IT202000009430A1

IT202000009430A1 - Composizione per la prevenzione e/o il trattamento delle infezioni delle vie respiratorie

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Publication number: IT202000009430A1
Application number: IT102020000009430A
Authority: IT
Original assignee: Tdc Tech Dedicated To Care Srl
Priority date: 2020-04-29
Filing date: 2020-04-29
Publication date: 2021-10-29
Also published as: EP4142772A1; WO2021220136A1; US20230226155A1

Description

DESCRIZIONE dell?invenzione avente per titolo:

?COMPOSIZIONE PER LA PREVENZIONE E/O IL TRATTAMENTO DELLE INFEZIONI DELLE VIE RESPIRATORIE?

RIASSUNTO

L?invenzione fa riferimento ad una composizione che comprende apolattoferrina, opzionalmente in miscela con lattoferrina, veicolata tramite liposomi, cos? come a prodotti che comprendono tale composizione, e al loro uso per la prevenzione e/o il trattamento delle patologie a carico dell?apparato respiratorio, in particolare le infezioni virali.

STATO DELLA TECNICA

La superficie delle mucose rappresenta la prima via d?ingresso al corpo umano per molti agenti patogeni, per esempio batteri e virus. I virus, in particolare quelli respiratori ed intestinali, hanno una significativa importanza epidemiologica.

Esempi di comuni malattie umane causate da virus includono il raffreddore comune, l'influenza, la varicella e l'herpes labiale. Tra le possibili malattie causate da infezioni virali ci sono anche gravi patologie quali l'AIDS, la malattia da virus Ebola, l'influenza aviaria e la SARS. Inoltre, i virus possono provocare un danneggiamento dell?epitelio che ricopre le cavit? interne del corpo comunicanti con l'esterno, come l'apparato digerente, l'apparato respiratorio, l'apparato urinario e genitale. Tale danneggiamento pu? favorire la superinfezione batterica, la quale, a sua volta, pu? portare all?insorgere di problemi clinici anche pi? gravi dell?infezione primaria virale.

Il ceppo di Coronavirus denominato SARS-CoV-2 non era mai stato identificato prima di essere segnalato a Wuhan, Cina, a Dicembre 2019. La malattia provocata da tale ceppo di Coronavirus ? stata denominata ?COVID-19?.

La condizione denominata COVID-19 si manifesta, in particolare, con alterazioni respiratorie, gastrointestinali e muscolari. La prima causa di morte da COVID-19 ? dovuta ad una polmonite interstiziale rapidamente ingravescente, con contestuale stato infiammatorio alveolare.

Nel Marzo 2020, a seguito della sua rapida ad ampia diffusione, l?Organizzazione Mondiale della Sanit? ha definito la COVID-19 una pandemia.

Risulta quindi fondamentale individuare sostanze che possano essere utilizzate per trattare e/o prevenire le infezioni virali, in particolare quelle dell?apparato respiratorio, quali, per esempio, la COVID-19.

La lattoferrina ? una glicoproteina bilobata, costituita da circa 690 aminoacidi. Ciascun lobo lega in modo reversibile uno ione ferrico per molecola.

Ogni molecola di lattoferrina pu? legare a s? al massimo due ioni ferrici ed in base a tale saturazione pu? esistere in tre forme distinte: apolattoferrina (priva di ferro), lattoferrina monoferrica (legata ad un solo ione ferrico) e ololattoferrina (che lega a s? due ioni ferrici).

Sono noti numerosi impieghi della lattoferrina.

Per esempio, nel brevetto italiano numero 0001394514, a nome della presente Richiedente, ? descritta una composizione a base di lattoferrina veicolata in nanolipidi ed il suo uso per il trattamento topico delle patologie cutanee caratterizzate da accumulo di metalli pesanti.

Inoltre, la domanda di brevetto Europeo EP3603621A1, a nome della presente Richiedente, descrive un prodotto costituito da liposomi che comprende lattoferrina e un componente scelto tra acido ialuronico o chitosano per il suo uso nella prevenzione e/o nel trattamento delle malattie oculari, per esempio congiuntivite, calazio, orzaiolo, blefarocongiuntivite e cheratite.

Sono anche noti usi della forma priva di ferro della lattoferina, cio? della apolattoferrina. Ad esempio, JP2011093893 descrive l?uso dell?apolattoferrina nel trattamento delle allergie. In documento JP2010229118 descrive, invece, un prodotto a base di proteine derivate dal latte quali lattoferrina, apolattoferrina e caseina enzimatica, in grado di inibire la lipasi e quindi vantaggiosamente utilizzato come coadiuvante nella perdita di peso.

WO2010005012 descrive una composizione a base di apolattoferrina unitamente ad almeno un ingrediente aggiuntivo scelto tra un agente glicato product-binding, una sostanza antiossidante e un antibatterico. La composizione descritta, pu? essere utilizzata nella formulazione di numerosi prodotti, ad esempio prodotti alimentari, cosmetici, detergenti, profumi ed altri ancora.

SCOPI DELL?INVENZIONE

Scopo della presente invenzione ? mettere a disposizione una composizione che sia in grado di prevenire, alleviare e/o trattare le infezioni dell?apparato respiratorio, in particolare le infezioni virali, quali, per esempio la COVID-19.

Ulteriore scopo della presente invenzione ? mettere a disposizione una composizione per il trattamento delle infezioni dell?apparato respiratorio, quando queste presentino sintomi lievi come, per esempio, durante le prime fasi di infezione e/o nei soggetti paucisintomatici.

Ancora scopo della presente invenzione ? mettere a disposizione una composizione che sia effecace nel trattamento e nella prevenzione delle infezioni, in particolare virali, delle vie respiratorie, e che non presenti effetti collaterali o tossici.

DESCRIZIONE DELL?INVENZIONE

Gli scopi sopra riportati, cos? come altri scopi, sono raggiunti tramite l?oggetto della presente invenzione, vale a dire da una composizione comprendente apolattoferrina come principio attivo, inclusa in liposomi. Infatti, tale composizione pu? essere efficacemente impiegata per il trattamento delle infezioni, in particolare virali, delle vie respiratorie.

Secondo un aspetto vantaggioso della presente invenzione, la composizione pu? essere utilizzata nella prevenzione e/o nel trattamento di infezioni virali anche gravi quali, per esempio, la SARS e la COVID-19.

Come sopra menzionato, la composizione dell?invenzione comprende apolattoferrina coma principio attivo.

Nella presente descrizione, il termine ?apolattoferrina? indica la lattoferrina nella sua forma priva di ferro, cio? non legata a ioni ferrici.

? stato sorprendentemente trovato che la composizione a base di apolattoferrina secondo la presente invenzione presenta delle caratteristiche particolari e consente di ottenere notevoli risultati nel trattamento delle patologie delle vie respiratorie causate da infezioni, in particolare virali, mostrando inoltre un effetto inaspettato rispetto all?azione della sola lattoferrina.

Senza volersi vincolare ad una specifica spiegazione scientifica, ? stato ipotizzato che l?apolattoferrina contrasti l?infezione virale impedendo l?ingresso del virus nella cellula ospite, per esempio durante le prime fasi dell?infezione. Per quanto concerne l?infezione da coronavirus, in particolare il ceppo che causa la COVID-19, ? stato ipotizzato che l?apolattoferrina interagisca con delle particolari proteine di adesione (spike proteins), che sono presenti sulla superficie del virus e che ne mediano l?ingresso nella cellula ospite, andando a svolgere i suoi effetti benefici direttamente a livello del capside virale. Inoltre, l?apolattoferrina e la lattoferrina possiedono attivit? antiinfiammatoria ed immunomodulante. La prima dipende dalla sua capacit? di entrare per endocitosi nella cellula ospite ed essere traslocata a livello nucleare, portando all?espressione di geni antinfiammatori, inoltre come immunomodulante sopprime l?espressione di geni proinfiammatori codificanti l?interleuchina 6 (IL6). ? stato inoltre ipotizzato che l?apolattoferrina, non essendo legata a ioni ferrici, possa chelare il ferro intracellulare, andando a riequilibrare lo stato REDOX intracellulare, riducendo cos? lo stato infiammatorio derivante dall?infezione virale.

Inoltre, ? stato trovato che i medesimi vantaggi sopra descritti possono essere ottenuti quando la composizione dell?invenzione comprende, in aggiunta alla apolattoferrina anche una certa quantit? di lattoferrina.

Per questo, secondo una forma di realizzazione, la composizione dell?invenzione pu? comprendere anche lattoferrina, in aggiunta all?apolattoferrina, inclusa nei liposomi. In altre parole, secondo ulteriori forme di realizzazione, la composizione pu? comprendere una miscela di apolattoferrina e lattoferrina come principio attivo, tale miscela essendo inclusa in liposomi.

Nella presente descrizione, il termine ?lattoferrina? indica la lattoferrina nella sua forma legata ad almeno uno ione ferrico. In altre parole, con tale termine si vuole indicare, per esempio, lattoferrina monoferrica (legata ad un solo ione ferrico).

Quando l?apolattoferrina si trova miscelata alla lattoferrina, l?apolattoferrina ? preferibilmente in quantit? superiore rispetto alla lattoferrina.

In differenti forme di realizzazione della presente invenzione, la lattoferrina ? in una quantit? tra 0,001% e 50%, preferibilmente tra 0,01% e 25%, pi? preferibilmente tra 0,1% e 10% in peso rispetto al peso totale di apolattoferrina e lattoferrina.

La presente invenzione supera inoltre i limiti della tecnica nota dovuti alla facilit? di degradazione e di denaturazione della proteina nella sua forma priva di ferro, mettendo a disposizione una composizione in un cui la apolattoferina ? nella conformazione non legata a ioni ferrici ma, allo stesso tempo, non risulta sostanzialmente denaturata o degradata. Infatti, vantaggiosamente, nella composizione della presente invenzione, l?apolattoferrina si trova inclusa in liposomi.

Nella presente descrzione, con il termine ?liposoma? si vuole indicare una vescicola costituita da almeno un doppio strato lipidico ed da un nucleo di soluzione acquosa incapsulata all?interno del doppio strato lipidico. I lipidi che costituiscono il doppio strato del liposoma (o lipidi formanti liposomi) possono comprendere miscele composte principalmente da fosfolipidi, come ad esempio fosfatidilcolina, e in minor quantit? da colesterolo. A titolo di esempio, lipidi utili a costituire il doppio strato lipidico del liposoma sono una miscela di colesterolo e di lecitina di soia, ad esempio, comprendente fosfatidilcolina (come ad esempio il prodotto commerciale Lipoid S75, oppure il prodotto commerciale Lipoid S80, attualmente venduti dall?azienda

Altri lipidi utili a costituire il doppio strato lipidico dei liposomi secondo la presente invenzione sono i fosfolipidi derivati dal latte, in particolare derivati dalla membrana di globulo di grasso di latte (?milk fat globule membrane? o ?MFGM? in lingua inglese). I fosfolipidi derivati dalla membrana di globulo di grasso di latte possono contenere, oltre alla fosfatidilcolina, per esempio sfingomielina e fosfatidiletanolammina (come ad esempio il prodotto commerciale ?Fosfolipidi da Latte?, attualmente commercializzato dall?azienda ). Il liposoma pu? altres? comprendere, nel proprio doppio strato lipidico, ulteriori composti di natura non lipidica, ad esempio altri composti organici (come il tocoferolo o il lattosio).

I liposomi possono essere prodotti attraverso tecniche di per s? note nell?arte quali, per esempio, estrusione e sonicazione.

Secondo forme di realizzazione della presente invenzione, i liposomi sono prodotti per estrusione.

Vantaggiosamente, variando paramentri quali tempo, pressione e numero di cicli, l?estrusione pu? essere utilizzata per produrre liposomi aventi dimensioni diverse, secondo la tipologia di prodotto che deve essere ottenuto.

Secondo forme di realizzazione, i liposomi usati nella composizione dell?invenzione comprendono fosfolipidi derivati dalla membrana di globuli di grasso di latte. In questo caso, vantaggiosamente, i liposomi risultano particolarmente gastroresistenti e, pertanto, particolamente adatti ad essere formulati in forme farmaceutiche ingeribili quali, per esempio, capsule. Tuttavia, i medesimi liposomi sono formulabili anche in numerose altre tipologie di formulazioni farmaceutiche, per esempio in formulazioni liquide per spray (per esempio spray nasali) o aerosol.

Secondo forme di realizzazione, i liposomi usati nella composizione dell?invenzione sono costituiti da fosfolipidi derivati dalla membrana di globuli di grasso di latte. L?apolattoferrina compresa nei liposomi secondo l?invenzione ? preferibilmente incapsulata all?interno dei liposomi, cio? all?interno dello spazio delimitato dal doppio strato lipidico, e pi? preferibilmente ? solubilizzata nel nucleo di soluzione acquosa che tipicamente ? all?interno del liposoma.

Per il raggiungimento delle basse vie aeree le particelle possono avere una dimensione tra i 2000 e 4000nm.

Secondo forme di realizzazione dell?invenzione, i liposomi hanno una dimensione media tra 25 nm e 1000 nm di diametro, preferibilmente tra 50 nm e 500 nm, pi? preferibilmente tra 70 nm e 250 nm. In forme di realizzazione, particolarmente preferiti sono i liposomi aventi una dimensione media tra 80 nm e 200 nm di diametro.

Vantaggiosamente, quando i liposomi hanno dimensione media inferiore a 1000 nm, preferibilmente inferiore a 500 nm, pi? preferibilmente inferiore a 300 nm, tali liposomi risultano particolarmente stabili e adatti ad essere formulati in forma di spray nasali e formulazioni per aerosol, in quanto tali dimensioni consentono ai liposomi di raggiungere le basse vie aeree.

La dimensione dei liposomi pu? essere misurata, come diametro z-medio (?z-average diameter?, in lingua inglese), utilizzando un analizzatore di particelle tramite la tecnica di diffusione dinamica della luce (?dynamic light scattering?, DLS), ad esempio tramite lo strumento Zetasizer Nano ZS di Malvern Panalytical. Tali misure possono essere condotte dopo che i liposomi sono stati opportunamente diluiti, ad esempio con una diluizione 1:10 con acqua distillata (per esempio Milli-Q).

La composizione dell?invenzione possiede inoltre diversi vantaggi che la rendono particolarmente stabile ed efficace per il suo utilizzo nel trattamento delle infezioni, in particolare delle infezioni virali. Ad esempio, l?apolattoferrina risulta stabilizzata grazie alla sua incorporazione nei liposomi, ed ? pertanto protetta da un?eventuale denaturazione. Inoltre, la composizione dell?invenzione risulta particolarmente adatta ad essere formulata in capsule, cos? come in formulazioni liquide per spray e/o aerosol, in particolar modo quando il liposoma ? formato da fosfolipidi derivati dalla mambrana di globuli di grasso di latte.

Secondo forme di realizzazione, i liposomi secondo l?invenzione hanno potenziale Z negativo. Secondo forme di realizzazione dell?invenzione, il potenziale Z dei liposomi, misurato in acqua distillata (per esempio Milli-Q, ad esempio con una diluizione 1:10), pu? essere compreso nell?intervallo tra -50 mV e -30 mV, preferibilmente tra -45 mV e ? 35 mV, pi? preferibilmente tra -42 e 38 mV. Tali valori possono variare, arrivando anche a valori positivi, cio? superiori a 0 mV, quando le misurazioni vengono condotte utilizzando un mezzo differente rispetto alla soluzione tampone. I valori di potenziale Z come sopra descritti possono essere misurati utilizzando un analizzatore di particelle tramite la tecnica dell?elettroforesi a laser Doppler, ad esempio tramite lo strumento Zetasizer Nano ZS di Malvern Panalytical.

Secondo forme di realizzazione dell?invenzione, i liposomi hanno indice di polidispersione compreso tra 0,100 e 0,400, preferibilmente tra 0,150 e 0,300, pi? preferibilmente tra 0,170 e 0,250.

L'indice di polidispersione ? una misura dell'uniformit? di distribuzione dei pesi molecolari dei liposomi in un campione.

I valori dell?indice di polidispersione possono essere misurati, ad esempio con una diluizione 1:10 con acqua distillata (per esempio Milli-Q), utilizzando un analizzatore di particelle, ad esempio tramite lo strumento Zetasizer Nano ZS di Malvern Panalytical.

Secondo forme di realizzazione, i liposomi possono inoltre incorporare agenti funzionali farmaceuticamente adatti, come ad esempio crioprotettori, regolatori dell?osmolarit?, tensioattivi e tamponi.

In particolare, secondo forme di realizzazione, i liposomi possono incorporare uno o pi? crioprotettori. I crioprotettori permettono di mantenere inalterate le caratteristiche chimico-fisiche dei liposomi, cos? come delle composizioni che li comprendono. Infatti, i crioprotettori sono utili, ad esempio, se i liposomi devono essere liofilizzati per essere conservati a lungo termine. Crioprotettori utili nella presente invenzione possono essere, ad esempio, mannitolo, trealosio, ciclodestrina, e loro miscele, e preferibilmente sono mannitolo, trealosio e loro miscele.

Vantaggiosamente, i liposomi possono essere liofilizzati per essere conservati a lungo termine. I liposomi possono essere liofilizzati attraveso tecniche di per s? note nell?arte. Vantaggiosamente, i liposomi liofilizzati in forma di polvere risultano particolarmente stabili, e possono essere incorporati, preferibilmente in forma appunto di polvere, all?interno di capsule.

Opzionalmente, le capsule possono essere aperte, e la composione liofilizzata in esse contenuta pu? essere disciolta in acqua tiepida o altre bevande non alcoliche per facilitarne l?assunzione da parte di soggetti con problemi di deglutizione.

I liposomi liofilizzati possono, inoltre, essere utilizzati nella produzione di composizioni liquide, quali spray e aerosol.

In questo caso, l?uso di crioprotettori risulta particolarmente vantaggioso, in particolare nella fase di ricostruzione dei liposomi, che corrisponde alla fase di idratazione del liposoma con acqua. L?uso di crioprotettori garantisce l?integrit? del liposoma una volta idratato, impedendo la rottura del liposoma, non solo durante la fase di liofilizzazione, ma anche durante la fase di ricostruzione.

Infatti, durante la preparazione della composizione acquosa, atta ad essere utilizzata come spray nasale o aerosol, la presenza di crioprotettori consente di evitare che i liposomi si danneggino o si rompano, e che la loro funzione di protezione dell?apolattoferrina sia compromessa.

Inoltre, quando ? in forma liquida, la composizione dell?invenzione pu? ulteriormente comprendere uno o pi? componenti scelti tra: sorbitolo, sodio cloruro, EDTA, sodio fosfato monobasico, sodio fosfato dibasico, e acqua.

Modulatori dell?osmolarit? utili nella presente invenzione possono essere, per esempio, elettroliti cationici, tra cui Na, K, Ca, Mg.

Ulteriori agenti funzionali utili nella presente invenzione, in particolare per l?allestimento dei liposomi, sono i tensioattivi. Vantaggiosamente, tensioattivi secondo la presente invenzione possono essere tensioattivi ionici o non-ionici, preferbilimente non ionici, come ad esempio il polisorbato 80 (anche detto Tween? 80).

Secondo forme di realizzazione, la composizione secondo l?invenzione comprende inoltre eccipienti farmaceuticamente accettabili.

Come sopra discusso, la composizione dell?invenzione pu? essere efficacemente impiegata per la prevenzione e/o il trattamento delle infezioni virali delle vie respiratorie, per esempio la COVID-19.

Vantaggiosamente, la composizione dell?invenzione pu? essere impiegata per il trattamento delle infezioni dell?apparato respiratorio, quando queste presentino sintomi lievi come, per esempio, durante le prime fasi di infezione e/o nei soggetti paucisintomatici.

Inoltre, in forme di realizzazione, la composizione dell?invenzione pu? essere formulata in forma di capsule, spray nasale o aerosol. Vantaggiosamente, i liposomi formati da fosfolipidi derivati dalla mambrana di globuli di grasso di latte, possono essere utilizzati sia nelle capsule che nelle formulazioni liquide, come lo spray nasale e l?aerosol.

Secondo forme di realizzazione, capsule e spray nasale e/o aerosol possono essere utilizzate, nella prevenzione e/o trattamento delle infezioni virali delle vie respiratorie, somministrate singolarmente o in associazione tra di loro.

Altro oggetto della presente invenzione ?, quindi, una capsula comprendente la composizione dell?invenzione, per l?uso nella prevenzione e/o trattamento delle infezioni virali delle vie respiratorie.

Secondo forme di realizzazione, la capsula comprende la composizione in forma di polvere, preferibilmente polvere liofilizzata.

Ancora oggetto della presente invenzione ? uno spray nasale o un aerosol (cio? una composizione liquida adatta ad essere nebulizzata in forma di spray nasale o aerosol), per il suo uso nella prevenzione e/o trattamento delle infezioni virali delle vie respiratorie.

Vantaggiosamente, la stessa composizione, in forma liquida, pu? essere utilizzata per produrre sia spray nasali che aerosol.

Preferibilmente, se la composizione ? destinata alla produzione di un aerosol, la composizione viene sterilizzata.

In forme di realizzazione, lo spray nasale o aerosol comprende una miscela di apolattoferrina e lattoferrina come principio attivo, inclusa in liposomi, preferibilmente incapsulata in liposomi.

Altro oggetto della presente invenzione ? un?associazione di capsule con spray nasale e/o aerosol, comprendenti la composizione secondo l?invenzione, per la prevenzione e/o il trattamento delle infezioni virali delle vie respiratorie.

Capsule, spray nasale e aerosol possono essere prodotti attraverso tecniche di per s? note nell?arte.

Secondo forme di realizzazione, ciascuna capsula include da 50 mg a 500 mg di apolattoferrina (opzionalmente in miscela con lattoferrina), preferibilmente tra 75 mg e 250 mg, pi? preferibilmente tra 90 mg e 200 mg. In forme di realizzazione, ogni capsula include circa 100 mg di apolattoferrina o 100 mg di miscela apolattoferrina e lattoferrina).

Secondo forme di realizzazione, la formulazione liquida atta ad essere utilizzata come spray contiene apolattoferrina (opzionalmente in miscela con lattoferrina), in una concentrazione tra 0.1 mg/ml e 2.mg/ml, preferibilmente tra 0.5 mg/ml e 1.5 mg/ml, pi? preferibilmente tra 0.6 mg/ml e 1.0 mg/ml.

Secondo forme di realizzazione, la formulazione liquida atta ad essere utilizzata come aerosol contiene apolattoferrina (opzionalmente in miscela con lattoferrina), in una concentrazione tra 0.1 mg/ml e 2.mg/ml, preferibilmente tra 0.5 mg/ml e 1.5 mg/ml, pi? preferibilmente tra 0.6 mg/ml e 1.0 mg/ml.

Quando l?apolattoferrina ? in miscela con lattoferrina, le quantit? e le concentrazioni descritte nella presente invenzione si riferiscono alla somma di apolattoferrina e lattoferina, salvo dove esplicitamente indicato diversamente.

La composizione dell?invenzione, cos? come i prodotti in cui essa ? contenuta, in particolare le formulazioni liquide per aerosol, possono dover essere sterili o sostanzialmente sterili, ad esempio per soddisfare requisiti normativi. A tale scopo, ? possibile sterilizzare la composizione dell?invenzione, cos? come i liposomi in essa contenuti, tramite l?irraggiamento con raggi ?, ad esempio ad una dose di 25 kGy, o di 10 kGy.

L?invenzione potr? essere ancora meglio compresa grazie agli esempi illustrativi, non limitativi, descritti nella seguente sezione sperimentale.

SEZIONE SPERIMENTALE

Esempio 1

Preparazione dei liposomi

Per la preparazione dei liposomi sono stati utilizzati fosfolipidi derivati dal latte, in particolare derivati dalla membrana di globulo di grasso di latte (?milk fat globule membrane? o ?MFGM? in lingua inglese), per la produzione del doppio strato lipidico, ed ? stata utilizzata apolattoferrina, oppure una miscela di apolattoferrina e lattoferrina, come principio attivo.

In particolare, per la produzione del doppio strato lipidico ? stato utilizzato il prodotto commerciale ?Fosfolipidi da latte? (attualmente commercializzato dall?azienda

Sono stati inoltre utilizzati mannitolo e trealosio, come crioprotettori.

Il prodotto commerciale ?Fosfolipidi da latte? presenta le seguenti caratteristiche. Composizione:

*= principalmente galattosil e glucosil- ceramidi ;;Analisi chimico-fisiche: ;Tabella 2 ;Consistenza polvere ;Colore biancastro ;umidit? max. 5 % ;Valore di perossido max. 3 meq/kg ;;Analisi microbiologiche: ;;Tabella 3 ;Conta in piastra totale max.5,000 CFU/g ;Lieviti e muffe < 100 CFU/g ;Coliformi < 10 /g ;Enterobacteriacee < 10 /g ;Salmonella negativo/ 25 g ;Listeria Monocytogenes negativo/ 25 g ;;I liposomi sono stati prodotti attraverso la tecnica dell?estrusione e liofilizzati. ;;Esempio 2 ;Studio in vitro della stabilit? dei liposomi alla digestione ;;1. Materiali ;Liposomi comprendenti apolattoferrina liofilizzati (come ottenuti nell?Esempio 1) ; Acqua Milli-Q; Acqua distillata; Micropipette; 4 becher; Bagno a 37 ?C; Zeta Sizer NanoZS. ;;2. Metodi ;2.1 Caratterizzazione fisico-chimica ;Per questo test, ? stata preparata una soluzione di liposomi liofilizzati con una concentrazione di 1 mg / ml. ;? stato pesato 1 mg (1,01 mg) di liposomi liofilizzati e sono stati aggiunti 10 ml di acqua Milli-Q. ;? stata poi effettuata una diluizione 1:10 usando una micropipetta P1000. La diluizione ? stata realizzata utilizzando 100 ?l di prodotto e 900 ?l di acqua Milli-Q, in una provetta Eppendorf da 2 ml. ;Questa soluzione ? stata trasferita in una cuvetta e le dimensioni medie del diametro (Zav), l'indice di polidispersione (PI) e il potenziale Zeta (ZP) dei liposomi sono state analizzate nello strumento Zeta Sizer. ;;2.2. Preparazione per il rilascio intestinale ;Preparazione di fluido gastrico simulato (SGF) e fluido intestinale simulato (SIF): ;;- SGF: ;? Pesare 2 g di NaCl e sciogliere in circa 100ml di acqua. ;? Aggiungere 7 ml di HCl 2M ;? Diluire fino a 700 ml ;? Verificare che il PH sia simile a 1.2 e, in caso contrario, aggiungere solo HCL fino a 1.2 ;? Portare a 1 L ;? Una volta preparato e portato a volume con il matraccio da 1 L, si divide la soluzione in due matracci da 250 ml e uno da 500 ml da conservare in frigorifero, etichettati con la data di preparazione. ;? In uno dei due matracci da 250 ml vengono aggiunti 8 mg di pepsina, cos? da ottenere una concentrazione di pepsina di 0.032 mg/ml. ;;- SFI ;? Pesare 6.8g di fosfato dipotassico e sciogliere in 100 ml di acqua Milli-Q. ;? Aggiungere 190 ml di una soluzione: 120-150 ml di NaOH 0,1 M, aggiungendo 0,83 g di CaCl2 e 1,66502 g di NaCl (soluzione NaOh 0,1 M, NaCl 150 mM e CaCl 30 mM) ;? Portare a 900 ml e portare il PH a 7.4 ;? Aggiungere sali biliari 0.32 mg/ml ;? Una volta preparato e portato a volume con il matraccio da 1L, si divide la soluzione in due matracci da 250 ml e uno da 500 ml da conservare in frigorifero, etichettati con la data di preparazione. ;? In uno dei due matracci da 250 ml si aggiungono 0.032 mg/ml di pancreatina, nell?altro no. ;;Per questo test ? stato preparato un bagno che riscaldato a 37 ?C, quindi sono state preparate 4 soluzioni costituite da 24 ml di campione (1 mg / ml) 72 di terreno SGF o SFI, con o senza enzimi, quindi avremo 4 becher con i seguenti mezzi: ;-SGF Pepsina ;-SGF ;-SIF Pancreatina ;-SIF ;;Una volta raggiunta la temperatura del bagno appropriata, sono stati aggiunti ai 4 mezzi i 24 ml (1 mg / ml) di campione di liposoma liofilizzato. I becher sono stati messi in agitazione e, una volta aggiunto il campione ai becher, ? stato fatto partire il cronometro. Sono stati estratti 1 ml di soluzione da ciascuno dei becher nei seguenti tempi (min): 0, 15, 30, 60, 120. Ogni ml estratto ? stato sostituito con 1 ml del mezzo corrispondente. I campioni estratti in momenti diversi, sono stati passati attraverso lo Zeta Sizer NanoZS per misurare la dimensione delle particelle, l'indice di polidispersit? e il potenziale Z. ;;3. Risultati ;3.1 Caratterizzazione fisico-chimica dei liposomi ;I risultati medi delle misurazioni effettuate sui lipomi prima di essere messi a contatto con i diversi mezzi da testare sono riportati nella seguente tabella (Tabella 4): ;;Tabella 4 ;Zav (nm) PI ZP (mV) ;192.9? 4.5 0.181 ? 0.02 ? 40 ? 0.5 3.2 Comportamento nel mezzo gastrico ed intestinale ;I risultati medi ottenuti sono riportati nelle tabelle seguenti (Tabelle 5, 6, 7 e 8): - SGF con Pepsina ; ;; - SGF ; ;; - SIF con Pancreatina ;; ;; - SIF ;; ; 120 326.9 ? 24.36 0.383 ? 0.042 -17.3 ? 1.31 ;;4. Conclusioni ;Il contatto dei liposomi con il mezzo di rilascio intestinale e gastrico aumenta la loro dimensione e PI. Soprattutto nel caso del liquido intestinale. ;La presenza di enzimi (pepsina o pancreatina) promuove il mantenimento della dimensione media delle particelle. ;I dati ottenuti mostrano che i liposomi comprendenti apolattoferrina, ottenuti secondo l?Esempio 1, a contatto con SGF e SIF, pur modificando le sue caratteristiche, non si rompe. La variazione delle caratteristiche dei liposomi risulta particolarmente ridotta in presenza di enzimi (pepsina o pancreatina). ;;Esempio 3 ;Uso di un?associazione di un integratore alimentare entrambi a base di apolattoferrina liposomiale in capsule e in spray nasale nella prevenzione e nel trattamento del COVID-19. ;;Disegno dello studio ;? stato disegnato uno studio pilota, al fine di valutare nel dettaglio gli effetti dell?uso di un?associazione di un integratore alimentare entrambi a base di apolattoferrina liposomiale in capsule e in spray nasale in tre gruppi di pazienti: COVID-19 positivi asintomatici, COVID-19 positivi pausintomatici ed in pazienti a rischio per infezione ma COVID-19 negativi. ;? stato ipotizzato che l?utilizzo contemporaneo di entrambe le forme garantirebbe una protezione sia a livello sistemico che a livello locale. ;Per questo motivo, l?assunzione dell?apolattoferrina (opzionalmente in miscela con lattoferrina) in liposomi per somministrazione orale risulta fondamentale anche nelle fasi di prevenzione e cio? in soggetti negativi ma fortemente esposti al COVID-19. Inoltre, ? stato ipotizzato che l?aumento della concentrazione di apolattoferrina in circolo, garantirebbe un incremento della sua concentrazione a livello delle mucose respiratorie, coadiuvando in maniera efficace l?attivit? antivirale svolta dall?apolattoferrina somministrata attraverso la via inalatoria. ;;Descrizione della popolazione in studio ;La popolazione in studio comprende soggetti suddivisi in 3 bracci secondo il razionale scientifico dello studio, pi? un quarto gruppo di controllo, e sono selezionati in base a specifici criteri di inclusione ed esclusione nonch? in proporzione alle rispettive classi di et? e sesso in relazione alla distribuzione di tutti i casi positivi (o, sotto certe condizioni, anche i negativi) per fascia di et? e sesso registrati in Italia dal Ministero della Salute a far data 31 marzo 2020 (ore 18:00). ;Il primo braccio di pazienti COVID-19 positivi ? quello degli asintomatici, iniziano al T0 il trattamento con apolattoferrina liposomiale per somministrazione orale due volte al giorno ed in spray per 3 volte al giorno, per 30 giorni. Viene raccolto espettorato e prelievo venoso al T0 contestualmente alla consegna del dispositivo medico che il paziente utilizza a domicilio. ;Il secondo braccio ? costituito dai pazienti COVID-19 positivi, paucisintomatici, che presentano temperatura corporea di oltre 37.5?C., tosse, cefalea, astenia, diarrea, miastenia, SPO2> 93% o PaO2/FiO2> 300mmHg senza inalazione di ossigeno. Iniziano al T0 il trattamento con apolattoferrina liposomiale per somministrazione orale due/tre volte al giorno (a seconda del peso corporeo) ed in spray per 3 volte al giorno, per 30 giorni. ;Il terzo braccio ? quello dei pazienti COVID-19 negativi a rischio ed in sorveglianza attiva per pregresso contatto con soggetti COVID-19 positivi. ;Iniziano al T0 il trattamento con apolattoferrina liposomiale per somministrazione orale ed in spray due volte al giorno, per 30 giorni. ;Il quarto gruppo, di pari caratteristiche al precedente, ? da considerarsi come gruppo di controllo necessario per l?effettuazione di tutti i possibili confronti previsti dal protocollo. ;;Obiettivo principale ;L?obiettivo primario dello studio, ? la valutazione delle condizioni cliniche dei soggetti arruolati, in seguito all?assunzione e all? inalazione di apolattoferrina liposomiale nei pazienti positivi per COVID-19 paucisintomatici o asintomatici o COVID-19 negativi ma a rischio. ;;Obiettivi secondari ;Gli obiettivi secondari vanno a valutare la sicurezza e tollerabilit? del dispositivo medico contenente apolattoferrina liposomiale ed inoltre sono analizzati i seguenti parametri dal prelievo venoso dei pazienti: ;? Valutazione emocromo completo al T0, T1 e T2 ;? Valutazione dei livelli di IL-1?, di IL-6, IL-10, TNF? al T0, T1 e T2 ? al T1 e al T2 valutazione del tasso di assenza di febbre, remissione dei sintomi respiratori, tasso di recupero di imaging polmonare ;? Tasso di recupero della proteina C-reattiva (CRP) ;? Tasso di recupero del criterio biochimico (CK) ;? Tasso di RNA virale non rilevabile (continuo due volte) ;? Tempo di ricovero ;;Criteri d?inclusione ;- Soggetti di et? compresa superiore a 1820 anni positivi al tampone per COVID-19 - soggetti affetti da COVID-19 confermati all?esame del tampone orofaringeo o da esame sierologico su plasma ;- Soggetti a rischio per infezione da COVID-19 in sorveglianza attiva per pregresso contatto con soggetti COVID-19 positivi ;;Criteri di esclusione ;- Donne in gravidanza e in allattamento. ;- Pazienti che assumono ossido nitrico e nitrati ;- Pazienti con riferita allergia alle proteine del latte ;- Pazienti con storia pregressa di iperattivit? bronchiale ;- Pazienti affetti da patologie respiratorie preesistenti ;;Metodi ;Viene valutato il supporto dell?apolattoferrina liposomiale al T0, dopo 15 giorni (T1) e dopo 30 gg (T2) nei pazienti reclutati nelle seguenti modalit?: ;;Gruppo 1: 15 pazienti asintomatici. ;Valutazione della temperatura corporea e di eventuali sintomi respiratori. ;Trattamento dal T0 con: ;1. apolattoferrina liposomiale in capsule (cps) da 200 mg (pari a 100 mg di apolattoferrina), 5 capsule al giorno di cui 3 al mattino e 2 la sera per 30 giorni. (dosaggio totale 500 mg di apo- lattoferrina al giorno). Per migliorare la compliance del paziente, le capsule possono essere aperte ed il contenuto disciolto in qualunque bevanda (non alcolica) a temperatura non superiore a 40?C. ;2. spray nasale (miscela di apolattoferrina e lattoferrina liposomiale): 2 spruzzi per narice 3 volte al giorno, inspirando profondamente durante la somministrazione. Prima della somministrazione ? consigliato effettuare un?accurata pulizia della cavit? nasale. ;;Gruppo 2: 15 pazienti paucisintomatici in regime di ricovero ospedaliero non in terapia intensiva. ;Valutazione della temperatura corporea, dei sintomi respiratori (rinorrea, tosse), cefalea, congiuntivite, miastenia e diarrea, eventuale imaging polmonare. ;Trattamento dal T0 con: ;1. apolattoferrina liposomiale in capsule da 200 mg (pari a 100 mg di apolattoferrina), 10 capsule al giorno per i pazienti con peso inferiore o uguale a 70 kg suddivise in 5 capsule al mattino e 5 capsule alla sera per 30 giorni per un totale di 1 g di apolattoferrina/die; pazienti con peso corporeo superiore a 70 kg, 15 capsule al giorno suddivise in 3 somministrazioni/die per 30 giorni per un totale di 1,5 gr di apolattoferrina al giorno. Per migliorare la compliance del paziente, le capsule possono essere aperte ed il contenuto disciolto in qualunque bevanda (non alcolica) a temperatura non superiore a 40?C. ;2. spray nasale: 2 spruzzi per narice 3 volte al giorno, inspirando profondamente durante la somministrazione. Prima della somministrazione ? consigliato effettuare un?accurata pulizia della cavit? nasale. ;;Gruppo 3: 15 pazienti a rischio per pregresso contatto con pazienti infetti ma COVID-19 negativi in sorveglianza attiva. ;Trattamento dal T0 con: ;1. lattoferrina liposomiale in cps da 200 mg (pari a 100 mg di lattoferrina), 2 capsule al giorno suddivise in 1 capsula al mattino e 1 capsula alla sera per 30 giorni per un totale di 200 mg di lattoferrina/die. Per migliorare la compliance del paziente, le stesse possono essere aperte ed il contenuto disciolto in qualunque bevanda (non alcolica) a temperatura non superiore a 40?C. ;2. spray nasale (miscela di apolattoferrina e lattoferrina liposomiale): 2 spruzzi per narice 2 volte al giorno, inspirando profondamente durante la somministrazione. Prima della somministrazione ? consigliato effettuare un?accurata pulizia della cavit? nasale. ;;Gruppo 4: 15 pazienti a rischio per pregresso contatto con pazienti infetti ma COVID-19 negativi in sorveglianza attiva in assenza di trattamento (gruppo di controllo). I 15 pazienti arruolati in ciascuno dei suddetti quattro gruppi assumono la medesima distribuzione per et? e sesso con caratteri, per?, diversificati secondo il proprio gruppo di appartenenza; la distribuzione in questione risulta proporzionale, come sopra detto, a quella ufficiale sul totale dei casi positivi al COVID19 rilevati dal Ministero della Salute. ;;La tabella che segue (Tabella 9) riporta tale distribuzione in questione per i quattro gruppi qui considerati: ;;Tabella 9 ; ;; * Fonte: GEDI VISUAL - Coronavirus, la situazione in Italia ? aggiornamento 31 marzo 2020 ore 18:00. Dati Ministero Salute.

Nei tempi previsti del follow-up dei pazienti (T1 e T2) a partire dalla prima visita di arruolamento (T0) viene eseguito, previo consenso informato, un prelievo venoso per la valutazione dei seguenti parametri: emocromo completo, PCR, CK, IL-6, IL-10, TNF?.

Analisi statistica

Poich? trattasi di uno studio preliminare, non si ? proceduto al calcolo della numerosit? del campione (power analysis) per mancanza di statistiche atto allo scopo per cui si intende arruolare 60 pazienti: 15 in ciascuno dei quattro gruppi ipotizzati. Per quanto riguarda l?analisi statistica descrittiva si procede al calcolo della tendenza centrale, della variabilit?, della simmetria e della curtosi. Grafici completano la descrizione visiva dell?insieme delle variabili rilevate. Vengono costruite, infine, le tabelle di contingenza 2X2 per tutti gli incroci tra le variabili sperimentali e quelle di controllo e calcolati i relativi ODDS RATIO. Dal punto di vista inferenziale, la significativit? statistica degli odds ratio viene determinata mediante la t di Student e vengono costruiti i relativi intervalli di confidenza al 95%; oltre a ci?, si procede al calcolo del ?2 di Pearson, del test esatto di Fisher, del test di Mc Nemar e del test di Yates. I risultati sperimentali si considerano statisticamente significativi se presentano dei p-value ? 0,05.

Claims

RIVENDICAZIONI

1. Composizione comprendente apolattoferrina come principio attivo inclusa in liposomi per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento delle infezioni delle vie respiratorie.

2. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 1, quando dette infezioni sono infezioni virali.

3. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 2, in cui detta infezione virale ? la COVID-19.

4. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 1, in cui detta composizione comprende una miscela di apolattoferrina e lattoferrina come principio attivo, detta miscela essendo inclusa in detti liposomi.

5. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 4, in cui detta apolattoferrina ? in quantit? maggiore o uguale rispetto a detta lattoferrina.

6. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 5, in cui detta lattoferrina ? in una tra 0,001% e 50%, preferibilmente tra 0,01% e 25%, pi? preferibilmente tra 0,1% e 10% in peso rispetto al peso totale di apolattoferrina e lattoferrina.

7. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 1, in cui detti liposomi comprendondo fosfolipidi derivati dalla membrana di globuli di grasso di latte.

8. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 1, in cui detta apolattoferrina ? incapsulata all?interno di detti liposomi, preferibilmente ? solubilizzata nel nucleo di soluzione acquosa all?interno di detti liposomi.

9. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 1, in cui detti liposomi hanno una dimensione media tra 25 nm e 1000 nm di diamtetro, preferibilmente tra 50 nm e 500 nm, pi? preferibilmente tra 70 nm e 250 nm.

10. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 1, in cui detti liposomi includono uno o pi? crioprotettori, preferibilmente scelti tra mannitolo, trealosio, ciclodestrina, e loro miscele.

11. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 1, in cui detti liposomi sono liofilizzati.

12. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 1, in cui detta composizione ? in forma liquida o in polvere.

13. Capsula comprendente detta composizione secondo la rivendicazione 1, per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento delle infezioni virali delle vie respiratorie.

14. Capsula per l?uso secondo la rivendicazione 13, in cui detti liposomi sono liofilizzati.

15. Spray nasale o aerosol comprendente detta composizione secondo la rivendicazione 1, per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento delle infezioni virali delle vie respiratorie.

16. Associazione di detta capsula secondo la rivendicazione 13 con detto spray nasale o detto aerosol secondo la rivendicazione 15, per l?uso nella prevenzione o nel trattamento delle infezioni virali delle vie respiratorie.