SK282624B6

SK282624B6 - Spôsob výroby a izolácie 7-aminodesacetoxycefalosporánovej kyseliny

Info

Publication number: SK282624B6
Application number: SK97-96A
Authority: SK
Inventors: Roelof Ary Lans Bovenberg; Bertus Pieter Koekman; Andreas Hoekema; Der Laan Jan Metske Van; Jan Verweij; Vroom Erik De
Original assignee: Dsm N. V.
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-07-29
Publication date: 2002-10-08
Also published as: ATE277187T1; SK9796A3; WO1995004148A1; KR100336174B1; CN1128045A; HU9600194D0; CN1103814C; PL312746A1; CA2168431A1; HU219259B; PL180799B1; DE69434023D1; US5726032A; CZ15896A3; HUT75377A; CZ285604B6; BR9407108A

Abstract

Je opísaný spôsob výroby a izolácie 7-aminodesacetoxycefalosporánovej kyseliny, 7-ADCA, pri ktorom sa a) kmeň Penicillium chrysogenum transformuje génom expandázy za transkripčnej a translačnej regulácie expresných signálov vláknitej huby; b) kmeň sa fermentuje v kultivačnom médiu, do ktorého sa pridá 3'-karboxymetyltiopropiónová kyselina alebo jej soľ, alebo ester, vhodná na získanie 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-6-aminopenicilánovej kyseliny, tzn. 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-6-APA, pričom kruh v posledne uvedených látkach sa in situ rozšíri za vzniku 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA; c) z fermentačnej pôdy sa izoluje 2-karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio(propionyl-7-ADCA; d) 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA sa deacyluje; a e) izoluje sa kryštalická 7-ADCA.ŕ

Description

Vynález sa týka biosyntetického spôsobu výroby a izolácie 7-aminodesacetoxycefalosporánovej kyseliny (7-ADCA).

Doterajší stav techniky β-Laktámové antibiotiká tvoria najdôležitejšiu skupinu antibiotický účinných zlúčenín s dlhou históriou klinického používania. Prominentnými typmi antibiotík patriacich do tejto skupiny sú penicilíny a cefalosporíny. Tieto zlúčeniny sú v prírode produkované vláknitými hubami Penicillium chrysogenum aAcremonium chrysogenum.

Pri použití klasických techník zlepšovania produkčných kmeňov sa v posledných desaťročiach dramaticky zvýšila úroveň produkcie antibiotík v Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum. Zvyšujúce sa znalosti biosyntetických dráh vedúcich k penicilínom a cefalosporínom a zavedenie technológie rekombinácie DNA predstavujú nové prostriedky na zlepšovanie produkčných kmeňov a pre in vivo derivatizáciu požadovaných zlúčenín.

Bola identifikovaná väčšina enzýmov podieľajúcich sa na biosyntéze β-laktámu a im zodpovedajúce gény boli klonované [porovnaj napr. Ingolia a Queener, Med. Res. Rev. 9 (1989), 245 až 264 (biosyntetická dráha a enzýmy) a Aharonowitz, Cohen a Martin, Ann. Rev. Microbiol., 46 (1992), str. 461 až 495 (klonovanie génu)].

Prvé dva stupne biosyntézy penicilínu v P. chrysogenum zahŕňajú kondenzáciu troch aminokyselín: L-5-amino-5-karboxypentánovej kyseliny (L-a-aminoadipovej kyseliny) (A), L-cysteínu (C) a L-valínu (V), za vzniku tripeptidu vzorca LLD-ACV, po ktorej nasleduje cyklizácia tohto tripeptidu na izopenicilín N. Táto zlúčenina obsahuje typickú β-laktámovú štruktúru.

Tretí stupeň zahŕňa výmenu hydrofilného postranného reťazca L-5-amino-5-karboxypcntánovcj kyseliny za hydrofóbny postranný reťazec pôsobením enzýmu acyltransferázy (AT). Pri priemyselnom spôsobe výroby penicilínu G sa ako postranný reťazec účelne používa zvyšok fenyloctovej kyseliny (PA).

V EP-A-0 532 341 je opísané použitie adipátovej (5-karboxypentanoátovej) suroviny. Inkorporácia tohto substrátu vedie k derivátu penicilínu s 5-karboxypentanoylovým postranným reťazcom, tzn. k 5-karboxypentanoyl-6-aminopenicilánovej kyseline. Táto inkorporácia je dôsledkom skutočnosti, že acyltransferáza má širokú substrátovú špccifitu [Behrens et ah, J. Biol. Chem. 175 (1948), str. 751 až 809; Cóle, Process Biochem. 1 (1966) str. 334 až 338; Ballio et al., Náture 185 (1960), str. 97 až 99], Enzymatická výmenná reakcia sprostredkovaná acyltransferázou sa uskutočňuje vnútri bunkovej organely, tzn. mikrotelieska (pozri EP-A-0 448 180).

Cefalosporíny sú podstatne nákladnejšie ako penicilíny. Jedným z dôvodov je, že niektoré cefalosporíny (ako napríklad cefalexín) sa vyrábajú z penicilínov radom chemických konverzií. Druhým dôvodom je, že až dosiaľ bolo možné fermentovať len cefalosporíny s D-5-amino-5-karboxypentanoylovým postranným reťazcom. Cefalosporín C, až dosiaľ najdôležitejšia východisková látka na tieto účely, je veľmi rozpustný vo vode pri akejkoľvek hodnote pH, čo vyvoláva potrebu zdĺhavých a nákladných izolačných postupov, pri ktorých je nutné používať neobratné a nákladné stĺpcové technológie. Cefalosporín C získaný takým spôsobom je nutné premieňať na terapeuticky použi teľné cefalosporíny radom chemických a enzymatických konverzií.

Medziprodukt 7-ADCA sa v súčasnosti vyrába chemickou derivatizáciou penicilínu G. Potrebné chemické stupne na výrobu 7-ADCA zahŕňajú rozšírenie päťčlennej kruhovej štruktúry penicilínu na šesťčlennú kruhovú štruktúru cefalosporínu. Také rozšírenie kruhu môže zaistiť enzým expandáza z vláknitej baktérie Streptomyces clavuligerus. Po zavedení do P. chrysogenum môže tento enzým premeniť penicilínovú kruhovú štruktúru na cefalosporínovú kruhovú štruktúru, ako je to opísané v Cantwell et al., Proc. R. Soc. Lond. B. 248 (1992) str. 283 až 289 a v EP-A-0 532 341 a EP-A-0 540 210. Enzým expandáza bol dobre charakterizovaný (EP-A-0 366 354) tak biochemický, ako funkčne, podobne ako jemu zodpovedajúci gén. Boli opísané fyzikálne mapy génu cefE (EP-A-0 233 715), sekvencie DNA a transformačné štúdie v P. chrysogenum pri použití cefE.

Ďalším zdrojom vhodného enzýmu na rozšírenie kruhu je vláknitá baktéria Nocardia lactamdurans (skôr označovaná názvom Streptomyces lactamdurans). Boli opísané tak biochemické vlastnosti tohto enzýmu, ako aj sekvencie DNA príslušného génu (Cortés et al., J. Gen. Microbiol., 133 (1987), str. 3165 až 3174; a Coque et al., Mol. Gen. Genet. 236 (1993), str. 453 až 458).

V prihláške EP-A-0 532 341 je konkrétnejšie opísané in vivo použitie enzýmu expandázy v P. chrysogenum v kombinácii s 5-karboxypentanoylovým postranným reťazcom, ako surovinou tvoriacou substrát na acyltransferázu v P. chrysogenum. Pritom vzniká 5-karboxypentanoyl-6-APA, ktorá sa premieňa enzýmom expandázou zavedeným do kmeňa P. chrysogenum na 5-karboxypcntanoyl-7-ADCA. Nakoniec sa navrhuje odštiepia 5-karboxypentanoylový postranný reťazec za vzniku 7-ADCA ako konečného produktu.

V patentovej prihláške EP-A-0 540 210 je opísaný podobný spôsob výroby 7-ACA, ktorý zahŕňa prídavné stupne konverzie 3-metylového postranného reťazca kruhu ADCA na 3-acetoxymetylový postranný reťazec ACA.

V posledne citovaných dvoch patentových prihláškach však nie je opísaný výkonný a ekonomicky účinný postup, pretože nebol vyriešený predovšetkým problém včasnej expresie enzýmu expandázy v bunkách, súčasne s expresiou enzýmu acyltransferázy.

Naproti tomu spôsob podľa vynálezu predstavuje účinný postup výroby 7-ADCA, pri ktorom sa expandáza exprimuje súčasne s acyltransferázou.

Okrem toho je podľa vynálezu navrhovaný nový prekurzor postranného reťazca, tzn. 3'-karboxymetyltiopropiónová kyselina. Tento prekurzor sa do zodpovedajúcich penicilínov, ktorých kruh má byť rozšírený následným pôsobením enzýmu expandázy, veľmi účinne zavádza pomocou P. chrysogenum.

Okrem toho nebol až dosiaľ opísaný žiadny efektívny spôsob izolácie derivátov 7-ADCA z fermentačnej pôdy pred jeho deacyláciou. Vynález zahŕňa účinný spôsob rozpúšťadlovej extrakcie na získanie derivátu 7-ADCA.

Vynález predstavuje skutočne účinný integrálny spôsob výroby 7-ADCA, ktorý zahŕňa reakčné stupne, ktoré dosiaľ neboli publikované, ani navrhnuté v doterajšom stave techniky.

Pri použití tohto vynálezu je možné v analógii k opisu uvedenému v EP-A-0 540 210 vyrábať účinným spôsobom tiež 7-ACA.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je spôsob výroby a izolácie 7-aminodesacetoxycefalosporánovej kyseliny, 7-ADCA, ktorého podstata spočíva v tom, že sa

a) kmeň Penicilium chrysogenum transformuje génom expandázy za transkripčnej a translačnej regulácie expresných signálov vláknitej huby;

b) kmeň sa fermentuje v kultivačnom médiu, do ktorého sa pridá 3'-karboxymetyltiopropiónová kyselina alebo jej soľ alebo ester, vhodná na získanie 2-(karboxyctyltiojacctyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-6-aminopenicilánovej kyseliny, tzn. 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-6-APA, pričom kruh v posledne uvedených látkach sa in situ rozšíri za vzniku 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA;

c) z fermentačnej pôdy sa izoluje 2-(karboxyetyltiojacetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA;

d) 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA sadeacyluje; a

e) izoluje sa kryštalická 7-ADCA.

Stupeň e) je prednostne filtračným stupňom.

Expresia génu expandázy je prednostne transkripčne a translačne regulovaná príslušnými kontrolnými prvkami AT-génu, čo zaisťuje súčasnosť expresie týchto génov.

Prednostne sa 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA izoluje z fermentačnej pôdy extrakciou filtrátu tejto pôdy organickým rozpúšťadlom, ktoré je nemiešateľné s vodou pri pH nižšom ako asi 4,5 a reextrakciou vzniknutého extraktu vodou pri pH v rozmedzí od 4 do 10.

Pri transformácii kmeňa Penicillium chrysogrenum génom expandázy za transkripčnej a translačnej regulácie expresných signálov vláknitej huby sa účelne používa rekombinantný DNA vektor obsahujúci DNA kódujúcu expandázu, ktorá je funkčne pripojená k transkripčným a translačným kontrolným prvkom AT-génu gpdA z P. chrysogenum alebo A. nadulans.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1	je	znázornená i	funkčná	mapa	plazmidu
pMcTNE. Na obr.	2	je	znázornená	funkčná	mapa	plazmidu
pMcTSE. Na obr.	3	je	znázornená	funkčná	mapa	plazmidu
pMcTNde. Na obr.	4	je	znázornená	funkčná	mapa	plazmidu
pGNETA. Na obr.	5	je	znázornená	funkčná	mapa	plazmidu
pGSETA.

Na obr. 6 je znázornená funkčná mapa plazmidu pANETA.

Na obr. 7 je znázornená funkčná mapa plazmidu pASETA.

Na obr. 8 je znázornená sekvencia DNA Nocardia lactamdurans cefE (Coque et al., hore uvedená citácia) (spodné riadky) uvedená v zákryte pod sekvenciou PCR produktu 1 (vrchné riadky).

Krátky opis zoznamu sekvencií

Sekvencie 1 až 13 (SEQ ID NO: 1 až 13) predstavujú oligonukleotidy použité na konštrukciu expresnej kazety P.

chrysogenum pre gény cefE Streptomyces clavuligerus a Nocardia lactamdurans.

Sekvencia 14 (SEQ ID NO: 14) predstavuje sekvenciu DNA cefE Nocardia lactamdurans (Coque et al., uvedená citácia).

Nasleduje podrobnejší opis tohto vynálezu.

Vynález sa opiera o použitie funkčných génových konštruktov v P. chrysogenum pre in vivo rozširovanie kruhovej štruktúry penicilínu v kombinácii s použitím nového substrátu pre biosyntetické enzýmy, s cieľom získať derivát kľúčového medziproduktu pri biosyntéze cefalosporínu, ktorým je 7-aminodesacetoxycefaIosporánová kyselina, tzn. 7-ADCA. Tento derivát má chemické zloženie umožňujúce účinnú rozpúšťadlovú extrakciu, ktorá predstavuje ekonomicky atraktívny spôsob izolácie.

Transformácia P. chrysogenum môže byť v zásade uskutočnená rôznymi spôsobmi zavádzania DNA, ako je prijímanie protoplastov sprostredkované PEG-Ca, elektroporácia alebo ostreľovanie s nasledujúcou selekciou transformantov [pozri napríklad Van den Hondel en Punt, Gene Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, Aplied Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridge University Press (1991). Bolo tiež opísané použitie dominantných a nedominantných selekčných markérov (Van den Hondel, hore uvedená citácia). Boli opísané tak selekčné markéry homologického pôvodu (získané z P. chrysogenum), ako aj selekčné markéry heterologického pôvodu (získané z iných zdrojov ako z P. chrysogenum).

Použitie rôznych homologických a heterologických markérov na selekciu transformantov v prítomnosti alebo neprítomnosti vektorových sekvencií, ktoré sú fyzikálne pripojené alebo ktoré nie sú pripojené k neselektovateľnej DNA, je pri selekcii transformantov dobre známe.

Na selekciu transformantov P. chrysogenum sa prednostne používa homologický selekčný markér, aby sa obmedzilo množstvo heterologickej DNA zavedenej do Penicillium chrysogenum. Najväčšia prednosť sa venuje použitiu dominantného selekčného markéru, ktorý sa dá selektívne odstrániť z transformovaného kmeňa, napríklad génu amdS z A. nidulans alebo inej vláknitej huby (pozri európska patentová prihláška č. 94201896.1). Tieto prednostné vlastnosti selekčného markéru z transformantu Penicillium chrysogenum sú veľmi prospešné pri postupoch monitorovania procesu a registrácie produktu, pretože sa na nich nepodieľajú žiadne markéry rezistencie proti antibiotikám a nemôže teda dôjsť k ich uvoľňovaniu do životného prostredia.

Rozpracovanie, ktorému sa venuje najväčšia prednosť, zahŕňa selekčný markér amdS, ktorý je možné selektívne z kmeňa odstraňovať a ktorý umožňuje donekonečna opakovať transformačné cykly pri použití rovnakej dominantnej selekcie. Okolnosť, že nové kmene P. chrysogenum exprimujúce expandázu neobsahujú selekčné markéry, má rozhodujúci význam na rýchly vývoj vysoko produkčných kmeňov v rámci programu zlepšovania priemyselných kmeňov.

Enzým expandáza sprostredkujúci reakciu spojenú s rozšírením kruhu sa zavádza a exprimuje v P. chrysogenum, napríklad v kmeni Wisconsin 54-1255. Toto rozšírenie kruhu sa tiež vykonáva v mutantoch majúcich zlepšený výťažok β-laktámu. Je zrejmé, že v posledne uvedenom prípade je potrebné podmienky média mierne prispôsobiť na dosiahnutie účinného rastu.

Okrem toho, gén cefE sa umiestni pod transkripčnú a translačnú kontrolu príslušných kontrolných elementov génu vláknitej huby, prednostne získaných z génu acyltransfe rázy (AT z P. chrysogenum), čo umožňuje jeho expresiu v optimálnom časovom rámci, pričom táto expresia je synchronizovaná so samotným pôsobením acyltransferázy. Tieto opatrenia majú rozhodujúci význam pre účinnosť rozširovania kruhu v molekule penicilínu.

Okrem synchronizovanej expresie génov kódujúcich expandázu a acyltransferázu môže byť pre vývoj ekonomického produkčného procesu dôležitá intraceluláma kolokalizácia časti enzýmu expandázy s acyltransferázou v miktotelieskach (intraceluláme umiestnenie acyltransferázy). Pri týchto prednostných rozpracovaniach sa nesmieme zníži množstvo penicilínových vedľajších produktov, ktoré nie sú registračnými úradmi tolerované vo výslednom produkte 7-ADCA.

V krátkosti je možné zhrnúť, že vynález učí, akým spôsobom sa dá aktivita enzýmu expandázy zavedeného do P. chrysogenum využiť na rozširovanie penicilínového kruhu za podmienok synchronizovanej expresie.

Podľa tohto vynálezu sa vyrábajú β-laktámové medziprodukty 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA v P. chrysogenum tak, že sa pridá 3-karboxymetyltiopropiónová kyselina alebo jej soľ, alebo ester. Ako vhodné soli je možné napríklad uviesť soli sodné a draselné. Tieto látky sa účinne regenerujú z produkčného média jednoduchou rozpúšťadlovou extrakciou, ktorá sa uskutočňuje napríklad takto:

Pôda sa prefdtruje a k filtrátu sa pridá organické rozpúšťadlo, ktoré je nemiešateľné s vodou. Prispôsobí sa hodnota pH, aby sa cefalosporín extrahoval z vodnej vrstvy. Hodnota pH musí byť nižšia ako 4,5 a prednostne by mala ležať v rozmedzí od 4 do 1, osobitne výhodne od 2 do

1. Pritom sa cefalosporín oddelí od mnohých iných nečistôt, ktoré sú prítomné vo fermentačnej pôde. Prednostne sa používa malý objem organického rozpúšťadla, takže vzniká koncentrovaný roztok cefalosporínu. Pritom je možné znížiť objemové rýchlosti prietoku. Druhú možnosť predstavuje úplná extrakcia pôdy pri pH 4 alebo nižšom. Prednostne sa pôda extrahuje pri pil v rozmedzí od 4 do 1 organickým rozpúšťadlom, ktoré je nemiešateľné s vodou.

Môže sa použiť akékoľvek rozpúšťadlo, ktoré neinterferuje s molekulou cefalosporínu. Ako vhodné rozpúšťadlá je možné uviesť napríklad butylacetát, etylacetát, metylizobutylketón, alkoholy, ako je butanol. Prednostne sa používa 1-butanol alebo izobutanol.

Cefalosporín sa potom reextrahuje vodou pri pH v rozmedzí od 4 do 10, prednostne od 6 do 9. I v tomto prípade sa drasticky zníži konečný objem. Izolácia sa môže vykonávať pri teplotách v rozmedzí od 0 do 50 °C, prednostne pri teplote okolia.

Na takto získaný vodný roztok cefalosporínu sa pôsobí vhodným enzýmom, aby sa odstránil 2-(karboxyetyltio)acetylový a 3-(karboxymetyltio)propionylový postranný reťazec a aby sa získala požadovaná 7-ADCA.

Prednostne sa používa imobilizovaný enzým, aby bolo možné používať enzým opakovane. Spôsoby výroby takých častíc a imobilizácia enzýmov sú dôkladne opísané v EP-A0 222462. Hodnota pH vodného roztoku je napríklad 4 až 9. Za týchto podmienok je degradácia cefalosporínu minimalizovaná a je optimalizovaná požadovaná enzymatická konverzia. Enzým sa teda pridá k vodnému roztoku cefalosporínu za súčasného udržovania hodnoty pH na vhodnej úrovni, napríklad pridávaním anorganickej bázy, ako je roztok hydroxidu draselného alebo pri použití katexovej živice. Po skončení reakcie sa imobilizovaný enzým odfiltruje. Ďalšia možnosť spočíva v použití imobilizovaného enzýmu v kolóne s pevným alebo fluidizovaným lôžkom alebo v použití roztoku enzýmu. V posledne uvedenom prí pade sa produkty oddeľujú membránovou fdtráciou. Potom sa reakčná zmes okyslí v prítomnosti organického rozpúšťadla, ktoré je nemiešateľné s vodou.

Vhodné enzýmy napríklad pochádzajú z mikroorganizmu Pseudomonas SY77 (mutácia v jednej alebo viacerých polohách 62, 177, 178 a 179). Môžu sa tiež použiť enzýmy z iných mikroorganizmov prednostne Pseudomonas SE83, ktoré prípadne majú mutáciu v jednej alebo vo viacerých z polôh zodpovedajúcich polohám 62, 177, 178 a 179 v Pseudomonas SY77.

Po nastavení hodnoty pH na asi 0,1 až 1,5 sa oddelia vrstvy a pH vodnej vrstvy sa nastaví na 2 až 5. Nakoniec sa kryštalická 7-ADCA odfiltruje.

Deacylácia sa tiež môže vykonávať chemicky pri použití spôsobov známych z doterajšieho stavu techniky, napríklad cez tvorbu iminochloridového postranného reťazca (táto reakcia sa uskutočňuje tak, že sa pridá chlorid fosforečný pri teplote nižšej ako 10 °C a potom izobutanol pri teplote okolia alebo pri teplote nižšej).

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch rozpracovania. Uvedené príklady majú výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú.

Príklady uskutočňovania vynálezu

Príklad 1

Expresia génov cefE Streptomyces a Nocardia v Penicillium chrysogenum

a) Všeobecné postupy klonovania génu a transformácie génu

Pri postupe podľa vynálezu sa používajú obvyklé techniky klonovania génu. Tieto techniky zahŕňajú reťazové reakcie katalyzované polymerázou (PCR), syntézu oligonukleotidu, stanovenie sekvencie nukleotidov v DNA, enzymatickú ligáciu a reštrikciu DNA, subklonovanie vektora E. coli, transformáciu a selekciu transformantov, izoláciu a purifikáciu DNA, charakterizáciu DNA analýzou Southem blot a próbami značenými ³²P, ³²P značenie DNA náhodným primovaním. Tieto techniky sú veľmi dobre známe v tomto odbore a sú dobre opísané v mnohých literárnych citáciách (pozri napríklad Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA (1989), Innes et al., PCR protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Prcss (1990) a McPherson et al., PCR, a Practical Approach, IRL Press (1991).

Všeobecné postupy použité pri transformácii vláknitých húb a selekcii transformantov zahŕňajú prípravu fiingálnych protoplastov, prenos DNA a vytvorenie podmienok na regeneráciu protoplastov, purifikáciu tranformantu a jeho charakterizáciu. Tieto postupy sú všetky dobre známe v tomto odbore a sú dobre dokumentované v nasledujúcich publikáciách: Finkelstein a Balí (eds.), Biotechnology of Filamentous Fungi, Technology and Products, ButterworthHeinemann (1992); Bennett a Lasure (Eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press (1991); Tumer, v Puhler (ed.), Biotechnology, druhé úplne prepracované vydanie, VCH (1992).

Ďalšie špecifické aplikácie klonovania génu a technológie transformácie génu do Penicillium chrysogenum sú veľmi dobre dokumentované v uvedených citáciách Bennett a Lasure; Finkelstein a Balí.

- Syntetické oligonukleotidy DNA sa syntetizujú pri použití obchodne dostupného syntetizátory DNA (Applied Biosystems, CA, USA) podľa inštrukcií výrobcu.

- PCR sa uskutočňuje pri použití obchodne dostupného automatizovaného prístroja na vykonávanie PCR (Perkin Elmer, USA) a DNA polymerázy Ultma (Perkin Elmer) podľa údajov výrobca.

- Použije sa protokol hGC PCR (Dutton et al., Nucleic Acid Res. 21, (číslo 12) (1993) 2953 až 2954), aby bolo možné amplifikovať kódujúce oblasti cefE N. lactamdurans a chromozomálnej DNA S. clavuligerus.

- Reštrikčné enzýmy a iné enzýmy na modifikáciu DNA pochádzajú od firmy BRL (MD, USA) a používajú sa v súlade s inštrukciami výrobca.

- Vektor E. coli, pBluescript^{1 * * * * * * * * (R)} je získaný od firmy Stratagene (CA, USA).

- Iné použité chemikálie sú v čistote p. a. a pochádzajú od rôznych dodávateľov.

- Analýza sekvencie nukleotidov v DNA sa uskutočňuje pri použití automatizovaného zariadenia na analýzu sekvencie DNA (Applied Biosystems), ktoré pracuje na báze detekcie sekvenčne špecifického fluorescenčného značenia. Pracuje sa podľa inštrukcií výrobcu.

b) Kultivácia mikroorganizmov

Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 sa pestuje v sójovom náleve „Tryptic soy broth“ (Difco). Chromozomálna DNA tohto kmeňa sa použije na izoláciu génu cefE (Kovacevitz et al., J. Bacteriol. (1989) 754 až 760).

Tiež Nocardia lactamdurans ATCC 27382 sa pestuje v sójovom náleve „Tryptic soy broth“ (Difco). Chromozomálna DNA tohto kmeňa sa použije na izoláciu génu cefE (Coque et al., uvedená citácia).

Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) sa pestuje v kompletnom médiu YPD (YPD; 1 % kvasnicový extrakt, 2 % peptón, 2 % glukóza). Chromozomálna DNA tohto kmeňa sa použije na izoláciu 5' a 3' regulačnej oblasti génu penDE, ktoré sú potrebné na expresiu génu cefE. Ako hostiteľ pre transformačné experimenty s génom cefE sa tiež použije Penicillium chrysogenum ATCC 28089. Iné kmene Penicillium chrysogenum vrátane mutantov kmeňa Winconsin 54-1255, poskytujúce zlepšené výťažky β-laktámu, sú tiež vhodné. V závislosti od použitého selekčného markéra pre transformanty sa môžu použiť kmene P. chrysogenum obsahujúce mutácie v géne pyrG, niaD alebo facA. Tieto mutantné kmene je možné získať metódami, ktoré sú dobre známe v tomto odbore (Cantoral, Bio/Technol. 5 (1987), 494 až 497; Gouka et al., J. Biotechn. 20 (1991), 189 až 200; a Gouka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1993), 514 až 519).

Kultivácia P. chrysogenum s cieľom získať protoplasty použité pri transformácii sa tiež uskutočňuje v médiu YPD.

V tomto odbore je dobre známe, že postupy tvorby protoplastov a regeneračné postupy sa môžu mierne líšiť v závislosti od konkrétne použitého kmeňa Penicillium chrysogenum a konkrétneho postupu selekcie transformantov.

Kultúra E. coli WK6 (Zell and Fritz, EMBO J. 6 (1987), 1809 až 1815), XLI-Blue (Stratagene) a HB 101 (Boyer a Roulland-Dussoix, J. Mol. Biol., 41 (1969), 459; Bolivar a Backman, Messages Enzymol. 68 (1979), 2040) sa udržuje a kultivuje pri použití štandardného kultivačného média pre E. coli (Sambrook, supra).

c) Konštrukcia expresných kaziet cefE

Expresné kazety cefE sú uvedené v tabuľke I, v ktorej je tiež vysvetlené názvoslovie, ktoré bolo použité na označovanie týchto plazmidov.

Tabuľka I

Zoznam skonštruovaných expresných kaziet cefE

Legenda:

’tac = hybridný promotor trp-lac ²gpd = 5'-koniec génu gpdA z A. nidulans ³ AT = 3'-koniec génu penDE z P. chrysogenum ⁴AT = 5'-koniec génu penDE z P. chrysogenum

Plazmld	Promotor	Gén	Mikrotelesá -zacielenie	Terminátor
pMCTSE	ta=l	S.cla cefE		FdT
pMCTNE	tac	N.lac cefE		Fdt
pGSE	gpd²	S.cla cefg		-
pGNE	gpa	N.lac cefE		-
pGMETA	gpd	N.lac oefE	* zacielenie	AT³
pGNEWA	9pd	N.lac cefE	Wt	AT
pANETA	AT⁴	N.lac cefE	4 zacielenie	AT
pANEWA	AT	N.lac cefE	wt	AT
pGSETA	9Pd	S.cla cefE	4 zacielenie	AT
pGSEWA	gpd	S.cla cefE	Wt	AT
pASETA	AT	S.cla cefg	4 zacielenie	AT
pÄSEWA	AT	S.cla cefE	wt	AT

Na zhotovenie syntetických oligonukleotidov, ktorých zoznam je uvedený v tabuľke II sa použijú publikované nukleotidové sekvencie: génu cefE z S. clavuligerus (Kovacevitz, uvedená citácia), génu cefE z N. lactamdurans (Coque, uvedená citácia), génu gpdA z A. nidulans (funt et al., Gene 69 (1988), 49 až 57) a génu penDE z P. chrysogenum (Barredo et al., Gene 83 (1989) 291 až 300): Diez et al., Mol. Gen. Genet. 218 (1989), 572 až 576.

Tabuľka II

Oligonukleotidy použité na konštrukciu expresných kaziet P. chrysogenum pre gén cefE z N. lactamdurans a S. clavuligerus

1. 5<-GCT GAA GGA GCT GAG CAT ATC ACG

GAC GCG ACC GTG CCG ACC-3'

2. 5'-CCC GGG TCT AGA TCT AGA TCA CCG

GGC GGC GGC GGT CTT CCG GAT GTT-3'

3. S'-GAT CAG TGA GAG TTG CAT ATG GAC

ACG ACG GTG CCC ACC TTC AGC CTG-3'

4. 5'-CCC GGG .TCT AGA TCT AGA CIA TGC

CTT GGA TGT GCG GCG GAT GTT-3'

5. 5'—GAG CTC TGT GAA TTC ACA GTG ACC

GCT GAC TCT TTC—3*·

6. S'-GGG AGC CAT ATG GAT GTC TGC TCA

AGC GGG GTA GCT-3'

7. 5'-AGA ACG GAT TAG ΤΓΑ GTC TGA ATT

CÄA CAA GAA CGG CCA GAC-3'

8. 5' -GAC AGA GGA TGT GAA GCA TAT GTG

CTG CGG GTC GGA AGA TGG-3'

9. 5'-ACA TCA ACA TCC GGA AGA CCG CCG

CCG CCC GGT GAA GGC TCT TCA TGA-3'

10. 5'-GGA CTA GTG TCG ACC CTG TCC ÄTC

CTG AAA GAG TTG-3'

11. S'-ACÄ TCA ACA TCC GGA AGA CCG CCG

CCG CCC GGC TTT GAA GGC TCT TCA-3' . 5'-TTC GAT GTC AGC CTG GAC GGC GAG

ACC GCC ACG TTC CAG GAT TGG ÄTC

GGG GGC AAC TAC GTG AAC ATC CGC CGC ACA TCC AAG GCA TGA AGG CTC

TTC ATG ACG-3'

13. 5'-GAT GTC AGC CTG GAC GGC GAG ACC

GCC ACG TTC CAG GAT TGG ATC GGG GGC AAC TAC GTG AAC ATC CGC CGC

ACA TCC AAG CTA TGA AGG CTC TTC

ATG ACG-3' cl. Konštrukcia expresných plazmidov cefE E. coli (pMCTSE a pMCTNE)

PCR, 1: Ύ. lactamdurans cefE

Pri prvej reťazovej reakcii PCR pri použití chromozomálnej DNA z N. lactamdurans a oligonukleotidov 1 a 2 sa získa otvorený čítací rámec N. lactamdurans cefE vo forme 0,9 kb PCR produktu obsahujúceho jedinečné reštrikčné miesto Ndel pri 5'- konci a jedinečné reštrikčné miesto Xbal pri 3'-konci.

PCR, 2: S. clavuligerus cefE

Pri druhej reťazovej reakcii PCR pri použití chromozomálnej DNA z 5. clavuligerus a oligonukleotidov 3 a 4 sa získa otvorený čítací rámec S. clavuligerus cefE vo forme 0,9 kb PCR produktu tiež obsahujúceho jedinečné reštrikčné miesto Ndel pri 5'-konci a jedinečné reštrikčné miesto Xbal pri 3'-konci.

Na účely expresie génov cefE v E. coli a charakterizácie PCR produktov DNA sekvenčnou analýzou sa PCR produkty 1 a 2 klonujú do vektoru pMCTNde, čo je derivát pMC-5 (Stanssens et ah, Nucleic Acids Res. 17 (1989), 4441). Plazmid pMCTNde je odvodený od pMCS-8 (európska patentová prihláška č. 0351029) inzerciou fragmentu kódujúceho promotor tac a potom miesta RBS a klonovacicho miesta Ndel (obr. 3).

PCR produkty 1 a 2 sa rozštiepia Ndel a Xbal a ligujú do Ndel Xbal rozštiepeného vektora pMCTNde. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli WK6. Transformanty sa selektujú na rezistenciu proti chloramfenikolu. Tieto transformanty sa použijú na izoláciu plazmidovej DNA. Vložená expresná kazeta cefE sa najprv analyzuje štiepením reštrikčným enzýmom a izoláciou predvídaných reštrikčných fragmentov. Plazmidy obsahujúce predvídané miesta na štepenie reštrikčným enzýmom sa nakoniec analyzujú automatizovanou DNA sekvenčnou analýzou.

Sekvencia DNA otvoreného čítacieho rámca S. clavuligerus cefE v plazmide pMCTSE (pozri obr. 2) je zo 100 identická s publikovanou sekvenciou (Kovacevitz, uvedená citácia).

Sekvencia DNA (obr. 8) všetkých analyzovaných klonov obsahujúcich otvorený čítací rámec N. lactamdurans cefE je odlišná od publikovanej sekvencie (Coque, uvedená citácia).

Odvodená aminokyselinová sekvencia publikovaného génu cefE z N. lactamdurans obsahuje prolín v aminokyselinovej polohe 41 (pozri SEQ ID NO: 14). Tento prolínový zvyšok chýba v klonoch, ktoré boli získané pri PCR 1. Získaný plazmid je označený názvom pMCTNE (pozri obr. 1).

c2. Konštrukcia expresných plazmidov P. chrysogenum cefE PCR, 3: gpdA promotor

Pri tejto tretej PCR pri použití DNA z plazmidu pAN71 (Punt et ah, Gene 56 (1987), 117 až 124), ktorý obsahuje gén hph z E. coli pod kontrolou promotoru gpdA z A. nidulans a oligonukleotidy 5 a 6, sa získa promotor gpdA vo forme 0,9 kb PCR produktu obsahujúceho jedinečné reštrikčné miesto EcoRI pri 5'-konci a jedinečné reštrikčné miesto Ndel pri 3'- konci.

PCR, 4: AT promotor

Pri štvrtej reťazovej reakcii PCR pri použití chromozomálnej DNA z P. chrysogenum a oligonukleotidov 7 a 8 sa získa 1,5 kb fragment promotoru AT tiež obsahujúci jedinečné reštrikčné miesto EcoRI pri 5'-konci a jedinečné reštrikčné miesto Ndel pri 3’-konci.

PCR, 5: AT terminátor a 3'-koniec génu cefE z M lactamdurans

Pri piatej PCR sa získa 0,5 kb oblasť penDE (AT) terminátoru pri použití chromozomálnej DNA z P. chrysoge num a oligonukleotidov 9 a 10 alebo 11 a 10. Tieto PCR produkty teda obsahujú 3'-terminálne sekvencie génu cefE so signálom na zacielenie mikrotelies alebo bez neho, ktoré sa skladajú z C-tcrminálncj aminokyselinovej sekvencie ARL (Miiller et al., Biochimica et Biophysica Acta 1116 (1992), 210 až 213).

Tieto oligonukleotidy sa skonštruujú tak, aby sa jedinečné miesto BspEI zaviedlo k 5’-koncu PCR produktu a jedinečné miesto Spel k 3'-koncu PCR produktu.

PCR, 6: AT terminátor a 3'-koniec génu cefE z S clavuligerus

Pri šiestej PCR sa získa 0,5 kb oblasť penDE (AT) terminátoru pri použití chromozomálnej DNA z P. chrysogenum a oligonukleotidov 12 a 10 alebo 13 a 10. Tieto PCR produkty teda obsahujú 3'-terminálne sekvencie génu cefE S. clavuligerus so signálom na zacielenie mikrotelies alebo bez neho, ktoré sa skladajú z C-terminálnej aminokyselinovej sekvencie SKL (De Hoop et al., Biochem. J. 286 (1992), 657 až 669).

Tieto oligonukleotidy sa skonštruujú tak, aby sa jedinečné miesto BglI zaviedlo k 5'-koncu PCR produktu a jedinečné miesto Spel k 3'-koncu PCR produktu.

Aby sa dosiahla expresia génov cefE v P. chrysogenum, liguje sa fragment promotoru gpdA a fragment promotoru AT k fragmentom cefE z plazmidov pMCTNE a pMCTSE. Tieto ligované fragmenty sa klonujú do vektora pBluescript II KS.

Produkt PCR 3 sa štiepi EcoRI a Ndel. Plazmidy pMCTNE a pMCTSE sa štiepia Ndel a Xbal. Tieto reštrikčné fragmenty sa oddelia elektroforézou na agarózovom géli. 0,9 kb fragmenty' kódujúce cefE sa purifikujú na agarózovom géli. Promotórový fragment EcoRI-Ndel sa liguje s fragmentmi cefE Ndel-Xbal do vektora pBluescript II KS štiepeného EcoRI-Xbal. Tak sa získajú plazmidy pGSE a pGNE.

Na dosiahnutie optimálnej expresie génov cefE v P. chrysogenum bol zvolený prístup, pri ktorom sa AT terminačná signálna sekvencia klonuje za gény cefE v uvedených expresných plazmidoch Penicillium.

pGNETA-pGNEWA

Produkty PCR 5 sa štiepia BspEI a SpEI a ligujú do vektora pGNE rozštiepeného BspEI a SpEI. Ligačné zmesi sa použijú na transformáciu E. coli HB101. Transformanty sa selektujú na základe rezistencie proti ampicilínu. Plazmidy izolované z týchto transformantov sa charakterizujú analýzou reštrikčných fragmentov a neskôr DNA sekvenčnou analýzou. Tak sa získajú plazmidy pGNEWA a pGNETA (obr. 4).

pGSETA-pGSEWA

Produkty PCR 6 sa štiepia BglI a SpEI a ligujú do vektora pGSE rozštiepeného BglI a SpEI. Ligačné zmesi sa použijú na transformáciu E. coli HB101. Transformanty sa selektujú na základe rezistencie proti ampicilínu. Plazmidy izolované z týchto transformantov sa tiež charakterizujú analýzou reštrikčných fragmentov a neskôr DNA sekvenčnou analýzou. Tak sa získajú plazmidy pGSEWA a pGSETA (obr. 5), pANETA, pANEWA, pASETA a pASEWA.

Plazmidy pGNETA, pGNEWA, pGSETA a pGSEWA sa štiepia EcoRI a Ndel. Reštrikčné fragmenty sa oddelia elektroforézou na agarózovom géli a z gélu sa purifikujú 4,5 kb fragmenty.

Produkt PCR 4 sa štiepi EcoRI a Ndel a liguje s purifikovanými uvedenými fragmentmi Po transformácii ligačných zmesí do E. coli HB101 sa transformanty selektujú na základe rezistencie proti ampicilínu.

Transformanty sa nechajú rásť a ich plazmidy sa izolujú a charakterizujú analýzou reštrikčných fragmentov a nakoniec DNA sekvenčnou analýzou. Tak sa získajú požadované konštrukty pANETA (obr. 6), pANEWA, pASETA (obr. 7)apASEWA.

d) Transformácia P. chrysogenum

Použije sa Ca-PEG sprostredkovaného postupu transformácie protoplastov.

Pri použití postupov opísaných v uvedených publikáciách Cantoral; Gouka et al. (J. Biotechn., pozri hore) a Gouka et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., pozri hore) sa použije celý plazmid alebo purifikovaná expresná kazeta cefE (neobsahujúca sekvenciu vektoru E. coli) na transformáciu kmeňov P. chrysogenum s génmi pyrG, niaD, facA alebo amdS (Beri et al., Curr. Genet. 11 (1987) 639 až 641), ako selekčnými markérmi.

Pri použití homologických selekčných markérov pyrG, niaD alebo facA v purifikovanej forme, tzn. bez obsahu sekvencií vektoru E. coli, sa získajú transformované kmene Penicillium chrysogenum, ktoré neobsahujú gény bakteriálnej rezistencie.

V európskej patentovej prihláške č. 94201895.1 je opísaný spôsob získavania rekombinantných kmeňov bez selekčného markérového génu. Tento spôsob bol s úspechom použitý pri transformantoch P. chrysogenum obsahujúcich ako dominantný selekčný markér gén amdS z A. nidulans.

Jedinými elementmi heterologickej povahy sú potom 0,9 kb oblasť kódujúca cefE a prípadne 0,9 kb oblasť promotoru gpdA.

e) Analýza transformantov

Transformanty P. chrysogenum sa purifikujú opakovanou kultiváciou na selekčnom médiu. Jednotlivé stabilné kolónie sa použijú na prípravu šikmých agarov, s cieľom produkcie spór a s cieľom skríningu na transformanty obsahujúce expresne kazetu cefE. Varením fragmentu čerstvého mycélia z transformantov na miske s agarom sa získa dostatočné množstvo templátovej DNA na efektívnu selekciu niekoľkých stoviek transformantov na prítomnosť génu cefE pri použití PCR techniky [Seth, Fungal Genetics Conference, Asilomar (1991), Abstract v Fungal Genetics Newsletter 38, 55], Pritom sa odhadne účinnosť transformácie.

Skríning transformantov sa tiež vykoná bioesejom. Transformanty sa nechajú rásť na agarovom médiu obsahujúcom zvolený prekurzor postranného reťazca. Ako indikátorové baktérie v prevrstvujúcom agare sa použije E. coli ESS2231.

Táto vrstva agaru obsahuje tiež Bacto-penázu, aby bola schopná diskriminovať medzi produkciou penicilínu a cefalosporínu v súlade s postupmi známymi v tomto odbore a opísanými napríklad v Guttiérez et al., Mol. Gen. Genet. 225(1991), 56 až 64.

Spóry sa použijú na inokuláciu kultivačného média P. chrysogenum, ktoré je opísané v časti d. Po 72 hodinách kultivácie pri 25 °C sa z mycélia izoluje chromozómová DNA. Táto DNA sa rozštiepi reštrikčným enzýmom s 6 bp rozpoznávacou sekvenciou, ako EcoRI alebo Pstl.

Fragmenty DNA sa oddelia elektroforézou na agarózovom géli a blotujú sa na nylonovej membráne Gene screen (New England Nuclear). Bloty Southem sa hybridizujú s ³²P-značeným produktom PCR 2, ako próbou na sekvencie génu cefE. ³²P značenie purifikovaného produktu PCR 2 sa vykoná náhodným značením pomocou primovania v prítomnosti a³²P dCTP pri použití obchodne dostupnej súpravy na značenie (Boehringer Mannheim).

Transformanty obsahujúce sekvenciu kódujúcu cefE sa skúšajú na expresiu produktu génu cefE, ktorá je tu označovaná názvom aktivita expandázy.

Selektované transformanty sa kultivujú v médiu na produkciu penicilínu (pozri príklad 2).

V experimente, pri ktorom sa sleduje priebeh fermentácie v závislosti od času, sa odoberajú vzorky média po 48, 72 a 96 hodinách. Vyrobia sa extrakty mycélia a v surových extraktoch sa stanoví aktivita expandázy v podstate spôsobom opísaným v Rollins et al., Can. J. Microbiol., 34 (1988), 1196 až 1202. Transformanty majúce aktivitu expandázy sa tiež skúšajú na aktivitu acyltransferázy spôsobmi opísanými v Alvarez et al., Antimicrob. Agent Chem. 31 (1987), 1675 až 1682.

Na základe týchto analýz sa selektujú transformanty s rôznou úrovňou acyltransferázovej a expandázovej enzymatickej aktivity na fermentačnú produkciu derivátov 7-ADCA.

Príklad 2

Fermentačná produkcia 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA a ich izolácia

Kmeň P. chrysogenum Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) sa transformuje jedným z konštruktov DNA opísaných v príklade 1 a inokuluje v koncentrácii 2 x 10⁶ konídií/ml do očkovacieho média, ktoré obsahuje nasledujúce látky (koncentrácie v g/liter sú uvedené v zátvorkách) : glukóza (30); síran amónny (10), dihydrogenfosforečnan draselný (10); roztok stopových prvkov I (10 ml/liter) [heptahydrát síranu horečnatého (25); heptahydrát síranu železnatého (10): pentahydrát síranu meďnatého (0,5); heptahydrát síranu zinočnatého (2); síran sodný (50); monohydrát síranu mangánatého (2); dihydrát chloridu vápenatého (5)]. Hodnota pH pred sterilizáciou je 6,5.

Očkovacia kultúra sa inkubuje 48 až 72 hodín pri teplote 25 až 30 °C a potom sa použije na inokuláciu 10 až 20 objemov produkčného média, ktoré obsahuje nasledujúce látky (koncentrácie v g/liter sú uvedené v zátvorkách): laktóza (80); maltóza (20); síran vápenatý (4); močovina (3); heptahydrát síranu horečnatého (2); dihydrogenfosforečnan draselný (7); chlorid sodný (0,5); síran amónny (6); heptahydrát síranu železnatého (0,1); 3'-karboxymetyltiopropiónová kyselina (5); roztok stopových prvkov II: (10 ml/liter) [pentahydrát síranu meďnatého (0,5); heptahydrát síranu zinočnatého (2); monohydrát síranu mangánatého (2); síran sodný (50)]. Hodnota pH pred sterilizáciou je 5,5 až 6,0. Potom sa v inkubácii pokračuje ďalších 96 až 120 hodín.

Na konci produkčnej fermentácie sa mycélium oddelí centrifugáciou alebo filtráciou a 2-(karboxyetyltio)acetyl a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA sa analyzuje vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) na stĺpci s obrátenými fázami. Použije sa zariadenie pre HPLC Beckman Systém Gold, ktoré sa skladá z programovateľného rozpúšťadlového systému model 126, automatického zberača frakcií model 507, diódového detektora model 168 a systému na spracovanie dát Systém Gold (5.10). Ako stacionárne fázy sa použijú dve patrónové kolóny Chromspher C18 (100 x 3 mm, Chrompack), ktoré sú zapojené v sérii. Mobilná fáza sa skladá z lineárneho gradientu od 100 % 0,07 M fosfátového tlmivého roztoku s pH 4,8 do kombinácie 25 % acetonitrilu a 75 % fosfátového tlmivého roztoku s pH 4,8, behom 15 minút pri prietokovej rýchlosti 0,5 ml/min. Produkcia 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karbo xymetyltio)propionyl-7-ADCA sa kvantifíkuje pri 260 nm pri použití syntetickej 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA, ako referenčnej látky.

Identita pikov sa potvrdí tým, že sa porovnajú UV a NMR spektrá (v systéme on line).

Pôda sa prefiltruje a k filtrátu sa pridá asi 0,1 objemu 1 -butanolu. Hodnota pH zmesi sa nastaví zriedenou kyselinou chlorovodíkovou na 2 a vzniknutá zmes sa 5 minút mieša pri teplote miestnosti. Organická vrstva sa oddelí a buď sa odparí, alebo sa ďalej použije na chemickú deacyláciu (príklad 3). Tiež sa môže reextrahovať 0,33 objemu vody s pH 8 (pričom vzniknutý extrakt sa potom môže použiť pri enzymatickej deacylácii (príklady 4 a 5).

Príklad 3

Deacylácia 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymctyltio)propionyl-7-ADCA

K zmesi 3 g (8 mmol) 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA sa pri teplote okolia pridá 3,5 ml (36 mmol) N,N-dimetylanilínu, 13 ml metylénchloridu a 2,6 ml (21 mmol) trimetylchlórsilánu. Zmes sa 30 minút mieša, ochladí sa na približne -50 °C a potom sa k nej naraz pridá 1,8 g (8,5 mmol) chloridu fosforečného. Teplota reakčnej zmesi sa 2 hodiny udržiava na -40 °C a potom sa zmes ochladí na -65 °C. Ďalej sa k tejto zmesi pridá 12 ml (137 mmol) izobutylalkoholu. Tento izobutylalkohol sa pridáva takou rýchlosťou, aby teplota reakčnej zmesi neprestúpila -40 °C. Roztok sa ďalej 2 hodiny mieša a potom sa naleje do 15 ml vody a bezprostredne na to sa k vzniknutej zmesi pridá 5 ml 4,5 N roztoku amoniaku. Pomalým pridávaním pevného hydrogenuhličitanu amónneho sa hodnota pH nastaví na 4. Zmes sa ochladí na 5 °C, prefiltruje a kryštalická 7-ADCA sa premyje 5 ml vodného acetónu (1 : 1) a izoluje.

Príklad 4

Enzymatická deacylácia 2-(karboxyetyltio)acetyl a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA pri použití acylázy z mutantu Pseudomonas SY77

Konverzia 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA sa vykonáva v jedinom enzymatickom stupni pri použití špecifickej acylázy, ktorá bola získaná miestne orientovanou mutagenézou z acylázy Pseudomonas SY77. Konštrukcia a identifikácia mutantnej acylázy Pseudomonas SY77 so zlepšenou aktivitou proti 2-(karboxytyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionylovému postrannému reťazcu bola opísaná v EP-A-0 453 048. V tomto mutante je tyrozín v polohe 178 v a-podjednotke acylázy Pseudomonas SY77 nahradený histidínom. Mutantná acyláza je produkovaná v E. coli. Bunky sa zoberú centrifugáciou a resuspendujú sa v 10 mM fosfátovom tlmivom roztoku s pH 7,4 s obsahom chloridu sodného (140 mM). Potom sa bunky rozbijú ultrazvukom. Zvyšky buniek sa odstránia a izolujú sa supematanty majúce acylázovú aktivitu. Ďalšia purifikácia acylázy sa vykonáva v sérii chromatografických stupňov: 1. ionexová chromatografia na stĺpci Q-Sepharose fast floty pri pH 8,8;

2. hydrofóbna interakčná chromatografia na PhenylSepharose a 3. gélová permeačná chromatografia na stĺpci Sephacryl S200HR.

Purifikovaná acyláza sa imobilizuje na časticiach skladajúcich sa zo zmesi želatíny a chitosánu. Tesne pred pridaním enzýmu sa na častice pôsobí glutaraldehydom.

Konverzia 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymctyltio)propionyl-7-ADCA sa vykonáva v reaktore typu miešanej nádrže. Do reaktoru sa najprv pridá vodný roztok cefalosporínu. Potom sa teplota roztoku za konštantného miešania zvýši na 30 °C a hodnota pH sa hydroxidom draselným upraví na 8. Potom sa pridá imobilizovaný enzým, čím sa začne konverzia. V priebehu konverzie sa kontinuálne zaznamenáva hodnota pH v reaktore a udržiava sa na 8. 3'-Karboxymetyltiopropiónová kyselina, ktorá sa uvoľňuje behom tejto reakcie, sa titruje hydroxidom draselným. Množstvo pridaného hydroxidu draselného sa integruje a zaznamenáva. Konverzia sa sleduje odberom vzoriek z reaktoru a analýzou na 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyItio)propionyl-7-ADCA a 7-ADCA pri použití HPLC opísanej v príklade 2.

Po dokončení reakcie sa imobilizovaný enzým odfiltruje a hodnota pH filtrátu obsahujúceho butylacetát sa upraví na 1. Oddelia sa vrstvy a pH vodnej vrstvy obsahujúcej 7-ADCA sa upraví na 3. Potom sa kryštalická 7-ADCA odfiltruje.

Príklad 5

Enzymatická deacylácia 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA pri použití acylázy Pseudomonas SE83

Konverzia 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA sa vykonáva spôsobom opísaným v príklade 4, tentokrát však pri použití acylázy Pseudomonas SE83. Dosiahnu sa rovnaké výsledky.

Claims

1. Spôsob výroby a izolácie 7-aminodesacetoxycefalosporánovej kyseliny, 7-ADCA, vyznačujúci sa t ý m , že sa

a) kmeň Penicillium chrysogenum transformuje génom expandázy za transkripčnej a translačnej regulácie expresných signálov vláknitej huby;

b) kmeň sa fermentuje v kultivačnom médiu, do ktorého sa pridá 3'-karboxymetyltiopropiónová kyselina alebo jej soľ alebo ester, vhodná na získanie 2-(karboxyetyltio)acetyl a 3-(karboxymetyltio)propionyl-6-aminopenicilánovej kyseliny, tzn. 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-6-APA, pričom kruh v posledne uvedených látkach sa in situ rozšíri za vzniku 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltío)propionyl-7-ADCA;

c) z fermentačnej pôdy sa izoluje 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA;

d) 2-(karboxyetyltio)acetyl- a 3-(karboxymetyltio)propionyl-7-ADCA sa deacyluje; a

e) izoluje sa kryštalická 7-ADCA.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že stupňom e) je filtračný stupeň.

3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa t ý m , že stupňom c) je filtračný stupeň, pričom filtrát pôdy sa extrahuje organickým rozpúšťadlom, ktoré je nemiešateľné s vodou, pri pH pod asi 4,5 a potom sa vykonájeho reextrakcia vodou pri pH v rozmedzí od 4 do 10.

4. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že gén expandázy pochádza zo Streptomyces clavuligerus alebo Nocardia lactamdurans.

5. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa kmeň Penicillium chrysogenum transformuje génom expandázy za transkripčnej a translačnej regulácie expresných signálov acyltransferázového génu.