,5; c) é medida a atividade residual da parte alíquota I (pH 9,0 e 25 °C); d) a parte alíquota II é incubada durante 2 horas a 5 °C e a pH 9,0; e) é medida a atividade residual da parte alíquota II (pH 9,0 e 25 °C); f) é calculada a atividade residual, em percentagem, da parte alíquota I, em relação à atividade residual da parte alíquota 11.
[00028] Em alternativa, na definição anterior da estabilidade em meio ácido, o valor do pH do tampão na etapa b) pode ser de 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3 ou 3,4.
[00029] Em outras variantes de alternativa da definição de estabilidade em meio ácido dada acima, relativamente aos valores de pFI do tampão na etapa b) alternativa anterior, a atividade residual de protease, em comparação com a de referência, é de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou de pelo menos 97%.
[00030] Em formas de realização de alternativa, podem ser aplicados para o tampão da etapa d) valores de pH de 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0 ou 8,5.
[00031] Na definição acima de estabilidade em meio ácido, o termo A.280 = 1,0 significa a concentração (diluição) da referida protease pura que dá origem a uma absorção de 1,0 a 280 nm em uma cuvete com um comprimento de trajeto luminoso de 1,0 cm, em relação a um ensaio em branco com o tampão.
[00032] E na definição acima de estabilidade em meio ácido, o termo protease pura se refere a uma amostra com uma razão Aaso'A^o maior ou igual a 1,70.
[00033] Em uma outra variante particular de realização, a protease para utilização de acordo com a invenção, além de ser estável em meio ácido, é também estável termicamente.
[00034] O termo estável termicamente tem um ou mais dos seguintes significados: Que a temperatura ótima é pelo menos de 50 °C, 52 °C, 54 °C, 56 °C, 58 °C, 60 °C, 62 °C, 64 °C, 66 °C, °68 C, ou pelo menos de 70 °C.
[00035] Como é evidente, a protease deverá ser aplicada em uma quantidade eficaz, ou seja, uma quantidade adequada para melhorar a ração de conversão de alimentos em aves vacinadas com uma vacina anti-coccídea.
[00036] Em um exemplo preferido, a dosagem desejada da protease é de 0,01-200 mg de protease da proteína enzimática por kg final de alimento.
[00037] O termo razão de conversão de alimentos é determinado com base em uma experiência de crescimento, compreendendo um primeiro tratamento em que a composição de acordo com a invenção é adicionada à alimentação dos animais em uma concentração apropriada por kg de alimento, e um segundo tratamento (controle) sem a adição da composição ao alimento dos animais.
[00038] Como é geralmente conhecido, uma FCR melhorada é menor do que a FCR do controle. Em formas de realização particulares, a FCR é melhorada (ou seja, é reduzida) em comparação com o controle, pelo menos de 1,0% a 5%.
[00039] Para utilizações de acordo com a invenção, não é necessário que a protease tenha uma pureza tão elevada assim; pode, por exemplo, incluir outras enzimas, ou mesmo outras proteases estáveis em meio ácido, caso em que deverá ser então designada como preparação de enzimas ou de proteases. No entanto, é vantajosa uma preparação de enzima/protease bem definida. Por exemplo, é muito mais fácil dosear corretamente na alimentação uma protease que está essencialmente isenta de interferências ou da contaminação com outras proteases. O termo "dosear" corretamente refere-se em particular ao objetivo de se obterem resultados consistentes e constantes, e à capacidade de otimização da dosagem baseada no efeito desejado.
[00040] Em uma variante preferida de um conceito de alimentação de aves de capoeira, a protease é usada na forma de um aditivo alimentar.
[00041] A incorporação da composição de aditivos alimentares, tal como foi aqui exemplificada anteriormente, nos alimentos das aves de capoeira é realizada, na prática, utilizando-se um concentrado ou uma pré- mix. Uma pré-mix designa uma mistura, preterencialmente uniforme, de um ou mais micro-ingredientes com um diluentes e/ou com um veículo. As pré- mixes são usadas para facilitar uma dispersão uniforme dos micro- ingredientes em uma mistura maior. Uma pré-mix de acordo com a invenção pode ser adicionada aos ingredientes da alimentação ou à água de beber, na forma de sólidos (por exemplo, como um pó solúvel em água) ou como líquidos.
[00042] À parte a protease, estável em meio ácido, da invenção, os aditivos alimentares de animais, da invenção, contêm pelo menos uma vitamina lipossolúvel, e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um oligoelemento, e/ou pelo menos um macroel emento.
[00043] Outros aditivos alimentares, opcionais, adicionais, são os agentes corantes, por exemplo, carotenóides, tais como beta-caroteno, astaxantina, cantaxantina, apo-éster e luteína; compostos aromáticos; estabilizadores; peptídeos anti microbianos; ácidos gordos poli-insaturados (PUFAs); espécies que geram oxigênio reativo; e/ou pelo menos uma enzima selecionada entre fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease (EC 3.4., fosfolipase Al (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (BC 3.1.1.4); lisolbsfolipase (EC 3,1.1.5); fosfolipase C (EC 3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); amilases tais como, por exemplo, alfa-amilase (EC 3.2.1.1); e/ou beta-glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6).
[00044] Os exemplos de peptídeos anlimicrobianos (AMP's) são o CAP 18, leucocina A, protegrina-1, tanatina, defensina, lactoferrina, lactoferricina, e ovispirina, tais como novispirina (Robert Lehrer, 2000), plectasinas e estatinas.
[00045] Os exemplos de ácidos gordos poli-insaturados são os ácidos gordos poli-insaturados em Cl8, C20 e C22, tais como o ácido araquidónico, ácido docosohexaenóico, ácido eicosapentaenóico, e ácido gama-linoleico.
[00046] Os exemplos de espécies que geram oxigênio reativo são compostos químicos, tais como perboratos, persulfatos ou percarbonatos; e enzimas, tais como uma oxidase, uma oxigênase ou uma sintetase.
[00047] Habitual mente, as vitaminas lipossolúveis e solúveis em água, assim como os oligoelementos, fazem parte de uma chamada pré-mix, destinada à adição aos alimentos, ao passo que os macroelementos são geralmente adicionados separadamente aos alimentos.
[00048] A seguir apresentam-se listas não exclusivas de exemplos destes componentes: - Os exemplos de vitaminas lipossolúveis são a vitamina A, a vitamina D-3, a vitamina E e as vitaminas K, por exemplo, a vitamina K3. - Os exemplos de vitaminas solúveis em água são a vitamina BI2, a biotina e a colina, vitamina Bl, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenatos, por exemplo, D-pantotenato de cálcio. - Os exemplos de oligoelementos são o manganês, zinco, ferro, cobre, iodo, selênio e cobalto. - Os exemplos de macroelementos são o cálcio, fósforo e sódio.
[00049] Uma pré-mix pode conter, por exemplo, por tonelada de alimentos para as aves, 50 a 200 g de uma solução em propilenoglicol da mistura dos compostos ativos, 20 a 1000 g de um agente emulsionante, 50 a 900 g de cereais e subprodutos, 20 a 100 g de um suporte proteico (leite em pó, caseína, etc.) e 50 a 300 g de um componente mineral (sílica expandida, carbonato de cálcio de qualidade alimentar, fosfato bi-cálcio, etc.).
[00050] Finalmente, é adicionado à composição alimentar dos animais um aditivo alimentar, ou a pré-mix tal como foi descrita acima. É preparada e adicionada de tal forma que a quantidade da protease corresponda a uma adição desejada de 0,01 - 200 mg de proteína da protease por kg do alimento.
[00051] As composições ou dietas da alimentação animal têm um teor de proteína relativamente alto. De acordo com as publicações do Conselho Nacional de Investigação (NRC) mencionadas acima, as dietas para as aves de capoeira e porcos podem ser caracterizadas como é indicado na Tabela B do documento
[00052] WO 01/58276. Uma composição alimentar para animais, de acordo com a invenção, tem um teor de proteína bruta de 50-800 g/kg, e compreende além disso pelo menos uma protease, tal como é aqui reivindicada.
[00053] Além disso, ou em alternativa (ao teor de proteína bruta acima indicado), a composição alimentar para animais, da invenção, tem um teor de energia metabolizável de 10-30 MJ/kg; e tem um teor de cálcio de 0,1 - 200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1 - 200 g/kg; e um teor de metionina de 0,1 - 100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0,1 - ] 50 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0,5 - 50 g/kg.
[00054] Em formas de realização particulares, os teores de energia metabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína, e/ou de lisina, encontram-se dentro de qualquer uma das faixas 2, 3, 4 ou 5, tal como são apresentadas na tabela B do documento WO 01/58276.
[00055] Para a determinação dos mg de proteína da protease por kg de alimento, a protease é purificada a partir de a composição alimentar, e a atividade específica da protease purificada é determinada usando-se um ensaio relevante (ver em atividade de protease, substratos, e ensaios). A atividade da protease da composição alimentar tal qual é também determinada usando-se o mesmo ensaio, e com base em estas duas determinações é calculada a dosagem em mg de proteína da protease por kg de alimentos.
[00056] São aplicados os mesmos princípios para a determinação de mg de proteína de protease em aditivos alimentares.
[00057] A protease da Nocardiopsis sp. NRRL 18262, de acordo com a invenção, pode ser preparada usando-se métodos convencionais, tal como é descrito genericamente em WO 01/58276. Um aditivo alimentar compreendendo a protease de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 está também disponível comercial mente (por exemplo, como Ronozyme®ProAct, fornecido por DSM Nutritional Products, Kaiseraugst, Suiça), ou pode ser preparado facilmente pelos peritos na técnica usando-se processos e métodos bem conhecidos na técnica anterior.
[00058] A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitada no seu escopo pelas modalidades específicas aqui reveladas, uma vez que essas modalidades destinam-se a ilustrar vários aspetos da invenção. Quaisquer modalidades equivalentes pertencem ao escopo dessa invenção. De fato, várias modificações da invenção, para além das aqui apresentadas e descritas, serão claras para os profissionais a partir de a descrição anterior. E pretendido que essas modificações também pertençam ao escopo das reivindicações adjuntas.
[00059] Os exemplos que se seguem ilustram melhor a invenção
Exemplos Exemplo 1 ensaio de estabilidade do pH
[00060] Foi usado Suc-AAPF-pNA (Sigma S-7388) para a obtenção de perfis de estabilidade de pH.
[00061] Tampão de ensaio: 100 mM de ácido succínico, 100 mM HEPES, 100 mM CEIES, 100 mM CABS, l mM de CaCb, 150 mM de KC1, 0,01% de Triton®X-100 ajustado aos valores de pH 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 ou 11,0 com HCI ou NaOH.
[00062] Cada amostra de protease (em 1 mM de ácido succínico, 2 mM CaClj, 100 mM NaCl, pH 6,0 e com uma absorção A28o >10) foi diluída no tampão de ensaio em cada valor de pH ensaiado a A?so =L0. As amostras de protease diluídas foram incubadas durante 2 horas a 37 °C.
[00063] Depois da incubação, as amostras de protease foram diluídas em 100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CEIES, 100 mM de CABS, 1 mM CaCl2, 150 mMKCl, 0,01% de Triton®X-100, pEI 9,0, levando o pH de todas as amostras a pEI 9,0.
[00064] Nas medições de atividade seguintes, a temperatura era de 25 OC'
[00065] 300|LLL de amostra de protease diluída foram misturados com J,5 mL do tampão de ensaio de pH 9,0 e a reação de atividade foi iniciada mediante a adição de 1,5 mL de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 mL de DMSO e diluídos ainda 445 x com 0,01% de Triton®X-100) e, depois da mistura, o aumento de A405 foi monitorizado por meio de um espetrofotômetro como uma medição da atividade (residual) da protease.
[00066] A incubação a 37 °C foi realizada aos diferentes valores de pH e as medidas de atividade foram registradas era um gráfico corno atividades residuais contra o pH. As atividades residuais foram normalizadas com a atividade de uma incubação paralela (controle), em que a protease foi diluída a A28O= 1,0 no tampão de ensaio a pH 9,0 e incubadas durante 2 horas a 5 °C antes da medição da atividade, como as outras incubações. As amostras de protease foram diluídas antes da medição da atividade, a fim de se assegurar que todas as medições de atividade caiam dentro da parte linear da curva dose-resposta para 0 ensaio.
Exemplo 2 - Alimentação das aves vacinadas com proteases estáveis em meio ácido
[00067] Foi realizada uma experiência em um cercado de criação no chão, usando-se aves macho Ross 708 com 1 dia. Foram usados na experiência um total de 27 cercados de criação e foram colocadas 10 aves em cada cercado no dia 1 de idade. Os cercados foram distribuídos ao acaso ao longo de 3 tratamentos com 9 réplicas/tratamento. As aves foram alimentadas, de forma nutricionalmente adequada, com dietas básicas à base de farinha de milho/soja e foram ajustadas à idade da ave fornecendo uma dieta inicial desde o dia 1 ao dia 21, e uma dieta de crescimento desde o dia 22 ao dia 42. Tratamento 1: Dieta basal Cocci Vac* B no dia 1 de idade + Monteban* de dieta (coccidiostato) 80 ppm. Todas as aves receberam Cocci Vac® B no dia 1 de idade, administrado por via nasal no centro de incubação. Tratamento 2: Cocci Vac® B no dia 1 de idade sera Monteban®. Tratamento 3: como o tratamento 2, mais 400 ppm de mistura de enzimas RONOZYME* (fornecida por DSM Nutritional Products, Kaiseraugst, Suíça). O Monteban foi fornecido para suprimir os efeitos do Cocci Vac. O Cocci Vac confere imunidade à coccidiose por causar um baixo nível da doença.
[00068] A mistura de enzimas compreendia: - 200 ppm de RONOZYME®ProAct (protease estável em meio ácido) e - 100 ppm de RONOZYME WX + 50 ppm de RONOZYME A + 50 - pm de ROXAZYME G2 (= mistura de enzimas contendo xilanase, amilase, celulose, beta-glucanase e outras).
[00069] No final da experiência, no dia 42 de idade, foram determinados o peso médio das aves e o consumo médio de alimentos, e foi calculada a razão de conversão de alimentos (FCR) dividindo-se a toma de alimentos pelo ganho de peso, para cada tratamento.
[00070] Os resultados estão resumidos nas tabelas a seguir, em que a tabela 1 é a lista do peso corporal no dia 42 e a tabela 2 é a lista do FCR no dia 42. Tabela 1. Peso corporal médio de 42 dias
Figure img0001
obcP<0.05 Tabela 2. Razão de conversãodealimentos no dia 42
Figure img0002
âh£P<0.05
[00071] Os resultados mostram claramente que a vacinação anti-cocci (Tratamento 2) diminuiu os pesos corporais e afetou adversamente o FCR. ao passo que o coccidiostato (Tratamento 1) eliminou estes efeitos. A adição da mistura de enzimas resultou em um peso corporal significativamente mais alto e melhorou o FCR, comparado com o Tratamento 2. A adição da mistura de enzimas às aves que sofreram de coccidiose aumentou o desempenho das aves para um próximo do das aves que fora alimentadas com o coccidiostato.
Exemplo 3 - Alimentação das aves vacinadas com proteases estáveis em meio ácido
[00072] Foi realizada uma experiência em um cercado de criação no chão, usando-se pintos macho Cobb x Cobb com 1 dia. Foram atribuídos para estudo um total de 2 160. A experiência consistiu em 48 cercados de 45 frangos para assar machos. Os tratamentos foram replicados em oito (8) blocos com seis (6) tratamentos aleatórios em cada um. As aves foram alimentadas, de forma nutricionalmente adequada, com dietas básicas à base de farinha de milho/soja e foram ajustadas à idade da ave fornecendo uma dieta inicial desde o dia 1 ao dia 16, e uma dieta de crescimento desde o dia 17 ao dia 32, e uma dieta de finalização do dia 33 ao dia 42. Os 6 tratamentos foram os sesuintes: Tratamentos
Figure img0003
Como tratamento foram usados produtos enzimáticos RONOZYME \ fornecidos por DSM Nutritional Products, Kaiseraugst, Suíça. Ronozyme* ÁX = 80% de Ronozyme* WX + 20% de Ronozyme* A Ronozyme“ ProAct = produto de protease pura.
[00073] Todas as aves receberam Cocci Vac® B no dia 1 de idade, administrado por via nasal no centro de incubação, excepto as aves de controle positivo, às quais foi ministrada uma dose convencional do coccidiostato Salinomicina, de 60 g/tonelada de alimentos, ao longo do estudo.
[00074] A salinomicina é o coccidiostato mais usado que suprime o desenvolvimento da doença mortal muito comum coccidiose.
[00075] A Cocci Vac® B induz a imunidade à coccidiose por causai' um baixo nível da doença.
[00076] No final da experiência, no dia 42, o peso médio das aves (Ganho Médio de Peso) e o consumo médio de alimentos (Consumo de Alim.) foram determinados, e a Razão de Conversão de Alimentos (FRC) foi • calculada, dividindo-se a toma de alimentos pelo ganho de peso para cada tratamento.
Figure img0004
[00077] O Cocci Vac (Tratamento 2) diminuiu os pesos corporais e afetou de forma adversa o FCR, comparado com o PC a que foi dado o tratamento com a salinomicina.
[00078] A adição da protease RONOZYME ProAct sobre o Cocei Vac® B teve como resultado uma melhoria significativa do FCR, em comparação com o Cocci Vac (Tratamento 2). A adição de qualquer das misturas de enzimas em conjunto com o produto RONOZYME PROACT resultou numa melhoria ainda maior da que foi conferida às aves que sofreram de coccidiose, e levou o desempenho das aves para um nível próximo do das aves que foram alimentadas com o coccidiostato.

Claims (6)

1. Uso de uma protease estável em meio ácido em combinação com a vacinação anti-coccídica de aves para aumentar o ganho de peso e/ou melhorar a Razão de Conversão de Ração (FCR) no animal comparada a um segundo tratamento (controle) sem adição da protease na ração animal, caracterizadopelo fato de que a protease é definida pela SEQ ID NO: 1 ou derivada a partir de Norcadiopsis sp. NRRL 18262 e Norcadiopsis alba.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a protease é utilizada em ração para aves que incluem aves de criação, tais como perus, patos e galinhas.
3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que a dosagem da protease pretendida é de 0,01 - 200 mg de proteína da enzima de protease por kg de ração.
4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que a FCR é melhorada em 1,0% em comparação ao controle.
5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que a FCR é melhorada em 5,0% em comparação ao controle.
6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadopelo fato de que a protease estável em meio ácido é, adicionalmente, em combinação com uma fitase, xilanase, galactanase, beta- glucanase, amilase e/ ou celulase.
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