CN111057692A - 一种酯酶、编码基因、载体、重组细胞及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种酯酶、编码基因、载体、重组细胞及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明通过从南极土壤中筛选克隆获得编码酯酶E2‑1404的基因，通过对其表达蛋白研究发现，通过对其表达蛋白研究发现，其能在高温和碱性环境下高效降解短链的pNP酯类(C2‑C4)，表明其可以作为高温条件下的酯类水解生物活性催化剂。这对高温条件下的工业生产有巨大的应用潜力，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种酯酶、编码基因、载体、重组细胞及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种酯酶、编码基因、载体、重组细胞及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

酯酶(esterase)，又称羧酸酯酶，是具有重要工业价值的生物催化剂之一，可以水解酯类底物产生酸类和醇类物质，也可以催化逆反应合成各种酯类。其通常作用于简单的酯类或低于10个碳原子的短链甘油酯。酯酶广泛存在于动物、植物和微生物中。相较于动、植物来源的酯酶，微生物来源的酯酶不仅种类多、来源广、作用高效，而且具有便于工业化生产、易纯化及生产成本低等优点。酯酶作为一种工业用酶，广泛应用于食品行业，医药行业，洗涤行业，环保行业，因此，微生物酯酶在生物技术领域应用最多，由于蛋白质的不稳定性，大多数酯酶不稳定，易受温度影响而使活性降低。

近年来，利用微生物酶法生产风味物质的运用引起了极大关注，风味物质被广泛应用于食品，洗涤，化妆品以及医药行业。目前，主要利用化学合成的方法获得风味物质，化学合成的方法其工艺复杂，反应条件苛刻，副产物难处理，反应成本较高且对环境有一定的污染。从原材料中提取风味产品，存在得到的产品较少，同样存在成本较高的问题。但是通过微生物酶法制备风味产品的方法具有许多优势，反应条件较为温和，不产生副反应和产物比较单一纯度较高，对环境不会造成污染。所以，近年来采用微生物酶法制备风味物逐渐成为研究热点。

短链和中长链的脂肪酸酯，因其具有果香味和较容易挥发被普遍的作为一类重要的风味物质。而酯酶可以分解，转化和生产这类风味物质，酯酶作为生物催化剂具有不需要辅因子，能够稳定存在有机试剂中，高区域和高独立选择性等优点。虽然酯酶广泛存在于各种生物体，但是具有商业价值的酯酶主要来源于微生物类群。根据其生化性质以及氨基酸序列，微生物来源的水解酶主要分为8个家族，这类脂质水解酶中只有很少一部分能够应用到风味物质工业生产中，还远远满足不了工业上对各类脂质水解酶的需求。

南极与其他大陆被南大洋和南极洋流隔开，它是一个几乎完全被冰盖覆盖的岩石陆地，只有大约2％的南极洲大陆是无冰的。南极地区各类生境微生物长期适应极地极端特殊环境，需要各种各样的生化和生理适应，这些适应常常伴随着基因调控和代谢途径的改变，导致生物合成具有特殊生物活性的酯酶，通过构建南极极端地域土壤样品的宏基因组文库，从而筛选得到大量具有特殊生物活性的酯酶，对于填补工业化酯酶的需求不足具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酯酶、编码基因、载体、重组细胞及其应用。本发明通过从南极土壤中筛选克隆获得编码酯酶E2-1404的基因，通过对其表达蛋白研究发现，本发明所述的来源于南极土壤酯酶E2-1404对高温具有很好的耐受性，可作为高温条件下具有高效活性的生物催化剂。

本发明的第一个方面，提供一种酯酶E2-1404，所述酯酶E2-1404是具有如下(a1)或(a2)特征的蛋白质：

(a1)其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列一致；

(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO.1所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的酯酶活性。

其中，SEQ ID NO.1由311个氨基酸残基组成。

本发明第二个方面，提供一种编码所述酯酶E2-1404的基因。所述酯酶E2-1404的编码基因从南极土壤中筛选克隆获得。

其中，所述基因具有(b1)-(b3)中任一所述核苷酸序列：

(b1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(b2)与(b1)互补的核苷酸序列；

(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明的第三个方面，提供一种重组表达载体，其包含上述基因。

所述的载体为细菌表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；真菌表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1。

进一步优选为pET系列载体，如pET22b。

本发明的第四个方面，提供一种重组细胞，其包含上述基因、上述重组表达载体或表达上述酯酶。

本发明的第六个方面，提供一种生产上述酯酶的方法，其包括培养上述重组细胞，回收纯化酯酶即得。

本发明的第七个方面，提供上述酯酶在催化水解酯类中的应用。

本发明有益技术效果：

本发明从南极土壤中克隆获得一种酯酶基因E2-1404，通过对其表达蛋白研究发现，其能在高温和碱性环境下高效降解短链的pNP酯类(C2-C4)，表明其可以作为高温条件下的酯类水解生物活性催化剂。这对高温条件下的工业生产有巨大的应用潜力，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1、本发明实施例2中经过镍柱亲和层析纯化后的纯酯酶E2-1404电泳图，M、蛋白质分子量标记(marker)；

图2、本发明实施例3中酯酶E2-1404的降解底物活性分析柱状图；

图3、本发明实施例3中酯酶E2-1404的酶活温度曲线图；

其中：(A)温度对酶活性的影响曲线图；(B)温度对酶稳定性的影响曲线图；

图4、本发明实施例3中酯酶E2-1404的酶活pH曲线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明的一个具体实施方式中，提供一种酯酶E2-1404，所述酯酶E2-1404是具有如下(a1)或(a2)特征的蛋白质：

(a1)其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列一致；

(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO.1所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的酯酶活性。

其中，SEQ ID NO.1由311个氨基酸残基组成。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种编码所述酯酶E2-1404的基因。所述酯酶E2-1404的编码基因从南极土壤中筛选克隆获得。

其中，所述基因具有(b1)-(b3)中任一所述核苷酸序列：

(b1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(b2)与(b1)互补的核苷酸序列；

(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种重组表达载体，其包含上述基因。

所述的载体为细菌表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；真菌表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1。

本发明的又一具体实施方式中，进一步优选为pET系列载体，如pET22b。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种重组细胞，其包含上述基因、上述重组表达载体或表达上述酯酶。

本发明的又一具体实施方式中，所述重组细胞包括但不限于细菌和真菌，进一步选自埃希氏大肠杆菌、芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、里氏木霉和草酸青霉；更进一步优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种生产上述酯酶的方法，其包括培养上述重组细胞，回收纯化酯酶即得。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述酯酶在催化水解酯类中的应用。

所述酯类为短链酯类，所述短链酯类具体为碳链长度为2～4个碳原子的酯类化合物。

所述应用环境可以为高温和/或碱性环境；

所述高温环境为不低于60℃，如60～100℃。

所述碱性环境为不低于7，优选为7.5～9.0，最优选为8.5。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

培养基：

LB液体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。

LB固体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。

实施例1：南极土壤来源酯酶E2-1404编码基因序列的获取及其序列分析

菌种来源：南极长城站附近区域位点E2的土壤样品宏基因组文库中大肠杆菌EPI300克隆子E2-1404。

具体步骤如下：

1.1亚克隆文库的构建

用OMEGA公司的BAC/PAC DNA提取试剂盒按照其说明提取大肠杆菌EPI300克隆子E2-1404中的大片段质粒fosmid。然后用限制性内切酶Sau3AI(购自Fermentas公司)对提取到的fosmid进行部分消化，以获取2,000-5,000bp的DNA片段，将其连接到经BamHI消化及去磷酸化处理的pUC19质粒(购自NEB公司)上。连接反应液电转E.coli Top10感受态细胞，涂布含有100μg/ml氨苄青霉素和1％(v/v)三丁酸甘油酯(购自Sigma公司)的LB固体平板，37℃倒置培养12～16h，构建成克隆子E2-1404的fosmid DNA的亚克隆文库。

1.2酯类水解酶基因序列的确定

选取固体平板上产生透明降解圈的亚克隆，提取质粒并进行测序。用NCBIORFFinder软件预测DNA序列上可能的开放阅读框架。用BLASTX在NCBI nr库中对预测的开放阅读框架进行相似性搜索，以确定克隆子E2-1404上携带的酯酶基因序列E2-1404，基因E2-1404共936bp，其中含有一个936bp的开放阅读框架，其编码南极土壤来源酯酶E2-1404，起始密码子位于1bp，终止密码子位于934bp，共编码311个氨基酸的蛋白。南极土壤来源酯酶E2-1404的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。获得的南极土壤来源酯酶E2-1404编码基因E2-1404的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

1.3南极土壤来源酯酶的序列分析

GenBank中，与南极土壤来源酯酶E2-1404最相似的序列为来源于Pseudomonassp.IB20的alpha/beta水解酶(WP_094949323.1)，序列相似性为99％。同时，BLAST给出的序列与南极土壤来源酯酶E2-1404相似度在80％-99％之间，均为基于基因序列预测的基因，生化性质均尚未被研究。

实施例2：酯酶的克隆、异源表达及分离纯化

2.1利用PCR对基因序列进行扩增

(1)根据基因E2-1404序列设计两条特异性引物：

1404F:AAGAAGGAGATATACATATGCGCATGTACCCGATTTCTCCGCA

(SEQ ID NO.3)；

1404R:TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGACCTGTGTCAGCCGCTCGCTCC

(SEQ ID NO.4)；

引物由济南铂尚生物技术有限公司合成。

(2)以1404F和1404R为引物，以基因E2-1404所在的fosmid为模板，用FastPfu DNA聚合酶(购自Transgen公司)扩增目的基因片段；

PCR反应条件为：95℃预变性2min；然后95℃变性20sec，50℃退火20sec，72℃延伸1min，30个循环后；72℃延伸10min。

(3)对PCR扩增产物进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约1,000bp的DNA片段。然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

(4)使用无缝克隆试剂盒(购自近岸蛋白质科技有限公司)将回收的E2-1404基因片段连接到pET22b载体上。

(5)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态。

(6)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pET22b载体转至大肠杆菌DH5α感受态。

(7)转化的大肠杆菌DH5α涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养。挑选阳性克隆子，转接至LB液体培养基中培养，提取质粒。

上述LB固体培养基组分如下：

1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。

上述LB液体培养基组分如下：

1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。

2.2重组表达载体pET22b-E2-1404转化到E.coli BL21(DE3)中

(1)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌BL21感受态；

(2)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将测序正确的重组载体pET22b-E2-1404转至大肠杆菌BL21感受态；

(3)将转化的大肠杆菌BL21涂于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。

2.3基因E2-1404在南极土壤微生物中诱导表达与纯化

(1)在平板上刮取菌苔，接于100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养2～3h；

(2)按1％(v/v)接种量转接到1,000ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.1mM，继续在16℃摇床培养24h；

(3)收集经过IPTG诱导表达的LB培养液，4℃，11,000rpm离心5min，收集菌体；

(4)用含100mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)悬浮菌体；

(5)将重新悬浮的菌液进行超声破碎；

(6)将破碎后的菌液4℃，11,000rpm离心30min，收集上清液；

(7)收集上清，4℃，11,000rpm离心20min，收集上清22μm滤膜过滤。

(8)将上清液按照说明书的要求进行镍柱亲和层析；

(9)层析后收集的样品用SDS-PAGE检测纯度，证明已经获得南极酯酶E2-1404的电泳纯酶(如图1)。通过透析除去咪唑，最后置于-20℃保存备用。

实施例3:南极酯酶E2-1404的性质测定

3.1底物特异性分析

用异丙醇配制不同碳链长度的pNP酯底物，C2、C4、C8、C10、C12、C14(购自Sigma公司)。

标准反应为：

20μl 10mMpNPC4底物与960μl 50mM Tris-HCl(pH 8.0)混合液于40℃预热3min后，加入20μl稀释好的酶液并于40℃反应10min，立即加100μl20wt％SDS(十二烷基硫酸钠)终止反应，测定OD405值。以不加酶液的反应作为空白对照。标准曲线以不同浓度的pNP(购自Sigma公司)来绘制。

酶活力定义为，在一定温度下，每分钟催化pNP酯底物水解产生1μM pNP所需的酶量为一个酶活力单位(U)。结果表明，南极酯酶E2-1404能高效降解短链的pNP酯底物(C2～C16)，其中对C4底物的降解能力最强，比活力为1867U/mg(如图2)。

3.2最适温度及温度稳定性分析

最适反应温度的测定：以pNPC4为底物，在50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，分别检测南极土壤来源酯酶E2-1404在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃下的酶活。最高酶活定义为100％。

结果表明该酶的最适酶活温度为90℃，其在60～100℃保留超过70％的高活力(如图3A)。

温度稳定性分析：酶液在95℃温育，2小时内每隔15min取出相同酶量检测南极土壤来源酯酶E2-1404在40℃、50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中的残余活力。

0℃酶活定义为100％，

结果表明，南极土壤来源酯酶E2-1404为热稳定酶，在95℃中2h仍保持80％以上酶活(如图3B)。

3.3最适pH分析

pNPC4底物在碱性条件下不稳定，酶反应完成后向反应体系中加入等体积的含2wt％SDS的2M Tris-HCl(pH 7.0)终止液以去除pH对反应的影响。

最适反应pH的测定：配制pH值在4.0～11.0范围内、间隔1个pH单位的Britton-Robinson缓冲液。测定南极土壤来源酯酶E2-1404在40℃、不同pH条件下的酶活，最高酶活定义为100％。

结果表明南极土壤来源酯酶E2-1404是碱性酯酶，其最适pH为8.5(如图4)。

4.结果

通过构建亚克隆文库和后期测序，确定了大肠杆菌克隆子E2-1404中fosmid上所携带的酯酶基因E2-1404的核酸序列。根据E2-1404基因序列设计特异性引物，利用PCR技术从E2-1404克隆子的fosmid DNA克隆了编码南极土壤来源的酯酶E2-1404的基因片段，构建了含南极土壤来源酯酶基因E2-1404的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。

基因E2-1404含有一个936的开放阅读框架，其编码南极土壤来源酯酶E2-1404，起始密码子位于1bp，终止密码子位于934bp，共编码311个氨基酸的前体蛋白。将基因E2-1404在大肠杆菌中进行异源表达和纯化，获得成熟有活性的酯酶E2-1404。

对纯化的酯酶E2-1404进行性质测定。结果表明该酶对碳链长度在2～4个碳原子的短链酯类表现出较强的降解活性(图2)。其在60～100℃范围内保持很高的酶活力，且能在95℃条件下稳定存在(图3B)，最适pH为8.5(图4)。结果表明南极土壤来源的酯酶E2-1404能够在高温下保持稳定活性，在工业应用中具有重要的应用潜力。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种酯酶、编码基因、载体、重组细胞及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Arg Met Tyr Pro Ile Ser Pro Gln Met Ala Ala Phe Val Ala Lys

1 5 10 15

Thr Glu Ser Phe Thr Ser Asp Asp Ser Ser Leu Ala Gly Leu Arg Gln

20 25 30

Asn Tyr Asp Arg Met Cys Gln Ala Phe Thr Pro Ala Gln Pro Asp Glu

35 40 45

Leu Gln Val Ser Asp Ala Thr Leu Gly Gly Val Lys Val Arg Cys Tyr

50 55 60

His Pro Ala Thr Thr Pro Pro Ala Gln Gly Trp Pro Cys Leu Leu Tyr

65 70 75 80

Met His Gly Gly Gly Trp Val Val Gly Gly Leu Asp Ser His Asp Phe

85 90 95

Ile Cys Phe Glu Leu Ala Ser Ala Leu Gln Val Leu Val Ile Ala Ile

100 105 110

Asp Tyr Arg Leu Ala Pro Glu His Pro Phe Pro Ala Ala Tyr Gln Asp

115 120 125

Cys Arg Ala Val Trp Gln Ala Ile Gln Ala Gly Gln Gly Pro His Ala

130 135 140

Ile Asn Arg Gln Arg Leu Val Val Met Gly Asp Ser Ala Gly Gly Asn

145 150 155 160

Leu Ala Ala Ala Leu Cys Leu Gly Leu Arg Asp Asp Gly Leu Pro Leu

165 170 175

Pro Cys Ala Gln Val Leu Ile Tyr Pro Gly Leu Gly Gly Pro Ala Asp

180 185 190

Leu Pro Ser Arg Arg Asp Cys Arg Asp Ala Pro Leu Leu Ser Thr Ala

195 200 205

Asp Thr Gly Asp Tyr Leu Ala Leu Tyr Leu Gln Gly Ala Gly Lys Pro

210 215 220

Ser Ala Tyr Ala Met Pro Leu Leu Ala Glu Asp Phe Ser Gly Leu Pro

225 230 235 240

Lys Ala Leu Ile Ala Val Ala Gln Phe Asp Pro Leu Arg Asp Asp Gly

245 250 255

Met Leu Tyr Ala Glu Arg Leu Gln Ala Ala Gly Val Glu Ala Val Leu

260 265 270

Tyr Pro Gly Lys Gly Leu Val His Gly Cys Leu Arg Ala Arg Gly Gln

275 280 285

Ala Pro Glu Val Asp Gln Leu Tyr Asp Tyr Leu Leu Ser Tyr Val Arg

290 295 300

Ser Glu Arg Leu Thr Gln Val

305 310

<210> 2

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgcgcatgt acccgatttc tccgcagatg gcggcctttg ttgccaagac tgagtccttc 60

accagtgacg attcatcgct ggccggcttg cgccagaact acgatcgcat gtgccaggcg 120

ttcaccccgg cgcagcctga tgagctgcaa gtctcggacg ctacgcttgg cggggtgaag 180

gttcgctgct atcaccccgc aacgacccct ccagcgcaag gctggccatg cctcctttat 240

atgcacggcg gcggctgggt ggtcggcggg ctggattccc atgatttcat ctgcttcgaa 300

ctggccagcg cgctgcaggt gctggtgatt gccatcgact accgtctggc gccggagcat 360

ccgttcccgg cggcgtacca agattgccgc gcggtttggc aggcgatcca agcggggcag 420

gggccgcacg ccatcaaccg gcagcgcctg gtggtgatgg gtgacagcgc gggcggcaat 480

ctggcggcgg cgttgtgcct gggcctgcgc gacgacggcc tgccgctgcc ctgcgcccag 540

gtgctgattt atcccgggtt gggcgggccg gccgatttgc cgtcgcgccg tgactgcagg 600

gacgcgccgc tgctcagtac cgccgacact ggcgactacc tggcgctgta cctgcagggg 660

gcgggcaagc cgtctgccta tgccatgcca ctgctggccg aggatttcag cggcttgccc 720

aaggcgctga tcgccgtggc ccagttcgac ccgctgcgcg acgacggcat gctgtatgcc 780

gaacgcctgc aagcggcggg cgtcgaggcc gtgctgtatc ccggcaaagg cttggtccac 840

ggctgtttgc gcgcgcgcgg ccaggcgccg gaggtggatc agctgtacga ctacctgttg 900

tcttacgtga ggagcgagcg gctgacacag gtctaa 936

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagaaggaga tatacatatg cgcatgtacc cgatttctcc gca 43

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcgagtgcgg ccgcaagctt gacctgtgtc agccgctcgc tcc 43

Claims (10)

1.一种酯酶E2-1404，其特征在于，所述酯酶E2-1404是具有如下(a1)或(a2)特征的蛋白质：

(a1)其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列一致；

(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO.1所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的酯酶活性。

2.一种编码所述酯酶E2-1404的基因。

3.如权利要求2所述基因，其特征在于，所述基因具有(b1)-(b3)中任一所述核苷酸序列：

(b1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(b2)与(b1)互补的核苷酸序列；

(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

4.一种重组表达载体，其特征在于，其包含权利要求2或3所述的基因。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的载体为细菌表达载体，包括pET系列载体，pQE系列载体；真菌表达载体，包括pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1；

优选为pET系列载体，进一步优选为pET22b。

6.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求2或3所述基因、权利要求4或5所述重组表达载体或表达权利要求1所述酯酶。

7.如权利要求6所述重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括但不限于细菌和真菌，进一步选自埃希氏大肠杆菌、芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、里氏木霉和草酸青霉；更进一步优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

8.一种生产权利要求1所述酯酶的方法，其特征在于，其包括培养权利要求6或7所述重组细胞，回收纯化酯酶即得。

9.权利要求1所述酯酶在催化水解酯类中的应用。

10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述酯类为短链酯类，所述短链酯类具体为碳链长度为2～4个碳原子的酯类化合物；

优选的，所述应用环境为高温和/或碱性环境；

优选的，所述高温环境为不低于60℃，如60～100℃；

优选的，所述碱性环境为不低于7，优选为7.5～9.0，最优选为8.5。

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