ES2663480T3 - Polipéptidos con actividad de permeasa - Google Patents

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ES2663480T3 ES14728558.9T ES14728558T ES2663480T3 ES 2663480 T3 ES2663480 T3 ES 2663480T3 ES 14728558 T ES14728558 T ES 14728558T ES 2663480 T3 ES2663480 T3 ES 2663480T3
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Paul Klaassen
Paulus Petrus DE WAAL
René Marcel de Jong
Arnold Jacob Mattieu Driessen
Jeroen Gerben Nijland
Hyun Yong Shin
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides

Abstract

Polipéptido que tiene una o más sustituciones en una posición correspondiente a la posición 339 o 376 de SEQ ID NO: 59, en la que el polipéptido es un miembro de la superfamilia de facilitadores principales (MFS), polipéptido que es polipéptido de hexosa permeasa, en el que, cuando la sustitución es en la posición correspondiente a 376, el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene un volumen de van der Waals de 80 a 138 Å3 y una hidrofobia de cadena lateral de 10 a 100 ΔtR, y cuando la sustitución es en la posición correspondiente a 339, el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene una hidrofobia de cadena lateral de -30 a 10 ΔtR y un volumen de van der Waals de 80 a 160 A3.

Description

Polipéptidos con actividad de permeasa
Sumario de la invención
Es un objeto de la invención proporcionar novedosos polipéptidos de permeasa con especificidad por azúcares alterada, en particular mejorada. Es otro objeto de la invención proporcionar cepas recombinantes que expresan el polipéptido de permeasa que tienen captación mejorada de la molécula que la permeasa transporta a través de la membrana celular. Es otro objeto proporcionar un polipéptido de permeasa que tienen una capacidad mejorada de transporte de azúcares C5, en particular xilosa, en comparación con un polipéptido original. Es otro objeto proporcionar un polipéptido de permeasa que tiene actividad de transporte reducida para azúcar C6, en particular glucosa, en comparación con un polipéptido original. Es otro objeto proporcionar un método de identificación de mutaciones en otros polipéptidos de permeasa relacionados que tienen un efecto beneficioso sobre la capacidad mejorada del transporte de xilosa o actividad de transporte reducida para glucosa.
Uno o más de estos objetos se obtienen según la invención. Según la presente invención, se proporciona un polipéptido que tiene una o más sustituciones en una posición correspondiente a la posición 339 o 376 de SEQ ID NO: 59, en la que el polipéptido es un miembro de la superfamilia de facilitadores principales (MFS), polipéptido que es polipéptido de hexosa permeasa, en el que, cuando la sustitución es en la posición correspondiente a 376, el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene un volumen de van der Waals de 80 a 138 Å3 y una hidrofobia de cadena lateral de 10 a 100 ΔtR, y cuando la sustitución es en la posición correspondiente a 339, el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene una hidrofobia de cadena lateral de -30 a 10 ΔtR y un volumen de van der Waals de 80 a 160 Å3. En una realización, el aminoácido tiene en la posición 376 un volumen de van der Waals de 85 a 138 Å3 y una hidrofobia de cadena lateral de 10 a 100 ΔtR.
Los valores para el volumen de van der Waals (Å3) para los aminoácidos se usan en el presente documento como se describen en: http://www.proteinsandproteomics.org/content/free/tables_1/table08.pdf. La bibliografía correspondiente es N. J. Darby, Thomas E. Creighton, Protein Structure (1993) Oxford University Press. Los valores para la hidrofobia de cadena lateral (ΔtR) de aminoácidos se usan en el presente documento como se describen en http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/psc.310010507/pdf. La referencia correspondiente a esto es Monera, O.D. et al, Journal of Peptide Science Vol. 1, 319-329 (1995).
Un polipéptido según la invención que tiene una o más de estas mutaciones tiene un consumo de azúcar y/o producción de productos de fermentación ventajosos. Esto se describirá más abajo en más detalle y se ilustrará por los Ejemplos 1-5 a continuación.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra resultados de cultivos en matraces oscilantes aerobios de mutantes transportadores de hexosa sobre Verduyn-urea + 15 g l-1 de glucosa + 20 g l-1 de xilosa. (A) Mediciones de densidad óptica a 600 nm de longitud de onda, (B) concentraciones de glucosa (g l-1), (C) concentraciones de xilosa durante el periodo de cultivo.
La FIG. 2 muestra resultados de cultivos en matraces oscilantes aerobios de mutantes transportadores de hexosa sobre Verduyn-urea + 20 g l-1 de xilosa. (A) Mediciones de densidad óptica a 600 nm de longitud de onda, (B) concentraciones de xilosa (g l-1).
La FIG. 3 muestra el esquema de construcción de cepas para la cepa YD01227
La FIG. 4 muestra resultados de cultivos en matraces oscilantes aerobios del mutante de hexosa cinasa cuádruple (col 2) y la cepa de referencia RN1014 sobre Verduyn-urea + 100 g l-1 de glucosa + 20 g l-1 de xilosa. A) Mediciones de densidad óptica a 600 nm de longitud de onda, (B) concentraciones de glucosa (g l-1), (C) concentraciones de xilosa durante el periodo de cultivo.
La FIG. 5 muestra resultados de cultivos en placa de microtitulación sobre mezclas de glucosa -xilosa. Características de crecimiento de la cepa de referencia RN1014, y mutantes de hexocinasa cuádruples YD01227 y colonia 2 (Col 2) con igual genotipo sobre Verduyn-urea complementado con mezclas de glucosa y xilosa a las siguientes concentraciones: (A) 60 + 20, (B) 100 + 20, (C) 15 + 5, y (D) 25 g l-1 + 5 g l-1 , respectivamente. Cada 15 minutos, se midió DO600 automáticamente por un aparato Bioscreen C. Los puntos de datos son el promedio de mediciones por triplicado.
La FIG. 6 muestra un mapa del plásmido pRN993.
La FIG. 7 muestra las relaciones entre xilosa residual y concentraciones de glucosa (A), o concentraciones residuales de xilosa y crecimiento (DO600; B) en el cribado de contador de la actividad del transporte de glucosa (cribado de GTAC), véanse los ejemplos. Se representaron concentraciones residuales de xilosa (g l-1)
contra la concentración residual (A) de glucosa (g l-1) y (B) DO600 a 96 horas. (Cuadro B) El análisis de regresión lineal muestra una buena correlación de DO600 y xilosa. Cada punto de datos representa el promedio de las concentraciones de azúcar de 1 a 3 duplicados, o de múltiples mediciones de la cepa de control RN1001 o muestras de medio por parte del cribado.
La FIG. 8 muestra el crecimiento y consumo por xilosa de variantes de mutantes Gal2-N376 en el cribado de GTAC. (A) Mediciones de DO600 en los momentos de tiempo 24, 72 y 96 horas, y (B) concentraciones residuales de xilosa (g l-1) medidas para las variantes de mutantes Gal2-N376, cepa de control RN1001 y muestras vacías (medio YD10-solo) durante el cribado de GTAC. Cada columna representa la DO600 promedio o concentración de xilosa residual de 3 transformantes; las barras de error representan el error estándar de la media. Los asteriscos indican aminoácidos con grandes cadenas laterales hidrófobas con un claro efecto.
La FIG. 9 muestra los perfiles de crecimiento del cribado de la actividad de transporte de xilosa (XTA) de TOP15 (véanse los ejemplos). Valores de DO600 de los tres puntos de muestreo para las cepas/variantes de TOP15 de (A) Parte A y (B) Parte B del cribado de XTA. Cada columna representa la DO600 promedio de 3 transformantes; las barras de error representan el error estándar de la media.
La FIG. 10 muestra un alineamiento de secuencias de proteínas de permeasa.
La FIG. 11 muestra la representación del volumen de van der Waals de aminoácidos (Å3) (eje y) contra la hidrofobia de aminoácidos (ΔtR) (eje x). Los aminoácidos ventajosos (actividad de transporte de glucosa reducida) para la posición correspondiente a 376 en SEQ ID NO: 59 están dentro del área definida por las líneas de rayas cortas y para la posición 339 por las líneas de rayas largas. Los valores para el volumen de van der Waals usados en el presente documento se describen en: http://www.proteinsandproteomics.org/content/free/tables 1/table08.pdf. La bibliografía correspondiente es N. J. Darby, Thomas E. Creighton, Protein Structure (1993) Oxford University Press. Los valores para la hidrofobia (ΔtR) de aminoácidos se usan en el presente documento como se describen en http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/psc.310010507/pdf. La referencia correspondiente a esto es Monera,
O.D. et al, Journal of Peptide Science Vol. 1 319-329 (1995).
La FIG. 12 muestra (A) Curva de crecimiento de la cepa RN1053-X2 desarrollada y la cepa RN1053 no mutada sobre Verduyn-urea-his complementado con 2 % de xilosa. Se expresaron curvas de crecimiento como unidades de densidad óptica (DO) medidas a 600 nm de longitud de onda (DO600) con el tiempo (h) (B) Nivel de expresión de HXT8-HXT17 en la cepa RN1053-X2. Nivel de expresión con respecto a niveles de ACT1 en cada muestra, se expresó como las veces del nivel de expresión normalizado; los niveles de expresión se normalizaron contra los niveles de ARNm de RN1053 del gen HXT específico (nivel de expresión de RN1053 establecido a 1).
La FIG. 13 (A-B) muestra. (A) Nivel de expresión de HXT11 y (B) Crecimiento de cepas inactivadas en HXT11 (KO1 a -6) en comparación con RN1053-X2-vacío (1053-X2) y RN1053-vacío. El crecimiento se expresó como unidades de densidad óptica (DO) medida a 600 nm de longitud de onda (DO600).
La FIG. 13 (C-D) muestra (C) Mapa del plásmido de pRS313-P7T7, (D) Crecimiento de RN1053-X2 transformada con control de vector vacío (1053-X), y de cuatro transformantes después de la introducción de pRS313-P7T7-HXT11inversa (iHXT1 a -4) sobre Verduyn-urea complementado con 2 % de xilosa. El crecimiento se expresó como unidades de densidad óptica (DO) medidas a 600 nm de longitud de onda (DO600)
La FIG. 14 muestra los perfiles de crecimiento de RN1053-HXT11 (Hxt11, diamantes rellenos), RN1053-HXT12 (Hxt12, triángulos blancos), RN1053-control de vector vacío (1053; triángulos), RN1041-control de vector vacío (1041; cuadrados blancos) sobre Verduyn-urea complementado con (A) mezcla de glucosa y xilosa (2 % de cada uno) o (B) 2 % de xilosa. Las curvas de crecimiento se expresaron como unidades de densidad óptica (DO) medidas a 600 nm de longitud de onda (DO600) con el tiempo (h).
La FIG. 15 muestra los estudios de captación de xilosa en RN1053-HXT11 (HXT11), RN1053-HXT2 (Hxt2), RN1053-vacío (vacío) con o sin concentraciones crecientes de glucosa de competición (0-500 mM).
La FIG. 16 muestra (A) Crecimiento de RN1053 que expresa proteína Hxt11p-GFP quimérica sobre 2 % de xilosa a 16 h (la densidad celular inicial fue DO 0,5). (B) Microscopía de fluorescencia de RN1053-HXT11 y RN1041-HXT11 cultivadas sobre Verduyn-urea complementado con glucosa o xilosa.
La FIG. 17 muestra los perfiles de fermentación del consumo de azúcar y la producción de etanol de (A) plásmido RN1041-vacío y (B) RN1053-HXT11 sobre Verduyn-urea complementado con 80 g l-1 de glucosa y 40 g l-1 de xilosa.
La FIG. 18 muestra los perfiles de crecimiento (DO600) (A), xilosa residual (B) y glucosa (C) concentraciones (g l-1) después de 96 horas del cribado de GTAC con los transformantes YD01227-GAL2 (n=3), YD01227-HXT2 (n=3), YD01227-HXT11 (n=3). Se añadieron medio y muestras de RN1001 como controles.
La FIG. 19 (A-B) muestra los perfiles de crecimiento de cultivos en matraces oscilantes de (A) transformantes YD01227-vacío, YD01227-HXT11 y YD01227-mHXT11(N366D) (n=2) sobre Verduyn-urea complementado con 15 % de glucosa y 1 % de xilosa y, (B) de RN1053-transformantes sobre Verduyn-urea con 2 % de xilosa (n=3).
La FIG. 19 (C-E) muestra los perfiles de captación de azúcar radiomarcados con 14C por RN1053-HXT11 y RN1053-mHXT11(N366D). (A) Captación de 14C-glucosa y captación de 14C-xilosa en ausencia (D) y presencia
(E) de concentraciones de glucosa no marcada creciente (0-500 mM). La captación de azúcar se expresó como nmol mg de peso seco (DW) de levadura por minuto (min).
La FIG. 19 (C-F) muestra los perfiles de fermentación de RN1041-vacío (diamantes rellenos; 1041+vacío), RN1053-HXT11 (triángulos rellenos; 1053+HXT11), RN1053-mHXT11 (N366D) (cuadrados rellenos; 1053+epHXT11) sobre Verduyn-urea + 100 g l-1 de glucosa y 60 g l-1 de xilosa. (C) Curvas de crecimiento (expresadas por mediciones de DO600) con el tiempo (h). Los constituyentes se midieron en el caldo de fermentación con el tiempo (h) tal como (D) glucosa, (E) xilosa y (F) etanol.
La FIG. 19 (J-L) muestra los perfiles de fermentación sobre Verduyn-urea complementado con 80 g l-1 de glucosa y 40 g l-1 de xilosa de la cepa RN1053-HXT11 (J y L-línea discontinua gris) y RN1053-mHXT11(N366D) (K y L-línea negra). (L) Figura combinada de ambos perfiles de fermentación ilustrados en (J) y (K).
La FIG. 20 muestra el esquema para la relación glucosa/xilosa en el medio Verduyn-urea-his durante el cultivo en quimiostato (días) de YD01227;
La FIG. 21 muestra los perfiles de crecimiento de cultivos en matraces oscilantes sobre Verduyn-urea-his complementado con 1 % de xilosa sin (triángulos rellenos; 1+0) o con (3 % de glucosa, raya, 1+3; 6 % de glucosa, círculos rellenos, 1+6; 10 % de glucosa, diamantes rellenos, 1+10) concentraciones crecientes de glucosa con YD01227-evo (A) y YD01227-ori (B). (C) Estudio de captación de 14C-xilosa de YD01227-ori (1227ori, cuadrados rellenos) o YD01227-evo (1227-evo, diamantes rellenos) con o sin concentraciones crecientes de glucosa (0-500 mM).
La FIG. 22 muestra (A) perfil de expresión de ARNm de YD01227-ori (barras blancas), YD01227-evoB sobre Verduyn-urea-his complementado con una mezcla de azúcar en una relación xilosa:glucosa 1:3 (barras grises) y 1:10 (barras negras). Los datos se expresaron como expresión normalizada (con respecto a ACT1 y con respecto a YD01227-ori, que se estableció a 1).
La FIG. 22 (B-D) Experimentos de captación con xilosa (B) y glucosa (C). La captación se midió en nmol/mg.DW.min en RN1053-Hxt3-6 (diamantes), RN1053-N367I (triángulos) y 1053-emp (cuadrados). (D) Captación de 14C-xilosa 50 mM en presencia de glucosa 0, 50, 100, 200 y 500 mM en la cepa RN1053-Hxt3-6 (diamantes) y RN1053-N367I (cuadrados).
FIG. 23 Imágenes de fluorescencia de la cepa RN1053 que expresa proteínas de fusión de GFP de Hxt36 (A) y Hxt36-N367I (B). Las imágenes se analizaron en un microscopio Nikon Eclipse-Ti. (C) Cantidad total de fluorescencia de GFP (en UA/DO600) en ambas cepas.
FIG. 24 Crecimiento de los vectores que contienen la cepa YD01227 que expresan transportadores de HXT36 con todas las posibles sustituciones de aminoácidos en la posición 367. Las células se cultivaron sobre 1 % de xilosa y 10 % de xilosa, y se usó YD01227 transformado con el vector vacío pRS313-P7T7 como control.
FIG. 25 Experimentos de captación para determinar Km y Vmáx para glucosa (panel A) y xilosa (panel B). La captación se midió en nmol/mgDW.min en la cepa RN1053-HXT36 (diamantes), la cepa RN1053-HXT36-N367I (cuadrados) y en la cepa RN1053-HXT36-N367A (triángulos). Los niveles de captación de la cepa RN1053vacío fueron, para ambos azúcares, restados de las cepas RN1053-HXT36, RN1053-HXT36-N367I y RN1053-HXT36-N367A.
FIG. 26 Crecimiento de la cepa RN1053 que expresa HXT36 (A), HXT36-N367I (B) y HXT36-N367A (C) sobre 5 g l-1 de D-glucosa y 5 g l-1 de D-xilosa. Se midieron D-glucosa residual (diamantes), D-xilosa (cuadrados) y etanol (círculos) en g/l.
FIG. 27 Caracterización de la especificidad por xilosa de mutantes HXT11-N366X. (A) Tasa de crecimiento exponencial máxima (1/h) de mutantes HXT11-N366X en la cepa YD01227. Tasa de crecimiento exponencial máxima (1/h) para mutantes N366X expresados en RN1053 sobre glucosa (B) o xilosa (C).
FIG. 28 Imágenes de fluorescencia de la cepa RN1053 que expresa proteínas de fusión de GFP de mutantes HXT11-N366X cultivados sobre 2 % de maltosa. Las letras arriba a mano izquierda de la imagen representan el aminoácido en la posición 366 de la variante de Hxt11 respectiva.
FIG. 29 Fermentaciones sobre Verduyn-urea complementado con xilosa (40 g l-1) y glucosa (71,8 g l-1) de (A) RN1053 HXT11-N366M, (B) RN1053 HXT11-N366T, (C) RN1001 y (D) RN1053 HXT11-N366N. Símbolos: glucosa (◆), xilosa (■), etanol (▲), densidad celular (●). (A), (B), (C) y (D) son los paneles de la FIG. 29.
Breve descripción del listado de secuencias
SEQ ID NO: 1: cebador 5034-kanf SEQ ID NO: 2: cebador 5035-kanr SEQ ID NO: 3: cebador 5116-lf2 SEQ ID NO: 4: cebador 5118-lr2 SEQ ID NO: 5: cebador 5115-lf1 SEQ ID NO: 6: cebador 5117-lr1 SEQ ID NO: 7: pRN201; TOPO-BLUNT-loxP-kanMX-loxP SEQ ID NO: 8: pRN251; TOPO-BLUNT-loxP-hphMX-loxP SEQ ID NO: 9. pRN365; TOPO-BLUNT-loxP-natMX-loxP SEO ID NO: 10: cebador 115-natf SEO ID NO: 11: cebador 116-natr SEQ ID NO: 12: pRN447; TOPO-BLUNT-loxP-zeoMX-loxP SEQ ID NO: 13: cebador 28-H3f SEQ ID NO: 14: cebador 29-H3r SEQ ID NO: 15: pRN247 (TOPO-BLUNT-HIS3:loxPkanMXloxP) SEQ ID NO: 16: cebador 201-Hx2uf SEQ ID NO: 17: cebador 202-Hx2ur SEQ ID NO: 18: cebador 203-Hx2df SEQ ID NO: 19: cebador 204-Hx2dr SEQ ID NO: 20: cebador 205-Hx3uf SEQ ID NO: 21: cebador 206-Hx3ur SEQ ID NO: 22: cebador 210-Hx4df SEQ ID NO: 23: cebador 211-Hx4dr SEQ ID NO: 24: cebador 212-Hx5uf SEQ ID NO: 25: cebador 213-Hx5ur SEQ ID NO: 26: cebador 229-Hx7df SEQ ID NO: 27: cebador 230-Hx7dr SEQ ID NO: 28: cebador 243-Gal2ufn SEQ ID NO: 29: cebador 244-Gal2urn SEQ ID NO: 30: cebador 233-Ga2df SEQ ID NO: 31: cebador 234-Ga2dr SEQ ID NO: 32: pRN485; TOPO-BLUNT-GAL2:loxPzeoMXloxP SEQ ID NO: 33: pRN566; TOPO-BLUNT-HXT367:loxP-hphMX-loxP
SEQ ID NO: 34: pRN569: TOPO-BLUNT-HXT514:loxP-natMX-loxP SEQ ID NO: 35: pRN635; TOPO-BLUNT-HXT2:loxP-kanMX-loxP SEQ ID NO: 36: cebador 281-Hx3inr2 SEQ ID NO: 37: cebador 323-Hx7inr1 SEQ ID NO: 38: cebador Hx4inr2 SEQ ID NO: 39: cebador Hx5inf SEQ ID NO: 40: cebador 324-Ga2inf1 SEQ ID NO: 41: cebador 325-Ga2inr1 SEQ ID NO 42: cebador 289-Hx2inf SEQ ID NO: 43: cebador 290-Hx2inr SEQ ID NO: 44: cebador 838-Glk1-psuc227f SEQ ID NO: 45: cebador 834-Hxk2-psuc227f SEQ ID NO: 46: cebador 645-pSUC227r SEQ ID NO: 47: cebador 839-Glk1-psuc225r SEQ ID NO: 48: cebador 835-Hxk2-psuc225r SEQ ID NO: 49: cebador 646-pSUC225f SEQ ID NO: 50: cebador 846-Hxk1_loxP_f SEQ ID NO: 51: cebador 847-Hxk1_loxP_r SEQ ID NO: 52: cebador 848-Gal1_loxP_f SEQ ID NO: 53: cebador 849-Gal1_loxP_r SEQ ID NO: 54: pRN774; TOPO-BLUNT-loxP-hphMX-loxP (sitios loxP en orientación opuesta) SEQ ID NO: 55: pRN775; TOPO-BLUNT-loxP-natMX-loxP (sitios loxP en orientación opuesta) SEQ ID NO: 56: secuencia de ADN de WT-GAL2 SEQ ID NO: 57 pRN993; sitio Xbal (TCTAGA) y sitio BssHII (GCGCGC). SEQ ID NO: 58: pDB1250; vector de expresión WT-GAL2 para el cribado; sitio Xbal (TCTAGA) y sitio BssHII
(GCGCGC). SEQ ID NO: 59: secuencia de aminoácidos de WT Gal2p SEQ ID NO: 60: pRN187 (vector de expresión de CRE recombinasa derivado de pSH65) SEQ ID NO: 61: pRN486 (TOPO-BLUNT-his3::loxP-natMX-loxP) SEQ ID NO: 62: Cebador ActinF (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 63: Cebador ActinR (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 64: Cebador HXT1 F (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 65: Cebador HXT1 R (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 66: Cebador HXT2F (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 67: Cebador HXT2R (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 68: Cebador HXT3F (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 69: Cebador HXT3R (PCR en tiempo real)
SEQ ID NO: 70: Cebador HXT4F (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 71: Cebador HXT4R (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 72: Cebador HXT5F (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 73: Cebador HXT5R (PCR en tiempo real) 5 SEQ ID NO: 74: Cebador HXT7F (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 75: Cebador HXT7R (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 76: Cebador HXT8F ((PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 77: Cebador HXT8R (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 78: Cebador HXT9F (PCR en tiempo real)
10 SEQ ID NO: 79: Cebador HXT9R (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 80: Cebador HXT10F (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 81: Cebador HXT10R (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 82: Cebador HXT11F (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 83: Cebador HXT11R (PCR en tiempo real)
15 SEQ ID NO: 84: Cebador HXT12F (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 85: Cebador HXT12R (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 86: Cebador HXT13F (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 87: Cebador HXT13R (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 88: Cebador HXT14F (PCR en tiempo real)
20 SEQ ID NO: 89: Cebador HXT14R (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 90: Cebador HXT15F (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 91: Cebador HXT15R (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 92: Cebador HXT16F (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 93: Cebador HXT16R (PCR en tiempo real)
25 SEQ ID NO: 94: Cebador HXT17F (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 95: Cebador HXT17R (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 96: Cebador GAL2F (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 97: Cebador GAL2R (PCR en tiempo real) SEQ ID NO: 98: Cebador KOP11* para KO HXT11
30 SEQ ID NO: 99: Cebador KOT11* para KO HXT11 SEO ID NO: 100: Cebador iHXT11F (HXT11 inversa) SEO ID NO: 101: Cebador iHXT11R (HXT11 inversa) SEO ID NO: 102: Cebador HXT11F (clonación) SEQ ID NO: 103: Cebador HXT12F (clonación)
35 SEQ ID NO: 104: Cebador HXT11/12R (clonación) SEQ ID NO: 105: Cebador HXT1 Xbal (clonación) SEQ ID NO: 106: Cebador R HXT1 Cfr9i (clonación)
SEQ ID NO: 107: Cebador F HXT2 Xbai (clonación) SEQ ID NO: 108: Cebador R HXT2 Cfr9i (clonación) SEQ ID NO: 109: Cebador F HXT3 Xbal (clonación) SEQ ID NO: 110: Cebador R HXT6 Cfr9i (clonación)
5 SEQ ID NO: 111: Cebador F HXT4 Xbal (clonación) SEQ ID NO: 112: Cebador R HXT4RN Cfr9l (clonación) SEQ ID NO: 113: Cebador F HXT5 Xbal (clonación) SEQ ID NO: 114: Cebador R HXT5 Cfr9i (clonación) SEQ ID NO: 115: Cebador F HXT7 Xbal (clonación)
10 SEQ ID NO: 116: Cebador R HXT7 Cfr9l (clonación) SEQ ID NO: 117: Plásmido pRS313-P7T7 SEQ ID NO: 118: Plásmido pRS313-P7t7-HXT11+GFP SEQ ID NO: 119: Secuencia de ADN de ORF de HXT11 de Saccharomyces cerevisiae SEQ ID NO: 120: Secuencia de ADN de ORF de HXT2 de Saccharomyces cerevisiae
15 SEQ ID NO: 121: Secuencia de ADN de ORF de GAL2 de Saccharomyces cerevisiae SEQ ID NO: 122: Secuencia de ADN de ORF de HXT3-6 de Saccharomyces cerevisiae SEQ ID NO: 123: Secuencia de aminoácidos de Hxt11p de Saccharomyces cerevisiae SEQ ID NO: 124: Secuencia de aminoácidos de Hxt2p de Saccharomyces cerevisiae SEQ ID NO: 125: Secuencia de aminoácidos de Gal2p de Saccharomyces cerevisiae
20 SEQ ID NO: 126: Secuencia de aminoácidos de Hxt3-6 de Saccharomyces cerevisiae SEQ ID NO: 127: F HXT36 Bcui SEQ ID NO: 128: R HXT36 367NNN SEQ ID NO: 129: F HXT36 367NNN SEQ ID NO: 130: R HXT36 BamHi
25 SEQ ID NO: 131: R HXT36 BamHI-stop SEQ ID NO: 132: F GFP BamHI SEO ID NO: 133: R GFP Clal SEQ ID NO: 134: F HXT11 XbaI SEQ ID NO: 135: R HXT11 BamHI
30 SEQ ID NO: 136: F HXT11 366NNN SEO ID NO: 137: R HXT11 366NNN SEQ ID NO: 138: F HXT11 N366F SEO ID NO: 139: R HXT11 N366F SEQ ID NO: 140: F HXT11 N366E
35 SEQ ID NO: 141: R HXT11 N366E SEQ ID NO: 142: F HXT11 N366K SEQ ID NO: 143: R HXT11 N366K
SEQ ID NO: 144: F HXT11 N366M
SEQ ID NO: 145: R HXT11 N366M
SEQ ID NO: 146: F HXT11 N366W
SEQ ID NO: 147: R HXT11 N366W
SEQ ID NO: 148: F HXT11 N366Y
SEQ ID NO: 149: R HXT11 N366Y
Descripción detallada de la invención
En toda la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprender" e "incluir", y variaciones tales como "comprende", "que comprende", "incluye" y "que incluye", deben interpretarse de forma incluyente. Es decir, estas palabras pretenden expresar la posible inclusión de otros elementos o números enteros no específicamente citados, donde lo permita el contexto. Los artículos "un" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a uno o al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.
La invención se refiere a un método de identificación de posiciones de aminoácidos de polipéptidos de hexosa permeasa, más preferentemente polipéptidos de hexosa permeasa de levadura y hongos, incluso más preferentemente en polipéptidos de permeasa Hxt o Gal2 de Saccharomyces cerevisiae, que pueden mutarse para alterar la especificidad por azúcares de la permeasa.
La invención se refiere a un polipéptido que tiene una o más sustituciones en una posición correspondiente a la posición 339 o 376 de SEQ ID NO: 59, en el que el polipéptido es un miembro de la superfamilia de facilitadores principales (MFS), polipéptido que es polipéptido de hexosa permeasa, en el que, cuando la sustitución es en la posición correspondiente a 376, el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene un volumen de van der Waals de 80 a 138 Å3 y una hidrofobia de cadena lateral de 10 a 100 ΔtR, y cuando la sustitución es en la posición correspondiente a 339, el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene una hidrofobia de cadena lateral de -30 a 10 ΔtR y un volumen de van der Waals de 80 a 160 A3.
Cuando la sustitución es en la posición correspondiente a 376, el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene un volumen de van der Waals de 80 a 138 Å3 y una hidrofobia de cadena lateral de 10 a 100 ΔtR(T, C, V, M, L, I, F).
En una realización, la sustitución es en la posición correspondiente a 376 y en la que el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene un volumen de van der Waals de 80 a 138 Å3 y una hidrofobia de cadena lateral de 40 a 100 ΔtR (C, V, M, L, I, F).
En una realización, la sustitución es en la posición correspondiente a 376 y en la que el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene un volumen de van der Waals de 90 a 138 Å3 y una hidrofobia de cadena lateral de 10 a 100 ΔtR (T, V, M, L, I, F)
En una realización, la sustitución es en la posición correspondiente a 376 y en la que el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene un volumen de van der Waals de 100 a 138 Å3 y una hidrofobia de cadena lateral de 60 a 100 ΔtR (V, M, L, I, F).
En una realización, la sustitución es en la posición correspondiente a 376 y en la que el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene un volumen de van der Waals de 100 a 130 Å3 y una hidrofobia de cadena lateral de 60 a 100 ΔtR (V, M, L, I).
En una realización, la sustitución es en la posición correspondiente a 376 y en la que el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene un volumen de van der Waals de 120 a 130 Å3 y una hidrofobia de cadena lateral de 60 a 100 ΔtR (M, L, I).
En una realización, la sustitución es en la posición correspondiente a 376 y en la que el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene un volumen de van der Waals de 120 a 130 Å3 y una hidrofobia de cadena lateral de 80 a 100 ΔtR (L, I).
En una realización, la sustitución es en la posición correspondiente a 376 y en la que el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene un volumen de van der Waals de 100 a 130 Å3 y una hidrofobia de cadena lateral de 60 a 80 ΔtR (V, M).
En una realización, la sustitución es en la posición correspondiente a 376 y en la que el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene un volumen de van der Waals de 100 a 130 Å3 y una hidrofobia de cadena lateral de 60 a 98 ΔtR (V, M, L).
En una realización, la sustitución es N376T, N376C, N376V, N376M, N376L, N376I o N376F.
Cuando la sustitución es en la posición correspondiente a 339, el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene una hidrofobia de cadena lateral de -30 a 10 ΔtR y un volumen de van der Waals de 80 a 160 Å3 (N, Q, H, K, R).
En una realización, el polipéptido tiene una sustitución en la posición correspondiente a 339 y en la que el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene una hidrofobia de cadena lateral de -30 a 10 ΔtR y un volumen de van der Waals de 100 a 160 Å3 (Q, H, K, R).
En una realización, el polipéptido tiene una sustitución en la posición correspondiente a 339 y en la que el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene una hidrofobia de cadena lateral de -30 a 0 ΔtR y un volumen de van der Waals de 100 a 160 Å3 (Q, K, R).
En una realización polipéptido tiene una sustitución en la posición correspondiente a 339 y en la que el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene una hidrofobia de cadena lateral de -30 a 0 ΔtR y un volumen de van der Waals de 120 a 160 Å3 (K, R).
En una realización, el polipéptido tiene una sustitución en la posición correspondiente a 339 y en la que el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene una hidrofobia de cadena lateral de -30 a 10 ΔtR y un volumen de van der Waals de 80 a 120 Å3 (N, Q, H).
En una realización, el polipéptido tiene una sustitución en la posición correspondiente a 339 y en la que el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene una hidrofobia de cadena lateral de -30 a 10 ΔtR y un volumen de van der Waals de 80 a 120 Å3 (N, Q).
En una realización, la sustitución es M339G, M339S, M339N, M339Q, M339H, M339K, M339R o M339V.
En una realización, el polipéptido tiene uno o más aminoácidos correspondientes a 339N/V y/o 376I/M/V.
Las permeasas pertenecen a la superfamilia de facilitadores principales (MFS). Esto se define en el presente documento más adelante. Los sistemas de transporte celular permiten la captación de nutrientes esenciales e iones, y la eliminación de productos de metabolismo y sustancias perjudiciales. Además, los sistemas de transporte desempeñan una función en la comunicación entre células y el entorno. Por tanto, son una parte esencial del sistema celular para dar o consumir moléculas que suministran energía, tales como ATP.
El transporte de solutos por transportadores activos primarios es conducido por energía en primer lugar, tal como por energía suministrada de la hidrólisis de ATP, absorción de fotones, flujo de electrones, descarboxilación de sustratos, o transferencia de metilo. Si moléculas cargadas son bombeadas en una dirección como consecuencia del consumo de una fuente de energía celular primaria, un potencial electroquímico es el resultado. Puede entonces usarse el gradiente quimiosmótico resultante para conducir el transporte de moléculas adicionales mediante estructuras de vehículo secundarias que precisamente facilitan el transporte de una o más moléculas a través de la membrana.
Las dos últimas décadas se ha aclarado la existencia de una multitud de familias de proteínas previamente desconocidas de transportadores primarios y secundarios por la emergencia de estrategias de genómica y haciendo uso de los muchos estudios bioquímicos y de genética molecular realizados. Las dos principales familias de transportadores de las que se encontraron proteínas en todos los organismos vivos son de la superficie de los casetes de unión a ATP (ABC) y la superfamilia de facilitadores principales (MFS), también conocida como la familia de uniportadores-simportadores-antiportadores. Mientras que las permeasas de la familia ABC consisten en múltiples componentes y son transportadores activos primarios, capaces de transportar tanto moléculas pequeñas como macromoléculas solo después de generar energía mediante la hidrólisis de ATP, los transportadores de MFS consisten en un único polipéptido de un vehículo secundario que facilita el transporte de pequeños solutos en respuesta a un gradiente de iones quimiosmótico. La superfamilia de ABC y las proteínas MFS explican casi la mitad de los transportadores de soluto codificados dentro de los genomas de microbio (revisado por Pao et al, 1998, Microbiol Mol Biol Rev.; 62 pp,1-34, y Saier et al, 1999, J Mol Microbiol Biotechnol, 1 pp,257-279).
Secuencias de polipéptidos de permeasa adecuadas pueden contener uno o más de los siguientes motivos:
a) G-R-x(3)-G-x(3)-G-x(11)-E-x(5)-[LIVM]-R-G-x(12)-[GA] ;
b) R-x(14)-G-x(2)-Y-x(2)-[YF]-[YF]-[GSAL];
c) V-x(15)-[GNR]-[RH]-R-x(2)-[LM]-x(2)-[GA]
El motivo (a) se corresponde con los restos 179-221 en el motivo Gal2; (b) se corresponde con los restos 330-353 en el motivo Gal2; (c) se corresponde con los restos 375-399 en Gal2.
En una realización, el polipéptido comprende un motivo G-R-x(3)-G-x(3)-G-x(11)-Ex(5)-[LIVM]-R-G-x(12)-[GA].
El método reivindicado comprende modelar una secuencia de polipéptidos de permeasa en la estructura cristalina publicada de la xilosa permeasa XylE de Escherichia coli unida a xilosa o glucosa (respectivamente, PDB código 4GBY y 4GBZ en la base de datos PDB, http://www.pdb.org) para identificar las posiciones de aminoácidos en el canal de la permeasa que interaccionan directamente con el azúcar unido (llamado los restos de la primera envuelta en la materia), y los restos que interaccionan con los restos de la primera envuelta (llamados los restos de la segunda envuelta en la materia). Software de modelado adecuado para construir tales modelos son YASARA, Prime (Schrodinger Inc.) o MODELLER usando los parámetros por defecto. Alternativamente, las posiciones de primera y segunda envuelta que alteran la especificidad por azúcares de los aminoácidos en una secuencia de polipéptidos de permeasa pueden identificarse por un alineamiento por pares global de la secuencia de permeasa con la secuencia de Gal2 SEQ ID NO: 59 usando el protocolo de NEEDLE descrito más adelante. Un alineamiento de ejemplo para Gal2 y Hxt de Saccharomyces cerevisiae se da en la Figura 10, que muestra cómo puede usarse el alineamiento para identificar las posiciones de aminoácidos correspondientes en los diferentes Hxt de levadura. Así, las posiciones de aminoácidos en el presente documento se refieren a SEQ ID NO: 59 que describe Gal2 o a posiciones de aminoácidos correspondientes en otros polipéptidos, en particular otros polipéptidos de permeasa. Por ejemplo, la posición correspondiente de la posición N376 en Gal2 (SEQ ID NO: 59) en Hxt1 es N370, en Hxt2 N361, en Hxt3 N367, en Hxt4SC N376, en Hxt4RN N376, en Hxt5 N391, en Hxt6/7 N370, en Hxt8 N372, en Hxt9 N366, en Hxt10 N354, en Hxt11 N366, en Hxt12 N256, en Hxt13 N363, en Hxt14 N387, en Hxt15 N366, en Hxt16 N366 y en Hxt17 N363. Similarmente, la posición correspondiente de N346 en Gal2 (SEQ ID NO: 9) en Hxt1 es D340, en Hxt2 N331, en Hxt3 D337, en Hxt4SC D346, en Hxt4RN D346, en Hxt5 D361, en Hxt6/7 D340, en Hxt8 D342, en Hxt9 D336, en Hxt10 C324, en Hxt11 D336, en Hxt12 D226, en Hxt13 E333, en Hxt14 I357, en Hxt15 E336, en Hxt16 E336 y en Hxt17 E333. Esto puede hacerse similarmente para otros transportadores de la superfamilia MFS, de manera que puedan obtenerse posiciones correspondientes en estos polipéptidos correspondientes a las posiciones en SEQ ID NO: 59. Esto está respaldado por los datos de los Ejemplos 6-20,
Un experto en la materia puede mutar posteriormente las posiciones de aminoácidos identificadas en el polipéptido de permeasa a los otros 19 aminoácidos, y cribar para la captación mejorada de azúcar C5 y/o captación reducida de azúcar C6 de la permeasa mutante, como se describe en el Ejemplo 4 y 5.
Por ejemplo, para un polipéptido que tiene una mutación en una posición correspondiente a una o más posiciones correspondientes a N376 de SEQ ID NO: 59, las mutaciones en las posiciones correspondientes a N376 pueden ser una sustitución con C, P, G, A, V, L, I, M, F, W, Y, H, S, T, N, Q, D, E, K, R o una deleción. X puede ser cualquier aminoácido, X(2) significa dos X.
En el presente documento, Gal2 es un transportador de la difusión facilitado requerido para tanto los procesos de transporte de galactosa dependientes de galactocinasa de alta afinidad como independientes de galactocinasa de baja afinidad. Pertenece a la superfamilia de facilitadores importantes, familia de transportadores de azúcar (TC 2.A.1.1). "Polipéptido de permeasa" también se designa en el presente documento como "polipéptido permeasa" o "polipéptido". "Polinucleótido de polipéptido de permeasa" es en el presente documento un polinucleótido que codifica el polipéptido de permeasa.
En una realización de la invención, el polipéptido de permeasa tiene al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 59.
En el presente documento, las mutaciones se indican por aminoácidos de una letra y las posiciones de estos aminoácidos. Por ejemplo, A6 en el presente documento indica un aminoácido (código de una letra) en una cierta posición en SEQ ID NO: 59, aquí A (Alanina) en la posición 6 de la proteína. A6 (L/N/Q/G/V/I/Y/S/E/K) indica en el presente documento la mutación de aminoácido en una cierta posición, aquí A (Alanina) en la posición 6 de la proteína se intercambia por cualquiera de L (Leucina), N (Asparagina), Q (Glutamina), G (Glicina), V (Valina), I (Isoleucina), Y (Tirosina), S (Serina), E (Ácido glutámico) o K (Lisina).
En una realización, el polipéptido tiene actividad de transporte de xilosa.
En una realización, el polipéptido tiene afinidad reducida por la glucosa en comparación con el polipéptido de SEQ ID NO: 59.
El polipéptido de permeasa de la invención puede tener una o más actividades alternativas y/o adicionales distintas de la actividad de permeasa de azúcar.
Como se explica anteriormente, un polipéptido de permeasa de la invención normalmente tendrá actividad de permeasa de azúcar. Sin embargo, un polipéptido de permeasa de la invención puede tener una o más de las actividades explicadas anteriormente, además de o alternativa a esa actividad.
Secuencia de polinucleótidos
Con el polipéptido de permeasa y su secuencia de aminoácidos como se desvela en el presente documento, el experto puede determinar polinucleótidos adecuados que codifican el polipéptido de permeasa.
En una realización el polinucleótido es un polinucleótido de variante que tiene al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 56, y codifica el polipéptido como se describe en las reivindicaciones 1 a 11.
La invención, por tanto, proporciona secuencias de polinucleótidos que comprenden el gen que codifica el polipéptido de permeasa, además de su secuencia codificante.
Los polinucleótidos de la invención pueden aislarse o sintetizarse. Los polipéptidos de permeasa y polinucleótidos de polipéptidos de permeasa en el presente documento pueden ser polipéptidos sintéticos, respectivamente polinucleótidos. Los polinucleótidos sintéticos pueden optimizarse en el uso de codones, preferentemente según los métodos descritos en los documentos WO2006/077258 y/o PCT/EP2007/055943 que tratan la optimización del par de codones.
El término se refiere a una molécula de polinucleótido, que es una molécula de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN), ya sea monocatenaria o bicatenaria. Un polinucleótido puede o bien estar presente en forma aislada, o estar comprendido en moléculas de ácido nucleico recombinantes o vectores, o estar comprendido en una célula hospedadora.
La palabra "polipéptido" se usa en el presente documento para cadenas que contienen más de siete restos de aminoácidos. Todas las fórmulas o secuencias de oligopéptidos y polipéptidos en el presente documento se escriben de izquierda a derecha y en la dirección de extremo amino a extremo carboxi. El código de una letra de aminoácidos usado en el presente documento es comúnmente conocido en la técnica.
Por polipéptido "aislado" o proteína está previsto un polipéptido o proteína sacado de su entorno nativo. Por ejemplo, polipéptidos recombinantemente producidos y proteínas expresadas en células hospedadoras se consideran aislados con el fin de la invención ya que son polipéptidos nativos o recombinantes que han sido sustancialmente purificados por cualquier técnica adecuada tal como, por ejemplo, el método de purificación de una sola etapa desvelado en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).
Los polinucleótidos de la presente invención, tales como un polinucleótido que codifica el polipéptido de permeasa, pueden aislarse o sintetizarse usando técnicas de biología molecular estándar y la información de secuencia proporcionada en el presente documento.
El polinucleótido que codifica el polipéptido de permeasa de la invención puede amplificarse usando ADNc, ARNm o, alternativamente, ADN genómico, como molde y cebadores de oligonucleótidos apropiados según técnicas de amplificación por PCR estándar. El ácido nucleico así amplificado puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de secuencias de ADN.
Transformación
Los polinucleótidos según la invención pueden expresarse en un hospedador adecuado. Así, la invención se refiere a una célula hospedadora transformada. En una realización, la célula hospedadora puede transformarse con una construcción de ácidos nucleicos que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido según la invención definido antes. Por tanto, pueden usarse técnicas de transformación estándar.
En una realización, la célula hospedadora transformada comprende un nucleótido heterólogo que codifica un polipéptido según la reivindicación 1 o codifica un polipéptido que tiene la sustitución F85Q/V, T89V, V187A/F, I218S, T219A, Q341S/A, N346V, T380A, F444L/V, T448A, T449F, T451G o W455M de secuencia ID NO: 59, y en una realización del mismo la célula hospedadora es Saccharomyces cerevisiae.
En una realización, el hospedador transformado se transforma con un polinucleótido que codifica un polipéptido que es un mutante de un polipéptido que es nativo en la célula hospedadora no transformada.
En una realización, el polipéptido que es nativo en la célula hospedadora no transformada es un miembro de los transportadores de la superfamilia de facilitadores principales (MFS) y un polipéptido transportador de hexosa.
En una realización, el polipéptido que es nativo en la célula hospedadora no transformada es un polipéptido transportador elegido de la lista que consiste en Gal2, Hxt1, Hxt2, Hxt3, Hxt4, Hxt5, Hxt6, Hxt7, Hxt8, Hxt9, Hxt10, Hxt11, Hxt12, Hxt13, Hxt14, Hxt15, Hxt16 y Hxt17.
En una realización, el polipéptido de la invención no tiene el resto de aminoácido X (X puede ser cualquier aminoácido) en una posición A dada (A puede ser cualquier posición específica en el polipéptido en SEQ ID NO: 59,
donde X es una mutación en SEQ ID NO: 59, cuando X es nativo en la posición correspondiente a A en un segundo polipéptido de la familia de MFS.
En una realización, el polipéptido no tiene el resto de aminoácido S, que se corresponde con M339S en SEQ ID NO: 59, en la posición correspondiente en HXT1 (es decir, no 333S en HXT1), en HXT2 (es decir, no 324S en HXT2), en HXT3 (es decir, no 330S en HXT3), en HXT4 (es decir, no 339S en HXT4), en HXT5 (es decir, no 354S en HXT5), en HXT6 o en HXT7 (es decir, no 333S en HXT6 o HXT7), en HXT8 (es decir, no 335S en HXT8), en HXT9 (es decir, no 329S en HXT9), en HXT10 (es decir, no 317S en HXT10) o en HXT11 (es decir, no 329S en HXT11).
En una realización, el polipéptido es un HXT3-6 mutante y tiene una o más sustituciones en HXT3-6. En una realización del mismo, el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N367A/C/D/F/G/I/L/M/S/T/V de SEQ ID NO: 126. En una realización, el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N367A/I de SEQ ID NO: 126. En una realización, el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N367A de SEQ ID NO: 126.
En una realización, el polipéptido es un HXT11 mutante y tiene una o más sustituciones en HXT11. En una realización del mismo, el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N366A/C/D/F/G/I/L/M/S/T/V de SEQ ID NO: 123. En una realización, el polipéptido es un HXT11 mutante. En una realización el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N366/F/I/L/M/T/V de SEQ ID NO: 123. En una realización, el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N366D/M/T de SEQ ID NO: 123. En una realización, el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N366M/T de SEQ ID NO: 123. En una realización, el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N366M/T o N366T de SEQ ID NO: 123.
El término se refiere a una molécula de polinucleótido, que es una molécula de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN), ya sea monocatenaria o bicatenaria. Un polinucleótido puede o bien estar presente en forma aislada, o estar comprendido en moléculas de ácido nucleico recombinantes o vectores, o estar comprendido en una célula hospedadora.
La palabra "polipéptido" se usa en el presente documento para cadenas que contienen más de siete restos de aminoácidos. Todas las fórmulas o secuencias de oligopéptidos y polipéptidos en el presente documento se escriben de izquierda a derecha y en la dirección de extremo amino a extremo carboxi. El código de una letra de aminoácidos usado en el presente documento es comúnmente conocido en la técnica.
Por polipéptido "aislado" o proteína está previsto un polipéptido o proteína sacado de su entorno nativo. Por ejemplo, polipéptidos recombinantemente producidos y proteínas expresadas en células hospedadoras se consideran aislados con el fin de la invención ya que son polipéptidos nativos o recombinantes que han sido sustancialmente purificados por cualquier técnica adecuada tal como, por ejemplo, el método de purificación de una sola etapa desvelado en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).
Los polinucleótidos de la presente invención, tales como un polinucleótido que codifica el polipéptido de permeasa, pueden aislarse o sintetizarse usando técnicas de biología molecular estándar y la información de secuencia proporcionada en el presente documento.
El polinucleótido que codifica el polipéptido de permeasa de la invención puede amplificarse usando ADNc, ARNm o, alternativamente, ADN genómico, como molde y cebadores de oligonucleótidos apropiados según técnicas de amplificación por PCR estándar. El ácido nucleico así amplificado puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de secuencias de ADN.
Transformación
Los polinucleótidos según la invención pueden expresarse en un hospedador adecuado. Así, la invención se refiere a una célula hospedadora transformada. En una realización, la célula hospedadora puede transformarse con una construcción de ácidos nucleicos que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido según la invención definido antes. Por tanto, pueden usarse técnicas de transformación estándar.
En una realización, la célula hospedadora transformada comprende un nucleótido heterólogo que codifica un polipéptido según la reivindicación 1 o codifica un polipéptido que tiene la sustitución F85Q/V, T89V, V187A/F, I218S, T219A, Q341S/A, N346V, T380A, F444L/V, T448A, T449F, T451G o W455M de secuencia ID NO: 59, y en una realización del mismo la célula hospedadora es Saccharomyces cerevisiae.
En una realización, el hospedador transformado se transforma con un polinucleótido que codifica un polipéptido que es un mutante de un polipéptido que es nativo en la célula hospedadora no transformada.
En una realización, el polipéptido que es nativo en la célula hospedadora no transformada es un miembro de los transportadores de la superfamilia de facilitadores principales (MFS), en una realización un polipéptido transportador de hexosa.
En una realización, el polipéptido que es nativo en la célula hospedadora no transformada es un polipéptido transportador elegido de la lista que consiste en Gal2, Hxt1, Hxt2, Hxt3, Hxt4, Hxt5, Hxt6, Hxt7, Hxt8, Hxt9, Hxt10, Hxt11, Hxt12, Hxt13, Hxt14, Hxt15, Hxt16 y Hxt17.
En una realización, el polipéptido de la invención no tiene el resto de aminoácido X (X puede ser cualquier aminoácido) en una posición A dada (A puede ser cualquier posición específica en el polipéptido en SEQ ID NO: 59, donde X es una mutación en SEQ ID NO: 59, cuando X es nativo en la posición correspondientes a A en un segundo polipéptido de la familia de MFS.
En una realización, el polipéptido no tiene el resto de aminoácido S, que se corresponde con M339S en SEQ ID NO: 59, en la posición correspondiente en HXT1 (es decir, no 333S en HXT1), en HXT2 (es decir, no 324S en HXT2), en HXT3 (es decir, no 330S en HXT3), en HXT4 (es decir, no 339S en HXT4), en HXT5 (es decir, no 354S en HXT5), en HXT6 o en HXT7 (es decir, no 333S en HXT6 o HXT7), en HXT8 (es decir, no 335S en HXT8), en HXT9 (es decir, no 329S en HXT9), en HXT10 (es decir, no 317S en HXT10) o en HXT11 (es decir, no 329S en HXT11).
En una realización, el polipéptido es un HXT3-6 mutante y tiene una o más sustituciones en HXT3-6. En una realización del mismo, el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N367A/C/D/F/G/I/L/M/S/T/V de SEQ ID NO: 126. En una realización, el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N367A/I de SEQ ID NO: 126. En una realización, el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N367A de SEQ ID NO: 126.
En una realización, el polipéptido es un HXT11 mutante y tiene una o más sustituciones en HXT11. En una realización del mismo, el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N366A/C/D/F/G/I/L/M/S/T/V de SEQ ID NO: 123. En una realización, el polipéptido es un HXT11 mutante. En una realización el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N366/F/I/L/M/T/V de SEQ ID NO: 123. En una realización, el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N366D/M/T de SEQ ID NO: 123. En una realización, el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N366M/T de SEQ ID NO: 123. En una realización, el polipéptido tiene sustituciones correspondientes a N366M/T o N366T de SEQ ID NO: 123.
Co-consumo
En una realización, el hospedador transformado es capaz de co-consumo de glucosa y al menos una pentosa. Esta pentosa puede ser arabinosa o xilosa, en una realización es xilosa. El co-consumo (o co-fermentación) de dos sustratos se define en el presente documento como una captación y conversión intracelular simultánea de dos fuentes de carbono diferentes (por ejemplo, xilosa y glucosa), a un nivel apreciable. Dichas fuentes de carbono se convierten simultáneamente en productos, tales como, por ejemplo, biomasa, etanol, glicerol, y similares.
El co-consumo de una célula se cuantifica y expresa en el presente documento como el índice de co-consumo. El índice de co-consumo es en el presente documento el índice de co-consumo para glucosa y xilosa y se calcula como la suma durante el intervalo de tiempo de 0-24 horas (medido a 0, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 horas) de la diferencia absoluta de la tasa de captación de glucosa (Qg) y la tasa de captación de xilosa (Qx), expresada como gramos de azúcar consumidos por unidad de tiempo, en una fermentación de cultivo discontinuo anaerobio a 1,0 g/l de alquitrán de levadura seca, 30 ºC de temperatura y en la que el medio de fermentación contiene 71,8 gramos de glucosa por litro y 40,0 gramos de xilosa por litro, al inicio de la fermentación. Véanse los Ejemplos 16-18.
En una realización, el índice de co-consumo de la célula hospedadora transformada es 27 g/h o menos, 25 g/h o menos, 23 g/h o menos, 20 g/h o menos, 18 g/h o menos, 16 g/h o menos, 14 g/h o menos, o 12 g/h o menos,
La invención se refiere además a una construcción de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido como se describe antes, por ejemplo un vector.
Otro aspecto de la invención se refiere entonces a vectores, que incluyen vectores de clonación y de expresión, que comprenden un polinucleótido de la invención que codifica un polipéptido de proteína permeasa o un equivalente funcional del mismo y métodos de cultivo, transformación o transfección de tales vectores en una célula hospedadora adecuada, por ejemplo en condiciones en las que la expresión de una permeasa de la invención se produce. Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido.
Los polinucleótidos de la invención pueden incorporarse en un vector recombinante replicable, por ejemplo un vector de clonación o de expresión. El vector puede usarse para replicar el ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. Así, en una realización adicional, la invención proporciona un método de preparación de polinucleótidos de la invención introduciendo un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedadora compatible, y cultivando la célula hospedadora en condiciones que provocan la replicación del vector. El vector puede recuperarse de la célula hospedadora. Células hospedadoras adecuadas se describen más adelante.
Se apreciará por aquellos expertos en la materia que el diseño del vector de expresión puede dependen de factores tales como la elección de la célula hospedadora que va a transformarse, el nivel de expresión de proteína deseada, etc. Los vectores, tales como vectores de expresión, de la invención pueden introducirse en células hospedadoras para así producir proteínas o péptidos, codificadas por ácidos nucleicos como se describen en el presente documento. Los vectores, tales como los vectores de expresión recombinantes, de la invención pueden diseñarse para la expresión de proteínas de polipéptidos de permeasa en células procariotas o eucariotas.
Por ejemplo, los polipéptidos de permeasa pueden expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus), hongos filamentosos, células de levadura o células de mamífero. Células hospedadoras adecuadas se tratan además en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Ejemplos representativos de hospedadores apropiados se describen más adelante.
Se conocen en la técnica medios de cultivo apropiados y condiciones para las células hospedadoras anteriormente descritas.
Para la mayoría de los hongos filamentosos y levadura, el vector o construcción de expresión se integra preferentemente en el genoma de la célula hospedadora con el fin de obtener transformantes estables. Sin embargo, para ciertas levaduras también están disponibles vectores episómicos adecuados en los que la construcción de expresión puede incorporarse para la expresión estable y de alto nivel, ejemplos de los mismos incluyen vectores derivados de los plásmidos 2µ y pKD1 de Saccharomyces y Kluyveromyces, respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA (por ejemplo, AMA1 de Aspergillus). En caso de que las construcciones de expresión se integren en el genoma de células hospedadoras, las construcciones son o bien integradas en loci al azar en el genoma, o en loci diana predeterminados usando recombinación homóloga, en cuyo caso los loci diana comprenden preferentemente un gen altamente expresado.
Por consiguiente, vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófago, episoma de levadura, elementos cromosómicos de levadura, virus tales como baculovirus, papovavirus, virus de la variolovacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar, pseudovirus de la rabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos.
Cuando el polipéptido según la invención va a secretarse de la célula hospedadora en el medio de cultivo, puede añadirse una secuencia señal apropiada al polipéptido con el fin de dirigir el polipéptido sintetizado de novo a la vía de secreción de la célula hospedadora. El experto en la materia conoce seleccionar una secuencia señal apropiada para un hospedador específico.
El vector puede incluir además secuencias que flanquean el polinucleótido que dan lugar a ARN que comprenden secuencias homólogas a secuencias genómicas eucariotas o secuencias genómicas virales. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la invención en el genoma de una célula hospedadora.
Un vector de clonación integrativo puede integrarse al azar o en un locus diana predeterminado en el (los) cromosoma(s) de la célula hospedadora en la que va a integrarse.
El sistema de vector puede ser un vector único, tal como un único plásmido, o dos o más vectores, tales como dos o más plásmidos, que juntos contienen el ADN total que va a introducirse en el genoma de la célula hospedadora.
El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en una dirección antisentido para proporcionar la producción de ARN antisentido.
El ADN de vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas mediante técnicas de transformación o de transfección convencionales. Como se usa en el presente documento, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una variedad de técnicas conocidas en la materia para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedadora, que incluye co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transducción, infección, lipofección, transfección mediada por lípidos catiónicos o electroporación. Métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras pueden encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y otros manuales de laboratorio.
Como se indica antes, la invención proporciona un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 59 con las mutaciones indicadas en la reivindicación 1.
El polipéptido de permeasa según la invención puede recuperarse y purificarse de cultivos celulares recombinantes por métodos conocidos en la técnica. Lo más preferentemente, se emplea cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC") para la purificación.
Polipéptidos de la presente invención incluyen productos naturalmente purificados, productos de procedimientos de síntesis química y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariota o eucariota, que incluyen, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamífero. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glucosilados o pueden estar no glucosilados. Además, los polipéptidos de la invención también pueden incluir un resto de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de los procesos mediados por hospedador.
La invención también caracteriza fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos según la invención.
También se proporcionan células hospedadoras, que comprenden un polinucleótido o vector de la invención. El polinucleótido puede ser heterólogo al genoma de la célula hospedadora. El término "heterólogo", normalmente con respecto a la célula hospedadora, significa que el polinucleótido no se produce naturalmente en el genoma de la célula hospedadora o que el polipéptido no es naturalmente producido por esa célula.
En otra realización, la invención caracteriza células, por ejemplo, células hospedadoras transformadas o células hospedadoras recombinantes que contienen un ácido nucleico englobado por la invención. Una "célula transformada" o "célula recombinante" es una célula en la que (o en un ancestro de la que) se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinante, un ácido nucleico según la invención. Están incluidas tanto células procariotas como eucariotas, por ejemplo, bacterias, hongos, levadura, y similares, especialmente se prefieren células de levadura que incluyen, por ejemplo, Saccharomyces, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae.
Puede elegirse una célula hospedadora que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico en un modo deseado específico. Tales modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos de proteína pueden facilitar el funcionamiento óptimo de la proteína.
Diversas células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación postraduccional de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares apropiadas o sistemas hospedadores familiares para aquellos expertos en la materia de la biología molecular y/o la microbiología para garantizar la modificación deseada y correcta y el procesamiento de la proteína extraña expresada. Para este fin, pueden usarse células hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para el apropiado procesamiento del transcrito primario, glucosilación y fosforilación del producto génico. Tales células hospedadoras son muy conocidas en la técnica.
Si se desea, puede usarse una célula como se ha descrito anteriormente en la preparación de un polipéptido según la invención. Un método tal normalmente comprende cultivar una célula hospedadora (por ejemplo, transformada o transfectada con un vector de expresión como se ha descrito anteriormente) en condiciones para proporcionar la expresión (por el vector) de una secuencia codificante que codifica el polipéptido, y opcionalmente recuperar el polipéptido expresado. Los polinucleótidos de la invención pueden incorporarse en un vector recombinante replicable, por ejemplo, un vector de expresión. El vector puede usarse para replicar el ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. Así, en una realización adicional, la invención proporciona un método de preparación de un polinucleótido de la invención introduciendo un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedadora compatible, y cultivando la célula hospedadora en condiciones que provocan la replicación del vector. El vector puede recuperarse de la célula hospedadora.
Los vectores pueden transformarse o transfectarse en una célula hospedadora adecuada como se ha descrito anteriormente para proporcionar la expresión de un polipéptido de la invención. Este proceso puede comprender cultivar una célula hospedadora transformada con un vector de expresión como se ha descrito anteriormente en condiciones para proporcionar la expresión por el vector de una secuencia codificante que codifica el polipéptido.
En el presente documento se usan técnicas de aislamiento, hibridación, transformación y clonación estándar (por ejemplo, como se describen en Sambrook, J., Fritsh, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Homología e identidad
Se dice que secuencias de aminoácidos o de nucleótidos son homólogas cuando presentan un cierto nivel de similitud. Dos secuencias que son homólogas indican un origen evolutivo común. Si dos secuencias homólogas están estrechamente relacionadas o más distantemente relacionadas se indica por el "porcentaje de identidad" o "porcentaje similitud", que es alto o bajo, respectivamente. Aunque es cuestionado, para indicar "porcentaje de identidad" o "porcentaje similitud", frecuentemente se usan indistintamente "nivel de homología" o "porcentaje de homología".
Puede llevarse a cabo una comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias usando un algoritmo matemático. El experto conocerá el hecho de que están disponibles varios programas informáticos diferentes para alinear dos secuencias y determinar la homología entre las dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) Un visión general de la comparación de secuencias en D. Sankoff y J. B. Kruskal, (ed.), Time
warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). Puede determinarse el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos usando el algoritmo de Needleman y Wunsch para el alineamiento de dos secuencias. (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). El algoritmo alinea secuencias de aminoácidos, además de secuencias de nucleótidos. El algoritmo de Needleman-Wunsch ha sido implementado en el programa informático NEEDLE. Con el fin de la presente invención se usó el programa de NEEDLE del paquete EMBOSS (versión 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. y Bleasby, A. Trends in Genetics 16,
(6) pp276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Para secuencias de proteínas, se usa EBLOSUM62 para la matriz de sustitución. Para secuencias de nucleótidos, se usa EDNAFULL. Pueden especificarse otras matrices. Los parámetros opcionales usados para el alineamiento de secuencias de aminoácidos son una penalización por abertura de hueco de 10 y una penalización por extensión de hueco de 0,5. El experto apreciará que todos estos parámetros diferentes darán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente si se usan diferentes algoritmos.
Definición de homología global
La homología o identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias completas a lo largo de la región alineada total que incluye cualquier hueco o extensión. La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula del siguiente modo: Número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido entre la longitud total del alineamiento que incluye los huecos. La identidad definida como en el presente documento puede obtenerse de NEEDLE y está marcada en la salida del programa como "IDENTIDAD".
Definición de identidad más larga
La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula del siguiente modo: Número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido entre la longitud total del alineamiento después de la resta del número total de huecos en el alineamiento. La identidad definida como en el presente documento puede obtenerse de NEEDLE usando la opción NOBRIEF y está marcada en la salida del programa como "Identidad más larga".
Las diversas realizaciones de la invención descrita en el presente documento pueden ser combinadas de forma cruzada.
La composición de azúcares
La composición de azúcares según la invención comprende glucosa, arabinosa y xilosa. Puede usarse cualquier composición de azúcares en la invención que cumpla aquellos criterios. Azúcares opcionales en la composición de azúcares son galactosa y manosa. En una realización preferida, la composición de azúcares es un hidrolizado de uno o más materiales lignocelulósicos. Lignocelulosa en el presente documento incluye hemicelulosa y partes de hemicelulosa de biomasa. Lignocelulosa también incluye fracciones lignocelulósicas de biomasa. Materiales lignocelulósicos adecuados pueden encontrarse en la siguiente lista: iniciadores de huerta, chaparral, desechos de molino, desechos de madera urbanos, residuos municipales, residuos de podas, materiales de poda de bosques, cultivos de arbolados de rotación corta, residuos industriales, paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, cáscaras de soja, cáscaras de arroz, paja de arroz, pienso de gluten de trigo, cáscaras de avena, caña de azúcar, tallos y hojas de maíz, cañas de maíz, mazorcas de maíz, vainas de maíz, pasto varilla, miscanthus, sorgo dulce, tallos de colza, tallos de soja, pasto de pradera, pasto gama, cola de zorro; pulpa de remolacha dulce, pulpa de frutas cítricas, cáscaras de semillas, residuos animales celulósicos, recortes de césped, algodón, algas marinas, árboles, madera blanda, madera dura, álamo, pino, arbustos, hierbas, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, vainas de maíz, mazorcas de maíz, grano de maíz, fibra de granos, productos y subproductos de la molienda en seco o húmedo de granos, residuos sólidos municipales, papel residual, residuos de jardinería, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos municipales, papel residual, pulpa, residuos de molienda de papel, ramas, arbustos, cañas, maíz, vainas de maíz, un cultivo energético, bosque, una fruta, una flor, un grano, una hierba, un cultivo herbáceo, una hoja, corteza, una espina, un tronco, una raíz, un árbol joven, un matorral, pasto varilla, un árbol, una verdura, piel de fruta, una vid, pulpa de remolacha azucarera, cascarillas de trigo, cáscaras de avena, madera dura o blanda, material de residuos orgánicos generado de un proceso agrícola, residuos de madera de silvicultura, o una combinación de cualesquiera dos o más de los mismos.
Una visión general de algunas composiciones de azúcares adecuadas derivadas de lignocelulosa y la composición de azúcares de sus hidrolizados se da en la Tabla 1. Las lignocelulosas enumeradas incluyen: mazorcas de maíz, fibra de maíz, cáscaras de arroz, cáscaras de melón, pulpa de remolacha azucarera, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, madera, pasto y prensados de aceituna.
Tabla 1: Visión general de las composiciones de azúcares de materiales lignocelulósicos. Gal=galactosa, Xil=xilosa, Ara=arabinosa, Man=manosa, Glu=glucosa, Ram=ramnosa. Se da el porcentaje de galactosa (% de Gal) y la fuente bibliográfica.
Material lignocelulósico
Gal Xil Ara Man Glu Ram Suma % de Gal.
Mazorca de maíz a
10 286 36 227 11 570 1,7
Mazorca de maíz b
131 228 160 144 663 19,8
Cáscaras de arroz a
9 122 24 18 234 10 417 2,2
Cáscaras de arroz b
8 120 28 209 12 378 2,2
Cáscaras de melón
6 120 11 208 16 361 1,7
Pulpa de remolacha azucarera
51 17 209 11 211 24 523 9,8
Paja de trigo Idaho
15 249 36 396 696 2,2
Fibra de maíz
36 176 113 372 697 5,2
Bagazo de caña de azúcar
14 180 24 5 391 614 2,3
Hojas y tallos de maíz
19 209 29 370 626
Athel (madera)
5 118 7 3 493 625 0,7
Eucalipto (madera)
22 105 8 3 445 583 3,8
CWR (pasto)
8 165 33 340 546 1,4
JTW (pasto)
7 169 28 311 515 1,3
MSW
4 24 5 20 440 493 0,9
Vegetación de pasto alpiste
16 117 30 6 209 1 379 4,2
Semilla de pasto alpiste
13 163 28 6 265 1 476 2,7
Residuos del prensado de aceitunas
15 111 24 8 329 487 3,1
5 Es evidente de la Tabla 1 que en estas lignocelulosas una alta cantidad de azúcar está presente en forma de glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa. La conversión de glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa en el producto de fermentación es así de gran importancia económica. También está presente manosa en algunos materiales de lignocelulosa, aunque normalmente en cantidades más bajas que los azúcares previamente mencionados. Ventajosamente, por tanto, también se convierte manosa por la célula hospedadora transformada.
10 La célula hospedadora transformada
En una realización, la célula hospedadora transformada puede comprender una o más copias del gen xilosa isomerasa y/o una o más copias de xilosa reductasa y/o xilitol deshidrogenasa, y dos a diez copias de genes araA, araB y araD, en los que estos genes están integrados en el genoma de la célula.
En una realización, la célula hospedadora transformada comprende genes, por ejemplo el gen xilosa isomerasa 15 anterior y/o una o más copias de xilosa reductasa y/o xilitol deshidrogenasa, y dos a diez copias de genes araA, araB y araD, están integrados en el genoma de la célula hospedadora transformada.
El número de copias puede ser determinado por el experto por cualquier método conocido. En los ejemplos se describe un método adecuado.
En una realización, la célula hospedadora transformada es capaz de fermentar glucosa, arabinosa, xilosa y 20 galactosa.
En una realización, la célula es capaz de convertir el 90 % o más de glucosa, xilosa arabinosa, galactosa y manosa disponible en un producto de fermentación. En una realización, la célula es capaz de convertir el 91 % o más, el 92% o más, el 94%omás, el 95% o más, el 96% o más, el 97%o más, el 98% o más o el 100% de toda la glucosa, xilosa arabinosa, galactosa y manosa disponible en un producto de fermentación.
En una realización de la invención, la célula hospedadora transformada es capaz de fermentar uno o más azúcares adicionales, preferentemente azúcar C5 y/o C6, por ejemplo, manosa. En una realización de la invención, la célula hospedadora transformada comprende uno o más de: un gen xylA, gen XYL1 y gen XYL2 y/o gen XKS1, para permitir que la célula hospedadora transformada fermente xilosa; deleción del gen de aldosa reductasa (GRE3); expresión en exceso de los genes de PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1 para permitir el aumento del flujo a través de la vía de la pentosa fosfato en la célula.
En una realización, la célula hospedadora transformada es una célula industrial, más preferentemente una levadura industrial. Una célula industrial y célula de levadura industrial puede definirse del siguiente modo. Los entornos vivos de células (de levadura) en procesos industriales son significativamente diferentes de aquellos en el laboratorio. Células de levadura industriales deben ser capaces de rendir bien en múltiples condiciones medioambientales que pueden variar durante el proceso. Tales variaciones incluyen cambio en las fuentes de nutriente, pH, concentración de etanol, temperatura, concentración de oxígeno, etc., que juntos tienen el potencial de tener un impacto sobre el crecimiento celular y la producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae. En condiciones industriales adversas, las cepas tolerantes medioambientales deben permitir el crecimiento y la producción robustos. Las cepas de levadura industriales son generalmente más robustas hacia estos cambios en condiciones medioambientales que pueden producirse en las aplicaciones en las que se usan, tales como en la industria de la panadería, industria cervecera, viticultura y la industria del etanol. En una realización, la célula hospedadora transformada industrial se construye basándose en una célula hospedadora industrial, en la que la construcción se realiza como se describe en lo sucesivo. Ejemplos de levadura industrial (S. cerevisiae) son Ethanol Red® (Fermentis), Fermiol® (DSM) y Thermosacc® (Lallemand).
En una realización, la célula hospedadora transformada es tolerante a inhibidor. La tolerancia a inhibidor es resistencia a inhibir compuestos. La presencia y nivel de compuestos inhibidores en lignocelulosa puede variar ampliamente con la variación de materia prima, proceso de hidrólisis del método de pretratamiento. Ejemplos de categorías de inhibidores son ácidos carboxílicos, furanos y/o compuestos fenólicos. Ejemplos de ácidos carboxílicos son ácido láctico, ácido acético o ácido fórmico. Ejemplos de furano son furfural e hidroximetilfurfural. Ejemplos de compuestos fenólicos son vainillina, ácido siríngico, ácido ferúlico y ácido cumárico. Las cantidades típicas de inhibidores son para ácidos carboxílicos: varios gramos por litro, hasta 20 gramos por litro o más, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de hidrólisis. Para furanos: varios cientos de miligramos por litro hasta varios gramos por litro, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de hidrólisis.
Para fenólicos: varias decenas de miligramos por litro, hasta un gramo por litro, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de hidrólisis.
Las células hospedadoras transformadas según la invención pueden ser tolerantes a inhibidor, es decir, pueden resistir a inhibidores comunes al nivel que normalmente tienen con condiciones de pretratamiento e hidrólisis comunes, de manera que las células hospedadoras transformadas pueden encontrar una amplia aplicación, es decir, tiene alta aplicabilidad para diferente materia prima, diferentes métodos de pretratamiento y diferentes condiciones de hidrólisis.
En una realización, la célula hospedadora transformada industrial se construye basándose en una célula hospedadora tolerante a inhibidor, en la que la construcción se realiza como se describe en lo sucesivo. Pueden seleccionarse células hospedadoras tolerantes a inhibidor seleccionando cepas para el crecimiento sobre inhibidores que contienen materiales, tal como se ilustra en Kadar et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847858, en el que se seleccionó una cepa de S. cerevisiae tolerante a inhibidor ATCC 26602.
En una realización, la célula hospedadora transformada está libre de marcador. Como se usa en el presente documento, el término "marcador" se refiere a un gen que codifica un rasgo o un fenotipo que permite la selección de, o el cribado de, una célula hospedadora que contiene el marcador. Libre de marcador significa que los marcadores están esencialmente ausentes en la célula hospedadora transformada. El estar libre de marcador es particularmente ventajoso cuando se han usado marcadores de antibiótico en la construcción de la célula hospedadora transformada y se eliminan a partir de aquí. La eliminación de marcadores puede hacerse usando cualquier técnica del estado de la técnica adecuada, por ejemplo, recombinación intramolecular. Un método adecuado de la eliminación de marcadores se ilustra en los ejemplos.
Una célula hospedadora transformada puede ser capaz de convertir biomasa de planta, celulosas, hemicelulosas, pectinas, almidón, derivados de almidón, por ejemplo en azúcares fermentables. Por consiguiente, una célula hospedadora transformada puede expresar una o más enzimas tales como una celulasa (una endocelulasa o una exocelulasa), una hemicelulasa (una endo-o exo-xilanasa o arabinasa) necesaria para la conversión de celulosa en monómeros de glucosa y hemicelulosa en xilosa y monómeros de arabinosa, una pectinasa capaz de convertir pectinas en ácido glucurónico y ácido galacturónico o una amilasa para convertir almidón en monómeros de glucosa.
La célula hospedadora transformada puede comprender además aquellas actividades enzimáticas requeridas para la conversión de piruvato en un producto de fermentación deseado, tal como etanol, butanol, ácido láctico, di-terpeno, di-terpeno glucosilado, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido
fumárico, ácido málico, ácido itacónico, un aminoácido, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, un antibiótico β-lactámico o una cefalosporina.
En una realización, la célula hospedadora transformada es una célula que es naturalmente capaz de fermentación alcohólica, preferentemente, fermentación alcohólica anaerobia. Una célula hospedadora transformada tiene preferentemente una alta tolerancia a etanol, una alta tolerancia a pH bajo (es decir, capaz de crecimiento a un pH inferior a aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, o aproximadamente 2,5) y hacia productos orgánicos y/o una alta tolerancia a temperaturas elevadas.
Cualquiera de las características o actividades anteriores de una célula hospedadora transformada puede estar naturalmente presente en la célula o puede introducirse o modificarse por modificación genética.
Construcción de la cepa hospedadora transformada
Según una realización, los genes pueden introducirse en la célula hospedadora introduciendo en una célula hospedadora:
a) una agrupación que consiste en los genes araA, araB y araD bajo el control de un promotor constitutivo fuerte
b) una agrupación que consiste en los genes de PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1, opcionalmente bajo el control de promotor constitutivo fuerte; y deleción de un gen de aldosa reductasa;
c) una agrupación que consiste en un gen xylA y un gen XKS1 bajo el control de promotor constitutivo fuerte;
d) una construcción que comprende un gen xylA bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, que tiene la capacidad de integrarse en el genoma en múltiples loci;
y evolución adaptativa para producir la célula hospedadora transformada. La célula anterior puede construirse usando técnicas de expresión recombinante.
Expresión recombinante
La célula hospedadora transformada es una célula recombinante. Es decir, una célula hospedadora transformada comprende, o se transforma con o se modifica genéticamente con una secuencia de nucleótidos que no se produce en la célula en cuestión.
Técnicas para la expresión recombinante de enzimas en una célula, además de para las modificaciones genéticas adicionales de una célula hospedadora transformada, son muy conocidas para aquellos expertos en la materia. Normalmente, tales técnicas implican la transformación de una célula con construcción de ácidos nucleicos que comprende la secuencia relevante. Tales métodos se conocen, por ejemplo, de manuales estándar, tales como Sambrook y Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, o F. Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Métodos para la transformación y modificación genética de células hospedadoras se conocen de, por ejemplo, los documentos EP-A-0635 574, WO 98/46772, WO 99/60102, WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635574 y US 6.265.186.
Normalmente, la construcción de ácidos nucleicos puede ser un plásmido, por ejemplo, un plásmido de copia baja o un plásmido de copia alta. La célula según la presente invención puede comprender una única copia o múltiples copias de la secuencia de nucleótidos que codifica una enzima, por ejemplo, por múltiples copias de una construcción de nucleótidos o por el uso de la construcción que tiene múltiples copias de la secuencia de enzima.
La construcción de ácidos nucleicos puede mantenerse episómicamente y así comprender una secuencia para la replicación autónoma, tal como una secuencia de secuencia de replicación autosómica. Una construcción episómica adecuada de ácidos nucleicos puede basarse, por ejemplo, en los plásmidos 2µ o pKD1 de levadura (Gleer et al., 1991, Biotechnology 9:968-975), o los plásmidos AMA (Fierro et al., 1995, Curr Genet. 29:482-489). Alternativamente, cada construcción de ácidos nucleicos puede integrarse en una o más copias en el genoma de la célula. La integración en el genoma de la célula puede producirse al azar por recombinación no homóloga, pero preferentemente, la construcción de ácidos nucleicos puede integrarse en el genoma de la célula por recombinación homóloga como es muy conocido en la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 y US 6.265.186).
La mayoría de los plásmidos episómicos o 2µ son relativamente inestables en levadura, perdiéndose en aproximadamente 10-2 o más células después de cada generación. Incluso en condiciones de crecimiento selectivo, solo del 60 % al 95 % de las células retienen el plásmido episómico. El número de copias de la mayoría de los plásmidos episómicos oscila de 20-100 por célula de hospedadores cir+. Sin embargo, los plásmidos no están igualmente distribuidos entre las células, y hay una alta varianza en el número de copias por célula en las poblaciones. Cepas transformadas con plásmidos integrativos son extremadamente estables, incluso en ausencia de presión selectiva. Sin embargo, puede producirse pérdida de plásmidos en aproximadamente 10-3 a 10-4 frecuencias
por recombinación homóloga entre ADN repetido en tándem, conduciendo a pérdida por formación de bucle de la secuencia del vector. Preferentemente, el diseño del vector en el caso de integración estable es tal que, ante la pérdida de los genes de marcadores de selección (que también ocurre mediante recombinación homologa intramolecular), esa pérdida por formación de bucle de la construcción integrada ya no es posible. Preferentemente, los genes están, por lo tanto, integrados de forma estable. La integración estable se define en el presente documento como la integración dentro del genoma, en el que ya no es posible la pérdida por formación de bucle de la construcción integrada. Preferentemente, los marcadores de selección están ausentes. Normalmente, la secuencia codificante de la enzima estará operativamente unid a una o más secuencias de ácidos nucleicos, capaces de proporcionar o ayudar en la transcripción y/o traducción de la secuencia de la enzima.
El término "operativamente unido" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en la manera esperada. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante de modo que dicho promotor o potenciador afecte la transcripción de la secuencia codificante.
Como se usa en el presente documento, el término "promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes, localizado en la dirección 5' con respecto a la dirección de transcripción del sitio de iniciación de la transcripción del gen, y está estructuralmente identificado por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa dependiente de ADN, sitios de iniciación de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN conocida por un experto en la materia. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo bajo la mayoría de las condiciones medioambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está activo bajo regulación medioambiental o del desarrollo.
El promotor que podría usarse para lograr la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima según la presente invención puede no ser nativo a la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que va a expresarse, es decir, un promotor que es heterólogo a la secuencia de nucleótidos (secuencia codificante) a la que está operativamente unido. Sin embargo, el promotor puede ser homólogo, es decir, endógeno, a la célula hospedadora.
Los promotores están ampliamente disponibles y son conocidos para el experto. Ejemplos adecuados de tales promotores incluyen, por ejemplo, promotores de genes glucolíticos, tales como los promotores de fosfofructocinasa (PFK), triosa fosfato isomerasa (TPI), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GPD, TDH3 o GAPDH), piruvato cinasa (PYK), fosfoglicerato cinasa (PGK) de levaduras u hongos filamentosos; más detalles sobre tales promotores de levadura pueden encontrarse en (documento WO 93/03159). Otros promotores útiles son los promotores de genes que codifican proteínas ribosómicas, el promotor del gen de lactasa (LAC4), promotores de alcohol deshidrogenasa (ADH1, ADH4, y similares), y el promotor de enolasa (ENO). Otros promotores, tanto constitutivos como inducibles, y potenciadores o secuencias de activación en la dirección 5' serán conocidos por aquellos expertos en la materia. Los promotores usados en las células hospedadoras de la invención pueden modificarse, si se desea, para afectar sus características de control. Promotores adecuados en este contexto incluyen tanto promotores naturales constitutivos como inducibles, además de promotores modificados por ingeniería, que son muy conocidos por el experto en la materia. Promotores adecuados para células hospedadoras eucariotas pueden ser GAL7, GAL10, o GAL1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO1, TPI1 y AOX1. Otros promotores adecuados incluyen PDC1, GPD1, PGK1, TEF1 y TDH3.
En una célula hospedadora transformada, el extremo 3' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la enzima está preferentemente unido operativamente a una secuencia terminadora de la transcripción. Preferentemente, la secuencia terminadora es operable en una célula hospedadora de elección, tal como, por ejemplo, las especies de levadura de elección. En cualquier caso, la elección del terminador no es crítica; puede ser, por ejemplo, de cualquier gen de levadura, aunque los terminadores pueden funcionar algunas veces si son de un gen eucariota distinto de levadura. Normalmente, una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima comprende un terminador. Preferentemente, tales terminadores se combinan con mutaciones que previenen el decaimiento del ARNm mediado por elementos sin sentido en la célula hospedadora transformada (véase, por ejemplo: Shirley et al., 2002, Genetics 161:1465-1482).
La secuencia de terminación de la transcripción comprende preferentemente además una señal de poliadenilación.
Opcionalmente, puede estar presente un marcador de selección en una construcción de ácido nucleico adecuada para su uso en la invención. Como se usa en el presente documento, el término "marcador" se refiere a un gen que codifica un rasgo o un fenotipo que permite la selección de, o el cribado de, una célula hospedadora que contiene el marcador. El gen marcador puede ser un gen de resistencia a antibióticos por el cual puede usarse el antibiótico apropiado para seleccionar células transformadas de entre células que no están transformadas. Ejemplos de marcadores de resistencia a antibiótico adecuados incluyen, por ejemplo, dihidrofolato reductasa, higromicina-Bfosfotransferasa, 3'-O-fosfotransferasa II (resistencia a kanamicina, neomicina y G418). Los marcadores de resistencia a antibiótico pueden ser más convenientes para la transformación de células hospedadoras poliploides. También pueden usarse marcadores no de resistencia a antibiótico, tales como marcadores auxotróficos (URA3, TRP1, LEU2) o el gen TPI de S. pombe (descrito por Russell P R, 1985, Gene 40: 125-130). En una realización preferida, las células hospedadoras transformadas con las construcciones de ácido nucleico están libres de genes
marcadores. Métodos de construcción de células hospedadoras microbianas recombinantes libres de genes marcadores se desvelan en el documento EP-A-0 635 574 y se basan en el uso de marcadores bidireccionales tales como el gen de A. nidulans amdS (acetamidasa) o los genes de levadura URA3 y LYS2. Alternativamente, puede incorporarse un marcador de selección tal como proteína verde fluorescente, lacL, luciferasa, cloranfenicol acetiltransferasa, beta-glucuronidasa en las construcciones de ácido nucleico de la invención, que permite cribar las células transformadas.
Elementos adicionales opcionales que pueden estar presentes en las construcciones de ácido nucleico adecuadas para su uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, una o más secuencias conductoras, potenciadores, factores de integración, y/o genes indicadores, secuencias intrónicas, centrómeros, telómeros y/o secuencias de unión a matriz (MAR). Las construcciones de ácido nucleico de la invención pueden comprender además una secuencia para replicación autónoma, tal como una secuencia ARS.
El proceso de combinación puede así ejecutarse con técnicas de recombinación conocidas. Diversos medios son conocidos por aquellos expertos en la materia para la expresión y expresión en exceso de enzimas en una célula hospedadora transformada. En particular, una enzima puede expresarse en exceso aumentando el número de copias del gen que codifica la enzima en la célula hospedadora, por ejemplo, mediante la integración de copias adicionales del gen en el genoma de la célula hospedadora, mediante la expresión del gen desde un vector de expresión multicopia episómico o mediante la introducción de un vector de expresión episómico que comprende múltiples copias del gen.
Alternativamente, la expresión en exceso de enzimas en las células hospedadoras de la invención puede lograrse usando un promotor que no es nativo a la secuencia que codifica la enzima que va a expresarse en exceso, es decir, un promotor que es heterólogo a la secuencia codificante a la que está operativamente unido. Aunque el promotor es preferentemente heterólogo a la secuencia codificante a la que está operativamente unido, también se prefiere que el promotor sea homólogo, es decir, endógeno a la célula hospedadora. Preferentemente, el promotor heterólogo es capaz de producir un mayor nivel de estado estacionario del transcrito que comprende la secuencia codificante (o es capaz de producir más moléculas de transcrito, es decir, moléculas de ARNm, por unidad de tiempo) que el promotor que es nativo a la secuencia codificante. Promotores adecuados en este contexto incluyen tanto promotores naturales constitutivos como inducibles, además de promotores modificados por ingeniería.
En una realización, la célula hospedadora transformada está libre de marcadores, que significa que no están presentes marcadores auxotróficos o dominantes, en particular marcadores de resistencia a antibióticos, en el genoma o extracromosómicamente.
La secuencia codificante usada para la expresión en exceso de las enzimas mencionadas anteriormente puede preferentemente ser homologa a la célula hospedadora. Sin embargo, pueden usarse secuencias codificantes que son heterólogas al hospedador.
La expresión en exceso de una enzima, cuando se refiere a la producción de la enzima en una célula genéticamente modificada, significa que la enzima se produce a un nivel mayor de actividad enzimática específica en comparación con la célula hospedadora sin modificar en condiciones idénticas. Normalmente, esto significa que la proteína enzimáticamente activa (o proteínas en el caso de enzimas con múltiples subunidades) se produce en cantidades mayores, o bien a un nivel de estado estacionario mayor en comparación con la célula hospedadora sin modificar, en condiciones idénticas. Similarmente, esto normalmente significa que el ARNm que codifica la proteína enzimáticamente activa se produce en cantidades mayores, o nuevamente a un nivel de estado estacionario mayor, en comparación con la célula hospedadora sin modificar en condiciones idénticas. Preferentemente, en un hospedador, una enzima que va a expresarse en exceso se expresa en exceso al menos un factor de aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que causa la expresión en exceso. Debe entenderse que estos niveles de expresión en exceso pueden aplicarse al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima, al nivel de estado estacionario de la proteína de la enzima, además de al nivel de estado estacionario del transcrito que codifica la enzima.
Adaptación
La adaptación es el proceso evolutivo por el cual una población se vuelve más adecuada (adaptada) para su hábitat
o hábitats. Este proceso tiene lugar durante de varias a muchas generaciones, y es uno de los fenómenos básicos de la biología.
El término adaptación también se puede referir a una característica que es especialmente importante para la supervivencia de un organismo. Tales adaptaciones se producen en una población variable por las formas mejor adecuadas que se reproducen más satisfactoriamente, mediante selección natural.
Los cambios en las condiciones medioambientales alteran el resultado de la selección natural, que afecta los beneficios selectivos de adaptaciones posteriores que mejoran la aptitud de un organismo bajo las nuevas condiciones. En el caso de un cambio medioambiental extremo, la aparición y fijación de adaptaciones beneficiosas puede ser esencial para la supervivencia. Un gran número de factores diferentes, tales como, por ejemplo,
disponibilidad de nutrientes, temperatura, la disponibilidad de oxígeno, etcétera, pueden impulsar la evolución adaptativa.
Aptitud
Hay una clara relación entre la adaptabilidad (el grado al cual un organismo es capaz de vivir y reproducirse en un grupo dado de hábitats) y la aptitud. La aptitud es una estimación y un factor pronóstico de la tasa de selección natural. Mediante la aplicación de la selección natural, las frecuencias relativas de fenotipos alternativos variarán con el tiempo, si son heredables.
Cambios genéticos
Cuando la selección natural actúa sobre la variabilidad genética de la población, los cambios genéticos son el mecanismo subyacente. Por este medio, la población se adapta genéticamente a sus circunstancias. Los cambios genéticos pueden producir estructuras visibles, o pueden ajustar la actividad fisiológica del organismo en un modo que se adecue al hábitat cambiado.
Puede ocurrir que los hábitats cambien frecuentemente. Por tanto, de esto resulta que el proceso de adaptación nunca está finalmente completo. Con el tiempo, puede ocurrir que el entorno cambie gradualmente, y la especie llegue a adaptarse a su entorno cada vez mejor. Por otra parte, puede ocurrir que los cambios en el entorno ocurran con relativa rapidez, y entonces la especie se vuelva cada menos bien adaptada. La adaptación es un proceso genético, que está ocurriendo todo el tiempo de algún modo, también cuando la población no cambia el hábitat o entorno.
La evolución adaptativa
Las células hospedadora transformada pueden someterse en su preparación a evolución adaptativa. Una célula hospedadora transformada puede adaptarse a la utilización de azúcares mediante selección de mutantes, ya sean espontáneos o inducidos (por ejemplo, mediante radiación o productos químicos), para crecer sobre el azúcar deseado, preferentemente como única fuente de carbono, y más preferentemente en condiciones anaerobias. Puede realizarse selección de mutantes por técnicas que incluyen transferencia en serie de cultivos como, por ejemplo, se describe por Kuyper et al. (2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664) o por cultivo bajo presión selectiva en un cultivo quimiostático. Por ejemplo, en una célula hospedadora preferida, al menos una de las modificaciones genéticas descritas previamente, que incluye las modificaciones obtenidas por selección de mutantes, confiere a la célula hospedadora la capacidad de crecer sobre xilosa como fuente de carbono, preferentemente como única fuente de carbono, y preferentemente en condiciones anaerobias. Cuando se usa XI como gen para convertir xilosa, preferentemente la célula esencialmente no produce xilitol, por ejemplo, el xilitol producido está por debajo del límite de detección o, por ejemplo, es inferior a aproximadamente el 5, aproximadamente el 2, aproximadamente el 1, aproximadamente el 0,5, o aproximadamente el 0,3 % del carbono consumido en base molar.
La evolución adaptativa también se describe, por ejemplo, en Wisselink H.W. et al., Applied and Environmental Microbiology Aug. 2007, p. 4881-4891
En una realización de la evolución adaptativa se aplica un régimen que consiste en cultivo discontinuo repetido con ciclos repetidos de crecimiento consecutivo en diferentes medios, por ejemplo, tres medios con diferentes composiciones (glucosa, xilosa y arabinosa; xilosa y arabinosa. Véase Wisselink et al. (2009) Applied and Environmental Microbiology, Feb. 2009, p. 907-914.
Transformación de levaduras y estabilidad genética
La ingeniería genética, es decir, la transformación de células de levadura con ADN recombinante, fue posible por primera vez en 1978 [Beggs, 1978; Hinnen et al., 1978]. La tecnología de ADN recombinante en levadura se ha establecido desde entonces. Están disponibles una multitud de diferentes construcciones de vector. Generalmente, estos vectores plasmídicos, denominados vectores lanzadera, contienen material genético derivado de vectores de
E. coli que consiste en un origen de replicación y un marcador de selección (frecuentemente el gen de β-lactamasa, ampR), que les permite propagarse en E. coli antes de la transformación en células de levadura. Además, los vectores lanzadera contienen un marcador de selección para selección en levadura. Los marcadores pueden ser genes que codifican enzimas para la síntesis de un aminoácido o nucleótido particular, de manera que las células que llevan la deleción genómica correspondiente (o mutación) se complementan para auxotrofía o autotrofía. Alternativamente, estos vectores contienen marcadores de resistencia dominantes heterólogos, que proveen a las células de levadura recombinantes (es decir, las células que han incorporado el ADN y expresan el gen marcador) resistencia hacia ciertos antibióticos, como g418 (Geneticin), higromicina B o fleomicina. Además, estos vectores pueden contener una secuencia de sitios de restricción (combinados) (sitio de clonación múltiple o MCS) que permitirá clonar ADN foráneo en estos sitios, aunque también existen métodos alternativos.
Tradicionalmente, pueden distinguirse cuatro tipos de vectores lanzadera por la ausencia o presencia de elementos genéticos adicionales:
 Plásmidos integrativos (YIp) que se integran por recombinación homologa dentro del genoma del hospedador en el locus del gen marcador u otro gen, cuando éste se abre por restricción y se usa el ADN linealizado para la transformación de las células de levadura. Esto generalmente resulta en presencia de una copia del ADN foráneo insertado en este sitio particular en el genoma.
 Plásmidos episómicos (YEp) que llevan parte de la secuencia de ADN del plásmido 2 µ necesaria para la
replicación autónoma en células de levadura. Se propagan múltiples copias del plásmido transformado en la
célula de levadura y se mantienen como episomas.
 Plásmidos de replicación autónoma (YRp) que llevan un origen de replicación para levaduras (ARS, secuencia
replicada autónomamente) que permite que los plásmidos transformados se propaguen varios cientos de
veces.
 Plásmidos CEN (YCp) que llevan, además de una secuencia ARS, una secuencia centromérica (derivada de
uno de los cromosomas nucleares) que normalmente garantiza la segregación mitótica estable y normalmente
reduce el número de copias de plásmido autoreplicado a solo una.
Estos plásmidos se introducen en las células de levadura por transformación. La transformación de células de levadura puede lograrse por varias técnicas diferentes, tales como permeabilización de las células con acetato de litio (Ito et al., 1983) y métodos de electroporación.
En la aplicación comercial de microorganismos recombinantes, la inestabilidad del plásmido es el problema más importante. La inestabilidad es la tendencia de las células transformadas a perder sus propiedades modificadas por ingeniería debido a cambios o a perdida de plásmidos. Este problema se trata en detalle por Zhang et al (Plasmid stability in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Advances, Vol. 14, N.º 4, pp. 401-435, 1996). Las cepas transformadas con plásmidos integrativos son extremadamente estables, incluso en ausencia de presión selectiva (Sherman, F. http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/shermanf/yeast/9.html y referencias en la misma).
El ADN heterólogo normalmente se introduce en el organismo en forma de plásmidos extracromosómicos (YEp, YCp y YRp). Desafortunadamente, se ha encontrado, tanto con bacterias como con levaduras, que no pueden ser retenidas las nuevas características, especialmente si la presión de selección no se aplica continuamente. Esto es debido a la inestabilidad segregacional del plásmido híbrido cuando las células recombinantes crecen durante un largo periodo de tiempo. Esto conduce a heterogeneidad de la población y variabilidad clonal, y eventualmente a una población celular en la que la mayoría de las células han perdido las propiedades que se introdujeron por la transformación. Si se usan vectores con marcadores auxotróficos, el cultivo en medios ricos frecuentemente conduce a una perdida rápida del vector, debido a que el vector solo se retiene en medio mínimo. La alternativa, el uso de marcadores de resistencia a antibióticos dominantes, frecuentemente no es compatible con los procesos de producción. El uso de antibióticos puede ser no deseable desde el punto de vista del registro (la posibilidad de que cantidades traza del antibiótico terminen en el producto final) o por motivos económicos (costes del uso de antibióticos a escala industrial).
La pérdida de vectores conduce a problemas en situaciones de producción a gran escala. Existen métodos alternativos para la introducción de ADN para levaduras, tales como el uso de plásmidos integrativos (YIp). El ADN se integra en el genoma hospedador mediante recombinación, produciendo alta estabilidad (Caunt, P. Stability of recombinant plasmids in yeast. Journal of Biotechnology 9(1988) 173 -192). Los presentes inventores han encontrado que es una buena alternativa un método de integración que usa los transposones del hospedador. En una realización, los genes pueden ser integrados en el genoma de la célula hospedadora transformada. La introducción inicial (es decir, antes de la evolución adaptativa) de múltiples copias, puede ejecutarse de cualquier modo conocido en la técnica que conduzca a la introducción de los genes. En una realización, esto puede llevarse a cabo usando un vector con partes homólogas a secuencias repetitivas (transposones), de la célula hospedadora. Cuando la célula hospedadora es una célula de levadura, secuencias repetidas adecuadas son las repeticiones terminales largas (LTR) del elemento Ty, conocido como secuencia delta. Los elementos Ty se clasifican en dos subfamilias bastante similares denominadas Ty1 y Ty2. Estos elementos son de aproximadamente 6 kilobases (kb) de longitud y están unidos mediante repeticiones terminales largas (LTR), secuencias de aproximadamente 335 pares de bases (Boeke JD et al., The Saccharomyces cerevisiae Genome Contains Functional and Nonfunctional Copies of Transposon Ty1. Molecular and Cellular Biology, Apr. 1988, p. 1432-1442 Vol. 8, N.º 4). En la cepa totalmente secuenciada de S. cerevisiae, S288c, los transposones más abundantes son Ty1 (31 copias) y Ty2 (13 copias) (Gabriel A, Dapprich J, Kunkel M, Gresham D, Pratt SC, et al. (2006) Global mapping of transposon location. PLoS Genet 2(12): e212.doi:10.1371/journal.pgen.0020212). Estos transposones consisten en dos marcos de lectura abiertos solapados (ORF), cada uno de los cuales codifica varias proteínas. Las regiones codificantes están flanqueadas por las LTR casi idénticas anteriormente mencionadas. Otros elementos Ty, pero menos abundantes y más distintos, en S. cerevisiae comprenden Ty3, Ty4 y Ty5. Para cada familia de elementos Ty de longitud completa hay un orden de magnitud más de elementos LTR solos dispersos a lo largo del genoma. Se cree que éstos surgen de la recombinación LTR-LTR de elementos de longitud completa, con una escisión por formación de bucle de las regiones internas que codifican proteínas.
Se ha usado el mecanismo de retrotransposición del retrotransposón Ty para integrar múltiples copias a lo largo del genoma (Boeke et al., 1988; Jacobs et al., 1988). Las repeticiones terminales largas (LTR) del elemento Ty, conocido como secuencias delta, también son buenas dianas para la integración por recombinación homologa ya que existen en aproximadamente 150-200 copias que están o bien asociadas a Ty o a sitios solos (Boeke, 1989; Kingsman y Kingsman, 1988). (Parekh R.N. (1996). An Integrating Vector for Tunable, High Copy, Stable Integration into the Dispersed Ty DELTA Sites of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Prog. 1996, 12, 16-21). Por adaptación evolutiva, puede cambiar el número de copias.
La célula hospedadora
La célula hospedadora puede ser cualquier célula hospedadora adecuada para la producción de un producto útil. Una célula hospedadora puede ser cualquier célula adecuada, tal como una célula procariota, tal como una bacteria,
o una célula eucariota. Normalmente, la célula será una célula eucariota, por ejemplo, una levadura o un hongo filamentoso.
Las levaduras se definen en la presente como microorganismos eucariotas e incluyen todas las especies de la subdivisión Eumycotina (Alexopoulos, C. J., 1962, en: Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York) que crecen predominantemente en forma unicelular.
Las levaduras pueden crecer ya sea por gemación de un tallo unicelular o pueden crecer por fisión del organismo. Una levadura preferida como célula hospedadora transformada puede pertenecer a los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces o Yarrowia. Preferentemente, la levadura es una capaz de fermentación anaerobia, más preferentemente una capaz de fermentación alcohólica anaerobia.
Los hongos filamentosos se definen en el presente documento como microorganismos eucariotas que incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina. Estos hongos se caracterizan por un micelio vegetativo compuesto de quitina, celulosa y otros polisacáridos complejos. Los hongos filamentosos que son adecuados para su uso como una célula de la presente invención son morfológicamente, fisiológicamente y genéticamente distintos de las levaduras. Pueden usarse ventajosamente células de hongos filamentosos debido a que la mayoría de los hongos no requieren condiciones estériles para la propagación y son insensibles a las infecciones por bacteriófagos. El crecimiento vegetativo por hongos filamentosos es por elongación de hifas y el metabolismo del carbono de la mayoría de los hongos filamentosos es aerobio estricto. Hongos filamentosos preferidos como célula hospedadora pueden pertenecer al género Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremoniurra, Fusarium o Penicillium. Más preferentemente, la célula de hongo filamentoso puede ser una célula de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, un Penicillium chrysogenum, o Rhizopus oryzae.
En una realización, la célula hospedadora puede ser levadura.
Preferentemente, el hospedadora es un hospedador industrial, más preferentemente una levadura industrial. Un hospedador industrial y una célula de levadura industrial pueden definirse como sigue. Los entornos vivos de las células de levadura en procesos industriales son significativamente diferentes de los del laboratorio. Las células de levadura industriales deben ser capaces de rendir bien bajo múltiples condiciones medioambientales que pueden variar durante el proceso. Tales variaciones incluyen cambios en las fuentes de nutrientes, pH, concentración de etanol, temperatura, concentración de oxígeno, etc., que juntos tienen un posible impacto sobre el crecimiento celular y la producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae. En condiciones industriales adversas, las cepas tolerantes al entorno deben permitir un crecimiento y producción robustos. Las cepas de levaduras industriales son generalmente más robustas a estos cambios en las condiciones medioambientales que pueden producirse en las aplicaciones en las que se usan, tales como en la industria de la panadería, industria cervecera, viticultura y la industria del etanol. Ejemplos de levaduras industriales (S. cerevisiae) son Ethanol Red® (Fermentis) Fermiol® (DSM) y Thermosacc® (Lallemand).
En una realización, el hospedador es tolerante a inhibidor. Pueden seleccionarse células hospedadoras tolerantes a inhibidor mediante el cribado de cepas para crecimiento sobre materiales que contienen inhibidores, tal como se ilustra en Kadar et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847-858, en el que se seleccionó una cepa tolerante a inhibidor de S. cerevisiae ATCC 26602.
Genes araA, araB y araD
Una célula hospedadora transformada es capaz de usar arabinosa. Una célula hospedadora transformada es, por tanto, capaz de convertir L-arabinosa y L-ribulosa y/o xilulosa 5-fosfato y/o en un producto de fermentación deseado, por ejemplo, uno de aquellos mencionados en el presente documento.
Pueden producirse organismos, por ejemplo cepas de S. cerevisiae, capaces de producir etanol a partir de Larabinosa modificando una célula por introducción de los genes araA (L-arabinosa isomerasa), araB (L-ribulocinasa) y araD (L-ribulosa-5-P4-epimerasa) a partir de una fuente adecuada. Tales genes pueden introducirse en una célula hospedadora transformada con el objetivo de que sea capaz de usar arabinosa. Un enfoque tal se da se describe en el documento WO2003/095627. Pueden usarse genes araA, araB y araD de Lactobacillus plantanum y se desvelan
en el documento WO2008/041840. Pueden usarse el gen araA de Bacillus subtilis y los genes araB y araD de Escherichia coli y se desvelan en el documento EP1499708. En otra realización, los genes araA, araB y araD pueden derivar de al menos uno del género Clavibacter, Arthrobacter y/o Gramella, en particular uno de Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens y/o Gramella forsetii, como se desvela en el documento WO 2009011591.
Genes de PPP
Una célula hospedadora transformada puede comprender una o más modificaciones genéticas que aumentan el flujo de la vía de la pentosa fosfato. En particular, la(s) modificación (modificaciones) genética(s) puede(n) conducir a un aumento del flujo a través de la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato. Una modificación genética que produce un aumento del flujo de la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato se entiende en el presente documento que significa una modificación que aumenta el flujo al menos un factor de aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con el flujo en una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que causa el aumento de flujo. El flujo de la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato puede medirse cultivando el hospedador modificado sobre xilosa como única fuente de carbono, determinando la tasa de consumo específico de xilosa y restando la tasa específica de producción de xilitol de la tasa específica de consumo de xilosa, si es que se produce xilitol. Sin embargo, el flujo de la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato es proporcional a la tasa de crecimiento sobre xilosa como única fuente de carbono, preferentemente con la tasa de crecimiento anaeróbico sobre xilosa como única fuente de carbono. Hay una relación lineal entre la tasa de crecimiento sobre xilosa como única fuente de carbono (µmáx) y el flujo de la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato. La tasa específica de consumo de xilosa (Qs) es igual a la tasa de crecimiento (µ) dividida entre el rendimiento de biomasa en azúcar (Yxs) debido a que el rendimiento de biomasa en azúcar es constante (en un grupo de condiciones dadas: anaerobias, medio de crecimiento, pH, antecedentes genéticos de la cepa, etc.; es decir, Qs = µ/ Yxs). Por lo tanto, el aumento de flujo de la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato puede deducirse a partir del aumento de la tasa de crecimiento máxima en estas condiciones a pesar del transporte (la captación es limitante).
Pueden introducirse una o más modificaciones genéticas que aumentan el flujo de la vía de la pentosa fosfato en la célula hospedadora de diversas formas. Éstas incluyen, por ejemplo, conseguir mayores niveles de actividad de estado estacionario de xilulosa cinasa y/o una o más de las enzimas de la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato y/o un nivel en estado estacionario reducido de la actividad inespecífica de aldosa reductasa. Estos cambios en los niveles de actividad de estado estacionario pueden estar afectados por la selección de mutantes (espontáneos o inducidos por productos químicos o radiación) y/o por tecnología de ADN recombinante, por ejemplo, por expresión en exceso o inactivación, respectivamente, de genes que codifican para las enzimas o factores que regulan estos genes.
En una célula hospedadora preferida, la modificación genética comprende la expresión en exceso de al menos una enzima de la (parte no oxidativa) de la vía de la pentosa fosfato. Preferentemente, la enzima se selecciona del grupo que consiste en las enzimas que codifican ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa. Pueden expresarse en exceso diversas combinaciones de las enzimas de la (parte no oxidativa) vía de la pentosa fosfato. Por ejemplo, las enzimas que se expresan en exceso pueden ser al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y ribulosa-5-fosfato epimerasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transcetolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa5-fosfato epimerasa y transcetolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato epimerasa y transaldolasa; o al menos las enzimas transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa y transcetolasa. En una realización de la invención, cada una de las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa se expresan en exceso en la célula hospedadora. Se prefiere más una célula hospedadora en la que la modificación genética comprenda al menos la expresión en exceso de ambas enzimas transcetolasa y transaldolasa de modo que una célula hospedadora ya sea capaz de crecimiento anaerobio sobre xilosa. En realidad, en algunas condiciones, las células hospedadoras que expresan en exceso solo la transcetolasa y la transaldolasa ya tienen la misma tasa de crecimiento anaerobio sobre xilosa que las células hospedadoras que expresan en exceso las cuatro enzimas, es decir, la ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa. Además, se prefieren las células hospedadoras que expresan en exceso ambas enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y ribulosa-5-fosfato epimerasa con respecto a las células hospedadoras que expresan en exceso solo la isomerasa o solo la epimerasa ya que la expresión en exceso de solo una de estas enzimas puede producir desequilibrios metabólicos.
La enzima "ribulosa 5-fosfato epimerasa" (EC 5.1.3.1) se define en el presente documento como una enzima que cataliza la epimerización de D-xilulosa 5-fosfato a D-ribulosa 5-fosfato y viceversa. La enzima también se conoce como fosforribulosa epimerasa; eritrosa-4-fosfato isomerasa; fosfocetopentosa 3-epimerasa; xilulosa fosfato 3epimerasa; fosfocetopentosa epimerasa; ribulosa 5-fosfato 3-epimerasa; D-ribulosa fosfato-3-epimerasa; D-ribulosa 5-fosfato epimerasa; D-ribulosa-5-P 3-epimerasa; D-xilulosa-5-fosfato 3-epimerasa; pentosa-5-fosfato 3-epimerasa; o D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa. Una ribulosa 5-fosfato epimerasa también puede definirse además por su
secuencia de aminoácidos. Asimismo, una ribulosa 5-fosfato epimerasa puede definirse por una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, además de por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una ribulosa 5-fosfato epimerasa. La secuencia de nucleótidos que codifica ribulosa 5-fosfato epimerasa se designa en el presente documento RPE1.
La enzima "ribulosa 5-fosfato isomerasa" (EC 5.3.1.6) se define en el presente documento como una enzima que cataliza la isomerización directa de D-ribosa 5-fosfato en D-ribulosa 5-fosfato y viceversa. La enzima también se conoce como fosfopentosisomerasa; fosforriboisomerasa; ribosa fosfato isomerasa; 5-fosforribosa isomerasa; Dribosa 5-fosfato isomerasa; D-ribosa-5-fosfato cetol-isomerasa; o D-ribosa-5-fosfato aldosa-cetosa-isomerasa. Una ribulosa 5-fosfato isomerasa también puede definirse por su secuencia de aminoácidos. Asimismo, una ribulosa 5fosfato isomerasa puede definirse por una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, además de por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una ribulosa 5fosfato isomerasa. La secuencia de nucleótidos que codifica ribulosa 5-fosfato isomerasa se designa en el presente documento RKI1.
La enzima "transcetolasa" (EC 2.2.1.1) se define en el presente documento como una enzima que cataliza la reacción: D-ribosa 5-fosfato + D-xilulosa 5-fosfato <-> sedoheptulosa 7-fosfato + D-gliceraldehído 3-fosfato y viceversa. La enzima también se conoce como glicolaldehídotransferasa o sedoheptulosa-7-fosfato:D-gliceraldehído3-fosfato glicolaldehídotransferasa. Una transcetolasa también puede definirse por su aminoácido. Asimismo, una transcetolasa puede definirse por una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, además de por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una transcetolasa. La secuencia de nucleótidos que codifica transcetolasa se designa en el presente documento TKL1.
La enzima "transaldolasa" (EC 2.2.1.2) se define en el presente documento como una enzima que cataliza la reacción: sedoheptulosa 7-fosfato + D-gliceraldehído 3-fosfato <-> D-eritrosa 4-fosfato + D-fructosa 6-fosfato y viceversa. La enzima también se conoce como dihidroxiacetonatransferasa; dihidroxiacetona sintasa; formaldehído transcetolasa; o sedoheptulosa-7-fosfato: D-gliceraldehído-3-fosfato glicerina transferasa. Una transaldolasa también puede definirse por su secuencia de aminoácidos. Asimismo, una transaldolasa puede definirse por una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, además de por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una transaldolasa. La secuencia de nucleótidos que codifica transcetolasa se designa en el presente documento TAL1.
Genes de xilosa isomerasa o xilosa reductasa
Según la invención, se introducen una o más copias de uno o más genes de xilosa isomerasa y/o uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa en el genoma de la célula hospedadora. La presencia de estos elementos genéticos confiere a la célula la capacidad de convertir xilosa por isomerización o reducción.
En una realización, las una o más copias de uno o más genes de xilosa isomerasa se introducen en el genoma de la célula hospedadora.
Una "xilosa isomerasa" (EC 5.3.1.5) se define en el presente documento como una enzima que cataliza la isomerización directa de D-xilosa en D-xilulosa y/o viceversa. La enzima también se conoce como una D-xilosa cetoisomerasa. Una xilosa isomerasa en el presente documento también puede ser capaz de catalizar la conversión de D-glucosa y D-fructosa (y, por consiguiente, puede, por tanto, denominarse una glucosa isomerasa). Una xilosa isomerasa en el presente documento puede requerir un catión bivalente, tal como magnesio, manganeso o cobalto como cofactor.
Por consiguiente, una célula hospedadora transformada tal es capaz de isomerizar xilosa en xilulosa. La capacidad de isomerizar xilosa en xilulosa se confiere a la célula hospedadora por la transformación de la célula hospedadora con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una xilosa isomerasa definida. Una célula hospedadora transformada isomeriza xilosa en xilulosa por la isomerización directa de xilosa en xilulosa.
Una unidad (U) de actividad de xilosa isomerasa puede definirse en el presente documento como la cantidad de enzima que produce 1 nmol de xilulosa por minuto, en condiciones como se describieron en Kuyper et al. (2003, FEMS Yeast Res. 4: 69-78).
El gen de xilosa isomerasa puede tener diversos orígenes, tales como, por ejemplo, de Piromyces sp. como se desvela en el documento WO2006/009434. Otros orígenes adecuados son Bacteroides, en particular Bacteroides uniformis como se describe en el documento PCT/EP2009/52623, Bacillus, en particular Bacillus stearothermophilus como se describe en el documento PCT/EP2009/052625.
En otra realización, una o más copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa se introducen en el genoma de la célula hospedadora. En esta realización, la conversión de xilosa se realiza en una conversión de dos etapas de xilosa en xilulosa a través de un producto intermedio de xilitol como se cataliza por xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, respectivamente. En una realización de la misma, pueden expresarse en exceso xilosa reductasa (XR), xilitol deshidrogenasa (XDH) y xilocinasa (XK), y opcionalmente se regulan por incremento uno o
más de genes que codifican enzimas productoras de NADPH y se regulan por incremento uno o más de los genes que codifican enzimas consumidoras de NADH, como se desvela en el documento WO 2004085627.
Gen XKS1
Una célula hospedadora transformada puede comprender una o más modificaciones genéticas que aumentan la actividad específica de xilulosa cinasa. Preferentemente, la modificación o modificaciones genéticas producen la expresión en exceso de una xilulosa cinasa, por ejemplo mediante expresión en exceso de una secuencia de nucleótidos que codifica una xilulosa cinasa. El gen que codifica la xilulosa cinasa puede ser endógeno a la célula hospedadora o puede ser una xilulosa cinasa que es heteróloga a la célula hospedadora. Una secuencia de nucleótidos usada para la expresión en exceso de xilulosa cinasa en la célula hospedadora es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de xilulosa cinasa.
La enzima "xilulosa cinasa" (EC 2.7.1.17) se define en el presente documento como una enzima que cataliza la reacción ATP + D-xilulosa = ADP + D-xilulosa 5-fosfato. La enzima también se conoce como una xilulocinasa fosforilante, D-xilulocinasa o ATP:D-xilulosa 5-fosfotransferasa. Una xilulosa cinasa de la invención también puede definirse por su secuencia de aminoácidos. Asimismo, una xilulosa cinasa puede definirse por una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, además de por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una xilulosa cinasa.
En una célula hospedadora transformada, puede combinarse una modificación o modificaciones genéticas que aumenta(n) la actividad específica de xilulosa cinasa con cualquiera de las modificaciones que aumentan el flujo de la vía de la pentosa fosfato como se describió anteriormente. Esto no es, sin embargo, esencial.
Así, una célula hospedadora puede comprender solo una modificación o modificaciones genéticas que aumentan la actividad específica de xilulosa cinasa. Los diversos medios disponibles en la materia para conseguir y analizar la expresión en exceso de una xilulosa cinasa en las células hospedadoras de la invención son los mismos que se describieron anteriormente para enzimas de la vía de la pentosa fosfato. Preferentemente, en las células hospedadoras de la invención, una xilulosa cinasa que va a expresarse en exceso se expresa en exceso al menos un factor de aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la(s) modificación (modificaciones) genética(s) que causan la expresión en exceso. Debe entenderse que estos niveles de expresión en exceso pueden aplicarse al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima, al nivel de estado estacionario de la proteína de la enzima, además de al nivel de estado estacionario del transcrito que codifica la enzima.
Deleción del gen de aldosa reductasa (GRE3)
En una realización, donde XI se usa como gen para convertir xilosa, puede ser ventajoso reducir la actividad de aldosa reductasa. Una célula hospedadora transformada puede, por tanto, comprender una o más modificaciones genéticas que reduzcan la actividad inespecífica de aldosa reductasa en la célula hospedadora. Preferentemente, la actividad inespecífica de aldosa reductasa se reduce en la célula hospedadora mediante una o más modificaciones genéticas que reducen la expresión o inactivan un gen que codifica una aldosa reductasa inespecífica. Preferentemente, la(s) modificación (modificaciones) genética(s) reducen o inactiva la expresión de cada copia endógena de un gen que codifica una aldosa reductasa inespecífica en la célula hospedadora (denominada en el presente documento deleción de GRE3). Las células hospedadoras transformadas pueden comprender múltiples copias de genes que codifican aldosas reductasas inespecíficas como resultado de di-, poli-o aneuploidía, y/o la célula hospedadora puede contener varias (iso)enzimas diferentes con actividad de aldosa reductasa que se diferencian en la secuencia de aminoácidos y que son cada una codificadas por un gen diferente. También en dichas casos se reduce o inactiva preferentemente la expresión de cada gen que codifica una aldosa reductasa inespecífica. Preferentemente, el gen se inactiva mediante deleción de al menos parte del gen o mediante interrupción del gen, por lo que en este contexto el término gen también incluye cualquier secuencia no codificante en la dirección 5' o 3' de la secuencia codificante, cuya deleción (parcial) o inactivación produce una reducción de la expresión de la actividad inespecífica de aldosa reductasa en la célula hospedadora.
Una secuencia de nucleótidos que codifica una aldosa reductasa cuya actividad va a reducirse en la célula hospedadora es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de aldosa reductasa.
Así, una célula hospedadora que comprende solo una modificación o modificaciones genéticas que reduzca(n) la actividad inespecífica de aldosa reductasa en la célula hospedadora está especialmente incluida en la invención.
La enzima "aldosa reductasa" (EC 1.1.1.21) se define en el presente documento como una enzima que es capaz de reducir xilosa o xilulosa a xilitol. En el contexto de la presente invención, una aldosa reductasa puede ser cualquier aldosa reductasa inespecífica que sea nativa (endógena) a una célula hospedadora de la invención y que sea capaz de reducir xilosa o xilulosa a xilitol. Las aldosa reductasas inespecíficas catalizan la reacción:
aldosa + NAD(P)H + H+ ↔ alditol + NAD(P)+
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La enzima tiene una amplia especificidad y también se conoce como aldosa reductasa; poliol deshidrogenasa (NADP+); alditol:NADP oxidorreductasa; alditol:NADP+ 1-oxidorreductasa; NADPH-aldopentosa reductasa; o NADPH-aldosa reductasa.
Un ejemplo particular de una aldosa reductasa inespecífica tal que es endógena a S. cerevisiae y que está codificada por el gen GRE3 (Traff et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 5668-74). Así, una aldosa reductasa de la invención también puede definirse por su secuencia de aminoácidos. Asimismo, una aldosa reductasa puede definirse por la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, además de por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una aldosa reductasa.
Producción de bioproductos
A lo largo de los años se han hecho sugerencias para la introducción de diversos organismos para la producción de bioetanol a partir de azúcares de cultivo. En la práctica, sin embargo, todos los procesos de bioproducción de etanol han continuado usando las levaduras del género Saccharomyces como productor de etanol. Esto es debido a las muchas características atractivas de las especies de Saccharomyces para los procesos industriales, es decir, una alta capacidad de crecimiento anaerobio con tolerancia a ácido, etanol y osmolaridad, y, por supuesto, su alta capacidad fermentativa alcohólica. Las especies de levadura preferidas como células hospedadoras incluyen S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus o K. fragilis.
Una célula hospedadora transformada puede ser una célula adecuada para la producción de etanol. Una célula hospedadora transformada puede, sin embargo, ser adecuada para la producción de productos de fermentación distintos de etanol
Tales productos de fermentación no etanólicos incluyen en principio cualquier producto químico a granel o refinado que pueda ser producido mediante un microorganismo eucariota tal como una levadura o un hongo filamentoso.
Una célula hospedadora transformada que puede usarse para la producción de productos de fermentación no etanólicos es una célula hospedadora que contiene una modificación genética que produjo una actividad de alcohol deshidrogenasa reducida.
En una realización, la célula hospedadora transformada puede usarse en un proceso en el que los azúcares que se originan a partir de lignocelulosa se convierten en etanol.
Lignocelulosa
La lignocelulosa, que puede considerarse como una materia prima potencialmente renovable, generalmente comprende los polisacáridos celulosa (glucanos) y hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos). Además, algo de la hemicelulosa puede estar presente como glucomananos, por ejemplo en materias primas derivadas de madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos en azúcares solubles, que incluyen tanto monómeros como multímeros, por ejemplo glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, manosa, ramnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico y otras hexosas y pentosas, se produce bajo la acción de diferentes enzimas que actúan en concierto.
Además, pectinas y otras sustancias pécticas tales como arabinanos pueden constituir una proporción considerable de la masa seca de paredes celulares típicas de tejidos vegetales distintos de madera (aproximadamente entre un cuarto y la mitad de la masa seca puede ser pectinas).
Pretratamiento
Antes del tratamiento enzimático, el material lignocelulósico puede ser pretratado. El pretratamiento puede comprender exponer el material lignocelulósico a un ácido, una base, un disolvente, calor, un peróxido, ozono, ruptura mecánica, trituración, molienda o despresurización rápida, o una combinación de dos o más cualquiera de los mismos. Este pretratamiento químico se combina frecuentemente con pretratamiento con calor, por ejemplo entre 150-220 ºC durante 1 a 30 minutos.
Hidrólisis enzimática
El material pretratado comúnmente se somete a hidrólisis enzimática para liberar los azúcares que pueden ser fermentados según la invención. Esto se puede llevar a cabo con métodos convencionales, por ejemplo poniendo en contacto con celulasas, por ejemplo celobiohidrolasa(s), endoglucanasa(s), beta-glucosidasa(s) y opcionalmente otras enzimas. La conversión con las celulasas puede llevarse a cabo a temperatura ambiente o a temperaturas más altas, a un tiempo de reacción para liberar cantidades suficientes de azúcar(es). El resultado de la hidrólisis enzimática es un producto de hidrólisis que comprende azúcares C5/C6, designados en el presente documento como la composición de azúcares.
Fermentación
El proceso de fermentación puede ser un proceso de fermentación aerobio o anaerobio. Un proceso de fermentación anaerobio se define en el presente documento como un proceso de fermentación realizado en ausencia de oxígeno
o en el que sustancialmente no se consume oxígeno, preferentemente se consume menos de aproximadamente 5, aproximadamente 2,5 o aproximadamente 1 mmol/l/h, más preferentemente 0 mmol/l/h (es decir, el consumo de oxígeno no es detectable), y en el que las moléculas orgánicas sirven tanto de donante de electrones como de aceptores de electrones. En ausencia de oxígeno, el NADH producido en la glicolisis y formación de biomasa no puede ser oxidado mediante la fosforilación oxidativa. Para resolver este problema, muchos microorganismos usan piruvato o uno de sus derivados como aceptor de electrones y de hidrógeno, regenerando así NAD+.
Así, en un proceso de fermentación anaerobio preferido se usa piruvato como aceptor de electrones (y de hidrógeno) y se reduce a productos de fermentación tales como etanol, butanol, ácido láctico, di-terpeno, di-terpeno glucosilado, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, un aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, un antibiótico β-lactámico y una cefalosporina.
El proceso de fermentación se realiza preferentemente a una temperatura que es óptima para la célula. Así, para la mayoría de las células hospedadoras de levadura o fúngicas, el proceso de fermentación se realiza a una temperatura que es inferior a aproximadamente 42 ºC, preferentemente inferior a aproximadamente 38 ºC. Para células hospedadoras de levadura o de hongos filamentosos, el proceso de fermentación se realiza preferentemente a una temperatura que es inferior a aproximadamente 35, aproximadamente 33, aproximadamente 30 o aproximadamente 28 ºC y a una temperatura que es superior a aproximadamente 20, aproximadamente 22, o aproximadamente 25 ºC.
El rendimiento de etanol sobre xilosa y/o glucosa en el proceso es preferentemente de al menos aproximadamente el 50, aproximadamente el 60, aproximadamente el 70, aproximadamente el 80, aproximadamente el 90, aproximadamente el 95 o aproximadamente el 98 %. El rendimiento de etanol se define en el presente documento como un porcentaje del rendimiento teórico máximo.
La invención también se refiere a un proceso de producción de un producto de fermentación.
El proceso de fermentación según la presente invención puede realizarse en condiciones aerobias y anaerobias. En una realización, el proceso se lleva a cabo bajo condiciones microaerófilas o de oxígeno limitado.
Un proceso de fermentación anaerobio se define en el presente documento como un proceso de fermentación realizado en ausencia de oxígeno o en el que sustancialmente no se consume oxígeno, preferentemente menos de aproximadamente 5, aproximadamente 2,5 o aproximadamente 1 mmol/l/h, y en el que las moléculas orgánicas sirven de donante de electrones como de aceptores de electrones.
Un proceso de fermentación de oxígeno limitado es un proceso en el que el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno del gas al líquido. El grado de limitación de oxígeno se determina por la cantidad y composición del flujo de gas entrante, además de las propiedades de mezcla/transferencia de masa reales del equipo de fermentación usado. Preferentemente, en un proceso en condiciones de oxígeno limitado, la tasa de consumo de oxígeno es de al menos aproximadamente 5,5, más preferentemente al menos aproximadamente 6, tal como al menos 7 mmol/l/h. Un proceso de la invención puede comprender la recuperación del producto de fermentación.
En un proceso preferido, la célula fermenta tanto la xilosa como la glucosa, preferentemente simultáneamente, en cuyo caso preferentemente se usa una célula que no es sensible a la represión por glucosa para prevenir el crecimiento diaúxico. Además de una fuente de xilosa (y glucosa) como fuente de carbono, el medio de fermentación comprenderá además el componente apropiado requerido para el crecimiento de la célula. Composiciones de medio de fermentación para el crecimiento de microorganismos tales como levaduras son muy conocidas en la técnica.
Los procesos de fermentación pueden llevarse a cabo en modo discontinuo, de lotes alimentados o continuo. También puede aplicarse un proceso de hidrólisis y fermentación (SHF) separado o un proceso de sacarificación y fermentación (SSF) simultáneo. También es posible una combinación de estos modos de procesos de fermentación para una productividad óptima. Estos procesos se describen más adelante en más detalle.
Modo SSF
Para el modo de sacarificación y fermentación simultánea (SSF), el tiempo de reacción para la etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación depende del tiempo para lograr un rendimiento deseado, es decir, el rendimiento de conversión de celulosa a glucosa. Tal rendimiento es preferentemente tan alto como sea posible, preferentemente 60% o más, 65% o más, 70% o más, 75% o más 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más, 96%o más, 97%o más, 98%o más, 99%o más, incluso 99,5%o más o 99,9%o más.
Según la invención, se logran concentraciones de azúcar muy altas en el modo SHF y concentraciones de producto muy altas (por ejemplo, etanol) en el modo SSF. En la operación de SHF, la concentración de glucosa es 25 g/l o
más, 30 g/l o más, 35 g/l o más, 40 g/l o más, 45 g/l o más, 50 g/l o más, 55 g/l o más, 60 g/l o más, 65 g/l o más, 70 g/l o más, 75 g/l o más, 80 g/l o más, 85 g/l o más, 90 g/l o más, 95 g/l o más, 100 g/l o más, 110 g/l o más, 120 g/l o más o puede ser, por ejemplo, 25 g/l-250 g/l, 30 g/l-200 g/l, 40 g/l-200 g/l, 50 g/l-200 g/l, 60 g/l-200 g/l, 70 g/l-200 g/l, 80 g/l-200 g/l, 90 g/l, 80 g/l-200 g/l.
Concentración de producto en modo SSF
En la operación de SSF, la concentración de producto (g/l) depende de la cantidad de glucosa producida, pero esto no es visible debido a que los azúcares se convierten en producto en SSF, y las concentraciones de productos pueden relacionarse con la concentración de glucosa subyacente por multiplicación con el rendimiento máximo teórico (Yps máximo en g de producto por gramo de glucosa)
El rendimiento máximo teórico (Yps máximo en g de producto por gramo de glucosa) de un producto de fermentación puede derivar de textos de bioquímica. Para etanol, 1 mol de glucosa (180 gramos) da según la vía normal de fermentación por glicolisis en levadura 2 moles de etanol (= 2x46 = 92 g de etanol. El rendimiento máximo teórico de etanol en glucosa es, por tanto, 92/180 = 0,511 g de etanol/g de glucosa.
Para butanol (MW 74 g/mol) o isobutanol, el rendimiento teórico máximo es 1 mol de butanol por mol de glucosa. Así, el Yps máximo para (iso-)butanol = 74/180 = 0,411 g de (iso-)butanol/g de glucosa.
Para el ácido láctico, el rendimiento de fermentación para la fermentación homoláctica es 2 moles de ácido láctico (MW = 90 g/mol) por mol de glucosa. Según esta estequiometria, el Yps máximo = 1 g de ácido láctico/g de glucosa.
Para otros productos de fermentación puede hacerse un cálculo similar.
Modo SSF
En la operación SSF, la concentración de producto es 25 g * Yps g/l/l o más, 30 * Yps g/l o más, 35 g * Yps g/l o más, 40 * Yps g/l o más, 45 * Ypsg/l o más, 50 * Ypsg/l o más, 55 * Ypsg/l o más, 60 * Ypsg/l o más, 65 * Yps g/l o más, 70 * Yps g/l o más, 75 * Ypsg/l o más, 80 * Ypsg/l o más, 85 * Ypsg/l o más, 90 * Ypsg/l o más, 95 * Yps g/l o más, 100 * Yps g/l o más, 110 * Yps g/l o más, 120 g/l * Yps o más o pude ser, por ejemplo, 25 * Yps g/l-250 * Yps g/l, 30 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 40 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 50 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 60 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 70
* Yps g/l-200 * Yps g/l, 80 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 90 * Yps g/l, 80 * Yps g/l-200 * Yps g/l
Por consiguiente, la invención proporciona un método para la preparación de un producto de fermentación, método que comprende:
a.
degradar lignocelulosa usando un método como se describe en el presente documento; y
b.
fermentar el material resultante,
preparando así un producto de fermentación.
Producto de fermentación
El producto de fermentación de la invención puede ser cualquier producto útil. En una realización, es un producto seleccionado del grupo que consiste en etanol, n-butanol, isobutanol, ácido láctico, di-terpeno, di-terpeno glucosilado, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacónico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido adípico, un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptófano, treonina y ácido aspártico, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, un antibiótico β-lactámico y una cefalosporina, vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos para piensos para animales, especialidades químicas, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles, que incluyen biocombustibles y biogás o polímeros orgánicos, y una enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasa, una transferasa o una xilanasa. Por ejemplo, los productos de fermentación pueden ser producidos por células según la invención, siguiendo métodos de preparación de células del estado de la técnica y procesos de fermentación, cuyos ejemplos, sin embargo, no deben interpretarse como limitantes en el presente documento. Puede producirse n-butanol mediante células como se describe en los documentos WO2008121701 o WO2008086124; ácido láctico como se describe en los documentos US2011053231 o US2010137551; ácido 3hidroxipropiónico como se describe en el documento WO2010010291; ácido acrílico como se describe en el documento WO2009153047.
Recuperación del producto de fermentación
Para la recuperación del producto de fermentación se usan tecnologías existentes. Para diferentes productos de fermentación son apropiados diferentes procesos de recuperación. Los métodos existentes de recuperación de etanol de mezclas acuosas comúnmente usan técnicas de fraccionamiento y adsorción. Por ejemplo, todavía puede usarse una cerveza para procesar un producto fermentado, que contiene etanol en una mezcla acuosa, para producir una mezcla enriquecida que contiene etanol que luego se somete a fraccionamiento (por ejemplo, destilación fraccionada u otras técnicas similares). A continuación, las fracciones que contienen las concentraciones
de etanol más altas pueden pasarse a través de un adsorbente para eliminar la mayoría, sino toda el agua remanente del etanol.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención:
EJEMPLOS
MÉTODOS
Técnicas de biología molecular y productos químicos. Se adquirieron enzimas de restricción y T4 ADN ligasa de Fermentas. Los antibióticos higromicina (HG), fleomicina (fleo) y geneticina (G418) se adquirieron de Invivogen. Se adquirieron pYL16 y nourseotricina (nour) de Werner Bioagents. Se adquirieron ampicilina y kanamicina de Sigma-Aldrich.
Para las amplificaciones por PCR, se usó la ADN polimerasa Phusion® High-Fidelity (Finnzymes). Se subclonaron fragmentos de PCR usando el kit TOPO® TA Cloning® o el kit de clonación por PCR Zero Blunt® TOPO® (ambos de Life Technologies). Los oligonucleótidos usados para la construcción de cepas se compraron de Sigma-Aldrich.
Se amplificaron los plásmidos y se mantuvieron en células TOP10 químicamente competentes (kit TOPO® TA Cloning®, Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los plásmidos se aislaron de minicultivos de
E. coli usando el kit GeneJET™ Plasmide (Fermentas). Se aisló ADN genómico de levadura usando el kit de ADN genómico YeaStar™ (ZymoResearch) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se realizaron técnicas de biología molecular estándar y genética de levadura según libros de textos que incluyen Sambrook et al. (1989) y Ausubel et al. (1995).
Cepas y mantenimiento. Para el almacenamiento de las cepas usadas en este trabajo (Tabla 2), se realizaron cultivos en matraces oscilantes en medio rico (YP), que consiste en 10 g l-1 de extracto de levadura (Oxoid) y 20 g l-1 de peptona (BD Difco), complementado con tanto 2 % de glucosa (YPD), 2 % de maltosa (YPM), como 3 % de xilosa (YPX). Los cultivos se mantuvieron a 30 ºC en un agitador orbital hasta que los cultivos alcanzaron la fase de crecimiento estacionaria. Después de añadir glicerol al 30 % (v/v), las muestras de los cultivos de matraces con agitación se almacenaron en alícuotas de 2 ml a -80 ºC.
Tabla 2: Cepas usadas o preparadas en el presente documento
Cepa
Genotipo
RN1001
Mat a, ura3-52, leu2-112, gre3::loxP, loxP-Ptpi:TAL1, loxP-Ptpi::RKI1, loxP-Ptpi-TKL1, loxP-Ptpi-RPE1, delta::Padh1XKS1Tcyc1-LEU2, delta::URA3-Ptpi-xylA-Tcyc1
RN1014
RN1001 + manipulación in vivo sobre xilosa y ácido acético
RN1041
RN1001 his3::/oxP
RN1053
RN1041 hxt2::loxP-kanMX-loxP, hxt367::loxP-hphMX-loxP, hxt145::loxP-natMX-loxP, gal2::loxP-zeoMXloxP
YD01227
RN1014 glk1::lox72; hxk1::loxP; hxk2::lox72; gal1::loxP; his3::loxPnatMXloxP
DO600 y análisis de HPLC en cultivo en matraces oscilantes. Se muestrearon cultivos en matraces oscilantes regularmente durante el cultivo. Para mediciones de DO600, se diluyeron apropiadamente cultivos para la medición precisa y se midió la densidad óptica a 600 nm de longitud de onda en un instrumento Perkin Elmer Spectrophotometer λ2. Se filtró la muestra restante para separar el medio de levadura.
El filtrado se insertó en los viales apropiados para análisis de HPLC. Se determinaron las concentraciones de glucosa, xilosa, glicerol, ácido acético y etanol en el medio usando un sistema de HPLC Shimadzu. El sistema está equipado con horno de columna CTO-10A-vp y autoinyector SIL-10AD-vp con una precolumna (cartucho Bio-Rad H, Bio-Rad) y una columna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm; Bio-Rad). La elución tuvo lugar a 80 ºC con H2SO4 5 mM a 0,6 ml/min. El eluato se monitorizó usando un detector del índice de refracción RID-10A (Shimadzu).
Cultivo en placas de microtitulación para el perfilado de la curva de crecimiento. Para el cultivo de microtitulación de cepas, se usó Bioscreen C (Growth Curves Ltd.). Durante la noche, se sedimentaron los precultivos, se lavaron con agua desmineralizada y se diluyeron en agua desmineralizada a dos veces la DO600 deseada para la inoculación. Se preparó medio en dos veces la concentración según se deseara. En un pocillo de una placa de titulación en panal de abeja, se mezclaron 150 µl de medio con 150 µl de suspensión de células. Las mediciones se realizaron por triplicado. Se mantuvieron los parámetros para Bioscreen C a 30 ºC de T de incubación, mediciones cada 15 min, agitación en tipo Continuo, amplitud Máximo y velocidad Normal. La agitación se estableció para detenerse 5 s antes de la medición.
Transformación automatizada y recogida de colonias. Para la generación de la transformación de una biblioteca de mutagénesis de saturación en las cepas modelo, se realizaron cultivos en matraces con agitación en o bien YPM para RN1053 o YPX para YD01227 (véase más adelante). Se sedimentaron células de levadura y, posteriormente, se usaron en un protocolo de transformación automatizado basado en Schiestl y Gietz (1989). Se sembraron las 5 mezclas de transformación en medio de selección que consistía en base nitrogenada de levadura (Sigma-Aldrich; 6,7 g l-1), agar (BD Biosciences; 15 g l-1), complementado con o bien 2 % de maltosa (transformaciones de RN1053)
o 3 % de xilosa (transformaciones de YD01227). Las placas de transformación se incubaron a 30 ºC, y después de la formación de colonias, las colonias volvieron a sembrarse usando un proceso automatizado que transfirió colonias a placas de microtitulación de 96 pocillos (MTP) que contenían los medios de selección anteriormente citados. Se
10 incubaron MTP con transformantes a 30 ºC hasta que se observó el claro crecimiento.
Análisis de RMN. Para la cuantificación de glucosa, xilosa, glicerol, ácido acético y etanol en la muestra, se transfiere muestra de 100 µl con exactitud a un vial adecuado. Posteriormente se añadieron 100 µl de disolución de patrón interno, que contenía ácido maleico (20 g/l), EDTA (40 g/l) y cantidades traza de DSS (ácido 4,4-dimetil-4silapentano-1-sulfónico) en D2O, y 450 µl de D2O.
15 Se registran espectros de RMN 1H 1D en un Bruker Avance III 700 MHz, equipado con una criosonda, usando un programa de pulsos con supresión de agua (potencia correspondiente a 3 Hz) a una temperatura de 27 ºC.
Las concentraciones de analito se calculan basándose en las siguientes señales (δ con respecto a DSS):
 Pico de α-glucosa a 5,22 ppm (d, 0,38 H, J = 4 Hz),
 Pico de α-xilosa a 5,18 ppm (d, 0,37 H, J = 4 Hz),
20  Pico de glicerol a 3,55 ppm (dd, 2 H, J1,2 = 6 Hz y J1a,1b = 12 Hz)
 Pico de ácido acético a 1,91 ppm (s, 3 H)
 Pico de etanol a 1,17 ppm (t, 3 H, J = 7Hz)
 El usuario de señal para el patrón:
 Pico de ácido maleico a 6,05 ppm (s, 2H)
25 Ejemplo 1 – Deleciones de genes transportadores de hexosa
Construcción de casetes de deleción. Los cebadores usados en las construcciones de plásmido se muestran en la Tabla 3; se muestran los plásmidos generados en la Tabla 4. Se muestran esquemas con sitios de restricción usados para clonar y sitios usados para liberar construcciones de deleción del esqueleto de plásmido en la Tabla 5.
Tabla 3: Cebadores (oligonucleótidos) usados en los ejemplos
SEQ ID NO:
Código interno Cebador Secuencia (5'→ 3') Gen(es) Fin
2
5034 Kanf AAGCTTGCCTCGTCCCCGCC kanMX Amplificación kanMX
3
5035 Kanr GTCGACACTGGATGGCGGCG kanMX Amplificación kanMX
4
5116 If2 loxP Parte del flanco loxP
5
5118 Ir2 loxP Parte del flanco loxP
6
5115 If1 loxP Reamplificación / flanco de loxP completo
10
5117 Ir1 loxP Reamplificación / flanco de loxP completo
11
115 Natf ACATGTAAAATGACCACTCTTGACGACACGGC nat1 Amplificación nat1
SEQ ID NO:
Código interno Cebador Secuencia (5'→ 3') Gen(es) Fin
13
116 Natr CAGTACTAGGGGCCAGGGCATGCTC nat1 Amplificación nat1
14
28 H3f TGTACATCCGGAATTCTAGATTGGTGAGCGCTAGGAGTCACT GCC HIS3 -
16
29 H3r CTCGAGTATTTCACACCGCATATGATCCGTCG HIS3 -
17
201 Hx2uf GACTAGTACCGGTGTTTTCAAAACCTAGCAACCCC HXT2 Flanco en la dirección 5’
18
202 Hx2ur CGTACGCGTCTTCCGGAAGGGTACCATCAGATTTCATTTGAC C HXT2 Flanco en la dirección 5’
19
203 Hx2df GAAGACACTCGAGACGTCCTTTGTCTGTGAAACCAAGGGC HXT2 Flanco en la dirección 3’
20
204 Hx2dr GTCGACGGGCCCTTATGTTGGTCTTGTTTAGTATGGCCG HXT2 Flanco en la dirección 3’
21
205 Hx3uf AAGCGGCCGCACTAGTACCGGTGAAACAACTCAATAACGATG TGGGAC HXT3 Flanco en la dirección 5’
22
206 Hx3ur ATCCGGACGTCTTCCTCAAGAAATCAGTTTGGGCGACG HXT3 Flanco en la dirección 5’
23
210 Hx4df AGAAGACGCTCGAGACGTCCCTTATGGGAAGAAGGTGTTTTG CC HXT4 Flanco en la dirección 3’
24
211 Hx4dr ATGGATCCTAGGGGTTCTTGCAGAGTAAACTGCG HXT4 Flanco en la dirección 3’
25
212 Hx5uf AAGCGGCCGCACTAGTACATGTGAACTTGAAAACGCTCATCA AGGC HXT5 Flanco en la dirección 5’
26
213 Hx5ur TTCGTACGCGTCTTCCGGAGTAACATGAAACCAGAGTACCAC G HXT5 Flanco en la dirección 5’
27
229 Hx7df AGAAGACCCTCGAGACGTCCGACGCTGAAGAAATGACTCACG HXT7 Flanco en la dirección 3’
28
230 Hx7dr AGTCGACGGATCCGTAATTTTTCTTCTTTTAAGTGACGGGCG HXT7 Flanco en la dirección 3’
29
243 Gal2ufn AAGCGGCCGCACTAGTACCGGTGATCTATATTCGAAAGGGGC GG GAL2 Flanco en la dirección 5’
30
244 Gal2urn AACGTACGTCCGGATCATTAGAATACTTTTGAGATTGTGCGCT GAL2 Flanco en la dirección 5’
31
233 Ga2df AGAAGACCCTCGAGACGTCTTACCTTGGAAATCTGAAGGCTG G GAL2 Flanco en la dirección 3’
36
234 Ga2dr GTGGATCCTAGGTAAAACGGTACGAGAAAAGCTCCG GAL2 Flanco en la dirección 3’
42
281 Hx3inr2 GCTCTTTTCACGGAGAAATTCGGG HXT3-67 Comprobación de integración
43
289 Hx2inf TCTTCGGGAACTAGATAGGTGGC HXT2 Comprobación de integración
38
290 Hx2inr GAAGTAATCAGCCACAATACGCC HXT2 Comprobación de integración
39
299 Hx4inr2 CCATACTATTTGTCGACTCAAGCGC HXT5-14 Comprobación de integración
37
317 Hx5inf GGGTTAATTAGTTTTAGGGGCACGG HXT5-14 Comprobación de integración
SEQ ID NO:
Código interno Cebador Secuencia (5'→ 3') Gen(es) Fin
40
323 Hx7inr1 GATGAGAATCCTTGGCAACCGC HXT3-67 Comprobación de integración
41
324 Ga2inf1 TCAATTCGGAAAGCTTCCTTCCGG GAL2 Comprobación de integración
44
325 Ga2inr1 CAGTGATAGTTTGGTTCGAGCGG GAL2 Comprobación de integración
45
838 Glk1psuc227f GLK1 Flanco de hexocinasa / casete bipartito
46
834 Hxk2psuc227f HXK2 Flanco de hexocinasa / casete bipartito
47
645 pSUC22 7r GCAATTTCGGCTATACGTAAC Casete bipartito
48
839 Glk1psuc225r GLK1 Flanco de hexocinasa / casete bipartito
49
835 Hxk2psuc225r HXK2 Flanco de hexocinasa/casete bipartito
50
646 pSUC22 5f CGTTCACTCATGGAAAATAGC Casete bipartito
51
846 Hxk1_lox P_f HXK1 Flanco de hexocinasa / casete de DRM
52
847 Hxk1_lox P_r HXK1 Flanco de hexocinasa / casete de DRM
53
848 Gal1_lox P_f GAL1 Flanco de hexocinasa / casete de DRM
54
849 Gal1_lox P_r GAL1 Flanco de hexocinasa /casete de DRM
Tabla 4: Plásmidos usados en la construcción de cepas
Número
Construcción Fin SEQ ID NO:
pRN201
pCR-BLUNT-loxP-kanMX-loxP Marcador de resistencia dominante 8
pRN251
pCR-BLUNT-loxP-hphMX-loxP Marcador de resistencia dominante 9
pRN365
pCR-BLUNT-loxP-natMX-loxP Marcador de resistencia dominante 10
pRN447
pCR-BLUNT-loxP-zeoMX-loxP Marcador de resistencia dominante 14
pRN247
pCR-BLUNT-his3:loxP-kanMX-loxP Construcción de deleción de HIS3 16
pRN485
pCR-BLUNT-gal2:loxP-zeoMX-loxP Construcción de deleción de GAL2 33
pRN566
pCR-BLUNT-hxt367:loxP-hphMXloxP Construcción de deleción de la agrupación HXT3-HXT6-HXT7 34
Número
Construcción Fin SEQ ID NO:
pRN569
pCR-BLUNT-hxt514:loxP-natMXloxP Construcción de deleción de la agrupación HXT5-HXT1-HXT4 35
pRN635
pCR-BLUNT-hxt2:loxP-kanMX-loxP Construcción de deleción de HXT2 36
pRN993
pRN978-PHXT7(-491)-GAL2-TADH1 Vector de expresión de GAL2 58
pDB1250
pRN978-PHXT7(-491)-synt.wt-GAL2-TADH1 Vector de expresión de GAL2 no mutada sintética 59
pRN187
pCRE-zeoMX (basado en pSH65) Vector de expresión de CRE recombinasa 60
pRN486
pCR-BLUNT-HIS3::loxPnatMXloxP Construcción de deleción de HIS3 61
Tabla 5: Esquema de clonación
Construcción
Fragmento Sitios de clonación Sitio de liberación
pRN247
HIS3 en la dirección 5’ SacI-DraI XhoI-BsrGI
loxP-kanMX-loxP
StuI-BsiWI
HIS3 en la dirección 3’
BsiWI-ApaI
pRN485
GAL2 en la dirección 5’ NotI-BsiWI BamHI-SpeI-PmlI
loxP-zeoMX-loxP
BsiWI-XhoI
GAL2 en la dirección 3’
XhoI-BamHI
pRN566
HXT3 en la dirección 5’ SpeI-BsiWI BamHI-AgeI-NaeI
loxP-hphMX-loxP
BsiWI-XhoI
HXT7 en la dirección 3’
XhoI-BamHI
pRN569
HXT5 en la dirección 5’ NotI-BspEI BamHI-NotI-ApaLI
loxP-natMX-loxP
BspEI-XhoI
HXT4 en la dirección 3’
XhoI-BamHI
pRN635
HXT2 en la dirección 5’ SpeI-BsiWI AgeI-NotI-BspHI
loxP-kanMX-loxP
BsiWI-XhoI
HXT2 en la dirección 3’
XhoI-EcoRI
Se amplificó el marcador kanMX del plásmido pFA6-kanMX4 (http://www-sequence.stanford.edu/group/yeast
5 deletion project/kanmx4.txt) usando cebadores de SEQ ID NO 1 y 2. Posteriormente, el marcador kanMX se flanqueó mediante la adición de flancos de loxP por amplificación por PCR con cebadores de SEQ ID NO 3 y 4. La reamplificación se hizo con cebadores SEQ ID NO 5 y 6. El fragmento loxP-kanMX-loxP resultante se clonó en pCR-BLUNT produciendo pRN201 (SEQ ID NO: 7).
Para la construcción de pRN251 (SEQ ID NO: 8), se aisló hphMX de pGRE3:hphMX (Kuyper et al, 2005). Para
10 delecionar un MluI como sitio de restricción apropiado en la proximidad de hphMX, se cortó pGRE3:hphMX con Eco32I y se re-ligó. Posteriormente, se clonó hphMX como el fragmento XhoI-MluI en pRN201 digerido con SalI y MluI para sustituir kanMX.
Para la construcción de pRN365 (SEQ ID NO: 9), se amplificó por PCR el gen nat1 de Streptomyces noursei a partir de pYL16 (Werner Bioagents) usando cebadores con SEQ ID NO: 10 y -11. Se clonaron el fragmento PscI-ScaI nat1
15 junto con el fragmento Acc65I-NcoI pRN201 en pRN201, ya linealizado con Acc65I y ScaI, con el fin de sustituir kanR por nat1.
Para la construcción de pRN447 (SEQ ID NO: 12), se digirió pRN201 con PmlI. Esto sirvió a dos fines. En primer lugar, se aisló el ORF ble de Streptoalloteichus hindustanus (gen de resistencia a zeocina o fleomicina), y en segundo lugar, después de la re-ligación de pRN201 digerido con PmlI se delecionó un sitio NcoI. Posteriormente, se clonaron ble como fragmento de NcoI-PmlI y parte de pRN201 como fragmento del vector BamHI-NcoI en pRN201 re-ligado (falta ble), se digirió con BamHI y ScaI produciendo pRN447.
Para la primera construcción de deleción de HIS3, se usaron los cebadores SEQ ID13 y -14 para amplificar el locus HIS3 de ADN genómico de levadura. Los sitios usados para cortar los flancos de HIS3 y para ligar éstos al marcador kanMX flanqueado por loxP se muestran en la Tabla 5. El producto de ligación se digirió con Sacl y ApaI y se clonó en pCR-BLUNT digerido con Sacl y ApaI. El plásmido resultante es pRN247 (SEQ ID NO: 15).
Para la deleción de los ocho transportadores de hexosa principales (HXT1-7 y GAL2) en S. cerevisiae, se generaron cuatro construcciones de deleción (véase la Tabla 4). Cada construcción de deleción contuvo un marcador de resistencia dominante flanqueado por loxP diferente. Para cada gen HXT se amplificaron flancos de 400-700 pb usando los cebadores enumerados en la Tabla 3 (SEQ ID NO: 16-31) usando ADN genómico de RN1001 como molde. Se ligaron el flanco en la dirección 5’, el marcador de resistencia dominante y el marcador en la dirección 3’ usando los fragmentos y los sitios de clonación enumerados abajo en la Tabla 5. Las ligaciones se amplificaron usando los cebadores directos de los flancos en la dirección 5’ y el cebador inverso de los flancos en la dirección 3’ (combinaciones de cebador SEQ ID NO: 16+19, SEQ ID NO: 20+27, SEQ ID NO: 24+23 y SEQ ID NO: 28+31). Los fragmentos de PCR fusionados se clonaron en pCR-BLUNT para obtener pRN485, pRN566, pRN569, pRN635 (SEQ ID NO: 32-35, respectivamente). Para obtener altos rendimiento de ADN de plásmido, los plásmidos se aislaron de cultivos de E. coli de 50 ml usando NucleoBond® Xtra Midi kit (Bioké, Leiden, Los Países Bajos). Antes de la transformación en levadura, se liberaron construcciones de deleción del esqueleto de plásmido por digestión con los sitios de restricción de liberación enumerados en la Tabla 5.
Construcción de cepas. Se hizo auxótrofa a histidina la cepa fermentadora de xilosa RN1001 por la inserción de loxP-kanMX-loxP (liberado de pRN247; SEQ NO ID15) en el locus HIS3. Posteriormente, el marcador se eliminó mediante expresión transitoria del plásmido pRN187 (derivado de pSH65 que expresa cre recombinasa inducible por galactosa; SEQ ID NO 60). Se seleccionó la introducción de pRN187 en fleo y se indujo la expresión de CRE recombinasa en medio YP complementado con galactosa. La cepa his3:loxP resultante se llamó RN1041. Los transportadores de hexosa se delecionaron en el siguiente orden: 1) agrupación HXT3-HXT6-HXT7, 2) agrupación HXT5-HXT1-HXT4, 3) GAL2, 4) HXT2. Las construcciones de deleción se linealizaron o liberaron del esqueleto de plásmido cortando con las combinaciones de enzimas enumeradas en la Tabla 5 y éstas se integraron en el genoma de RN1041. Todas las transformaciones se sembraron en placa en medio de extracto de levadura (10 g/l), peptona (20 g/l) y agar (15 g/l) complementado con 20 g/l de maltosa. La maltosa se añadió al medio, debido a que la captación de este disacárido va mediante un sistema de transporte alternativo al sistema de transporte de la glucosa (Wieczorke et al, 1999). Con cada deleción de una (agrupación de) gen(es) HXT, se insertó un marcador adicional en el orden: 1) hphMX, 2) natMX, 3) zeoMX, 4) kanMX. Con cada marcador adicional insertado, el antibiótico respectivo se complementó adicionalmente al medio en el siguiente orden: 1) HG, 2) HG y nour, 3) HG, nour y fleo, 4) HG, nour, fleo y G418. Después de la integración de las cuatro construcciones de deleción, se aisló una única colonia bajo selección de los cuatro antibióticos. Se verificaron las correctas integraciones por análisis por PCR en cepas aisladas de ADN genómico. Se usaron cebadores fuera del sitio de integración (combinaciones SEQ ID NO: 36+37, SEQ ID NO: 38+39, SEQ ID NO: 40+41, SEQ ID NO: 42+43; secuencias enumeradas en la Tabla 3).
Caracterización de cepas. Para caracterizar las cepas transportadoras de hexosa (intermedias), se realizaron cultivos en matraces oscilantes. Se inocularon cultivos a DO600=0,1. La cepa resultante, RN1053 (Δhxt1-7; gal2mutante RN1041; véase la Tabla 2 para el genotipo exacto), mostró un patrón de crecimiento retardado sobre Verduyn-urea (medio mineral según Verduyn usando urea como fuente de nitrógeno; Luttik et al, 2001) complementado con 0,2 g l-1 de histidina (Sigma-Aldrich; Verduyn-urea-his; para complementar la auxotrofía de histidina) y 15 g l-1 de glucosa y 20 g l-1 de xilosa solo a partir de cultivar lentamente sobre glucosa solo después de 60 horas; de forma interesante, cuando la glucosa estuvo presente en el medio xilosa se acabó también después de 150 h (Figura 1), que indica que uno o más de los genes transportadores de hexosa crípticos (HXT8-17) se indujo sobre glucosa y facilitó el transporte de xilosa (Figura 1). Sin embargo, sobre xilosa como única fuente de carbono, RN1053 no creció sobre Verduyn-urea (+ 20 g l-1 % de xilosa durante el periodo de cultivo (Figura 2) que indica que la cepa es útil como cepa modelo para probar los transportadores de xilosa putativos. RN10153 se mantuvo adicionalmente sobre YPM.
Ejemplo 2 – Deleciones de genes hexocinasa
Construcción de casetes de deleción. Para la deleción de genes hexocinasa se diseñaron oligonucleótidos (SEQ ID NO: en la Tabla 3) que comprendían secuencias flanqueantes de 60 nucleótidos homólogas al locus del gen hexocinasa y 20 nucleótidos homólogas a un casete de marcador de resistencia dominante flanqueado por loxP. Los oligonucleótidos se usaron para amplificar las construcciones de deleción. Productos de PCR posteriores se purificaron en filtro en columna (Fermentas GeneJet Kit) y se usaron para experimentos de transformaciones. Se usaron tres tipos de casetes de deleción: en primer lugar, para las deleciones GLK1 y HXK2 se usó un sistema bipartito. Un fragmento consistió en un sitio lox66, KanMX, promotor GAL1 en la dirección 5’ de CRE, y la parte 5' de
CRE (CRE1) se amplificó de pSUC227 con un cebador específico de gen (SEQ ID NO: 44 para GLK1 y SEQ ID NO: 45 para HXK2) y un cebador específico de pSUC227 (SEQ ID NO: 46); el segundo fragmento consistió en la parte 3' de CRE (CRE2) con solapamiento sobre CRE1, y un sitio lox71, amplificado de pSUC225 con nuevamente un cebador específico de gen (SEQ ID NO: 47 para GLK1 y SEQ ID48 para HXK2) y un cebador específico de pSUC225 de SEQ ID NO: 49. Mediante recombinación homóloga, los dos fragmentos se integran como lox66-kanMX-CRE-lox71 en el locus de hexocinasa (secuencias de pSUC225 y pSUC227 y método proporcionado en el documento PCT/EP2013/055047). En segundo lugar, para deleciones HXK1 (cebadores SEQ ID NO: 50-51) y GAL1 (cebadores de SEQ ID NO: 52-53), se amplificó un marcador de resistencia dominante (DRM) flanqueado por loxP con secuencias flanqueantes homólogas a la hexocinasa respectiva para sustituir la región codificante en el locus; como moldes para la amplificación por PCR del casete de DRM se usaron pRN774 (loxP-hphMX-loxP; SEQ ID NO: 54) y pRN775 (loxP-natMx-loxP; SEQ ID NO: 55), respectivamente. En tercer lugar, para la deleción HIS3 para permitir la complementación del fenotipo auxotrófico por plásmidos episómicos transportadores, se integró una construcción similar con flancos homólogos a HIS3 como se usó para generar RN1041 (RN1001-his3:loxP, en la familia de cepas RN1053; véase el Ejemplo 1 anterior). En este caso, la construcción poseyó natMX como marcador de resistencia dominante en lugar de kanMX (SEQ ID NO 61).
Construcción de cepas. Para la generación de una cepa incapaz del metabolismo hexosa, pero capaz del transporte de hexosa, se hicieron deleciones del gen hexocinasa en la cepa fermentadora de xilosa RN1014 (Tabla 2; Figura 3 para el esquema de deleción).
Como se mencionó, en el caso de GLK1 y HXK2, los casetes de rotura fueron bipartitos. Mediante recombinación homóloga, los dos fragmentos se integran como lox66-kanMX-CRE-lox71 en el locus de hexocinasa. La integración se seleccionó en YPD complementado con G418. Los casetes de rotura para HXK1 y GAL1 consistieron en un fragmento: ya sea loxP-natMX-loxP o loxP-hphMX-loxP, respectivamente. RN1014 se transformó con los productos de PCR purificados y se seleccionó la integración en el antibiótico apropiado. Adicionalmente, HIS3 se alteró con una construcción similar (SEQ ID NO: 61) usada para la generación de RN1053. En este caso, natMX fue el marcador de selección en lugar de kanMX.
Los genes se delecionaron en el siguiente orden: 1) GLK1, 2) HXK1, 3) GAL1, 4) HXK2 y 5) HIS3. Después de la deleción de GLK1 y HXK1, ambos marcadores se recircularon por recombinación mediada por Cre inducida por galactosa. Después de la deleción de HXK2, la cepa intermedia se mantuvo en medio rico que contenía xilosa (YPX). Después de la deleción de HIS3, se eliminaron los marcadores hphMX y kanMX integrados por recombinación de CRE inducida por galactosa. Para garantizar el crecimiento de la cepa, se añadieron 2 % de xilosa a YP 2 % de galactosa + nourseotricina (YPGX). La selección en nourseotricina garantizó el mantenimiento del marcador natMX en el locus HIS3 dejando un rasgo de selección que iba a usarse posiblemente después. Después del aislamiento de una sola colonia, la cepa se verificó para sus deleciones y el perfil de secuencia por PCR de colonias, y se llamó YD01227.
Caracterización de cepas. En experimentos en cultivos en matraces oscilantes aerobios usando Verduyn-urea-his, se caracterizó otra colonia con el mismo genotipo de inactivación (KO) de hexocinasa cuádruple (col 2) como YD01227 en un pre-cribado para su capacidad para consumir xilosa en ausencia y presencia de un exceso de glucosa (10 %), y para su capacidad para consumir glucosa (Figura 4). Los cultivos se inocularon a DO600=0,1. Tanto RN1014 como KO de hexocinasa cuádruple son capaces de crecer y consumir xilosa (datos no mostrados). Y, como era de esperar, el KO de hexocinasa cuádruple ni crece ni consume glucosa, mientras que RN1014 sí (datos no mostrados). Además, el exceso de glucosa (10 %) previene el crecimiento y consumo de xilosa durante al menos 96 horas, mientras que RN1014 utiliza xilosa (Figura 4).
En experimentos de Bioscreen C, YD01227 y la col 2 anteriormente mencionada se cribaron para crecimiento sobre Verduyn-urea-his complementado con diferentes azúcares y mezclas de azúcar. Los cultivos se inocularon a DO600=0,05. YD01227 se cultivó sobre xilosa, pero no fue capaz de crecer sobre glucosa, maltosa o galactosa (datos no mostrados). Se cribaron mezclas de glucosa-xilosa para soportar una elección de composición de medio adecuada para el cribado para transportadores específicos de pentosa. Como se observa en la Figura 5, con una relación de glucosa: xilosa de 5:1 se mostró la inhibición del crecimiento óptima sobre xilosa para la cepa YD01227. Esto fue el caso para tanto una carga alta de azúcar (10:2), como para una carga baja (2,5: 0,5). YD01227 se mantuvo adicionalmente sobre YPX para almacenamiento y manipulación.
Ejemplo 3. Biblioteca de mutagénesis de saturación de GAL2 y otras construcciones.
Se ordenó una construcción de ADN sintética para GAL2 no mutada (WT) en GeneArt (SEQ ID NO: 56; Invitrogen) y se usó como molde para la mutagénesis dirigida al sitio. La construcción de ADN de GAL2 WT sintética se clonó en pRN993 (SEQ ID NO: 57) como fragmento XbaI-BssHII intercambiando la construcción de GAL2 WT sintética por otro ORF para generar pDB1250 (SEQ ID NO: 58). pDB1250 es un vector de levadura lanzadera basado en pRS313, que lleva como las principales características prominentes, además de ORF de GAL2 sintéticamente preparado: 1) un casete de expresión de HIS3 para complementar la auxotrofía a histidina, 2) un CEN.ARSH para mantener 1-2 copias (bajo número de copias) del vector de expresión en células de levadura, 3) promotor HXT7 truncado (-491 pb) que produce niveles de expresión medios de ORF en la dirección 3’, 4) terminador ADH1, y 5) gen de resistencia a ampicilina (ampr) para la selección en células TOP10 de E. coli (véase anteriormente) para fines
de clonación (Figura 6). Se ordenó la biblioteca de mutagénesis de saturación para al menos 13 cambios de aminoácidos no naturales en 30 posiciones de aminoácidos en Gal2p de Invitrogen Life Technologies. (http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cloning/gene-synthesis/directedevolution/GeneArt-Site-Saturation-Mutagenesis.html); para posiciones y cambios de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de Gal2p no mutada (SEQ ID NO: 59) véase la Tabla 6.
Tabla 6: Biblioteca de mutagénesis de saturación de un único sitio de GAL2 5
Gal2
N.º sitios
Posición AA WT Nº AA no wt AA no wt
1
85 F 15 A, C, D, E, G, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, V
2
89 T 18 A, C, D, E, F, H, I, K, l, M, N, P, Q, R, S, V, W, Y
3
187 V 17 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, Q, R, S, T, W, Y
4
191 A 19 C, D, E, F, G, H, K, L, M. N. P, Q, R, S, T, V, W, Y
5
214 Y 15 A, C, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W
6
215 Q 16 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, R, S, V, W, Y
7
218 I 15 A, C, D, E, G, H, K, L, M, N, R, S, T, V, W
8
219 T 15 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N P, Q, R, S, V, W
9
222 I 15 A, C, D, E, G, H, K, M, P, R, S, T, V, W, Y
10
226 Y 19 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W
11
338 Q 18 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, R, S, T, V, W, Y
12
339 M 19 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
13
341 Q 13 D, E, H, I. K, L, M, N, R, S, T, V, Y
14
342 Q 19 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, Y
15
343 L 19 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
16
346 N 19 A. C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, Y
17
347 N 13 A, D, E, G, H, I, K, L, Q, R, S, T, V
18
350 F 14 D, E, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, Y
19
373 G 19 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
20
376 N 18 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, Y
21
380 T 18 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, Y
22
383 S 17 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, Y
23
444 F 19 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
24
446 Y 13 D, E, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V
25
448 T 18 A, C, D, E, F,G, H, I. K, L, M, P, Q, R, S, V, W, Y
26
449 T 19 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, Y
27
451 A 18 C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
28
455 W 18 A. C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y
29
478 N 16 A, C, D, F, G, H, I, K, L, P, Q, R, V, W, Y
Gal2
N.º sitios
Posición AA WT Nº AA no wt AA no wt
30
479 W 18 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y
Se insertaron construcciones resultantes por clonación personalizada en GeneArt (Invitrogen, Regensburgo, Alemania) en pDB1250 (SEQ ID NO: ID58).
Ejemplo 4: Cribado de contador de la actividad de transporte de glucosa
Objetivo. Usando el cribado de contador de la actividad de transporte de glucosa (GTAC), es decir, transformación de la cepa mutante de hexocinasa YD01227 como hospedador para introducir variantes de GAL2 y cribado de los transformantes resultantes en medio para el crecimiento y consumo de xilosa en presencia de una cantidad 5 veces más alta de glucosa, pueden identificarse mutaciones que favorecen la xilosa anterior en presencia de un excedente de glucosa en la variante de Gal2p (es decir, afinidad por xilosa más alta que por la reducción de glucosa o más preferentemente eliminación completa de la capacidad de transporte de glucosa, mientras que se mantiene la capacidad de transporte de xilosa más o menos intacta).
Transformación y recogida de colonias. Se transformó YD01227 con un total de 497 construcciones, llevando cada una un mutante GAL2. Se incluyó una construcción con secuencia de GAL2 no mutada (pDB1250; SEQ ID NO: 58) como control. Para cada transformación, 3 colonias, cuando estuvieron disponibles, se volvieron a sembrar en MTP de medio agar ascendiendo a 1450 transformantes. Los 1450 transformantes se cribaron en tres partes. Para cada parte del cribado, se incluyó GAL2 no mutada como control.
Pre-cultivo y cribado. Para el pre-cultivo, se transfirieron transformantes por proceso automatizado de MTP de medio de agar de selección a placas de pocillos semi-profundos de 96 pocillos (96HDWP) que contenían medio de selección líquido que consistía en medio mineral (según Verduyn, con urea como fuente de nitrógeno) complementado con 3 % de xilosa. Se cultivaron 96HDWP durante 3 días de pre-cultivo en un agitador orbital a 30 ºC y 750 rpm. Posteriormente, para cada pocillo se transfirieron 20 µl de cultivo por proceso automatizado a placas de 24 pocillos profundos (24 DWP) que contenían 2,5 ml de Verduyn-urea complementado con la mezcla de azúcares glucosa:xilosa en una relación 5:1 con las siguientes concentraciones: 10 g I-1 de glucosa y 2 g I-1 de xilosa (medio YD10). Para cada uno de los tres puntos de muestreo se inoculó una serie de 24DWP. En cada 24DWP, se inoculó un control de crecimiento de RN1001 para tener una indicación de los efectos de variación de placas. Después de 24 horas, 72 horas y 96 horas se realizó el muestreo automático y transferencia a 96HDWP para la medición de DO automatizada a 600 nm de longitud de onda.
Después de la última medición de DO después de 96 horas, las células se sedimentaron después de la centrifugación y se recogieron 100 µl de sobrenadante por proceso automatizado para los constituyentes de análisis residual de RMN de flujo en el medio después del cultivo (véase anteriormente para la descripción del método). Para cada construcción y cada momento de tiempo, se promediaron la glucosa residual medida y las concentraciones de xilosa para los diferentes duplicados. Con el fin de comparar las diferentes partes del cribado, se calculó un valor relativo basado en la diferencia con la concentración de xilosa residual no mutada medida en la parte particular del cribado de GTAC, según la siguiente fórmula:
xilosa residualGal2no mutada  xilosaresidualGal2mu tan te 
Xilrel  x100 %
xilosa residual
Gal2no mutada
Resultados. Mientras que RN1001 presentó consumo completo de tanto glucosa como xilosa, los transformantes YD01227 de construcciones de GAL2 de bibliotecas no mutadas y de mutagénesis no consumieron glucosa y presentaron un espectro de concentraciones residuales de xilosa que representan su capacidad individual para consumir xilosa en presencia de glucosa (Figura 7A). Como se muestra en la Figura 7B, el consumo de xilosa presentó una alta correlación (R2=0,93) con las medidas de crecimiento (DO600). Como el cribado se realizó en condiciones aerobias, y se mostró poca formación de etanol (datos no mostrados) y el crecimiento presentó alta correlación con el consumo de xilosa, se usaron las concentraciones de xilosa residual como parámetro principal para comparar variantes de GAL2 con no mutada. La comparación de todas las variantes de GAL2 mutantes probadas frente a GAL2 no mutada sobre el consumo de xilosa (Xil rel promedio) a las 96 horas se enumera en la Tabla 7. Todas las mutaciones que afectan el transporte de glucosa con respecto al beneficio del transporte de xilosa tienen Xil rel>0 (Tabla 7). Se clasificaron las posiciones de TOP con respecto a la diana para una segunda ronda de mutagénesis basándose en su puntuación de Xil rel promedio por mutación; mutaciones específicas se clasificaron por preferencia basándose también en la puntuación de Xil rel (Tabla 8).
Tabla 7. DO600 relativa (DO600rel) y consumo de xilosa (Xilrel) del cribado de GTAC. La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut Xilrel
85
F A 1,45
C
0,66
D
-1,89
E
-13,09
G
-1,06
H
1,76
K
-20,81
M
7,03
N
1,96
P
2,83
Q
37,68
R
-1,93
S
19,81
T
50,51
V
32,76
89
T A 11,68
C
13,22
D
19,68
F
-9,97
H
25,59
I
-17,32
K
-24,84
L
12,38
M
-8,38
N
9,88
Q
-16,03
R
-16,11
S
-11,44
V
41,06
Y
-2,89
187
V A 26,84
C
9,98
Pos
AA wt AA mut Xilrel
D
3,76
E
6,21
F
14,53
G
10,01
H
8,32
I
6,69
K
4,09
L
4,12
M
1,85
Q
10,17
R
3,05
S
7,54
T
10,41
W
1,81
Y
1,22
191
A C 4,70
D
12,43
E
-2,61
F
5,49
G
15,83
H
2,83
I
11,93
K
1,94
L
-8,25
M
-14,37
N
20,35
P
14,89
Q
2,94
R
-1,09
S
3,09
T
10,61
V
4,52
W
2,49
Y
1,93
Pos
AA wt AA mut Xilrel
214
Y A -12,81
C
-5,85
G
18,41
I
-12,07
K
-4,66
L
35,33
M
23,92
N
32,71
P
18,44
Q
39,94
R
25,50
S
14,91
V
55,48
W
47,35
215
Q A 2,01
C
9,90
D
13,62
F
10,12
G
-9,62
H
-18,18
I
17,72
L
24,63
M
21,59
N
-11,47
S
2,14
V
-8,22
W
-20,47
Y
-8,07
218
I A 17,98
C
5,52
D
4,64
E
8,44
G
4,62
H
9,88
Pos
AA wt AA mut Xilrel
K
27,86
L
9,73
M
5,80
N
24,31
R
-0,73
S
24,96
T
-2,65
V
7,69
W
-2,10
219
T A 52,55
C
25,05
D
18,04
E
-14,58
F
43,86
G
46,45
I
-11,07
K
-4,44
M
-18,28
N
7,85
Q
-22,81
R
-24,62
S
4,90
W
-16,77
222
I A 11,37
C
13,45
D
20,91
E
3,35
G
3,75
H
9,73
K
-4,92
M
4,39
P
0,97
S
1,85
T
-1,59
Pos
AA wt AA mut Xilrel
V
8,42
W
-8,04
Y
7,87
226
Y A 63,63
C
62,07
D
81,68
E
70,43
G
39,06
H
5,10
I
32,79
K
-1,86
L
42,48
M
74,04
N
62,81
P
49,78
Q
56,23
R
65,53
S
14,97
T
7,27
V
-11,15
W
44,48
338
Q A 38,18
C
52,66
D
33,17
E
46,93
F
46,65
G
13,80
H
26,28
I
28,32
L
33,08
M
-2,53
N
22,26
P
3,96
R
39,83
Pos
AA wt AA mut Xilrel
S
3,96
T
11,84
V
24,84
W
35,55
Y
19,90
339
M A 50,56
C
30,36
D
46,71
E
10,48
F
63,75
G
73,03
H
67,99
I
40,96
K
71,92
L
67,43
N
83,73
P
12,77
Q
77,74
R
70,25
S
81,65
T
57,02
V
82,35
W
-23,02
Y
37,43
341
Q D -20,08
E
-3,38
H
-22,19
L
46,71
M
23,17
N
11,77
R
-5,18
S
15,78
T
28,67
Y
19,78
Pos
AA wt AA mut Xilrel
342
Q A 61,47
C
64,63
D
48,62
E
34,90
F
45,61
G
14,10
H
46,28
I
16,81
K
41,75
L
37,38
M
27,70
N
32,30
P
44,88
R
23,95
S
68,48
T
50,54
V
24,39
W
59,43
Y
76,45
343
L A 9,67
C
8,74
D
9,41
E
2,39
F
15,49
G
11,87
H
16,96
I
10,67
K
40,15
M
16,94
N
14,03
P
26,08
Q
8,73
R
29,11
S
20,28
Pos
AA wt AA mut Xilrel
T
14,38
V
-6,06
W
7,76
Y
20,43
346
N A 21,99
C
17,11
D
8,88
E
-8,32
F
9,91
G
8,42
H
26,01
I
17,12
K
17,48
L
6,48
M
13,19
Q
19,93
R
7,94
S
23,37
T
23,19
V
47,09
W
45,58
Y
41,70
347
N A 44,64
D
26,67
E
25,36
G
-22,71
H
11,18
I
27,33
K
-22,05
L
7,79
Q
-14,96
R
-15,36
S
-15,56
T
-19,33
Pos
AA wt AA mut Xilrel
V
-28,12
350
Y D 2,93
E
-13,15
H
-19,99
I
-10,76
K
3,00
L
40,49
M
5,01
N
13,57
Q
0,66
R
57,58
S
15,25
T
21,64
V
13,39
Y
-7,36
373
G A 25,90
C
36,56
D
36,22
E
41,01
F
15,15
H
6,96
I
9,10
K
20,72
L
51,94
M
35,03
N
38,49
P
35,75
Q
5,50
R
8,35
S
11,62
T
10,67
V
21,91
W
22,96
Y
31,04
Pos
AA wt AA mut Xilrel
376
N A 36,70
C
78,63
D
19,23
E
20,15
F
92,62
H
39,30
I
99,46
K
7,53
L
93,69
M
97,33
P
51,70
Q
24,24
R
27,86
S
59,39
T
99,01
V
96,57
W
13,51
Y
43,95
380
T A 53,06
C
42,34
D
37,28
E
-29,92
F
54,67
G
34,22
I
47,40
K
42,12
L
39,25
M
74,78
N
49,79
P
43,28
Q
43,31
R
42,31
S
42,03
V
42,53
Pos
AA wt AA mut Xilrel
W
51,16
Y
25,09
383
S A 57,21
C
67,78
D
29,42
E
54,55
F
52,71
G
39,71
I
25,88
K
49,19
L
37,72
M
52,64
N
58,14
Q
83,94
R
61,78
T
71,85
V
19,38
W
65,32
Y
62,76
444
F A 32,41
C
14,64
D
13,21
E
16,38
G
12,78
H
25,62
I
31,95
K
28,79
L
39,43
M
17,30
N
5,43
P
15,65
Q
19,63
R
0,06
S
10,94
Pos
AA wt AA mut Xilrel
T
7,44
V
37,29
W
2,94
Y
32,56
446
F D 10,80
E
10,63
H
16,93
I
8,65
K
-3,40
L
22,78
M
18,62
N
14,99
Q
34,25
R
-8,44
S
-20,59
T
-16,07
V
-9,48
448
T A 76,95
C
58,53
D
66,10
E
53,25
F
61,94
G
65,05
H
67,00
I
58,01
K
54,82
L
63,49
M
77,64
P
64,39
Q
58,15
R
33,80
S
59,40
V
53,50
W
56,69
Pos
AA wt AA mut Xilrel
Y
47,73
449
T A 57,64
C
50,44
D
55,89
E
37,14
F
92,65
G
61,00
H
82,47
I
71,71
K
79,30
L
81,03
M
89,29
N
84,60
P
37,06
Q
81,19
R
82,14
S
83,15
V
74,98
W
80,75
Y
79,80
451
T C 10,57
D
9,68
E
15,39
F
13,38
G
43,34
H
7,65
I
17,96
K
8,59
L
11,00
M
5,68
N
14,56
P
11,89
Q
8,63
R
4,46
Pos
AA wt AA mut Xilrel
S
13,08
T
2,10
V
4,99
W
15,25
Y
1,62
455
W A 1,31
C
1,19
D
-6,13
E
19,68
F
-1,57
G
0,73
I
-2,70
K
6,91
L
19,08
M
19,92
N
19,10
P
14,76
Q
3,03
R
-14,86
S
8,05
T
19,75
V
10,66
Y
7,30
478
N A -11,71
C
-1,14
D
-3,08
F
30,35
G
8,29
H
-15,02
I
10,06
K
9,95
L
-3,27
P
30,98
Q
4,37
Pos
AA wt AA mut Xilrel
R
11,41
V
21,91
W
3,25
Y
4,98
479
W C 13,20
D
6,12
E
11,20
F
1,41
G
1,34
H
6,90
I
1,50
K
5,54
L
7,80
M
5,47
N
2,20
P
7,07
Q
15,50
R
1,63
S
18,50
T
21,51
V
5,89
Y
8,63
Tabla 8. Posiciones de Gal2p y mutaciones identificadas en el cribado de GTAC se ordenan por preferencia. PUNTUACIÓN PRINCIPAL es la puntuación de Xilrel para la sustitución de aminoácidos dentro que una posición que da la mejora más clara en comparación con Gal2p no mutada. Esto permite una clasificación de las mutaciones más influyentes y posiciones relevantes con respecto a la diana en Gal2p para eliminar la afinidad por glucosa.
GTAC
Mutaciones
Posición
AA wt Más preferida Preferida Menos preferida Inactiva PUNTUACIÓN PRINCIPAL
Más preferida
376 N FILMTV ACHPSY DEKQRW 99,46
449
T FM HIKLNQRSVWY ACDEGP 92,65
383
S CQRTWY AEFKMN DGILV 83,94
339
M NQSV AFGHKLRT CDEIPY W 83,73
226
Y ACDMNR EQ GHILPSTW KV 81,68
448
T AM CDEFGHIKLPQSVW RY 77,64
GTAC
Mutaciones
Posición
AA wt Más preferida Preferida Menos preferida Inactiva PUNTUACIÓN PRINCIPAL
342
Q ACSWY DFHKPT EGILMNRV 76,45
380
T AFMW CDGIKLNPQRSV Y E 74,78
350
F LR NSTV DKMQ EHIY 57,58
214
Y VW LNQ GMPRS ACIK 55,48
338
Q CEF ADHILRW GNPSTVY M 52,66
219
T AFG CD NS EIKMQRW 52,55
373
G L ACDEMNPVWY FHIKQRST 51,94
85
F QTV S ACHMNP DEGKR 50,51
Preferida
346 N VWY AHST CDFGIKLMQR E 47,09
341
Q L MT NSY DEHR 46,71
347
N A DEI HL GKQRSTV 44,64
451
A G CDEFILNPSW HKMQRTVY 43,34
89
T DHV ACL N FIKMQRSY 41,06
343
L K PRSY ACDEFGHIMNQT W V 40,15
444
F AILVY HK CDEGMNPQSTW R 39,43
446
F Q HLMN DEI KRSTV 34,25
478
N FP V GIKQRWY ACDHL 30,98
Menos preferida
218 I KNS AHL CDEGMV RTW 27,86
187
V A CFGQT DEHIKLMRSWY 26,84
215
Q LM CDF AIS GHNVWY 24,63
479
W QST CE DFGHIKLMNPRVY 21,51
222
I D ACH EGMPSVY KTW 20,91
191
A N DGIPT CFHKQSVWY ELMR 20,35
455
W ELMNT PV ACGKQSY DFIR 19,92
Las mutaciones más destacadas se encontraron en la posición 376 cuando el aminoácido no mutado Asn se intercambió por aminoácidos con grandes cadenas laterales hidrófobas tales como Phe, Ile, Leu, Met, Thr o Val; estas variantes facilitaron el claro crecimiento y el consumo casi completo de xilosa y casi ningún transporte de 5 actividad para glucosa en el cribado de GTAC (Figura 8). Los presentes inventores han encontrado que aminoácidos ventajosos en la posición 376 tienen un volumen de van der Waals de 85 a 138 Å3 y una hidrofobia de 10 a 100 ΔtR,
o en una realización un volumen de van der Waals de 100 a 138 Å3 y una hidrofobia de 10 a 100 ΔtR. Una realización importante adicional es aminoácidos específicos en la posición 339, donde los presentes inventores han encontrado que un aminoácido que tiene un hidrofobia de -30 a 10 ΔtR produce mutantes con actividad de transporte
10 de glucosa reducida. Esto se ilustra por la Figura 11.
Los valores para el volumen de van der Waals (Å3) para aminoácidos usados en el presente documento son como se describen en: http://www.proteinsandproteomics.org/content/free/tables 1/table08.pdf. La bibliografía correspondiente es N. J. Darby, Thomas E. Creighton, Protein Structure (1993) Oxford University Press. Los valores
para la hidrofobia (ΔtR) de los aminoácidos usados en el presente documento son como se describen en http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/psc.310010507/pdf. La referencia correspondiente a esto es Monera, O.D. et al, Journal of Peptide Science Vol. 1 319-329 (1995).
Ejemplo 5: Cribado de la actividad de transporte de xilosa
Objetivo. Usando el cribado de la actividad de transporte de xilosa (XTA), es decir, usando la cepa mutante del transportador de hexosa RN1053 como hospedador para introducir variantes de GAL2 y cribando los transformantes resultantes en medio para crecimiento sobre bajas concentraciones de xilosa (1 g I-1), pueden identificarse mutaciones que aumentan la actividad de transporte de xilosa en la variante de Gal2p. La actividad de transporte puede definirse por más de un parámetro, por ejemplo, la afinidad del transportador (expresada por la constante de Michaelis, es decir, Km), o la tasa del transportador (expresada como Vmáx). También es posible que una mutación aumente la expresión del transportador, y así mejore la actividad de transporte de xilosa en la célula hospedadora.
Transformación y recogida de colonias. Se transformó RN1053 con un total de 468 construcciones, llevando cada una el mutante GAL2. Se incluyó una construcción con secuencia de GAL2 no mutada (SEQ ID 58) como control. Para cada transformación, volvieron a sembrarse 1-3 colonias en MTP de medio de agar ascendiendo a 1229 transformantes. Los 1229 transformantes se cribaron en dos partes. Para cada parte del cribado, se incluyó GAL2 no mutada como control.
Pre-cultivo y cribado. Para el pre-cultivo, se transfirieron transformantes resultantes de la transformación automatizada y la recogida de colonias por proceso automatizado de las MTP de medio de agar de selección a 96HDWP que contenían en cada pocillo 250 µl de Verduyn-urea complementado con 2 % de maltosa. Después de 3 días de pre-cultivo en un agitador orbital a 30 ºC y 750 rpm, se transfirieron 5 µl de cultivo a tres 96HDWP diferentes que contenían 250 µl de Verduyn-urea complementado con 1 g I-1 de xilosa (medio RN01), representando cada 96HDWP un punto de muestreo. En cada placa (24 DWP o 96 HDWP) se inoculó al menos un control de crecimiento de RN1001 para tener una indicación de los efectos de placa a placa. Después de 24 horas, 72 horas y 96 horas se recogió una serie de 96HDWP para la medición de DO automatizada a 600 nm. Para cada construcción y cada momento de tiempo se promediaron los valores de DO600 para los duplicados diferentes. Con el fin de comparar las diferentes partes del cribado, se calculó un valor relativo basándose en la diferencia con el valor de DO600 no mutada medido en la parte particular del cribado de XTA, según la siguiente fórmula:
DO600Gal2 mu tan te  DO600Gal2no mutada 
DO600 rel  x100 %
DO600
Gal2no mutada
Resultados. En ambas partes del cribado de XTA, RN1001 es parte de las posiciones de TOP15 basándose en el perfil de crecimiento en comparación con Gal2p no mutada; RN1001 tiene el complemento completo de transportadores de hexosa y la presencia de RN1001 en TOP15 en ambas partes del cribado de XTA (Figura 9) indica que uno o más transportadores de hexosa endógenos en levadura facilitan la captación de afinidad de alta afinidad a diferencia de los transformantes RN1053 de Gal2 no mutada que presentaron peores perfiles de crecimiento. Las variantes mutantes con los cambios de un único aminoácido presentes en TOP15 presentaron una elevada afinidad por xilosa en comparación con Gal2p no mutada y se desarrollaron hacia el perfil de crecimiento de RN1001 o incluso mostraron características de crecimiento similares o mejoradas sobre bajas concentraciones de xilosa. De forma interesante, cuando se alinean secuencias de aminoácidos de la familia de transportadores de hexosa de S. cerevisiae, algunas de las mutaciones de Gal2p en TOP15, por ejemplo N346D y M339S, deben ser encontradas en las secuencias no mutadas de Hxt2 (S324) y Hxt11 (D336 y S329), respectivamente. La comparación de todas las variantes de GAL2 mutantes probadas frente a GAL2 no mutada sobre el crecimiento (DO600 rel promedio) a las 96 horas se enumera en la Tabla 8. Se propone que todas las mutaciones con DO600 rel >0 tienen un efecto positivo sobre la afinidad de xilosa.
Tabla 9. Valores de DO600 rel promedio para los mutantes Gal2p cribados en el cribado de XTA.
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
85
F A -2,50
C
-1,81
D
-32,03
E
-37,55
G
-51,06
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
H
-35,08
K
-27,75
N
-6,14
P
-23,27
Q
-0,27
R
-18,30
S
7,30
T
-6,07
V
2,40
89
T A -1,12
C
19,39
E
-13,89
I
-20,86
K
-13,89
L
1,12
M
-9,48
N
-8,70
Q
-4,57
R
-10,12
V
3,11
W
-43,47
Y
0,01
187
V A -10,62
C
14,34
D
-5,07
E
-2,94
F
-6,14
G
14,77
H
-2,79
I
15,55
L
10,08
M
36,83
Q
26,77
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
R
-11,36
S
-28,01
T
-10,54
W
-17,20
Y
11,95
191
A C 5,10
D
7,05
E
0,58
F
-1,81
G
-4,01
H
-12,93
I
10,13
K
7,11
M
-4,82
N
4,60
P
1,90
Q
-8,47
R
3,34
S
-19,15
T
-2,00
V
-9,91
W
4,10
Y
-15,24
214
Y A -3,04
C
-12,04
G
-6,92
I
-6,92
K
-4,15
L
6,02
M
-26,59
N
-9,60
P
5,35
Q
-26,44
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
R
-29,77
S
-37,90
W
-21,91
215
Q A 1,54
C
5,92
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
D
25,93
E
20,81
F
3,28
I
-5,50
L
8,24
M
11,19
R
-48,74
S
16,66
V
-21,07
W
-39,22
Y
-24,30
218
I A -15,52
C
-13,03
D
-19,50
E
-15,31
G
-9,12
H
-9,12
K
-10,19
L
-15,45
M
-24,27
N
-23,20
R
-13,39
S
-13,60
T
-15,95
V
-4,00
W
40,30
219
T A -6,71
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
C
-20,53
D
-21,69
E
3,47
F
-17,01
G
-35,80
I
-47,23
L
3,78
M
-20,00
N
-13,93
P
-18,27
Q
-14,25
R
7,17
S
-18,08
V
11,19
W
-15,13
222
I A -7,91
C
-6,92
D
-12,54
E
-16,80
G
28,78
H
-13,50
K
-48,17
M
20,18
P
11,01
R
-0,62
S
3,03
T
10,25
V
-12,55
W
11,38
Y
23,82
226
Y A 23,92
C
-6,78
D
-12,89
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
E
5,10
F
-28,04
G
-4,64
H
-11,26
I
-12,46
K
-10,55
M
24,16
N
-4,86
P
20,39
Q
0,33
R
-9,19
S
-5,78
T
23,80
W
-5,71
338
Q A 4,10
C
10,88
D
7,99
E
3,59
F
0,45
G
5,29
H
11,63
I
12,95
L
0,58
M
4,79
N
14,12
P
2,21
R
15,03
S
-17,02
T
-26,76
V
-11,33
W
-6,92
Y
-17,30
339
M A 28,42
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
C
20,32
D
-0,09
E
18,97
F
4,17
G
-20,00
H
-14,46
I
-17,55
K
-11,75
L
21,03
N
4,25
P
-4,64
Q
-3,65
R
-7,91
S
54,52
T
10,79
V
-11,90
W
6,56
Y
38,66
341
Q D -10,62
E
-8,13
H
2,89
K
-21,66
L
-22,79
M
-11,30
N
-13,31
R
-10,76
S
7,16
T
-3,08
V
18,89
Y
9,37
342
Q A -15,66
C
2,04
D
-12,54
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
E
-9,23
F
33,22
G
42,01
H
45,21
I
34,38
K
12,92
L
28,91
M
7,99
N
45,31
P
-7,15
R
44,36
S
22,25
T
20,62
V
-16,07
W
32,62
Y
-21,41
343
L A 15,98
C
7,16
D
-12,82
E
9,65
F
-6,07
G
-6,63
H
-9,83
I
19,04
K
2,40
M
-0,73
N
0,97
P
4,53
Q
19,53
R
-10,62
S
10,72
T
-6,46
W
0,69
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
Y
29,99
346
N A 26,36
C
15,73
D
69,10
F
10,15
G
24,01
H
-4,93
I
0,76
K
-1,66
P
-0,80
Q
-5,28
R
-7,84
V
-44,97
Y
-3,51
347
N D 5,29
E
-24,11
G
7,59
H
-4,57
I
-3,08
K
9,65
L
14,52
Q
6,55
R
-1,93
S
18,92
T
2,61
V
6,09
350
Y D -2,08
E
39,52
I
-28,19
L
33,56
M
7,09
Q
6,95
R
-40,48
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
S
7,93
T
-6,33
V
-15,81
Y
-9,27
373
G A -51,50
E
-50,72
F
-47,17
H
-37,99
I
2,84
K
15,40
L
18,36
M
14,21
N
21,06
Q
14,02
R
32,18
S
18,92
T
-11,04
V
-6,71
W
-5,20
Y
1,21
376
N A 10,19
C
24,67
D
8,93
E
10,19
F
-13,02
H
-13,78
I
14,59
K
47,76
L
-9,63
M
6,29
P
29,04
Q
35,51
R
-23,42
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
S
44,42
V
-42,40
W
-15,74
Y
-21,28
380
T A 3,56
C
8,37
D
24,95
E
14,21
F
-17,33
G
29,22
I
20,81
K
14,34
L
23,45
M
29,16
N
-50,25
P
-7,46
Q
-15,32
R
-0,55
S
-6,02
V
-6,21
W
14,78
Y
29,48
383
S A 16,05
C
3,32
D
-2,94
E
1,97
F
-15,10
G
-4,50
I
2,40
K
-47,86
L
3,59
M
-2,56
N
-44,72
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
Q
14,40
R
21,37
T
-28,26
V
24,58
W
26,71
Y
27,84
444
F C -6,49
D
-2,08
E
-16,16
G
1,54
H
-16,38
I
-20,29
K
-24,06
L
-10,19
M
-7,20
N
-9,76
P
-18,79
Q
-27,18
S
-14,45602
W
-16,94
Y
-18,08
446
F D 19,61
E
-36,17
H
30,98
I
0,83
L
-40,55
M
-2,58
N
-10,90
Q
-35,54
R
-37,62
S
-2,94
T
-39,41
V
-47,79
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
448
T A 10,57
C
0,08
D
15,78
E
19,55
F
-6,65
G
16,91
H
25,64
I
-0,18
K
26,65
L
22,31
M
0,77
P
12,58
Q
14,08
R
29,22
S
11,19
V
W
8,09
Y
-2,01
449
T A 4,67
C
6,59
D
-2,58
E
-2,08
F
16,48
G
11,00
H
16,26
I
9,51
K
-3,51
L
11,29
M
-15,59
N
-7,13
P
8,73
Q
13,21
R
-10,33
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
S
15,48
V
14,41
W
-5,78
Y
-5,57
451
T C -33,23
D
-23,20
F
-4,75
G
-16,94
H
-41,76
I
-40,26
K
-8,91
L
-23,73
N
-6,07
P
-6,14
Q
-8,22
R
-6,21
S
2,90
T
-11,42
V
-5,89
W
4,10
Y
3,91
455
W C -14,75
D
8,18
E
4,22
F
-2,31
G
-10,67
I
5,45
K
8,12
L
-5,96
M
6,39
N
-9,22
P
0,83
Q
0,95
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
R
-48,55
S
-4,82
T
-9,44
V
-2,06
Y
-19,81
478
N A -25,74
C
-14,75
D
-9,91
F
6,86
G
0,01
H
-13,12
I
8,81
K
-24,30
P
-20,47
Q
14,40
R
-27,44
W
-13,40
Y
6,77
479
W C -12,96
D
15,20
E
18,40
F
24,87
H
1,83
I
48,83
K
8,58
L
-3,79
M
7,87
N
8,05
P
-42,40
Q
-33,73
R
13,42
S
57,22
T
15,48
La construcción de GAL2 no mutada pDB1250 se estableció a 0. Los valores de DO600 rel son los promedios de 1-3 duplicados y son valores relativos en comparación con no mutada.
Pos
AA wt AA mut DO600 rel
V
-12,54
Y
12,07

Tabla 10. Posiciones de Gal2p y mutaciones identificadas en el cribado de XTA se ordenan por preferencia. PUNTUACIÓN PRINCIPAL es la puntuación de Xilrel para la sustitución de aminoácidos dentro que una posición que da la mejora más clara en comparación con Gal2p no mutada. Esto permite una clasificación de las mutaciones más influyentes y posiciones relevantes con respecto a la diana en Gal2p para aumentar la actividad de transporte de xilosa.
XTA
Mutaciones
Posición
AA wt Más preferida Preferida Menos preferida Inactivo PUNTUACIÓN PRINCIPAL
Más preferida
346 N D AG CF HIKPQRVY 69,10
479
W S I DEFHKMNRTY CLPQV 57,22
339
M SY ACEL FNTW DGHIKPQRV 54,52
342
Q GHNR FILW CKMST ADEPVY 47,76
376
N KS CPQ ADEIM FHLRVWY 47,76
Preferida
218 I W ACDEGHKLMNRSTV 40,30
350
F E L MQS DIRTVY 39,52
187
V MQ CGI LY ADEFHRSTW 36,83
373
G R KLMNQS IY AEFHTVW 32,18
446
F H D EILMNQRSTV 30,98
Menos preferida
343 L Y AIQ CEKSP DFGHMNRTW 29,99
380
T GMY DIL ACEKW FNPQRSV 29,48
448
T HKR EL ADGPQSW MCFIVY 29,22
222
I G MY PTW ACDEHKRSV 28,78
383
S VWY AQR CEIL DFGKMNT 27,84
215
Q DE S ACFL IMRVWY 25,93
226
Y AMPT E CDFGHIKNQRSW 24,16
89
T C LVY AEIKMNQRW 19,39
347
N S KL DGQTV EHIR 18,92
449
T FH QSV ACGILP DEKMNRWY 16,48
338
Q NR CDHI AEFGLMP STVWY 15,03
478
N Q FIY ACDGHKPRW 14,40
191
A I DK CENPRW FGHMQSTVY 10,13
341
Q V SY H DEKLMNRT 9,37
XTA
Mutaciones
Posición
AA wt Más preferida Preferida Menos preferida Inactivo PUNTUACIÓN PRINCIPAL
455
W DK EIM CFGLNPQRSTVY 8,18
85
F S V ACDEGHKNPQRT 7,30
219
T V R EL ACDFGIMNPQSW 7,17
214
Y LP ACGIKMNQRS 6,02
451
A WY S CDFGHIKLNPQRTV 4,10
444
F G CDEHIKLMNPQSWY 1,54
EJEMPLOS 6 a 15
Métodos
Técnicas de biología molecular y productos químicos. Se adquirieron enzimas de restricción y T4 ADN ligasa de
5 Fermentas (Fisher Scientific, Landsmeer, Los Países Bajos). Los cebadores usados en los estudios (SEQ ID NO: 155) se indican en la Tabla 11. Se realizaron técnicas de biología molecular y genética de levadura estándar según libros de textos que incluyen Sambrook et al. (2001; Molecular cloning: a laboratory manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, NY, EE.UU.) y Ausubel et al. (1995; Current Protocols in Molecular Biology).
10 Amplificación por PCR y clonación. Para las amplificaciones por PCR, se usó Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix con tampón HF (Finnzymes; Fisher Scientific, Landsmeer, Los Países Bajos). Los cebadores usados para la clonación y secuenciación se indican en la Tabla 11 (SEQ ID NO: 37-55). Se clonaron fragmentos de PCR de HXT2, HXT3-6 y HXT11 en el vector de expresión en levadura pRS313-P7T7 (SEQ ID NO 56), basándose en el vector lanzadera pRS313 (Sikorski & Hieter, 1989, A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient
15 manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 122, pp. 19-27). La construcción pRS313-P7T7 lleva el promotor HXT7 truncado (Hauf et al, 2000, Simultaneous genomic overexpression of seven glycolytic enzymes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Enzyme Microb Technol, 26:688-698) y el terminador HXT7. Entre el promotor y el terminador, existe un sitio de clonación múltiple (MCS). Los fragmentos de PCR resultantes se digirieron por combinaciones de enzimas de restricción (como se indica adicionalmente en los ejemplos más adelante) y se
20 clonaron por técnicas de biología molecular estándar en el vector de expresión en levadura. HXT11 también se clonó en pRS313-P7T7-GFP (produciendo SEQ ID NO: 57) para estudios de localización de la proteína Hxt11 marcada con GFP usando microscopía de fluorescencia (Ejemplo 5). pDB1250 contuvo el ORF de GAL2 (SEQ ID NO: 60) entre el promotor HXT7 truncado y el terminador ADH1 (para referencia de secuencia pDB1250 véase SEQ ID NO: 58. Los plásmidos se amplificaron y se mantuvieron en células DH5α siguiendo las instrucciones del
25 fabricante. Los plásmidos se aislaron de minicultivos de E. coli usando el kit GeneElute plasmid Miniprep (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Los Países Bajos). Secuencias de genes / proteínas y construcciones usadas y generadas durante estos estudios se enumeran en la Tabla 12.

Tabla 11: Oligonucleótidos usados en los ejemplos
Nombre
Secuencia (5' → 3') Fin SEQ ID NO
ActinF
GGATTCTGAGGTTGCTGCTTTGG PCR en tiempo real 62
ActinR
GAGCTTCATCACCAACGTAGGAG PCR en tiempo real 63
HXT1F
TGTTCTCTGTACACCGTTGACCG PCR en tiempo real 64
HXT1R
AGATCATACAGTTACCAGCACCC PCR en tiempo real 65
HXT2F
CTTCGCATCCACTTTCGTG PCR en tiempo real 66
HXT2R
AATCATGACGTTACCGGCAGCC PCR en tiempo real 67
HXT3F
GAAGCTAGAGCTGCTGGTTCAGC PCR en tiempo real 68
HXT3R
ACAACGACATAAGGAATTGGAGCC PCR en tiempo real 69
Nombre
Secuencia (5' → 3') Fin SEQ ID NO
HXT4F
ATGGAGAGTTCCATTAGGTCTAGG PCR en tiempo real 70
HXT4R
ATAACAGCTGGATCGTCTGCGC PCR en tiempo real 71
HXT5F
TTGCTATGTCGTCTATGCCTCTG PCR en tiempo real 72
HXT5R
AGATAAGGACATAGGCAACGGG PCR en tiempo real 73
HXT7F
GGGTGCTGCATCCATGACTGC PCR en tiempo real 74
HXT7R
ACAACGACATAAGGAATTGGAGCC PCR en tiempo real 75
HXT8F
GTACTACTATCTTCAAATCTGTCGG PCR en tiempo real 76
HXT8R
CTTGTGACGCCAACGGAGGCG PCR en tiempo real 77
HXT9F
CCATTGAGAGGTTTGGACGCCG PCR en tiempo real 78
HXT9R
ACACAATCATACAGTTACCGGCG PCR en tiempo real 79
HXT10F
GGAATGCAAGACTCTTTCGAGAC PCR en tiempo real 80
HXT10R
CTAGTGACGCCAACGGTGGCG PCR en tiempo real 81
HXT11F
GCCACTCAATGGAGAGTCGGC PCR en tiempo real 82
HXT11R
CAACTAGCAAGGCTGGATCGTC PCR en tiempo real 83
HXT12F
CACCATCTTCAAATCTGTCGGTC PCR en tiempo real 84
HXT12R
CAATCATACAGTTACCGGCACCC PCR en tiempo real 85
HXT13F
CCCTCATGGCCAGGACGGTC PCR en tiempo real 86
HXT13R
TTGCCATAACCAGTTGCATGCAG PCR en tiempo real 87
HXT14F
GCCTTAGTAGTGTACTGCATCGGT PCR en tiempo real 88
HXT14R
TGATACGTAGATACCATGGAGCC PCR en tiempo real 89
HXT15F
GAGGCCTGTGTCTCCATCGCC PCR en tiempo real 90
HXT15R
CACAAGAATACCTGTGATCAAACG PCR en tiempo real 91
HXT16F
CAAGGAAGTATAGTAATACTGCGC PCR en tiempo real 92
HXT16R
TTGGCGATGGAGACACAGGCC PCR en tiempo real 93
HXT17F
TAACACTGCACAATGGAGAGTCC PCR en tiempo real 94
HXT17R
TGAGTACCCATGGATCCTCTGG PCR en tiempo real 95
GAL2F
TCAATGGAGAGTTCCATTAGGGC PCR en tiempo real 96
GAL2R
CTGGACGGCAGGATCCTCTGG PCR en tiempo real 97
KOP11*
KO HXT11 98
KOT11*
KO HXT11 99
Nombre
Secuencia (5' → 3') Fin SEQ ID NO
iHXT11F
HXT11 inversa 100
iHXT11R
HXT11 inversa 101
HXT11F
GGCCTCTAGAATGTCAGGTGTTAATAATACATCCGC clonación 102
HXT12F
GGCCTCTAGAATGGGTTTGATTGTCTCAATATTCAAC clonación 103
HXT11/1 2R
clonación 104
HXT1 XbaI
GCATTCTAGAATGAATTCAACTCCCGATCTAATATC clonación 105
R HXT1 Cfr9i
TGCATCCCGGGTTATTTCCTGCTAAACAAACTCTTGTA clonación 106
F HXT2 Xbai
GTCCTCTAGAATGTCTGAATTCGCTACTAGCCG clonación 107
R HXT2 Cfr9i
clonación 108
F HXT3 XbaI
GCATTCTAGAATGAATTCAACTCCAGATTTAATATCTC clonación 109
R HXT6 Cfr91
CATCGCCCGGGTTATTTGGTGCTGAACATTCTCTTG clonación 110
F HXT4 XbaI
GTCCTCTAGAATGTCTGAAGAAGCTGCCTATCAAG clonación 111
R HXT4RN Cfr91
TATCGCCCGGGTTAATTAACTGACCTACTTTTTTCCGA clonación 112
F HXT5 XbaI
GTCCTCTAGAATGTCGGAACTTGAAAACGCTCATC clonación 113
R HXT5 Cfr91
clonación 114
F HXT7 XbaI
GTCCTCTAGAATGTCACAAGACGCTGCTATTGCA clonación 115
R HXT7 Cfr91
CATCGCCCGGGTTATTTGGTGCTGAACATTCTCTTG clonación 116
*En cursiva la secuencia flanqueante de HXT11, y subrayada la secuencia de HIS3
Extracción de ARN y síntesis de ADNc. Se aisló ARN total de células de levadura en fase exponencial por un procedimiento de rotura con perlas de vidrio / extracción con Trizol. Se mezclaron sedimentos de levadura de 2 ml de cultivo celular con 0,2 ml de perlas de vidrio (diámetro, 0,45 mm) y 0,9 ml de Trizol con 125 µl de cloroformo, y se
5 rompieron en un Fastprep FP120 (Bio-101, Thermo Savant, California, EE.UU.) por un estallido de 45 segundos a la velocidad 6. Se usó 1 µg de ARN total para sintetizar ADNc usando el kit iScript (Bio-Rad, Veenendaal, Los Países Bajos).
PCR en tiempo real. Se realizaron las PCR en tiempo real específicas de HXT1-HXT17 y GAL2, respectivamente, usando el kit SensiMix SYBR & Fluorescein (GC Biotech, Alphen aan den Rijn, Los Países Bajos) y el instrumento de
10 PCR en tiempo real MyiQ iCYCLER (BIO-Rad, Veenendaal, Los Países Bajos). Cada reacción de 25 µl contuvo 12,5 µl de SYBR green Master Mix, 4 µl de ADNc, 0,5 µl de cada cebador (10 nM) y 7,5 µl de agua desionizada estéril. Las condiciones de PCR fueron 10 min a 95 ºC seguido de 39 ciclos de amplificación (15 s a 95 ºC, 30 s a 60 ºC, 30 s a 72 ºC). Los cebadores mostrados en la Tabla 11 se utilizaron para amplificar los fragmentos de ADNc por amplificación por PCR (SEQ ID NO 1-36).
15 PCR propensa a error. Se realizaron experimentos de PCR propensa a error siguiendo las indicaciones proporcionadas por ADN Taq polimerasa (Thermo Fischer) usando 10 ng de molde en 100 µl de mezcla de PCR que contenía MgCl2 5,5 mM y MnCl2 0,15 mM.
Mantenimiento, cultivo e ingeniería evolutiva de cepas. Las cepas generadas en estos estudios se enumeran en la Tabla 13. Para el almacenamiento de las cepas usadas en este trabajo (Tabla 2), se realizaron cultivos en matraces oscilantes en medio rico (YP), que consistía en 10 g I-1 de extracto de levadura (Oxoid) y 20 g I-1 de peptona (BD Difco), complementado con o bien 2 % de glucosa (YPD), 2 % maltosa (YPM; en caso de derivados de 5 RN1053), o 3 % de xilosa (YPX; en caso de derivados de YD01227). Los cultivos se mantuvieron a 30 ºC en un agitador orbital hasta que los cultivos alcanzaron la fase de crecimiento estacionaria. Después de añadir glicerol al 30 % (v/v), se almacenaron las muestras de los cultivos en matraces agitados en alícuotas de 2 ml a -80 ºC.
Para las caracterizaciones de cepas e ingeniería evolutiva, se realizaron cultivos usando medio mineral según Verduyn usando urea como fuente de nitrógeno (Verduyn-urea Luttik et al, 2001, J Bacteriol, 182:501-517) a pH 4,5
10 complementado con el azúcar deseado (mezclas). En cultivos de las cepas modelo RN1053 o YD01227, se complementó Verduyn-urea con 0,2 g I-1 de histidina (Sigma-Aldrich; Verduyn-urea-his) para complementar para la auxotrofía de histidina.
Se realizaron cultivos de cepas para la caracterización de los perfiles de crecimiento y de consumo de azúcares en matraces con agitación, un lector de Bioscreen C que usa placas de pocillos en panal de abeja (Growth Curves Ltd,
15 representado por Thermo Fisher Scientific BV, Breda, Los Países Bajos). Los cultivos se mantuvieron a una temperatura de 30 ºC. Específicamente con el fin de ingeniería evolutiva, se cultivaron cultivos de quimiostato en un biorreactor de tanque con agitación de 3 l (Applikon, Schiedam, Los Países Bajos) lleno de 500 ml de Verduyn-ureahis complementado con las fuentes de carbono requeridas a una temperatura de 30 ºC. El punto de consigna del oxígeno disuelto inicial (DO) fue del 5 %, la agitación se realizó a 400 rpm y la DO600 inicial fue 0,2.
20 Tabla 12: Plásmidos y secuencias de genes / proteínas
Plásmido/gen/proteína
Tipo de secuencia SEQ ID NO o referencia Ejemplo
pRS313-P7T7 (control de vector vacío)
ADN artificial 117 7, 8, 9, 10, 11, 13, 15
pRS313-P7TA-GAL2 (pDB1250)
ADN artificial 12
pRS313-P7T7-iHXT11
ADN artificial 7
pRS313-P7T7-HXT11
ADN artificial 8, 9, 10
pRS313-P7T7-HXT12
ADN artificial 8
pRS313-P7T7-HXT2
ADN artificial 9, 10
pRS313-P7T7-HXT11-GFP
ADN artificial 57 10
pRS313-P7T7-mHXT11 (N366D)
ADN artificial 11
pRS313-P7T7-HXT36
ADN artificial 15
pRS313-P7T7-mHXT36(N367l)
ADN artificial 15
HXT11
ADN, S. cerevisiae 58 7, 8, 9, 10, 11, 12
HXT2
ADN, S. cerevisiae 59 9, 10
GAL2
ADN, S. cerevisiae 60 12
HXT3-6
ADN, S. cerevisiae 61 15
Hxt11p
Proteína, S. cerevisiae 62 7, 8, 9, 10, 11, 12
Hxt2p
Proteína, S. cerevisiae 63 9
Gal2p
Proteína, S. cerevisiae 64 10
Hxt36p
Proteína, S. cerevisiae 65 15

Tabla 13: Cepas usadas o preparadas en el presente documento
Cepa
Genotipo Ejemplo
RN1001
Mat a, ura3-52, leu2-112, gre3::loxP, loxP-Ptpi:TAL1, loxP-Ptpi::RKI1, loxP-Ptpi-TKL1, loxP-Ptpi-RPE1, delta::Padh1XKS1Tcyc1-LEU2, delta::URA3-Ptpi-xylA-Tcyc1 10
RN1014
RN1001 + ingeniería in vivo sobre xilosa y ácido acético Referencia
RN1041
RN1001 his3::loxP WO2013081456
RN1041-vacío
RN1041, pRS313-P7T7 (control de vector vacío) 8, 11
RN1053
RN1041 hxt2::loxP-kanMX-loxP, hxt367::loxP-hphMX-loxP, hxt145::loxPnatMX-loxP, gal2::loxP-zeoMX-loxP 6,7
RN1053-X2
Colonia individual RN1053 seleccionada sobre YPX después de la ingeniería evolutiva en quimiostato sobre 2 % de xilosa 6,7
RN1053-X2-hxt11Δ
RN1053-X2, hxt11::HIS3 7
RN1053-vacío
RN1053, pRS313-P7T7 (control de vector vacío) 8, 9, 10, 15
RN1053-HXT2
RN1053, pRS313-P7T7-HXT2 9
RN1053-HXT3-6
RN1053, pRS13-P7T7-HXT3-6 15
RN1053-mHXT36(N3671)
RN1053, pRS13-P7T7-mHXT3-6(N3671) 15
RN1053-HXT11
RN1053, pRS13-P7T7-HXT11 8, 9, 10, 11, 13
RN1053-mHXT11-N366D
RN1053, pRS313-P7T7-mHXT11(N366D) 13
RN1053-iHXT11
RN1053-pRS313-P7T7-iHXT11 7
RN1053-HXT11-GFP
RN1053, pRS313-P7T7-HXT11-GFP 10
RN1053-HXT12
RN1053, pRS13-P7T7-HXT12 8
YD01227 (ori)
RN1014 glk1::lox72; hxk1::loxP; hxk2::lox72; gal1::loxP; his3::loxPnatMXloxP 14
YD01227-evoA, -B, y -C
YD01227, tres colonias individuales seleccionadas en placas con 1 % de xilosa + 10 % de glucosa después de series de ingeniería evolutiva en quimiostato (véase el Ejemplo 14) 14
YD01227-vacío
YD01227, pRS313-P7T7 (control de vector vacío) 13
YD01227-HXT2
YD01227, pDB1162 (pRS313-P7T7-HXT2) 12
YD01227-GAL2
YD01227, pDB1250 (pRS313-P7TA-GAL2) 12
YD01227-HXT11
YD01227, pDB1152 (pRS313-P7T7-HXT11) 12, 13
YD01227mHXT11(N366D)
YD01227, pRS313-P7T7-mHXT11(N366D) 13
Métodos analíticos. Se monitorizó el crecimiento celular por densidad óptica (DO) a 600 nm usando espectrofotómetro de UV-visible (Novaspec PLUS). Se midieron las concentraciones de glucosa, xilosa, etanol en 5 sobrenadante de cultivos (separado del sedimento de células después de la centrifugación a 4000 rpm durante 5 min) por cromatografía líquida de alta resolución (Shimadzu, Kioto, Japón) usando una columna Aminex HPX-87H (Bio-Rad) y un detector del índice de refracción (Shimadzu, Kioto, Japón). La temperatura de la columna y el detector se mantuvo a 65 ºC. La fase móvil fue H2SO4 0,005 N a un caudal de 0,55 ml/min.
Medición de la captación de azúcar. Se midió la captación de xilosa radiomarcada del siguiente modo: las células
10 se cultivaron durante 24 horas en matraces con agitación en Verduyn-urea complementado con 2 % de xilosa y 0,05 % de maltosa y se recogieron por centrifugación (3.000 rpm, 3 min, 20 ºC), se lavaron y se resuspendieron en
Verduyn-urea. Se añadieron reservas de [14C] xilosa o [14C] glucosa (CAMPRO scientific, Veenendaal, Los Países Bajos) a la suspensión de células. La reacción se detuvo, para xilosa después de 1 minuto y para glucosa después de 15 segundos, mediante la adición de 5 ml de cloruro de litio 0,1 M, y la suspensión de células se filtró (filtro de membrana de HV de 0,45 µm, Millipore, Francia). Los filtros se lavaron con otros 5 ml de cloruro de litio y se contaron con contador de centelleo líquido en un Emulsifier Scintillator Plus (Perkin-Elmer, EE.UU.). Se hicieron experimentos de captación para YD01227-ori y YD01227-evo con xilosa 0,5, 2, 6, 20, 40 mM o glucosa 0,1, 0,4, 1,5, 6, 20, 80 mM. Se realizaron estudios de competición de glucosa para RN1053-HXT3-6 y RN1053-mHXT3-6(N3671), RN1053-HXT11 y RN1053-mHXT11 (N366D) con la reserva de [14C]xilosa y con glucosa sin marcar. Las concentraciones de xilosa y de glucosa finales fueron 50 mM y 50-500 mM, respectivamente.
Microscopía de fluorescencia. Se transformó el plásmido pRS313-P7T7-HXT11-GFP (SEQ ID NO 57) en la cepa RN1053 y RN1041. Se inocularon colonias frescas en medio mínimo con xilosa o glucosa. Se sometió un cultivo celular líquido fresco tomado en la fase de crecimiento exponencial (a una densidad óptica de 10 a 600 nm) a microscopía de fluorescencia en un microscopio Nikon Eclipse-Ti equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 100×, un filtro para GFP y una cámara refrigerada Nikon DS-5Mc. Los presentes inventores examinaron rutinariamente al menos 100 células por muestra, y cada experimento se duplicó al menos tres veces.
Transformación automatizada y recogida de colonias. Para la generación de transformación de una biblioteca de mutagénesis de saturación en YD01227, se realizaron cultivos en matraces con agitación en o bien YPM para RN1053, o YPX para YD01227 (véase más adelante). Las células de levadura se sedimentaron y, posteriormente, se usaron en un protocolo de transformación automatizado basado en Gietz, R.D. y Woods, R.A. (Gietz, R.D. y Woods, R.A. 2006, Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Mol. Biol., 313:107120). Las mezclas de transformación se sembraron en medio de selección que consistía en base nitrogenada de levadura (Sigma-Aldrich; 6,7 g I-1), agar (BD Biosciences; 15 g I-1), complementado con o bien 2 % de maltosa (transformaciones de RN1053) o 3 % de xilosa (transformaciones de YD01227). Las placas de transformación se incubaron a 30 ºC, y después de la formación de colonias, las colonias volvieron a sembrarse usando un proceso automático que transfiere las colonias a placas de microtitulación de 96 pocillos (MTP) que contienen los medios de selección anteriormente citados. Se incubaron MTP con transformantes a 30 ºC hasta que se observó crecimiento claro.
Análisis de RMN. Para la cuantificación de glucosa, xilosa, glicerol, ácido acético y etanol en la muestra, se transfieren 100 µl de muestra con exactitud a un vial adecuado. Posteriormente, se añaden 100 µl de disolución de patrón interno, que contiene ácido maleico (20 g/l), EDTA (40 g/l) y cantidades traza de DSS (ácido 4,4-dimetil-4silapentano-1-sulfónico) en D2O, y 450 µl de D2O.
Los espectros de RMN 1H 1D se registran en un Bruker Avance III 700 MHz, equipado con una crio-sonda, usando un programa de pulsos con supresión de agua (potencia correspondiente a 3 Hz) a una temperatura de 27 ºC.
Las concentraciones de analito se calculan basándose en las siguientes señales (δ con respecto a DSS):
 Pico de α-glucosa a 5,22 ppm (d, 0,38 H, J = 4 Hz),
 Pico de α-xilosa a 5,18 ppm (d, 0,37 H, J = 4 Hz),
 Pico de glicerol a 3,55 ppm (dd, 2 H, J1,2 = 6 Hz y J1a,1b = 12 Hz)
 Pico de ácido acético a 1,91 ppm (s, 3 H)
 Pico de etanol a 1,17 ppm (t, 3 H, J = 7Hz)
 El usuario de señal para el patrón:
 Pico de ácido maleico a 6,05 ppm (s, 2H)
EJEMPLO 6
ELEVADA EXPRESIÓN DE HXT11 DE S. CEREVISIAE EN LA CEPA NEGATIVA DE TRANSPORTE DE XILOSA
DESARROLLADA CON CAPACIDAD RESTAURADA PARA CRECER SOBRE XILOSA
Cultivo en quimiostato de RN1053. Se facilita la captación de xilosa en Saccharomyces cerevisiae por un subgrupo distinto de transportadores de hexosa (Hamacher et al, 2002, Characterization of the xylose-transporting properties of yeast hexose transporters and their influence on xylose utilization. Microbiology, 148: 2783-2788). Los presentes inventores han construido una deleción mutante con capacidades fermentadoras de xilosa (RN1053) que carecen de los principales transportadores de hexosa HXT1-HXT7 y GAL2. Como resultado de las deleciones, RN1053 no es capaz de utilizar xilosa (como se describe en el Ejemplo 1). Saccharomyces cerevisiae posee más genes HXT que los ocho principales (HXT8-17) de los cuales no se sabe mucho más que su expresión es baja o despreciable (Sedlak & Ho, 2004, Characterization of the effectiveness of hexose transporters for transporting xylose during glucose and xylose co-fermentation by a recombinant Saccharomyces yeast. Yeast, 21, pp. 671-684) o que han sido conectados a funciones fisiológicas distintas del transporte de azúcar (Nourani et al 1997 Multiple-drugresistance phenomenon in the yeast Saccharomyces cerevisiae: involvement of two hexose transporters. Mol Cell Biol, 17: 5453-5460). Por tanto, los presentes inventores se refieren a ellos como los genes HXT crípticos. Se hizo un intento por seleccionar posibles mutaciones espontáneas en loci HXT crípticos que producen la expresión mejorada o afinidad por xilosa posiblemente mejorada. Con el fin de hacer esto, se cultivó la cepa RN1053 en un cultivo en quimiostato anaerobio de xilosa limitada a una tasa de dilución de 0,05 h-1. Las cepas desarrolladas por el cultivo en quimiostato, RN1053-X2, se aislaron sobre placa de 2 % de xilosa. Se seleccionó una única colonia para cultivo en matraz con agitación aerobio en Verduyn-urea-his complementado con 2 % de xilosa durante 96 h para comparación con la cepa de RN1053 original. Las curvas de crecimiento de la cepa RN1053-X2 y RN1053 se representaron en la Fig. 12A. La cepa RN1053-X2 desarrollada fue capaz de crecer sobre 2 % de xilosa, mientras que la cepa RN1053 original no creció sobre el medio de xilosa. Un motivo podría ser que uno o más de los genes HXT crípticos (HXT8-HXT17) se reguló por incremento sobre medio de xilosa durante el cultivo en quimiostato, facilitando la captación de xilosa.
Perfil de expresión generado por RN1053-X2. Se compararon los patrones de expresión de HXT8-HXT17 en la cepa RN1053-X2 generada y la cepa RN1053 original durante los cultivos discontinuos sobre 2 % de medio de xilosa. El nivel de transcripción de HXT11 y HXT12 aumentó espectacularmente hasta 8 veces en la cepa RN1053-X2 desarrollada desde el comienzo de la fase exponencial (Fig. 12B) y alcanzó un nivel máximo en el día 3, en comparación con la cepa RN1053 original. El quimiostato fue eficaz para la evolución de mutantes para potenciar el consumo de xilosa expresando genes transportadores HXT11 y/o HXT12 en la cepa RN1053. Sin embargo, el nivel de expresión de otros genes HXT (es decir, HXT8-HXT10 y HXT13-HXT17) fue reprimido sobre medio de xilosa, en comparación con no mutada de RN1053.
La primera etapa limitante del metabolismo de la xilosa es su transporte a través de la membrana plasmática (Kahar P, Taku K, Tanaka S, 2011. Enhancement of xylose uptake in 2-deoxyglucose tolerant mutant of Saccharomyces cerevisiae. J. Biosci. Bioeng. 111:557-63). Se informó que la expresión de los genes transportadores HXT de
S. cerevisiae estuvo regulada en respuesta a diferentes niveles de glucosa extracelular (Ozcan & Johnston, 1999. Function and regulation of yeast hexose transporters. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63:554-569). Posiblemente, las mutaciones en los promotores o genes reguladores son la base de la expresión potenciada de los genes HXT crípticos en la cepa RN1053-X2 desarrollada en el cultivo en quimiostato sobre glucosa.
EJEMPLO 7
INACTIVACIÓN/SILENCIAMIENTO DE HXT11 EN RN1053 GENERADA SUPRIME LA CAPACIDAD RECIENTEMENTE ADQUIRIDA PARA CRECER SOBRE XILOSA
Inactivación y silenciamiento de HXT11 en la cepa RN1053-X2. Para la deleción de la construcción de HXT11, se amplificó el casete de expresión PHIS3-HIS3-THIS3 del molde de plásmido pRS313-P7T7 (SEQ ID NO 117) usando los oligonucleótidos KOP11 (SEQ ID NO 98) y KOT11 (SEQ ID NO 99) que consisten en secuencias flanqueantes de HXT11 para la integración en el locus HXT11 y la secuencia de HIS3 para amplificar el casete de expresión.
Con el fin de determinar si Hxt11p era responsable del crecimiento espontáneo sobre xilosa, los presentes inventores delecionaron HXT11 en la cepa RN1053-X2 desarrollada por sucesión de deleción génica de una etapa complementando para el marcador HIS3 tras la deleción de HXT11. Niveles de ARNm de HXT11 disminuyeron considerablemente después de que se introdujera la construcción de inactivación (Figura 13a). Cuando HXT11 se alteró en la cepa RN1053-X2, la cepa perdió su capacidad recientemente adquirida para crecer sobre medio de xilosa (Figura 13b). Además, el nivel de expresión de HXT11 de cepas inactivadas disminuyó al 60 %. Lo más probablemente, todavía se midieron niveles de HXT11 ya que también expresaron transcritos de HXT12 en la cepa RN1053-X2 aproximadamente el 98 % homólogos a HXT11 (Figura 13a).
La técnica de ARN antisentido es muy útil para la represión de la traducción de una proteína diana secuestrando ARNm diana en microorganismos. Puede promoverse la represión de la traducción por secuencias antisentido que se hibridan con ARN mensajero. El mecanismo antisentido implica la interferencia de ribosomas, en la que el ribosoma no puede unirse a los nucleótidos del ARNm (Park et al 2001. Antisense-mediated inhibition of arginase [CAR1] gene expression in Saccharomyces cerevisiae. J. Biosci. Bioeng. 92:481-484). Este método es más conveniente para inhibir la expresión génica que el método de alteración de genes. Para la expresión de HXT11 inversa (iHXT11), se amplificó iHXT11 usando cebadores iHXT11F (SEQ ID NO: 100) y iHXT11R (SEQ ID NO: 101) y se clonó como el fragmento BamHI-XbaI inversamente entre el promotor HXT7 truncado y el terminador HXT7 en el vector pRS313-P7T7 (Figura 13c; SEQ ID NO: 117). La construcción se introdujo en RN1053-X2 para expresar ARN antisentido de HXT11 que evita la traducción de ARNm de HXT11 en proteína. iHXT11 se expresó en exceso en la cepa RN1053-X2, y la cepa perdió su capacidad para crecer sobre medio de xilosa (Figura 13d).
Estos experimentos de inactivación/silenciamiento indican claramente que la cepa RN1053-X2 desarrollada empezó a consumir xilosa debido al aumento en la expresión de HXT11 y la probable expresión funcional de Hxt11p sobre la membrana de levaduras.
EJEMPLO 8
LA EXPRESIÓN EN EXCESO DE HXT11 EN RN1053 RESTAURA EL CRECIMIENTO SOBRE XILOSA
Expresión en exceso de HXT11 y HXT12 en RN1053. Para determinar si las cepas que expresan HXT11 o HXT12 son capaces de crecer sobre xilosa, se expresaron individualmente ambos genes HXT en la cepa RN1053 original que es incapaz de crecer sobre xilosa debido a la deleción de los ocho transportadores de hexosa principales (HXT1-HXT7 y GAL2). Para estos experimentos se usaron RN1041-vacío, RN1053-vacío, RN1053-HXT11 y RN1053-HXT12 (véase la Tabla 13). RN1053-HXT11 y RN1053 HXT12 se construyeron del siguiente modo: los marcos de lectura abiertos para los genes HXT11 y HXT12 fueron amplificados por PCR a partir de ADNc de RN1053 no mutada usando los cebadores HXT11F (SEQ ID NO: 102), HXT12F (SEQ ID NO: 103) y HXT11/12R (SEQ ID NO: 104); se secuenciaron fragmentos de PCR y se encontró que eran el 100 % homólogos a las secuencias de genes CEN.PK113-7D respectivas (Genome Database de Saccharomyces, www.yeastgenome.org; secuencia de HXT11 SEQ ID NO; 119); los fragmentos de PCR se cortaron usando enzimas de restricción XbaI y BamHI y se clonaron en vector de expresión en levadura pRS313-P7T7 (SEQ ID NO: 117; Figura 13C; Tabla 12). La construcción de expresión de HXT11 y HXT12 de los transportadores se transformaron en RN1053 usando una técnica genética de levadura estándar según el método de Gietz (Gietz Y Woods 2006, Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Mol. Biol 313 pp. 107-120). Los transformantes aislados de colonias individuales produjeron las cepas RN1053-HXT11 y RN1053-HXT12. Ambas cepas se inocularon en medio de maltosa, seguido de cultivos en matraz oscilante sobre medios líquidos que contenían 2 % de xilosa y/o 2 % de glucosa. Solo RN1053-HXT11 y RN1041 presentaron un claro crecimiento en el plazo de 48 horas, mientras que RN1053-vacío y RN1053-HXT12 presentaron difícilmente cualquier crecimiento en este periodo (Figura 14a). El crecimiento de RN1053-HXT11 empezó antes y presentó crecimiento más rápido que el de la cepa de referencia RN1041-vacío (con ruido de fondo de HXT no mutada) en medio de xilosa (Figura 14b). Sin embargo, la introducción de la secuencia de HXT12 en RN1053 no permitió el crecimiento sobre medio de xilosa. En la cepa de referencia de la base de datos del genoma de Saccharomyces S288C, HXT12 se considera un pseudogén debido a una mutación de desplazamiento del marco (www.yeastgenome.org; ORF YIL170W y YIL171W).
Este experimento mostró claramente que el crecimiento espontáneo sobre xilosa de RN1053-X2 se produjo por expresión más alta de HXT11 y que HXT11 es un transportador de xilosa eficiente, si se expresa.
EJEMPLO 9
Hxt11p FACILITA EL TRANSPORTE DE XILOSA CON NIVEL INTRÍNSECO MÁS ALTO DE ESPECIFICIDAD POR XILOSA QUE Hxt2p
Captación de xilosa por Hxt11p. Para determinar si HXT11 es capaz de transportar xilosa en ausencia y presencia de glucosa, se realizaron estudios de captación usando 14C-xilosa radiomarcada. Para estos experimentos se usaron las cepas RN1053-vacío, RN1053-HXT11 y RN1053-HXT2 (véase la Tabla 13). HXT2 es conocida por sus capacidades de transporte de xilosa (Saloheimo et al, 2007, Xylose transport studies with xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae strains expressing heterologous and homologous permeases. Appl Microbiol Biotechnol. 74:1041-1052; Sedlak y Ho, 2004, Characterization of the effectiveness of hexose transporters for transporting xylose during glucose and xylose co-fermentation by a recombinant Saccharomyces yeast. Yeast, 21:671-684). La construcción de RN1053-HXT11 fue como se ha descrito en el ejemplo previo. Se construyó RN1053-HXT2 del siguiente modo: se amplificó por PCR HXT2 (SEQ ID NO: 120) a partir del genoma de RN1001 (Tabla 12) usando los cebadores F HXT2 Xbal (SEQ ID NO: 107) y R HXT2 Cfr9l (SEQ ID NO: 108). Se verificó la secuencia del fragmento de PCR resultante y se clonó en pRS313-P7-T7 (SEQ ID NO: 117) como el fragmento XbaI-Cfr9I. RN1053 se transformó con la construcción resultante pRS313-P7T7-HXT2 (; véase la Tabla 12) generando un transformante derivado de una única colonia llamada la cepa RN1053-HXT2 (Tabla 13). Para determinar si Hxt11p aumentó la captación de xilosa en la cepa RN1053, se midió la captación de xilosa usando 14C en las células que expresan los transportadores. En presencia de glucosa, las cepas que expresan HXT11 acumularon hasta el 50 % más de xilosa en comparación con las cepas que expresan HXT2 en presencia de glucosa (Figura 15). Además, la captación de xilosa de RN1053-HXT11 aumentó hasta 4,5 veces, en comparación con RN1053-HXT2 (Figura 15). Estos experimentos muestran que Hxt11p es capaz de transportar xilosa a través de la membrana plasmática de levadura. Aún más, Hxt11p emplea una especificidad intrínseca más alta hacia xilosa que podría no ser fácilmente competida por la glucosa en comparación con los transportadores de xilosa previamente identificados del genoma de levadura tales como Hxt2p.
EJEMPLO 10
Hxt11p SE EXPRESA FUNCIONALMENTE EN LA MEMBRANA PLASMÁTICA DE LEVADURA
Expresión funcional de HXT11 en RN1053. La detección de Hxt11p por análisis de inmunotransferencia no demostrará completamente la expresión funcional de la proteína. Para la expresión funcional de una proteína transportadora de hexosa, debe residir en la membrana plasmática. Con el fin de monitorizar la expresión y el direccionamiento de Hxt11p, se manipuló una proteína Hxt11p-GFP quimérica y se examinó por fluorometría y microscopía de fluorescencia. Para estos estudios, se usaron RN1053-HXT11-GFP, RN1041-HXT11-GFP, RN1053HXT11 y RN1053-vacío (Tabla 13). Para la construcción de cepas que expresan HXT11-GFP, se transformaron RN1053 y RN1041 con el vector de expresión que lleva esta proteína quimérica Hxt11-GFP (pRS313-P7T7-HXT11-GFP; SEQ ID NO: 118; Tabla 12). La proteína de fusión Hxt11p+GFP es un transportador de hexosa funcional: restauró el crecimiento sobre 2 % de xilosa a la cepa RN1053 (Figura 16a). Además, se localizó la fluorescencia de Hxt11p+GFP de RN1053-HXT11-GFP y RN1041-HXT11-GFP en la membrana plasmática sobre medio de xilosa o glucosa (Figura 16b). Estos experimentos muestran que Hxt11p-GFP es funcional como transportador de xilosa y que Hxt11p se expresa funcionalmente en la membrana plasmática.
EJEMPLO 11
LA EXPRESIÓN DE HXT11 EN RN1053 FACILITA LA CO-FERMENTACIÓN MÁS RÁPIDA DE GLUCOSA Y
XILOSA EN CONCENTRACIONES INDUSTRIALMENTE RELEVANTES
Perfil de fermentación de RN1053-HXT11 en mezclas de glucosa-xilosa. Para determinar el comportamiento de fermentación sobre una mezcla de glucosa-xilosa de una cepa que expresa funcionalmente HXT11 en un ruido de fondo de deleción de HXT (hxt1-7, gal2) en comparación con una cepa que expresa el panorama de HXT no mutada, se realizaron fermentaciones sobre Verduyn-urea complementado con concentraciones de glucosa-xilosa industrialmente relevantes (80 y 40 g l-1, respectivamente). Para estos fermentaciones se usaron RN1053-HXT11 y RN1041-vacío (véase tabla 13).
Como se muestra en la Figura 17a, xilosa de RN1041 no se co-fermentó con glucosa; mientras que el grado de cofermentación de glucosa-xilosa se potenció en la cepa RN1053-HXT11 como se muestra en la Figura 17b. Además, la fermentación de xilosa se agotó completamente en HXT11-RN1053, mientras que 10 g/l de xilosa quedaron todavía en RN1041 a las 40 h; además, el consumo de xilosa de RN1053-HXT11 aumentó espectacularmente al 2 % de glucosa residual, y la concentración de etanol aumentó de 63,92 g/l a 72,33 g/l al final de la fermentación (Figura 17ab).
Este ejemplo muestra que una cepa en la que están delecionados los transportadores de hexosa principales, pero que expresa HXT11, presenta utilización de xilosa más rápida que una cepa con un ruido de fondo de transportador de hexosa no mutada sin HXT11.
EJEMPLO 12
LA EXPRESIÓN DE HXT11 NO MUTADA RESPALDA EL CRECIMIENTO SOBRE XILOSA EN EL CRIBADO DE
CONTADOR DE LA ACTIVIDAD DE TRANSPORTE DE GLUCOSA
Objetivo. Usando el cribado de contador de la actividad de transporte de glucosa (GTAC), es decir, transformación de la cepa mutante de hexocinasa YD01227 como hospedador para introducir transportadores y cribado de los transformantes resultantes en medio para el crecimiento y consumo de xilosa en presencia de una cantidad 5 veces más alta de glucosa, pueden identificarse transportadores de xilosa que presentan una capacidad mejorada para transportar xilosa en presencia de un excedente de glucosa (es decir, una afinidad por xilosa más alta que por glucosa; una reducción o más preferentemente eliminación completa de la capacidad de transporte de glucosa, mientras que se mantiene la capacidad de transporte de xilosa al menos al mismo nivel).
Transformación y recogida de colonias. Se transformó YD01227 con construcciones que llevan GAL2 no mutada (pDB1250, EPA-29355), construcciones HXT2 (pDB1162; véase el Ejemplo 9 para el plásmido de construcción) y HXT11 (pRS313-P7T7-HXT11, véase para el Ejemplo 8 de construcción). Para cada transformación, 3 colonias, cuando estuvieron disponibles, se volvieron a sembrar usando recogida de colonias automatizada para placas de MTP de medio de xilosa de YNB + 3 % de agar y se cultivaron a 30 ºC hasta que fue visible el crecimiento de colonias visibles en la punción de agar.
Pre-cultivo y cribado. Para el pre-cultivo, se transfirieron transformantes por proceso automatizado de MTP de medio de agar de selección a placas de pocillos semi-profundos de 96 pocillos (96HDWP) que contenían medio de selección líquido que consistía en medio mineral (según Verduyn, con urea como fuente de nitrógeno) complementado con 3 % de xilosa. Se incubaron HDWP de 96 pocillos durante 3 días (pre-cultivo) en un agitador orbital a 30 ºC y 750 rpm. Posteriormente, para cada muestra, se transfirieron 20 µl de cultivo a placas de 24 pocillos profundos (24 DWPs) que contenían 2,5 ml de Verduyn-urea complementado con la mezcla de azúcares glucosa:xilosa en una relación 5:1 con las siguientes concentraciones: 10 g l-1 de glucosa y 2 g l-1 de xilosa (medio YD10). Para cada uno de los tres puntos de muestreo se inoculó una serie de DWP de 24 pocillos. En cada 24DWP, se inoculó un control de crecimiento de RN1001 para tener una indicación de los efectos de variación de placas entre diferentes 24DWP. Después de 24 horas, 72 horas y 96 horas se realizó el muestreo automático, transferencia a 96HDWP para la medición de DO automatizada a 600 nm de longitud de onda. Después de la última medición de DO después de 96 horas, las células se sedimentaron después de la centrifugación y se recogieron 100 µl de sobrenadante para el análisis por RMN de flujo de azúcares residuales y formación de etanol en el medio, después de la incubación (véase anteriormente para la descripción del método).
Resultados. Mientras que RN1001 presentó crecimiento de 24 horas en adelante (Figura 18a) y consumo completo de tanto glucosa como xilosa (Figura 18b, 18c), transformantes YD01227 que expresan construcciones de GAL2, HXT2 y HXT11 no consumieron glucosa (Figura 18c) debido a la deleción de las actividades de hexo-y glucocinasa. Las últimas cepas también presentaron diversos perfiles de crecimiento (Figura 18a) con el tiempo y diversas concentraciones residuales de xilosa que representan su capacidad individual para consumir xilosa (Figura 18b) en presencia de glucosa. YD01227 que expresa la construcción de HXT11 (YD01227-HXT11) presentó un claro crecimiento a las 72 horas (Figura 18a) y consumo sustancial de xilosa residiendo 4,83 ± 1,26 g l-1 (n=3) de xilosa en el medio después de 96 horas desde 22,7 ± 0,12 g l-1 (n=43) presente en el medio al principio del experimento; YD01227-GAL2 y YD01227-HXT2 presentaron difícilmente cualquier crecimiento y no se consumió mucha xilosa en comparación con YD01227-HXT11, residiendo respectivamente 18,34 ± 0,39 y 21,29 ± 0,32 g l-1 de xilosa en el medio después de 96 horas de incubación (Figura 18b).
Este ejemplo muestra que HXT11 respalda la considerable formación de biomasa y el consumo de xilosa en presencia de glucosa que indica que la expresión de HXT11 en el mutante de hexocinasa YD01227 permite un componente más específico de xilosa en el transporte de azúcar que el ejercido por la expresión de GAL2 o HXT2, ambos transportadores de xilosa demostrados en el transportoma de S. cerevisiae (Saloheimo et al, 2007, Xylose transport studies with xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae strains expressing heterologous and homologous permeases. Appl Microbiol Biotechnol., 74:1041-1052; Sedlak and Ho, 2004, Characterization of the effectiveness of hexose transporters for transporting xylose during glucose and xylose co-fermentation by a recombinant Saccharomyces yeast. Yeast 21:671-684; Hamacher et al, 2002, Characterization of the xylose-transporting properties of yeast hexose transporters and their influence on xylose utilization. Microbiology, 148:2783-2788).
EJEMPLO 13
MUTANTE DE HXT11 MEJORADO OBTENIDO DE LA BIBLIOTECA PROPENSA A ERROR DE HXT11 CRIBADA EN YD01227
Para mejorar la captación de xilosa en presencia de glucosa, se realizó PCR propensa a error para generar una biblioteca de mutantes HXT11 que codificaban variantes de Hxt11p que se cribaron para el transporte de xilosa competitivo en presencia de glucosa en la cepa YD01227 (véase la Tabla 3 en el presente documento). La concentración de Mn2+ en la mezcla de reacción de PCR fue 0,15 mM, y se añadió siguiendo el protocolo de PCR propensa a error estándar (Cirino, P.C et al. 2003. Generating mutant libraries using error-prone PCR. Methods Mol. Biol., 231, pp. 3-9) usando los cebadores HXT11F (SEQ ID NO: 41) y HXT11/12R (SEQ ID NO: 43). La biblioteca se clonó en pRS313-P7T7 como fragmentos XbaI-BamHI. La cepa YD01227 se transformó con la biblioteca de HXT11 y se cribaron tres mil transformantes sobre medio de Verduyn-urea complementado con una relación 1:15 de xilosa (1 %) y glucosa (15 %) en formato de placa de 96 pocillos usando Synergy MX (BioTek Instruments, Inc., EE.UU.). De estos 3000 mutantes, se obtuvieron ocho mutantes que superaron a Hxt11p no mutada en el medio de cribado. Se mostró un clon representativo en la Figura 19a. Los plásmidos se aislaron de YD01227 usando el protocolo según Chowdhury (Chowdhury, K. 1991. One step 'miniprep' method for the isolation of plasmid DNA. Nucl. Acids Res 19, pp. 2792), y se re-secuenció. Se encontró que los ocho mutantes levaban un plásmido que llevaba secuencias mutantes que se tradujeron en una proteína que contenía la misma mutación en Hxt11 (secuencia de aminoácidos no mutada Hxt11p SEQ ID NO: 62) que condujo a cambio de aminoácidos en la posición 366 Asn (N) en Asp (D). En experimentos en matraces oscilantes, el mutante N366D (YD01227-mHXT11[N366D]; véase la Tabla 13) también presentó crecimiento más rápido en el medio de cribado en comparación con YD01227-HXT11, como se muestra en la Figura 19a. La construcción pRS313-P7T7-mHXT11(N366D) se re-transformó en RN1053 produciendo RN1053-mHXT11(N366D). RN1053 que expresa el mutante HXT11-N366D no estuvo afectada con respecto a la utilización de xilosa sobre 2 % de medio de xilosa, en comparación con RN1053 que expresa el gen HXT11 no mutado, ya que se observaron curvas de crecimiento similares (Figura 19b).
Captación de azúcar de la cepa RN1053 con Hxt11 y mutante de N366D. Se determinaron la cinética de transporte de xilosa y glucosa en la cepa de S. cerevisiae que utiliza xilosa RN1053 que expresa los transportadores Hxt11 y mHxt11p-(N366D). Se representó la tasa de transporte de xilosa medida frente a la concentración de glucosa o xilosa. La afinidad por glucosa de RN1053-mHXT11(N366D) disminuyó fuertemente hasta 2 veces en comparación con RN1053-HXT11, mientras que la afinidad por xilosa de RN1053-mHXT11(N366D) también disminuyó ligeramente hasta 1,2 veces, en comparación con RN1053-HXT11 (Figura 19c, 19d). Además, en presencia de concentraciones crecientes de cepas de glucosa que expresan el mutante N366D, se acumuló hasta el 75 % más de xilosa en comparación con cepas que expresan Hxt11 (Figura 19e).
Fermentación de xilosa en presencia de glucosa. Se realizaron experimentos de fermentación de mezclas de azúcares comparando RN1053-mHXT11(N366D) con RN1053-HXT11 y RN1041-vacío.
En un primer experimento sobre Verduyn-urea complementado con 100 g/l de glucosa y 60 g/l de xilosa, como se muestra en la Figura 19f, 19g, 19h y 19i, se retrasaron la utilización de glucosa, formación de biomasa (DO600) y producción de etanol de RN1053-mHXT11(N366D) durante la fermentación, en comparación con RN1041 y RN1053-HXT11. Parece que el consumo de glucosa por RN1053-mHXT11(N366D) fue fuertemente reducido en la fase exponencial temprana en comparación con RN1053-HXT11 (Figura 19g). Además, el consumo de xilosa de RN1053-mHXT11 (N366D) no disminuyó (Figura 19h), aunque la densidad celular de RN1053-mHXT11(N366D) fue más baja que la de RN1041 y RN1053-HXT11 (Figura 19f).
En un segundo experimento de fermentación sobre Verduyn-urea complementado con concentraciones de azúcar más bajas (80 g l-1 de glucosa y 40 g l-1 de xilosa) que comparaban RN1053-mHXT11 (N366D) con RN1053-HXT11, se observó una clara diferencia en el perfil de consumo de azúcar (Figura 19j, 19k, 19l). Mientras que el perfil de consumo de glucosa presentó una tasa de consumo de glucosa más rápida durante la fase en la que la glucosa está disminuyendo rápidamente (entre 0 y 35 horas; qgluc(RN1053-HXT11) 2,22 g/l/h frente a qgluc(RN1053-mHXT11[N366D])) 2,04 g/l/h/, disminución del 8,5 % en qgluc), mientras que la tasa de consumo de xilosa ha aumentado enormemente durante la misma ventana de tiempo (qxil(RN1053-HXT11) de 0,23 g/l/h frente a qxil(RN1053-mHXT11[N366D]) de 0,38 g/l/h, pendiente del 65 % en qxil). Durante la fase en la que se fermentó principalmente xilosa (35-73 h), las tasas de consumo de xilosa fueron casi idénticas (qxil(RN1053-HXT11) de 0,36 g/l/h frente a qxil(RN1053-mHXT11[N366D]) de 0,37 g/l/h). La tasa de consumo de xilosa máxima fue más alta y se alcanzó antes en la fermentación para RN1053-mHXT11(N366D) (0,65 g/l/h a 23 h) que para RN1053-HXT11 (0,50 g/l/h a 35 h). Al final de la serie de fermentación (periodo de 72 h típico para fermentaciones industriales), RN1053-HXT11 consumió el 51 % de xilosa, mientras que RN1053-mHXT11(N366D) consumió el 63 %. Los títulos de etanol medidos al final de la fermentación fueron el 4,4 % más altos para RN1053 que expresa el mutante de N366D que para RN1053 que expresa HXT11 no mutada. Considerando que la entrada de azúcares en la fermentación fue casi idéntica, podría imaginarse que se obtuvieron rendimientos más altos de esta mezcla de glucosa-xilosa con concentraciones de azúcar típicas para fermentaciones discontinuas industrialmente relevantes, y más específicamente rendimientos más altos de la fracción de xilosa.
Estos experimentos de fermentación indican que, en comparación con su secuencia de referencia no mutada, la presencia de una variante de transportador específica de xilosa manipulada del transportador de hexosa de HXT11 de S. cerevisiae sobre la membrana aumenta la tasa de consumo de xilosa durante la fase de glucosa, donde la tasa de consumo de glucosa disminuyó algo, y que se obtuvieron rendimientos de etanol más altos finales en una mezcla de glucosa-xilosa típica típica de hidrolizados relevantes industrialmente relevantes.
EJEMPLO 14
LA HEXOCINASA MUTANTE DESARROLLADA CONSUME XILOSA EN PRESENCIA DE GLUCOSA
Ingeniería evolutiva de la cepa YD01227. Para la ingeniería evolutiva, se usó la cepa YD01227 para la ingeniería evolutiva sobre mezclas de glucosa-xilosa para desarrollar la asimilación de xilosa en presencia de glucosa que tiene como objetivo aislar mutantes espontáneos en el transporte de hexosa o la regulación de la expresión y/o actividad del transporte de hexosa.
Se inoculó YD01227 durante 16 horas en matraz oscilante con Verduyn-urea-his complementado con 2 % de xilosa. Al comienzo de la ingeniería evolutiva, se diluyó YD01227 a una DO600 de 0,2 y punto de consigna de DO al 5 % en Verduyn-urea-his que contenía 1 % de xilosa, 3 % de glucosa. Se monitorizó el flujo de salida de dióxido de carbono. En diversos momentos de tiempo se tomaron muestras para el análisis de las concentraciones de glucosa y xilosa. Se determinó si la cepa YD01227 estaba creciendo únicamente sobre xilosa o sobre ambas, glucosa y xilosa. La relación de glucosa con respecto a xilosa, al comienzo de la ingeniería evolutiva, se mantuvo baja a una relación (glucosa 3 %, xilosa 1 %), que todavía permitió el crecimiento de YD01227 al principio del experimento. Sin embargo, esto fue a tasas de crecimiento significativamente más bajas si se compara con el crecimiento en solo 1 % de xilosa. En esta configuración, la cepa consume la xilosa que conduce a relaciones de glucosa:xilosa más altas y, por tanto, una disminución en la tasa de crecimiento. Cuando disminuyó la producción de CO2, se añadió xilosa adicional (5 ml de 50 % de xilosa a 500 ml de volumen de fermentador) para mantener el crecimiento. A una DO600 de 20, que se alcanzó en promedio después de 5-6 días, el cultivo se diluyó en Verduyn-urea-his fresco en una relación de glucosa con respecto a xilosa más alta, si las tasas de crecimiento habían mejorado significativamente en el ciclo previo. En total, en un periodo de tiempo de 27 días, la cepa se diluyó en serie 5 veces en 1 % de Xil/3 % de Glc (1:3), 1,5 % de Xil/9 % de Glc (1:6), 1 % de Xil/8 % de Glc (1:8), 1 % de Xil/10 % de Glc (1:10) y 0,57 % de Xil/10 % de Glc (1:15), respectivamente. Antes de la inoculación en 1 % de xilosa y 8 % de glucosa, el punto de consigna para DO se redujo al 0 % (crecimiento anaerobio) con el fin de mantener una tasa de crecimiento más baja. En la Figura 20 se da el esquema para la relación de glucosa/xilosa en el medio Verduyn-urea-his durante el cultivo en quimiostato (días) de YD01227. Después de 27 días, se tomaron las muestras de la cepa YD01227 desarrollada y se sembraron en 1 % de xilosa y 10 % de glucosa con YD01227 original como control negativo. Mientras que YD01227 original mostró solo pequeñas colonias, las colonias de la cepa YD01227 desarrollada fueron 10-15 veces mayores.
Crecimiento de xilosa y captación de xilosa con/sin competición de glucosa. Después de volver a extender la cepa YD01227 desarrollada sobre una placa de 1 % de xilosa y 10 % de glucosa, se analizaron tres colonias (EvoA, EvoB y EvoC) para el crecimiento en matraces con agitación sobre 1 % de xilosa en presencia de, respectivamente, 0 %, 3 %, 6 % y 10 % de glucosa. YD01227 EvoB tuvo la tasa de crecimiento más alta sobre xilosa al 6 % en 10 % de glucosa y se comparó con la cepa YD01227 original (Figura 21a, 21b). En la cepa YD01227 original (YD01227 ORI en la Figura 21b), la tasa de crecimiento ya está parcialmente inhibida al 3 % de glucosa y completamente inhibida al 6 % y 10 % de glucosa, sin embargo, la cepa YD01227 EvoB muestra solo inhibición menor en la tasa de crecimiento a todas las concentraciones de glucosa y esto parece no estar relacionado con la cantidad de glucosa añadida (Figura 21a). Se usaron las dos mismas cepas en un experimento de captación de 14C xilosa (50 mM) en el que la captación de xilosa se inhibe por glucosa (Figura 21c). La captación de xilosa sin la adición de glucosa en ambas cepas es la misma, sin embargo, tan pronto como la glucosa se añadió a ambas cepas, la captación de xilosa en la cepa YD01227 EvoB no fue tan inhibida como la captación en la cepa YD01227 original. En una relación 1:10 la captación de xilosa en la cepa YD01227 original se suprime completamente, mientras que en la cepa YD01227 EvoB todavía se recogen 5 nmol/mgDW.min.
EJEMPLO 15
EL POLIMORFISMO DE UN SOLO NUCLEÓTIDO EN LA QUIMERA DE HXT3-6 PERMITE EL CONSUMO DE XILOSA EN PRESENCIA DE GLUCOSA EN EL MUTANTE DE HEXOCINASA DESARROLLADO
Expresión de HXT en la cepa YD01227 desarrollada. Se compararon los niveles de expresión de HXT1-17 y GAL2 en las cepas YD01227 EvoB desarrollada y YD01227 original durante cultivos discontinuos en Verduyn-urea-his que contenían 1 % de xilosa y 3 % de glucosa (Figura 22a). Se usaron cebadores (SEQ ID NO: 2-37) en la caracterización de PCR en tiempo real de la expresión de HXT en YD01227 y derivado desarrollado. Además, los niveles de expresión en la cepa YD01227 EvoB también se analizaron en Verduyn-urea-his que contenía 1 % de xilosa y 10 % de glucosa. Los valores de C(t) absolutos (datos no mostrados) muestran que los genes HXT1-7 son los únicos genes HXT que son intermedia o altamente expresados de los que la quimera HXT3-6 (deleción específica en las secuencias de HXT3 y HXT6 intragénicas e intergénicas de linaje de cepa que produce una secuencia quimérica de HXT36) tiene los niveles de expresión más altos. Ninguno de los transportadores de azúcar analizados está regulado por incremento en la cepa YD01227 EvoB en comparación con la cepa YD01227 original. La regulación por incremento observada en el gen HXT1 en YD01227 EvoB en 1 % de xilosa y 10 % de glucosa se produjo por la alta concentración de glucosa en esta muestra que es muy bien conocida (Ozcan & Johnston, 1995, Three different regulatory mechanisms enable yeast hexose transporter (HXT) genes to be induced by different levels of glucose. Mol Cell Biol 15, pp. 1564-1572). Esta alta concentración de glucosa también conduce a la regulación por disminución de HXT2 y HXT7 en YD01227 EvoB. Tanto la regulación por incremento en HXT1 como la regulación por disminución de HXT2 y HXT7 se describen en la bibliografía (Boles & Hollenberger 1997, Kinetic characterization of individual hexose transporters of Saccharomyces cerevisiae and their relation to the triggering mechanisms of glucose repression, FEMS Microbiol Rev 21, pp. 85-111).
Secuenciación de los genes HXT altamente expresados. Se amplificaron HXT1-7 de ADNc que se aisló del cultivo de YD01227 EvoB en 1 % de xilosa y 3 % de glucosa usando los cebadores SEQ ID NO: 49-60. Se secuenciaron los productos de PCR de estos genes. No se revelaron mutaciones en HXT1, HXT2 y HXT4, una mutación silenciosa en HXT5 y HXT7 y una mutación que condujo a cambio de aminoácido en la posición 367 (Asn en Ile; N367I) en la quimera HXT3-6. En algún sitio en el linaje de la cepa YD01227 se produjo una deleción entre los loci vecinos de HXT3 y HXT6 en los que se delecionaron secuencias intragénicas e intergénicas (parte de la parte 3' de ORF de HXT3, terminador HXT3, promotor HXT6, ORF de HXT6) produciendo una secuencia quimérica de HXT36 que está en marco y puede expresarse como ARNm y se tradujo en proteína funcional. La proteína quimérica traducida Hxt3-6p de la que los primeros 438 aminoácidos son idénticos a la secuencia de aminoácidos de CEN.PK Hxt3p, mientras que los 130 aminoácidos hacia el extremo C son idénticos a Hxt6p en CEN.PK. Se han documentado reordenamientos genómicos en el locus HXT3-6-7 en el pasado, por ejemplo secuencias quiméricas de HXT6/7 resultantes de cultivos en quimiostato a bajas concentraciones de glucosa, y se propone que se producen por recombinación homóloga debido a los estiramientos altamente homólogos de secuencias en esta agrupación de transportadores de hexosa (Brown et al 1998. Multiple duplications of yeast hexose transport genes in response to selection in a glucose-limited environment. Mol Biol Evol 15:931-942). La mutación puntual N367I se localiza en el dominio transmembrana (TMD) 8 que se sabe que contiene restos responsables de la afinidad por glucosa (Kasahara & Kasahara, 2003. Transmembrane segments 1, 5, 7 and 8 are required for high-affinity glucose transport by S. cerevisiae Hxt2 transporter. Biochem J. 372:247-252, reconfirmado por la presente solicitud de patente).
EJEMPLOS 16-18
MÉTODOS
Métodos no mencionados en la sección de los Ejemplos 16 y 17 fueron ya descritos en la Ejemplos 6-15 de la sección. Oligonucleótidos usados en los estudios descritos en el Ejemplo 16 y 17 se representan en la Tabla 14. Se hizo la mutagénesis saturada de la posición N367 en HXT36 usando PCR con Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix con tampón HF usando los pares de cebadores F HXT36 BcuI (SEQ ID NO 127)/R HXT36 367NNN (SEQ ID NO 128) y F HXT36 367NNN (SEQ ID NO 129)/R HXT36 BamHI (SEQ ID NO 130). Se usaron posteriormente fragmentos de 1119 y 623 pares de bases en una PCR de solapamiento usando los cebadores externos F HXT36 BcuI y R HXT36 BamHI y se clonaron en pRS313P7T7 usando BcuI y BamHI. La secuenciación de 48 clones de E. coli dio N367S (tcc), N367P (ccc), N367G (ggg), N367Y (tac), N367A (gcc), N367H (cac), N367R (agg), N367F (ttt), N367E (gag) y N367V (gtg). Se amplificaron los 8 aminoácidos restantes en la posición 367 y se clonaron con PCR de solapamiento usando cebadores específicos en los que NNN se sustituyó por tta (L), tgt (C), tgg (W), atg (M), act (T), aag (K), gat (D) y cag (Q).
Se hicieron fusiones de GFP del extremo carboxilo con mutante HXT36 y HXT36-N367I por amplificación de los genes correspondientes con Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (tampón HF) usando los cebadores F HXT36 BcuI (SEQ ID NO 127) y R HXT36 BamHI-stop (SEQ ID NO 131). El propio GFP se amplificó con F GFP BamHI (SEQ ID NO 132) y R GFP ClaI (SEQ ID NO 133). Se digirieron HXT36 y HXT36-N367l con las enzimas de
restricción BcuI y BamHI y GFP se digirió con BamHI y ClaI. Los genes HXT36 se ligaron por separado en una ligación de dos fragmentos juntos con GFP en pRS313-P7T7 que se cortó con BcuI y ClaI.
Para las fermentaciones del Ejemplo 18, se cultivaron las cepas, por duplicado, en botellas Schott de 50 ml llenas hasta el borde con 68 ml de medio de fermentación que contenía 0,5 % de D-glucosa y 0,5 % de D-xilosa y se mantuvieron completamente cerradas a 30 ºC en un baño de agua. La velocidad de agitación, con un agitador de imán, fue 200 rpm y las cepas se inocularon a una DO600 inicial de aproximadamente 8,0. A intervalos regulares se tomaron muestras para las mismas mediciones de DO600 y análisis de HPLC.
Tabla 14. Oligonucleótidos usados en la clonación y secuenciación.
SEQ ID NO Nombre Secuencia (5' → 3')
127 F HXT36 Bcui GCATACTAGTATGAATTCAACTCCAGATTTAATATCC 128 R HXT36 367NNN CAACAAGTAGAGAAGAAnnnGACGACACCG 129 F HXT36 367NNN CGGTGTCGTCnnnTTCTTCTCTACTTGTTG 130 R HXT36 BamHi ACGTGGATCCTTATTTGGTGCTGAACATTCTCTTGT 131 R HXT36 BamHI-stop CCATGGATCCTTTGGTGCTGAACATTCTCTTGTAC 132 F GFP BamHI AAAGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC 133 R GFP ClaI AAAATCGATTTACTTGTACAGCTCGTCC
EJEMPLO 16 LA DISMINUCIÓN DE VMÁX DE HXT3-6 N367I NO ES EL RESULTADO DE LA DISMINUCIÓN DE LA EXPRESIÓN
DE MUTANTE COMO SE MUESTRA POR ESTUDIOS DE MARCADO DE GFP
Para garantizar que esta Vmáx más baja no es debida a una disminución en la expresión, se prepararon quimeras en las que GFP se fusionó con el extremo C de HXT36 y el mutante HXT36-N367I. Ambas fusiones se transformaron en la cepa RN1053, y la obtención de imágenes de fluorescencia reveló que las proteínas estaban uniformemente distribuidas sobre la membrana plasmática (Fig. 23A y 23B). Como se registraron los mismos niveles de GFP, se expresan Hxt36p y Hxt36p-N367I a grados similares (Fig. 23C).
EJEMPLO 17
LA MUTAGÉNESIS DE SATURACIÓN EN LA POSICIÓN ASPARAGINA-367 EN LA QUIMERA DE HXT3-6 PARA LA EXPLORACIÓN DEL ESPACIO DE SECUENCIA REVELA LA ALANINA COMO UN RESTO POTENTE EN EL
TRANSPORTADOR POTENCIADO CON CAPACIDAD DE TRANSPORTE DE XILOSA POTENCIADA
Para explorar el espacio de secuencia de la posición N367 (correspondiente a la posición N376 en SEQ ID NO: 59), todas las sustituciones de aminoácidos se introdujeron individualmente en el gen HXT36. Los mutantes HXT36-N367X individuales se transformaron en la cepa de deleción de hexocinasa YD01227 y se probaron para el crecimiento sobre medio mínimo que contenía 1 % de D-xilosa y 10 % de D-glucosa. El transformante que lleva el mutante HXT36-N367I original mostró una DO600 de 0,56 después de 24 h, mientras que HXT36 no mutada fue incapaz de crecer bajo estas condiciones (Fig. 24). El transformante de crecimiento más rápido poseyó el mutante Hxt36p-N367A, que alcanzó una DO600 de casi 2. También los transformantes que expresan los mutantes HXT36 las otras sustituciones de aminoácidos alifáticos no polares (glicina, valina, leucina y metionina) fueron capaces de crecer sobre D-xilosa en presencia de 10 % de D-glucosa. Por otra parte, los mutantes de fenilalanina e histidina mostraron una tasa de crecimiento reducida mientras que las fuertes sustituciones polares y cargadas de aminoácidos no soportaron el crecimiento (Fig. 24). Estos datos muestran que N367 (correspondientes a N376 en Gal2p y N366 en Hxt11p) es un resto crítico en determinar la especificidad de Hxt36p por glucosa frente a xilosa.
Se analizaron los mutantes de Hxt36p N367A y N367I adicionalmente para determinar su cinética de transportador. En el presente documento, los transportadores se expresaron en la cepa RN1053 que está equipada con una baja actividad de ruido de fondo de transporte de glucosa. Km y Vmáx para la captación de D-glucosa por HXT36 fue aproximadamente 6 mM y 32 nmol/mgDW.min, respectivamente (Tabla 15 y Fig. 25). Sorprendentemente, el mutante Hxt36p-N367I fue completamente defectuoso en la captación de D-glucosa, mientras que la afinidad por la captación de D-xilosa mejoró 2,7 veces (es decir, de 108 a 40 mM) en comparación con Hxt36p (Tabla 15). La mutación, sin embargo, también causó una disminución de casi 3 veces en la Vmáx para la captación de D-xilosa.
También se examinó la actividad de transporte del mutante de Hxt36p-N367A que mostró el crecimiento más rápido sobre D-xilosa. Este transportador todavía mostró alguna captación de glucosa, aunque con una Km muy pobre
(171 mM frente a 6 mM). En comparación con el mutante N367I, la mutación N367A causó tanto una mejora de los valores de Km como de Vmáx para la captación de D-xilosa a 25 mM y 15,3 nmol/mgDW.min, respectivamente.
EJEMPLO 18
CO-FERMENTACIÓN DE D-GLUCOSA Y D-XILOSA POR UNA CEPA DE S. CEREVISIAE MANIPULADA CON CARACTERÍSTICAS DE TRANSPORTE ALTERADAS
Con el fin de investigar la co-fermentación de D-glucosa y D-xilosa, se cultivaron la cepa RN1053 que aloja Hxt36, Hxt36-N367l y Hxt36p-N367A no mutada, sobre 5 g l-1 de D-glucosa/ 5 g l-1 de D-xilosa a una DO600 inicial industrialmente relevante más alta de aproximadamente 8,0. El consumo de azúcar y las concentraciones de etanol fueron seguidos con el tiempo (Fig. 26). La cepa que contiene el transportador Hxt36-N367l crece sobre D-xilosa, pero debido al grave defecto de captación de D-glucosa (Fig. 26B), solo muestra algún nivel de ruido de fondo de consumo de D-glucosa que es similar al de la cepa RN1053 original sin ningún transportador reintroducido (datos no mostrados). La cepa que aloja el mutante de Hxt36-N367A mostró un co-consumo de D-glucosa y D-xilosa mejorado (Fig. 26C) en comparación con la cepa que contiene el transportador no mutado de Hxt36 (Fig. 26A). Además, también aumentó el consumo de azúcar total debido al co-consumo de glucosa y xilosa por RN1053 que expresa Hxt36p-N367A, dando una concentración de etanol más alta (2,83 g l-1) que RN1053 que expresa Hxt36p no mutada (2,67 g l-1) después de 9 horas de fermentación.
Tabla 15. Valores de Km y Vmáx para la captación de D-glucosa y D-xilosa por transportadores de Hxt36p expresados en la cepa RN1053.
Km (mM)
Vmáx (nmol/mgDW.min)
Glucosa
Xilosa Glucosa Xilosa
HXT36 HXT36-N367I
6,13 ± 0,02 -a 107,9 ± 12,1 39,8 ± 5,6 31,7 ± 0,07 -a 32,9 ± 3,1 12,1 ± 1,63
HXT36-N367A
170,7 ± 37,8 24,9 ± 3,4 37,2 ± 4,4 15,3 ± 0,2
a No pudo determinarse

EJEMPLOS 19 y 20
Material y métodos
Métodos no mencionados en la sección de los Ejemplos 19 y 20 fueron ya descritos en secciones de los Ejemplos 6
18. Los oligonucleótidos usados en los estudios descritos en el Ejemplo 19 y 20 se representan en la Tabla 16.
Mutagénesis de N366X. Se hizo la mutagénesis saturada de la posición N366 en HXT11 usando PCR con Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix con tampón HF usando los pares de cebadores F HXT11 XbaI/R HXT11 366NNN y F HXT11 366NNN/R HXT11 BamHI (véase la Tabla 16). Los fragmentos de 1113 y 591 pares de bases se usaron posteriormente en una PCR de solapamiento usando los cebadores externos F HXT11 Xbal y R HXT11 BamHI y clonados en pRS313P7T7 usando XbaI y BamHI. La secuenciación de 48 clones de E. coli dio N367S (tct), N367P (cca), N367G (ggt), N367A (gcc), N367H (cac), N367R (cgc), N367L (ttg), N367C (tgt), N367T (acg), N367D (gat), N367Q (caa) y N367V (gtg). Se amplificaron los 6 aminoácidos restantes en la posición 366 y se clonaron como se ha mencionado anteriormente con PCR de solapamiento usando cebadores específicos en los que NNN se sustituyó por ttt (F), gag (E), tgg (W), atg (M), aaa (K) y N367Y (tat).
Usando las secuencias de variante de HXT11 generadas generadas por la PCR de mutagénesis de saturación, se prepararon construcciones de fusión HXT11-N366x-GFP para estudiar la localización celular de variantes de HXT11 similarmente (con oligonucleótidos, sitios de restricción y vector de esqueleto de pRS313-P7T7-GFP) como se describe en los métodos para el Ejemplo 10 (p. 96).
Experimentos de fermentación. Se pre-cultivaron cultivos de levadura en medio mineral que contenía 2 % de maltosa. Se recogieron las células en la fase exponencial media y se inocularon después de lavar dos veces con agua esterilizada. Los experimentos de fermentación se realizaron usando 100 ml de medio mineral que contenía 7 % de glucosa y 4 % de xilosa en botella de 120 ml a 30 ºC con una DO600 inicial de 5 en condiciones de oxígeno limitado. La velocidad de agitación, con un agitador magnético, fue 200 rpm. Todos los experimentos de fermentación en botella se repitieron independientemente.
25 Nombre Secuencia (5' → 3')

Tabla 16. Cebadores usados para la mutagénesis de saturación de HXT11 de S. cerevisiae.
F HXT11 XbaI
GGCCTCTAGAATGTCAGGTGTTAATAATACATCCGC
R HXT11 BamHI
CGATGGATCCTCAGCTGGAAAAGAACCTCTTGTAAATTG
F HXT11 366NNN
CGGTGTGGTTnnnTTTTTCTCTTCATTC
R HXT11 366NNN
GAATGAAGAGAAAAA nnnAACCACACCG
F HXT11 N366F
CGGTGTGGTTtttTTTTTCTCTTCATTC
R HXT11 N366F
GAATGAAGAGAAAAAaaaAACCACACCG
F HXT11 N366E
CGGTGTGGTTgagTTTTTCTCTTCATTC
R HXT11 N366E
GAATGAAGAGAAAAActcAACCACACCG
F HXT11 N366K
CGGTGTGGTTaaaTTTTTCTCTTCATTC
R HXT11 N366K
GAATGAAGAGAAAAAtttAACCACACCG
F HXT11 N366M
CGGTGTGGTTatgTTTTTCTCTTCATTC
R HXT11 N366M
GAATGAAGAGAAAAAcatAACCACACCG
F HXT11 N366W
CGGTGTGGTTtggTTTTTCTCTTCATTC
R HXT11 N366W
GAATGAAGAGAAAAAccaAACCACACCG
F HXT11 N366Y
CGGTGTGGTTtatTTTTTCTCTTCATTC
R HXT11 N366Y
GAATGAAGAGAAAAAataAACCACACCG
n es cualquier nucleótido
EJEMPLO 19
MUTACIONES N366 EN HXT11 MEJORAN LA UTILIZACIÓN DE XILOSA EN PRESENCIA DE GLUCOSA.
La mutación N366D en Hxt11 mejoró la captación de xilosa en presencia de glucosa debido a una reducción en la afinidad de transporte de glucosa. Con el fin de evaluar la importancia de esta posición, se sustituyó N366 con cada uno de los otros 19 aminoácidos para generar una serie de mutantes N366X. Los genes correspondientes se expresaron en la cepa YD01227 y se evaluaron para su capacidad para utilizar 1 % de xilosa en presencia de 10 % de glucosa usando placas de 96 pocillos. Aquí, se usó 10 % de glucosa en lugar de 15 % para aumentar la sensibilidad del ensayo con el fin de discriminar entre el rendimiento de los diversos mutantes. Las tasas de crecimiento sobre xilosa en presencia de un exceso de 10 veces de glucosa mejoraron cuando N366 se sustituyó por un resto de metionina (M) o treonina (T) (Figura 27A), y fue hasta 3 veces superior que la sustitución de N366D. Aminoácidos con una cadena lateral hidrófoba de carga positiva o voluminosa no respaldaron el crecimiento sobre xilosa en la condición de cribado. Los mutantes también se probaron para crecimiento sobre glucosa y se expresaron en la cepa RN1053. Los mutantes N366M y N366T-Hxt11 mostraron crecimiento similar sobre glucosa o en comparación con Hxt11 no mutada (Figura 27B y 27C). Además, el nivel de expresión de todos los mutantes individuales se determinó usando proteínas Hxt11 marcadas con GFP (Figura 28). Todas las proteínas Hxt11-GFP se expresaron altamente en la membrana, excepto aquellas con las proteínas N366W y N366Y Hxt11 marcadas con GFP, parece evidente una localización citosólica y probablemente vacuolar. Esto sugiere plegamiento erróneo de proteína y direccionamiento defectuoso a la membrana por estos mutantes que explican la baja actividad en los experimentos de crecimiento con xilosa y glucosa. Sin embargo, la proteína no mutada y el mutante N366M y N366T-Hxt11 se localizó en la membrana plasmática. En general, estos datos indican que N366 es un resto crítico en determinar la especificidad de Hxt11 para xilosa frente a glucosa.
Se determinó la cinética de transporte de xilosa y glucosa mediante Hxt11 y los mutantes N366T y N366M-Hxt11 para los genes expresados en la xilosa que utiliza la cepa RN1053 de S. cerevisiae. En comparación con Hxt11no mutada, la afinidad por el transporte de glucosa por N366T y N366M-Hxt11 se redujo hasta 5 y 4 veces, respectivamente. A diferencia, la afinidad por xilosa por estos mutantes mejoró hasta 2 veces (Tabla 17) con respecto a Hxt11. La Vmáx para la captación de glucosa por el mutante de N366T Hxt11 aumentó aproximadamente el 40 % en comparación con Hxt11 no mutada, mientras que Vmáx no cambió para la proteína N366M Hxt11. Y, lo
que es más importante, la Vmáx para xilosa de los mutantes siguió siendo ampliamente invariable en comparación con Hxt11.
Tabla 17. Valores de Km y Vmáx para la captación de D-glucosa y D-xilosa por transportadores de Hxt11 expresados en la cepa RN1053.
Km (mM)
Vmáx (nmol/mg DW.min)
Glucosa
Xilosa Glucosa Xilosa
Hxt11
33,4 ± 2,1 84,2 ± 10,0 82,3 ± 3,8 44,5 ±1,7
Hxt11-N366D
87,0 ± 6,4 106,7 ± 21,7 98,9 ± 5,7 45,5 ± 1,0
Hxt11-N366T
194,4 ± 47,9 46,7 ± 2,7 125,6 ± 3,7 40,1 ± 2,4
Hxt11-N366M
144,9 ± 36,0 50,1 ± 9,7 75,3 ± 8,6 34,2 ± 3,4
Hxt2
n.d. 51,2 ± 0,1 n.d. 12,5 ± 0,2
n.d., no determinado
EJEMPLO 20
CO-FERMENTACIÓN DE D-GLUCOSA Y D-XILOSA POR CEPAS DE S. CEREVISIAE MANIPULADAS QUE EXPRESAN VARIANTES DE HXT11
Debido a los marcados efectos de las mutaciones N366 en Hxt11 sobre el transporte de glucosa sin interferir con el transporte de xilosa, los mutantes se examinaron adicionalmente para su capacidad para co-metabolizar xilosa y glucosa en condiciones industriales, es decir, 7 % de glucosa y 4 % de xilosa, respectivamente. En el presente documento, los mutantes se expresaron en la cepa RN1053, y el crecimiento se comparó con Hxt11 no mutada y la cepa RN1001 que contiene un complemento completo de los transportadores endógenos. Los dos mutantes respaldaron un co-consumo próximo a perfecto de glucosa y xilosa (Figura 29A y 29B) a diferencia de la cepa RN1001 (Figura 29C) y Hxt11 no mutada de RN1053 (Figura 29D) y que mostraron consumo de xilosa retardado. Estos datos demuestran que la mutagénesis de la posición N366 de Hxt11 da mutantes que median en una captación equilibrada de glucosa y xilosa respaldando así el co-consumo de los azúcares hexosa y pentosa. Se obtuvieron los mejores resultados para HXT11 mutante de N366T.
Co-consumo
El co-consumo de una célula se cuantifica en el presente documento y se expresa como el índice de co-consumo. El índice de co-consumo era en el presente documento el índice de co-consumo para glucosa y xilosa y se calculó como la suma durante el intervalo de tiempo de 0-24 horas (se midió a 0, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 horas) de la diferencia absoluta de la tasa de captación de glucosa (Qg) y la tasa de captación de xilosa (Qx), expresada como gramos de azúcar consumidos por unidad de tiempo. La fermentación fue una fermentación en cultivo discontinuo anaerobio a 1,0 g/l de brea de levadura seca, 30 ºC de temperatura y en la que el medio de fermentación contiene 71,8 gramos de glucosa por litro y 40,0 gramos de xilosa por litro, al comienzo de la fermentación. Un bajo valor para el índice de consumo indica alto co-consumo, una alto valor menos co-consumo.
Estos datos y cálculos de fermentación para las cepas RN1001, RN1053 HXT11, RN1053 HXT11 (N366M) y RN1053 HXT11 (N366T) se dan en la Tabla 18.

Tabla 18: Datos de fermentación y cálculo del índice de co-consumo para las cepas RN1001, RN1053 HXT11, RN1053 HXT11 (N366M) y RN1053 HXT11 (N366T)
DS68616
Tiempo
Promedio
Glucosa
Xilosa Qg (g/h) Qx (g/h) abs(Qg-Qx) suma(abs(Qg-Qx)) corr(glucosa, xilosa)
0
71,8 39,9
8
46,9 39,8 3,12 0,02 3,10 29,1 0,69
12
31,0 38,7 3,97 0,27 3,70
14
18,4 37,8 6,31 0,46 5,85
16
5,42 35,9 6,47 0,94 5,53
18
0 29,1 2,71 3,39 0,68
20
0 20,7 0 4,25 4,25
22
0 15,4 0 2,632 2,63
24
0 8,60 0 3,40 3,40
HXT11
Promedio
Glucosa
Xilosa Qg (g/h) Qx (g/h) abs(Qg-Qx) suma(abs(Qg-Qx)) corr(glucosa, xilosa)
0
71,8 39,9
8
55,4 40,0 2,06 0,00 2,06 25,0 0,84
12
41,1 38,6 3,55 0,345 3,21
14
25,5 35,2 7,84 1,70 6,15
16
12,5 32,3 6,49 1,47 5,02
18
2,85 26,0 4,82 3,12 1,70
20
0 19,4 1,42 3,34 1,91
22
0 14,3 0 2,51 2,51
24
0 9,44 0 2,45 2,45
HXT11 (N366M)
Promedio
Glucosa
Xilosa Qg (g/h) Qx (g/h) abs(Qg-Qx) suma(abs(Qg-Qx)) corr(glucosa, xilosa)
0
71,8 39,9
8
60,2 38,2 1,45 0,220 1,23 11,2 0,977
12
52,5 35,6 1,93 0,644 1,29
14
42,7 31,3 4,87 2,15 2,72
16
35,6 28,8 3,55 1,23 2,32
18
29,4 26,0 3,09 1,44 1,66
20
23,3 22,3 3,05 1,82 1,24
22
18,5 18,7 2,42 1,83 0,592
24
14,1 14,5 2,18 2,07 0,117
HXT11 (N366T)
Promedio
Glucosa
Xilosa Qg (g/h) Qx (g/h) abs(Qg-Qx) suma(abs(Qg-Qx)) corr(glucosa, xilosa)
0
71,8 39,9
8
59,1 36,7 1,59 0,409 1,18 11,8 0,977
12
47,7 33,5 2,84 0,798 2,05
14
37,5 28,6 5,13 2,41 2,71
16
28,6 24,7 4,42 1,99 2,43
18
21,3 20,7 3,68 1,97 1,72
20
14,2 15,9 3,55 2,44 1,11
22
8,87 11,1 2,65 2,38 0,268
24
4,94 6,56 1,96 2,26 0,3

Tabla 19: Índice de co-consumo de las cepas
El índice de co-consumo de las cepas RN1001, RN1053 HXT11, RN1053 HXT11 (N366M) y RN1053 HXT11 (N366T) se determinó como en la Tabla 18. En resumen, los resultados para el índice de co-consumo se dan en la Tabla 19.
Cepa
Índice de co-consumo (suma abs (Qg*-Qx*) (g/h))
RN1001
29,1
RN1053 HXT11
25,0
RN1053 HXT11 (N366M)
11,2
RN1053 HXT11 (N366T)
11,8
REFERENCIAS
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> DSM IP Assets B.V.
<120> POLIPÉPTIDOS CON ACTIVIDAD DE PERMEASA
<130>29382-WO-PCT
<150>
EP13170644.2 <151>
<150>
EP13197988.2
<151>
<150> EP14160772.1
<151>
<150> EP13170646.7
<151>
<150> EP14164270.2
<151>
<150> EP13170648.3
<151>
<160> 149
<170> BiSSAP 1.2
<210> 1
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..20
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 5034-kanf" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 1 aagcttgcct cgtccccgcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..20
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 5035-kanr" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 2 gtcgacactg gatggcggcg 20
<210> 3
<211> 60
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..60
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 5116-lf2" /tipo_mol="ADN no asignado" <400> 3 attctagtaa cggccgccag tgtgctggaa ttcgccctta agcttgcctc gtccccgccg 60
<210> 4
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..56
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 5118-lr2" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 4 catacattat acgaagttat gcgcgctcta gatatcgtcg acactggatg gcggcg 56
<210> 5
<211> 65
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..65
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 5115-lf1" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 5
<210> 6
<211> 60
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..60
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 5117-lr1" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 6 5 tcatgacgtc tcgaggccta taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatgcgcgct 60
<210> 7
<211> 5082
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..5082
15 <223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="pRN201; TOPO-BLUNT-loxP-kanMX-loxP" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 7
<210> 8
<211> 5352 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente 10 <222> 1..5352
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="pRN251; TOPO-BLUNT-loxP-hphMX-loxP" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 8
<210> 9
<211>
4847 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..4847
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="pRN365; TOPO-BLUNT-loxP-natMX-loxP" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 9
<210> 10
<211>
32 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente 10 <222> 1..32
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 115-natf" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 10 acatgtaaaa tgaccactct tgacgacacg gc 32
<210> 11
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..25
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 116-natr" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 11 cagtactagg ggccagggca tgctc 25
<210> 12
<211> 4254
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..4254
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="pRN447; TOPO-BLUNT-loxP-zeoMX-loxP" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 12
<210> 13
<211> 45 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente 10 <222> 1..45
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 28-H3f" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 13
tgtacatccg gaattctaga ttggtgagcg ctaggagtca ctgcc 45 15
<210> 14
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..32
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 29-H3r" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 14 ctcgagtatt tcacaccgca tatgatccgt cg 32
<210> 15
<211> 6000
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..6000
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="pRN247 (TOPO-BLUNT-HIS3::loxPkanMXloxP)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 15
<210> 16
<211> 35 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente 10 <222> 1..35
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 201-Hx2uf" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 16
gactagtacc ggtgttttca aaacctagca acccc 35 15
<210> 17
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..43
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 202-Hx2ur" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 17 cgtacgcgtc ttccggaagg gtaccatcag atttcatttg acc 43
<210> 18
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..40
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 203-Hx2df" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 18 gaagacactc gagacgtcct ttgtctgtga aaccaagggc 40
<210> 19
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..39
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 204-Hx2dr" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 19 gtcgacgggc ccttatgttg gtcttgttta gtatggccg 39
<210> 20
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..48
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 205-Hx3uf" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 20 aagcggccgc actagtaccg gtgaaacaac tcaataacga tgtgggac 48
<210> 21
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..38
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 206-Hx3urATCCGGACGTCTTCCTCAAGAAATCAGTTTGGGCGACG" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 21 atccggacgt cttcctcaag aaatcagttt gggcgacg 38
<210> 22
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..44
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 210-Hx4df" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 22
agaagacgct cgagacgtcc cttatgggaa gaaggtgttt tgcc 44
<210> 23
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..34
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 211-Hx4dr" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 23 atggatccta ggggttcttg cagagtaaac tgcg 34
<210> 24
<211> 46
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..46
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 212-Hx5uf" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 24 aagcggccgc actagtacat gtgaacttga aaacgctcat caaggc 46
<210> 25
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..43
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 213-Hx5ur" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 25
ttcgtacgcg tcttccggag taacatgaaa ccagagtacc acg 43
<210> 26
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..42
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 229-Hx7df" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 26 agaagaccct cgagacgtcc gacgctgaag aaatgactca cg 42
<210> 27
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..42
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 230-Hx7dr" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 27 agtcgacgga tccgtaattt ttcttctttt aagtgacggg cg 42
<210> 28
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..44
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 243-Gal2ufn" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 28 aagcggccgc actagtaccg gtgatctata ttcgaaaggg gcgg 44
<210> 29
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..43
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 244-Gal2urn" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 29 aacgtacgtc cggatcatta gaatactttt gagattgtgc gct 43
<210> 30
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..43
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 233-Ga2df" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 30 agaagaccct cgagacgtct taccttggaa atctgaaggc tgg 43
<210> 31
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..36
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 234-Ga2dr" /tipo_mol="ADN no asignado"
5 <400> 31 gtggatccta ggtaaaacgg tacgagaaaa gctccg 36
<210> 32
<211> 5959 10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente 15 <222> 1..5959
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="pRN485; TOPO-BLUNT-GAL2::loxPzeoMXloxP" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 32 20
<210> 33 5 <211> 6384
<212> ADN 121
<213> Secuencia artificial
5
<220> <221> fuente <222> 1..6384 <223> /organismo="Secuencia /tipo_mol="ADN no asignado" artificial" /nota="pRN566; TOPO-BLUNT-HXT367::loxP-hphMX-loxP"
10
<400> 33
5
<210> 34 <211> 6073 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <221> fuente <222> 1..6073 <223> /organismo="Secuencia /tipo_mol="ADN no asignado" artificial" /nota="pRN569: TOPO-BLUNT-HXT514::loxP-natMX-loxP"
15
<400> 34
<210>
35
<210>
36
<211> 6189
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<221> fuente
<222> 1..6189
<223>
/organismo="Secuencia artificial" /nota="pRN635; TOPO-BLUNT-HXT2::loxP-kanMX-loxP"
10
/tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 35
<211> 24 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente 10 <222> 1..24
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 281-Hx3inr2" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 36
gctcttttca cggagaaatt cggg 24 15
<210> 37
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..22
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 323-Hx7inr1" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 37 gatgagaatc cttggcaacc gc 22
<210> 38
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..25
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador Hx4inr2" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 38 ccatactatt tgtcgactca agcgc 25
<210> 39
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..25
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador Hx5inf" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 39 gggttaatta gttttagggg cacgg 25
<210> 40
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..24
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 324-Ga2inf1" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 40 tcaattcgga aagcttcctt ccgg 24
<210> 41
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 325-Ga2inr1" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 41 cagtgatagt ttggttcgag cgg 23
<210> 42
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 289-Hx2inf" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 42
tcttcgggaa ctagataggt ggc 23
<210> 43
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 290-Hx2inr" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 43 gaagtaatca gccacaatac gcc 23
<210> 44
<211> 73
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..73
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 838-Glk1-psuc227f" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 44
<210> 45
<211> 73
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..73
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 834-Hxk2-psuc227f" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 45
<210> 46
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..21
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 645-pSUC227r" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 46 gcaatttcgg ctatacgtaa c 21
<210> 47
<211> 73
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..73
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 839-Glk1-psuc225r" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 47
<210> 48 <211> 73
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..73
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 835-Hxk2-psuc225r" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 48
<210> 49
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..21
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 646-pSUC225f" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 49 cgttcactca tggaaaatag c 21
<210> 50
<211> 72
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..72
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 846-Hxk1_loxP_f" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 50
<210> 51
<211> 72
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..72
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 847-Hxk1_loxP_r" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 51
<210> 52
<211> 72
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..72
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 848-Gal1_loxP_f" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 52
<210> 53
<211> 70 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..70
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador 849-Gal1_loxP_r" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 53
<210> 54
<211> 5250
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..5250
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="pRN774; TOPO-BLUNT-loxP-hphMX-loxP (sitios loxP en orientación opuesta) " /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 54
<210> 55
<211> 4744 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente 10 <222> 1..4744
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="pRN775; TOPO-BLUNT-loxP-natMX-loxP (sitios loxP en orientación opuesta)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 55 15
<210> 56
<211> 1725 5 <212> ADN
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<221> fuente 10 <222> 1..1725
<223> /organismo="Saccharomyces cerevisiae" /nota="WT-GAL2 secuencia de ADN " /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 56 15
<210> 57
<211> 7392
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..7392
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="pRN993 " /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 57
<210> 58
<211> 7389 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente 10 <222> 1..7389
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="pDB1250; WT-GAL2 vector de expresión para cribar" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 58 15
<210> 59
<211> 574 5 <212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Secuencia de aminoácidos de Gal2p WT 10
<400> 59
<210> 60
<211> 9400
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 5
<220>
<221> fuente
<222> 1..9400
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="pRN187 (pSH65-derived CRE recombinase que expresun 10 vector)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 60
5
<210> 61 <211> 5763 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <221> fuente <222> 1..5763 <223> /organismo="Secuencia /tipo_mol="ADN no asignado" artificial" /nota="pRN486 (TOPO-BLUNT-his3::loxP-natMX-loxP)"
15
<400> 61
<210> 62
<211> 23 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente 10 <222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador ActinF (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 62 15 ggattctgag gttgctgctt tgg 23
<210> 63
<211> 23
<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador ActinR (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 63 gagcttcatc accaacgtag gag 23
<210> 64
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT1F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 64 tgttctctgt acaccgttga ccg 23
<210> 65
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT1R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 65 agatcataca gttaccagca ccc 23
<210> 66
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..19
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota=" Cebador HXT2F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 66 cttcgcatcc actttcgtg 19
<210> 67
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..22
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT2R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 67 aatcatgacg ttaccggcag cc 22
<210> 68
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT3F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 68 gaagctagag ctgctggttc agc 23
<210> 69
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..24
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT3R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 69 acaacgacat aaggaattgg agcc 24
<210> 70
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..24
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT4F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 70 atggagagtt ccattaggtc tagg 24
<210> 71
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..24
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT4R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 71 atggagagtt ccattaggtc tagg 24
<210> 72
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT5F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 72 ttgctatgtc gtctatgcct ctg 23
<210> 73
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..22
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT5R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 73 agataaggac ataggcaacg gg 22
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..21
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT7F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 74 gggtgctgca tccatgactg c 21
<210> 75
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..24
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT7R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 75 acaacgacat aaggaattgg agcc 24
<210> 76
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..25
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT8F ((PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 76 gtactactat cttcaaatct gtcgg 25
<210> 77
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..21
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT8R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 77 cttgtgacgc caacggaggc g 21
<210> 78
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..22
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT9F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 78 ccattgagag gtttggacgc cg 22
<210> 79
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT9R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 79
acacaatcat acagttaccg gcg 23
<210> 80
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT10F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 80 ggaatgcaag actctttcga gac 23
<210> 81
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..21
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT10R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 81 ctagtgacgc caacggtggc g 21
<210> 82
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..21
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT11F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 82 gccactcaat ggagagtcgg c 21
<210> 83
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..22
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT11R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 83 caactagcaa ggctggatcg tc 22
<210> 84
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT12F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 84 caccatcttc aaatctgtcg gtc 23
<210> 85
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT12R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 85 caatcataca gttaccggca ccc 23
<210> 86
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..20
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT13F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 86 ccctcatggc caggacggtc 20
<210> 87
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT13R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 87
ttgccataac cagttgcatg cag 23
<210> 88
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..24
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT14F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 88 gccttagtag tgtactgcat cggt 24
<210> 89
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT14R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 89 tgatacgtag ataccatgga gcc 23
<210> 90
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..21
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT15F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 90 gaggcctgtg tctccatcgc c 21
<210> 91
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..24
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT15R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 91 cacaagaata cctgtgatca aacg 24
<210> 92
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..24
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT16F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 92 caaggaagta tagtaatact gcgc 24
<210> 93
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..21
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT16R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 93 ttggcgatgg agacacaggc c 21
<210> 94
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT17F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 94 taacactgca caatggagag tcc 23
<210> 95
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..22
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT17R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 95 tgagtaccca tggatcctct gg 22
<210> 96
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..23
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador GAL2F (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 96 tcaatggaga gttccattag ggc 23
<210> 97
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..21
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador GAL2R (PCR en tiempo real)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 97 ctggacggca ggatcctctg g 21
<210> 98
<211> 82
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..82
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador KOP11* para KO HXT11" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 98
<210> 99
<211> 101
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..101
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador KOT11* para KO HXT11" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 99
<210> 100
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..39
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador iHXT11F (HXT11 inversa)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 100 ggcctctaga tcagctggaa aagaacctct tgtaaattg 39
<210> 101
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..41
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador iHXT11R (HXT11 inversa)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 101 gctaggatcc atgtcaggtg ttaataatac atccgcaaat g 41
<210> 102
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..36
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT11F (clonación)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 102 ggcctctaga atgtcaggtg ttaataatac atccgc 36
<210> 103
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..37
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT12F (clonación)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 103 ggcctctaga atgggtttga ttgtctcaat attcaac 37
<210> 104
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..39
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT11/12R (clonación)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 104 cgatggatcc tcagctggaa aagaacctct tgtaaattg 39
<210> 105
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..36
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador HXT1 Xbal (clonación)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 105 gcattctaga atgaattcaa ctcccgatct aatatc 36
<210> 106
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..38
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador R HXT1 Cfr9i (clonación)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 106
tgcatcccgg gttatttcct gctaaacaaa ctcttgta 38
<210> 107
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..33
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador F HXT2 Xbai (clonación)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 107 gtcctctaga atgtctgaat tcgctactag ccg 33
<210> 108
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..40
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador R HXT2 Cfr9i (clonación)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 108 catcgcccgg gttattcctc ggaaactctt ttttcttttg 40
<210> 109
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..38
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador F HXT3 Xbal (clonación)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 109 gcattctaga atgaattcaa ctccagattt aatatctc 38
<210> 110
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..36
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador R HXT6 Cfr9i (clonación)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 110 catcgcccgg gttatttggt gctgaacatt ctcttg 36
<210> 111
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..35
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador F HXT4 Xbal (clonación)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 111 gtcctctaga atgtctgaag aagctgccta tcaag 35
<210> 112
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..38
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador R HXT4RN Cfr9l (clonación)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 112 tatcgcccgg gttaattaac tgacctactt ttttccga 38
<210> 113
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..35
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador F HXT5 Xbal (clonación)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 113 gtcctctaga atgtcggaac ttgaaaacgc tcatc 35
<210> 114
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..40
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador R HXT5 Cfr9i (clonación)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 114
gcatcccggg ttatttttct ttagtgaaca tccttttata 40
<210> 115
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..34
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador F HXT7 Xbal (clonación)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 115 gtcctctaga atgtcacaag acgctgctat tgca 34
<210> 116
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..36
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Cebador R HXT7 Cfr9l (clonación)" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 116 catcgcccgg gttatttggt gctgaacatt ctcttg 36
<210> 117
<211> 6338
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..6338
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Plásmido pRS313-P7T7" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 117
<210> 118
<211> 8726
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 5
<220>
<221> fuente
<222> 1..8726
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="Plásmido pRS313-P7t7-HXT11+GFP" /tipo_mol="ADN no 10 asignado"
<400> 118
<210> 119 5 <211> 1704
<212> ADN 196
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<221> fuente
<222> 1..1704
<223> /organismo="Saccharomyces cerevisiae" /nota="HXT11 ORF RN1053" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 119
<210> 120
<211> 1626 5 <212> ADN
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<221> fuente 10 <222> 1..1626
<223> /organismo="Saccharomyces cerevisiae" /nota="HXT2 ORF" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 120 <212> ADN
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220> 10 <221> fuente
<222> 1..1725
<223> /organismo="Saccharomyces cerevisiae" /nota="GAL2 ORF" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 121
<210> 122 <211> 1704
<212> ADN
<213> Saccharomyces cerevisiae
5 <220>
<221> fuente
<222> 1..1704
<223> /organismo="Saccharomyces cerevisiae" /nota="HXT3-6 ORF" /tipo_mol="ADN no asignado"
10 <400> 122 <210> 123
<211> 567 5 <212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Hxt11p 10
<400> 123
<210> 124
<211> 541
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Hxt2p
<400> 124
<210> 125
<211> 574 5 <212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Gal2p 10
<400> 125
<210> 126
<211> 508 5 <212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> Hxt3-6p 10
<400> 126
<210> 127 5 <211> 38
209 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..38
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador F HXT36 Bcui" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 127 gcatactagt atgaattcaa ctccagattt aatatctc 38
<210> 128
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..30
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador R HXT36 367NNN" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 128 caacaagtag agaagaannn gacgacaccg 30
<210> 129
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..30
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador F HXT36 367NNN" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 129 cggtgtcgtc nnnttcttct ctacttgttg 30
<210> 130
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..36
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador R HXT36 BamHi" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 130 acgtggatcc ttatttggtg ctgaacattc tcttgt 36
<210> 131
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..35
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador R HXT36 BamHI-stop" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 131 ccatggatcc tttggtgctg aacattctct tgtac 35
<210> 132
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..31
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador F GFP BamHI" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 132 aaaggatcca tggtgagcaa gggcgaggag c 31
<210> 133
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..28
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="cebador R GFP ClaI" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 133 aaaatcgatt tacttgtaca gctcgtcc 28
<210> 134
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..36
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="F HXT11 XbaI" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 134 ggcctctaga atgtcaggtg ttaataatac atccgc 36
<210> 135
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..39
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="R HXT11 BamHI" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 135
cgatggatcc tcagctggaa aagaacctct tgtaaattg 39
<210> 136
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..28
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="F HXT11 366NNN" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 136 cggtgtggtt nnntttttct cttcattc 28
<210> 137
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..28
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="R HXT11 366NNN" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 137 gaatgaagag aaaaannnaa ccacaccg 28
<210> 138
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..28
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="F HXT11 N366F" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 138 cggtgtggtt ttttttttct cttcattc 28
<210> 139
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..28
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="R HXT11 N366F" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 139 gaatgaagag aaaaaaaaaa ccacaccg 28
<210> 140
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..28
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="F HXT11 N366E" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 140 cggtgtggtt gagtttttct cttcattc 28
<210> 141
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..28
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="R HXT11 N366E" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 141 gaatgaagag aaaaactcaa ccacaccg 28
<210> 142
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..28
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="F HXT11 N366K" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 142 cggtgtggtt aaatttttct cttcattc 28
<210> 143
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..28
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="R HXT11 N366K " /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 143 gaatgaagag aaaaatttaa ccacaccg 28
<210> 144
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..28
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="F HXT11 N366M" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 144 cggtgtggtt atgtttttct cttcattc 28
<210> 145
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..28
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="R HXT11 N366M" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 145 gaatgaagag aaaaacataa ccacaccg 28
<210> 146
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..28
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="F HXT11 N366W" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 146 cggtgtggtt tggtttttct cttcattc 28
<210> 147
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..28
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="R HXT11 N366W" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 147 gaatgaagag aaaaaccaaa ccacaccg 28
<210> 148
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..28
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="F HXT11 N366Y" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 148 cggtgtggtt tattttttct cttcattc 28
<210> 149
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<222> 1..28
<223> /organismo="Secuencia artificial" /nota="R HXT11 N366Y" /tipo_mol="ADN no asignado"
<400> 149 gaatgaagag aaaaaataaa ccacaccg 28

Claims (24)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Polipéptido que tiene una o más sustituciones en una posición correspondiente a la posición 339 o 376 de SEQ ID NO: 59, en la que el polipéptido es un miembro de la superfamilia de facilitadores principales (MFS), polipéptido que es polipéptido de hexosa permeasa, en el que, cuando la sustitución es en la posición correspondiente a 376, el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene un volumen de van der Waals de 80 a 138 Å3 y una hidrofobia de cadena lateral de 10 a 100 ΔtR, y cuando la sustitución es en la posición correspondiente a 339, el aminoácido en esa posición está sustituido por un aminoácido que tiene una hidrofobia de cadena lateral de -30 a 10 ΔtR y un volumen de van der Waals de 80 a 160 A3.
  2. 2.
    Polipéptido según la reivindicación 1, que tiene uno o más aminoácido correspondientes a 339N/V, o 3761/M/V.
  3. 3.
    Polipéptido según la reivindicación 1 o 2, en el que el polipéptido tiene actividad de transporte de glucosa reducida en comparación con el polipéptido de SEQ ID NO: 59.
  4. 4.
    Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el polipéptido tiene actividad de transporte de xilosa mejorada en comparación con el polipéptido de SED ID NO: 59.
  5. 5.
    Polipéptido según la reivindicación 1, en la que el polipéptido tiene actividad de transporte de glucosa reducida y actividad de transporte de xilosa mejorada en comparación con el polipéptido que tiene SEQ ID NO: 59.
  6. 6.
    Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende secuencias que contienen uno o más de los siguientes motivos de aminoácido: G-R-x(3)-G-x(3)-G-x(11)-E-x(5)-[LIVM]-R-G-x(12)-[GA]; R-x(14)-G-x(2)-Y-x(2)-[YF]-[YF]-[GSAL] y/o
    V-x(15)-[GNR]-[RH]-R-x(2)-[LM]-x(2)-[GA] en el que los fragmentos en (a) a (c) en el polipéptido se corresponden con las posiciones en SEQ ID NO: 59.
  7. 7.
    Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprenden un motivo G-R-x(3)-G-x(3)-G-x(11)-E-x(5)-[LIVM]-R-G-x(12)-[GA].
  8. 8.
    Polinucleótido que tiene al menos el 50 % de identidad con SEQ ID NO: 56, que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
  9. 9.
    Construcción de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8.
  10. 10.
    Célula hospedadora transformada con la construcción de ácidos nucleicos de la reivindicación 9.
  11. 11.
    Célula hospedadora transformada según la reivindicación 10, que es una eucariota.
  12. 12.
    Célula hospedadora transformada según la reivindicación 11, que es levadura.
  13. 13.
    Célula hospedadora transformada según la reivindicación 12, que pertenece al género Saccharomyces, en particular la especie Saccharomyces cerevisiae.
  14. 14.
    Célula hospedadora transformada que comprende un nucleótido heterólogo que codifica un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o codifica un polipéptido que tiene la sustitución M339S o N376C de secuencia ID NO: 59.
  15. 15.
    Hospedador transformado según la reivindicación 14, en el que el polinucleótido codifica un polipéptido que es un mutante de un polipéptido que es nativo en la célula hospedadora no transformada.
  16. 16.
    Célula hospedadora transformada según la reivindicación 14 o 15, en la que el polipéptido que es nativo en la célula hospedadora no transformada es un miembro de la superfamilia de facilitadores principales (MFS).
  17. 17.
    Célula hospedadora transformada según cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16, en la que el polipéptido que es nativo en la célula hospedadora no transformada es un polipéptido de transportador de hexosa.
  18. 18.
    Célula hospedadora transformada según la reivindicación 17, en la que el polipéptido que es nativo en la célula hospedadora no transformada es un transportador polipéptido elegido de la lista que consiste en Gal2, Hxt1, Hxt2, Hxt3, Hxt4, Hxt5, Hxt6, Hxt7, Hxt8, Hxt9, Hxt10, Hxt11, Hxt12, Hxt13, Hxt14, Hxt15, Hxt16 y Hxt17.
  19. 19.
    Uso de un polipéptido que tiene una sustitución correspondiente a N376T de SEQ ID NO:59, como un transportador de xilosa, en el que el polipéptido es un miembro de la superfamilia de facilitadores principales (MFS) y el polipéptido es un polipéptido de hexosa permeasa.
  20. 20.
    Uso según la reivindicación 19, en el que el polipéptido se expresa en una célula eucariota y la célula eucariota se usa para fermentar xilosa en presencia de glucosa.
  21. 21.
    Proceso para la degradación de material lignocelulósico o hemicelulósico, en el que el material lignocelulósico o hemicelulósico se pone en contacto con una composición de enzima, en el que se producen uno o más azúcares, y
    5 en el que el azúcar producido se fermenta para dar un producto de fermentación, en el que la fermentación se realiza con una célula hospedadora transformada de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18.
  22. 22.
    Proceso según la reivindicación 21, en el que el azúcar producido comprende xilosa y glucosa y en el que la célula co-fermenta xilosa y glucosa.
  23. 23.
    Proceso según la reivindicación 22, en el que el producto de fermentación es uno o más de etanol, butanol, ácido
    10 láctico, un plástico, un ácido orgánico, un disolvente, un suplemento para pienso para animales, un producto farmacéutico, una vitamina, un aminoácido, una enzima o una materia prima química.
  24. 24. Proceso según la reivindicación 23, en el que el producto de fermentación es uno o más de etanol, butanol, ácido láctico, di-terpeno, di-terpeno glucosilado, un plástico, un ácido orgánico, un disolvente, un suplemento para pienso para animales, un producto farmacéutico, una vitamina, un aminoácido, una enzima o una materia prima química.
    228 229 230 231
    245 246 247 248
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