CN1169836C - 液-固萃取体系分离纯化血红蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用液-固萃取体系从血液中分离纯化血红蛋白的方法。本发明方法所需设备简单，分离纯化成本低，速度快，成相容易，成相后直接倾出液相即可使液固两相分离，无须双水相萃取中的离心等操作，不用有机溶剂，无毒性，成相聚合物及盐对蛋白质有稳定和保护作用。萃取分离选择性好，萃取容量大，是易于规模放大分离纯化血红蛋白的新技术。本发明用PEG修饰物混合聚合物-盐-水液-固萃取体系对猪血、牛血、人血中血红蛋白进行萃取，经过一次萃取，一次反萃和透析即可得到纯度大于99%的血红蛋白的水溶液。
Description
技术领域
本发明涉及一种用液-固萃取体系从血液中分离纯化血红蛋白的方法。更具体地说，是通过聚乙二醇(PEG)修饰物混合聚合物-盐-水液-固亲和萃取法从血液中提取血红蛋白。
背景技术
蛋白质的分离纯化，一般采用萃取法、沉淀法、层析法、电泳法、液相色谱法等。沉淀法分为有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法，Preparationand Properties of Serum and Plasma Proteins.IV.A System for theSeparation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Componentsof Biological Tissues and Fluids.(J.Am.Chem.Soc.1964：459-475)介绍的有机溶剂沉淀法易引起蛋白质变性，沈同、王镜岩主编的《生物化学》(第二版)上册，(高等教育出版社，北京，1994，p.210-222.)介绍的等电点沉淀法只能用于去除等电点相距较大的杂蛋白，上书介绍的电泳法、层析法和中国专利ZL 94190708提供的液相色谱法虽制品纯度高，但处理量小、费时、费力，主要用于蛋白质的定量分析、检测和精制。
提取血红蛋白用萃取法，主要有双水相萃取和反胶团萃取，其中用两种亲水性聚合物或聚合物盐混合后形成的双水相萃取体系研究，已成为实验室或工业规模分离蛋白质等生物材料的适用技术，但Purification ofRecombinant Protein A by Aqueous Two-phase Extraction Intergratedwith Affinity Precipitation.Biotechnol.Bioeng.(1992，40：1381-1387)提供的聚合物/盐双水相萃取体系，该体系相分离操作要用分液漏斗，操作繁琐；而在聚合物/聚合物双水相萃取体系中，由于两相密度相近，相系粘度很大，导致相分离困难，且由于高聚物的性质，生物大分子在两相界面存在较强的吸附及乳化作用，导致蛋白质的两相滞留。《生物工程学报》，1997，13(4)：430-432.介绍的反胶团萃取技术在1998年孙彦编著的《生物分离工程》，北京化学工业出版社出版的一书谈到此法必须添加的表面活性剂与蛋白质在静电引力作用下极易形成复合物，沉淀于相界面，引起蛋白质的变性。
发明内容
本发明的目的是克服了双水相技术萃取血红蛋白相分离困难和反胶团技术萃取血红蛋白引起蛋白质的变性的缺陷，提供一种液-固亲和萃取体系分离纯化血红蛋白的方法，所需设备简单，分离纯化成本低，速度快，成相容易，成相后直接倾出液相即可使液固两相分离，无须双水相萃取中的离心等操作，不用有机溶剂，无毒性，成相聚合物及盐对蛋白质有稳定和保护作用，萃取分离选择性好，萃取容量大，是易于规模放大分离纯化血红蛋白的新技术。
本发明是这样实现的：在具塞比色管中，使体系中硫酸铵或磷酸钾浓度达到0.5-3.0mol·L-1，无机盐的浓度与聚合物的种类、浓度有相关性，pH控制在3.0～9.0，体系成相聚合物吐温80溶液浓度达到3～20％和体系聚乙二醇(PEG)8000或聚乙二醇(PEG)6000与亚胺基二乙酸(IDA)组成的修饰物溶液浓度达到0.2～2.0g·mL-1，然后加入血样，置于康氏电动震荡机上平置振荡2-10分钟，优选4-6分钟，取下倒置10-20分钟，优选12-16分钟，体系分成聚合物固相和盐水液相，血红蛋白被萃入固相；
上述固相加二次水溶解后，使体系乙二胺四乙酸浓度为0.5×10-3-2.0×10-3mol·L-1，并使硫酸铵或磷酸钾浓度达到0.5-3.0mol·L-1，置于康氏电动震荡机上平置振荡2-10分钟，优选4-6分钟，取下倒置10-20分钟，优选12-16分钟，体系重新分成聚合物固相和盐水液相，血红蛋白被反萃入液相；
上述萃入液相的血红蛋白于透析袋中进行透析，小分子的盐、少量聚合物可以通过透析袋，而留在透析袋中血红蛋白大分子，其纯度可达到99％以上。
成相聚合物为吐温80，成相无机盐有硫酸铵、磷酸钾，修饰物有聚乙二醇8000与亚胺基二乙酸(IDA)修饰物、聚乙二醇6000与亚胺基二乙酸(IDA)修饰物。
本发明用PEG修饰物混合聚合物-盐-水液-固萃取体系对猪血、牛血、人血中血红蛋白进行萃取，经过一次萃取，一次反萃和透析即可得到纯度大于99％的血红蛋白的水溶液。在此体系中，牛血红蛋白、人血红蛋白、猪血红蛋白混合分配系数K(K＝固相中血红蛋白浓度∶液相中血红蛋白浓度)均达到1000；一次萃取固相收得率R(R＝萃取分相后固相血红蛋白的量∶加入体系的血红蛋白的总量)大于99％[Wuenschell G.E.等人在论文Aqueous Two-phase Metal Affinity Extraction of Heme Proteins.(Bioprocess Eng.1990，5：1992-02)中的双水相体系萃取血红蛋白分配系数为14，猪血红蛋白分配系数为6]，一次反萃取率可达75％(刘景林等人在《高等学校化学学报》，1997，20：1122一文中的反胶团体系其第8次反萃取率为73.2％)，经高效液相色谱、盘状凝胶电泳、光度法验证纯度不低于美国sigma公司所购试剂。
具体实施方式
实施例1：用聚乙二醇6000修饰物混合吐温80-硫酸铵液-固萃取体系直接对猪血液中血红蛋白进行分离纯化。
具体实施方法：在具塞比色管中，加入4.0mL浓度为4.5mol·L-1硫酸铵，调节pH至6.5，加入2.0mL浓度为30％聚合物吐温80溶液和1.0mL浓度为5.0g·mL-1聚乙二醇6000修饰物溶液，然后加入2mL猪血样，用二次水定容至10.0mL，置于康氏电动震荡机上平置振荡5分钟，取下倒置15分钟，体系分成聚合物固相和盐水液相，血红蛋白被萃入固相；
上述固相加二次水溶解后，加入1.0mL浓度为10.0mmol·L-1乙二胺四乙酸和4.0mL浓度为4.5mol·L-1硫酸铵，置于康氏电动震荡机上平置振荡4分钟，取下倒置15分钟，体系再次分成聚合物固相和盐水液相，血红蛋白被反萃入液相；
上述萃入液相的血红蛋白于透析袋中进行透析，小分子的盐、少量聚合物可以通过透析袋，而留在透析袋中血红蛋白大分子，其纯度可达到99％以上。
将上述所得猪血红蛋白用光度法测定，其结果如表1所示。一次正萃收率猪血红蛋白(PHb)达99.93％，一次反萃取率PHb达69.99％。
表1：聚乙二醇6000修饰物混合吐温80-硫酸铵液-固萃取体系从猪血液样品中分离纯化血红蛋白的结果
| 试验次数 | 血样总蛋含量(mg) | 血样Hb含量(mg) | 正萃后固相Hb量(mg) | 反萃后盐水相蛋白总量(mg) | 反萃后盐水相Hb量(mg) | 正萃Hb收得率(％) | 反萃取率(％) | 反萃后Hb纯度(％) | 纯化倍数 |
| 1 | 6.754 | 5.842 | 5.837 | 4.117 | 4.086 | ||||
| 2 | 5.840 | 4.122 | 4.088 | ||||||
| 3 | 5.835 | 4.119 | 4.085 | ||||||
| 4 | 5.839 | 4.119 | 4.087 | ||||||
| 5 | 5.838 | 4.120 | 4.086 | ||||||
| 平均值 | 5.838 | 4.120 | 4.086 | 99.93 | 69.99 | 99.17 | 19.28 |
实施例2：用聚乙二醇6000修饰物混合吐温80-硫酸铵液-固萃取体系直接分别对牛血液中血红蛋白进行分离纯化。
具体实施方法与实施例1相同。将上述所得牛血红蛋白用光度法测定，其结果如表2所示。一次正萃收率牛血红蛋白(BHb)达99.91％，一次反萃取率PHb达70.00％。
表2：聚乙二醇6000修饰物混合吐温80-硫酸铵液-固萃取体系从牛血液样品中分离纯化血红蛋白的结果
| 试验次数 | 血样总蛋含量(mg) | 血样Hb含量(mg) | 正萃后固相Hb量(mg) | 反萃后盐水相蛋白总量(mg) | 反萃后盐水相Hb量(mg) | 正萃Hb收得率(％) | 反萃取率(％) | 反萃后Hb纯度(％) | 纯化倍数 |
| 1 | 6.734 | 5.792 | 5.784 | 4.084 | 4.049 | ||||
| 2 | 5.786 | 4.085 | 4.051 | ||||||
| 3 | 5.789 | 4.088 | 4.053 | ||||||
| 4 | 5.785 | 4.083 | 4.050 | ||||||
| 5 | 5.790 | 4.086 | 4.053 | ||||||
| 平均值 | 5.787 | 4.085 | 4.051 | 99.91 | 70.00 | 99.17 | 19.50 |
实施例3：用聚乙二醇6000修饰物混合吐温80-硫酸铵液-固萃取体系直接分别对人血液中血红蛋白进行分离纯化。
具体实施方法与实施例1相同。将上述所得人血红蛋白用光度法测定，其结果如表3所示。一次正萃收率人血红蛋白(HHb)达99.97％；一次反萃取率PHb达75.00％。
表3：聚乙二醇6000修饰物混合吐温80-硫酸铵液-固萃取体系从人血液样品中分离纯化血红蛋白的结果
| 试验次数 | 血样总蛋含量(mg) | 血样Hb含量(mg) | 正萃后固相Hb量(mg) | 反萃后盐水相蛋白总量(mg) | 反萃后盐水相Hb量(mg) | 正萃Hb收得率(％) | 反萃取率(％) | 反萃后Hb纯度(％) | 纯化倍数 |
| 1 | 6.713 | 5.742 | 5.740 | 4.342 | 4.305 | ||||
| 2 | 5.740 | 4.340 | 4.304 | ||||||
| 3 | 5.741 | 4.342 | 4.306 |
| 试验次数 | 血样总蛋含量(mg) | 血样Hb含量(mg) | 正萃后固相Hb量(mg) | 反萃后盐水相蛋白总量(mg) | 反萃后盐水相Hb量(mg) | 正萃Hb收得率(％) | 反萃取率(％) | 反萃后Hb纯度(％) | 纯化倍数 |
| 4 | 5.739 | 4.341 | 4.305 | ||||||
| 5 | 5.739 | 4.340 | 4.304 | ||||||
| 平均值 | 5.740 | 4.341 | 4.305 | 99.97 | 75.00 | 99.17 | 20.00 |
实施例4：用聚乙二醇8000修饰物混合吐温80-磷酸钾液-固萃取体系直接对猪血液中血红蛋白进行分离纯化。
具体实施方法：在具塞比色管中，加入4.0mL浓度为4.0mol·L-1磷酸钾溶液，酸度调至7.2，加入2.0mL浓度为30％聚合物吐温80溶液和1.0mL浓度为5.0g·mL-1PEG8000修饰物溶液，然后加入猪血样2.0mL，用二次水定容至10.0mL，置于康氏电动震荡机上平置振荡5分钟，取下倒置15分钟，体系分成聚合物固相和盐水液相，血红蛋白被萃入固相；固相加二次水溶解后，加入1.0mL浓度为10.0mmol·L-1乙二胺四乙酸和4.0mL浓度为4.0mol·L-1磷酸钾，置于康氏电动震荡机上平置振荡4分钟，取下倒置15分钟，体系再次分成聚合物固相和盐水液相，血红蛋白被反萃入液相；液相中的血红蛋白于透析袋中进行透析，小分子的盐、少量聚合物可以通过透析袋，而留在透析袋中血红蛋白大分子，其纯度可达到99％以上。
将上述所得猪血红蛋白用光度法测定，其结果如表4所示。一次正萃收率猪血红蛋白(PHb)达99.90％，一次反萃取率PHb达74.98％。
表4：聚乙二醇8000修饰物混合吐温80-磷酸钾液-固萃取体系从猪血液样品中分离纯化血红蛋白的结果
| 试验次数 | 血样总蛋含量(mg) | 血样Hb含量(mg) | 正萃后固相Hb量(mg) | 反萃后盐水相蛋白总量(mg) | 反萃后盐水相Hb量(mg) | 正萃Hb收得率(％) | 反萃取率(％) | 反萃后Hb纯度(％) | 纯化倍数 |
| 1 | 6.754 | 5.842 | 5.839 | 4.413 | 4.379 | ||||
| 2 | 5.840 | 4.412 | 4.378 | ||||||
| 3 | 5.831 | 4.407 | 4.373 |
| 试验次数 | 血样总蛋含量(mg) | 血样Hb含量(mg) | 正萃后固相Hb量(mg) | 反萃后盐水相蛋白总量(mg) | 反萃后盐水相Hb量(mg) | 正萃Hb收得率(％) | 反萃取率(％) | 反萃后Hb纯度(％) | 纯化倍数 |
| 4 | 5.836 | 4.411 | 4.377 | ||||||
| 5 | 5.835 | 4.409 | 4.375 | ||||||
| 平均值 | 5.836 | 4.410 | 4.376 | 99.90 | 74.98 | 99.23 | 20.09 |
实施例5：用聚乙二醇8000修饰物混合吐温80-磷酸钾液-固萃取体系直接对牛血液中血红蛋白进行分离纯化。
具体实施方法与实施例4相同。将上述所得牛血红蛋白用光度法测定，其结果如表5所示。一次正萃收率牛血红蛋白(HHb)达99.96％；一次反萃取率PHb达75.01％。
表5：聚乙二醇8000修饰物混合吐温80-磷酸钾液-固萃取体系从牛血液样品中分离纯化血红蛋白的结果
| 试验次数 | 血样总蛋含量(mg) | 血样Hb含量(mg) | 正萃后固相Hb量(mg) | 反萃后盐水相蛋白总量(mg) | 反萃后盐水相Hb量(mg) | 正萃Hb收得率(％) | 反萃取率(％) | 反萃后Hb纯度(％) | 纯化倍数 |
| 1 | 6.734 | 5.792 | 5.784 | 4.377 | 4.342 | ||||
| 2 | 5.791 | 4.377 | 4.343 | ||||||
| 3 | 5.791 | 4.379 | 4.344 | ||||||
| 4 | 5.790 | 4.378 | 4.343 | ||||||
| 5 | 5.787 | 4.375 | 4.340 |
| 试验次数 | 血样总蛋含量(mg) | 血样Hb含量(mg) | 正萃后固相Hb量(mg) | 反萃后盐水相蛋白总量(mg) | 反萃后盐水相Hb量(mg) | 正萃Hb收得率(％) | 反萃取率(％) | 反萃后Hb纯度(％) | 纯化倍数 |
| 平均值 | 5.790 | 4.377 | 4.342 | 99.96 | 75.01 | 99.20 | 20.18 |
实施例6：用聚乙二醇8000修饰物混合吐温80-磷酸钾液-固萃取体系直接对人血液中血红蛋白进行分离纯化。
具体实施方法与实施例4相同。将上述所得人血红蛋白用光度法测定，其结果如表6所示。一次正萃收率牛血红蛋白(HHb)达99.97％；一次反萃取率PHb达75.01％。
表6：聚乙二醇8000修饰物混合吐温80-磷酸钾液-固萃取体系从人血液样品中分离纯化血红蛋白的结果
| 试验次数 | 血样总蛋含量(mg) | 血样Hb含量(mg) | 正萃后固相Hb量(mg) | 反萃后盐水相蛋白总量(mg) | 反萃后盐水相Hb量(mg) | 正萃Hb收得率(％) | 反萃取率(％) | 反萃后Hb纯度(％) | 纯化倍数 |
| 1 | 6.713 | 5.742 | 5.740 | 4.342 | 4.305 | ||||
| 2 | 5.740 | 4.340 | 4.304 | ||||||
| 3 | 5.741 | 4.342 | 4.306 | ||||||
| 4 | 5.739 | 4.341 | 4.305 | ||||||
| 5 | 5.739 | 4.340 | 4.304 | ||||||
| 平均值 | 5.740 | 4.341 | 4.305 | 99.97 | 75.00 | 99.17 | 20.39 |
Claims (6)
1、一种液-固萃取体系分离纯化血红蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)、在具塞比色管中，加入硫酸铵或磷酸钾，pH控制在3.0～9.0，加入成相聚合物吐温80溶液和聚乙二醇(PEG)8000或聚乙二醇(PEG)6000与亚胺基二乙酸(IDA)组成的修饰物溶液，然后加入血样，用二次水定容，置于康氏电动震荡机上，平置振荡2-10分钟，取下倒置10-20分钟，体系分成聚合物固相和盐水液相，血红蛋白被萃入固相；
(2)、在上述固相加二次水溶解后，加入乙二胺四乙酸和硫酸铵或磷酸钾，置于康氏电动震荡机上，平置振荡2-10分钟，取下倒置10-20分钟，体系分成聚合物固相和盐水液相，血红蛋白被反萃入液相；
(3)、将上述萃入液相的血红蛋白置于透析袋中进行透析，小分子的盐、少量聚合物可以通过透析袋，而留在透析袋中血红蛋白大分子，其纯度可达到99％以上。
2、根据权利要求1所述分离纯化血红蛋白的方法，其特征在于所述液-固萃取体系中硫酸铵或磷酸钾的浓度为0.5-3.0mo1·L-1。
3、根据权利要求1所述分离纯化血红蛋白的方法，其特征在于所述液-固萃取体系中成相聚合物吐温80溶液的浓度为3～20％。
4、根据权利要求1所述分离纯化血红蛋白的方法，其特征在于所述液-固萃取体系中修饰物溶液的浓度为0.2～2.0g·mL-1。
5、根据权利要求1所述分离纯化血红蛋白的方法，其特征在于所述液-固萃取体系中乙二胺四乙酸的浓度为0.5×10-3-2.0×10-3mol·L-1。
6、根据权利要求1所述分离纯化血红蛋白的方法，其特征在于将具塞比色管置于康氏电动震荡机上，平置振荡4-6分钟，取下倒置12-16分钟。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |