JP2015139420A - 化学物質検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 化学物質を高感度かつリアルタイムな検出を小型で簡単な構成で実現すること。
【解決手段】 化学物質受容体１０２と、Ｇタンパク質１０３と、アデニル酸シクラーゼ１０４と、ｃＡＭＰが結合した時に形状変化を引き起こす特性を有するｃＡＭＰ結合型タンパク質７００と、微小貫通孔１０７を備え、化学物質１０５が化学物質受容体１０２に結合することにより産生されるｃＡＭＰとｃＡＭＰ結合型タンパク質との複合体１０８が微小貫通孔１０７に送られ、ｃＡＭＰが微小貫通孔１０７を通過するときに、微小貫通孔１０７の溶液抵抗の変化により微小貫通孔１０７の出入り口の間に流れる電流が変化する。この電流を検出することにより、化学物質１０５を高感度に検出することが可能となる。
【選択図】図２

Description

本発明は高感度かつリアルタイムで化学物質検出する簡便な方法を提供することに関するものである。

高感度でかつ特異性の高い化学物質センサを作成するためには、生体に存在する化学物質受容体を利用するのが効率的な方法である。生体由来の受容体を利用した化学物質検出方法としては、目的の受容体と関連して動作する膜タンパク質を分子生物学的手法によって細胞に発現させ、受容体と膜タンパク質との間に発生する内因性シグナルパスウエーを利用して、化学物質を検出するというものがあった（たとえば、非特許文献１）。

図１に示すように、生体の細胞膜２０１には、（１）化学物質受容体（レセプター）１０２、細胞内側（図１では脂質二重膜１０１の下側）に（２）Ｇタンパク質１０３、（３）アデニル酸シクラーゼ１０４が存在する。例えば、神経伝達物質などの化学物質１０５が、化学物質受容体１０２の細胞外側（図１では細胞膜２０１の上側）に結合すると、化学物質受容体１０２の近傍にあるＧタンパク質１０３が活性化する。Ｇタンパク質１０３が活性化すると、その近傍に存在するアデニル酸シクラーゼ１０４を活性化させる。アデニル酸シクラーゼが活性化すると、細胞内に存在するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を脱リン酸化し、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）を産生する。

非特許文献１では、ｃＡＭＰと特異的に結合し、ホタル由来の発光するタンパク質であるルシフェラーゼを改変して作成されたｃＡＭＰ結合型発光タンパク質２０２を予め細胞内に発現させておき、さらに基質であるルシフェリン２０３を与えておくと、化学物質１０５が化学物質受容体１０２に結合したことによって産生されるｃＡＭＰが、ｃＡＭＰ結合型発光タンパク質２０２の形状変化を引き起こし、ルシフェリン２０３と結合して発光する。この現象を利用すれば、化学物質受容体１０２に結合する前記化学物質１０５の結合量を、ｃＡＭＰ結合型発光タンパク質２０２の光量変化として検出可能であることが開示されている。

また、同様の技術をさらに進化させた技術として、ｃＡＭＰ結合型発光タンパク質と蛍光タンパク質が隣接する融合タンパク質を用いて生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）現象を利用し発光の効率を飛躍的に上昇させる技術が開示されている（非特許文献２）。

Ｆａｎ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｏｖｅｌ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ Ｕｓｉｎｇ Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ３， ３４６−５１ （２００８） Ｋｅｎｔａ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ａｎｄ ｗｈｏｌｅ−ｂｏｄｙ ｉｍａｇｉｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ．， ３， ｎｏ．１２６２． （２０１２）

従来の方法では、目的の化学物質を高感度、かつ、高精度に検出できず、かつ、小型で簡便な構成で実現することができなかった。

本発明の一態様は、化学物質を検知または定量する方法であって、脂質二重膜と前記脂質二重膜の裏側に微小貫通孔を有しており、前記脂質二重膜には、化学物質受容体と、Ｇタンパク質と、アデニル酸シクラーゼとを具備しており、前記脂質二重膜は、裏側にＡＴＰおよびｃＡＭＰが結合した時に形状変化を引き起こす特性を有するｃＡＭＰ結合型タンパク質を有しており、前記方法は、検知または定量される化学物質を前記脂質二重膜の表側からさらに供給し、前記化学物質受容体が前記Ｇタンパク質と前記アデニル酸シクラーゼを活性化させ、前記ＡＴＰが脱リン酸化してｃＡＭＰに変化する工程、前記ｃＡＭＰとｃＡＭＰ結合型タンパク質が複合体を形成する工程、前記微小貫通孔に前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質とｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体とを輸送する工程、前記微小貫通孔に前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質あるいはｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体が通過するときに、前記微小貫通孔における溶液抵抗の変化に伴う貫通孔出入り口間の電流の大きさによって、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体を検出する工程、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体の濃度変化に基づいて前記化学物質を検知または定量する工程を有する、化学物質検出方法である。

また、本発明の他の一態様は、化学物質を検知または定量する方法であって、脂質二重膜と前記脂質二重膜の裏側に微小貫通孔を有しており、前記脂質二重膜には、化学物質受容体と、Ｇタンパク質と、アデニル酸シクラーゼとを具備しており、前記脂質二重膜は、裏側にＡＴＰおよびｃＡＭＰが結合した時に形状変化を引き起こす特性を有するｃＡＭＰ結合型タンパク質を有しており、前記方法は、検知または定量される化学物質を前記脂質二重膜の表側からさらに供給し、前記化学物質受容体が前記Ｇタンパク質と前記アデニル酸シクラーゼを活性化させ、前記ＡＴＰが脱リン酸化してｃＡＭＰに変化する工程、前記ｃＡＭＰとｃＡＭＰ結合型タンパク質が複合体を形成する工程、前記微小貫通孔に前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質とｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体とを輸送する工程、前記微小貫通孔に前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質とｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体とが通過するときに、前記微小貫通孔で計測される溶液抵抗の変化の大きさによって、前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質とｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体とを区別して測定する工程、前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質およびｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体の濃度変化に基づいて前記化学物質を検知または定量する工程を有する、化学物質検出方法である。

前記微小貫通孔が、直径１０ナノメートル以上のサイズを有しても良い。

前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質が、ｎａｎｏ−Ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ）であっても良い。

前記化学物質受容体が、Ｇタンパク質を活性化するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であっても良い。

前記化学物質受容体が、ホルモン受容体、神経伝達物質受容体、味覚受容体、嗅覚受容体またはフェロモン受容体であっても良い。

前記Ｇタンパク質が、Ｇｓタンパク質であっても良い。

前記Ｇタンパク質が、Ｇｓタンパク質のαサブユニットであっても良い。

本発明の実施形態の化学物質検出方法によれば、目的の化学物質を高感度、かつ、高精度に検出するだけでなく、小型で簡便な構成で実現することができる。

従来の化学物質検出方法の概念図 本発明の実施の形態１における化学物質検出方法の構成図 本発明の実施の形態１における化学物質検出デバイスの構成図 （ａ）〜（ｃ）は、本発明の実施の形態１における、化学物質の存在における微小貫通孔における溶液抵抗の変化に伴う電流の変化を示すグラフおよびその解析結果を示す図 本発明の実施の形態２における化学物質検出方法の構成図 （ａ）〜（ｄ）は、本発明の実施の形態２における、化学物質の存在における微小貫通孔における溶液抵抗の変化に伴う電流の変化を示すグラフとその解析結果を示す図 ｎａｎｏ−Ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ）を示す図

まず、本発明者らの着眼点について説明する。

参考文献１（未公開の特願２０１３−１４１７１１）には、小型で化学物質を検出する方法として、微小間隙で計測されるトンネル電流の大きさによって化学物質の計測を行う方法が開示されている。その方法では、化学物質受容体と、Ｇタンパク質と、アデニル酸シクラーゼとを具備した脂質二重膜と脂質二重膜の裏側にＡＴＰを有してかつ微小間隙を有し、検知される化学物質を脂質二重膜の表側から供給し、化学物質受容体がＧタンパク質とアデニル酸シクラーゼを活性化させることでＡＴＰが脱リン酸化したｃＡＭＰを微小間隙に輸送してその微小間隙で計測されるトンネル電流の大きさによって、ｃＡＭＰを検出してひいてはその濃度変化に基づいて化学物質を検知または定量する方法である。また、同参考文献１では微小間隙だけではなくナノポアでのトンネル電流測定方法も開示されている。

非特許文献１ならびに非特許文献２に開示されている化学物質検出方法は、ｃＡＭＰ結合型発光タンパク質から発生される微弱な光量を検出する必要があり、冷却ＣＣＤなど大型の超高感度検出計が必要となる。また、Ｓ／Ｎを向上させるためには迷光の除去などが必要となり、装置が大型かつ複雑になってしまうという課題を有していた。

また、参考文献１の方法は上記の課題を解決する高感度かつリアルタイムで検出する方法のものであるが、原理上ナノギャップ以外を通過する物質が大半を占める中でギャップ間を偶然通過する物質を検出する方法であるため溶液内の物質検出における確実性を確保できない場合がある。ナノギャップの代わりにナノポアを用いる方法では、上記の参考文献１ではそのサイズが具体的に示されていないが、ｃＡＭＰのサイズとの関係上１ｎｍ程度という非常に微細なポア形成が必要なうえ、トンネル電流を計測する構造として、ポアを横断する方向にシリコン基板の両端からさらに一対の電極をパターニングする必要があり、作製が非常に困難である。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。

（実施の形態１）
図２は、本発明の実施の形態１における化学物質検出方法の構成図である。図２において、図１と同じ構成要素については同じ符号を用い、説明を省略する。

図２において、脂質二重膜１０１は人工的に脂質から構成されたものが脂質保持層１０６に保持されている。化学物質受容体１０２、Ｇタンパク質１０３、および、アデニル酸シクラーゼ１０４が発現している細胞の細胞膜２０１を、脂質二重膜１０１へ融合させることによって、化学物質受容体１０２、Ｇタンパク質１０３、および、アデニル酸シクラーゼ１０４が脂質二重膜１０１に保持されている。脂質保持層１０６に保持されている脂質二重膜１０１の下側に微小貫通孔１０７が設置されており、脂質二重膜１０１と微小貫通孔１０７の間には電解液が満たされている。微小貫通孔１０７を縦断する方向（図２に示す微小貫通孔の上下方向）に流れる電流を測定する。脂質二重膜１０１と微小貫通孔１０７間のチャンバー内にはあらかじめｃＡＭＰ結合型タンパク質が保持されている。

ｃＡＭＰ結合型タンパク質は既存の種々のものでよいがｃＡＭＰが結合した時に形状変化を引き起こす特性を有するものを用いる。たとえば非特許文献２に開示されている、ｎａｎｏ−Ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ）を用いることができる（図７に図示）。ｎａｎｏ−Ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ）は化学発光タンパク質と蛍光タンパク質をハイブリッド化した、改変型ウミシイタケルシフェラーゼ（改変ＲＬｕｃ）とＶｅｎｕｓとを融合した構造をしており、改変ＲＬｕｃはあらかじめＮ末端側とＣ末端側に分割されており、その間にｃＡＭＰ受容体の基質ペプチド結合ドメイン（ｃＡＭＰ−ＢＤ）で接続している構成をしている。

ｎａｎｏ−Ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ）はｃＡＭＰと結合することで、化学発光タンパク質の分割されていた部分である、改変ＲＬｕｃ（Ｎ末端側）７０２と改変ＲＬｕｃ（Ｃ末端側）７０３がコンパクトな構造になり、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８を形成し、その結果、タンパク質全体としてかさ高さが小さくなる特性を持っている。ＲＬｕｃ、ＶｅｎｕｓおよびｃＡＭＰ−ＢＤの分子量はそれぞれ約３７ｋＤａ、２６ｋＤａ、１７ｋＤａであり、ｃＡＭＰの分子量が３２９であることから、ｃＡＭＰと比較するとかなり大きいサイズと見積もることができる。以降の実験はｃＡＭＰ結合型タンパク質７００としてｎａｎｏ−Ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ）を用いて行った。

かかる構成によれば、化学物質１０５が化学物質受容体１０２に結合することによって産生されたＡＭＰが脱リン酸化してｃＡＭＰが産生され、産生されたｃＡＭＰはｃＡＭＰ結合型タンパク質７００と結合し、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８を形成する。微小貫通孔１０７は、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が通過できる程度の大きさを持っており、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が微小貫通孔１０７の出入り口の方向に電界が印加されている。微小貫通孔１０７に電界を印加し、かつイオン電流を測定するために、微小貫通孔１０７の上下方向に１対の電極を設けてその間に電界を印加するとともに計測器が接続されている。ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が微小貫通孔１０７近傍に送られ、微小貫通孔１０７を通過する。そのとき、微小貫通孔１０７における溶液抵抗の変化に伴う電流の大きさが変化する。その結果、微小貫通孔１０７の上下方向に設けた１対の電極においてｃＡＭＰの変化量が測定されることとなり、簡単な構成で化学物質１０５を検出することができる。

なお、本実施の形態において、脂質二重膜１０１として人工的に脂質より構成したが、生体の細胞膜の一部を切り取って脂質保持層１０６に取り付けても良い。

なお、本実施の形態において、化学物質受容体１０２、Ｇタンパク質１０３、および、アデニル酸シクラーゼ１０４はそれらが発現している細胞の細胞膜２０１を脂質二重膜１０１に融合させたが、人工的に合成して脂質二重膜１０１に保持させても良い。

なお、本実施の形態において、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が微小貫通孔１０７を通過するように電界を印加したが、圧力や重力、磁力になどによって、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が微小貫通孔１０７を通過するようにしても良い。

（実施の形態２）
図５は、本発明の実施の形態２の化学物質検出方法の構成図である。図２との相違点は、微小貫通孔１０７によって検出する物質がｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８だけでなくｃＡＭＰ結合型タンパク質７００も対象とし、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８とｃＡＭＰ結合型タンパク質７００が微小貫通孔１０７を通過するときに、微小貫通孔１０７を縦断する方向に流れている電流の変化を区別して検出するところである。

図５において、脂質二重膜１０１と微小貫通孔１０７の間には電解液が満たされており、その中にＡＴＰも混入されている。化学物質１０５が化学物質受容体１０２に結合すると、図２で説明したと同様のシグナルパスウエーが活性化され、ＡＴＰの脱リン酸化によってｃＡＭＰが産生される。ｃＡＭＰ結合型タンパク質７００およびｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が微小貫通孔１０７を通過するように電界が印加されており、微小貫通孔１０７を縦断する方向（図２に示す微小貫通孔１０７の上下方向）に流れる電流を測定するために、微小貫通孔１０７の上下方向に１対の電極を設けてその間に電界を印加するとともに計測器が接続されている（実施の形態２の構成）。

かかる構成によれば、微小貫通孔１０７近傍に送られたｃＡＭＰ結合型タンパク質７００およびｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が微小貫通孔１０７を通過するとき、微小貫通孔１０７を縦断する方向に流れる電流が検出される。このとき、ｃＡＭＰ結合型タンパク質７００およびｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８の間で検出される電流の大きさが異なるため、それぞれを区別して測定される。その結果、ｃＡＭＰ結合型タンパク質７００およびｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８の変化量が測定されることとなり、簡単な構成で化学物質１０５を検出することができる。

なお、本実施の形態において、ｃＡＭＰ結合型タンパク質７００およびｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が微小貫通孔１０７を通過するように電界を印加したが、圧力や重力、磁力になどによって、ｃＡＭＰ結合型タンパク質７００およびｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が微小貫通孔１０７を通過するようにしても良い。

次に、本発明の実施例１について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

（化学物質受容体発現細胞の作製とプロテオリポソームの作製）
化学物質受容体、Ｇタンパク質を株化細胞の細胞膜表面（脂質二重膜）に共発現させる方法については、参考文献１などに詳細に開示されている。ここでは、参考文献１と同様に化学物質受容体としてβ１アドレナリン受容体を、Ｇタンパク質としてＧｓαタンパク質を発現させた。それぞれの膜タンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅し、それをクローニングする。そして、それぞれの膜タンパク質をコードするｃＤＮＡを組み込んだ発現プラスミドを調製した。次に、２種類の発現プラスミドをベクターとして株化細胞（ＨＥＫ２９３）内へ導入することにより、株化細胞表面の脂質二重膜に、２種類の膜タンパク質を共発現させた。

株化細胞の１つであるＨＥＫ２９３細胞に、発現プラスミド２種類を導入し、化学物質受容体、およびＧタンパク質を共発現させた。また、アデニル酸シクラーゼはＨＥＫ２９３細胞が初めから保有しているため、必要な膜タンパク質群はＨＥＫ２９３細胞の細胞膜上に上記の方法で用意される。人工的に作製した脂質二重膜へＨＥＫ２９３細胞の細胞膜の一部を融合することによって、膜タンパク質群を脂質二重膜上に移植する。そのために、ＨＥＫ２９３細胞よりプロテオリポソームを作製した。膜タンパク質を発現させたＨＥＫ２９３細胞を、超音波破砕装置によって破砕した。５秒破砕、５秒休止の繰り返しを１０分間氷上で行ったところ、直径５０〜１５０ｎｍの大きさのプロテオリポソームが得られた。このプロテオリポソームは、ＨＥＫ２９３細胞の細胞膜の一部から構成されるリポソームで、ＨＥＫ２９３細胞の細胞膜に存在していた膜タンパク質を有するリポソームである。

（化学物質検出デバイスの作製）
図３に本発明の実施の形態である化学物質検出デバイスの構成図を示す。化学物質検出デバイスは３つのチャンバーから構成されており、第一のチャンバー１１１と第二のチャンバー１１２の間に脂質保持層１０６が設置されている。また、第二のチャンバー１１２と第三のチャンバー１１３の間に微小貫通孔１０７が設置されている。第一のチャンバー１１１と、第二のチャンバー１１２、および、第三のチャンバー１１３には電解液１１４が満たされている。

微小貫通孔１０７の上下に設置されている第二のチャンバー１１２と第三のチャンバー１１３には、電界印加および電流測定用の銀／塩化銀電極１２１が備え付けられており、微小間隙１０７を上下に通過するように電界を与えることができる。銀／塩化銀電極１２１を含めた計測部１２２は微小な抵抗変化を計測できる回路であれば特に問わないが、今回は非反転増幅回路にて構成する。

この電界によって、あらかじめ第二のチャンバー１１２内に保持したｃＡＭＰ結合型タンパク質７００に脂質二重膜１０１で産生されたｃＡＭＰが結合した複合体１０８を微小貫通孔１０７に輸送することができる。微小貫通孔１０７の溶液抵抗に伴う電流は、計測部１２２によって計測することができる。よって、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が微小貫通孔１０７を通過すると、電流の大きさの変化として検出することが可能である。

脂質保持層１０６は、厚さ０．１ｍｍのテフロン（登録商標）の板を用い、人工の脂質二重膜を形成するために中央に直径０．１ｍｍの孔があけられている。脂質二重膜１０１は、脂質溶液を用いて直径０．１ｍｍの孔にハケ塗り法により形成する。脂質溶液は、デカンを溶媒とし、ホスファチジルセリンとホスファチジルコリンが１：１になるように混合させ、脂質濃度が２０ｍｇ／ｍｌになるように作製したものを用いる。

ＨＥＫ２９３細胞を破砕して作製されたプロテオリポソームを、脂質保持層１０６に作製した脂質二重膜１０１近傍に近づけて接触させると、プロテオリポソームと脂質二重膜１０１とが融合する。このような融合を繰り返し行うことによって、化学物質受容体、Ｇタンパク質、そして、アデニル酸シクラーゼといった膜タンパク質群が保持された脂質二重膜１０１が形成される。

微小貫通孔１０７ｅは以下のようにして作製する。窒化シリコン３５ｎｍ膜付のシリコンウエハ上に，両面アライナーによって下穴用の描画をフォトリソによって行う。この穴をＫＯＨ水溶液によってエッチングを行い、これにより，１０ｕｍ四方のＳｉＮ膜のみを残した構造体を作製する。ここにＺＥＰを塗布し，上から４０ｎｍ径の穴を電子線描画し，その形状をＲＩＥによって貫通させることで作製する。

（化学物質の検出）
図４（ａ）にｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が微小貫通孔１０７を通過したときに検出される電流の波形を示す。ここでは、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８を混入した電解液を第二のチャンバー１１２と第三のチャンバー１１３の両方での電極間に流して得られた電流の波形を示している。ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が微小貫通孔１０７を通過すると、パルス状の波形が出現した。

化学物質が投与されると、脂質二重膜に存在する膜タンパク質群でｃＡＭＰが産生される。そのｃＡＭＰがあらかじめ第二のチャンバー１１２内に保持したｃＡＭＰ結合型タンパク質７００と結合し、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８を形成する。

微小貫通孔１０７を通過すると、パルス状の電流波形が検出される。微小貫通孔１０７はｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８の大きさとほぼ同じ大きさで設計されているため、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が１分子ずつしか通過できない。そのため、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が１分子ずつ微小貫通孔１０７を通過したときに、１つのパルス状の電流波形が発生すると考えられる。よって、パルス状の電流波形の頻度を検出することによって、産生されたｃＡＭＰを検知また定量することができる。

図４（ｂ）には、化学物質（イソプロテレノール）が投与される前の電流に見られるパルス波形の頻度を示している。縦軸に頻度、横軸にパルス波形の大きさを示している。図４（ｃ）には、化学物質（イソプロテレノール）が投与された後の電流に見られるパルス波形の頻度を示している。化学物質が投与された結果、ｃＡＭＰが多く産生され、あらかじめ保持したｃＡＭＰ結合型タンパク質と結合し、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８を形成してその結果、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が微小貫通孔１０７を通過したときに発生するパルス状の波形の頻度が増加する。電流に現れるパルス状の波形の頻度について、化学物質投与前（図４（ｂ））と投与後（図４（ｃ））を比較することにより、投与された化学物質の検出と定量が可能である。

次に、本発明の実施例２について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。なお、化学物質受容体発現細胞の作製、プロテオリポソームの作製、および、化学物質検出デバイスの作製については実施例１と同じ要領で作製した。

（化学物質の検出）
図６（ｂ）および（ｂ）に、ｃＡＭＰ結合型タンパク質７００およびｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が微小貫通孔１０７を通過したときに検出される電流の波形を示す。図６（ｂ）では、ｃＡＭＰ結合型タンパク質７００だけを混入した電解液を流して得られた電流の波形を示している。一方、図６（ｂ）では、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８だけを混入した電解液を流して得られた電流の波形を示している。いずれの場合も、パルス状の波形を観察することができた。図６（ｂ）と図６（ｂ）で観察されたパルス状の波形の大きさを比較すると、ｃＡＭＰ結合型タンパク質７００由来の波形の方が、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８由来の波形よりも大きくなることがわかる。

このことから、電流に見られるパルス状の波形の大きさによって、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８由来の波形か、ｃＡＭＰ結合型タンパク質７００由来の波形かを区別できる。

化学物質が投与されると、脂質二重膜に存在する膜タンパク質群でＡＴＰが脱リン酸化してｃＡＭＰが産生される。もともと存在するｃＡＭＰ結合型タンパク質７００およびｃＡＭＰ結合型タンパク質に産生されたｃＡＭＰが結合した複合体１０８が微小貫通孔１０７を通過すると、パルス状の電流波形が検出される。図６（ｂ）および（ｂ）で示したとおり、ｃＡＭＰ結合型タンパク質７００およびｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が通過したときに発生するパルス状の電流波形の大きさは、通過する物体の大きさと微小貫通孔１０７との大きさの関係と関連がある。これは、ｃＡＭＰ結合型タンパク質７００にｃＡＭＰが結合することでタンパク質全体のかさ高さが小さくなり、その結果微小貫通孔１０７の溶液抵抗の増加度合いが小さくなることから電流の減少度合いが小さくなっていることを示唆している。

このため、ｃＡＭＰ結合型タンパク質７００の通過とｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８の通過を区別してその頻度を検出することが可能である。

図６（ｃ）には、化学物質が投与される前の電流に見られるパルス波形の頻度を示している。縦軸に頻度、横軸にパルス波形の大きさを示す。図４（ｄ）には、化学物質が投与された後の電流に見られるパルス波形の頻度を示している。化学物質が投与された結果、ｃＡＭＰが産生され、その結果ｃＡＭＰ結合型タンパク質７００と結合し、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８を形成する。ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８が微小貫通孔１０７を通過したときに発生するパルス状の波形の頻度が増加する。一方、結合前のｃＡＭＰ結合型タンパク質７００が微小貫通孔１０７を通過したときに発生するパルス状の波形の頻度は多少減少するが、十分量のｃＡＭＰ結合型タンパク質７００が存在することからさほど変化が見られない。よって、電流に現れるｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８由来およびｃＡＭＰ結合型タンパク質由来のパルス状の波形の頻度を区別して検出することによって、より正確に化学物質投与前（図６（ｃ））と投与後（図６（ｄ））のｃＡＭＰの変化を検出することが可能となり、投与された化学物質のより正確な検出と定量ができる。

以上のように、化学物質が化学物質受容体に結合すると、Ｇタンパク質およびアデニル酸シクラーゼが活性し、ＡＴＰが脱リン酸化してｃＡＭＰが産生される。その結果ｃＡＭＰ結合型タンパク質７００と結合し、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８を形成する。ｃＡＭＰ結合型タンパク質７００とｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体１０８は微小貫通孔１０７へ輸送され、微小貫通孔１０７を通過する。このとき、微小貫通孔１０７で計測されていたトンネル電流で発生するパルス状の波形を大きさで区別することによって、正確にｃＡＭＰの変化を検出でき、化学物質の検出と定量が可能となる。

本発明にかかる化学物質検出方法は、簡便な構成で高感度な検出能力を有し、環境ホルモンなどの化学物質センサ等として有用である。また薬品スクリーニング等の用途にも応用できる。

１０１ 脂質二重膜
１０２ 化学物質受容体
１０３ Ｇタンパク質
１０４ アデニル酸シクラーゼ
１０５ 化学物質
１０６ 脂質膜保持層
１０７ 微小貫通孔
１０８ ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した複合体
１１１ 第一のチャンバー
１１２ 第二のチャンバー
１１３ 第三のチャンバー
１２１ 銀／塩化銀電極
１２２ 計測部
２０１ 細胞膜
２０２ ｃＡＭＰ結合型発光タンパク質
２０３ ルシフェリン
７００ ｃＡＭＰ結合型タンパク質
７０１ 蛍光タンパク質
７０２ 改変ＲＬｕｃ（Ｎ末端側）
７０３ 改変ＲＬｕｃ（Ｃ末端側）

Claims (14)

1. 化学物質を検知または定量する方法であって、
   脂質二重膜と前記脂質二重膜の裏側に微小貫通孔を有しており、
   前記脂質二重膜には、化学物質受容体と、Ｇタンパク質と、アデニル酸シクラーゼとを具備しており、
   前記脂質二重膜は、裏側にＡＴＰおよびｃＡＭＰが結合した時に形状変化を引き起こす特性を有するｃＡＭＰ結合型タンパク質を有しており、
   前記方法は、
   検知または定量される化学物質を前記脂質二重膜の表側からさらに供給し、前記化学物質受容体が前記Ｇタンパク質と前記アデニル酸シクラーゼを活性化させ、前記ＡＴＰが脱リン酸化してｃＡＭＰに変化する工程、
   前記ｃＡＭＰとｃＡＭＰ結合型タンパク質が複合体を形成する工程、
   前記微小貫通孔に前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質とｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体とを輸送する工程、
   前記微小貫通孔に前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質あるいはｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体が通過するときに、前記微小貫通孔における溶液抵抗の変化に伴う貫通孔出入り口間の電流の大きさによって、ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体を検出する工程、および
   ｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体の濃度変化に基づいて前記化学物質を検知または定量する工程を有する、化学物質検出方法。
2. 前記微小貫通孔が、直径１０ナノメートル以上のサイズを有する、請求項１に記載の化学物質検出方法。
3. 前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質が、ｎａｎｏ−Ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ）である、請求項１に記載の化学物質検出方法。
4. 前記化学物質受容体が、Ｇタンパク質を活性化するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である、請求項１に記載の化学物質検出方法。
5. 前記化学物質受容体が、ホルモン受容体、神経伝達物質受容体、味覚受容体、嗅覚受容体またはフェロモン受容体である、請求項４に記載の化学物質検出方法。
6. 前記Ｇタンパク質が、Ｇｓタンパク質である、請求項１に記載の化学物質検出方法。
7. 前記Ｇタンパク質が、Ｇｓタンパク質のαサブユニットである、請求項６に記載の化学物質検出方法。
8. 化学物質を検知または定量する方法であって、
   脂質二重膜と前記脂質二重膜の裏側に微小貫通孔を有しており、
   前記脂質二重膜には、化学物質受容体と、Ｇタンパク質と、アデニル酸シクラーゼとを具備しており、
   前記脂質二重膜は、裏側にＡＴＰおよびｃＡＭＰが結合した時に形状変化を引き起こす特性を有するｃＡＭＰ結合型タンパク質を有しており、
   前記方法は、
   検知または定量される化学物質を前記脂質二重膜の表側からさらに供給し、前記化学物質受容体が前記Ｇタンパク質と前記アデニル酸シクラーゼを活性化させ、前記ＡＴＰが脱リン酸化してｃＡＭＰに変化する工程、
   前記ｃＡＭＰと前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質が複合体を形成する工程、
   前記微小貫通孔に前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質とｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体とを輸送する工程、
   前記微小貫通孔に前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質とｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体とが通過するときに、前記微小貫通孔で計測される溶液抵抗の変化の大きさによって、前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質とｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体とを区別して測定する工程、および
   前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質およびｃＡＭＰ結合型タンパク質にｃＡＭＰが結合した前記複合体との濃度変化に基づいて前記化学物質を検知または定量する工程
   を有する、化学物質検出方法。
9. 前記微小貫通孔が、直径１０ナノメートル以上のサイズを有する、請求項８に記載の化学物質検出方法。
10. 前記ｃＡＭＰ結合型タンパク質がｎａｎｏ−Ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ）である、請求項８に記載の化学物質検出方法。
11. 前記化学物質受容体が、Ｇタンパク質を活性化するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である、請求項８に記載の化学物質検出方法。
12. 前記化学物質受容体が、ホルモン受容体、神経伝達物質受容体、味覚受容体、嗅覚受容体またはフェロモン受容体である、請求項１１に記載の化学物質検出方法。
13. 前記Ｇタンパク質が、Ｇｓタンパク質である、請求項８に記載の化学物質検出方法。
14. 前記Ｇタンパク質が、Ｇｓタンパク質のαサブユニットである、請求項１３に記載の化学物質検出方法。

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