WO2021066179A1 - 計測器具及びそれを用いた標的物質の計測方法 - Google Patents

計測器具及びそれを用いた標的物質の計測方法 Download PDF

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target substance
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山田　哲也
寿久 大崎
久敏 三村
広峻 杉浦
昌治 竹内
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地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a measuring instrument for measuring a target substance using a lipid bilayer membrane, a measuring method for the target substance using the measuring instrument, and a stirring method for droplets filled in the measuring instrument.
  • Non-Patent Document 1 a specified amount of target substance is dissolved in water to prepare a sample, which is mixed with an aqueous solution infiltrating receptors and cells.
  • Patent Document 1 Non-Patent Documents 2 to 4.
  • the problem is the poor solubility of the target substance (or a low partition coefficient between gas and liquid).
  • the diffusion coefficient in the solution is about 10 -9 m 2 / s, and it takes a long time for the entire aqueous solution to reach vapor-liquid equilibrium in free diffusion. It is considered that the time until the substance reaches a sufficient concentration is also extended, and the detection time is lengthened (or the sensitivity is lowered).
  • volatile molecules detected by artificial cell membrane sensors using agarose gel but once the target substance dissolved in the aqueous solution stays, dynamic concentration changes are detected. It was difficult to do.
  • An object of the present invention is a measuring instrument capable of efficiently introducing a target substance into a droplet in a measurement using a lipid bilayer film, a measuring method of the target substance using the measuring instrument, and filling the measuring instrument. It is to provide a method of stirring droplets.
  • the inventors of the present application provided a gas flow path having a hydrophobic surface in a container filled with droplets in the measurement of a target substance using a lipid bilayer film, and placed the target substance in the gas flow path.
  • the target substance can be efficiently introduced into the droplets by circulating the gaseous sample containing the mixture, and completed the present invention.
  • the present invention provides the following.
  • (1) The first container and the second container arranged adjacent to each other, A measuring instrument provided with a partition wall provided between the first and second containers and having a partition wall having a through hole forming a lipid bilayer film.
  • a gas flow path having a hydrophobic surface is formed in at least one of the first and second containers, and the gas flow path has an inlet and an outlet, and the inlet and the outlet are each measured. It communicates with the outside of the appliance, the gas flow path is open in the container in which it is provided, and the gas flowing in the gas flow path comes into contact with the droplets filled in the container. Measuring instrument.
  • (2) The measuring instrument according to (1), which is provided with a plurality of the gas flow paths.
  • a plurality of units consisting of the measuring instruments according to any one of (1) to (5) are provided, and the inlets of the gas flow paths of each unit communicate with each other via each gas introduction path for use.
  • a method for measuring a target substance wherein a lipid bilayer film is formed on the surface of the lipid bilayer membrane, and a gaseous sample containing the target substance is circulated through the gas flow path for measurement.
  • the first and second containers are filled with droplets and the through holes are filled with the lipid.
  • the target substance can be efficiently diffused into the droplet. Further, the target substance in the droplet can be removed by passing a gas containing no target substance through the gas flow path. By adding a new sample containing the target substance again after removing the target substance, it becomes possible to detect a dynamic concentration change of the target substance in the sample. Further, by passing the gas through the gas flow path, the droplets that the gas flow path contacts can be agitated. As specifically shown in the examples below, agitation of droplets significantly increases the efficiency of signal detection.
  • FIG. 1 It is a schematic plan view of the measuring instrument of this invention. It is an end view of the bb'cut portion of FIG. 1 (a). It is a schematic plan view of one specific example of the measuring instrument of this invention produced in the following Example. It is the figure which connected the circuit to the measuring instrument of FIG. 2 (a). It is a schematic plan view which shows the lower substrate used for manufacturing the measuring instrument shown in FIG. It is a schematic plan view which shows the upper substrate used for manufacturing the measuring instrument shown in FIG. Comparing the time course of the octenor concentration in the droplet when the octenor gas was circulated in the gas flow path and when the octenor gas was naturally diffused in the droplet, which was carried out in the following Examples and Comparative Examples.
  • the drawing showing the measuring instrument is a schematic diagram for explaining the invention, and the dimensional ratio of each part is different from that of the actual measuring instrument.
  • FIG. 1 (a) is a schematic plan view of a measuring instrument in the form of a double-well chamber (DWC), which is a preferred embodiment of the present invention
  • FIG. 1 (b) is b- in FIG. 1 (a).
  • b'Cut end view The DWC has two wells arranged adjacent to each other in the substrate, and is well known as a measuring instrument using a lipid bilayer membrane, and is also described in Patent Document 1 and the like.
  • the instruments shown in FIG. 1 are a substrate 10, a first well 14 which is a first container provided in the substrate 10, and a second container provided in the substrate 10 and adjacent to the well 14.
  • a partition wall 12 is provided between the well 16 and the well 14 and the well 16 and separates the well 16.
  • a through hole 18 is provided in the partition wall 12 to form a lipid bilayer film at the time of use (see FIG. 1 (b)).
  • a plurality of groove-shaped gas flow paths 20 are formed on the bottom surface of the well 14.
  • the number of the gas flow paths 20 may be one, but it is preferable that there are a plurality of gas flow paths 20 because the contact between the gas and the droplets can be increased.
  • the number of gas flow paths 20 is not particularly limited, but is preferably about 1 to 50.
  • the width of the gas flow path 20 is usually about 0.001 mm to 2 mm, preferably about 0.01 mm to 0.5 mm, and the depth is usually about 0.01 mm to 2 mm, preferably about 0.2 mm to 0.8 mm. ..
  • Each gas flow path 20 has an inlet and an outlet, respectively, and the gas flow enters from the inlet and exits from the outlet during use.
  • Each inlet communicates with the gas introduction path 22, and each outlet communicates with the gas discharge path 24.
  • the gas introduced from the gas introduction path 22 at the time of use enters each gas flow path 20 from the inlet of each gas flow path and enters each gas flow path 20 from each outlet of each gas flow path 20 as shown by an arrow in FIG. 1 (a). It is discharged to the gas discharge path 24.
  • each well of the DWC may be the same as the conventional one, and the diameter is usually about 1 mm to 10 mm, preferably about 2 mm to 6 mm, and the depth is usually about 1 mm to 10 mm, preferably about 1 mm to 10 mm. It is about 2 mm to 6 mm. Further, the diameter of the through hole 18 in the partition wall 12 is also the same as the conventional one, and is usually about 0.5 ⁇ m to 1000 ⁇ m, preferably about 10 ⁇ m to 600 ⁇ m.
  • Each gas flow path 20 has at least a hydrophobic surface. Due to this hydrophobicity, even if the well 14 is filled with droplets during use, each gas flow path 20 is not blocked by the liquid, and a space through which the gas flows is maintained. Hydrophobicity can be easily imparted by hydrophobizing the gas flow path 20.
  • the hydrophobizing treatment can be performed, for example, by applying a fluorine-based coating agent.
  • a lower substrate formed by cutting a gas flow path 20, a gas introduction path 22 and a gas discharge path 24 and an upper substrate constituting the side surfaces of the wells 14 and 16 are bonded to each other, and the wells 14 are formed.
  • 16 can be manufactured by inserting and installing the partition wall 12.
  • the partition wall 12 is inserted by forming a groove or a hole (42 in FIG. 4) into which the partition wall 12 is inserted in the adjacent portion between the first well 14 and the second well 16, and then inserting the partition wall 12 into the groove or hole (42 in FIG. 4). It can be carried out.
  • the partition wall 12 is preferably made of a parylene film or the like that easily forms small through holes.
  • the gas flow path 20 can be easily formed by cutting a groove on the bottom surface of the well 14, but the gas flow path 20 is not limited to this, and a fibrous, porous, plate-like, or columnar member can be formed. It can also be formed by arranging it on the bottom surface or the like. Further, the gas flow path 20 does not need to be formed on the bottom surface, and may be formed on the side surface of the well, or the top of the well may be covered with a lid and formed on the lower surface of the lid. However, it is easy and preferable to form it on the bottom surface by cutting. Further, in the above embodiment, the gas flow path is formed only in the first well 14, but may be formed in the second well 16.
  • each well is formed with through holes (38 and 40 in FIG. 3) for connecting electrodes, and during use, each electrode comes into contact with a droplet filled in each well.
  • a circuit for applying a predetermined voltage between both wells to amplify and measure the flowing current is connected to each electrode.
  • Such circuits are well known and are specifically described in the examples below (see FIG. 2 (b)).
  • a lipid bilayer film is formed in the through hole 18 in the partition wall 12 by a well-known droplet contact method.
  • a method for forming a lipid bilayer membrane is well known and is also described in Patent Document 1.
  • the protein When a receptor protein or the like to be reconstituted in the lipid bilayer membrane is added to the liquid to be filled in one of the wells, the protein is naturally reconstituted (retained) in the lipid bilayer membrane.
  • the protein include, but are not limited to, various receptor proteins, peptide proteins such as ⁇ -hemolysin, grammicidin, and aramethicin, various ion channels, and ABC transporter proteins.
  • the sample gas containing the target substance is introduced from the gas introduction path 22.
  • the sample gas can be introduced into the gas introduction path 22 by a pump, a syringe, or the like.
  • the sample gas flows through each gas flow path 20 and is discharged from the gas discharge path 24.
  • the target substance in the sample gas flowing through each gas flow path 20 diffuses into the droplets filled in the well 14. In this state, the target substance in the sample gas can be detected by measuring the current flowing between both wells.
  • the amount of gas introduced into the gas flow path 20 is not particularly limited and can be appropriately selected, but the flow velocity of the gas introduced into the gas introduction path 20 is usually 0.001 / min to 3 L / min, preferably 0.001 / min. It is 0.05 L / min to 1 L / min.
  • the diffusion rate of the target substance diffused into the droplet from the gas flow path 20 is much higher than the natural diffusion in the conventional method. Therefore, the measurement can be performed efficiently.
  • the target substance contained in the droplet is formed by flowing a gas containing no target substance, for example, nitrogen gas which is an inert gas, through the gas flow path 20. Can be removed at least partially. After this removal, the sample gas containing the target substance is circulated again, so that the change in the concentration of the target substance in the sample gas over time can be continuously measured.
  • the droplets in contact with the gas flow path 20 are agitated by passing the gas through the gas flow path 20.
  • a method of stirring in a small droplet has not been known. Therefore, according to the present invention, in the measurement of the target substance using the measuring instrument of the present invention described above, the first and second containers are filled with droplets to form the lipid bilayer film on the instrument, and the gas is formed.
  • the present invention also provides a method for stirring droplets in measurement using a lipid bilayer membrane, which agitates droplets in contact with the gas flow path by circulating the liquid in the gas flow path.
  • the signal detection efficiency is greatly increased by the agitation of the droplets, so that the agitation by gas introduction greatly improves the efficiency of the measurement using the lipid bilayer membrane. It is something that makes you.
  • one DWC is formed in the substrate 10, but a plurality of DWCs are formed in a single substrate, and each of the gas introduction paths 22 is merged into one flow path.
  • the same gas can be circulated to each DWC at the same time, and measurement can be performed at the same time (see Examples and FIG. 4 below).
  • the gas is introduced into the gas introduction path 22 of each DWC, and each gas flow path is introduced. It is discharged from the gas discharge path 24 through 20.
  • Each gas discharge path 24 merges into a gas discharge trunk line (30, 34 in FIG. 2), and is discharged from the substrate 10.
  • the detection efficiency of the target substance can be improved and the time required for the detection operation can be shortened. can do.
  • Example 1 1.
  • a measuring instrument was prepared in which 16 DWCs described above were provided in the substrate 10 with reference to FIG. 1 (FIG. 2).
  • Each DWC comprises a first well 14, a second well 16, and a partition wall 12, as described above.
  • the groove-shaped gas flow path described above is provided on the bottom surface of the first well 14.
  • the gas introduction paths 22 merge to form a gas introduction trunk path 26, and the gas introduction trunk path 26 communicates with the gas introduction hole 28.
  • the gas discharge paths 24 of the eight DWCs located in the lower half of FIG. 2 merge to form the gas discharge trunk line 30, which communicates with the gas discharge hole 32.
  • the gas discharge passages 24 of the eight DWCs located in the upper half of FIG. 2 merge to form a gas discharge trunk line 34, which communicates with the gas discharge hole 36.
  • the measuring instrument shown in FIG. 2 was manufactured as follows. As shown in FIG. 3, first, a lower substrate 10a made of an acrylic plate having a thickness of 1 mm was prepared. A plurality of groove-shaped gas flow paths were formed by cutting in a region to be the bottom surface of the first well 14 in parallel with each other. The gas flow path was cut using a mill with a diameter of 0.2 mm to a depth of 0.5 mm. The distance between each groove-shaped gas flow path was 0.3 mm. In addition, the length of the groove-shaped gas flow path is 3 mm to 8 mm, and it is processed so as to be oval as a whole.
  • Through holes 38 and 40 having a diameter of 0.56 mm for inserting electrodes were formed in the center of the region to be the bottom surface of the first well 14 and the center of the region to be the bottom surface of the second well 16, respectively.
  • the gas introduction path 22, the gas introduction trunk path 26, the gas discharge path 24, and the gas discharge trunk paths 30 and 34 were cut into the shapes shown in FIG. These gas flow paths were formed by cutting with a mill having a diameter of 0.5 mm and having a depth of 0.5 mm. Further, a flow path having a depth of 0.8 mm was cut at the inlet portion of each gas flow path with a mill having a diameter of 1 mm, and the inlet of each gas flow path was communicated with the gas introduction path 22. Similarly, a flow path having a depth of 0.8 mm was cut at the outlet portion of each gas flow path with a mill having a diameter of 1 mm, and the outlets of each gas flow path were communicated with each other and connected to the gas discharge path 24.
  • an upper substrate 10b made of an acrylic plate having a thickness of 3 mm was prepared.
  • Through holes (diameter 4.0 mm) to be the first wells 14 and the second wells 16 were formed by cutting. Further, a pair of through holes 42 (diameter 1.0 mm) for inserting the partition wall 12 are formed at the connection portion of each well.
  • the lower substrate 10a shown in FIG. 3 and the upper substrate 10b shown in FIG. 4 were laminated and thermocompression bonded.
  • the partition wall 12 made of parylene film was inserted into the pair of through holes 42.
  • the partition wall 12 is provided with 11 through holes having a diameter of 100 ⁇ m for forming a lipid bilayer film.
  • the bottom surface of the first well was treated with a hydrophobizing agent to hydrophobize the groove-shaped gas flow path.
  • As the hydrophobizing agent SFE-B002H (AGC Seimi Chemical Co., Ltd.) was used, and 3 to 6 ⁇ L of this was added dropwise to the well having a groove to perform hydrophobization treatment.
  • FIG. 2 (b) The voltage application and amplifier circuit is shown in FIG. 2 (b).
  • the circuit is connected to only one DWC on the upper right, but in reality, the same circuit is connected to all 16 DWCs.
  • Example 2 Confirmation test of whether gas is uniformly introduced into 16 DWCs
  • Example 3 and Comparative Example 1 Confirmation test for improvement of introduction efficiency of target substance by gas flow
  • Nitrogen gas was injected at a flow rate of 0.5 L / min from the gas introduction hole 28 of the device prepared in Example 1.
  • 5 ⁇ L of the same lipid solution as in Example 2 was added dropwise to the second well, and 23 ⁇ L of the same buffer 1 as in Example 2 was added dropwise to the second well.
  • 28 ⁇ L of buffer 1 was added dropwise to the first well.
  • a lipid bilayer film was formed in the through holes 18 in the partition wall 12.
  • the octenol concentration in the droplets in the first well was more than 3 times higher than that in Comparative Example 1, and was almost saturated 10 minutes after the start of injection. ..
  • the octenol concentration in the case of Comparative Example 1 was 15 ppm, which was three times the concentration in the case of Example 3 (5 ppm) in which the octenol was contained in the distribution gas, but such a result was obtained. This confirmed that the target substance in the flowing gas was diffused into the droplets in the first well much more efficiently than in the case of natural diffusion.
  • Example 4 Comparative Example 2 Improvement confirmation test of introduction efficiency of target substance by gas distribution and 16 channels (16 DWCs are provided)
  • Nitrogen gas is 0.25 L / L from the gas introduction hole 28 of the device manufactured in Example 1. It was injected at a flow rate of minutes. 5 ⁇ L of the same lipid solution as in Example 2 was added dropwise to the second well, and 23 ⁇ L of a solution containing liposomes containing the olfactory receptor protein was added dropwise to the same buffer 1 as in Example 2. On the other hand, 28 ⁇ L of the same buffer 1 as in Example 2 was added dropwise to the first well. As a result, a lipid bilayer membrane was formed in the through hole 18 in the partition wall 12, and the olfactory receptor protein was reconstituted in the lipid bilayer membrane.
  • Example 5 Dynamic continuous detection for about 1 hour Nitrogen gas was injected at a flow rate of 0.5 L / min from the gas introduction hole 28 of the device prepared in Example 1. 5 ⁇ L of the same lipid solution as in Example 2 was added dropwise to the second well, and 23 ⁇ L of a solution containing liposomes containing the olfactory receptor protein was added dropwise to the same buffer 1 as in Example 2. On the other hand, 28 ⁇ L of buffer 1 was added dropwise to the first well. As a result, a lipid bilayer membrane was formed in the through hole 18 in the partition wall 12, and the olfactory receptor protein was reconstituted in the lipid bilayer membrane.
  • the gas to be circulated is octenol gas
  • the octenol concentration in the droplet increases and the open rate also increases
  • nitrogen gas octenol in the droplet increases. It was confirmed that the concentration decreased until it became almost 0, and the open rate also decreased. That is, it was confirmed that the target substance in the droplet can remove the target substance from the droplet by circulating a gas that does not contain the target substance.
  • Example 6 Stirring of Droplet Solution by Introducing Gas Lipid DPhPC (1,2-difitanoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine (DPhPC) / n-decane solution) in the second well of the device prepared in Example 1.
  • 4.2 ⁇ L of (20 mg / mL) was added dropwise.
  • 21 ⁇ L of the solution (KCl 1M, phosphate buffer 10 mM pH 7.0) was added dropwise to the second well.
  • Microbeads polystyrene beads, diameter 75 ⁇ m) were added to the first well.
  • 25 ⁇ L of the containing solution (KCl 1M, phosphate buffer 10 mM pH 7.0) was added dropwise, whereby a lipid double film was formed in the through holes 18 in the partition wall 12.
  • Example 7 Effect of in-solution agitation by gas introduction Nitrogen gas was injected at a flow rate of 0.25 L / min from the gas introduction hole 28 of the device prepared in Example 1.
  • 4.2 ⁇ L of lipid DPhPC / n-decane solution (20 mg / mL) was added dropwise to the second well.
  • 21 ⁇ L of a solution containing 1 nM ⁇ -hemolysin (KCl 1M, phosphate buffer 10 mM pH 7.0) was added dropwise.
  • 25 ⁇ L of a buffer containing 10 ⁇ M cyclodextrin ((KCl 1M, phosphate buffer 10 mM pH 7.0)) was added dropwise to the first well.

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Abstract

計測器具は、互いに隣接して配置される第１の容器及び第２の容器と、第１及び第２の容器間に設けられた隔壁であって、脂質二重膜を形成する透孔を有する隔壁とを具備する。第１及び第２の容器の少なくとも一方に、表面が疎水性であるガス流路が形成されており、ガス流路は、入口と出口を有し、入口及び出口は、それぞれ計測器具の外部に連通しており、ガス流路は、それが設けられている容器内に開口しており、ガス流路内を流れるガスが、容器内に充填される液滴に接触する。

Description

計測器具及びそれを用いた標的物質の計測方法
　本発明は、脂質二重膜を用いて標的物質の計測を行う計測器具並びにそれを用いた標的物質の計測方法及び該計測器具に充填される液滴のかくはん方法に関する。
　嗅覚受容体を脂質二重膜に再構成し、匂い・揮発性有機物のセンサとしての応用を目指す研究が行われている。同様に、生体がもつ高い感度・特異性を利用するため、細胞や組織を用いた匂い・揮発性有機物センサの研究も行われている。
　しかしながら、匂いや揮発性有機物（標的物質）の多くは水に難溶性であり、水溶液中でなければ活性を保てない受容体や細胞に対して標的物質を届ける機構に工夫が必要である。多くの研究では規定量の標的物質を水に溶解してサンプルとし、受容体や細胞を浸潤している水溶液と混合している（非特許文献１）。あるいは、標的物質を受動的に取り込む方法として、アガロースゲルを利用した例がある（特許文献１、非特許文献２～４）。
特開２０１７－０８３２１０号公報
Nobuo Misawa et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 107, 15340, 2010. Satoshi Fujii et al., Lab on a Chip, 17, 2421, 2017. Nobuo Misawa et al., ACS sensors, 4, 711, 2018. Koji Sato et al., Angewandte Chemie International Edition, 53, 11798, 2014..
　受容体等を利用したセンサを形成する水溶液に匂いや揮発性有機物等の標的物質を気相から溶解する場合、問題となるのが標的物質の難溶性（あるいは気液間での低い分配係数）および溶液内の遅い拡散速度である。溶液内の拡散係数はおよそ10-9m2/s程度であり、自由拡散では水溶液内全体が気液平衡に到達するまでには長い時間を要するため、センサ素子である受容体等に標的物質が十分な濃度で届くまでの時間も延び、検出時間が長くなる（あるいは感度が低下する）と考えられる。また、上記のとおり、これまでにアガロースゲルを利用した人工細胞膜センサにより揮発性分子を検出した例はあるが、一度、水溶液内に溶け込んだ標的物質は滞留するため、動的な濃度変化を検出することは困難であった。
本発明の目的は、脂質二重膜を用いた計測において、液滴内に標的物質を効率良く導入させることができる計測器具並びにそれを用いた標的物質の計測方法及び該計測器具に充填される液滴のかくはん方法を提供することである。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、脂質二重膜を用いた標的物質の計測において、液滴を充填する容器に表面が疎水性のガス流路を設け、該ガス流路に標的物質を含むガス状試料を流通させることにより、該液滴内に効率良く標的物質を導入することができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
(1)　互いに隣接して配置される第１の容器及び第２の容器と、
　該第１及び第２の容器間に設けられた隔壁であって、脂質二重膜を形成する透孔を有する隔壁と
を具備する計測器具であって、
　前記第１及び第２の容器の少なくとも一方に、表面が疎水性であるガス流路が形成されており、該ガス流路は、入口と出口を有し、該入口及び出口は、それぞれ前記計測器具の外部に連通しており、該ガス流路は、それが設けられている容器内に開口しており、該ガス流路内を流れるガスが、該容器内に充填される液滴に接触する、計測器具。
(2)　複数の前記ガス流路が設けられている、(1)記載の計測器具。
(3)　前記ガス流路は、溝状の流路である(1)又は(2)記載の計測器具。
(4)　前記ガス流路は、前記第１及び第２の容器の少なくとも一方の底面に設けられている、(1)～(3)のいずれか１項に記載の計測器具。
(5)　前記第１及び第２の容器が、基板内に設けられたダブルウェルチャンバーの形態にある、(1)～(4)のいずれか１項に記載の計測器具。
(6)　(1)～(5)のいずれか１項に記載の計測器具からなるユニットを複数具備し、各ユニットの各ガス流路の入口が各ガス導入路を介して互いに連通し、使用時には各ユニットに同時にガスを供給できる、計測器具。
(7)　(1)～(6)のいずれか１項に記載の計測器具を用いた標的物質の計測方法であって、前記第１及び第２の容器に液滴を充填して前記透孔に前記脂質二重膜を形成し、標的物質を含むガス状の試料を前記ガス流路に流通させながら計測を行う、標的物質の計測方法。
(8)　標的物質を含まないガスを前記ガス流路に流通させ、前記液滴中の標的物質を除去する工程をさらに含む(7)記載の方法。
(9)　(1)～(6)のいずれか１項に記載の計測器具を用いた標的物質の計測において、前記第１及び第２の容器に液滴を充填して前記透孔に前記脂質二重膜を形成し、ガスを前記ガス流路に流通させて、該ガス流路と接触する液滴のかくはんを行う、脂質二重膜を用いた計測における液滴のかくはん方法。
　本発明の計測器具を用いて計測を行うことにより、液滴内に標的物質を効率良く拡散させることができる。また、標的物質を含まないガスをガス流路に流通させることにより、液滴内の標的物質を除去することもできる。標的物質を除去後に再度、標的物質を含む新たな試料を加えることにより、試料中の標的物質の動的な濃度変化を検出することも可能になる。さらに、ガスをガス流路に流通させることにより、該ガス流路が接触する液滴をかくはんすることもできる。下記実施例に具体的に示されるように、液滴のかくはんにより、シグナルの検出効率が大幅に増大する。
本発明の計測器具の模式平面図である。 図１（ａ）のｂ-ｂ'切断部端面図である。 下記実施例で作製した、本発明の計測器具の一具体例の模式平面図である。 図２（ａ）の計測器具に回路を接続した図である。 図２に示す計測器具の作製に用いた下部基板を示す模式平面図である。 図２に示す計測器具の作製に用いた上部基板を示す模式平面図である。 下記実施例及び比較例で行った、ガス流路にオクテノールガスを流通させた場合と、液滴にオクテノールガスを自然拡散させた場合の液滴内のオクテノール濃度の経時変化を比較して示す図である。 下記実施例及び比較例で行った、本発明の実施例になる、１６チャネルのデバイスを用いた場合と、従来の１チャネルのデバイスを用いた場合の計測時間とシグナル検出確率との関係を示す図である。 下記実施例において行った、導入ガスをオクテノールガスから窒素ガスに変更し、再びオクテノールガスに変更し、再び窒素ガスに変更した場合の、時間と液滴内のオクテノール濃度又はイオンチャネルのオープン率との関係を示す図である。 下記実施例において行った、窒素ガスを導入した場合と、導入を止めた場合における、α－ヘモリシンのナノポアをシクロデキストリンが閉塞する頻度を調べた結果を示す図である。
　以下、図面に基づき、本発明の好ましい実施形態について説明する。なお、計測器具を図示している図面は、発明を説明するための模式図であり、現実の計測器具とは各部分の寸法比率は異なる。
　図１(a)は、ダブルウェルチャンバー(DWC)の形態にある、本発明の好ましい一実施形態になる計測器具の模式平面図、図１(b)は、図１(a)中のb-b'切断部端面図である。なお、DWCは、基板中に２つのウェルを隣接して配置したもので、脂質二重膜を用いる計測器具として周知のものであり、特許文献１等にも記載されている。図１に示す器具は、基板１０と、基板１０内に設けられた第１の容器である第１のウェル１４と、基板１０内に設けられ、ウェル１４に隣接する第２の容器である第２のウェル１６と、ウェル１４とウェル１６の間に設けられ、これらを隔てる隔壁１２を具備する。隔壁１２内には、使用時に脂質二重膜を形成する透孔１８が設けられている（図１(b)参照）。ウェル１４の底面には、溝状のガス流路２０が複数形成されている。ガス流路２０の数は１本でもよいが、複数ある方が、ガスと液滴との接触を増やすことができるので好ましい。ガス流路２０の数は、特に限定されないが、好ましくは、1本～50本程度である。また、ガス流路２０の幅は、通常、0.001 mm～2 mm程度、好ましくは0.01 mm～0.5 mm程度、深さは通常、0.01 mm～2 mm程度、好ましくは0.2 mm～0.8 mm程度である。各ガス流路２０はそれぞれ入口と出口を有し、使用時にガス流は入口から入って出口から出る。各入口は、ガス導入路２２に連通しており、各出口はガス排出路２４に連通している。使用時にガス導入路２２から導入されたガスは、図１(a)の矢印で示されるように、各ガス流路の入口から各ガス流路２０に入り、各ガス流路２０の各出口からガス排出路２４に排出される。なお、DWCの各ウェルのサイズは、従来と同様でよく、直径が通常、1 mm～10 mm程度、好ましくは2 mm～6 mm程度、深さが通常、1 mm～10 mm程度、好ましくは2 mm～6 mm程度である。また、隔壁１２内の透孔１８の直径も従来と同様であり、通常、0.5 μm～1000μm程度、好ましくは10 μm～600 μm程度である。
　各ガス流路２０は、少なくともその表面が疎水性である。この疎水性により、使用時にウェル１４内に液滴を充填しても、各ガス流路２０が液で塞がれることがなく、ガスが流通するスペースが維持される。疎水性は、ガス流路２０を疎水化処理することにより容易に付与することができる。疎水化処理は、例えば、フッ素系コーティング剤を塗布することにより行うことができる。
　図１に示すDWCは、ガス流路２０、ガス導入路２２及びガス排出路２４を切削加工により形成した下部基板と、各ウェル１４、１６の側面を構成する上部基板を貼り合わせ、各ウェル１４、１６の間に隔壁１２を挿入して設置することにより作製することができる。隔壁１２の挿入は、第１のウェル１４と第２のウェル１６の隣接部に隔壁１２を挿入する溝又は孔（図４の４２）を形成しておき、ここに隔壁１２を挿入することにより行うことができる。なお、隔壁１２は、公知のとおり、小さな透孔を形成しやすいパリレンフィルム等により構成することが好ましい。
　ガス流路２０は、ウェル１４の底面に溝を切削加工することにより容易に形成することができるが、これに限定されるものではなく、繊維状や多孔質状、板状、柱状の部材を底面上に配置したりすること等によっても形成することができる。また、ガス流路２０は、底面に形成する必要はなく、ウェルの側面に形成してもよいし、ウェルの頂部を蓋で覆い、該蓋の下面に形成することも可能である。もっとも底面に切削加工により形成することが容易で好ましい。また、上記実施形態では、ガス流路は第１のウェル１４内にのみ形成したが、第２のウェル１６内にも形成してもよい。
　また、周知のとおり、各ウェルには、電極を接続する透孔（図３の３８及び４０）が形成されており、使用時には、各電極が、各ウェル内に充填される液滴と接触し、両ウェル間に所定の電圧を印加し、流れる電流を増幅して計測する回路が各電極に接続される。このような回路は周知であり、下記実施例にも具体的に記載されている（図２(b)参照）。
　使用時には、周知の液滴接触法により、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜を形成する。脂質二重膜の形成方法は周知であり、特許文献１にも記載されている。一方のウェルに充填する液に、脂質二重膜に再構成すべき受容体タンパク質等を添加しておくと、脂質二重膜に該タンパク質が自然に再構成（保持）される。タンパク質としては、各種受容体タンパク質、α－ヘモリシン、グラミシジン、アラメチシンなどのペプチドタンパク質類、各種イオンチャンネル、ABCトランスポータタンパク質等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
　脂質二重膜形成後、ガス導入路２２から、標的物質を含む試料ガスを導入する。試料ガスは、ポンプやシリンジ等により、ガス導入路２２に導入することができる。これにより、各ガス流路２０に試料ガスが流通し、ガス排出路２４から排出される。この際、各ガス流路２０を流れる試料ガス中の標的物質が、ウェル１４内に充填されている液滴内に拡散する。この状態で、両ウェル間に流れる電流を測定することにより、試料ガス中の標的物質を検出することができる。ガス流路２０に導入するガスの量は、特に限定されず、適宜選択することができるが、ガス導入路２０に導入するガスの流速として、通常、0.001 /分～3 L/分、好ましくは0.05 L/分～1 L/分である。
　下記実施例において具体的に記載するように、ガス流路２０から液滴内に拡散する標的物質の拡散速度は、従来法における自然拡散と比べてはるかに大きい。このため、効率良く計測を行うことができる。また、下記実施例により明らかになったとおり、ガス流路２０に、標的物質を含まないガス、例えば、不活性なガスである窒素ガス等を流通させることにより、液滴中に含まれる標的物質を少なくとも部分的に除去することができる。この除去後、再度、標的物質を含む試料ガスを流通させることにより、試料ガス中の標的物質の経時的な濃度変化を連続的に計測することも可能になる。
　さらに、下記実施例に具体的に記載するように、ガス流路２０内にガスを流通させることにより、ガス流路２０と接触する液滴がかくはんされることが明らかになった。従来、脂質二重膜を用いた計測において、小さな液滴内のかくはんを行う方法は知られていなかった。したがって、本発明は、上記した本発明の計測器具を用いた標的物質の計測において、前記第１及び第２の容器に液滴を充填して前記器具に前記脂質二重膜を形成し、ガスを前記ガス流路に流通させて、該ガス流路と接触する液滴のかくはんを行う、脂質二重膜を用いた計測における液滴のかくはん方法をも提供するものである。なお、下記実施例に具体的に示されるように、液滴のかくはんにより、シグナルの検出効率が大幅に増大するので、ガス導入によるかくはんは、脂質二重膜を用いる計測の効率を大幅に向上させるものである。
　なお、上記の実施形態では、基板１０内にDWCが１個形成されているが、単一の基板内にDWCを複数形成し、それらの各ガス導入路２２を１つの流路に合流させ、各DWCに同時に同じガスを流通させて、同時に計測を行うこともできる（下記実施例及び図４参照）。この場合、各ガス導入路が合流している大元のガス導入幹路（図２の２６）にガスを導入することにより、各DWCのガス導入路２２にガスが導入され、各ガス流路２０を通って、ガス排出路２４から排出される。各ガス排出路２４は合流してガス排出幹路（図２の３０、３４）となり、基板１０から排出される。
　このように、第１の容器、第２の容器、隔壁を含むユニットを複数連結して同時に計測を行うことにより、標的物質の検出効率を向上させることができ、検出操作に必要な時間を短縮することができる。
　以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
１．計測器具の作製
　図１を参照して上記したDWCを基板１０内に１６個設けた計測器具を作製した（図２）。各DWCは、上記のとおり、第１のウェル１４と、第２のウェル１６と、隔壁１２を具備する。第１のウェル１４の底面には、上記した溝状のガス流路が設けられている。各ガス導入路２２は合流してガス導入幹路２６となり、ガス導入幹路２６はガス導入孔２８に連通している。一方、図２の下半分に位置する８個のDWCの各ガス排出路２４は合流してガス排出幹路３０となり、ガス排出孔３２に連通している。同様に、図２の上半分に位置する８個のDWCの各ガス排出路２４は合流してガス排出幹路３４となり、ガス排出孔３６に連通している。
　図２に示す計測器具は、次のようにして作製した。図３に示すように、まず、厚さ1mmのアクリル板から成る下部基板10aを準備した。第１のウェル１４の底面となる領域に、互いに平行に複数の溝状のガス流路を切削加工して形成した。ガス流路は、直径0.2mmのミルを用いて切削し、深さ0.5mmとした。溝状の各ガス流路の間隔は0.3mmとした。また、溝状のガス流路の長さは3 mm～8 mmであり、全体として長円状になるように加工した。第１のウェル１４の底面となる領域の中央及び第２のウェル１６の底面となる領域の中央に、それぞれ電極挿入用の、直径0.56mmの透孔３８及び４０を形成した。さらに、ガス導入路２２、ガス導入幹路２６、ガス排出路２４、ガス排出幹路３０、３４を図３に示す形状に切削加工した。これらのガス流路は、直径0.5mmのミルで切削加工して形成し、深さは0.5mmとした。さらに、各ガス流路の入口部分に、直径1mmのミルで深さ0.8mmの流路を切削加工して、各ガス流路の入口を連通させ、ガス導入路２２と接続した。また、同様に、各ガス流路の出口部分に、直径1mmのミルで深さ0.8mmの流路を切削加工して、各ガス流路の出口を連通させ、ガス排出路２４と接続した。
　一方、図４に示すように、厚さ3mmのアクリル板から成る上部基板10bを準備した。第１のウェル１４及び第２のウェル１６である各ウェルとなる透孔(直径4.0 mm）を切削加工により形成した。さらに、隔壁１２を挿入するための透孔４２(直径1.0 mm）を、各ウェルの接続部にそれぞれ一対ずつ形成した。
　図３に示す下部基板10aと図４に示す上部基板10bとを積層して熱圧着した。この状態で、一対の透孔４２にパリレンフィルムから成る隔壁１２を挿入した。なお、隔壁１２内には、脂質二重膜を形成するための、直径100 μmの透孔が11個設けられている。さらに、この状態で、第１のウェルの底面を疎水化剤で処理し、溝状のガス流路を疎水化した。なお、疎水化剤としては、エスエフコート　SFE-B002H　（AGCセイミケミカル株式会社）を用い、これを溝を有するウェルに３～6μL滴下することにより、疎水化処理を行った。以上の操作により、本発明の計測器具を作製した。
　さらに、電極挿入用の透孔３８、４０にそれぞれ電極を挿入し、各第２のウェルを接地し、各第１のウェルに電圧印加及び増幅回路を接続した。電圧印加及び増幅回路を図２(b)に示す。なお、図２(b)では、簡潔性のために右上の１個のDWCのみに回路が接続されているが、実際には、１６個のDWCの全てについて、それぞれ同様な回路を接続した。
実施例２　１６個のDWCにガスが均一に導入されるか否かの確認試験
　第２のウェルに、脂質DOPC(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン):DOPE（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)混合物（質量比1:3 , 20 mg/ml濃度でn-デカンに溶解) を5μL滴下した。次いで、第２のウェルにバッファー１を23μL滴下した。バッファー１の組成は、NaCl(96 mM), KCl(2mM), MgCl2(5mM), CaCl2(0.8mM) HEPES(5 mM)/pH7.6であった。一方、第１のウェルにフェノールフタレイン 0.1 w/vol%水溶液を28μL滴下した。これにより、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜を形成した。
　一方、アンモニア溶液（２５％）1mLをバイアルに入れて密閉した。バイアルの気相部位からシリンジでアンモニアガスを30mL採取した。アンモニアガス30mLをシリンジでガス導入孔２８（図２参照）内に注入した (流速：約0.5 ml/s)。アンモニアガスを注入する前（０秒）及び注入後、５秒毎に２５秒後まで写真を撮影した。フェノールフタレインは、酸塩基指示薬であり、塩基性のアンモニアガスと接触すると赤紫色を呈する。
　その結果、１６個のDWCの全てにおいて、第１のウェル中の溶液の色が赤紫色に同程度に変色し、経時的に赤紫色が濃くなった。これにより、ガス導入孔２８から注入されたアンモニアガスが、全てのDWCの第１のウェルに均一に導入されたことが確認された。
実施例３、比較例１　　ガス流通による標的物質の導入効率の向上確認試験
　実施例１で作製したデバイスのガス導入孔２８から窒素ガスを0.5L/分の流速で注入した。第２のウェルに実施例２と同じ脂質溶液を５μL滴下し、さらに、実施例２と同じバッファー１を２３μL滴下した。一方、第１のウェルにバッファー１を２８μL滴下した。これにより、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜を形成した。
　この状態で、窒素ガスの注入を止め、オクテノール濃度が5ppmのガスを、0.5L/分の流速でガス導入孔２８から注入した。注入前（０分）、及び注入後１０分毎に３０分後まで第１のウェル内の液滴の一部をサンプリングしてガスクロマトグラフィーにより解析し、オクテノール濃度を測定した。
　自然拡散を模した場合と比較するため、ガスは注入せず、デバイス全体の上面を、オクテノール濃度が15ppmのガス（流速：0.5L/分）に連続的に暴露した（比較例１）。曝露前（０分）、及び曝露後１０分毎に３０分後まで第１のウェル内の液滴の一部をサンプリングしてガスクロマトグラフィーにより解析し、オクテノール濃度を測定した。結果を図５に示す。
　図５に示すように、第１のウェル内の液滴中のオクテノール濃度は、比較例１の場合よりも３倍以上高くなり、かつ、注入開始後１０分後には、ほぼ飽和に達していた。ちなみに、比較例１の場合のオクテノール濃度は15ppmであり、流通ガスにオクテノールを含ませる実施例３の場合（5ppm）の３倍の濃度であるにもかかわらず、このような結果となった。これにより、流通ガス内の標的物質は、自然拡散の場合よりもはるかに効率よく第１のウェル内の液滴中に拡散されることが確認された。
実施例４、比較例２　　ガス流通及び１６チャネル化(DWCを１６個設けた）による標的物質の導入効率の向上確認試験
　実施例１で作製したデバイスのガス導入孔２８から窒素ガスを0.25L/分の流速で注入した。第２のウェルに実施例２と同じ脂質溶液を5μL滴下し、さらに、実施例２と同じバッファー１に、嗅覚受容体タンパク質を含んだリポソームを混合した溶液を２３μL滴下した。一方、第１のウェルに、実施例２と同じバッファー１を２８μL滴下した。これにより、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜を形成するとともに、脂質二重膜に嗅覚受容体タンパク質が再構成された。
　この状態で、電気計測を開始した。計測１０分後から0.5～1ppmのオクテノールガスをガス導入孔２８から注入した。流速は0.25 L/minで流した。嗅覚受容体タンパク質にオクテノールが捕捉されると、ウェル間に電流が流れ、電流シグナルとして検出される。シグナルが得られた時点を時系列的にプロットし、検出確率を見積もった。なお、ここでの検出確率とは母集団を計測回数とする。（例えば、4回の独立した計測を行ったとき、10分、20分、30分、40分でシグナルが出たとすると、10分後を1/4 = 25%, 20分後を2/4 = 50%, 30分後を3/4 = 75%、40分後を4/4 = 100%と計算する。）
　一方、比較のため、基板内にDWCを１個形成した従来の計測デバイスを用いて、比較例１と同様に自然拡散を模してオクテノールガスにデバイスを暴露した。結果を図６に示す。
　図６に示すように、１６チャネルでガス流路にガスを流通させる実施例１のデバイスを用いた場合には、１チャンネルでガス流路を持たない従来のデバイスを用いた場合に比べ、はるかに検出確率が高くなった。
実施例５　　約１時間の動的な連続検出
　実施例１で作製したデバイスのガス導入孔２８から窒素ガスを0.5L/分の流速で注入した。第２のウェルに実施例２と同じ脂質溶液を５μL滴下し、さらに、実施例２と同じバッファー１に、嗅覚受容体タンパク質を含んだリポソームを混合した溶液２３μL滴下した。一方、第１のウェルに、バッファー1を２８μL滴下した。これにより、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜を形成するとともに、脂質二重膜に嗅覚受容体タンパク質が再構成された。
　次に、ガス発生機で連続的発生させている5ppmのオクテノールガスをガス導入孔２８から導入しながら、電気計測を開始した。計測開始7分後に窒素ガスに切り替え、25分でオクテノールガスに切り替え、さらに50分で窒素ガスに切り替えた。嗅覚受容体チャンネルの開状態と閉状態を示す電流シグナルが得られ、それぞれの時間でオープン率（開状態/（開状態＋閉状態））を見積もった。一方、 第１のウェル内の液滴中のオクテノール濃度を調べるために、同じ条件で液滴中のオクテノール濃度をガスクロマトグラフィーで計測した。結果を図７に示す。
　図７に示されるように、流通させるガスがオクテノールガスである場合には、液滴中のオクテノール濃度が増大し、オープン率も増大し、一方、窒素ガスに切り替えると、液滴中のオクテノール濃度がほぼ０になるまで減少し、オープン率も減少することが確認された。すなわち、液滴内の標的物質は、標的物質を含まないガスを流通させることにより、液滴から標的物質を除去できることが確認された。
実施例６　　ガス導入による液滴溶液のかくはん
　実施例１で作製したデバイスの第２のウェルに脂質DPhPC (1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォリルコリン（DPhPC)/n-デカン溶液（20 mg/mL）を4.2μL滴下した。第２のウェルに溶液 (KCl 1M, リン酸バッファー10mM pH 7.0)を21μL滴下した。第１のウェルに、マイクロビーズ（ポリスチレンビーズ、直径75μm）を含んだ溶液(KCl 1M, リン酸バッファー10 mM pH 7.0）を25μL滴下した。これにより、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜が形成された。
　この状態で、窒素ガスを0.25 L/分の流速でガス導入孔２８から注入し、ガス注入前後のマイクロビーズの動きを液滴の上面から観察した。
　その結果、窒素ガス導入前のマイクロビーズはほとんど動かないが、窒素ガスを導入するとマイクロビーズが激しく動き始めた。これによりウェル内の液滴を構成する溶液がかくはんされることが示された。
実施例７　　ガス導入による溶液内かくはんの効果
　実施例１で作製したデバイスのガス導入孔２８から窒素ガスを0.25L/分の流速で注入した。第２のウェルに脂質DPhPC/n-デカン溶液（20 mg/mL）を4.2μL滴下した。第２のウェルに、1nMのα－ヘモリシンを含む溶液 (KCl 1M, リン酸バッファー10mM pH 7.0)を21μL滴下した。第１のウェルに10 μMのシクロデキストリンを含むバッファー（(KCl 1M, リン酸バッファー10 mM pH 7.0）を25μL 滴下した。電気計測を開始し、しばらくするとα－へモリシン由来のナノポアが脂質二重膜中に形成され、シクロデキストリンのブロッキングが見られるようになった。シクロデキストリン由来の閉塞シグナルが観測された後に、窒素ガスの導入をストップさせ、シクロデキストリンの閉塞シグナルの変化を観測した。結果を図８に示す。
　図８に示されるように、窒素ガスを導入すると、シクロデキストリンによりα－へモリシン由来のナノポアが高頻度で閉塞されるのに対し、窒素ガスの導入をとめると、閉塞の頻度が激減する。これにより、液滴を構成する溶液がかくはんされることにより、シグナルの検出効率が大幅に増大することが確認された。
　１０　基板
　１２　隔壁
　１４　第１のウェル
　１６　第２のウェル
　１８　透孔
　２０　ガス流路
　２２　ガス導入路
　２４　ガス排出路
　２６　ガス導入幹路
　２８　ガス導入孔
　３０　ガス排出幹路
　３２　ガス排出孔
　３４　ガス排出幹路
　３６　ガス排出孔
　３８　電極を接続する透孔
　４０　電極を接続する透孔
　４２　隔壁１２を挿入する透孔

Claims (9)

  1. 　互いに隣接して配置される第１の容器及び第２の容器と、
    　該第１及び第２の容器間に設けられた隔壁であって、脂質二重膜を形成する透孔を有する隔壁と
    を具備する計測器具であって、
    　前記第１及び第２の容器の少なくとも一方に、表面が疎水性であるガス流路が形成されており、該ガス流路は、入口と出口を有し、該入口及び出口は、それぞれ前記計測器具の外部に連通しており、該ガス流路は、それが設けられている容器内に開口しており、該ガス流路内を流れるガスが、該容器内に充填される液滴に接触する、計測器具。
  2. 　複数の前記ガス流路が設けられている、請求項１記載の計測器具。
  3. 　前記ガス流路は、溝状の流路である請求項１又は２記載の計測器具。
  4. 　前記ガス流路は、前記第１及び第２の容器の少なくとも一方の底面に設けられている、請求項１～３のいずれか１項に記載の計測器具。
  5. 　前記第１及び第２の容器が、基板内に設けられたダブルウェルチャンバーの形態にある、請求項１～４のいずれか１項に記載の計測器具。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の計測器具からなるユニットを複数具備し、各ユニットの各ガス流路の入口が各ガス導入路を介して互いに連通し、使用時には各ユニットに同時にガスを供給できる、計測器具。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の計測器具を用いた標的物質の計測方法であって、前記第１及び第２の容器に液滴を充填して前記透孔に前記脂質二重膜を形成し、標的物質を含むガス状の試料を前記ガス流路に流通させながら計測を行う、標的物質の計測方法。
  8. 　標的物質を含まないガスを前記ガス流路に流通させ、前記液滴中の標的物質を除去する工程をさらに含む請求項７記載の方法。
  9. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の計測器具を用いた標的物質の計測において、前記第１及び第２の容器に液滴を充填して前記透孔に前記脂質二重膜を形成し、ガスを前記ガス流路に流通させて、該ガス流路と接触する液滴のかくはんを行う、脂質二重膜を用いた計測における液滴のかくはん方法。
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