JP7353597B2 - 計測器具及びそれを用いた標的物質の計測方法 - Google Patents
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Description
本発明は、脂質二重膜を用いて標的物質の計測を行う計測器具並びにそれを用いた標的物質の計測方法及び該計測器具に充填される液滴のかくはん方法に関する。
嗅覚受容体を脂質二重膜に再構成し、匂い・揮発性有機物のセンサとしての応用を目指す研究が行われている。同様に、生体がもつ高い感度・特異性を利用するため、細胞や組織を用いた匂い・揮発性有機物センサの研究も行われている。
しかしながら、匂いや揮発性有機物（標的物質）の多くは水に難溶性であり、水溶液中でなければ活性を保てない受容体や細胞に対して標的物質を届ける機構に工夫が必要である。多くの研究では規定量の標的物質を水に溶解してサンプルとし、受容体や細胞を浸潤している水溶液と混合している（非特許文献１）。あるいは、標的物質を受動的に取り込む方法として、アガロースゲルを利用した例がある（特許文献１、非特許文献２～４）。
Nobuo Misawa et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 107, 15340, 2010.
Satoshi Fujii et al., Lab on a Chip, 17, 2421,2017.
Nobuo Misawa et al., ACS sensors,4, 711,2018.
Koji Sato et al., Angewandte Chemie International Edition,53, 11798, 2014.
受容体等を利用したセンサを形成する水溶液に匂いや揮発性有機物等の標的物質を気相から溶解する場合、問題となるのが標的物質の難溶性（あるいは気液間での低い分配係数）および溶液内の遅い拡散速度である。溶液内の拡散係数はおよそ10-9m2/s程度であり、自由拡散では水溶液内全体が気液平衡に到達するまでには長い時間を要するため、センサ素子である受容体等に標的物質が十分な濃度で届くまでの時間も延び、検出時間が長くなる（あるいは感度が低下する）と考えられる。また、上記のとおり、これまでにアガロースゲルを利用した人工細胞膜センサにより揮発性分子を検出した例はあるが、一度、水溶液内に溶け込んだ標的物質は滞留するため、動的な濃度変化を検出することは困難であった。
本発明の目的は、脂質二重膜を用いた計測において、液滴内に標的物質を効率良く導入させることができる計測器具並びにそれを用いた標的物質の計測方法及び該計測器具に充填される液滴のかくはん方法を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、脂質二重膜を用いた標的物質の計測において、液滴を充填する容器に表面が疎水性のガス流路を設け、該ガス流路に標的物質を含むガス状試料を流通させることにより、該液滴内に効率良く標的物質を導入することができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
(1) 互いに隣接して配置される第１の容器及び第２の容器と、
該第１及び第２の容器間に設けられた隔壁であって、脂質二重膜を形成する透孔を有する隔壁と
を具備する計測器具であって、
前記第１及び第２の容器の少なくとも一方に、表面が疎水性であるガス流路が形成されており、該ガス流路は、入口と出口を有し、該入口及び出口は、それぞれ前記計測器具の外部に連通しており、該ガス流路は、それが設けられている容器内に開口しており、該ガス流路内を流れるガスが、該容器内に充填される液滴に接触する、計測器具。
(2) 複数の前記ガス流路が設けられている、(1)記載の計測器具。
(3) 前記ガス流路は、溝状の流路である(1)又は(2)記載の計測器具。
(4) 前記ガス流路は、前記第１及び第２の容器の少なくとも一方の底面に設けられている、(1)～(3)のいずれか１項に記載の計測器具。
(5) 前記第１及び第２の容器が、基板内に設けられたダブルウェルチャンバーの形態にある、(1)～(4)のいずれか１項に記載の計測器具。
(6) (1)～(5)のいずれか１項に記載の計測器具からなるユニットを複数具備し、各ユニットの各ガス流路の入口が各ガス導入路を介して互いに連通し、使用時には各ユニットに同時にガスを供給できる、計測器具。
(7) (1)～(6)のいずれか１項に記載の計測器具を用いた標的物質の計測方法であって、前記第１及び第２の容器に液滴を充填して前記透孔に前記脂質二重膜を形成し、標的物質を含むガス状の試料を前記ガス流路に流通させながら計測を行う、標的物質の計測方法。
(8) 標的物質を含まないガスを前記ガス流路に流通させ、前記液滴中の標的物質を除去する工程をさらに含む(7)記載の方法。
(9) (1)～(6)のいずれか１項に記載の計測器具を用いた標的物質の計測において、前記第１及び第２の容器に液滴を充填して前記透孔に前記脂質二重膜を形成し、ガスを前記ガス流路に流通させて、該ガス流路と接触する液滴のかくはんを行う、脂質二重膜を用いた計測における液滴のかくはん方法。
(1) 互いに隣接して配置される第１の容器及び第２の容器と、
該第１及び第２の容器間に設けられた隔壁であって、脂質二重膜を形成する透孔を有する隔壁と
を具備する計測器具であって、
前記第１及び第２の容器の少なくとも一方に、表面が疎水性であるガス流路が形成されており、該ガス流路は、入口と出口を有し、該入口及び出口は、それぞれ前記計測器具の外部に連通しており、該ガス流路は、それが設けられている容器内に開口しており、該ガス流路内を流れるガスが、該容器内に充填される液滴に接触する、計測器具。
(2) 複数の前記ガス流路が設けられている、(1)記載の計測器具。
(3) 前記ガス流路は、溝状の流路である(1)又は(2)記載の計測器具。
(4) 前記ガス流路は、前記第１及び第２の容器の少なくとも一方の底面に設けられている、(1)～(3)のいずれか１項に記載の計測器具。
(5) 前記第１及び第２の容器が、基板内に設けられたダブルウェルチャンバーの形態にある、(1)～(4)のいずれか１項に記載の計測器具。
(6) (1)～(5)のいずれか１項に記載の計測器具からなるユニットを複数具備し、各ユニットの各ガス流路の入口が各ガス導入路を介して互いに連通し、使用時には各ユニットに同時にガスを供給できる、計測器具。
(7) (1)～(6)のいずれか１項に記載の計測器具を用いた標的物質の計測方法であって、前記第１及び第２の容器に液滴を充填して前記透孔に前記脂質二重膜を形成し、標的物質を含むガス状の試料を前記ガス流路に流通させながら計測を行う、標的物質の計測方法。
(8) 標的物質を含まないガスを前記ガス流路に流通させ、前記液滴中の標的物質を除去する工程をさらに含む(7)記載の方法。
(9) (1)～(6)のいずれか１項に記載の計測器具を用いた標的物質の計測において、前記第１及び第２の容器に液滴を充填して前記透孔に前記脂質二重膜を形成し、ガスを前記ガス流路に流通させて、該ガス流路と接触する液滴のかくはんを行う、脂質二重膜を用いた計測における液滴のかくはん方法。
本発明の計測器具を用いて計測を行うことにより、液滴内に標的物質を効率良く拡散させることができる。また、標的物質を含まないガスをガス流路に流通させることにより、液滴内の標的物質を除去することもできる。標的物質を除去後に再度、標的物質を含む新たな試料を加えることにより、試料中の標的物質の動的な濃度変化を検出することも可能になる。さらに、ガスをガス流路に流通させることにより、該ガス流路が接触する液滴をかくはんすることもできる。下記実施例に具体的に示されるように、液滴のかくはんにより、シグナルの検出効率が大幅に増大する。
以下、図面に基づき、本発明の好ましい実施形態について説明する。なお、計測器具を図示している図面は、発明を説明するための模式図であり、現実の計測器具とは各部分の寸法比率は異なる。
図１(a)は、ダブルウェルチャンバー(DWC)の形態にある、本発明の好ましい一実施形態になる計測器具の模式平面図、図１(b)は、図１(a)中のb-b'切断部端面図である。なお、DWCは、基板中に２つのウェルを隣接して配置したもので、脂質二重膜を用いる計測器具として周知のものであり、特許文献１等にも記載されている。図１に示す器具は、基板１０と、基板１０内に設けられた第１の容器である第１のウェル１４と、基板１０内に設けられ、ウェル１４に隣接する第２の容器である第２のウェル１６と、ウェル１４とウェル１６の間に設けられ、これらを隔てる隔壁１２を具備する。隔壁１２内には、使用時に脂質二重膜を形成する透孔１８が設けられている（図１(b)参照）。ウェル１４の底面には、溝状のガス流路２０が複数形成されている。ガス流路２０の数は１本でもよいが、複数ある方が、ガスと液滴との接触を増やすことができるので好ましい。ガス流路２０の数は、特に限定されないが、好ましくは、1本～50本程度である。また、ガス流路２０の幅は、通常、0.001 mm～2 mm程度、好ましくは0.01 mm～0.5 mm程度、深さは通常、0.01 mm～2 mm程度、好ましくは0.2 mm～0.8 mm程度である。各ガス流路２０はそれぞれ入口と出口を有し、使用時にガス流は入口から入って出口から出る。各入口は、ガス導入路２２に連通しており、各出口はガス排出路２４に連通している。使用時にガス導入路２２から導入されたガスは、図１(a)の矢印で示されるように、各ガス流路の入口から各ガス流路２０に入り、各ガス流路２０の各出口からガス排出路２４に排出される。なお、DWCの各ウェルのサイズは、従来と同様でよく、直径が通常、1 mm～10 mm程度、好ましくは2 mm～6 mm程度、深さが通常、1 mm～10 mm程度、好ましくは2 mm～6 mm程度である。また、隔壁１２内の透孔１８の直径も従来と同様であり、通常、0.5 μm～1000μm程度、好ましくは10 μm～600 μm程度である。
各ガス流路２０は、少なくともその表面が疎水性である。この疎水性により、使用時にウェル１４内に液滴を充填しても、各ガス流路２０が液で塞がれることがなく、ガスが流通するスペースが維持される。疎水性は、ガス流路２０を疎水化処理することにより容易に付与することができる。疎水化処理は、例えば、フッ素系コーティング剤を塗布することにより行うことができる。
図１に示すDWCは、ガス流路２０、ガス導入路２２及びガス排出路２４を切削加工により形成した下部基板と、各ウェル１４、１６の側面を構成する上部基板を貼り合わせ、各ウェル１４、１６の間に隔壁１２を挿入して設置することにより作製することができる。隔壁１２の挿入は、第１のウェル１４と第２のウェル１６の隣接部に隔壁１２を挿入する溝又は孔（図４の４２）を形成しておき、ここに隔壁１２を挿入することにより行うことができる。なお、隔壁１２は、公知のとおり、小さな透孔を形成しやすいパリレンフィルム等により構成することが好ましい。
ガス流路２０は、ウェル１４の底面に溝を切削加工することにより容易に形成することができるが、これに限定されるものではなく、繊維状や多孔質状、板状、柱状の部材を底面上に配置したりすること等によっても形成することができる。また、ガス流路２０は、底面に形成する必要はなく、ウェルの側面に形成してもよいし、ウェルの頂部を蓋で覆い、該蓋の下面に形成することも可能である。もっとも底面に切削加工により形成することが容易で好ましい。また、上記実施形態では、ガス流路は第１のウェル１４内にのみ形成したが、第２のウェル１６内にも形成してもよい。
また、周知のとおり、各ウェルには、電極を接続する透孔（図３の３８及び４０）が形成されており、使用時には、各電極が、各ウェル内に充填される液滴と接触し、両ウェル間に所定の電圧を印加し、流れる電流を増幅して計測する回路が各電極に接続される。このような回路は周知であり、下記実施例にも具体的に記載されている（図２(b)参照）。
使用時には、周知の液滴接触法により、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜を形成する。脂質二重膜の形成方法は周知であり、特許文献１にも記載されている。一方のウェルに充填する液に、脂質二重膜に再構成すべき受容体タンパク質等を添加しておくと、脂質二重膜に該タンパク質が自然に再構成（保持）される。タンパク質としては、各種受容体タンパク質、α－ヘモリシン、グラミシジン、アラメチシンなどのペプチドタンパク質類、各種イオンチャンネル、ABCトランスポータタンパク質等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
脂質二重膜形成後、ガス導入路２２から、標的物質を含む試料ガスを導入する。試料ガスは、ポンプやシリンジ等により、ガス導入路２２に導入することができる。これにより、各ガス流路２０に試料ガスが流通し、ガス排出路２４から排出される。この際、各ガス流路２０を流れる試料ガス中の標的物質が、ウェル１４内に充填されている液滴内に拡散する。この状態で、両ウェル間に流れる電流を測定することにより、試料ガス中の標的物質を検出することができる。ガス流路２０に導入するガスの量は、特に限定されず、適宜選択することができるが、ガス導入路２０に導入するガスの流速として、通常、0.001 L/分～3 L/分、好ましくは0.05 L/分～1 L/分である。
下記実施例において具体的に記載するように、ガス流路２０から液滴内に拡散する標的物質の拡散速度は、従来法における自然拡散と比べてはるかに大きい。このため、効率良く計測を行うことができる。また、下記実施例により明らかになったとおり、ガス流路２０に、標的物質を含まないガス、例えば、不活性なガスである窒素ガス等を流通させることにより、液滴中に含まれる標的物質を少なくとも部分的に除去することができる。この除去後、再度、標的物質を含む試料ガスを流通させることにより、試料ガス中の標的物質の経時的な濃度変化を連続的に計測することも可能になる。
さらに、下記実施例に具体的に記載するように、ガス流路２０内にガスを流通させることにより、ガス流路２０と接触する液滴がかくはんされることが明らかになった。従来、脂質二重膜を用いた計測において、小さな液滴内のかくはんを行う方法は知られていなかった。したがって、本発明は、上記した本発明の計測器具を用いた標的物質の計測において、前記第１及び第２の容器に液滴を充填して前記器具に前記脂質二重膜を形成し、ガスを前記ガス流路に流通させて、該ガス流路と接触する液滴のかくはんを行う、脂質二重膜を用いた計測における液滴のかくはん方法をも提供するものである。なお、下記実施例に具体的に示されるように、液滴のかくはんにより、シグナルの検出効率が大幅に増大するので、ガス導入によるかくはんは、脂質二重膜を用いる計測の効率を大幅に向上させるものである。
なお、上記の実施形態では、基板１０内にDWCが１個形成されているが、単一の基板内にDWCを複数形成し、それらの各ガス導入路２２を１つの流路に合流させ、各DWCに同時に同じガスを流通させて、同時に計測を行うこともできる（下記実施例及び図４参照）。この場合、各ガス導入路が合流している大元のガス導入幹路（図２の２６）にガスを導入することにより、各DWCのガス導入路２２にガスが導入され、各ガス流路２０を通って、ガス排出路２４から排出される。各ガス排出路２４は合流してガス排出幹路（図２の３０、３４）となり、基板１０から排出される。
このように、第１の容器、第２の容器、隔壁を含むユニットを複数連結して同時に計測を行うことにより、標的物質の検出効率を向上させることができ、検出操作に必要な時間を短縮することができる。
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
１．計測器具の作製
図１を参照して上記したDWCを基板１０内に１６個設けた計測器具を作製した（図２）。各DWCは、上記のとおり、第１のウェル１４と、第２のウェル１６と、隔壁１２を具備する。第１のウェル１４の底面には、上記した溝状のガス流路が設けられている。各ガス導入路２２は合流してガス導入幹路２６となり、ガス導入幹路２６はガス導入孔２８に連通している。一方、図２の下半分に位置する８個のDWCの各ガス排出路２４は合流してガス排出幹路３０となり、ガス排出孔３２に連通している。同様に、図２の上半分に位置する８個のDWCの各ガス排出路２４は合流してガス排出幹路３４となり、ガス排出孔３６に連通している。
１．計測器具の作製
図１を参照して上記したDWCを基板１０内に１６個設けた計測器具を作製した（図２）。各DWCは、上記のとおり、第１のウェル１４と、第２のウェル１６と、隔壁１２を具備する。第１のウェル１４の底面には、上記した溝状のガス流路が設けられている。各ガス導入路２２は合流してガス導入幹路２６となり、ガス導入幹路２６はガス導入孔２８に連通している。一方、図２の下半分に位置する８個のDWCの各ガス排出路２４は合流してガス排出幹路３０となり、ガス排出孔３２に連通している。同様に、図２の上半分に位置する８個のDWCの各ガス排出路２４は合流してガス排出幹路３４となり、ガス排出孔３６に連通している。
図２に示す計測器具は、次のようにして作製した。図３に示すように、まず、厚さ1mmのアクリル板から成る下部基板10aを準備した。第１のウェル１４の底面となる領域に、互いに平行に複数の溝状のガス流路を切削加工して形成した。ガス流路は、直径0.2mmのミルを用いて切削し、深さ0.5mmとした。溝状の各ガス流路の間隔は0.3mmとした。また、溝状のガス流路の長さは3 mm～8 mmであり、全体として長円状になるように加工した。第１のウェル１４の底面となる領域の中央及び第２のウェル１６の底面となる領域の中央に、それぞれ電極挿入用の、直径0.56mmの透孔３８及び４０を形成した。さらに、ガス導入路２２、ガス導入幹路２６、ガス排出路２４、ガス排出幹路３０、３４を図３に示す形状に切削加工した。これらのガス流路は、直径0.5mmのミルで切削加工して形成し、深さは0.5mmとした。さらに、各ガス流路の入口部分に、直径1mmのミルで深さ0.8mmの流路を切削加工して、各ガス流路の入口を連通させ、ガス導入路２２と接続した。また、同様に、各ガス流路の出口部分に、直径1mmのミルで深さ0.8mmの流路を切削加工して、各ガス流路の出口を連通させ、ガス排出路２４と接続した。
一方、図４に示すように、厚さ3mmのアクリル板から成る上部基板10bを準備した。第１のウェル１４及び第２のウェル１６である各ウェルとなる透孔(直径4.0 mm）を切削加工により形成した。さらに、隔壁１２を挿入するための透孔４２(直径1.0 mm）を、各ウェルの接続部にそれぞれ一対ずつ形成した。
図３に示す下部基板10aと図４に示す上部基板10bとを積層して熱圧着した。この状態で、一対の透孔４２にパリレンフィルムから成る隔壁１２を挿入した。なお、隔壁１２内には、脂質二重膜を形成するための、直径100 μmの透孔が11個設けられている。さらに、この状態で、第１のウェルの底面を疎水化剤で処理し、溝状のガス流路を疎水化した。なお、疎水化剤としては、エスエフコート SFE-B002H （AGCセイミケミカル株式会社）を用い、これを溝を有するウェルに３～6μL滴下することにより、疎水化処理を行った。以上の操作により、本発明の計測器具を作製した。
さらに、電極挿入用の透孔３８、４０にそれぞれ電極を挿入し、各第２のウェルを接地し、各第１のウェルに電圧印加及び増幅回路を接続した。電圧印加及び増幅回路を図２(b)に示す。なお、図２(b)では、簡潔性のために右上の１個のDWCのみに回路が接続されているが、実際には、１６個のDWCの全てについて、それぞれ同様な回路を接続した。
実施例２ １６個のDWCにガスが均一に導入されるか否かの確認試験
第２のウェルに、脂質DOPC(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン):DOPE（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)混合物（質量比1:3 , 20 mg/ml濃度でn-デカンに溶解) を5μL滴下した。次いで、第２のウェルにバッファー１を23μL滴下した。バッファー１の組成は、NaCl(96 mM), KCl(2mM), MgCl2(5mM), CaCl2(0.8mM) HEPES(5 mM)/pH7.6であった。一方、第１のウェルにフェノールフタレイン 0.1 w/vol%水溶液を28μL滴下した。これにより、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜を形成した。
第２のウェルに、脂質DOPC(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン):DOPE（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)混合物（質量比1:3 , 20 mg/ml濃度でn-デカンに溶解) を5μL滴下した。次いで、第２のウェルにバッファー１を23μL滴下した。バッファー１の組成は、NaCl(96 mM), KCl(2mM), MgCl2(5mM), CaCl2(0.8mM) HEPES(5 mM)/pH7.6であった。一方、第１のウェルにフェノールフタレイン 0.1 w/vol%水溶液を28μL滴下した。これにより、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜を形成した。
一方、アンモニア溶液（２５％）1mLをバイアルに入れて密閉した。バイアルの気相部位からシリンジでアンモニアガスを30mL採取した。アンモニアガス30mLをシリンジでガス導入孔２８（図２参照）内に注入した (流速：約0.5 ml/s)。アンモニアガスを注入する前（０秒）及び注入後、５秒毎に２５秒後まで写真を撮影した。フェノールフタレインは、酸塩基指示薬であり、塩基性のアンモニアガスと接触すると赤紫色を呈する。
その結果、１６個のDWCの全てにおいて、第１のウェル中の溶液の色が赤紫色に同程度に変色し、経時的に赤紫色が濃くなった。これにより、ガス導入孔２８から注入されたアンモニアガスが、全てのDWCの第１のウェルに均一に導入されたことが確認された。
実施例３、比較例１ ガス流通による標的物質の導入効率の向上確認試験
実施例１で作製したデバイスのガス導入孔２８から窒素ガスを0.5L/分の流速で注入した。第２のウェルに実施例２と同じ脂質溶液を５μL滴下し、さらに、実施例２と同じバッファー１を２３μL滴下した。一方、第１のウェルにバッファー１を２８μL滴下した。これにより、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜を形成した。
実施例１で作製したデバイスのガス導入孔２８から窒素ガスを0.5L/分の流速で注入した。第２のウェルに実施例２と同じ脂質溶液を５μL滴下し、さらに、実施例２と同じバッファー１を２３μL滴下した。一方、第１のウェルにバッファー１を２８μL滴下した。これにより、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜を形成した。
この状態で、窒素ガスの注入を止め、オクテノール濃度が5ppmのガスを、0.5L/分の流速でガス導入孔２８から注入した。注入前（０分）、及び注入後１０分毎に３０分後まで第１のウェル内の液滴の一部をサンプリングしてガスクロマトグラフィーにより解析し、オクテノール濃度を測定した。
自然拡散を模した場合と比較するため、ガスは注入せず、デバイス全体の上面を、オクテノール濃度が15ppmのガス（流速：0.5L/分）に連続的に暴露した（比較例１）。曝露前（０分）、及び曝露後１０分毎に３０分後まで第１のウェル内の液滴の一部をサンプリングしてガスクロマトグラフィーにより解析し、オクテノール濃度を測定した。結果を図５に示す。
図５に示すように、第１のウェル内の液滴中のオクテノール濃度は、比較例１の場合よりも３倍以上高くなり、かつ、注入開始後１０分後には、ほぼ飽和に達していた。ちなみに、比較例１の場合のオクテノール濃度は15ppmであり、流通ガスにオクテノールを含ませる実施例３の場合（5ppm）の３倍の濃度であるにもかかわらず、このような結果となった。これにより、流通ガス内の標的物質は、自然拡散の場合よりもはるかに効率よく第１のウェル内の液滴中に拡散されることが確認された。
実施例４、比較例２ ガス流通及び１６チャネル化(DWCを１６個設けた）による標的物質の導入効率の向上確認試験
実施例１で作製したデバイスのガス導入孔２８から窒素ガスを0.25L/分の流速で注入した。第２のウェルに実施例２と同じ脂質溶液を5μL滴下し、さらに、実施例２と同じバッファー１に、嗅覚受容体タンパク質を含んだリポソームを混合した溶液を２３μL滴下した。一方、第１のウェルに、実施例２と同じバッファー１を２８μL滴下した。これにより、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜を形成するとともに、脂質二重膜に嗅覚受容体タンパク質が再構成された。
実施例１で作製したデバイスのガス導入孔２８から窒素ガスを0.25L/分の流速で注入した。第２のウェルに実施例２と同じ脂質溶液を5μL滴下し、さらに、実施例２と同じバッファー１に、嗅覚受容体タンパク質を含んだリポソームを混合した溶液を２３μL滴下した。一方、第１のウェルに、実施例２と同じバッファー１を２８μL滴下した。これにより、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜を形成するとともに、脂質二重膜に嗅覚受容体タンパク質が再構成された。
この状態で、電気計測を開始した。計測１０分後から0.5～1ppmのオクテノールガスをガス導入孔２８から注入した。流速は0.25 L/minで流した。嗅覚受容体タンパク質にオクテノールが捕捉されると、ウェル間に電流が流れ、電流シグナルとして検出される。シグナルが得られた時点を時系列的にプロットし、検出確率を見積もった。なお、ここでの検出確率とは母集団を計測回数とする。（例えば、4回の独立した計測を行ったとき、10分、20分、30分、40分でシグナルが出たとすると、10分後を1/4 = 25%, 20分後を2/4 = 50%, 30分後を3/4 = 75%、40分後を4/4 = 100%と計算する。）
一方、比較のため、基板内にDWCを１個形成した従来の計測デバイスを用いて、比較例１と同様に自然拡散を模してオクテノールガスにデバイスを暴露した。結果を図６に示す。
図６に示すように、１６チャネルでガス流路にガスを流通させる実施例１のデバイスを用いた場合には、１チャンネルでガス流路を持たない従来のデバイスを用いた場合に比べ、はるかに検出確率が高くなった。
実施例５ 約１時間の動的な連続検出
実施例１で作製したデバイスのガス導入孔２８から窒素ガスを0.5L/分の流速で注入した。第２のウェルに実施例２と同じ脂質溶液を５μL滴下し、さらに、実施例２と同じバッファー１に、嗅覚受容体タンパク質を含んだリポソームを混合した溶液２３μL滴下した。一方、第１のウェルに、バッファー1を２８μL滴下した。これにより、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜を形成するとともに、脂質二重膜に嗅覚受容体タンパク質が再構成された。
実施例１で作製したデバイスのガス導入孔２８から窒素ガスを0.5L/分の流速で注入した。第２のウェルに実施例２と同じ脂質溶液を５μL滴下し、さらに、実施例２と同じバッファー１に、嗅覚受容体タンパク質を含んだリポソームを混合した溶液２３μL滴下した。一方、第１のウェルに、バッファー1を２８μL滴下した。これにより、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜を形成するとともに、脂質二重膜に嗅覚受容体タンパク質が再構成された。
次に、ガス発生機で連続的発生させている5ppmのオクテノールガスをガス導入孔２８から導入しながら、電気計測を開始した。計測開始7分後に窒素ガスに切り替え、25分でオクテノールガスに切り替え、さらに50分で窒素ガスに切り替えた。嗅覚受容体チャンネルの開状態と閉状態を示す電流シグナルが得られ、それぞれの時間でオープン率（開状態/（開状態＋閉状態））を見積もった。一方、 第１のウェル内の液滴中のオクテノール濃度を調べるために、同じ条件で液滴中のオクテノール濃度をガスクロマトグラフィーで計測した。結果を図７に示す。
図７に示されるように、流通させるガスがオクテノールガスである場合には、液滴中のオクテノール濃度が増大し、オープン率も増大し、一方、窒素ガスに切り替えると、液滴中のオクテノール濃度がほぼ０になるまで減少し、オープン率も減少することが確認された。すなわち、液滴内の標的物質は、標的物質を含まないガスを流通させることにより、液滴から標的物質を除去できることが確認された。
実施例６ ガス導入による液滴溶液のかくはん
実施例１で作製したデバイスの第２のウェルに脂質DPhPC (1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォリルコリン（DPhPC)/n-デカン溶液（20 mg/mL）を4.2μL滴下した。第２のウェルに溶液 (KCl 1M, リン酸バッファー10mM pH 7.0)を21μL滴下した。第１のウェルに、マイクロビーズ（ポリスチレンビーズ、直径75μm）を含んだ溶液(KCl 1M, リン酸バッファー10 mM pH 7.0）を25μL滴下した。これにより、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜が形成された。
実施例１で作製したデバイスの第２のウェルに脂質DPhPC (1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォリルコリン（DPhPC)/n-デカン溶液（20 mg/mL）を4.2μL滴下した。第２のウェルに溶液 (KCl 1M, リン酸バッファー10mM pH 7.0)を21μL滴下した。第１のウェルに、マイクロビーズ（ポリスチレンビーズ、直径75μm）を含んだ溶液(KCl 1M, リン酸バッファー10 mM pH 7.0）を25μL滴下した。これにより、隔壁１２内の透孔１８に脂質二重膜が形成された。
この状態で、窒素ガスを0.25 L/分の流速でガス導入孔２８から注入し、ガス注入前後のマイクロビーズの動きを液滴の上面から観察した。
その結果、窒素ガス導入前のマイクロビーズはほとんど動かないが、窒素ガスを導入するとマイクロビーズが激しく動き始めた。これによりウェル内の液滴を構成する溶液がかくはんされることが示された。
実施例７ ガス導入による溶液内かくはんの効果
実施例１で作製したデバイスのガス導入孔２８から窒素ガスを0.25L/分の流速で注入した。第２のウェルに脂質DPhPC/n-デカン溶液（20 mg/mL）を4.2μL滴下した。第２のウェルに、1nMのα－ヘモリシンを含む溶液 (KCl 1M, リン酸バッファー10mM pH 7.0)を21μL滴下した。第１のウェルに10 μMのシクロデキストリンを含むバッファー（(KCl 1M, リン酸バッファー10 mM pH 7.0）を25μL 滴下した。電気計測を開始し、しばらくするとα－へモリシン由来のナノポアが脂質二重膜中に形成され、シクロデキストリンのブロッキングが見られるようになった。シクロデキストリン由来の閉塞シグナルが観測された後に、窒素ガスの導入をストップさせ、シクロデキストリンの閉塞シグナルの変化を観測した。結果を図８に示す。
実施例１で作製したデバイスのガス導入孔２８から窒素ガスを0.25L/分の流速で注入した。第２のウェルに脂質DPhPC/n-デカン溶液（20 mg/mL）を4.2μL滴下した。第２のウェルに、1nMのα－ヘモリシンを含む溶液 (KCl 1M, リン酸バッファー10mM pH 7.0)を21μL滴下した。第１のウェルに10 μMのシクロデキストリンを含むバッファー（(KCl 1M, リン酸バッファー10 mM pH 7.0）を25μL 滴下した。電気計測を開始し、しばらくするとα－へモリシン由来のナノポアが脂質二重膜中に形成され、シクロデキストリンのブロッキングが見られるようになった。シクロデキストリン由来の閉塞シグナルが観測された後に、窒素ガスの導入をストップさせ、シクロデキストリンの閉塞シグナルの変化を観測した。結果を図８に示す。
図８に示されるように、窒素ガスを導入すると、シクロデキストリンによりα－へモリシン由来のナノポアが高頻度で閉塞されるのに対し、窒素ガスの導入をとめると、閉塞の頻度が激減する。これにより、液滴を構成する溶液がかくはんされることにより、シグナルの検出効率が大幅に増大することが確認された。
１０ 基板
１２ 隔壁
１４ 第１のウェル
１６ 第２のウェル
１８ 透孔
２０ ガス流路
２２ ガス導入路
２４ ガス排出路
２６ ガス導入幹路
２８ ガス導入孔
３０ ガス排出幹路
３２ ガス排出孔
３４ ガス排出幹路
３６ ガス排出孔
３８ 電極を接続する透孔
４０ 電極を接続する透孔
４２ 隔壁１２を挿入する透孔
１２ 隔壁
１４ 第１のウェル
１６ 第２のウェル
１８ 透孔
２０ ガス流路
２２ ガス導入路
２４ ガス排出路
２６ ガス導入幹路
２８ ガス導入孔
３０ ガス排出幹路
３２ ガス排出孔
３４ ガス排出幹路
３６ ガス排出孔
３８ 電極を接続する透孔
４０ 電極を接続する透孔
４２ 隔壁１２を挿入する透孔
Claims (9)
- 互いに隣接して配置される第１の容器及び第２の容器と、
該第１及び第２の容器間に設けられた隔壁であって、脂質二重膜を形成する透孔を有する隔壁と
を具備する計測器具であって、
前記第１及び第２の容器の少なくとも一方に、表面が疎水性であるガス流路が形成されており、該ガス流路は、入口と出口を有し、該入口及び出口は、それぞれ前記計測器具の外部に連通しており、該ガス流路は、それが設けられている容器内に開口しており、該ガス流路内を流れるガスが、該容器内に充填される液滴に接触する、計測器具。 - 複数の前記ガス流路が設けられている、請求項１記載の計測器具。
- 前記ガス流路は、溝状の流路である請求項１又は２記載の計測器具。
- 前記ガス流路は、前記第１及び第２の容器の少なくとも一方の底面に設けられている、請求項１～３のいずれか１項に記載の計測器具。
- 前記第１及び第２の容器が、基板内に設けられたダブルウェルチャンバーの形態にある、請求項１～４のいずれか１項に記載の計測器具。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載の計測器具からなるユニットを複数具備し、各ユニットの各ガス流路の入口が各ガス導入路を介して互いに連通し、使用時には各ユニットに同時にガスを供給できる、計測器具。
- 請求項１～６のいずれか１項に記載の計測器具を用いた標的物質の計測方法であって、前記第１及び第２の容器に液滴を充填して前記透孔に前記脂質二重膜を形成し、標的物質を含むガス状の試料を前記ガス流路に流通させながら計測を行う、標的物質の計測方法。
- 標的物質を含まないガスを前記ガス流路に流通させ、前記液滴中の標的物質を除去する工程をさらに含む請求項７記載の方法。
- 請求項１～６のいずれか１項に記載の計測器具を用いた標的物質の計測において、前記第１及び第２の容器に液滴を充填して前記透孔に前記脂質二重膜を形成し、ガスを前記ガス流路に流通させて、該ガス流路と接触する液滴のかくはんを行う、脂質二重膜を用いた計測における液滴のかくはん方法。
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