CN104342468A - 一种利用枯草芽孢杆菌生产环磷腺苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产作为药物和生化试剂有用的环磷腺苷的工业方法，编码具有腺苷酸环化酶活性的蛋白并可用于上诉生产方法的基因，含有该基因的重组DNA，含有该重组DNA的新菌株，和使用该新菌株生产环磷腺苷的方法。

Description

一种利用枯草芽孢杆菌生产环磷腺苷的方法

技术领域

本发明属于微生物菌种筛选的技术领域，特别涉及利用基因重组构建环磷腺苷高产菌株及其发酵生产的技术。

背景技术

本发明涉及一种生产作为药物和生化试剂有用的环磷腺苷的工业方法，编码具有腺苷酸环化酶活性的蛋白并可用于上诉生产方法的基因，含有该基因的重组DNA，含有该重组DNA的转化子，和使用该转化子生产环磷腺苷的方法。而环磷腺苷为循环系统用药，属于能量合剂的一种，临床主要用于心力衰竭、心肌炎、病窦综合征、冠心病及心肌病，也可用于心律失常的辅助治疗。

下列方法是生产环磷腺苷的已知方法：

(1)碱性水解法

David lipkin等人在1959年曾用碱性水解的工艺方法制得了环磷腺苷。此法主要是利用三磷酸腺苷(ATP)100℃时在氢氧化钡强碱水溶液中水解并关环制得环磷腺苷。

(2)活性酯类法

河北大学韩文炎和屠宛蓉在1986年报道了环磷腺苷的改进合成工艺方法。5-腺苷酸、4-吗啡啉-N，N-二环己基脒和金属钠在乙二醇单甲醚溶剂中反应，合成了环磷腺苷。

(3)DCC脱水法

M.Smith等在1961年用5一腺苷酸和4一吗啡啉一N，N一二环己基脒在吡啶溶剂中，用DCC作脱水剂进行脱水反应，使5-腺苷酸发生内酯化反应，产物的收率可达80％。-

(4)三氯氧磷法

1989年，Genieser等报道了腺苷与三氯氧磷反应得到腺苷的合成工艺路线。中间体腺苷二氯磷酸酯不经过分离，加碱环化得到环磷腺苷。此法原料容易得到，反应条件温和适中，但收率偏低(49％)。

但以上方法全都属于化学合成方法，难点在于反应所需原料都具有毒性和污染，且工业化生产过于昂贵。

本发明的目的是提供发酵法生产环磷腺苷的方法，为了更适于工业化生产，本发明还提供了含有腺苷酸环化酶基因的转化子。利用该转化子可以大量生产环磷腺苷。

发明内容

本发明的目的是提出一种构建环磷腺苷高产菌株并使之产生环磷腺苷的方法，依此方法可有效的生产环磷腺苷。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：一种构建重组环磷腺苷产生菌株的方法，其特征在于包括以下过程：从十字花科蔬菜黑腐病菌jsim-3017获得腺苷酸环化酶基因并连接于表达载体pHT01。电转化该载体于宿主菌枯草芽孢杆菌jsim-1025。在青霉素平板上挑取不敏感的菌落。于斜面培养基培养2-3天后，接种于装有30ml液体发酵培养基的250ml摇瓶，分1级或2级发酵，于28-36℃，转速为200-220rpm的摇床中培养24-120h，通过高压液相色谱，检测环磷腺苷产量，从而获得高产的环磷腺苷产生菌。新的遗传标记为：黄嘌呤、组氨酸、硫胺素三重缺陷型(缩写为Xan-、His-、Thi-)，鸟苷酸还原酶、腺苷酸脱氨酶缺失(GMPred-、Deam-)，8-氮鸟嘌呤抗性(8-AGr)以及腺苷酸环化酶阳性。

上述的筛选平板中青霉素的含量为：50μg/ml。

上述的液体发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖30-100g，胰蛋白胨5-20g，K2HPO45-8g，玉米浆1-3g，NaCl2-10g溶于1L自来水中，PH，5-9。

本发明采用的通过重组得到的环磷腺苷高产菌株，设备简单、方法宜行、效果良好，发酵单位达到6-10g/L，最高可以达到12g/L。

具体实施方式

实施例一

本发明包括提取含有腺苷酸环化酶活性的蛋白基因，如序列号1所示氨基酸序列的蛋白。

含有腺苷酸环化酶基因的DNA片段可以从能够产生环磷腺苷的微生物中获得。任何具有产生环磷腺苷的微生物都可以用于本发明。一株十字花科蔬菜黑腐病菌jsim-3017是本发明者拥有并保藏的。

以下描述从十字花科蔬菜黑腐病菌jsim-3017获得腺苷酸环化酶基因的方法。

通过常规DNA分离方法如苯酚方法(Biochem.Biophys.Acta，72，619-629)，从十字花科蔬菜黑腐病菌jsim-3017制备染色体DNA。

可用常规方法合成引物PCR扩增序列1的DNA片段，跑胶回收PCR产物。

PCR引物序列如下：

正向引物：agctggatccatgggtatcgaaatcgaacg

反向引物：agctcccgggtcagcgtaccgaccactgcg

枯草杆菌表达质粒使用pHT01(7955bp)。

使用BamHI和SmaI两个限制性内切酶酶切质粒，并跑胶回收酶切后的载体。

使用BamHI和SmaI两个限制性内切酶酶切PCR产物，并跑胶回收大片段。

连接经酶切的质粒和PCR产物，构建重组质粒pHT01107，并常规方法转化大肠杆菌DH5α。

培养大肠杆菌菌体后，常规方法提取质粒。得到在枯草杆菌中表达目标基因的质粒。

可用常规方法电转化重组质粒到宿主菌枯草芽孢杆菌jsim-1025中。

在含有50μg/ml青霉素的LB培养平板中挑取不敏感菌，按碱性-SDS方法快速抽提质粒，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

转化子接种50μg/ml青霉素的LB斜面保存。

实施例二

接种于装有30ml液体发酵培养基的250ml摇瓶(葡萄糖50g，胰蛋白胨10g，K2HPO45g，玉米浆3g，NaCl3g溶于1L自来水中，PH7.5)，于30℃，转速为200rpm的摇床中培养72h，通过HPLC，检测环磷腺苷产量，筛选得到发酵单位达到3克/升以上菌株4株。其中Bacillus.subtilis jsim-1277发酵单位达到5.5克/升。

实施例三

将Bacillus.subtilis jsim-1277在装有30ml液体发酵培养基的250ml摇瓶(葡萄糖30g，胰蛋白胨10g，玉米浆3g，NaCl3g溶于1L自来水中，PH7.5)，于30℃，转速为200rpm的摇床中培养18h，取3ml作为种子液接种到装有30ml液体发酵培养基的250ml摇瓶(葡萄糖50g，胰蛋白胨10g，玉米浆3g，NaCl3g溶于1L自来水中，PH7.5)，于30℃，转速为200rpm的摇床中培养72h，得到最终发酵液环磷腺苷发酵单位达到6.1克/升。

实施例四

将Bacillus.subtilis jsim-1277在装有30ml液体发酵培养基的250ml摇瓶(葡萄糖30g，胰蛋白胨10g，玉米浆3g，NaCl3g溶于1L自来水中，PH7.5)，于30℃，转速为200rpm的摇床中培养18h，取3ml作为种子液接种到装有30ml液体发酵培养基的250ml摇瓶(葡萄糖50g，胰蛋白胨10g，玉米浆3g，NaCl3g，肌苷3g溶于1L自来水中，PH7.5)，于30℃，转速为200rpm的摇床中培养72h，得到最终发酵液环磷腺苷发酵单位达到12.1克/升。

实施例五

将来自实施例四得到的发酵液合并，得到1升料液，其中环磷腺苷含量10.9克/升。调节PH到3.5，静置4小时。过滤得到清液。清液用200ml处理成OH型的717树脂吸附，用PH3的稀盐酸溶液300ml冲洗，再用0.15N的稀盐酸溶液洗脱，得到300ml洗脱液，其中环磷腺苷浓度为28.3克/升。6NnaOH溶液调节PH到2，加入工业乙醇300lml，得到结晶，经过滤烘干得到环磷腺苷白色结晶6.1克。纯度98.3％。

Claims (6)

1.一种环磷腺苷的生产方法，其特征是微生物发酵生产。

2.依据权利要求1，其发酵菌株特征是以Bacillus subtilis JSIM-1025腺苷产生菌为宿主菌，采用基因重组方法，转入能编码腺苷酸环化酶的基因，得到新的工程菌。该突变株不再积累腺苷而积累大量环磷腺苷。新的遗传标记为：黄嘌呤、组氨酸、硫胺素三重缺陷型(缩写为Xan-、His-、Thi-)，鸟苷酸还原酶、腺苷酸脱氨酶缺失(GMP red-、Deam-)，8-氮鸟嘌呤抗性(8-AGr)以及腺苷酸环化酶阳性。

3.依据权利要求2，该编码腺苷酸环化酶的基因源自一株十字花科蔬菜黑腐病菌jsim-3017。

4.依据权利要求1，所述的一种发酵产生环磷腺苷的方法，其特点在发酵培养基中，于28-36℃，转速为200-220rpm的摇床中培养24-120h。

5.依据权利要求1，发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖30-100g，胰蛋白胨5-20g，K2HPO45-8g，玉米浆1-3g，NaCl2-10g溶于1L自来水中。

6.依据权利要求1，发酵过程中PH控制在5-9。