KR100524870B1 - 비브리오 메치니코비 ｒｈ530 ｎ-4-8 유래의 알칼리성 지방질 분해효소 및 이를 코드하는 뉴클레오티드 서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비브리오 메치니코비(Vibrio metschnikovii) RH530으로부터 유래한 알칼리성 지방질 분해효소 및 이를 코드하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 알칼리성 지방질 분해효소 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 상기 알칼리성 지방질 분해효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 알칼리성 지방질 분해효소에 의하면, 높은 pH(10~11)에서 최적 활성을 보이고, 효소 잔존율도 매우 높으며, 계면활성제와의 적합성도 높아 세탁 세제용 효소로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

비브리오 메치니코비 ＲＨ530 Ｎ-4-8 유래의 알칼리성 지방질 분해효소 및 이를 코드하는 뉴클레오티드 서열{An alkaline lipase from Vibrio metschnikovii RH530 N-4-8 and a nucleotide sequence encoding the same}

본 발명은 비브리오 메치니코비(Vibrio metschnikovii) RH530 N-4-8 균주로부터 유래한 알칼리성 지방질 분해효소 및 이를 코드하는 유전자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 형질전환 숙주세포 및 상기 형질전환 숙주세포를 이용한 알칼리성 지방질 분해효소의 생산방법에 관한 것이다.

알칼리성 지방질 분해효소는 알칼리성 pH 하에서 트리아실글리세롤을 글리세롤과 지방산으로 분해하는 효소를 말한다. 알칼리성 지방질 분해효소를 생산하는 미생물은 지금까지 다양하게 보고되고 있다. 이중에, 슈도모나스속(Pseudomonas), 바실러스속(Bacillus) 등이 대표적으로 알려져 있다. 이러한 효소들은 세제와 같은 알칼리성 조건에서 지방질 분해를 필요로 하는 산업분야에 응용되어 왔다.

한편, 현재 시판중인 세제용 지방질 분해 효소의 생화학적 특성은 약알칼리성 pH(8~9)에서 최적의 활성을 나타내고, LAS와 같은 음이온 계면활성제 하에서 비교적 빠르게 불활성화된다.

따라서, 보다 높은 pH(10~11)에서 최적 활성을 보이고, 효소 잔존율도 매우 높으며, 계면활성제와 적합성도 높은 지방질 분해효소의 필요성이 존재하고 있었다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 연구하던 중, 대한민국 특허 제145277호 및 제258740호에 개시되어 있는 세제용 단백질 분해효소를 생산하는 균주인 비브리오 메치니코비 RH530 N-4-8 균주(V. metschnikovii RH530 N-4-8: 한국종균협회에 1998년 2월 23일자로 기탁하였음. 기탁번호 KFCC-11030)가 지방질 분해효소도 생산한다는 사실을 발견하고, 이의 생화학적 특성 및 이를 코딩하는 유전자, 계면 활성제에 대한 저항성 등을 연구하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 목적은 높은 pH(10~11)에서 최적 활성을 보이고, 효소 잔존율도 매우 높으며, 계면활성제와의 적합성도 높은 지방질 분해효소를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명을 목적은 상기 지방질 분해효소를 코드하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 지방질 분해효소를 코드하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 형질전환 숙주세포를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 형질전환 숙주세포를 배양하여 상기 지방질 분해효소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 비브리오 메치니코비 RH530 N-4-8 균주(Vibrio metschnikovii RH530 N-4-8)로부터 유래한 알칼리성 지방질 분해효소는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 벡터는, 서열번호 5의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 바람직하기로는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하기로는 pHL1, pHLB29 또는 pHAAH38이다.

본 발명의 형질전환된 형질전환 숙주세포는, 서열번호 5의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 바람직하기로는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 것임을 특징으로 한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하기로는 pHL1, pHLB29 또는 pHAAH38이다. 상기 형질전환된 형질전환 숙주세포는, 바람직하기로는 상기 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 대장균이다. 상기 형질전환된 대장균은 바람직하기로는, HB101(pHL1)이다.

또한, 본 발명의 비브리오 메치니코비 RH530 N-4-8 균주(Vibrio metschnikovii RH530 N-4-8)로부터 유래한 알칼리성 지방질 분해효소를 제조하는 방법은, 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 세제는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 비브리오 메치니코비(Vibrio metschnikovii) RH530 N-4-8 균주로부터 유래한 알칼리성 지방질 분해효소를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 세제는 바람직하기로는, 액상 또는 분말상을 띄는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

본 실시예에는 대한민국 특허 제10-0145277호 및 제10-0258740호에서 이미 공지된 세제용 단백질 분해효소를 생산하는 균주인 비브리오 메치니코비 RH530 N-4-8 균주(V. metschnikovii RH530 N-4-8 )가 지방질 분해효소도 생산한다는 사실을 발견하고, 이의 생화학적 특성 및 이를 코딩하는 유전자, 계면 활성제에 대한 저항성 등을 연구하였다.

먼저, 알칼리성 지방질 분해효소를 코딩하는 유전자를 분리하기 위해 비브리오 메치니코비 RH530 N-4-8 균주를 배양 후 세포를 수확하여 리소자임을 처리하여 세포를 용해시켰다. 여기에 페놀과 클로르포름을 처리하여 단백질을 제거하고, 고형물을 원심분리로 제거한 상등액에서 비브리오의 염색체 DNA를 얻었다. 얻어진 염색체 DNA를 제한효소로 잘라서 유전자 운반체인 벡터(pUC19)에 재조합하여 pHL1, pHLB29 등의 재조합 벡터를 제작하였고, 이를 대장균에 형질전환하였다. 클로닝된 균주의 스크리닝은, 표1에 명시된 배지에 지방질 분해효소의 기질인 트리부티린(tributyrin) 혹은 트리카프릴린(tricaprylin)을 0.5%~1%되게 첨가하고 유화제로 폴리옥시에틸렌(7eo)을 0.1%, 아가를 1.8%되게 첨가하여 제조된 배지에서 자란 콜로니 주위에 투명환을 형성하는 균주를 선별하였다. 이렇게 선별된 대장균을 HB101(pHL1)이라 하였다.

제조된 재조합 대장균 HB101(pHL1)에서 추출한 조효소액으로, 알칼리성 pH 조건에서 지방질 분해효소의 활성을 측정하여, 알칼리성 지방질 분해효소의 발현을 확인하였다.

상기 재조합 벡터를 제한효소로 잘라 재조합 벡터 중에 삽입된 외래 DNA 단편의 염기서열을 밝혔다.

실시예1: 알칼리성 지방질 분해효소 유전자의 클로닝

비브리오 메치니코비 RH530 N-4-8 균주를 하기 표1의 조성으로 된 배지를 이용하여 30℃ 에서 배양한 후에 세포를 회수하고 리소자임을 처리하여 세포를 용해시켰다. 여기에 페놀과 클로르포름을 처리하여 단백질을 제거하고, 고형물을 원심분리로 제거한 상등액에서 비브리오의 염색체 DNA를 얻었다. 이 염색체 DNA를 제한효소인 HindIII로 잘라서 운반체인 벡터(pUC19)에 재조합하고, 대장균 HB101에 형질 전환하여 3.2Kb의 알칼리성 지방질 분해효소 유전자를 포함하는 DNA 단편을 클로닝하였다. 이 클론을 벡터 pHL1(도1)이라 명명하였다. 클로닝한 제한효소인 HindIII로 처리한 후 1% 아가로즈 젤 전기영동을 하였다. 아가로즈 젤 전기영동을 통하여 분석한 결과 알칼리성 지방질 분해효소 유전자가 클로닝되었음을 확인하였다(도2).

LSC 배지

조성	함량(g/L)
트립톤(Trypton)	10
이스트 익스트랙트(Yeast extract)	5
염화나트륨(Sodium chloride)	10
1M 탄산나트륨 완충용액 (Sodium carbonate buffer, pH 10.5)	100(㎖/L)

실시예2 : pHL1의 서던 블롯팅

도1의 구조를 갖는 재조합 벡터 pHL1에 포함되어 있는 비브리오 메치니코비 유래의 알칼리성 지방질 분해효소 유전자를 포함하는 DNA 단편이 원균주로부터 유래되었음을 확인하기 위해 서던 블롯팅을 수행하였다.

프로브는 pHL1을 제한효소인 AvaⅠ과 EcoRⅠ을 이용하여 자른 0.8kb의 DIG(DIG DNA Labelling Kit, Roche Diagnostics)가 표지된 DNA 조각을 사용하고, 원 균주인 Vibrio metschnikovii RH530 N-4-8에서 추출한 염색체 DNA와 블롯팅한 결과, 3.2kb에서 유색의 밴드가 확인되었다(도 3a 및 3b).

이로써 재조합 벡터인 pHL1에 포함되어 있는 유전자가 원균주인 비브리오 메치니코비이 RH530 N-4-8 균주에서 유래된 것임을 확인할 수 있었다(도 3a, 3b 및 도4).

실시예3 : 지방질 분해효소 유전자의 위치 확인을 위한 서브클로닝

재조합된 벡터에 삽입되어 있는 외래 DNA 중의 유전자의 위치를 확인하기 위하여, 3.2kb의 DNA를 엑소 뉴크레아제인 Bal31로 처리하여 지방질 분해효소의 발현에 필수적인 최소 길이로 서브클로닝하였다.

지방 분해효소의 생산은 투명환(halo) 형성을 통해 평가하였으며, 서브클로닝 결과 지방질 분해효소의 활성에 2.6kb DNA 단편이 필수적임을 알아내었다. 이러한 최소 길이의 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 pHLB29라 명명하였다.

또한, 2.6kb의 DNA 단편은 pUC19의 SmaⅠ사이트에 역방향으로 서브클로닝하고, pHAAH38라 명명하였다.

pHAAH38은 2.6kb의 DNA 단편이 lac 프로모터까지 역 방향임에도 불구하고, 트리카프릴린 배지에서 할로를 형성함으로써, 상기 2.6kb DNA 단편에 알칼리성 지방질 분해효소의 프로모터가 존재하고, 대장균에서 전사될 때에 자신의 프로모터를 사용한다는 것을 알아내었다(도5).

실시예4: 염기서열 분석을 위한 재조합 벡터의 제작

위에서 제작된 재조합 벡터 pHL1의 DNA 삽입체를 여러 가지 제한 효소를 이용해 작은 크기로 자른 후, 다시 pUC19 벡터에 재도입하여 대장균을 형질전환시켰다. 이 재조합 벡터 중의 삽입체의 DNA 염기서열 분석을 수행한 결과를 서열번호 1에 나타내었다. 한 개의 프로모터 하에 797bp(서열번호 2), 554bp(서열번호 4)로 이루어진 두 개의 유전자(ORF1, ORF2)가 존재한다는 것을 알아내었다. 이들로부터 발현되는 효소를 각각 Val L1 및 Val L2라 명명하고, 이를 코딩하는 유전자를 각각 valL1 및 valL2라 명명하였다. valL1 및 valL2 유전자의 염기서열은 각각 서열번호 2와 4에 나타내었으며, 이들이 코드하는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 각각 서열번호 3과 5에 나타내었다. 또한, 원핵 세포에 공통적인 -35, -10부위와 일치되는 염기 서열을 발견할 수 있었으며, 샤인 달가노 서열(SD sequence)도 가지고 있음이 확인되었다(도4). 이 부위의 서열과 다른 여러 가지 지방질 분해효소의 서열에 대한 상동성을 비교한 결과, 두 번째 유전자에서 슈도모나스 글루매(Pseudomonas glumae)와 부크홀더리아 세파시아(Burkholderia cepacia)의 지방질 분해효소의 유전자와 각각 17.5%, 18.3%의 상동성을 보였다. 그리고, 이 유전자에서 지방질 분해효소의 활성부위를 이루는 G-X1-S-X2-G와 일치되는 부분을 갖고 있는 것을 볼 수 있었다(도6). 따라서, 이 유전자는 지방질 분해 효소의 유전자이며, 앞쪽의 유전자는 지방 분해효소의 샤페론(chaperon)이거나 세포외 분비에 보조역할을 하는 유전자라고 사료된다.

실시예5: 알칼리성 지방질 분해효소의 활성과 안정도 측정

효소 활성의 측정방법은 천연 오일(oil)을 유화시켜 수행하는 방법과는 달리, 합성 기질인 p-니트로페닐 팔미테이트(p-nitrophenyl palmitate :pNPP)를 기질로 하여 측정하였다. 먼저, 모주인 비브리오 메치니코비 RH530(V. metschnikovii RH530) 또는 지방질 분해효소 유전자가 클로닝된 재조합 균주를 배양하여 얻어진 조효소액 20㎕를 50mM 트리스-염산(pH6.8)과 0.5% 아라빅검이 포함된 완충용액 880㎕에 첨가하였다. 그 후, 100mM p-나이트로페닐 팔미테이트 용액 100㎕을 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 반응시켰다. 10분 후에 3M 염산 0.5ml을 첨가하여 반응을 정지시킨 다음, 원심 분리하여 1ml의 상등액에 2M NaOH 3ml를 첨가하여, 420nm에서 흡광도를 측정하였다.

다른 방법으로는 기질로 p-나이트로페닐 부티레이트(p-nitrophenyl butyrate; p-NPB)을 사용하였다. 먼저, p-나이트로페닐 부티레이트를 디메실술폭사이드에 10mM 되게 용해시켜 기질 용액을 제조하였다. 이 기질용액 30㎕를 50mM 트리스-염산과 0.1% 트리톤-X-100(pH8.2)이 포함된 완충용액과 섞고, 30㎕의 지방질 분해 조효소액을 첨가하여 최종 3ml를 만들었다. 역시 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후에, 아세톤 3ml을 첨가하여 반응을 정지시킨 다음, 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

단백질의 정량분석은 보바인 시럼 알부민(BSA)을 기준으로 하여 로우리(Lowry)의 방법을 따랐다.

실시예6: 프로모터 앞부분이 효소의 발현에 미치는 영향 연구

프로모터 앞부분이 비브리오 메치니코비 알칼리성 지방질 분해효소의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 제한효소를 사용하여 프로모터 앞부분을 제거하였다. 효소의 활성측정은 p-나이트로페닐 부티레이트(p-nitrophenyl butyrate; p-NPB)를 기질로 이용하였으며, 제한효소는 BamHⅠ, AflⅢ를 사용하였다. 그 결과, 프로모터 앞부분이 500bp가 제거되면, 효소의 역가가 정상적인 것보다 40%정도 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

이로서, 프로모터 앞부분은 효소의 발현에 중요한 영향을 미치는 것을 유추할 수 있었다(도 7a 및 7b).

실시예7: 재조합 균주에서 추출한 지방질 분해효소의 생화학적 특성

온도, pH, 계면활성제나 세제가 지방질 분해 효소의 활성도에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 지방질 분해효소의 유전자를 함유한 재조합 균주로부터 조효소액을 제조하여 아래와 같은 실험을 수행하였다.

(1) 온도가 효소의 활성도와 안정성에 미치는 영향

온도의 영향을 알아보기 위해서, 지방질 분해 효소 유전자를 포함하고 있는 대장균 HB101(pHL1)를 표1에 예시한 배지에서 18시간 배양하여 균체를 회수하였다. 그 후, 생리 식염수로 2회 세척하고, 소니케이터 혹은 프렌치 프레스 등으로 균체를 파쇄하고, 15,000rpm에서 30분간 원심분리하였다. 원심분리에서 얻어진 상등액을 조효소액으로 사용하였다. 조효소액을 p-NPB와 혼합하여, 10℃에서 80℃ 까지의 다양한 온도 범위에서 2시간 반응시킨 후, 지방질 분해 효소의 활성도와 안정성을 앞에서 서술한 역가 측정 방법으로 수행하였다. 그 결과, 50~60℃에서 가장 높은 활성도를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 잔존활성을 측정한 결과 40℃까지는 안정하지만, 60℃부터는 급격히 안정도가 떨어짐을 확인할 수 있었다(도8a 및 b)

(2) pH가 효소의 활성도와 안정성에 미치는 영향.

pH가 효소의 활성도와 안정성에 미치는 영향을 조사하기 위해, 상기와 같은 방법으로 추출한 조효소액으로 반응 조건을 동일하게 하여 최적 pH 및 여러 버퍼(50mM sodium phosphate(pH 6∼7): ◆, 50mM Tris-HCl(pH 7∼9): ■, 50mM 소듐 카보네이트(sodium carbonate)(pH 9∼11): ▲, 50mM 소듐-포스페이트(sodium phosphate)-NaOH(pH 11∼12): *) 하에서의 효소 잔존율을 조사하였다. 그 결과, 최적 pH는 10∼11이었다. pH에 대한 효소 잔존율은 20℃에서 12시간 방치 후, 잔존 활성을 조사하였으며, 그 결과 pH 8∼10사이에서 매우 안정함을 확인할 수 있었다(도 9b).

(3) 계면활성제가 효소의 활성도와 안정성에 미치는 영향.

세제의 주성분인 계면활성제에 대한 저항성을 측정하기 위해, 소디움-알파올레핀술포네이트(AOS; sodium-alphaolefinsulfonate), 소디움알킬벤젠-술포네이트 (LAS; sodium alkylbenzen-sulfonate), 소디움 도데실 설페이트(SDS; sodium dodecyl sulfate)를 효소액에 섞어준 후, 0.5%의 트리카프릴린 배지에 스팟팅하였다.

그 결과, 비브리오 알칼리성 지방질 분해효소는 0.07%의 소디움알킬벤젠-술포네이트(LAS), 0.1%의 소디움-올레핀술포네이트(AOS)에 내성을 갖음을 확인할 수 있었다.

또한, 0.1%의 소디움 도데실 설페이트(SDS)에서도 효소가 활성을 보임으로써 이 효소가 세탁 세제의 첨가제로 적합함을 알 수 있었다(도11).

현재 시판중인 세제용 지방질 분해 효소의 생화학적 특성이 약알칼리성 pH(8~9)에서 최적의 활성을 나타내고, LAS와 같은 음이온 계면활성제 하에서 비교적 빠르게 불활성화된다. 이에 비해, 본 명세서에 개시된 지방질 분해 효소는 높은 pH(10~11)에서 최적 활성을 보이고, 효소 잔존율도 매우 높으며, 계면활성제와 적합성도 높으므로, 기존의 지방질 분해효소보다 성능면에서 우수하다고 판단되며, 세탁세제용 효소로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

본 실시예에서 제조된 재조합 벡터의 기탁

본 실시예에서 제조된 재조합 벡터 pHL1, pHLB29은 국제 기탁기관인 한국종균협회에 2002년 6월 11일자로 기탁번호 KCCM-10384, KCCM-10385로 기탁하였다.

본 발명의 알칼리성 지방질 분해효소에 의하면, 높은 pH(10~11)에서 최적 활성을 보이고, 효소 잔존율도 매우 높으며, 계면활성제와의 적합성도 높아 세탁 세제용 효소로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 알칼리성 지방질 분해효소를 코드하는 유전자는, 기존의 다른 알칼리성 지방질 분해효소의 유전자와 상동성이 매우 낮으며, 높은 pH(10~11)에서 최적 활성을 보이고, 효소 잔존율도 매우 높으며, 계면활성제와의 적합성도 높아 세탁 세제용 효소로서 유용한 알칼리성 지방질 분해효소를 코드한다.

도1은 본 발명의 알칼리성 지방질 분해효소의 유전자를 포함하는 3.2kb DNA 삽입체(valL)가 포함된 재조합 벡터 pHL1을 나타내는 도면이다.

도2는 본 발명의 알칼리성 지방질 분해 효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pHL1의 아가로즈 젤 전기영동 사진으로서, M은 사이즈 마커이고, 1 레인은 수퍼코일 형태의 pUC19이고, 2 레인은 HindIII로 소화된 pUC19이고, 3레인은 HindIII로 소화된 재조합 벡터 pHL1로서, 2.7Kb 위치의 밴드는 벡터 pUC19이고, 3.2Kb 위치의 밴드는 본 발명의 알칼리성 지방질 분해 효소 유전자를 포함하는 DNA 삽입체이며, 4 레인은 수퍼코일 형태의 재조합 벡터 pHL1이다.

도3a는 본 발명의 알칼리성 지방질 분해 효소 유전자를 포함하는 DNA 단편의 아가로즈 젤 전기영동 사진이고, 도3b는 서던 블롯팅 사진으로서, M은 DIG로 표지된 사이즈 마커이고, 1 레인은 비브리오 메치니코비 염색체 DNA이고, 2 레인은 HindIII로 소화된 비브리오 메치니코비 염색체 DNA이고, 3 레인은 AvaI 및 EcoRI로 소화된 비브리오 메치니코비 염색체 DNA이고, 4레인은 HindIII로 소화된 pUC19이고, 5 레인은 수퍼코일 형태의 재조합 벡터 pHL1이고, 6 레인은 HindIII로 소화된 재조합 벡터 pHL1이고, 7 레인은 재조합 벡터 pHL1/AvaI, EcoRI (프로브)이다.

도4a 및 b는 본 발명의 비브리오 유래의 알칼리성 지방질 분해 효소 유전자가 포함된 DNA 삽입체의 염기서열, 조절인자 및 이로부터 추론되는 아미노산 배열을 나타내는 도면이다.

도5는 재조합 벡터 pHL1의 DNA 삽입체 중 본 발명의 알칼리성 지방질 분해효소의 발현에 필수적인 최소 길이와 유전자의 위치를 확인한 제한효소 지도이다.

도6은 본 발명의 알칼리성 지방질 분해 효소의 유전자로부터 유추된 아미노산 서열과 슈도모나스 글루매(Pseudomonas glumae), 부크홀더리아 세파시아(Burkholderia cepacia)와의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타내는 도면이다.

도7a는 본 발명의 알칼리성 지방질 분해 효소 유전자의 프로모터 앞부분의 제한효소지도이고, 도7b는 제한효소를 이용하여 프로모터 앞부분을 제거했을 때의 활성 변화를 나타내는 도면이다.

도8a는 온도에 따른 본 발명의 알칼리성 지방질 분해 효소의 활성도 변화를 나타내는 도면이고, 도8b는 온도에 따른 잔존 활성 측정 결과를 나타내는 도면이다.

도9a는 pH 변화에 따른 본 발명의 알칼리성 지방질 분해 효소의 활성도 변화를 나타내는 도면이고, 도9b는 pH 변화에 따른 잔존 활성 측정 결과를 나타내는 도면이다.

도10은 계면활성제나 세제가 본 발명의 알칼리성 지방질 분해 효소의 활성도와 안정성에 미치는 영향을 알아보기 위해, 소디움-올레핀술포네이트(AOS;sodium-olefinsulfonate)(도10a), 소디움알킬벤젠-술포네이트(LAS;sodium alkylbenzen-sulfonate)(도10b) 또는 소디움 도데실설페이트(SDS;sodium dodecyl sulfate)(도10c)를 효소액에 섞어준 후, 0.5%의 트리카프릴린 배지에 스팟팅한 결과를 나타내는 도면이다.

<110> Cheil Jedang Corporation <120> An alkaline lipase from Vibrio metschnikovii RH530 and a nucleotide sequence encoding the same <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2578 <212> DNA <213> Vibrio metschnikovii RH530 <400> 1 agcttgcact ttatcagcca atacttgcat cggtaactcg gcgggcactt gtgcccagtg 60 gcggcggcta cgtacttcag agattaaggc catgactagc gtttcatata aaatggtgtc 120 tcgccacgta ccttgaatgg cgatacgcag ctggcgtttg ccctcttgct tgaggatccc 180 gatttcaatt tgccgatcgg gttgaaaatg gaaatagcgt aatgactgta aaaaagtacg 240 attcaaatga ggtgcatgct gctctaaata aacaatgtcg gcatccgaaa agcgcaatga 300 agccaactga ttgatttctt ggcgtacttc ctctaataaa tcgctaatgt cttcatcact 360 gcgcacaatc aattcatagc gcacctcaac atccggatac aacgaatgaa cggcctgcat 420 catattgatt ttataggcat caagatccaa taaactgcgg ataaaaagag gagaaaatag 480 gcgatcgctc atgatgatgc catcctttcg ttcggtttca ttcagtcatt acgttagtaa 540 caacgtgttg ctaactttgg gcgaacaata aagtaccctt gtaagtttgt caacttttgt 600 gacaaaccta gtcagtcgtt atttggcctt attataatta tggatattga ggggtaagga 660 cgtagtcata acaacaatta cagtactctt gttatctgag ttatgtttgt cacaaagtct 720 tatttacatt tgaccatcat catgcactta cctaaaataa gcccgttgtt tattagggaa 780 gccattatga ttgtcactat cgatatgatt tgtctgcgtc ttgcgccgaa atctatccag 840 gttttactgg tgaaacgctc taatccaaat cggccagatt gtggtaaatg ggcattgcct 900 ggcgggatag tgtatgacga agatatgacc gctcatggtg gagaacctgt cgatgaggat 960 tttgatgcag cgagacgacg tatttgtcgg caaaaagtcc atacttatcc taattttatc 1020 agcgatccgc tggttgatgg caaccccaaa cgcgatccga atggttggag tgtcagtatt 1080 tcccattacg ctttattaaa cccgtggaat gtcaaacaaa tagaagattt tggtatcgac 1140 cccgagcgcg ctaattggtt tgatcttcat actttactca aagaagaaat gccgctggct 1200 tttgatcatg tcgcgcaaat tcagcatgcg tggcaaaaat tacgcgctgc ggttgaatac 1260 acatccgtgg tactattttc attagaaaaa gagtttttag tggcggatat tattgatgcc 1320 tacgccaaat ttggcgtcga agttaatcgc atgaccatta aacgccgctt gatcaatacc 1380 ggggtgatcg tcagtaccaa taaaatggcc gcatcttgta aaggcaaagg agccaaacca 1440 gccaccgttt atcgtcttgc cagtcatgaa gtcacctatt ttcaaacctg tttacgaggt 1500 taactgttcg aaaatcgtgt acagtaggtg atgatgtcaa ttgatgatag gtaggaagca 1560 atgcagatta ttcttgttca tggactctat atgcatggct tggtaatgca tccgcttagt 1620 catcgtctgc ataaattggg ttatcgtact caaaccatta gctacaactc actcgctatc 1680 gatgatgagg ccatttttcg ccgccttgac cgatcgctca ctcatgcctc gcctaatgct 1740 ttagtcggac acagtttggg cggattggtg atcaaacgtt atctagaatc gcgcgcaccg 1800 tcctgtgaaa ccctctccca tgtcgtcgcc atcggctcac ctttgcaagg agcttccatt 1860 gtcaataaaa ttgagcaatt aggtttaggg gtggcactag gtaattcagc agaatttggg 1920 ttaaaagaac acgacgacga atcccgctat ccacaaaaat caggcagtat tgcaggaacg 1980 atacctttag ggctgcgcag ccttttactg cgcgatccac tggactccga tggtaccgtc 2040 acagtagaag aaaccaaaat agctggcatg acagatcata tcgcgatatc caccacttca 2100 tacgagaatg ctgtttaatc attccgttgc cgagcaaatc gaccactttc ttcgttatga 2160 ccgcttccgg cgctaaagcc gtttaaactt cagatgatag tgtacttcgt atcaaaccga 2220 tggtgattga aaacataccc accattcatt cagaataaga cgttgccatc atcagagctt 2280 tcccatgcaa taaacaatcc gcgactttac gtctggccgc tttaactaaa ttggcaagtg 2340 tctgccgcga tacgctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc 2400 tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 2460 ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa 2520 gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttag 2578 <210> 2 <211> 798 <212> DNA <213> Vibrio metschnikovii RH530 <220> <221> CDS <222> (1)..(798) <223> valL1 gene <400> 2 atg ttt gtc aca aag tct tat tta cat ttg acc atc atc atg cac tta 48 Met Phe Val Thr Lys Ser Tyr Leu His Leu Thr Ile Ile Met His Leu 1 5 10 15 cct aaa ata agc ccg ttg ttt att agg gaa gcc att atg att gtc act 96 Pro Lys Ile Ser Pro Leu Phe Ile Arg Glu Ala Ile Met Ile Val Thr 20 25 30 atc gat atg att tgt ctg cgt ctt gcg ccg aaa tct atc cag gtt tta 144 Ile Asp Met Ile Cys Leu Arg Leu Ala Pro Lys Ser Ile Gln Val Leu 35 40 45 ctg gtg aaa cgc tct aat cca aat cgg cca gat tgt ggt aaa tgg gca 192 Leu Val Lys Arg Ser Asn Pro Asn Arg Pro Asp Cys Gly Lys Trp Ala 50 55 60 ttg cct ggc ggg ata gtg tat gac gaa gat atg acc gct cat ggt gga 240 Leu Pro Gly Gly Ile Val Tyr Asp Glu Asp Met Thr Ala His Gly Gly 65 70 75 80 gaa cct gtc gat gag gat ttt gat gca gcg aga cga cgt att tgt cgg 288 Glu Pro Val Asp Glu Asp Phe Asp Ala Ala Arg Arg Arg Ile Cys Arg 85 90 95 caa aaa gtc cat act tat cct aat ttt atc agc gat ccg ctg gtt gat 336 Gln Lys Val His Thr Tyr Pro Asn Phe Ile Ser Asp Pro Leu Val Asp 100 105 110 ggc aac ccc aaa cgc gat ccg aat ggt tgg agt gtc agt att tcc cat 384 Gly Asn Pro Lys Arg Asp Pro Asn Gly Trp Ser Val Ser Ile Ser His 115 120 125 tac gct tta tta aac ccg tgg aat gtc aaa caa ata gaa gat ttt ggt 432 Tyr Ala Leu Leu Asn Pro Trp Asn Val Lys Gln Ile Glu Asp Phe Gly 130 135 140 atc gac ccc gag cgc gct aat tgg ttt gat ctt cat act tta ctc aaa 480 Ile Asp Pro Glu Arg Ala Asn Trp Phe Asp Leu His Thr Leu Leu Lys 145 150 155 160 gaa gaa atg ccg ctg gct ttt gat cat gtc gcg caa att cag cat gcg 528 Glu Glu Met Pro Leu Ala Phe Asp His Val Ala Gln Ile Gln His Ala 165 170 175 tgg caa aaa tta cgc gct gcg gtt gaa tac aca tcc gtg gta cta ttt 576 Trp Gln Lys Leu Arg Ala Ala Val Glu Tyr Thr Ser Val Val Leu Phe 180 185 190 tca tta gaa aaa gag ttt tta gtg gcg gat att att gat gcc tac gcc 624 Ser Leu Glu Lys Glu Phe Leu Val Ala Asp Ile Ile Asp Ala Tyr Ala 195 200 205 aaa ttt ggc gtc gaa gtt aat cgc atg acc att aaa cgc cgc ttg atc 672 Lys Phe Gly Val Glu Val Asn Arg Met Thr Ile Lys Arg Arg Leu Ile 210 215 220 aat acc ggg gtg atc gtc agt acc aat aaa atg gcc gca tct tgt aaa 720 Asn Thr Gly Val Ile Val Ser Thr Asn Lys Met Ala Ala Ser Cys Lys 225 230 235 240 ggc aaa gga gcc aaa cca gcc acc gtt tat cgt ctt gcc agt cat gaa 768 Gly Lys Gly Ala Lys Pro Ala Thr Val Tyr Arg Leu Ala Ser His Glu 245 250 255 gtc acc tat ttt caa acc tgt tta cga ggt 798 Val Thr Tyr Phe Gln Thr Cys Leu Arg Gly 260 265 <210> 3 <211> 266 <212> PRT <213> Vibrio metschnikovii RH530 <400> 3 Met Phe Val Thr Lys Ser Tyr Leu His Leu Thr Ile Ile Met His Leu 1 5 10 15 Pro Lys Ile Ser Pro Leu Phe Ile Arg Glu Ala Ile Met Ile Val Thr 20 25 30 Ile Asp Met Ile Cys Leu Arg Leu Ala Pro Lys Ser Ile Gln Val Leu 35 40 45 Leu Val Lys Arg Ser Asn Pro Asn Arg Pro Asp Cys Gly Lys Trp Ala 50 55 60 Leu Pro Gly Gly Ile Val Tyr Asp Glu Asp Met Thr Ala His Gly Gly 65 70 75 80 Glu Pro Val Asp Glu Asp Phe Asp Ala Ala Arg Arg Arg Ile Cys Arg 85 90 95 Gln Lys Val His Thr Tyr Pro Asn Phe Ile Ser Asp Pro Leu Val Asp 100 105 110 Gly Asn Pro Lys Arg Asp Pro Asn Gly Trp Ser Val Ser Ile Ser His 115 120 125 Tyr Ala Leu Leu Asn Pro Trp Asn Val Lys Gln Ile Glu Asp Phe Gly 130 135 140 Ile Asp Pro Glu Arg Ala Asn Trp Phe Asp Leu His Thr Leu Leu Lys 145 150 155 160 Glu Glu Met Pro Leu Ala Phe Asp His Val Ala Gln Ile Gln His Ala 165 170 175 Trp Gln Lys Leu Arg Ala Ala Val Glu Tyr Thr Ser Val Val Leu Phe 180 185 190 Ser Leu Glu Lys Glu Phe Leu Val Ala Asp Ile Ile Asp Ala Tyr Ala 195 200 205 Lys Phe Gly Val Glu Val Asn Arg Met Thr Ile Lys Arg Arg Leu Ile 210 215 220 Asn Thr Gly Val Ile Val Ser Thr Asn Lys Met Ala Ala Ser Cys Lys 225 230 235 240 Gly Lys Gly Ala Lys Pro Ala Thr Val Tyr Arg Leu Ala Ser His Glu 245 250 255 Val Thr Tyr Phe Gln Thr Cys Leu Arg Gly 260 265 <210> 4 <211> 555 <212> DNA <213> Vibrio metschnikovii RH530 <220> <221> CDS <222> (1)..(555) <223> valL2 gene <400> 4 atg cag att att ctt gtt cat gga ctc tat atg cat ggc ttg gta atg 48 Met Gln Ile Ile Leu Val His Gly Leu Tyr Met His Gly Leu Val Met 1 5 10 15 cat ccg ctt agt cat cgt ctg cat aaa ttg ggt tat cgt act caa acc 96 His Pro Leu Ser His Arg Leu His Lys Leu Gly Tyr Arg Thr Gln Thr 20 25 30 att agc tac aac tca ctc gct atc gat gat gag gcc att ttt cgc cgc 144 Ile Ser Tyr Asn Ser Leu Ala Ile Asp Asp Glu Ala Ile Phe Arg Arg 35 40 45 ctt gac cga tcg ctc act cat gcc tcg cct aat gct tta gtc gga cac 192 Leu Asp Arg Ser Leu Thr His Ala Ser Pro Asn Ala Leu Val Gly His 50 55 60 agt ttg ggc gga ttg gtg atc aaa cgt tat cta gaa tcg cgc gca ccg 240 Ser Leu Gly Gly Leu Val Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Ser Arg Ala Pro 65 70 75 80 tcc tgt gaa acc ctc tcc cat gtc gtc gcc atc ggc tca cct ttg caa 288 Ser Cys Glu Thr Leu Ser His Val Val Ala Ile Gly Ser Pro Leu Gln 85 90 95 gga gct tcc att gtc aat aaa att gag caa tta ggt tta ggg gtg gca 336 Gly Ala Ser Ile Val Asn Lys Ile Glu Gln Leu Gly Leu Gly Val Ala 100 105 110 cta ggt aat tca gca gaa ttt ggg tta aaa gaa cac gac gac gaa tcc 384 Leu Gly Asn Ser Ala Glu Phe Gly Leu Lys Glu His Asp Asp Glu Ser 115 120 125 cgc tat cca caa aaa tca ggc agt att gca gga acg ata cct tta ggg 432 Arg Tyr Pro Gln Lys Ser Gly Ser Ile Ala Gly Thr Ile Pro Leu Gly 130 135 140 ctg cgc agc ctt tta ctg cgc gat cca ctg gac tcc gat ggt acc gtc 480 Leu Arg Ser Leu Leu Leu Arg Asp Pro Leu Asp Ser Asp Gly Thr Val 145 150 155 160 aca gta gaa gaa acc aaa ata gct ggc atg aca gat cat atc gcg ata 528 Thr Val Glu Glu Thr Lys Ile Ala Gly Met Thr Asp His Ile Ala Ile 165 170 175 tcc acc act tca tac gag aat gct gtt 555 Ser Thr Thr Ser Tyr Glu Asn Ala Val 180 185 <210> 5 <211> 185 <212> PRT <213> Vibrio metschnikovii RH530 <400> 5 Met Gln Ile Ile Leu Val His Gly Leu Tyr Met His Gly Leu Val Met 1 5 10 15 His Pro Leu Ser His Arg Leu His Lys Leu Gly Tyr Arg Thr Gln Thr 20 25 30 Ile Ser Tyr Asn Ser Leu Ala Ile Asp Asp Glu Ala Ile Phe Arg Arg 35 40 45 Leu Asp Arg Ser Leu Thr His Ala Ser Pro Asn Ala Leu Val Gly His 50 55 60 Ser Leu Gly Gly Leu Val Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Ser Arg Ala Pro 65 70 75 80 Ser Cys Glu Thr Leu Ser His Val Val Ala Ile Gly Ser Pro Leu Gln 85 90 95 Gly Ala Ser Ile Val Asn Lys Ile Glu Gln Leu Gly Leu Gly Val Ala 100 105 110 Leu Gly Asn Ser Ala Glu Phe Gly Leu Lys Glu His Asp Asp Glu Ser 115 120 125 Arg Tyr Pro Gln Lys Ser Gly Ser Ile Ala Gly Thr Ile Pro Leu Gly 130 135 140 Leu Arg Ser Leu Leu Leu Arg Asp Pro Leu Asp Ser Asp Gly Thr Val 145 150 155 160 Thr Val Glu Glu Thr Lys Ile Ala Gly Met Thr Asp His Ile Ala Ile 165 170 175 Ser Thr Thr Ser Tyr Glu Asn Ala Val 180 185

Claims (12)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 서열번호 2 및 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터로서, 대장균 HB101 [pHLB29] (수탁번호가 KCCM-10385호)에 포함되어 있는 재조합 벡터 pHLB29.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 대장균 HB101 [pHLB29] (수탁번호가 KCCM-10385호)을 배양하는 단계를 포함하는 알칼리성 지방질 분해효소를 제조하는 방법.
12. 삭제