JP7058858B2 - 脂質二重膜形成器具及びそれを用いた脂質二重膜形成方法 - Google Patents
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Description
1. 脂質二重膜形成器具であって、
基板と、
該基板内に設けられ、平坦な開口部を有する第1のウェルと、
該第1のウェル内に充填された、第1の脂質一重膜形成性液滴と、
前記基板に対して相対的に移動可能な移動部材と、
該移動部材内に設けられ、平坦な開口部を有する第2のウェルと、
該第2のウェル内に充填された、第2の脂質一重膜形成性液滴と、
前記第1の脂質一重膜形成性液滴と前記第2の脂質一重膜形成性液滴とを同時に被覆する1個のシール部材と
を具備し、
前記器具の使用前には、前記第1のウェルと前記第2のウェルは、互いに離れた位置にあり、使用時には、前記移動部材を前記基板に対して相対的に移動させ、前記第1のウェルの前記開口部と、前記第2のウェルの前記開口部とが重なり合って、前記第1の脂質一重膜形成性液滴と前記第2の脂質一重膜形成性液滴とが接触し、この接触部位において脂質二重膜が形成され、
前記移動部材は、前記基板内に設けられた溝に摺動可能に挿入されており、
前記シール部材は、前記第1の脂質一重膜形成性液滴と前記第2の脂質一重膜形成性液滴とを同時に被覆する単一の粘着テープである、
脂質二重膜形成器具。
3. 前記シール部材は、前記第1の脂質一重膜形成性液滴及び前記第2の脂質一重膜形成性液滴のそれぞれと接触しない位置に配置されている、1又は2記載の器具。
4. 前記第1のウェルの前記開口部又は前記第2のウェルの前記開口部には、透孔を有する隔壁が配置され、前記第1の脂質一重膜形成性液滴と前記第2の脂質一重膜形成性液滴とは、該透孔を介して接触する、1~3のいずれか1項に記載の器具。
5. 前記第1の脂質一重膜形成性液滴及び前記第2の脂質一重膜形成性液滴が、ヒドロゲルの形態にある、1~4のいずれか1項に記載の器具。
6. 前記第1の脂質一重膜形成性液滴及び前記第2の脂質一重膜形成性液滴が、凍結状態にある、1~5のいずれか1項に記載の器具。
7. 前記第1の脂質一重膜形成性液滴及び前記第2の脂質一重膜形成性液滴に含まれる有機溶媒が、n-ヘキサデカンを含む、6記載の器具。
8. 前記第1の脂質一重膜形成性液滴及び前記第2の脂質一重膜形成性液滴に含まれる有機溶媒が、n-ヘキサデカンとn-デカンの混合溶媒である、7記載の器具。
9. 前記第1のウェル及び前記第2のウェルのそれぞれの底部に電極が配置されている、1~8のいずれか1項に記載の器具。
該器具をその使用場所まで輸送する工程と、
使用場所において、前記第1の脂質一重膜形成性液滴及び前記第2の脂質一重膜形成性液滴が凍結状態にある場合にはこれらの液滴を融解後、前記第1のウェルの前記開口部と前記第2のウェルの前記開口部とが重なり合う位置まで前記移動部材を前記基板に対して相対的に移動させて、前記第1の脂質一重膜形成性液滴と前記第2の脂質一重膜形成性液滴とを接触させ、この接触部位において脂質二重膜を形成させる工程とを含む、脂質二重膜の形成方法。
1. 脂質二重膜形成器具
図1に示す脂質二重膜器具を作製した。基板10の厚さは4mm、移動部材14の厚さは3mm、第1のウェル12及び第2のウェル16の直径はそれぞれ4mm、高さはそれぞれ3mm(従って、段差22は1mmとなる)、透孔18aの直径は0.6mmであった。また、透孔12b及び透孔20aには、銀-塩化銀電極を配置した。
(1) 脂質分散デカン溶液を作製した。脂質(DPhPC, Avanti Polar Lipids)を質量比1:1のn-デカン:ヘキサデカン(シグマ)に分散させ、20 mg/mLとした(脂質溶液)。
(2) アガロースゲル(Agarose Type IX-A, Ultra-low Gelling Temperature, Sigma-Aldrich)45 mgを計量し、遠沈管に入れた。
(3) アガロース濃度が1.5%になるように別途準備した1 M KCl(10 mM リン酸バッファ, pH7.4)を加えた。
(4) 突沸に気を付けながら、電子レンジ(500 W)で沸騰させてアガロースを溶かした。ゲルが均一となるよう、適宜ボルテックスミキサーで撹拌しながら十分に溶かした。
(5) 溶解後、エッペンチューブに小分けにしてヒートブロック(40℃)上で保持した(アガロースゲル溶液)。
(6) 100 nM α-ヘモリシン(Sigma-Aldrich)水溶液を別途作製しておいた。
(1) ヒートブロック(40℃)で温めてあるゲル溶液(99 μL)に100 nM α-ヘモリシン(1 μL)を加えた(終濃度1 nM、ヘモリシンゲル溶液)。ウェルに滴下するまでヒートブロック上で保持した。
(2) 移動部材を動かし、ウェル同士が互いに離れて接触しない状態にした。
(3) 脂質溶液を3μLずつ2つのウェルに加えた。ウェル底面にオイルが広がった。
(4) 第1のウェルにアガロースゲル溶液(27μL)を加えた。
(5) 続けて、第2のウェルにヘモリシンゲル溶液(27μL)を加えた。
(6) シール部材として粘着テープ(ポリオレフィン マイクロシーリングテープ、3 M)を基板上面に空気が入らないよう貼り付けた(実施例1)。上記のとおり、1mmの段差22があるので、ゲル溶液(ウェル上部)や移動部材14上面は、粘着テープと触れない。なお、参考例1では、シール部材は貼り付けなかった。
作製した器具を一夜(15時間)冷蔵保存(4℃)した(実施例1)。なお、参考例1では、保存せず、液滴を調製後、すぐに下記の測定を行った。
実施例1では、冷蔵保存後の器具を室温で5分~30分間放置して室温に戻し、粘着テープを剥離した。参考例1、実施例1とも、透孔12bに配置した電極をアースし、透孔20aに配置した電極を周知のパッチアンプ回路(特許文献1)に接続して両ウェル間を流れる電流を測定した。印加電圧は50~100 mVとし、増幅率1 mV/pAまたは10 mV/pA、サンプリング周波数5 kHzにおいてイオン電流を観測した。取得シグナルには、ベッセルローパスフィルタ1 kHzを施した。移動部材14を指で移動して、第1の液滴と第2の液滴が、透孔18aを介して接触する状態とした。この後も電流測定を継続した。
電流の測定結果を図4の(a)(参考例1)及び図4の(b)(実施例1)に示す。図4の(a)及び(b)に示されるように、階段状の電流が測定された。この結果は、脂質二重膜が形成され、かつ、α-ヘモリシンが脂質二重膜中に機能的に保持され、α-ヘモリシンが持つナノ孔(イオンチャネル)を介してイオンの移動が起きたことを示している。脂質二重膜に保持されるα-ヘモリシンの分子数が増えると、測定される電流が増大するので、電流が階段状になる。図4の(a)に示すように、参考例1では、最初の階段状電流が測定されるまでの時間(すなわち、α-ヘモリシンを保持する脂質二重膜が形成されるまでの時間)は24±28秒であり、迅速に脂質二重膜が形成された。また、実施例1でも、最初の階段状電流が測定されるまでの時間概ね10秒~5分であり、同様に迅速に脂質二重膜が形成された。
実施例1で作製した器具を種々の時間(約15時間、約40時間、約90時間、7日間又は1ヶ月間)凍結保存(-20℃)し、あるいは宅配便の冷凍便(-10℃)で運搬試験(計2日間)を行った後、実施例1と同様に電流測定を行った。
12 第1のウェル
12a 開口部
12b 透孔
14 移動部材
14a 突起
16 第2のウェル
18 隔壁
18a 透孔
20 溝
20a 透孔
22 段差
24 段差
26 透孔
Claims (10)
- 脂質二重膜形成器具であって、
基板と、
該基板内に設けられ、平坦な開口部を有する第1のウェルと、
該第1のウェル内に充填された、第1の脂質一重膜形成性液滴と、
前記基板に対して相対的に移動可能な移動部材と、
該移動部材内に設けられ、平坦な開口部を有する第2のウェルと、
該第2のウェル内に充填された、第2の脂質一重膜形成性液滴と、
前記第1の脂質一重膜形成性液滴と前記第2の脂質一重膜形成性液滴とを同時に被覆する1個のシール部材と
を具備し、
前記器具の使用前には、前記第1のウェルと前記第2のウェルは、互いに離れた位置にあり、使用時には、前記移動部材を前記基板に対して相対的に移動させ、前記第1のウェルの前記開口部と、前記第2のウェルの前記開口部とが重なり合って、前記第1の脂質一重膜形成性液滴と前記第2の脂質一重膜形成性液滴とが接触し、この接触部位において脂質二重膜が形成され、
前記移動部材は、前記基板内に設けられた溝に摺動可能に挿入されており、
前記シール部材は、前記第1の脂質一重膜形成性液滴と前記第2の脂質一重膜形成性液滴とを同時に被覆する単一の粘着テープである、
脂質二重膜形成器具。 - 前記移動部材は、前記基板外に突出する突起部を具備する請求項1記載の器具。
- 前記シール部材は、前記第1の脂質一重膜形成性液滴及び前記第2の脂質一重膜形成性液滴のそれぞれと接触しない位置に配置されている、請求項1又は2記載の器具。
- 前記第1のウェルの前記開口部又は前記第2のウェルの前記開口部には、透孔を有する隔壁が配置され、前記第1の脂質一重膜形成性液滴と前記第2の脂質一重膜形成性液滴とは、該透孔を介して接触する、請求項1~3のいずれか1項に記載の器具。
- 前記第1の脂質一重膜形成性液滴及び前記第2の脂質一重膜形成性液滴が、ヒドロゲルの形態にある、請求項1~4のいずれか1項に記載の器具。
- 前記第1の脂質一重膜形成性液滴及び前記第2の脂質一重膜形成性液滴が、凍結状態にある、請求項1~5のいずれか1項に記載の器具。
- 前記第1の脂質一重膜形成性液滴及び前記第2の脂質一重膜形成性液滴に含まれる有機溶媒が、n-ヘキサデカンを含む、請求項6記載の器具。
- 前記第1の脂質一重膜形成性液滴及び前記第2の脂質一重膜形成性液滴に含まれる有機溶媒が、n-ヘキサデカンとn-デカンの混合溶媒である、請求項7記載の器具。
- 前記第1のウェル及び前記第2のウェルのそれぞれの底部に電極が配置されている、請求項1~8のいずれか1項に記載の器具。
- 請求項1~9のいずれか1項に記載の器具を準備する工程と、
該器具をその使用場所まで輸送する工程と、
使用場所において、前記第1の脂質一重膜形成性液滴及び前記第2の脂質一重膜形成性液滴が凍結状態にある場合にはこれらの液滴を融解後、前記第1のウェルの前記開口部と前記第2のウェルの前記開口部とが重なり合う位置まで前記移動部材を前記基板に対して相対的に移動させて、前記第1の脂質一重膜形成性液滴と前記第2の脂質一重膜形成性液滴とを接触させ、この接触部位において脂質二重膜を形成させる工程とを含む、脂質二重膜の形成方法。
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