RO120653B1

RO120653B1 - Procedeu îmbunătăţit pentru preparare de cefalosporine

Info

Publication number: RO120653B1
Application number: RO98-01711A
Authority: RO
Inventors: John Krijgsman; Jan Willem Hubert Smeets; Braal Henriette Elisabeth Anna De; Vroom Erik De; Herman Pieter Fasel
Original assignee: Gist-Brocades B.V.
Priority date: 1997-04-22
Filing date: 1998-04-22
Publication date: 2006-05-30
Also published as: ZA983383B; DE69828940D1; EP0918878B1; AU7759298A; BR9804855A; JP2000512510A; ATE288962T1; EP0918878A1; US6319684B1; ES2237840T3; WO1998048036A1; CN1224470A; DE69828940T2; RU2203323C2; PL330706A1; TW565612B; CN1137271C; PT918878E

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu pentru prepararea unei cefalosporine deacilate la gruparea 7-amino, prin fermentaţia microorganismelor producătoare de cefalosporine, în prezenţa unei părţi a lanţului precursor, extracţia compusului cefalosporinic N-substituit prezent în mediul sau fluidul de fermentaţie sau într-un solvent organic, reextracţia compusului cefalosporinic N-substituit în apă, tratarea fazei apoase cu o acilază decarboxilată şi izolarea cristalelor compusului cefalosporinic din soluţia de transformare, astfel obţinută prin cristalizare.

Description

Invenția se referă la un procedeu pentru prepararea unei cefalosporine pe cale fermentativă.

Sunt cunoscute căi de semisinteză pentru obținerea cefalosporinelor, de cele mai multe ori, pornind de la produși de fermentație, cum ar fi penicilina G, penicilina V și cefalosporina C, care sunt transformate în nuclee de tip β-lactamic, de exemplu, printr-un procedeu ca cel prezentat de K. Matsumoto, Bioprocess. Techn., 16, (1993), 67-88, J.G. Shewale și H. Sivaraman, Process Biochemistry, August 1989, 146-154, T.A. Savidge, Biotechonology of Industrial Antibiotics (Ed. E.J. Vandamme) Marcel Dekker, New York, 1984, sau J.G. Shewale și alții, Process Biochemistry Internațional, iunie 1990, 97- 103. Nucleele β-lactamice obținute sunt ulterior transformate în antibioticul dorit, prin cuplarea pe partea dorită a lanțului, ca în descrierea din EP 0 339 751 , JP-A-53005185 și CH-A-640 240. Prin realizarea diferitelor combinații de structuri chimice și nuclee β-lactamice, pot fi obținute o varietate de antibiotice cefalosporine și peniciline.

Acidul 7-amino-desacetoxi cefalosporinic (7-ADCA) și acidul 7-amino-cefalosporinic (7-ACA) sunt cunoscuți ca fiind cei mai importanți intermediari pentru obținerea antibioticelor folosite în industria farmaceutică.

7-ADCA este, de exemplu, obținut prin clivare chimică sau enzimatică (deacilare) a fenil-acetil 7-ADCA, rezultând 7-ADCA și acid fenil acetic. Fenil-acetil-7-ADCA este obținut în mod normal prin tratamentul chimic al sulfoxidului penicilinei G, care este obținut din penicilina G. în procedeul de obținere este necesară o cantitate mare de substanță, pentru a se asigura că au loc reacțiile dorite. Randamentul total al procedeului nu este foarte mare.

Pentru a îndepărta câteva din dezavantajele procedeului chimic, a fost realizat procedeul de fermentație pentru obținerea 7-ADCA și 7-ACA, implicând procedeul de fermentație al 3-lactamelor N-substituite, cum ar fi adipil-7-ADCA sau adipil-7-ACA, printr-o recombinare a tulpinei Penicillium chrysogenum, capabilă de a realiza sinteza acidului desacetoxicefalosporinic (DAOCS), cunoscut de asemenea ca expandant, pornind de la o trans-genă (EP 0 532 341 și 0 540 210, WO 93/08287, 95/04148 și 95/04149). Produsul expandant realizează dilatarea celor cinci inele aparținând acizilor N-acilați ai penicilinei. Ca urmare, se obțin acizi de tip N-acilat desacetoxicefalosporinici corespunzători.

Procedeele cunoscute pentru regenerarea chimică sau enzimatică a acizilor penicilinei sau cefalosporinei nu sunt eficiente pentru regenerarea intermediarilor N-substituiți ai β-lactamei și a amino^-lactamei dezacilate. Principala problemă privind regenerarea compușilor cefalosporinici N-substituiți prin fermentarea prezentată mai sus, este reprezentată de complexitatea mediului nutritiv lichid sau a culturilor filtrate. De obicei, mediile nutritive lichide conțin diferiți acizi penicilinici, cum ar fi acizi a-amino-adipil-6-penicilinici și a-hidroxiadipil-7-ADCA și o cantitate mare de material proteic. Procedeele de regenerare cunoscute nu duc la obținerea unui produs acid cefalosporinic de o calitate acceptabilă din punct de vedere al purității. în dezacilarea enzimatică, are loc o reducere la jumătate a duratei de viață a enzimelor, o viteză scăzută a bioconversiei și cheltuieli mari pentru regenerare după bioconversie și/sau niveluri inacceptabile de contaminare. Mai mult, după dezacilare, prevenirea impurităților, cel puțin împiedică regenerarea compușilor cefalosporinici dezacilați doriți, cu caracteristici dorite. Astfel, procedeele cunoscute de preparare a penicilinelor și cefalosporinelor nu oferă o calitate acceptabilă a acestora la sfârșitul procesului: de exemplu 7-ADCA sau 7-ACA conțin un nivel ridicat, inacceptabil de compuși de penicilină, ca impurități.

Prezenta invenție se referă la un procedeu pentru prepararea unei cefalosporine.

Procedeul pentru prepararea unei cefalosporine, având structura chimică corespunzătoare formulei:

RO 120653 Β1

în care

R_o este hidrogen sau alcoxi C_V3 11

Y este CH₂, oxigen, sulf sau o formă oxidată a sulfului și

R, este o grupare aleasă dintre hidrogen, hidroxi, halogen, alcoxi C₁₃ opțional substituit, con- 13 ținând, în mod opțional, unul sau mai mulți heteroatomi, alchil 0,.5 saturat sau nesaturat ramificat sau liniar, care este, în mod preferat, metil opțional substituit, conținând, în mod 15 opțional unul sau mai mulți heteroatomi, cicloalchil C_54i arii sau heteroaril opțional substituit sau benzii opțional substituit, care cuprinde fermentarea unui microorganism producător de 17 cefalosporine în prezența unui precursor de lanț lateral, extracția compusului cefalosporinic N-substituit prezent în mediul sau fluidul de fermentație sau fluid într-un solvent organic, 19 reextracția compusului cefalosporinic N-substituit în apă, tratarea fazei apoase cu o dicarboxilat acilază și izolarea compusului cefalosporinic cu formula I din soluția de trans- 21 formare, astfel obținută, prin cristalizare, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că mediul sau fluidul de fermentație sau reextractul este incubat la un pH mai 23 mic de 4 și la o temperatură cuprinsă în intervalul 2O...14O°C, înaintea extracției mediului sau fluidului de fermentație, cu un solvent organic, sau înaintea procesării ulterioare a produsului 25 de reextracție.

Prin aplicarea invenției, se obțin următoarele avantaje: 27

- obținerea unor randamente și a unui produs de calitate mai bună.

Invenția se referă, în special, la o îmbunătățire a procedeului de preparare a cefa- 29 losporinelor, pornind de la gruparea 7- arnino dezacilată și având următoarea formulă generală I: 31

în care: Rq este hidrogen sau alcoxi Ο_ν3 41

Y este CH₂, oxigen, sulf sau o formă oxidată a sulfului și

R, este orice grupare aleasă dintre hidrogen, hidroxi, halogen, C₁₃ alcoxi, opțional 43 substituite, opțional conținând unul sau mai mulți heteroatomi, saturată sau nesaturată, C₁₅alchil ramnificat sau drept, de preferat, metil, opțional substituit, opțional conținând unul sau 45 mai mulți heteroatomi, C_{5 8} cicloalchil, opțional substituit cu arii sau heteroaril, sau opțional substituit cu benzii, prin fermentarea microorganismelor ce produc cefalosporine în prezența 47 lanțului precursor, extragerea compușilor cefalosporinici N-substituiți, prezenți în mediile

RO 120653 Β1 nutritive de fermentație sau a fluidului, cu un solvent organic, reextracția compușilor cefalosporinici N-substituiți cu apă, tratarea fazei apoase cu un acid dicarboxilic și izolarea cristalelor de compus cefalosporinic, conform formulei I, din faza apoasă, caracterizat prin aceea că mediul nutritiv de fermentație sau fluidul sau reextractul este incubat în condiții acide și la temperaturi ridicate, înainte de extragerea mediului de fermentație sau fluidului cu un solvent organic, sau înainte de procedeul de reextracție. îmbunătățirile suplimentare ale procedeului sunt obținute prin spălarea primului extract de solvent organic, ce conține compus cefalosporinic N-substituit, cu apă acidulată și/sau prin tratarea soluției apoase de cefalosporină obținută din unul sau mai multe etape ale procesului cu bioxid de carbon și/sau prin extracția părții de lanț eliberat enzimatic într-un solvent organic, înainte de cristalizarea cefalosporinei dezacilate. Procedeul conform invenției va duce, în general, la obținerea unor randamente și la un produs de calitate mai bună, decât procedeele cunoscute până în prezent. în noul procedeu de regenerare, aplicat pentru obținerea compușilor cefalosporinici dezacilați de la compușii, de asemenea, N-acilați, de exemplu 7-ADCA de la adipil-7-ADCA sau 7-ACA de la adipil-7-ACA, sunt mai multe etape ce vor fi descrise în continuare.

Un mediu de fermentație este obținut prin orice procedeu adecvat de fermentare, de exemplu, prin fermentare, folosind o tulpină de Penicillium chrysogenum în prezența unui lanț potrivit precursor, ca cel menționat în cele de mai sus. Biomasa este separată din mediul de fermentație, folosind orice tehnologie potrivită, cum ar fi centrifugarea sau filtrarea, obținându-se un fluid de fermentație ce conține cefalosporina. De preferat, etapa filtrării este aplicată pentru obținerea separării menționate mai sus. Opțional, reziduul solid este spălat cu apă. Unul dintre obstacolele obținerii acidului cefalosporinic N-substituit este reprezentat de contaminarea nedorită a componenților β-lactamici, în special, cu acidul 6-amino-penicilinic (6-APA), 6-APA N-substituiți sau a-aminoadipil-7-ADCA.

într-un aspect suplimentar al invenției, sunt prezentate contaminări reduse în mod remarcabil, prin incubarea unei soluții apose care conține compuși cefalosporinici N-substituiți, produși la fiecare etapă a procedeului, conform invenției, în condiții acide și la temperaturi ridicate. Soluția apoasă, care conține compuși cefalosporinici N-substituiți, este acidulată la pH mai mic de 4, de preferat, la un pH mai mic de 3, folosind unul sau mai mulți acizi cunoscuți, de exemplu, acid sulfuric, acid clorhidric sau acid azotic sau o combinație a acestora. Temperatura de lucru este cuprinsă în intervalul de la 20 la 140°C, de preferat, între 60 și 80°C. Timpul de staționare în aceste condiții este în intervalul a câtorva zile sau câteva minute, de preferat, mai puțin de 60 min și mai de preferat, între 1 și 30 min.

Etapa de incubare prezentată mai sus, conform invenției, poate fi aplicată la mediul de fermentație sau fluid sau la reextractul apos ce conține cefalosporină N-substituită. Etapa de incubare este aplicată, de preferat, la mediul de fermentație sau la fluid. Etapa de incubare poate fi aplicată atât înainte, cât și după separarea biomasei. Incubarea este aplicată, de preferat, înainte de filtrare, aceasta reprezentând un avantaj în filtrare. Compusul cefalosporinic N-substituit este separat din faza apoasă, cum ar fi mediul de fermentare sau fluidul, prin acidularea mediului de fermentație sau a fluidului și extracția ulterioară a compusului cefalosporinic N-substituit cu un solvent organic. în mod obișnuit, acidularea se face la un pH mai mic de 4, de preferat, mai mic de 3 și numai în situația în care mediul de fermentare sau fluidul nu este supus unei incubări, ca cea menționată mai sus, în condiții acide și la temperaturi ridicate. La mediul de fermentare sau fluid, poate fi adăugat un agent de spargere al emulsiei, adecvat pentru îmbunătățirea semnificativă a extracției. Solventul organic este ales, de preferat, din grupul acetat de amil, acetat de butii, acetat de etil, metil izobutil cetonă, ciclohexanol, izobutanol sau n-butanol. Extracția cu un solvent organic, ca cei descriși mai sus, nu este suficient de selectivă, conducând la produși nedoriți β-lactamici,

RO 120653 Β1 cum ar fi a-aminoadipil-7-ADCA și 6-APA. Astfel, invenția include un procedeu de spălare 1 pentru îndepărtarea specifică a acestor compuși. Procedeul de spălare este caracterizat prin faptul că amestecarea solventului organic de extracție se face cu o cantitate mică de apă aci- 3 dulată, urmată de separarea fazelor. în mod obișnuit, apa acidulată are un pH mai mic de 4, de preferat, mai mic de 3 și, în special, mai mic de 2. în plus, raportul apă: solvent este 5 în mod obișnuit între 1: 1 și 1: 20, de preferat, 1:2.

Compusul cefalosporinic N-substituit este din nou extras cu apă, prin procedee con- 7 venționale, prin extragerea fazei organice cu o soluție alcalină, rezultând un extract apos cu pH-ul cuprins în intervalul de la 6 la 9. în mod obișnuit, se folosește un raport apă: solvent 9 de 1:10. Soluția alcalină este o soluție ce conține baze minerale obișnuite, cum ar fi hidroxid de sodiu sau amoniac. Extracția, spălarea și reextracția sunt realizate, de preferință, prin ex- 11 tracții continue și repetate, de exemplu, o combinare a unui amestec intensiv, prin amestecare mecanică cu o separare centrifugală, de preferat, 2 la 8 și, mai preferat, 3 la 6 și, în 13 special, 4 la 5. După faza de separare, opțional, este înlăturată faza apoasă, pentru îndepărtarea solventului. Ulterior, soluția apoasă este pusă în contact cu o decarboxil acilază 15 potrivită, pentru deacilarea compusului cefalosporinic N-substituit, de exemplu, pentru a forma 7-ADCA sau 7-ACA de la derivații de tip N-adipil corespunzători. Organismele care 17 produc decarboxilat acilaza sunt: Alcaligenes, Arthrobacter, Achromobacter, Aspergillus, Acinetobacter, Badllus și speciile Pseudomonas. în special, următoarele specii produc un 19 nivel ridicat de decarboxil acilaze: Achromobacter xylosooxidans, Arthrobacter viscosis, Arthrobacter CAI28, Bacillus CAI8, Bacillus megaterium ATCC 53667, Bacillus cereus, 21 Bacillus laterosporus Jl, Paecilomyces C2106, Pseudomonas diminutd spN176, Pseudomonas diminuta sp V22, Pseudomonas paucimobilis, Pseudomonas diminuta BL072, 23 tulpină de Pseudomonas C427, Psedomonas sp SE83, Pseudomonas sp SE495, PseudomonasovalisATCC950, Comamonassp SY77, Pseudomonas GK16, Pseudomonas 25

SY-77-1, Pseudomonas spA14, Psedomonas vesicularisB965, Pseudomonas syringae, Ps putida ATCC 17390, Ps aeroginosa NCTC 10701, Proteus vulgaris ATCC 9634, Ps fragi 27 DSM3881 și B. subtilus IFO 3025. Decarboxil acilaza poate fi obținută din microorganisme, cu ajutorul cărora este produsă într-un mod optim, de exemplu, ca cel descris pentru tulpina 29 Pseudomonas sp SE 83 în US 4 774 179. De asemenea, genele care codifică decarboxil acilazele SE 83 sau SY 77 pot fi exprimate în diferite gazde adecvate, cum ar fi E. coli, care 31 a fost menționat de Matsuda și alții în J. Bacteriology, 169, (1987), 5818-5820 pentru SE 83 și în US 5 457 032 pentru tulpina SY 78. Izolarea enzimelor din sursele mai sus menționate 33 se referă adesea la glutaril acilaze. Oricum, partea specifică a lanțului enzimelor nu este limitată la partea lanțului glutaril, dar conține, de asemenea, lanțuri mai mici și mai mari de 35 dicarboxil. Câteva decarboxil acilaze, au, în special, activitate gama-glutamil transpeptidazică și, de aceea, uneori sunt clasificate ca transpeptidaze gama-glutamil. Decarboxil acilaza 37 poate fi utilizată ca o enzimă liberă, dar, de asemenea, în formă imobilizată adecvată, de exemplu, ca cea descrisă EP 0222462. Invenția cuprinde, de asemenea, deacilarea corn- 39 pusului cefalosporinic, de exemplu, 7-ADCA sau 7-ACA, care este izolat din soluția transformată prin cristalizare în condiții acide. în mod obișnuit, cristalizarea compusului cefalo- 41 sporinic deacilat dintr-o soluție apoasă este realizată prin corectarea pH-ului soluției apoase la o valoare acidă, prin adăugarea unui titrant peste soluția apoasă, până când pH-ul atinge 43 o valoare cuprinsă între 2,5 și 4,5, de preferat, între 3 și 4. Invenția cuprinde cristalizarea compusului cefalosporinic deacilat din soluția apoasă, obținut prin adăugarea soluției apoase 45 într-un vas de cristalizare care este păstrat la un pH fix, cu valoarea cuprinsă între 2,5 și 4,5, folosind un titrant potrivit. Invenția cuprinde și un alt aspect referitor la cristalizarea obținută 47 printr-o corectare a pH-ului soluției apoase până la o valoare finală cuprinsă între 2,5 și 4,5

RO 120653 Β1 prin adăugarea soluției apoase la o serie de vase de cristalizare interconectate, cum ar fi adăugarea soluției apoase la primul vas, simultan, adăugând conținutul primului vas la un al doilea vas, simultan, adăugând conținutul celui de-al doilea vas la al treilea vas etc., interval în care pH-ul este aplicat pentru vasele interconectate, folosind un titrant potrivit, începând de la un pH, în primul vas, care virează la aproximativ 0,5... 2 unități de pH, de la pHul soluției apoase conținând cefalosporină deacilată și terminând la un pH în vasul final, care are o valoare cuprinsă între 2,5 și 4,5. în mod convenabil, pH-ul soluției apoase, ce conține cefalosporină deacilată, este corectat la valoarea finală dorită, folosind o serie de 2... 6 vase interconectate. De exemplu, pentru obținerea cristalizării cefalosporinei deacilate dintr-o soluție de transformare, poate fi aplicată o scădere a nivelului pH-ului de la 8 la 3, folosind un titrant care este un acid, cum ar fi acid sulfuruc, acid clorhidric și/sau acid azotic, aplicat la o serie de 3,4 vase interconectate. Cele două aspecte incluse în invenție și descrise mai sus este preferabil să se desfășoare în mod continuu. Mai mult, un alt aspect inclus în invenție se referă la latura lanțului, la produșii colorați și la traseul compusului netransformat, care este înlăturat din soluția de transformare înainte de cristalizare, urmărind etapele indicate în cele ce urmează. Soluția de transformare este acidulată și amestecată cu un solvent organic, de exemplu, acetat de amil, acetat de butii, acetat de etil, metil izobutil cetonă, ciclohexanonă, izobutanol, n-butanol, pentru a îndepărta o parte a lanțului înainte de cristalizare. Acidularea se realizează cu un acid, cum ar fi acid sulfuric, acid clorhidric, acid azotic sau combinații ale acestora, de preferat, cu acid sulfuric la un pH mai mic de 3, de preferat, la un pH mai mic de 2. în mod neașteptat, este obținută în plus o îndepărtare eficientă a impurităților colorate la această parte a lanțului. Conform cu alt aspect al invenției, componenții penicilinici de contaminare, de exemplu, 6-APA amfionic este prezent în soluțiile apoase ce conțin cefalosporine, produse la unul sau mai multe stadii ale procesului, conform invenției, cum ar fi fermentarea mediului sau a fluidului, reextracția, transformarea soluției sau soluția ce conține cefalosporină deacilată dizolvată, conform formulei I, sunt în mod remarcabil reduse prin amestecarea cu fluidul penicilinic contaminat, de obicei, la un pH cuprins între 5 și 7, cu bioxid de carbon. Bioxidul de carbon poate fi adăugat la soluție pe orice cale, cum ar fi în formă solidă sau gazoasă sau ca o soluție de ioni de carbonat. Soluția apoasă ce conține cefalosporină, este amestecată cu sursa de bioxid de carbon la o temperatură cuprinsă între 10 și 60°C, de preferat, între 20 și 40°C, când spunem că soluția este saturată cu bioxid de carbon molecular, timp de 4 până la 10 h. După reducerea compușilor penicilinici pot fi obținuți prin purificare, compuși cefalosporinici conform formulei I. După extracția laturii lanțului într-un solvent organic, compusul cefalosporinic deacilat poate fi cristalizat din faza apoasă în câteva moduri, cum ar fi modurile care au fost menționate în cele de mai sus pentru cristalizarea compusului cefalosporinic deacilat din soluția apoasă. într-un mod adecvat, pH-ul fazei apoase este ridicat la o valoare cuprinsă între 2,5 și 5, de preferat, între 3,5 și 4,5 prin adăugarea soluției care conține compus cefalosporinic deacilat în prima etapă, în vasul de cristalizare păstrat la o valoare a pH-ului dorită sau la o serie de 2 - 6 vase de cristalizare interconectate, aplicându-se o creștere a nivelului pH-ului. Aceste procedee pot fi realizate, de preferință, în mod continuu. Cristalele sunt izolate prin filtrare, centrifugare și uscare în mod continuu, convențional sau în uscător. Toate etapele menționate mai sus, de exemplu, extracția, spălarea, reextracția și cristalizarea pot fi realizate separat sau continuu, dar din motive de stabilitate este preferată metoda continuă.

în continuare, se prezintă un exemplu de realizare a invenției.

Exemplul 1. Un litru de mediu nutritiv, ce conține adipil 7-ADCA, a fost filtrat pentru a se îndepărta biomasa. Miceliul a fost spălat cu apă de la robinet, pentru a obține un volum final de filtrat de aproximativ 2 I. Circa 2 I de filtrat a fost acidulat la 40°C cu 250 ml soluție

RO 120653 Β1 acid sulfuric 6 N până la pH=1,5. A fost adăugat n-butanol la 2/3 din volumul filtratului 1 acidulat, după care a fost amestecat energic și separat. Faza apoasă a fost supusă la 2 sau mai multe extracții cu n-butanol. Ulterior, fazele organice reunite au fost spălate cu porții de 3 250 ml apă acidulată având un pH-2. Faza organică rezultată a fost reextrasă cu 245 ml soluție hidroxid de sodiu 2N la 20°C și după separarea fazelor, urmele de n-butanol din faza 5 apoasă au fost îndepărtate la vid. 135 g de fază apoasă au fost diluate cu apă distilată la un volum total de 650 ml, la o temperatură de 30°C și a fost amestecată cu soluție NaOH 4N 7 până la pH=8,5. Au fost adăugate 50 g de enzimă deacilată izolată și după 2 h, la 30°C, pH=8,5, sub adăugare de soluție de NaOH 4N (13,5 ml), faza apoasă a fost colectată. Filtra- 9 tul a fost extras cu 3 porții de câte 125 ml apă saturată cu n-butanol, până la pH=0,4. în timpul extracției a fost adăugat un total de 50,6 ml de soluție acid clorhidric 37%. Faza apoasă 11 rămasă a fost neutralizată cu 56,5 ml de soluție NaOH 8N și produsul a fost cristalizat din faza apoasă fără urme de n-butanol, prin scăderea pH-ului la 5,3 cu soluție de acid sulfuric 13 6N. După 5 min, pH-ul a fost scăzut până la valoarea finală de 3,5. S-au utilizat în total 15 ml de acid. Suspensia a fost filtrată și turta de cristale a fost spălată cu 50 ml apă, uscată și s- 15 au obținut 4,1 g produs 7-ADCA de puritate 96%.

Claims

1. Procedeu pentru prepararea unei cefalosporine, având structura chimică corespunzătoare formulei: 21

31 în care:

R_o este hidrogen sau alcoxi C_V3 33

Y este CH₂, oxigen, sulf sau o formă oxidată a sulfului și

R! este o grupare aleasă dintre hidrogen, hidroxi, halogen, alcoxi C₁₃ opțional substituit, con- 35 ținând, în mod opțional, unul sau mai mulți heteroatomi, alchil Ο_ν5 saturat sau nesaturat, ramificat sau liniar, care este, în mod preferat, metil opțional substituit, conținând, în mod op- 37 țional, unul sau mai mulți heteroatomi, cicloalchil C₅.₈, arii sau heteroaril opțional substituit sau benzii opțional substituit, care cuprinde fermentarea unui microorganism producător de 39 cefalosporine în prezența unui precursor de lanț lateral, extracția compusului cefalosporinic N-substituit prezent în mediul sau fluidul de fermentație sau fluid într-un solvent organic, 41 reextracția compusului cefalosporinic N-substituit în apă, tratarea fazei apoase cu o dicarboxilat acilază și izolarea compusului cefalosporinic cu formula I din soluția de trans- 43 formare, astfel obținută, prin cristalizare, caracterizat prin aceea că mediul sau fluidul de fermentație sau reextractul este incubat la un pH mai mic decât 4 și la o temperatură cu- 45 prinsă în intervalul 20 ... 140°C, înaintea extracției mediului sau fluidului de fermentație, cu un solvent organic, sau înaintea procesării ulterioare a produsului de la reextracție. 47

2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că mediul sau fluidul de fermentație sau reextractul este incubat la un pH mai mic decât 3. 49

RO 120653 Β1

3. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că mediul sau fluidul de fermentație sau reextractul este incubat la o temperatură cuprinsă în intervalul 60 la 80°C.

4. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 3, caracterizat prin aceea că extractul solventului organic, ce conține compusul cefalosporinic N-substituit, este spălat cu apă acidifiată având un pH mai mic decât 4, înainte de reextracție.

5. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 3, caracterizat prin aceea că extractul solventului organic, ce conține compusul cefalosporinic N-substituit, este spălat cu apă acidifiată, având un pH mai mic decât 3, înainte de reextracție.

6. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 3, caracterizat prin aceea că extractul solventului organic, ce conține compusul cefalosporinic N-substituit, este spălat cu apă acidifiată, având un pH mai mic decât 2, înainte de reextracție.

7. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 6, caracterizat prin aceea că precursorul de lanț lateral din soluția de transformare este extras cu un solvent organic înaintea cristalizării compusului cefalosporinic care corespunde formulei I.

8. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 7, caracterizat prin aceea că o soluție apoasă, ce conține cefalosporină din una sau mai multe etape, cum ar fi mediul sau fluidul de fermentație, reextractul, soluția de transformare sau soluția ce conține compusul cefalosporinic care corespunde cu formula 1 dizolvat, este pusă în contact cu dioxid de carbon.

9. Procedeu conform revendicării 8, caracterizat prin aceea că dioxidul de carbon este sub formă solidă sau gazoasă sau ca o soluție de ioni carbonat.

10. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 9, caracterizat prin aceea că solventul organic este acetat de amil, acetat de butii, acetat de etil, metil izobutil cetonă, ciclohexanonă, izobutanol sau n-butanol.

11. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 9, caracterizat prin aceea că cristalizarea compusului cefalosporinic, definit în revendicarea 1, din soluția de transformare sau faza apoasă, este realizată prin adăugarea soluției apoase sau a fazei apoase la un vas de cristalizare, care este păstrat la o valoare fixă a pH-ului, cuprinsă în intervalul 2,5 ... 4,5, folosind un titrant adecvat.

12. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 9, caracterizat prin aceea că, cristalizarea compusului cefalosporinic definit în revendicarea 1 din soluția de transformare sau faza apoasă este realizată prin adăugarea soluției apoase sau a fazei apoase la o serie de vase de cristalizare interconectate, timp în care este aplicat un interval de pH, folosind un titrant adecvat, pornind de la un pH în primul vas, care virează la aproximativ 0,5...2 unități, la pH de la pH-ul soluției de 6-APA și terminând la un pH în vasul final, care are valoarea cuprinsă în intervalul 2,5...4,5.