CN105255934B - 一种高效联产α-氨基丁酸及葡萄糖酸的策略 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种串联葡萄糖脱氢酶及L‑氨基酸脱氢酶重组大肠杆菌用于联产α‑氨基丁酸和葡萄糖酸的方法。将葡萄糖脱氢酶基因与L‑氨基酸脱氢酶基因构建重组共表达载体并将其转化至基因工程菌大肠杆菌内。同时构建好表达L‑苏氨酸脱氨酶的重组大肠杆菌。高效共表达葡萄糖脱氢酶及L‑氨基酸脱氢酶于大肠杆菌中可以促进辅因子在菌体胞内的循环，不需要添加任何外源辅因子，利用该辅因子循环再生系统可以利用廉价底物L‑苏氨酸及葡萄糖联产高附加值的α‑氨基丁酸和葡萄糖酸，该转化过程简单快捷，成本低廉。在5L发酵罐中该方法所得的α‑氨基丁酸和葡萄糖酸产量分别可达102.8g/L及196.8g/L，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种构建葡萄糖脱氢酶与L-氨基酸脱氢酶串联到质粒上并在大肠杆菌中共表达，利用该重组大肠杆菌进行全细胞转化高效制备α-氨基丁酸和葡萄糖酸盐的方法。
背景技术
α-氨基丁酸是一种可以抑制人体神经信息传递的非天然氨基酸，具有加强葡萄糖磷酸酯酶的活性，促进脑细胞代谢的作用。α-氨基丁酸作为一种重要的化工原料和医药中间体如抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦的合成前体，具有广阔的应用市场。α-氨基丁酸主要通过化学合成法、酶拆分法及酶转化法来制备，在这三种方法之中，微生物酶转化法具有特异性较强，条件温和，对环境友好等优点。微生物酶转化法制备α-氨基丁酸主要是通过利用L-氨基酸脱氢酶对酮丁酸进行转氨催化作用完成，这之中需要辅因子NADH的参与，而辅因子NADH价格昂贵，显然不适用于工业生产中。通过基因工程手段可以在细胞中构建辅酶偶联再生系统，Degussa公司首次利用甲酸脱氢酶提供辅因子NADH的再生并且将其应用到L-叔亮氨酸的制备中，大大提高了产物的转化率。
葡萄糖酸是化工、医药及食品等产品的重要中间体，可被用来生产葡萄糖酸的衍生物如与钠、钙、锌、亚铁等金属氧化物合成制得的葡萄糖酸盐，也可直接作为一种产品，用在乳品工业上防止乳石沉淀，用在食品配方中作为酸味剂，也用来配制家用或工厂用清洗剂(替代多磷酸盐)、织物加工和金属加工的助剂、皮革矾鞣剂、去藻剂、金属除锈剂、建筑工业上混凝土的塑化剂、生物降解的螯合剂及二次采油的防沉淀剂等。葡萄糖酸的生产主要包括微生物发酵法、电解法和催化氧化法，其中微生物发酵法因其环境友好且能耗较低被广泛采用，但也存在发酵时间长，发酵条件控制严格等问题。
葡萄糖脱氢酶(Glucosedehydrogenase，缩写GlcDH)作为短链乙醇脱氢酶家族的一员，在辅因子NAD(P)+等存在时能够快速地催化葡萄糖转化为葡萄糖酸同时生成辅因子NAD(P)H。制备α-氨基丁酸过程所需的NADH可通过葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖生成葡萄糖酸来获取，α-氨基丁酸与葡萄糖酸的制备过程构建了一个NAD+与NADH的辅因子循环过程，可以达到高效联产α-氨基丁酸与葡萄糖酸的目的。
发明内容
本发明的主要研究内容：本发明在于将不同来源的葡萄糖脱氢酶基因与L-氨基酸脱氢酶 基因构建重组共表达载体pET-28a-Bsglcdh+Bcldh、pET-28a-Bsglcdh+Rjpdh及pET-duet-Ppglcdh+Bsadh、pET-duet-Ppglcdh+Scvdh，并将其转化E.coli BL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-Bsglcdh+Bcldh/BL21、pET-28a-Bsglcdh+Rjpdh/BL21、pET-duet-Ppglcdh+Bsadh/BL21、pET-duet-Ppglcdh+Scvdh/BL21。同时将L-苏氨酸脱氨酶(ltd)基因利用分子技术进行克隆，构建重组表达载体pET-28a-Ecltd和pET-28a-Seltd，并将其转化E.coli BL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-Ecltd/BL21及pET-28a-Ecltd/BL21。在不添加任何外源辅因子的条件下，利用全细胞转化法对廉价底物L-苏氨酸及葡萄糖进行转化高效联产α-氨基丁酸和葡萄糖酸，为α-氨基丁酸及葡萄糖酸的应用提供了一种有效的策略。
本发明的技术方案：
1.引物的设计
根据不同来源的苏氨酸脱氨酶的基因序列设计引物。
PEcltdF：5’-ACCGGGATCCATGGCTGACTCGCAACCCCT-3’(BamH I)
PEcltdR：5’-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAAAAAGAACCTG-3’(Hind III)
PSeltdF：5’-ACCGGGATCCATGGCGGAATCTCAACCTCT-3’(BamH I)
PSeltdR：5’-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAGAAAGAACC-3’(Hind III)
根据不同来源的葡萄糖脱氢酶的基因序列设计引物。
PBsglcdhF：5’-CGGGATCCATGTATCCGGATTTAAAAGG-3’(BamH I)
PBsglcdhR：5’-CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3’(Hind III)
P28aPromoterF：5’-ACATGCATGCCGATCCCGCGAAATTAATAC-3’(Sph I)
PBsglcdhRBglII：5’-GAAGATCTTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3’(Bgl II)
PPpglcdhF：5’-CGGGATCCATGAGCACTGAAGGTGCGAACC-3’(BamH I)
PPpglcdhR：5’-CCCAAGCTTTTACTCGGCTAATTTGTAAG-3’(Hind III)
根据不同来源的氨基酸脱氢酶的基因序列设计引物。
PBcldhF：5’-CGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3’(BamH I)
PBcldhR：5’-CGAGCTCTTAGCGACGGCTAATAATAT C-3’(Sac I)
PRjpdhF：5’-CGGGATCCATGACTCTCACCGCGGAAC-3’(BamH I)
PRjpdhR：5’-CGAGCTCCTACCTGGCTGCAGCGATG-3’(Sac I)
PBsadhF：5’-GGGGTACCATGATCATAGGGGTTCCT-3’(Kpn I)
PBsadhR：5’-CCGCTCGAGTTAAGCACCCGCCACAGATG-3’(Xho I)
PScvdhF：5’-GGAATTCCATATGGTGACCGACGTAAACGG-3’(Nde I)
PScvdhR：5’-CGAGCTCTCACGGCCGGGGACGGGCCT-3’(Xho I)
2.重组菌的构建
以染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对载体pET-28a或者pET-Duet和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入氨苄霉素或卡那霉素的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。
以pET-28a为葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶的共表达载体时，以连上pET-28a的葡萄糖酸脱氢酶质粒为模板，根据预先设计好的带启动子的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对已经连上L-氨基酸脱氢酶的载体pET-28a-ldh和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入卡那霉素的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。
以pET-Duet为葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶的共表达载体时。先以染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行L-氨基酸脱氢酶的基因PCR，采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对已经连上pET-Duet的葡萄糖脱氢酶质粒载体和纯化的PCR产物进行双酶切以，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入氨苄霉素的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。
3.重组菌全细胞转化联产α-氨基丁酸和葡萄糖酸
将获得的菌体用pH 7.5的50mM PB缓冲液洗涤两次，再加入pH 6.0-8.0的50mM PB缓冲液重悬，然后于30-42℃不同温度下加入底物L-苏氨酸及葡萄糖，以添加一定的化学试剂来控制pH在6.0-8.0之间，以HPLC检测底物α-氨基丁酸及葡萄糖酸的产率。
本发明中，所用的葡萄糖脱氢酶选自：但不限于，芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶、假单胞菌来源的葡萄糖脱氢酶。所用的L-氨基酸脱氨酶选自：但不限于，芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶、链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶、红球菌属来源的L-苯丙氨酸脱氢酶。所述L-苏氨酸脱氨酶选自：但不限于，大肠杆菌来源的L-苏氨酸脱氨酶、鼠伤寒沙门(氏)菌来源的L-苏氨酸脱氨酶。
本发明的有益效果：
α-氨基丁酸和葡萄糖酸是一种重要的化工原料和医药中间体，具有巨大的市场需求。本发明将葡萄糖脱氢酶与L-氨基酸脱氢酶串联在质粒上于E.coli BL21中的表达，构建了共表达葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶的工程菌株，同时结合构建单表达L-苏氨酸脱氢酶的重组E.coli BL21。利用这些重组菌对L-苏氨酸及葡萄糖进行全细胞转化为α-氨基丁酸和葡萄糖酸，转化过程快速高效，且不需要添加任何辅因子，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细的说明，以下实施例不对本发明产生限制。
实施例1：重组质粒pET-28a-Bcldh/pET-28a-Rjpdh的构建及转化
[1]以蜡样芽孢杆菌、红球菌的基因组DNA作为模板。
[2]根据枯草芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶及红球菌的L-苯丙氨酸脱氢酶基因序列以及pET-28a质粒上的酶切位点设计ldh基因引物。
PBcldhF：5’-CGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3’(BamH I)
PBcldhR：5’-CGAGCTCTTAGCGACGGCTAATAATATC-3’(Sac I)
PRjpdhF：5’-CGGGATCCATGACTCTCACCGCGGAAC-3’(BamH I)
PRjpdhR：5’-CGAGCTCCTACCTGGCTGCAGCGATG-3’(Sac I)
[3]利用蜡样芽孢杆菌及红球菌的DNA作为模板做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系： 模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×ExTaq Buffer 5μL，灭菌ddH2O 37μL，ExTaq DNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min 30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[4]构建重组质粒pMD18-T-Bcldh/pMD18-T-Rjpdh，导入感受态E.coliJM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T 0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coilJM109，转化方法参照实施例[5]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-Bcldh/pMD18-T-Rjpdh，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。
[5]将[4]中提取的质粒和表达载体pET-28a分别用BamH I和Hind III进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-Bcldh/pET-28a-Rjpdh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[5]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
实施例2：重组质粒pET-28a-Bsglcdh+Bcldh/pET-28a-Bsglcdh+Rjpdh的构建及转化
[1]以枯草芽孢杆菌基因组DNA作为模板。
[2]根据枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因序列以及pET-28a质粒上的酶切位点设计glcdh基因引物以及用于串联L-氨基酸脱氢酶的glcdh基因引物。
PBsglcdhF：5’-CGGGATCCATGTATCCGGATTTAAAAGG-3’(BamH I)
PBsglcdhR：5’-CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3’(Hind III)
P28aPromoterF：5’-ACATGCATGCCGATCCCGCGAAATTAATAC-3’(Sph I)
PBsglcdhRBglII：5’-GAAGATCTTTAACCGCGG CCTGCCTGG-3’(Bgl II)
[3]利用染色体DNA作为模板，做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×ExTaq Buffer 5μL，灭菌ddH2O 37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min 30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[4]构建重组质粒pMD18-T-Bsglcdh，导入感受态E.coliJM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T 0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coilJM109，转化方法参照实施例[5]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-Bsglcdh，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。
[5]将[4]中提取的质粒和表达载体pET-28a进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-glcdh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[5]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
[6]利用[5]提出的质粒pET-28a-Bsglcdh作为模板，做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×ExTaq Buffer 5μL，灭菌ddH2O 37μL，ExTaq DNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min 30s，72℃延伸，1min 30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[7]构建重组质粒pMD18-T-promoter+Bsglcdh，导入感受态E.coliJM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coilJM109，转化方法参照实施例[5]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-pBsglcdh，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。
[8]将[7]中提取的质粒和实施例1中已经连上L-氨基酸脱氢酶的表达载体pET-28a-Bcldh/pET-28a-Rjpdh分别用Sph I及Bgl II进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-Bsglcdh+Bcldh/pET-28a-Bsglcdh+Rjpdh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[5]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
实施例3：重组质粒pET-duet-Ppglcdh+Bsadh/pET-duet-Ppglcdh+Scvdh的构建及转化
[1]以恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌及天蓝色链霉菌的基因组DNA作为模板。
[2]根据恶臭假单胞菌的葡萄糖脱氢酶基因序列、枯草芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶基因序列、天蓝色链霉菌的缬氨酸脱氢酶基因序列以及pET-duet质粒上的酶切位点设计基因引物。
PPpglcdhF：5’-CGGGATCCATGAGCACTGAAGGTGCGAACC-3’(BamH I)
PPpglcdhR：5’-CCCAAGCTTTTACTCGGCTAATTTGTAAG-3’(Hind III)
PBsadhF：5’-GGGGTACCATGATCATAGGGGTTCCT-3’(Kpn I)
PBsadhR：5’-CCGCTCGAGTTAAGCACCCGCCACAGATG-3’(Xho I)
PScvdhF：5’-GGAATTCCATATGGTGACCGACGTAAACGG-3’(Nde I)
PScvdhR：5’-CGAGCTCTCACGGCCGGGGACGGGCCT-3’(Xho I)
[3]利用恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌及天蓝色链霉菌DNA作为模板做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌ddH2O 37μL，ExTaq DNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min 30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[4]构建重组质粒pMD18-T-Ppglcdh/pMD18-T-Bsadh/pMD18-T-Scvdh，导入感受态E.coliJM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coilJM109，转化方法参照实施例[5]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-Ppglcdh/pMD18-T-Bsadh/pMD18-T-Scvdh，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。
[5]将[4]中提取的质粒pMD18-T-Ppglcdh和表达载体pET-duet分别用BamH I和Hind III进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-duet-Ppglcdh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[5]，用氨苄霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
[6]将[4]中提取的质粒pMD18-T-Bsadh和表达载体pET-duet-Ppglcdh分别用KpnI和Xho I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将[4]中提取的质粒pMD18-T-Scvdh和表达载体pET-duet-Ppglcdh分别用Nde I和Xho I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收 后进行连接。将连接好的重组质粒pET-duet-Ppglcdh+Bsadh/pET-duet-Ppglcdh+Scvdh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[5]，用氨苄霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
实施例4：重组质粒pET-28a-Ecltd/pET-28a-Seltd的构建及转化
[1]以大肠杆菌、鼠伤寒沙门(氏)菌的基因组DNA作为模板。
[2]根据大肠杆菌、鼠伤寒沙门(氏)菌的L-苏氨酸脱氨酶基因序列以及pET-28a质粒上的酶切位点设计ltd基因引物。
PEcltdF：5’-ACCGGGATCCATGGCTGACTCGCAACCCCT-3’(BamH I)
PEcltdR：5’-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAAAAAGAACCTG-3’(Hind III)
PSeltdF：5’-ACCGGGATCCATGGCGGAATCTCAACCTCT-3’(BamH I)
PSeltdR：5’-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAGAAAGAACC-3’(Hind III)
[3]利用大肠杆菌及鼠伤寒沙门(氏)菌DNA作为模板做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×ExTaq Buffer 5μL，灭菌ddH2O 37μL，ExTaq DNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min 30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[4]构建重组质粒pMD18-T-Ecltd/pMD18-T-Seltd，导入感受态E.coli JM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T 0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coilJM109，转化方法参照实施例[5]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-Ecltd/pMD18-T-Seltd，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。
[5]将[4]中提取的质粒和表达载体pET-28a分别用BamH I和Hind III进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-Ecltd/pET-28a-Seltd转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[5]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
实施例5：大肠杆菌感受态的制备及质粒的转化
[1]大肠杆菌感受态的制备。将单克隆大肠杆菌于10ml LB培养基中活化，之后转接于 37℃振荡培养至OD6000.35即可制备感受态；将培养好的菌液置于冰水中，轻轻摇晃使菌液迅速冷却约10min；准备灭好菌的1.5ml离心管若干个，分装菌液于管中，每管装菌量1.2ml，将离心管放置于冰中；菌液离心8000r/min 10-20s，冰水中静置2min，弃上清，加入预冷好的0.1M CaCl2400μL，轻轻吹吸悬浮液，放入冰中15min(该步骤重复2-3次)；最后，每管菌液离心弃上清后加入预冷好的0.1M CaCl280μL，轻轻吹吸悬浮菌液放入冰中。
[2]质粒的转化。取[1]制备好的感受态细胞，加入需要转化的质粒，轻轻反复吹吸，并在冰中放置45min；将离心管放入42℃水浴锅准确放置90s，然后取出迅速放入冰中5min；加入LB培养基800μL，轻轻混合，37℃摇床培养1-1.5h；菌体离心2min，弃大部分上清，再重新吹吸悬浮，取200μL于目标抗性平板，置于37℃培养箱中培养；待转化子长出之后提质粒验证。
实施例6：串联来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶及来源于蜡样芽孢杆菌的L-亮氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化联产α-氨基丁酸和葡萄糖酸
[1]将重组菌pET-28a-Ecltd/BL21和串联有L-亮氨酸脱氢酶的pET-28a-Bsglcdh+Bcldh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 7.0的50mM PB缓冲液分别将pET-28a-Ecltd/BL21和pET-28a-Bsglcdh+Bcldh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.0的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入1M L-苏氨酸和1M葡萄糖及0.1％(v/v)tween-80，于30℃、300r/min进行转化，转化过程中补充碳酸钙以保持反应液pH为6.0。分不同时间取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。α-氨基丁酸的产率为102.8g/L，葡萄糖酸的产率为196.8g/L。
[2]氨基酸的HPLC分析条件：在EP管中依次加入转化液样品200μL，衍生剂400μL(取10mg邻苯二甲醛+0.5ml无水乙醇，再加入2ml pH 9.5的0.l M硼砂缓冲液及50μL 2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400μL 0.1M KH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱：dimosoil C18(5μl,250mm×4.6mm)，流动相：0.05M醋酸钠缓冲液:甲醇-63:35，检测器：UV Detector，检测波长：338nm，柱温：40℃，进样量：20μL，流速：1.0ml/min。
[3]葡萄糖酸的HPLC分析条件：色谱柱：Aminex HPX-87(300mm×7.8mm)，流动相：5mM H2SO4，检测器：UV Detector，检测波长：210nm，柱温：30℃，进样量：10μL，流速：0.6 ml/min。
实施例7：串联枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶及红球菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化联产α-氨基丁酸和葡萄糖酸
将重组菌pET-28a-Ecltd/BL21和串联有L-苯丙氨酸脱氢酶的pET-28a-Bsglcdh+Rjpdh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 7.0的50mM PB缓冲液分别将pET-28a-Ecltd/BL21和pET-28a-Bsglcdh+Rjpdh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.0的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入1M L-苏氨酸和1M葡萄糖及1％(v/v)甲苯，于30℃、300r/min进行转化，以1M NaOH溶液以保持反应液pH为7.0。分不同时间取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析(同实施例6中的HPLC方法)。测得α-氨基丁酸的产率为87.3g/L，葡萄糖酸的产率为164.2g/L。
实施例8：串联恶臭假单胞菌来源的葡萄糖脱氢酶及枯草芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化联产α-氨基丁酸和葡萄糖酸
将重组菌pET-28a-Seltd/BL21和串联有L-丙氨酸脱氢酶的pET-duet-Ppglcdh+Bsadh/BL21利用LB培基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 7.0的50mM PB缓冲液分别将pET-28a-Ecltd/BL21和pET-28a-Bsglcdh+Rjpdh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.0的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入1M L-苏氨酸和1M葡萄糖及0.2％(v/v)曲拉通X100，于30℃、300r/min进行转化，以5M氨水以保持反应液pH为8.0。分不同时间取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析(同实施例6中的HPLC方法)。测得α-氨基丁酸的产率为67.6g/L，葡萄糖酸的产率为135.2g/L。
实施例9：串联恶臭假单胞菌来源的葡萄糖脱氢酶及天蓝色链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化联产α-氨基丁酸和葡萄糖酸
将重组菌pET-28a-Seltd/BL21和串联有L-缬氨酸脱氢酶的pET-duet-Ppglcdh+Scvdh/BL21利用LB基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 7.0 的50mM PB缓冲液分别将pET-28a-Ecltd/BL21和pET-28a-Bsglcdh+Rjpdh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.0的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入1M L-苏氨酸和1M葡萄糖及0.5％(v/v)CTAB，于30℃、300r/min进行转化，以5M氨水以保持反应液pH为7.0。分不同时间取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析(同实施例6中的HPLC方法)。测得α-氨基丁酸的产率为74.9g/L，葡萄糖酸的产率为142.2g/L。
Claims (1)
1.一种串联葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶重组大肠杆菌用于联产α-氨基丁酸和葡萄糖酸的方法，其特征在于包括以下内容：
(1)重组菌的构建
以染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR；采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；采用相同的限制性内切酶对载体pET-28a或者pET-Duet和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收；将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coliBL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入氨苄霉素或卡那霉素的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存；
以pET-28a为葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶的共表达载体时，以连上pET-28a的葡萄糖酸脱氢酶质粒为模板，根据预先设计好的带启动子的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR；采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；采用相同的限制性内切酶对已经连上L-氨基酸脱氢酶的载体pET-28a-ldh和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收；将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coliBL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入卡那霉素的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存；
以pET-Duet为葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶的共表达载体时；先以染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行L-氨基酸脱氢酶的基因PCR，采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；采用相同的限制性内切酶对已经连上pET-Duet的葡萄糖脱氢酶质粒载体和纯化的PCR产物进行双酶切以，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收；将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coliBL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入氨苄霉素的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存；
(2)使用重组大肠杆菌在LB培养基进行诱导培养，然后进行全细胞转化：利用pH7.0的50mMPB缓冲液洗涤细胞然后将细胞重新悬浮于pH6.0-8.0的50mMPB缓冲液中，在不加入任何辅因子的情况下，加入1ML-苏氨酸、1M葡萄糖及0.1-1v/v％的增加细胞通透性的表面活性剂，利用添加一定的化学试剂调节使转化的pH保持在6.0-8.0之间，并控制转化的温度在30-42℃之间，制备得到α-氨基丁酸和葡萄糖酸；
所述的L-氨基酸脱氢酶选自：芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶、链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶或红球菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶；
所述的葡萄糖脱氢酶选自：芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶或假单胞菌来源的葡萄糖脱氢酶；
所述的增加细胞通透性的表面活性剂为：吐温80、甲苯、曲拉通X100或十六烷基三甲基溴化铵CTAB。
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