JPS63174935A - リゾチーム含有化粧品組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、リゾチームまたはその塩を含有した医薬会化
粧品組成物に関するものである。

従来の技術 リゾチームは分子量約１４，０００のタンパク質であり
、全ての生体中に見出される。リゾチームまたはその場
は、抗炎症、止血、抗ウィルス、抗結膜炎、抗限炎症等
の薬理作用を有しており、医薬品として有用である。ま
た化粧品にも用いられてている。

リゾチームの原料としては通常卵白が用いられる。

卵白リゾチームを製造するには、典型的には、卵白を水
中に中性付近で均一に分散した後、弱酸性陽イオン交換
樹脂と接触させてリゾチームを該樹脂に吸着させ、つい
で吸着しているリゾチームを適当な塩の溶液で溶出させ
、ざらに塩析を行ってリゾチームを結晶として取出す方
法が採用される。

卵白リゾチームの製造法または精製法に関する文献とし
ては、たとえば、特開昭５５−７１４９０号公報、特開
昭５８−２０１９８Ｅ１号公報、特開昭５８−２０９９
７７号公報、特開昭５８−２０９９８１号公報、特開昭
５８−２１２７８４号公報などがある。

発明が解決しようとする問題点 しかしながら、リゾチームは卵白から取出されたタンパ
ク質であってヒトに対しては異種タンパクであることか
ら、リゾチームを点限剤などの医薬品として用いる場合
は、それが精製品として市販されているリゾチームであ
ってもアレルギーを起こすことがあった。

−木発明者らは、リゾチームによるアレルギーが果たし
てリゾチームそのものに起因するのか、あるいはリゾチ
ーム中に含まれる不純物によるものかにつき研究を行っ
ていたが、一般に抗原性の発揮のしやすさは分子量に依
存する可能性があることに鑑み、分子量約１４，０００
のリゾチームよりももっと大きな分子量のタンパク質が
不純物として混入していれば、そのタンパク質があたか
もリゾチーム自身に起因するアレルギーのように思える
こともありうるとの考えに達した。

そこで、リゾチームを種々の方法で取得してその分析を
行ったところ、精製品として市販されているリゾチーム
は電気泳動図においてアビジン（分子量約６４，０００
）が検出されると共に、アビジンが電気泳動過程におい
て分解して生ずるアビジン分解物も検出されるのに対し
、さらに充分な精製を行ったリゾチーム高精製品の中に
は電気泳動図においてアビジンもアビジン分解物も実質
的に検出されないものがあることを見出した。

本発明者らは、このアビジンンがリゾチームを投与した
ときのアレルギーの原因の一つではないかという仮説を
たて、それを確認するために鋭意研究を行った結果、以
下に述べる本発明に到達した。

問題点を解決するための手段 すなわち、本発明は、「リゾチームまたはその塩を含有
した医薬・化粧品組成物において、前記リゾチームまた
はその塩として、アビジンを実質的に含有しない高精製
リゾチームまたはその塩を用いたことを特徴とするリゾ
チーム含有医薬・化粧品組成物。」をその要旨とするも
のである。

以下本発明の詳細な説明する。

リゾチームまたはその塩は種々の原料から製造しうるが
、卵白から製造することが有利である。

リゾチームの塩としては、塩酸塩のほか、炭酸塩、リン
酸塩、ヘキサメタリン酸塩、硫酸塩、グルタミン酸塩、
グリセロリン酸塩、グルコン酸塩など各種の無機酸また
は有機酸の塩があげられる。特に塩酸塩、つまり塩化リ
ゾチームが重要である。

リゾチームの製造法としては、従来の技術の項でも説明
したように、卵白を水中に中性付近で均一に分散した後
、弱酸性陽イオン交換樹脂と接触させてリゾチームを該
樹脂に吸着させ、ついで吸着しているリゾチームを適当
な塩の溶液で溶出させ、ざらに塩析を行ってリゾチーム
を結晶として取出す方法が採用される。

リゾチームの高度の精製は、たとえば、（ａ）弱酸性陽
イオン交換樹脂と接触させてリゾチームを該樹脂に吸着
させた後の洗浄操作に際し、塩類水溶液や水による不純
物の除去を多数回行う方法、（ｂ）弱酸性陽イオン交換
樹脂に吸着したリゾチームを塩類水溶液や緩衝液などに
より溶出させるに際し、ｐＨ，濃度、攪拌条件等を工夫
する方法、（Ｃ）溶出したリゾチームを含む水溶液をさ
らに弱酸性陽イオン交換樹脂と接触させる操作を繰り返
す方法、（、ｄ　）溶出後に種結晶を加えて塩析するに
際し、ｐＨ，濃度、攪拌条件、冷却条件などを工夫する
方法、（ｅ）塩析操作を複数回繰返す方法、（ｆ）リゾ
チームの結晶を水に溶解し、ＰＨをコントロールしなが
らパルプ、木綿、その他の吸着材を加えてこの吸着材に
不純物を吸着させる方法、などを適宜組合せて行うこと
により達成される。

いずれにせよ、本発明で用いるリゾチームまたはその塩
は、アビジンを実質的に含有しないほどに高度に精製し
たものであることが要求される。

ただし、本発明の趣旨を損なわない限りにおいて、痕跡
程度のアビジンが含まれている場合までも本発明外とす
るものではなく、「アビジンを実質的に含有しない」と
は、アビジンの有無を容易に確認できる測定法の一つで
ある電気泳動法の電気泳動図において、アビジンおよび
アビジン分解物の存在を示すピークまたは肩がほとんど
全く認められないことを言うものとする。

第１図は、本発明で用いる高精製リゾチーム（１００μ
ｇ）の電気泳動図であり、リゾチーム（１）に基〈主ピ
ークのみが見られ、アビジンやアビジン分解物に基く肩
やピークは認められない。

第２図は、市販の精製リゾチーム（１００膳ｇ）の電気
泳動図であり、リゾチーム（１）に基く主ピークの立上
り部分にアビジン（２）に基く肩が認められる、またそ
の左側にアビジン分解物（３）に基くピークも認められ
る。

第３図は、上記市販の精製リゾチーム（１００μｇ）に
アビジン（２ｇ　ｇ）を加えたものの電気泳動図であり
、リゾチーム（１）に基く主ピークの立上り部分にアビ
ジン（２）に基くピークが認められ、またその左側にア
ビジン分解物（３）に基くピークが認められる。

第４図は、上記市販の精製リゾチーム（１００ｇ　ｇ）
にアビジン（４ルｇ）を加えたものの電気泳動図であり
、リゾチーム（１）に基〈主ピークの立上り部分にアビ
ジン（２）に基〈ピークが認められ、またその左側にア
ビジン分解物（３）に基くピークが認められる。アビジ
ン（２）に基くピークは、第３図の場合よりも高くなっ
ている。

第２図と第３〜４図との比較からも、第２図の肩やピー
クが、それぞれアビジン、アビジン分解物であることが
確認できる。

このようにして得られたアビジンを実質的に含有しない
高精製リゾチームまたはその塩を用いたリゾチーム含有
医薬・化粧品組成物は、アレルギー症状をほとんど起こ
さないが、これについては後の実施例で詳述する。

本発明の組成物は、医薬としては１点眼剤、注射剤、点
鼻薬、生薬、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液体製
剤、クリーム剤などの剤型で使用され、抗炎症、抗結膜
炎、止血、抗ウィルスなどの薬理作用を示す。特に点眼
剤が重要である。

また、化粧品としても液体、クリームをはじめ種々の形
態で使用される。

これらの医薬品または化粧品は、医薬品または化粧品を
製造する常法のいずれもを便宜に利用して製造すること
ができる。もちろん、本発明の目的に反しない限りにお
いて、リゾチーム以外の有効成分紮添加し、または適宜
の添加物、たとえば賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、
崩壊剤、潤滑剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、懸濁化剤、
香料、色素等を共存させてもよい。

作　　　用 アビジンを実質的に含有しない高精製リゾチームまたは
その塩は抗原性が小さいので抗体をほとんど産生ぜず、
従ってアレルギー症状を起こすおそれがほとんどない。

すなわち、動物を、■アビジンを実質的に含まない高精
製リゾチーム、■アビジンが検出される市販の精製リゾ
チーム、■アビジン、でそれぞれ感作し、抗体価の測定
を行うと、アビジン群の抗体価が最も大きく、ついで市
販の精製リゾチームが抗体価が高く、高精製リゾチーム
は抗体価が最も小さいという結果が得られる。

このようにアビジンが含まれている市販の精製リゾチー
ムはアビジンを実質的に含まない高精製リゾチームに比
し抗体産生性能が大きく、さらにアビジン単独では高い
抗体産生性能が示されるという事実から、抗体産生にア
ビジンが大きく関与していることがわかる。

次に、これら抗体保有動物に点眼を行い、惹起させたア
レルギー症状を観察したところ、アビジンを実質的に含
まない高精製リゾチームで感作した動物は、アビジンを
含む市販の精製リゾチームで感作した動物に比し有意に
アレルギー症状は弱く、誘発原性が低いものと考えられ
た。

しかしながら、この結果は、両群の抗体価に差があるた
めに、誘発されたアレルギー症状にも相違が出たという
可能性が考えられる。そこで抗原性の原因物質と考えた
アビジンそのもので感作を行った動物に点眼し、アレル
ギー症状を観察したところ、アビジンを点眼した群にお
いては、上記高精製リゾチーム、市販の精製リゾチーム
を点眼したときよりもかなり強い症状が現れ、市販の精
製リゾチーム点眼ではそれよりも弱く、高精製リゾチー
ム点眼ではさらに弱い反応が見られたのみであった。

この結果は、上述の高精製リゾチーム感作群と市販の精
製リゾチーム感作群での症状の差が抗体価の違いによる
という可能性だけでなく、抗体を有する動物に症状を惹
き起こさせる能力の違い。

つまり誘発原性が異なることを示している。そして、高
精製リゾチームを用いることにより、抗原性および誘発
原性が減弱するということを示している。

よって、リゾチームをアビジンが実質的に検出されなく
なるまで高度に精製することによってアレルギー症状の
発現が減少し、臨床的にもより安全なリゾチーム含有医
薬または化粧品を製造しうることが明らかとなった。

実　　施　　例 （実験材料および方法〉 車　１リゾ　−ム 卵白より得られた市販のリゾチーム３ｇを水に溶解して
１交とし、そこに食塩３０ｇを溶かし、加えて水に溶解
して１文とし、ＩＮ水酸化ナトリウムを加えてＰＨを９
．５にしてから、これに予め用意しておいた５％濃度の
等電点結晶リゾチーム懸濁液（５％食塩水）　０．４　
ｇを添加し、ついで２０°Ｃに４時間保持した後晶温を
２℃に下げ、この温度でさらに４時間保持してから白濁
状態にある溶液を濾紙（東洋濾紙Ｎｏ、２）を用−いて
ゲージ圧１．５ｋｇ／ｃｍｚの条件で濾過した。なお濾
過までの操作はアジテータ−による攪拌条件下に行った
。

このようにして得られた結晶リゾチームを水に溶解して
から再結晶する操作をさらに２回行い、目的とする高精
製リゾチームを得た。

次にこの高精製リゾチームの水溶液を塩酸酸性ｐＨ３〜
３．５とし１食塩を加えて塩析させて高精製の塩化リゾ
チームを得た。以下単に高精製リゾチームとあるのは、
この高精製塩化リゾチームを言うものとする。

彼ｌ目虻！ 動物を感作し、またアレルギー反応の惹起を見るため、
被験物質として上述の高精製リゾチーム、市販の精製リ
ゾチーム、およびアビジン（シグマ社製）を用いた。

第１図は高精製リゾチームの電気泳動図、第２図は市販
の精製リゾチームの電気泳動図である。

高精製リゾチームには市販の精製リゾチームに見られる
アビジンの位置に肩がなく、アビジンは実質的に混入し
ていないことがわかる。

また、第３図、第４図は、それぞれ市販の精製リゾチー
ム（１００ＩＬｇ）に種々の濃度のアビジン（２ＩＬｇ
　、　　４ｇｇ）を添加したものの電気泳動図であり、
第２図に見られる肩がアビジンであることがわかる。

惑ｎ誌 静岡実験動物協同組合より購入した体重５８０ｇ　〜７
００　ｇｒｙ）バーＬ／　−（Ｈａｒｔｌｅｙ）系雄性
モルモット２３匹を高精製リゾチーム群５匹、市販の精
製リゾチーム群５匹、およびアビジン群１３匹に分けた
。

高精製リゾチームおよび市販の精製リゾチームはそれぞ
れ５％溶液となるように生理食塩液に溶かした。またア
ビジンは０．５％溶液となるように生理食塩液に溶かし
た。

これらの溶液をそれぞれフロイント完全アジュバント（
Ｆｒｅｕｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）
　　（シグマ社製）とｌ：ｌの割合で混合し、エマルジ
ョンヲｍ製した。

これらのエマルジョンを各群とも１回目は１モルモット
の四肢足踏史的に０．２ｍＭずつ合計１匹につき０．８
ｍＭを注射した。この２週間後に再び同じくエマルジョ
ンを調製し、０．２ｍｆＬずつを背部史的４ケ所に合計
１匹につき０．８＋Ｊｌを注射した。

１代車１１ ２回目感作の１週後モルモットの後肢の爪を切り、血液
をセパラビッドチューブミニＳ（セキスイメディカル社
製）に各１　　ｍｌ採取した。採取した血液を３００Ｏ
ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた血清について別に用
意したモルモッ）（１５匹）を用いて４時間ＰＣＡ反応
を行い、抗体価を測定した。

すなわち、各群とも希釈抗血清の０．１ｍＱずつを前日
に毛を刈っておいたモルモット背部史的に注射し、４時
間後に抗原０．５％とエバンスブルー０．５％とを含む
溶液（生理食塩液に溶解）　１　　ｍｌを後肢足前部静
脈より注射し、３０分後に皮膚の色素漏出斑の長径およ
び短径を測定した。その長径および短径の平均値が５ｍ
ｍ以上の場合を陽性とし、陽性反応を示す最大希釈倍数
を抗血清の抗体価とした。

１藍１Ｌ 抗体価測定の翌日、点眼により惹起を行った。

高精製リゾチーム群５匹の感作モルモットの８眼に生理
食塩液に溶解した０、５％高精製リゾチームを点眼し、
２眼には生理食塩液を点眼した。

市阪の精製リゾチーム群についても、５匹の感作モルモ
ットの８眼に生理食塩液に溶解した０、５％市販精製リ
ゾチームを点眼し、２眼には生理食塩液を点眼した。

アビジン群については、１３匹の感作モルモットの８眼
に０．５％高精製リゾチームを、８＠に０．５％市販精
製リゾチームを、８眼に生理食塩液に溶解した０、５％
アビジンを、２眼に生理食塩液を点眼した。

そしていずれの動物も点眼開始１．２．４．７．２４．
４８および７２時間後に観察を行った。観察は、角膜の
混濁、結膜充血、結膜浮腫および分泌物について、次に
示す採点基準で行った。

占 採点基準は次の通りである。合計点は１５点満点となる
。なお、各点数の中間にあたるような症状のときには、
０．５　、１．５というように中間の採点を行った。

角膜混濁 ０・・・透明である ■・・・虹彩の細部が明瞭に見える程度の混濁２・・・
虹彩の細部が不明瞭な混濁 ３・・・不透明、虹彩が見えない混濁 ４・・・全く不透明、出血、＠瘍を伴なうこともある 結膜発赤 Ｏ・・・充血なし １・・・角膜周囲の血管がやや拡張 ２・・・血管の拡張が著明になる ３・・・全体にビマン性に赤味 ４・・・全体に著しい赤味 結膜浮腫 Ｏ・・・膨張なし １・・・わずかに浮腫の傾向 ２・・・明らかに膨張 ３・・・浮腫のため角膜を覆いはじめる４・・・浮腫の
ために角膜のかなりの部分を覆う分泌物 ０・・・分泌物なし １・・・正常と異なる多少の量 ２・・・眼瞼と眼瞼に接する毛を濡らしている３・・・
眼瞼の毛と眼の周囲のかなりの区域を濡らしている 〈実験結果） 各感作群の抗体価を第１表に示す。

第１表 高精製リゾチーム群は×１００〜８００の幅で平均はＸ
３２０．市販の精製リゾチーム群は×８００〜１６００
の幅で平均はＸ１４４０、アビジン群はＸ３２００〜６
４００の幅で平均はＸ５４２０であった。このように、
高精製リゾチーム群の抗体価はｔ検定（５ｔｕｄｅｎｔ
’　ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）の結果、他の２群より有意に低
く、アビジンの抗体価は他の２群より有意に高かった。

抗体価測定後、点固での局所アレルギー反応惹起を見る
ため、高精製リゾチーム、市販の精製リゾチーム、アビ
ジンの溶液を１回５ル文ずつ１時間間隔で８回点眼を行
い、経時的に耶での症状を観察し、その結果を第２表に
示した。また累積法による分散分析の結果を第３表に示
した。

（以下余白） 第２表 （各種感作モルモットへの各種誘発原点眼による限症状
の合計点釦□□□−」 注１．動物Ｎｏ、中、Ｒは右眼、Ｌは左眼。

高精製リゾチームで感作し、高精製リゾデームで点眼惹
起した群では、点眼開始４時間後までは何ら症状は認め
らなかったが、７時間後に８＠中４眼に角膜周囲の血管
がやや拡張する程度の球結膜の軽度充血が見られた。し
かし、それらは２４時間後には正常に回復した。

市販の精製リゾチームで感作し、市販の精製リゾチーム
で点暦惹起した群では、点眼開始後１時間後より８眼中
２眼に球結膜の軽度充血が認められ、さらに４時間後に
は４眼に認められ、７時間後には球結膜の軽度充血が２
眼、血管の拡張が著明になったものが５眼あった。しか
し２４時間後にはすべて回復していた。

次にアビジンで感作した動物にそれぞれの溶液で点眼惹
起した。高精製リゾチーム点眼ではへ眼開始１時間後よ
り球結膜の軽度充血が２眼に出はじめ、ｌ眼は点眼とと
もに症状がひどくなっていったが、２４時間後には症状
は全く認められなくなった。

市販の精製リゾチーム点眼では、点眼開始１時間後より
球結膜の軽度充血が２眼に出はじめ、点眼とともに症状
は悪化し、４時間後には著明な球！膜の充血３眼を含む
５眼に症状が認められた。

７時間後にはさらに例数が増え、６眼に症状が認められ
た。そのうち４眼は２４時間後にもまだ症状が残ってお
り、４８時間後にもまだ２眼には観察されたが、その２
例も７２時間後には症状は回復した。

アビジン点眼では、点眼１時間後には１眼しか球結膜の
充血が見られなかったが、点眼とともに増え、７時間後
には著明な充血４眼を含む６眼となった。それらの充血
は４８時ＶＩ後においてまだ４＠に認められ、７２時間
後においてもまだ２眼回復しなかった。また、輝度の結
膜浮腫が７時間後より１＠、また２４時間後より１眼に
認められ、それぞれ４８．７２時間後まで残っていた。

今回認められたアレルギー症状は球結膜の充血および浮
腫で、角膜混濁および分泌物は全く認められなかった。

また、どの感作群においても。

生理食塩液の点眼による症状は認められなかった。

〈処方例〉 処方例１（点眼剤） 高精製リゾチーム　　　　　　　０．５　ｇ塩化ナトリ
ウム　　　　　　　　０．８５　ｇホウ酸　　　　　　
　　　　　０．５ｇ１０％水酸化ナトリウム水溶液　　
ＸＩ！　　事項化ベンザルコニウム　　　　　０．００
５ｇ７１ｓ、　　　　　　　　　　　　　　　１００ｃ
ｃＨＥｌ 処方例２（注射剤） 高精製リゾチーム　　　　　　　２．２ｇ塩化ナトリウ
ム　　　　　　　　０．５　ｇリン酸−ナトリウム　　
　　　　ｏ、ｔ　ｇ１０％水酸化ナトリウム水溶液　　
適　量茄　　　　　　　　　　　　　　　１００ｃｃＨ
Ｅｌ 処方例３（生薬） 高精製リゾチーム　　　　　　　５０　ｍｇカカオ脂　
　　　　　　　　　　１．５ｇ（これらを常法により生
薬１個とする。）処方例４（化粧用クリーム） 高精製リゾチーム　　　　　　　０．５　ｇステアリン
酸　　　　　　　　　　２．０ｇステアリルアルコール
　　　　　７．０ｇスクワラン　　　　　　　　　　５
．０　ｇオクチルドデカノール　　　　　６．０ｇポリ
オキシエチレン（１５）セチルエーテル３．０ｇ グリセリンモノステアレート　　２．０ｇプロピレング
リコール　　　　　５．ＯｇＰ−安息香酸メチル　　　
　　　０．２ｇｐ−オキシ安息香酸プロピル　　０．１
ｇ滅菌精製水　　　　　　　　全量８９．２ｇ発明の効
果 本発明の組成物は、リゾチームを用いるものであるにも
かかわらず抗原性が小さく、従ってアレルギー症状を起
こすおそれがほとんどない。

よって本発明の組成物は、リゾチーム含有医薬・化粧品
組成物として有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で用いる高精製リゾチームの電気泳動図
である。 第２図は市販の精製リゾチームの電気泳動図である。 第３図および第４図は、上記市販の精製リゾチームにア
ビジンを加えたものの電気泳動図である。 （１）・・・リゾチーム、（２）・・・アビジン、（３
）・・・アビジン分解物

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リゾチームまたはその塩を含有した医薬・化粧品組
   成物において、前記リゾチームまたはその塩として、ア
   ビジンを実質的に含有しない高精製リゾチームまたはそ
   の塩を用いたことを特徴とするリゾチーム含有医薬・化
   粧品組成物。 ２、高精製リゾチームまたはその塩が、電気泳動図にお
   いてアビジンおよびアビジン分解物を実質的に検出しな
   いものである特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ３、点眼剤である特許請求の範囲第１項記載の組成物。