CN101705269A - 一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法 - Google Patents
一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101705269A CN101705269A CN200910035990A CN200910035990A CN101705269A CN 101705269 A CN101705269 A CN 101705269A CN 200910035990 A CN200910035990 A CN 200910035990A CN 200910035990 A CN200910035990 A CN 200910035990A CN 101705269 A CN101705269 A CN 101705269A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- deoxythymidine
- triphosphate
- kinase
- synthesizing
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法，具体步骤为：脱氧胸苷酸激酶的克隆，表达和纯化；丙酮酸激酶的克隆，表达和纯化；用激动剂脱氧腺苷三磷酸，烯醇式丙酮酸和游离的脱氧胸苷酸激酶、丙酮酸激酶从脱氧胸苷单磷酸合成脱氧胸苷三磷酸；包括以脱氧胸苷单磷酸为原料进行的脱氧胸苷三磷酸的生物催化合成；该过程由两步耦合的磷酸化反应经生成中间产物脱氧胸苷二磷酸实现。本发明的优点：表达量高，纯化简单，生产成本较低；产物的分离和纯化将更加简单；可溶解很多的溶质，从而可以满足不同的使用要求。
Description
【技术领域】
本发明涉及脱氧胸苷三磷酸技术领域，具体地说，是一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法。
【背景技术】
DNA分子是由四种脱氧核糖核苷酸分子结合成的两条互补多聚核苷酸链。合成这些多聚核苷酸的前体是四种脱氧核苷三磷酸，脱氧胸苷三磷酸作为四种原料之一参与核酸分子的体内或体外扩增。随着生物技术工业的发展特别是DNA生物合成和聚合酶链式反应的推广，市场上对DNA扩增所需要的脱氧核苷三磷酸的需求量将会明显地持续升高。另外，由于脱氧胸苷三磷酸在抗病毒抗肿瘤，治疗心血管疾病等方面应用的推广，同样也会对包括本发明所阐述的产品-脱氧胸苷三磷酸的需求量的提高起到促进作用。
目前，商业化的脱氧胸苷三磷酸产品主要是由化学合成法实现的(Chamberset al.，1957；Smith and Khorana，1958)；其中，脱氧胸苷三磷酸的合成方法包括使用脱氧胸苷单磷酸的三正丁基铵盐与正磷酸在二环己基碳二亚胺的存在下，在吡啶或二甲基甲酰胺水溶液中进行反应。脱氧胸苷单磷酸的转化率为65％；而且在转化过程中不可避免地会生成脱氧胸苷二磷酸和脱氧胸苷多磷酸等主要副产物。因此在后续的分离中，需要色谱分离方法实现脱氧胸苷单磷酸与脱氧胸苷二磷酸和脱氧胸苷三磷酸的分离。提纯过程还需要除去未反应的二环己基碳二亚胺(DCC)和正磷酸、副产物脱氧胸苷单磷酸、二磷酸和多磷酸以及还原后的DCC、吡啶或DMF溶剂。在化学转化法所用溶剂属于美国环境保护署列出的有毒化学品。
中国专利申请号00100844中公开了一种通过酶催化和化学反应联合生产脱氧核苷三磷酸的方法；该方法以天然DNA为起始原料，DNA经酶解后，脱氧核苷单磷酸经“脱氧核苷单磷酸酶的催化”反应和相应的化学反应后转化为包括脱氧胸苷三磷酸产品在内的四种脱氧核苷三磷酸；在该方法中，发明者没有对这种“脱氧核苷单磷酸酶”进行具体描述；这种酶的名字也没有被NC-IUBMB(国际生物化学和分子生物学联合命名委员会http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/)酶命名法收录和接受，其中的化学法就是上文中所提到的方法。
中国专利申请号02134612公开了一种三磷酸脱氧核苷的生产方法；该方法是将核苷酸还原酶EC 1.17.4.2和要转化的底物腺苷三磷酸或鸟苷三磷酸或胸苷三磷酸或胸苷三磷酸加入到反应系统中，使酶的浓度达0.01～0.16单位/ml，使底物浓度达到1～60mmol/L，并加入以维生素B12为基础的辅酶形式的辅酶，以及含巯基还原剂或NADH或蛋白质还原剂，以缓冲液控制溶液pH6～9，于25℃～40℃反应；在该过程中必须使用维生素B-12作为辅酶，以NADH或蛋白作为还原剂。工艺路线与本专利不同。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法.
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法，其特征在于，具体步骤为：
(a)脱氧胸苷酸激酶的克隆，表达和纯化；
脱氧胸苷酸激酶的克隆是指：包含了酿酒酵母的培养，基因组DNA的提取，利用PCR技术从中获得包含起始密码子和终止密码子在内的完整的脱氧胸苷单磷酸激酶的基因CDC8，然后利用粘性末端连接法，进行重组质粒pET-17b/CDC8的成功构建，以及该质粒顺利转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并成功地进行高效表达；
脱氧胸苷酸激酶的表达和纯化是指：利用2～3mg/ml的细菌溶菌酶加表面活性剂(如0.5％Tween20和0.5％的P450)或超声波破碎细胞，然后使用蛋白分子量截留为3,500～14,000Daltons的透析膜直接透析获得粗酶，或者通过色谱柱进行进一步的纯化；
(b)丙酮酸激酶的克隆，表达和纯化；
丙酮酸激酶的克隆是指：自枯草杆菌中获得丙酮酸激酶的基因BYK，重组质粒pET-28a/byk的成功构建，以及该质粒顺利转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并成功地进行高效表达；
丙酮酸激酶的表达和纯化是指：利用溶菌酶加表面活性剂或超声波破碎细胞，使用蛋白分子截留量在3,500～14,000Daltons的透析膜直接透析获得粗酶，或者通过色谱柱进行进一步的纯化；
(c)用激动剂脱氧腺苷三磷酸，烯醇式丙酮酸和游离的脱氧胸苷酸激酶、丙酮酸激酶从脱氧胸苷单磷酸合成脱氧胸苷三磷酸；
本步骤包括以脱氧胸苷单磷酸为原料进行的脱氧胸苷三磷酸的生物催化合成；该过程由两步耦合的磷酸化反应经生成中间产物脱氧胸苷二磷酸实现，其中用到原料为可溶性的脱氧胸苷单磷酸激酶和丙酮酸激酶，如附图1所示，在第一步中，使用脱氧腺苷三磷酸为磷酸供体，而在第二步反应中，磷酸供体为磷酸烯醇式丙酮酸；
第一步反应在可溶性脱氧胸苷单磷酸激酶的作用下一摩尔的脱氧胸苷单磷酸和一摩尔的脱氧腺苷三磷酸转变为一摩尔的脱氧胸苷二磷酸和脱氧腺苷二磷酸；第二步反应中，一摩尔的脱氧胸苷二磷酸和脱氧腺苷二磷酸在可溶性丙酮酸激酶的作用下，伴随着磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的转化，脱氧胸苷二磷酸和脱氧腺苷二磷酸同时被转化为脱氧胸苷三磷酸和脱氧腺苷三磷酸，生成的脱氧腺苷三磷酸产物又可以重新作为第一步反应的磷酸供体再次参与反应；
另外，在两步反应中，总计一摩尔的脱氧胸苷单磷酸和一摩尔的脱氧腺苷三磷酸以及两摩尔的磷酸烯醇式丙酮酸被转化为一摩尔的脱氧胸苷三磷酸和一摩尔的脱氧腺苷三磷酸以及两摩尔的丙酮酸，而生成的脱氧腺苷三磷酸可以再次被用做第一步反应所需要的磷酸供体，因此本反应体系的第一步反应中只需要添加极为微量的脱氧腺苷三磷酸即可满足反应所需。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
(1)目前，传统的化学法既有可能破坏环境，又因为反应过程、纯化过程的低产率而不经济。虽然产品相同，但本发明描述的酶促工艺与化学法工艺截然不同：过程简单，转化率高，环境友好，避免使用有毒和有腐蚀性的物质，如DCC、吡啶、DMF等。
(2)本发明采用两种很容易确认的酶，脱氧胸苷单磷酸激酶(EC 2.7.4.9)和丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)，而且这两种酶制剂可以利用工程菌自行生产，表达量高，纯化简单，生产成本较低。使用过程中，可根据需要对酶用量、酶纯度等进行实时控制和调节。
(3)本发明使用两种工程菌生产的激酶，包括脱氧胸苷单磷酸激酶(EC2.7.4.9)和丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)，这两种酶的催化反应不需要额外地添加辅酶。而现有技术使用一种酶核苷酸还原酶(EC1.17.4.2)，需要维生素B12作为酶促反应的辅酶，
(4)本发明不使用还原剂。现有所述的方法必须使用含巯基还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)或二硫赤藓糖醇(DTE)或二氢硫辛酸或巯基乙醇，本发明中不需要添加任何还原剂，成份更加简洁；
(5)本发明所建立的催化体系中，调节两种酶制剂的用量可以保持反应流的正向进行，使脱氧胸苷单磷酸底物完全转化为脱氧胸苷三磷酸产物，产物的分离和纯化将更加简单；
(6)本发明的原材料为脱氧胸苷单磷酸这一单一化合物；
(7)本发明的终产物是单独封装的脱氧胸苷三磷酸产物，然后可以按照需求进行分装或者和其它三种脱氧核苷三磷酸产品进行混合；
(8)本发明中反应在水相中进行，原料溶解度大，可以获得高浓度的产品。
【附图说明】
图1脱氧胸苷单磷酸激酶和丙酮酸激酶催化下由脱氧胸苷单磷酸生物合成脱氧胸苷三磷酸；
图2HPLC检测14小时后脱氧胸苷单磷酸向脱氧胸苷三磷酸的全转化图。
【具体实施方式】
以下提供本发明一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法的具体实施方式。
实施例1
(a)脱氧胸苷单磷酸激酶的克隆，表达和纯化
利用PCR技术，以酿酒酵母基因组DNA为模板，扩增获得包含起始密码子和终止密码子在内的完整的脱氧胸苷单磷酸激酶的基因GUK1，然后利用粘性末端连接法，插入pET-17b的多克隆位点内，构建重组质粒pET-17b/GUK1，并将该质粒顺利转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，按照下述程序进行高效表达；
脱氧胸苷单磷酸激酶制剂制备的基本培养基组成为0.5％的酵母提取物，1.0％蛋白胨和1.0％的氯化钠，其余的液体为水，用5mol/L的NaOH溶液调节培养基的pH值至7.0，121℃保温20分钟灭菌.灭菌后以1％接种量接种，37℃条件下，充分搅拌培养至OD600为0.5～0.6，加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，37℃下搅拌诱导4小时.在4℃下，10000g离心5min收集细胞，用pH值为5～9的缓冲液洗涤，缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸，葡萄糖和乙二胺四乙酸.离心收集洗涤后的细胞，用pH值为5～9的裂解缓冲液裂解细胞，裂解液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸，氯化钾，乙二胺四乙酸和溶菌酶，吐温-20和P-40以及PMSF，离心后获得提取液，该提取液可以不经纯化直接使用，或者使用蛋白分子截留量在3,500～14,000Daltons的透析膜直接透析获得粗酶，还可以通过色谱柱进行进一步的纯化；
表1由BL21(DE3)细胞产生的脱氧胞苷单磷酸激酶的活性
| 样品 | TK浓度(Bradford法) | 反应速度(mM dTTP/min) | 总蛋白片段(wt.％) |
| 透析液 | 14.62 | 0.3988 | |
| 葡聚糖凝胶G-100#1片段 | 0.92 | 0.2775 | 58.64 |
| 葡聚糖凝胶G-100#2片段 | 0.63 | 0.1423 | 30.08 |
| 其它片段组合 | 11.38 |
(b)丙酮酸激酶的克隆，表达和纯化
利用PCR技术，以枯草杆菌基因组DNA为模板，扩增获得包含起始密码子和终止密码子在内完整的丙酮酸激酶的基因BYK，然后利用粘性末端连接法，插入pET-28a的多克隆位点内，构建重组质粒pET-28a/byk1，并将该质粒顺利转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，按照下述程序进行高效表达；
丙酮酸激酶制剂制备的基本培养基组成为0.5％的酵母提取物，1.0％蛋白胨和1.0％的氯化钠，其余的液体为水，用5mol/l的NaOH调节培养基pH值至7.0，121℃保温20分钟灭菌。灭菌后以1％接种量接种，37℃条件下，充分搅拌培养至OD600为0.6～0.9，加入终浓度为0.35mM的诱导剂IPTG，25℃下搅拌诱导6小时。在4℃下，10000g离心5min收集细胞，用pH值为5～9的缓冲液洗涤，缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸，葡萄糖和乙二胺四乙酸。离心收集洗涤后的细胞，用pH值为5～9的裂解缓冲液裂解细胞，裂解液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸，氯化钾，乙二胺四乙酸和溶菌酶，吐温-20和P-40以及PMSF，离心后获得提取液，该提取液可以不经纯化直接使用，或者使用蛋白分子截留量在3,500～14,000Daltons的透析膜直接透析获得粗酶，还可以通过色谱柱进行进一步的纯化；
表2由BL21(DE3)细胞产生的丙酮酸激酶的活性
(c)在可溶性脱氧胸苷单磷酸激酶和丙酮酸激酶的作用下将脱氧胸苷单磷酸完全转化为脱氧胸苷三磷酸
生产脱氧胸苷三磷酸的过程在30℃下进行，缓冲液由pH8.0的50mM Tris，100mM的氯化钾和50mM的氯化镁组成.可溶性脱氧胸苷单磷酸激酶活力为4.6U/ml，可溶性丙酮酸激酶的活力为14.5U/ml.脱氧胸苷单磷酸浓度为25mM，磷酸烯醇式丙酮酸的浓度为50mM，脱氧腺苷三磷酸浓度为1.0mM.脱氧胸苷单磷酸激酶和丙酮酸激酶皆由自主克隆相应基因的工程菌提取.反应过程pH的控制通过滴加5mol/l的NaOH溶液实现，脱氧胸苷三磷酸的生成速率为0.0283mM/min，在大约14小时以后96％左右的脱氧胸苷单磷酸基本可以完全转化为脱氧胸苷三磷酸，如附图2所示.需要特别说明的是本反应中酶的用量、底物浓度和其它试剂的用量以及反应器的大小可根据过程要求，如产量和生产率而改变.
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法，其特征在于，具体步骤为：
(a)脱氧胸苷酸激酶的克隆，表达和纯化；
(b)丙酮酸激酶的克隆，表达和纯化；
(c)用激动剂脱氧腺苷三磷酸，磷酸烯醇式丙酮酸和游离的脱氧胸苷酸激酶、丙酮酸激酶从脱氧胸苷单磷酸合成脱氧胸苷三磷酸；包括以脱氧胸苷单磷酸为原料进行的脱氧胸苷三磷酸的生物催化合成；该过程由两步耦合的磷酸化反应经生成中间产物脱氧胸苷二磷酸实现，其中用到原料为可溶性的脱氧胸苷单磷酸激酶和丙酮酸激酶，在第一步中，使用脱氧腺苷三磷酸为磷酸供体，而在第二步反应中，磷酸供体为磷酸烯醇式丙酮酸。
2.如权利要求1所述的一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(a)中，所述的脱氧胸苷酸激酶的克隆是指：包含了酿酒酵母的培养，基因组DNA的提取，利用PCR技术从中获得包含起始密码子和终止密码子在内的完整的脱氧胸苷单磷酸激酶的基因CDC8，然后利用粘性末端连接法，进行重组质粒pET-17b/CDC8的成功构建，以及该质粒顺利转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并成功地进行高效表达。
3.如权利要求1所述的一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(a)中，所述的脱氧胸苷酸激酶的表达和纯化是指：利用2～3mg/ml的细菌溶菌酶加表面活性剂或超声波破碎细胞，然后使用蛋白分子量截留为3,500～14,000 Daltons的透析膜直接透析获得粗酶，或者通过色谱柱进行进一步的纯化。
4.如权利要求1所述的一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(b)中，所述的丙酮酸激酶的克隆是指：自枯草杆菌中获得丙酮酸激酶的基因BYK，重组质粒pET-28a/byk的成功构建，以及该质粒顺利转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并成功地进行高效表达。
5.如权利要求1所述的一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(b)中，所述的丙酮酸激酶的表达和纯化是指：利用溶菌酶加表面活性剂或超声波破碎细胞，使用蛋白分子截留量在3,500～14,000 Daltons的透析膜直接透析获得粗酶，或者通过色谱柱进行进一步的纯化。
6.如权利要求1所述的一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(c)中，所述的第一步反应是指：在可溶性脱氧胸苷单磷酸激酶的作用下一摩尔的脱氧胸苷单磷酸和一摩尔的脱氧腺苷三磷酸转变为一摩尔的脱氧胸苷二磷酸和一摩尔的腺苷二磷酸。
7.如权利要求1所述的一种通过生物技术合成脱氧鸟苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(c)中，所述的第二步反应是指：一摩尔的脱氧胸苷二磷酸和一摩尔的脱氧腺苷二磷酸在可溶性丙酮酸激酶的作用下，伴随着磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的转化，脱氧胸苷二磷酸转化为脱氧胸苷三磷酸同时脱氧腺苷二磷酸也同时被转化为脱氧腺苷三磷酸，此时生成的脱氧腺苷三磷酸又可以再次作为第一步反应的磷酸供体，参与第一步反应。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910035990A CN101705269A (zh) | 2009-10-15 | 2009-10-15 | 一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910035990A CN101705269A (zh) | 2009-10-15 | 2009-10-15 | 一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101705269A true CN101705269A (zh) | 2010-05-12 |
Family
ID=42375524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200910035990A Pending CN101705269A (zh) | 2009-10-15 | 2009-10-15 | 一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101705269A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105616438A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-06-01 | 端木鲁健 | 齐多夫定用于制备抗高血压药物的应用 |
| CN113122593A (zh) * | 2019-12-31 | 2021-07-16 | 安徽古特生物科技有限公司 | 一种利用多聚磷酸盐制备核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸的方法 |
-
2009
- 2009-10-15 CN CN200910035990A patent/CN101705269A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105616438A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-06-01 | 端木鲁健 | 齐多夫定用于制备抗高血压药物的应用 |
| CN113122593A (zh) * | 2019-12-31 | 2021-07-16 | 安徽古特生物科技有限公司 | 一种利用多聚磷酸盐制备核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ravella et al. | Extracellular polysaccharide (EPS) production by a novel strain of yeast-like fungus Aureobasidium pullulans | |
| WO2008078614A1 (ja) | ラクト－ｎ－ビオースｉ及びガラクト－ｎ－ビオースの製造方法 | |
| CN113684164B (zh) | 一种高产乳酰-n-新四糖的微生物的构建方法及应用 | |
| CN107384991B (zh) | 一种脂肪酶催化在线合成5′-o-乙烯己二酰尿苷的方法 | |
| Guellout et al. | Study of the dark fermentative hydrogen production using modified ADM1 models | |
| Alissandratos et al. | ATP recycling with cell lysate for enzyme-catalyzed chemical synthesis, protein expression and PCR | |
| CN104561195A (zh) | 一种尿苷二磷酸葡萄糖的制备方法 | |
| CN104371966A (zh) | 一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN108018252A (zh) | 一种中间体2’-脱氧鸟苷的制备方法 | |
| CN107746856A (zh) | 生产l‑稀少糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法与应用 | |
| CN101768617B (zh) | 全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的方法 | |
| CN105255934B (zh) | 一种高效联产α-氨基丁酸及葡萄糖酸的策略 | |
| CN110885812A (zh) | 一种酶法制备尿苷酸的方法 | |
| CN104862326B (zh) | 一种绿僵菌氧甲基转移酶及其应用 | |
| CN101705269A (zh) | 一种通过生物技术合成脱氧胸苷三磷酸的方法 | |
| CN104726435B (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶突变体、其重组表达质粒及转化的工程菌株 | |
| CN104328148A (zh) | 酶法制备(3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯 | |
| CN101705270A (zh) | 一种通过生物技术合成脱氧胞苷三磷酸的方法 | |
| CN106947772A (zh) | 一种羰基还原酶突变体及其在手性醇制备中的应用 | |
| CN106244569A (zh) | 一种酯酶EstC10及其编码基因和应用 | |
| CN102120999A (zh) | 利用基因工程菌株耦合发酵合成人乳岩藻糖基化寡糖的方法 | |
| CN101705271A (zh) | 一种通过生物技术合成脱氧鸟苷三磷酸的方法 | |
| CN101705272A (zh) | 一种通过生物技术合成脱氧腺苷三磷酸的方法 | |
| CN106520856A (zh) | (s)‑n‑叔丁氧羰基‑3‑羟基哌啶的酶催化制备方法 | |
| CN103865951B (zh) | 酿酒酵母表达载体及其构建和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20100512 |