CN105002234A - 一种酶法催化合成环磷酸腺苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酶法催化合成环磷酸腺苷的方法，该方法包括：在大肠杆菌中分别重组表达百日咳腺苷酸环化酶毒素(Adenylate？cyclase？toxin，ACT_1-373)和钙调蛋白(Calmodulin，CALM)。重组菌株经破碎后，分离得到上清，将含有ACT_1-373和CALM的破碎上清混合，加入三磷酸腺苷(ATP)，在30℃下搅拌10min，完成酶促反应，上清经乙醇处理后可获得高纯度的CAMP。本发明为大量制备CAMP提供了可能。

Description

一种酶法催化合成环磷酸腺苷的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体的说，本发明涉及酶法催化合成环磷酸腺苷(CAMP)的方法。

背景技术

环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，CAMP)是一种重要的核酸衍生物，具有多种生理功能，在医药和畜牧业领域有广泛的应用。在医药应用中，CAMP是人体细胞内的第二信使，参与调节糖代谢、脂代谢、核酸的合成、蛋白质的合成。研究表明，包括冠心病、心肌梗塞、癌症等40余种疾病的发生都与CAMP的代谢异常有关。外源性的CAMP具有舒张平滑肌、扩张血管、改善心肌缺氧、改善肝功能等生理功能。因此，临床上使用CAMP治疗心绞痛、急性心肌梗死、心源性休克以及呼吸系统疾病、肝胆疾病等(党立，王希敏，韩利文等，山东科学，2007，20(3)：61-64)。此外，CAMP也可以用作中间体，合成脂溶性效果好、药理作用更强、起效更快的二丁酰环磷酸腺苷和环磷酸腺苷葡甲酸等药物。在畜牧业领域，CAMP可以作为饲料添加剂，模拟生长激素的作用，促进畜禽的生长增重，增强畜禽的体质，提高抗病、抗寒能力，增加优质畜禽产品的产量。

大部分国内企业使用化学法生产CAMP，合成方法包括碱水解法、DCC脱水法、活性脂法、三氯氧磷法等。少数企业从大枣等天然产物中提取CAMP。但是，现有的化学合成法成本高、污染严重、原料毒性大。而从天然产物中提取的工艺复杂，获得的CAMP纯度低，一般仅作为保健品使用。这些不足限制了CAMP的大规模生产和广泛应用。基于这一现状，亟需开发高效、无污染且适合产业化的新型CAMP生产方法。发酵法和酶法因为其环境友好的特点越来越受到重视。发酵法是通过筛选和培养产CAMP的菌株或者构建表达腺苷酸环化酶的重组菌株实现在细胞水平催化生产CAMP。如发明专利CN102433292公布了一种利用基因重组大肠杆菌催化生成CAMP的方法。发明专利CN 102899372公布了一株高产CAMP节杆菌及其发酵方法，该方法获得CAMP的产量为7.52g/L。发明专利CN 104342468公开了腺苷酸环化酶基因克隆入枯草芽孢杆菌获得一株基因工程菌，通过培养最高可以获得12.1g/L CAMP的发酵水平。但是，现有的发酵法所用菌株的发酵水平较低，还无法满足大规模工业生产的要求。酶法是通过使用腺苷酸环化酶催化ATP生成CAMP。与发酵法相比，酶法同样具有条件温和、无污染等特点。酶法的优点在于反应的产物更加专一，过程易于控制，反应体系中不含有微生物、有毒的原料试剂等杂质，非常有利于后续的分离纯化。目前，酶法生产CAMP的报道较少，原因在于酶的制备复杂。因此，有必要开发出高效的腺苷酸环化酶制备方法、简单的酶促反应体系，突破这一瓶颈。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷来发明一种酶法催化合成环磷酸腺苷的方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供一种酶法催化合成环磷酸腺苷的方法，该方法包括下列步骤：

1)获得表达腺苷酸环化酶的重组大肠杆菌；

2)获得表达钙调蛋白的重组大肠杆菌；

3)将所述步骤1)和步骤2)中获得的重组大肠杆菌诱导表达，并且破碎收集上清，加入三磷酸腺苷完成酶促反应，经有机溶剂处理后可获得高纯度的环磷酸腺苷。

优选地，在所述步骤1)中，根据百日咳腺苷酸环化酶毒素1-373位氨基酸的功能域的编码核苷酸序列来设计引物，在两侧引入酶切位点，PCR扩增后回收片段并连接到pET22b载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)并筛选获得重组大肠杆菌。

优选地，在所述步骤2)中，根据人钙调蛋白的编码核苷酸序列来设计引物，在两侧引入酶切位点，PCR扩增后回收片段并连接到pET22b载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)并筛选获得重组大肠杆菌。

更优选地，在所述步骤3)中，分别接种所述步骤1)和所述步骤2)中的重组大肠杆菌至LB/Amp培养基中，在37℃、180rpm条件下振荡培养过夜，然后转接至新鲜LB/Amp培养基中继续培养3h后开始诱导表达，诱导条件为：IPTG浓度1mM，诱导温度37℃，诱导时长5h。

优选地，在所述步骤3)中，将蛋白终浓度为1mg/ml的含有百日咳腺苷酸环化酶毒素的上清25μl、蛋白终浓度为1mg/ml的含有钙调蛋白的上清25μl、浓度为1mg/ml的三磷酸腺苷100μl、2μl 6mMMgCl₂、2μl 0.12mM CaCl₂、46μl 50mM Tris·HCl(pH8.0)在20-45℃条件下反应1-100分钟。

优选地，在所述步骤3)中，在30℃条件下反应10分钟。

优选地，在所述步骤3)中，经有机溶剂处理为加入有机溶剂至最终浓度为40体积％。

更优选地，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮酸或三氟乙酸。

最优选地，所述有机溶剂为乙醇。

本发明构建的酶法合成CAMP反应体系具有下列优点：

1.采用原核大肠杆菌表达ACT_1-373及辅酶CALM。大肠杆菌背景清楚，培养简单、周期短、成本低，适合酶的大规模制备。

2.重组表达菌株经破碎后分离上清，采用表达上清液直接进行催化反应，减少了酶的纯化、分离等操作步骤，极大地简化了工艺。

3.反应结束后采用乙醇沉淀的方法高效地去除杂质，方便高纯度CAMP的获得。

附图说明

图1为本发明中SDS-PAGE检测BL21(DE3)/pET22b-act_1-373和BL21(DE3)/pET22b-calm诱导后腺苷酸环化酶和钙调蛋白的表达。其中，泳道1为BL21(DE3)/pET22b-calm全菌蛋白。泳道2为BL21(DE3)/pET22b-act_1-373全菌蛋白。

图2.为本发明中HPLC检测催化CAMP的生成。其中，图A为ATP标准品。图B为CAMP标准品。图C为催化合成的CAMP。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1.BL21/pET22b-act_1-373表达菌株的构建

以带有编码ACT核苷酸序列(Genbank登录号：GQ370813.1)的pUC57-act为模板，通过常规PCR扩增ACT蛋白_1-373位的核苷酸编码序列。所用上游引物带有Nde I酶切位点，序列为：TATACATATGCAGCAATCGCATCAGGC。下游引物带有Xho I酶切位点，序列为：TATACTCGAGCGAACGTCCGCTCGGCACG。反应条件为：94℃2min；94℃30s，55℃45s，72℃1min，共35个循环；72℃5min。得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将该序列与表达载体pET22b用Takara公司的Nde I(1160A)和Xho I(1094A)酶切，酶切反应体系为：10×buffer H 2μl，Nde I 0.5μl，Xho I 0.5μl，基因片段或pET22b载体3μl，H₂O 14μl。酶切体系于37℃条件下反应3小时。将酶切产物连接，反应体系为：10×Ligase buffer 2μl，T4 DNA Ligase(Takara，2011A)0.5μl，基因片段5μl，载体1μl，H₂O 11.5μl。连接于室温反应12小时。将连接产物转化大肠杆菌DH5α。PCR筛选阳性菌株DH5α/pET22b-act_1-373并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。

将阳性DH5α/pET22b-act_1-373菌株接种至5ml LB/Amp液体培养基，LB/Amp液体培养基组成为1％蛋白胨(BD公司)、0.5％酵母提取物(BD公司)、1％NaCl(国药集团化学试剂有限公司)，于37℃、180rpm条件下振荡培养过夜。第二天按照天根质粒提试剂盒(DP103)操作说明提取质粒pET22b-act_1-373。取1ul pET22b-act_1-373质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。PCR筛选阳性菌株BL21(DE3)/pET22b-act_1-373。

实施例2.BL21/pET22b-calm表达菌株的构建

以带有编码CALM核苷酸序列(Genbank登录号：BT006818.1)的pUC57-calm为模板，通过常规PCR扩增CALM蛋白的核苷酸编码序列。所用上游引物带有Nde I酶切位点，序列为：TATACATATGGCTGATCAGCTGACCGA。下游引物带有Xho I酶切位点，序列为：TATACTCGAGCTATTTTGCAGTCATCATCT。反应条件为：94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃5min。得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将该序列与表达载体pET22b用Takara公司的Nde I(1160A)和Xho I(1094A)酶切，酶切反应体系为：10×buffer H 2μl，Nde I 0.5μl，Xho I 0.5μl，基因片段或pET22b载体3μl，H₂O 14μl。酶切体系于37℃条件下反应3小时。将酶切产物连接，反应体系为：10×Ligase buffer 2μl，T4 DNA Ligase(Takara，2011A)0.5μl，基因片段5μl，载体1μl，H₂O 11.5μl。连接于室温反应12小时。将连接产物转化大肠杆菌DH5α。PCR筛选阳性菌株DH5α/pET22b-calm并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。

3.BL21/pET22b-calm表达菌株的构建

将阳性DH5α/pET22b-calm菌株接种至5ml LB/Amp液体培养基，LB/Amp液体培养基组成为1％蛋白胨(BD公司)、0.5％酵母提取物(BD公司)、1％NaCl(国药集团化学试剂有限公司)，于37℃、180rpm条件下振荡培养过夜。第二天按照天根质粒提试剂盒(DP103)操作说明提取质粒pET22b-calm。取1ul pET22b-calm质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。PCR筛选阳性菌株BL21(DE3)/pET22b-calm。

实施例3.ACT_1-373和CALM的诱导表达和菌体破碎

1.ACT_1-373和CALM的诱导表达

阳性菌株BL21(DE3)/pET22b-act_1-373和BL21(DE3)/pET22b-calm分别接种至50ml LB/Amp液体培养基，37℃、180rpm条件下振荡培养过夜。第二天按1:100的比例分别接种于5L新鲜的LB/Amp液体培养基，37℃、180rpm条件下振荡培养3h。加入IPTG至终浓度1mM，在37℃、180rpm条件下振荡培养5h。10000rpm离心5min，分别收集菌体。

2.菌体破碎

将菌体用50mM PB、pH7.0的缓冲液重悬，用高压匀质机破碎，条件为12000psi，4℃，三个循环。10000rpm离心30min收集上清，Bradford法测定蛋白浓度。

实施例4.催化合成CAMP

在试管中混合如下反应体系：浓度为1mg/ml的ATP 100μl，蛋白终浓度为1mg/ml的ACT_1-373上清25μl，蛋白终浓度为1mg/ml的CALM上清25μl，2μl 6mM MgCl₂，2μl 0.12mM CaCl₂，46μl 50mMTris·HCl(pH8.0)。反应于30℃水浴中搅拌10min。加入乙醇至终浓度40％，10000rpm离心30min离心去除蛋白，用C18色谱柱检测上清中CAMP的生成，流动相为0.02mol/L磷酸二氢钾：甲醇＝90：10，流速1ml/min,检测波长260nm。

Claims (9)

1.一种酶法催化合成环磷酸腺苷的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

1)获得表达腺苷酸环化酶的重组大肠杆菌；

2)获得表达钙调蛋白的重组大肠杆菌；

3)将所述步骤1)和步骤2)中获得的重组大肠杆菌诱导表达，并且破碎收集上清，加入三磷酸腺苷完成酶促反应，经有机溶剂处理后可获得高纯度的环磷酸腺苷。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤1)中，根据百日咳腺苷酸环化酶毒素1-373位氨基酸的功能域的编码核苷酸序列来设计引物，在两侧引入酶切位点，PCR扩增后回收片段并连接到pET22b载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)并筛选获得重组大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤2)中，根据人钙调蛋白的编码核苷酸序列来设计引物，在两侧引入酶切位点，PCR扩增后回收片段并连接到pET22b载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)并筛选获得重组大肠杆菌。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤3)中，分别接种所述步骤1)和所述步骤2)中的重组大肠杆菌至LB/Amp培养基中，在37℃、180rpm条件下振荡培养过夜，然后转接至新鲜LB/Amp培养基中继续培养3h后开始诱导表达，诱导条件为：IPTG浓度1mM，诱导温度37℃，诱导时长5h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步骤3)中，将蛋白终浓度为1mg/ml的含有百日咳腺苷酸环化酶毒素的上清25μl、蛋白终浓度为1mg/ml的含有钙调蛋白的上清25μl、浓度为1mg/ml的三磷酸腺苷100μl、2μl 6mM MgCl₂、2μl 0.12mM CaCl₂、46μl50mM Tris·HCl(pH8.0)在20-45℃条件下反应1-100分钟。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述步骤3)中，在30℃条件下反应10分钟。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步骤3)中，经有机溶剂处理为加入有机溶剂至最终浓度为40体积％。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮酸或三氟乙酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇。