BR112015030371B1

BR112015030371B1 - Polipeptídeo possuindo uma ou mais substituições, construto de ácido nucleico, célula hospedeira, célula hospedeira transformada, uso do referido polipeptídeo e processo para degradação de material lignocelulósico ou hemicelulose

Info

Publication number: BR112015030371B1
Application number: BR112015030371-4A
Authority: BR
Inventors: Paul Klaassen; Paulus Petrus De Waal; René Marcel De Jong; Arnold Jacob Mattieu Driessen; Jeroen Gerben Nijland; Hyun Yong Shin
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V.
Priority date: 2013-06-05
Filing date: 2014-06-04
Publication date: 2023-04-25
Also published as: WO2014195378A1; EP3004146B1; KR20160012153A; BR112015030371A2; DK3004146T3; WO2014195376A2; EP3004146A2; PL3004146T3; CN105263955B; ES2663480T3; US10000537B2; US20160122400A1; WO2014195377A2; WO2014195376A3; MY178931A; CN105263955A; WO2014195377A3

Abstract

POLIPEPTÍDEOS COM ATIVIDADE DE PERMEASE. A invenção refere-se a um polipeptídeo possuindo uma ou mais substituições em uma posição correspondente à posição 339 ou 376 da SEQ ID NO: 59, em que o polipeptídeo é um membro da superfamília de facilitadores principais (MFS). Em uma forma de realização, a substituição está na posição correspondente a 376 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem um volume de van der Waals de 80 a 138 Â3 e uma hidrofobicidade de cadeia lateral de 10 a 100 (Delta)tR.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[01] A invenção é direcionada a novos polipeptídeos e para os organismos recombinantes que expressam os polipeptídeos. Em uma forma de realização, a presente invenção refere-se a novos polipeptídeos de permease com especificidade de açúcar e/ou atividade de transporte de açúcar alterados.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[02] A membrana plasmática de células de levedura e outros eucariotas é uma bio-membrana complexa, que consiste em duas camadas de fosfolipídios com uma multiplicidade de proteínas incorporadas. Muitas moléculas podem atravessar a membrana do plasma por difusão ou osmose e com o auxílio de sistemas de transporte específicos.

[03] Sistemas de transporte permitem a absorção de nutrientes e íons, exportação de produtos do metabolismo e substâncias indesejáveis ou prejudiciais. Existem diferentes mecanismos. Transportadores ativos primários direcionam a acumulação ou extrusão de solutos através da utilização de, por exemplo, hidrólise de ATP. Transportadores secundários, pertencentes aos transportadores da superfamília de facilitadores principais (MFS), facilitam o transporte de uma ou mais espécies moleculares através da membrana em resposta a gradientes quimo-osmóticos. Na levedura Saccharomyces cerevisiae, 186 proteínas MFS foram identificadas (Nelissen, 1997) na estirpe S288c.

[04] Um exemplo de tal transportador é a proteína Hxt1, envolvida no transporte de hexose em Saccharomyces cerevisiae.

[05] Permeases são proteínas de transporte da membrana, uma classe de proteínas transmembranares de ação de passagem múltipla que facilitam a difusão de uma molécula específica, aqui, especificamente, um ou mais açúcares, dentro ou fora da célula por transporte passivo. Em contraste, os transportadores ativos acoplam transporte transmembranar de molécula com uma fonte de energia, tal como ATP, ou um gradiente de íons favorável.

[06] Os termos permease, facilitador, transportador ou proteína de transporte, ou termos relacionados, são todos proteínas de descrição com múltiplos domínios de abrangência de membrana que apresentam uma função no transporte de moléculas através de uma membrana. Este transporte pode ser provocado por diferentes mecanismos: Uniporte (transporte de uma molécula), simporte (co- transporte simultâneo de duas moléculas diferentes na mesma direção), antiporte (transporte simultâneo de duas moléculas em direções opostas) e difusão facilitada.

[07] A família dos transportadores de açúcar em levedura consiste de 30-40 membros (34 membros na estirpe S288c (Nelissen, 1997)). Os transportadores de açúcar podem ser divididos em cinco grupos: permeases de hexose (genes Hxt, GAL2), permeases de dissacarídeo, permeases de mio- inositol, receptores de açúcar e um conjunto final de transportadores os quais o substrato é desconhecido.

[08] A biomassa lignocelulósica, uma matéria-prima alternativa atrativa para a produção de combustíveis de transporte de líquidos, consiste em vários açúcares diferentes. A fração de hexose de lignocelulose, principalmente glicose, pode, em princípio, ser facilmente fermentada por versões não recombinantes da levedura S. cerevisiae. No entanto, este organismo não é capaz de metabolizar os açúcares de pentose, tal como xilose e arabinose, a etanol.

[09] Os métodos de criação de microrganismos que são capazes de metabolizar açúcares de pentoses são conhecidos na técnica. Por exemplo, na WO/2009/109630 a construção de cassetes de expressão e a transformação de células de S. cerevisiae em células de fermentação de pentose pela expressão de xilose isomerase, são ilustrados.

[010] Organismos que utilizam pentoses nativas existem, mas faltam ferramentas genéticas bem desenvolvidas e/ou tolerâncias a produto baixo, que limitam a sua adequação como hospedeiros para processos de conversão lignocelulósicos.

[011] Como consequência, esforços têm sido focados na introdução de vias de conversão de pentose na levedura S. cerevisiae, que ainda é o organismo de escolha na indústria de etanol, a fim de permitir a fermentação de pentose.

[012] Apesar da grande quantidade do progresso alcançado em anos anteriores, o transporte de açúcares de pentose ainda é considerado a ser (um dos) o passo limitante da taxa no metabolismo da pentose.

[013] O transporte de pentoses em S. cerevisiae é mediado por diferentes membros da família de transportador de hexose (Hxt). Hxt4, Hxt5, Hxt7 e Gal2 foram descritos como os principais transportadores de xilose em S. cerevisiae (Hamacher et al., 2002), e Gal2 é também conhecido por mediar o transporte de arabinose (Becker et al., 2003). No entanto, a afinidade para os respectivos açúcares de pentose é de, aproximadamente, 10 a 100 vezes menor do que para os respectivos açúcares de hexose. A falta de um transportador de xilose ou arabinose dedicado em células de levedura recombinantes limita, assim, a capacidade para co-utilização de hexoses e pentoses em misturas de açúcar, e proíbe um fluxo catabólico de pentose alto. Como consequência, a conversão de açúcares de biomassa pode ser considerada bifásica: na primeira fase, uma conversão relativamente rápida de hexoses (glicose) ocorre, enquanto na segunda fase, que começa quando as hexoses foram esgotadas a partir do meio, a fermentação das pentoses começa, mas a uma taxa muito mais baixa em comparação com a taxa de conversão de hexoses.

[014] Por conseguinte, é um desejo há muito sentido de expressar transportadores de açúcar específicos de pentose, isto é, sem interferência da glicose (especificidade de pentose) e elevada afinidade para pentose, em uma vista de transportador de outro modo inalterado, de modo a manter a capacidade de converter hexoses, aproximadamente, ao mesmo nível.

[015] Uma maneira de resolver este problema é a triagem para os transportadores de açúcar (pentoses) heterólogos que são específicos de pentose e têm um (moderadamente) elevada afinidade à pentose. No entanto, tais esforços têm sido com sucesso limitado até agora. Apenas alguns têm sido mostrados serem capazes de facilitar o transporte de pentose aquando da expressão em S. cerevisiae, mas todos favorecem glicose sobre xilose (Young et al., 2011, e referências nele contidas), como é o caso das proteínas Hxt de S. cerevisiae, tal como indicado acima.

[016] Outra abordagem é a de reestruturação de transportadores de hexoses à transportadores de pentoses. Por exemplo, as obras de Kasahara et al., (2000; 2009; 2010) indicam que os resíduos em vários transportadores de açúcar desempenham um papel chave na determinação da afinidade de substrato ao substrato natural.

[017] Transportadores de hexoses mutantes que sejam capazes de transportar açúcares de pentoses de forma mais eficiente são conhecidos na arte. Por exemplo, na WO/2012/049173, o isolamento dos genes de transportadores de hexoses mutantes a partir de culturas de células de S. cerevisiae de fermentação de pentose é descrito.

[018] Em Saccharomyces cerevisiae, a permease GAL2 transporta galactose através da membrana celular. É também conhecido como um transportador de glicose através da membrana.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[019] Um objeto da invenção é proporcionar novos polipeptídeos de permease com alterada, em particular, melhorada, especificidade de açúcar. Um outro objeto da invenção consiste em proporcionar estirpes recombinantes que expressam o polipeptídeo de permease que tem a absorção melhorada da molécula que a permease transporta através da membrana celular. Outro objeto é proporcionar um polipeptídeo de permease que tem uma capacidade melhorada para o transporte de açúcares C5, em particular xilose, em comparação com um polipeptídeo progenitor. Outro objeto é proporcionar um polipeptídeo de permease que tem atividade de transporte reduzida para açúcar C6, em particular glicose, em comparação com um polipeptídeo progenitor. Outro objeto é proporcionar um método para identificar mutações em outros polipeptídeos de permease relacionados que têm um efeito benéfico sobre a melhoria da capacidade de transporte de xilose ou atividade de transporte reduzida para glicose.

[020] Um ou mais destes objetivos são atingidos de acordo com a invenção. De acordo com a presente invenção, é proporcionado um polipeptídeo possuindo uma ou mais substituições em uma posição correspondente à posição 339 ou 376 da SEQ ID NO: 59, em que o polipeptídeo é um membro da superfamília de facilitadores principais (MFS). Em uma forma de realização, a substituição está na posição correspondente a 376 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem um volume de van der Waals de 80 a 138 Â3 e uma hidrofobicidade de cadeia lateral de 10 a 100 ΔtR. Em uma forma de realização, o aminoácido na posição 376 tem um volume de van der Waals de 85 a 138 Â3 e uma hidrofobicidade de cadeia lateral de 10 a 100 ΔtR.

[021] Os valores para o volume van der Waals (Â3) para aminoácidos são aqui utilizados conforme descrito em: http://www.proteinsandproteomics.orq/content/free/tables_1/ table08.pdf. A literatura correspondente é N.J. Darby, Thomas E. Creighton, Protein Structure (1993) Oxford University Press. Os valores para a hidrofobicidade de cadeia lateral (ΔtR) de aminoácidos são aqui utilizados tal como descrito em http://onlinelibrarv.wiley.eom/doi/10.1002/psc.310010507/pd f. A referência que corresponde a esta é Monera, O.D. et al., Journal of Peptide science Vol. 1, 319-329 (1995).

[022] Um polipeptídeo de acordo com a invenção, possuindo uma ou mais destas mutações, tem um consumo de açúcar e/ou produção de produtos de fermentação vantajosos. Isto será descrito em mais detalhe a seguir e será ilustrado pelos exemplos 1-5 abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[023] A Figura 1 mostra os resultados de culturas de mutantes transportadores de hexose em balão de agitação aeróbica sobre Verduyn-ureia + glicose 15 gL-1 + xilose 20 gL-1. (A) Medidas de densidade ótica a 600 nm de comprimento de onda, (B) Concentrações de glicose (gL-1), (C) Concentrações de xilose durante o período de cultura.

[024] A Figura 2 mostra os resultados de culturas de mutantes transportadores de hexose em balão de agitação aeróbica sobre Verduyn-ureia + xilose 20 gL-1. (A) Medidas de densidade ótica a 600 nm de comprimento de onda, (B) Concentrações de xilose (gL-1).

[025] A Figura 3 mostra o esquema de construção de estirpe para a estirpe YD01227.

[026] A Figura 4 mostra os resultados de aeróbios culturas em balão de agitação de mutante de quadruple hexose quinase (col 2) e estirpe de referência RN1014 sobre Verduyn-ureia + glicose 100 gL-1 + xilose 20 gL-1. (A) Medidas de densidade ótica a 600 nm de comprimento de onda, (B) Concentrações de glicose (gL-1), (C) Concentrações de xilose durante o período de cultura.

[027] A Figura 5 mostra os resultados de culturas em placa de micro poços em misturas de glicose - xilose. As características de crescimento da estirpe de referência RN1014, e mutantes hexoquinase quádruplos YD01227 e colônia 2 (Col 2) com igual genótipo em Verduyn-ureia suplementado com misturas de glicose e de xilose nas seguintes concentrações: (A) 60 + 20, (B) 100 + 20, (C) 15 + 5, e (D) 25 gL-1 + 5 gL-1, respectivamente. A cada 15 minutos, a DO600 foi medida automaticamente por um aparelho de Bioscreen C. Os pontos de dados são a média de medições em triplicado.

[028] A Figura 6 mostra um mapa do plasmídeo pRN993.

[029] A Figura 7 mostra as relações entre as concentrações de xilose e glicose residual (A), ou concentrações de xilose residuais e crescimento (DO600; B) na tela de contagem de Atividade de transporte de glicose (seleção GTAC), ver exemplos. As concentrações de xilose residual (gL-1) foram representadas graficamente contra a concentração de glicose (A) residual (gL-1) e (B) DO600 em 96 horas. (Inset B) análise de regressão linear mostra uma boa correlação entre DO600 e xilose. Cada ponto de dados representa a média das concentrações de açúcar de 1 a 3 réplicas, ou de múltiplas medições de estirpe de controle RN 1001 ou amostras de meio por parte da tela.

[030] A Figura 8 mostra o crescimento e o consumo de xilose de variantes Gal2-N376-mutantes na tela GTAC. (A) medições de DO600 em tempo de pontos 24, 72 e 96 horas, e (B) concentrações de xilose residuais (gL-1) medidas para as variantes Gal2-N376-mutantes, amostras de estirpe de controle RN1001 e vazias (YD10 somente meio) durante a triagem GTAC. Cada coluna representa a DO600 média ou concentração de xilose residual de 3 transformantes; barras de erro representam o erro padrão da média. Os asteriscos indicam aminoácidos com grandes cadeias laterais hidrofóbicas com um efeito claro.

[031] A Figura 9 mostra perfis de crescimento de Triagem de Atividade de Transporte de TOP15 Xilose (XTA) (ver exemplos). Valores de DO600 dos três pontos de amostragem para as estirpes/variantes de Top15 de (A) Parte A e (B) Parte B da Tela XTA. Cada coluna representa a média de DO600 de 3 transformantes; barras de erro representam o erro padrão da média.

[032] A Figura 10 mostra um alinhamento de sequências de proteína de permease.

[033] A Figura 11 mostra a representação em gráfico do volume de van der Waals de aminoácidos (Â3) (eixo Y) contra a hidrofobicidade de aminoácidos (ΔtR) (eixo X). Amino ácidos vantajosos (reduzida atividade de transporte de glicose) para a posição correspondente ao 376 na SEQ ID NO: 59 estão dentro da área definida pelas linhas listradas curtas e para oa posição 339 pelas linhas listradas longas. Os valores de volume de van der Waals utilizados aqui são descritos em: http://www.proteinsandproteomics.org/content/free/tables_1/ table08.pdf. A literatura correspondente é N.J. Darby, Thomas E. Creighton, Protein Structure (1993) Oxford University Press. Os valores de hidrofobicidade (ΔtR) de aminoácidos são aqui utilizados tal como descrito em http://onlinelibrarv.wilev.com/doi/10.1002/psc.310010507/pd f. A referência que corresponde a esta é Monera, O.D. et al., Journal of Peptide science Vol. 1, 319-329 (1995).

[034] A Figura 12 mostra (a) Curva de crescimento de estirpe RN1053-X2 evoluída e estirpe RN1053 do tipo selvagem sobre Verduyn-ureia-His suplementado com 2% de xilose. As curvas de crescimento foram expressas como unidades de densidade ótica (DO) medidas a 600 nm de comprimento de onda (DO600) ao longo do tempo (h), (B) Nível de expressão de Hxt8-Hxt17 na estirpe RN1053-X2. O nível de expressão em relação aos níveis ACT1 em cada amostra foi expresso como Nível de Expressão de Multiplicidade Normalizado; os níveis de expressão foram normalizados em relação aos níveis de ARNm de RN1053 do gene específico de Hxt (nível de expressão de RN1053 definida como 1).

[035] A Figura 13 (A-B) shows. (A) Nível de expressão de Hxt11 (B) Crescimento de estirpes Hxt11 knockout (KO1 a 6) em comparação com RN1053-X2-vazio (1053-X2) e RN1053 vazio. O crescimento foi expresso em unidades de densidade ótica (DO) medida a 600 nm de comprimento de onda (DO600).

[036] A Figura 13 (C-D) mostra (C) Mapa de plasmídeo de pRS313-P7T7, (D) Crescimento do RN1053-X2 transformado com controle de vetor vazio (1053-X), e de quatro transformantes após a introdução de pRS313-P7T7- inverseHxtll (iHXTl a 4) em Verduyn-ureia suplementado com 2% de xilose. O crescimento foi expresso em unidades de densidade ótica (DO) medido a 600 nm de comprimento de onda (DO600).

[037] A Figura 14 mostra perfis de crescimento de RN1053-Hxt11 (Hxt11, diamantes fechados), RN1053-Hxt12 (Hxt12, triângulos abertos), controle de vetor vazio em RN1053 (1053; triângulos), controle de vetores vazio em RN1041 (1041; quadrados abertos) em Verduyn-ureia suplementado com (A) mistura de glicose e xilose (2% cada) ou (B) 2% de xilose. As curvas de crescimento foram expressas em unidades de densidade ótica (DO) medidas a 600 nm de comprimento de onda (DO600) ao longo do tempo (h).

[038] A Figura 15 mostra estudos de captação de xilose em RN1053-Hxt11 (Hxt11), RN1053-Hxt2 (Hxt2), RN1053-vazio (vazio) com ou sem concentrações crescentes de glicose de competição (0-500 mM).

[039] A Figura 16 mostra (a) Crescimento de RN1053 expressando proteína quimérica Hxt11p-GFP em 2% de xilose, a 16 h (densidade celular inicial foi DO 0,5). (B) Microscopia de fluorescência de RN1053-Hxt11 e RN1041-Hxt11 cultivadas em Verduyn-ureia suplementado com glicose ou xilose.

[040] A Figura 17 mostra os perfis de consumo de fermentação de açúcar e a produção de etanol de (A) plasmídeo de RN1041 vazio e (B) RN1053-Hxt11 em Verduyn- ureia suplementado com 80 gL-1 de glicose e 40 gL-1 de xilose.

[041] A Figura 18 mostra perfis de crescimento (DO600) (A), concentrações (gL-1) de xilose residual (B) e glicose (C) após 96 horas tela de GTAC com transformantes YD01227- GAL2 (n = 3), YD01227-Hxt2 (n = 3), YD01227 Hxt1-1 (n = 3). Amostras do meio e RN1001 foram adicionados como controles.

[042] A Figura 19 (AB) mostra perfis de crescimento de culturas em frascos de agitação de transformantes (a) YD01227-vazio, YD01227-Hxt11 e YD01227-mHxt11 (N366D) (n = 2) em Verduyn-ureia suplementado com 15% de glicose e 1% de xilose e, (B) de transformantes de RN1053 sobre Verduyn- ureia com 2% de xilose (n = 3).

[043] A Figura 19 (C-E) mostra perfis de absorção de açúcar marcados radioativamente com 14C por RN1053-Hxt11 e RN1053-mHxt11 (N366D). (A) absorção de glicose 14C e absorção de xilose 14C na ausência (D) e presença (E) de concentrações de aumento de glicose não marcada (0-500 mM). A absorção de açúcar foi expressa em nmol por mg de peso seco (DW) de fermento por minuto (min).

[044] A Figura 19 (CF) mostra perfis de fermentação de RN1041 vazio (diamantes fechados; 1041 + vazio), RN1053- Hxt11 (triângulos fechados; 1053 + Hxt11), RN1053-mHxt11 (N366D) (quadrados fechados; 1053 + epHxt11) em Verduyn- ureia + glicose 100 gL-1 e xilose 60 gL-1. (C) Curvas de crescimento (expressas por medições de DO600) ao longo do tempo (h). Componentes medidos no caldo de fermentação ao longo do tempo (h), tais como (D) glicose, (E) xilose e (F) etanol.

[045] A Figura 19 (J-L) mostra perfis de fermentação sobre Verduyn-ureia suplementado com glicose 80 gL-1 e xilose 40 gL-1 de estirpe RN1053-Hxt11 (J e L - linha cinza tracejada) e RN1053-mHxt11 (N366D) (K e L - linha preta). (G) Figura combinada de ambos os perfis de fermentação ilustrados em (J) e (K).

[046] A Figura 20 mostra o esquema para a relação glicose/xilose no meio de Verduyn-ureia-his durante o cultivo quimo estático (dias) de YD01227;

[047] A Figura 21 mostra os perfis de crescimento de culturas em balão de agitação sobre Verduyn-ureia-his suplementado com 1% de xilose sem (triângulos fechados; 1 + 0) ou com (3% de glicose, listra, 1 + 3; 6% de glicose, círculos fechados, 1 + 6; 10% de glicose, diamantes, 1 + 10) crescentes concentrações de glicose com YD01227-evo (A) e YD01227-ori (B). (C) Estudo de captação de xilose 14C de YD01227-ori (1227-ori, quadrados fechados) ou YD01227-evo (1227-evo, diamantes fechados) com ou sem aumentar as concentrações de glicose (0-500).

[048] A Figura 22 mostra (A) perfil de expressão de ARNm de YD01227-ori (barras brancas), YD01227-evoB em Verduyn-ureia-His suplementado com uma mistura de açúcar em uma relação xilose:glicose de 1:3 (barras cinzas) e 1:10 (barras pretas). Os dados foram expressos como a expressão normalizada (em relação ao ACT1 e em relação ao YD01227- Ori, o qual foi definido como 1).

[049] FIG. 22 (B-D) Experimentos de incorporação com xilose (B) e glicose (C). A captação foi medida em nmol/mg.DW.min em RN 1053-Hxt3-6 (diamantes), RN1053-N367I (triângulos) e 1053-emp (quadrados). (D) A absorção de 50 mM de xilose 14C na presença de 0, 50, 100, 200 e 500 mM de glicose na estirpe RN1053-Hxt3-6 (diamantes) e RN1053-N367I (quadrados).

[050] Figura 23: Imagens de fluorescência de estirpe RN1053 que expressam proteínas de fusão GFP de Hxt36 (A) e Hxt36-N367I (B). As imagens foram analisadas em um microscópio Nikon Eclipse-Ti. (C) Quantidade total de fluorescência da GFP (em AU/DO600) em ambas as linhagens.

[051] Figura 24: Crescimento da estirpe YD01227 contendo vetores que expressam transportadores de Hxt36 com todas as possíveis substituições de aminoácidos na posição 367. As células foram cultivadas em 1% de xilose e 10% de xilose, e YD01227 transformadas com o vetor vazio pRS313- P7T7 foram utilizadas como um controle.

[052] Figura 25: Experimentos de incorporação para determinar o Km e Vmax para a glicose (painel A) e xilose (painel B). A absorção foi medida em nmol/mgDW.min na estirpe RN1053-Hxt36 (losangos), na estirpe RN1053-Hxt36- N367I (quadrados) e na estirpe RN1053-Hxt36-N367A (triângulos). Os níveis de captação da estirpe RN1053 vazia foram, para ambos os açúcares, subtraídas das estirpes RN1053-Hxt36, RN1053-Hxt36-N367I e RN1053-Hxt36-N367A.

[053] Figura 26: Crescimento da estirpe RN1053 expressando Hxt36 (A), HX736-N367I (B) e HX736-N367A (C) em D-glicose 5 gL-1 e D-xilose 5 gL-1. A D-glicose (diamantes), D-xilose (quadrados) e etanol (círculos) residual foram medidos em g/L.

[054] Figura 27: Caracterização de especificidade de xilose de Hxt11-N366X mutantes. (A) Taxa de crescimento exponencial máxima (1/h) de Hxt11-N366X mutantes na estirpe YD01227. Taxa de crescimento exponencial máxima (1/h) para N366X mutantes expressos em RN1053 sobre glicose (B) ou xilose (C).

[055] Figura 28: Imagens de fluorescência de estirpe RN1053 expressando de proteínas de fusão GFP de Hxt11 N366X mutantes crescidas em maltose 2%. As letras na parte superior esquerdo da imagem mostram o aminoácido na posição 366 da respectiva variante Hxt11.

[056] Figura 29: Fermentações em Verduyn-ureia suplementadas com xilose (40 gL-1) e glicose (71,8 gL-1) de (A) RN1053 Hxt11-N366M, (B) RN1053 Hxt11-N366T, (C) RN 1001 e (D) RN 1053 Hxt11-N366N. Símbolos: glicose (♦), xilose (■), etanol (▲), densidade celular (•). (A), (B), (C) e (D) são os painéis da FIG. 29.

BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[057] SEQ ID NO: 1: iniciador 5034-kanf

[058] SEQ ID NO: 2: iniciador 5035-kanr

[059] SEQ ID NO: 3: iniciador 5116-lf2

[060] SEQ ID NO: 4: iniciador 5118-lr2

[061] SEQ ID NO: 5: iniciador 5115-lf1

[062] SEQ ID NO: 6: iniciador 5117-lr1

[063] SEQ ID NO: 7: pRN201; TOPO-BLUNT-loxP-kanMX-loxP

[064] SEQ ID NO: 8: pRN251; TOPO-BLUNT-loxP-hphMX-loxP

[065] SEQ ID NO: 9: pRN365; TOPO-BLUNT-loxP-natMX-loxP

[066] SEQ ID NO: 10: iniciador 115-NATF

[067] SEQ ID NO: 11: iniciador 116-NATR

[068] SEQ ID NO: 12: pRN447; TOPO-BLUNT-loxP-zeoMX-loxP

[069] SEQ ID NO: 13: iniciador 28-H3f

[070] SEQ ID NO: 14: iniciador 29-H3r

[071] SEQ ID NO: 15: pRN247 (TOPO-BLUNT-HIS3: loxPkanMXIoxP)

[072] SEQ ID NO: 16: iniciador 201-Hx2uf

[073] SEQ ID NO: 17: iniciador 202-Hx2ur

[074] SEQ ID NO: 18: Iniciador 203-Hx2df

[075] SEQ ID NO: 19: Iniciador 204-Hx2dr

[076] SEQ ID NO: 20: Iniciador 205-Hx3uf

[077] SEQ ID NO: 21: Iniciador 206-Hx3ur

[078] SEQ ID NO: 22: Iniciador 210-Hx4df

[079] SEQ ID NO: 23: Iniciador 211-Hx4dr

[080] SEQ ID NO: 24: Iniciador 212-Hx5uf

[081] SEQ ID NO: 25: Iniciador 213-Hx5ur

[082] SEQ ID NO: 26: Iniciador 229-Hx7df

[083] SEQ ID NO: 27: Iniciador 230-Hx7dr

[084] SEQ ID NO: 28: Iniciador 243-Gal2ufn

[085] SEQ ID NO: 29: Iniciador 244-Gal2urn

[086] SEQ ID NO: 30: Iniciador 233-Ga2df

[087] SEQ ID NO: 31: Iniciador 234-Ga2dr

[088] SEQ ID NO: 32: pRN485; TOPO-Blunt-GAL2: loxPzeoMXIoxP

[089] SEQ ID NO: 33: pRN566; TOPO-Blunt-Hxt367: loxP- hphMX-loxP

[090] SEQ ID NO: 34: pRN569; TOPO-Blunt-Hxt514: loxP- natMX-loxP

[091] SEQ ID NO: 35: pRN635; TOPO-Blunt-Hxt2: loxP- kanMX-loxP

[092] SEQ ID NO: 36: iniciador 281-Hx3inr2

[093] SEQ ID NO: 37: iniciador 323-Hx7inr1

[094] SEQ ID NO: 38: iniciador Hx4inr2

[095] SEQ ID NO: 39: iniciador Hx5inf

[096] SEQ ID NO: 40: iniciador 324-Ga2inf1

[097] SEQ ID NO: 41: iniciador 325 Ga2inr1

[098] SEQ ID NO: 42: iniciador 289-Hx2inf

[099] SEQ ID NO: 43: iniciador 290-Hx2inr

[0100] SEQ ID NO: 44: iniciador 838-Glk1-psuc227f

[0101] SEQ ID NO: 45: iniciador 834-Hxk2-psuc227f

[0102] SEQ ID NO: 46: iniciador 645-pSUC227r

[0103] SEQ ID NO: 47: iniciador 839-Glk1-psuc225r

[0104] SEQ ID NO: 48: iniciador 835-Hxk2-psuc225r

[0105] SEQ ID NO: 49: iniciador 646-pSUC225f

[0106] SEQ ID NO: 50: Iniciador 846-Hxk1_loxP_f

[0107] SEQ ID NO: 51: iniciador 847-Hxk1_loxP_r

[0108] SEQ ID NO: 52: iniciador 848-Gal1_loxP_f

[0109] SEQ ID NO: 53: iniciador 849-Gal1_loxP_r

[0110] SEQ ID NO: 54: pRN774; TOPO-BLUNT-loxP-hphMX-loxP (sítios loxP em orientação oposta)

[0111] SEQ ID NO: 55: pRN775; TOPO-BLUNT-loxP-natMX-loxP (sítios loxP em orientação oposta)

[0112] SEQ ID NO: 56: sequência de ADN de WT-GAL2

[0113] SEQ ID NO: 57 pRN993; local XbaI (TCTAGA) e o local BssHII (GCGCGC).

[0114] SEQ ID NO: 58: pDB1250; vetor de expressão WT- GAL2 para rastreio; local XbaI (TCTAGA) e local BssHII (GCGCGC).

[0115] SEQ ID NO: 59: sequência de aminoácidos WT Gal2p.

[0116] SEQ ID NO: 60: pRN187 (vetor de expressão de CRE recombinase derivada de pSH65)

[0117] SEQ ID NO: 61: pRN486 (TOPO-BLUNT-his3::loxP- natMX-loxP)

[0118] SEQ ID NO: 62: iniciador ActinF real)

[0119] SEQ ID NO: 63: iniciador ActinR real)

[0120] SEQ ID NO: 64: iniciador Hxt1F real)

[0121] SEQ ID NO: 65: iniciador Hxt1R real)

[0122] SEQ ID NO: 66: iniciador Hxt2F real)

[0123] SEQ ID NO: 67: iniciador Hxt2R real)

[0124] SEQ ID NO: 68: iniciador Hxt3F (PCR em tempo (PCR em tempo (PCR em tempo (PCR em tempo (PCR em tempo (PCR em tempo (PCR em tempo real)

[0125] SEQ ID NO: real)

[0126] SEQ ID NO: real)

[0127] SEQ ID NO: real)

[0128] SEQ ID NO: real)

[0129] SEQ ID NO: real)

[0130] SEQ ID NO: real)

[0131] SEQ ID NO: real)

[0132] SEQ ID NO: real)

[0133] SEQ ID NO: real)

[0134] SEQ ID NO: real)

[0135] SEQ ID NO: real)

[0136] SEQ ID NO: real)

[0137] SEQ ID NO: real)

[0138] SEQ ID NO: real)

[0139] SEQ ID NO: 69: iniciador Hxt3R (PCR em tempo 70: iniciador Hxt4F (PCR em tempo 71: iniciador Hxt4R (PCR em tempo 72: iniciador Hxt5F (PCR em tempo 73: iniciador Hxt5R (PCR em tempo 74: iniciador Hxt7F (PCR em tempo 75: iniciador Hxt7R (PCR em tempo 76: iniciador Hxt8F ((PCR em tempo 77: iniciador Hxt8R (PCR em tempo 78: iniciador Hxt9F (PCR em tempo 79: iniciador Hxt9R (PCR em tempo 80: iniciador Hxt10F (PCR em tempo 81: iniciador Hxt10R (PCR em tempo 82: iniciador Hxt11M (PCR em tempo 83: iniciador Hxt11R (PCR em tempo real)

[0140] SEQ ID NO: 84: iniciador Hxt12F (PCR real)

[0141] SEQ ID NO: 85: iniciador Hxt12R (PCR real)

[0142] SEQ ID NO: 86: iniciador Hxt13F (PCR real)

[0143] SEQ ID NO: 87: iniciador Hxt13R (PCR real)

[0144] SEQ ID NO: 88: iniciador Hxt14F (PCR real)

[0145] SEQ ID NO: 89: iniciador Hxt14R (PCR real)

[0146] SEQ ID NO: 90: iniciador Hxt15F (PCR real)

[0147] SEQ ID NO: 91: iniciador Hxt15R (PCR real)

[0148] SEQ ID NO: 92: iniciador Hxt16F (PCR real)

[0149] SEQ ID NO: 93: iniciador Hxt16R (PCR real)

[0150] SEQ ID NO: 94: iniciador Hxt17F (PCR real)

[0151] SEQ ID NO: 95: iniciador Hxt17R (PCR real)

[0152] SEQ ID NO: 96: iniciador GAL2F (PCR real)

[0153] SEQ ID NO: 97: iniciador GAL2R (PCR real)

[0154] SEQ ID NO: 98: iniciador KOP11* para KO

[0155] SEQ ID NO: 99: iniciador KOT11* para KO Hxt11

[0156] SEQ ID NO: 100: iniciador iHxt11F (Hxt11 inverso)

[0157] SEQ ID NO: 101: iniciador iHxt11R (Hxt11 inverso)

[0158] SEQ ID NO: 102: iniciador Hxt11F (Clonagem)

[0159] SEQ ID NO: 103: iniciador Hxt12F (Clonagem)

[0160] SEQ ID NO: 104: iniciador Hxt11/12R (Clonagem)

[0161] SEQ ID NO: 105: iniciador Hxt1 Xbal (Clonagem)

[0162] SEQ ID NO: 106: iniciador R Hxt1 Cfr9i (Clonagem)

[0163] SEQ ID NO: 107: iniciador F Hxt2 XbaI (Clonagem)

[0164] SEQ ID NO: 108: iniciador R Hxt2 Cfr9i (Clonagem)

[0165] SEQ ID NO: 109: iniciador F Hxt3 Xbal (Clonagem)

[0166] SEQ ID NO: 110: iniciador R Hxt6 Cfr9i (Clonagem)

[0167] SEQ ID NO: 111: iniciador F Hxt4 XbaI (clonagem)

[0168] SEQ ID NO: 112: iniciador R Hxt4RN Cfr9l (Clonagem)

[0169] SEQ ID NO: 113: iniciador F Hxt5 Xbal (Clonagem)

[0170] SEQ ID NO: 114: iniciador R Hxt5 Cfr9i (Clonagem)

[0171] SEQ ID NO: 115: iniciador F Hxt7 Xbal (Clonagem)

[0172] SEQ ID NO: 116: iniciador R Hxt7 Cfr9l (Clonagem)

[0173] SEQ ID NO: 117: plasmídeo pRS313-P7T7

[0174] SEQ ID NO: 118: plasmídeo pRS313-P7t7-Hxt11 + GFP

[0175] SEQ ID NO: 119: sequência de ADN de Hxt11 ORF de Saccharomyces cerevisiae

[0176] SEQ ID NO: 120: sequência de ADN de Hxt2 ORF de Saccharomyces cerevisiae

[0177] SEQ ID NO: 121: sequência de ADN de GAL2 ORF de Saccharomyces cerevisiae

[0178] SEQ ID NO: 122: sequência de ADN de Hxt3-6 ORF de Saccharomyces cerevisiae

[0179] SEQ ID NO: 123: sequência de aminoácido Hxt11p de Saccharomyces cerevisiae

[0180] SEQ ID NO: 124: sequência de aminoácidos Hxt2p de Saccharomyces cerevisiae

[0181] SEQ ID NO: 125: sequência de aminoácidos Gal2p de Saccharomyces cerevisiae

[0182] SEQ ID NO: 126: sequência de aminoácidos Hxt3-6 de Saccharomyces cerevisiae

[0183] SEQ ID NO: 127: F Hxt36 Bcui

[0184] SEQ ID NO: 128: RHxt36367NNN

[0185] SEQ ID NO: 129: FHxt36367NNN

[0186] SEQ ID NO: 130: R Hxt36 BamHI

[0187] SEQ ID NO: 131: R Hxt36 BamHI-stop

[0188] SEQ ID NO: 132: F GFP BamHI

[0189] SEQ ID NO: 133: R GFP Clal

[0190] SEQ ID NO: 134: F Hxt11 XbaI

[0191] SEQ ID NO: 135: R Hxt11 BamHI

[0192] SEQ ID NO: 136: F Hxt11 366NNN

[0193] SEQ ID NO: 137: R Hxt11 366NNN

[0194] SEQ ID NO: 138: F Hxt11 N366F

[0195] SEQ ID NO: 139: R Hxt11 N366F

[0196] SEQ ID NO: 140: F Hxt11 N366E

[0197] SEQ ID NO: 141: R Hxt11 N366E

[0198] SEQ ID NO: 142: F Hxt11 N366K

[0199] SEQ ID NO: 143: R Hxt11 N366K

[0200] SEQ ID NO: 144: F Hxt11 N366M

[0201] SEQ ID NO: 145: R Hxt11 N366M

[0202] SEQ ID NO: 146: F Hxt11 N366W

[0203] SEQ ID NO: 147: R Hxt11 N366W

[0204] SEQ ID NO: 148: F Hxt11 N366Y

[0205] SEQ ID NO: 149: R Hxt11 N366Y

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0206]Ao longo da presente memória descritiva e nas reivindicações anexas, as palavras "compreende" e "inclui" e variações tais como "compreendem, "compreendendo", "incluem" e "incluindo" devem ser interpretadas inclusivamente. Ou seja, estas palavras pretendem transmitir a possível inclusão de outros elementos ou inteiros não especificamente recitados, onde o contexto o permita. Os artigos "um" e "uma" são aqui utilizados para se referir a um ou a mais do que um (isto é, um ou pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" pode significar um elemento ou mais de um elemento.

[0207]A invenção refere-se a um método de identificação de posições de aminoácidos em polipeptídeos de permease, preferencialmente polipeptídeos de permease de hexose, mais preferencialmente de polipeptídeos de permease de hexose a partir de leveduras e fungos, ainda mais preferencialmente em polipeptídeos de permease Hxt ou Gal2 de Saccharomyces cerevisiae, que podem ser mutados para alterar a especificidade de açúcar da permease.

[0208]A invenção refere-se a um polipeptídeo possuindo uma ou mais substituições em uma posição correspondente à posição 339 ou 376 da SEQ ID NO: 59, em que o polipeptídeo é um membro da superfamília de facilitadores principais (MFS). Em uma forma de realização, a substituição está na posição correspondente a 376 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem um volume de van der Waals de 80 a 138 Â3 e uma hidrofobicidade de cadeia lateral de 10 a 100 ΔtR (T, C, V, M, L, I, F).

[0209]Em uma forma de realização, a substituição está na posição correspondente a 376 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem um volume de van der Waals de 80 a 138 Â3 e uma hidrofobicidade de cadeia lateral de 40 a 100 ΔtR. (C, V, M, L, I, F).

[0210]Em uma forma de realização, a substituição está na posição correspondente a 376 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem um volume de van der Waals de 90 a 138 Â3 e uma hidrofobicidade de cadeia lateral de 10 a 100 ΔtR (T, V, M, L, I, F).

[0211]Em uma forma de realização, a substituição está na posição correspondente a 376 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem um volume de van der Waals de 100 a 138 Â3 e uma hidrofobicidade de cadeia lateral de 60 a 100 ΔtR (V, M, L, I, F).

[0212]Em uma forma de realização, a substituição está na posição correspondente a 376 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem um volume de van der Waals de 100 a 130 Â3 e uma hidrofobicidade de cadeia lateral de 60 a 100 ΔtR (V, M, L, I).

[0213]Em uma forma de realização, a substituição está na posição correspondente a 376 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem um volume de van der Waals de 120 a 130 Â3 e uma hidrofobicidade da cadeia lateral de 60 a 100 ΔtR (M, L, I).

[0214]Em uma forma de realização, a substituição está na posição correspondente a 376 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem um volume de van der Waals de 120 a 130 Â3 e uma hidrofobicidade de cadeia lateral de 80 a 100 ΔtR (L, I).

[0215]Em uma forma de realização, a substituição está na posição correspondente a 376 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem um volume de van der Waals de 100 a 130 Â3 e uma hidrofobicidade de cadeia lateral de 60 a 80 ΔtR (V, M).

[0216]Em uma forma de realização, a substituição está na posição correspondente a 376 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem um volume de van der Waals de 100 a 130 Â3 e uma hidrofobicidade de cadeia lateral de 60 a 98 ΔtR (V, M, L).

[0217]Em uma forma de realização, a substituição é N376T, N376C, N376V, N376M, N376L, N376I ou N376F.

[0218]Em uma forma de realização, o polipeptídeo possui uma substituição na posição correspondente a 339 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem uma hidrofobicidade de cadeia lateral de -30 a 10 ΔtR (G, S, N, Q, H, K, R).

[0219]Em uma forma de realização, um polipeptídeo possui uma substituição na posição correspondente a 339 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem uma hidrofobicidade da cadeia lateral de -30 a 10 ΔtR e um volume de van der Waals entre 60 e 160 Â3 (S, N, Q, H, K, R).

[0220]Em uma forma de realização, um polipeptídeo possui uma substituição na posição correspondente a 339 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem uma hidrofobicidade da cadeia lateral de -30 a 10 ΔtR e um volume de van der Waals entre 80 e 160 Â3 (N, Q, H, K, R).

[0221]Em uma forma de realização, um polipeptídeo possui uma substituição na posição correspondente a 339 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem uma hidrofobicidade da cadeia lateral de -30 a 10 ΔtR e um volume de van der Waals de 100 a 160 Â3 (Q, H, K, R).

[0222]Em uma forma de realização, um polipeptídeo possui uma substituição na posição correspondente a 339 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem uma hidrofobicidade da cadeia lateral de -30 a 0 ΔtR e um volume de van der Waals de 100 a 160 Â3 (Q, K, R).

[0223]Em uma forma de realização, um polipeptídeo possui uma substituição na posição correspondente a 339 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem uma hidrofobicidade da cadeia lateral de -30 a 0 ΔtR e um volume de van der Waals de 120 a 160 Â3 (K, R).

[0224]Em uma forma de realização, um polipeptídeo possui uma substituição na posição correspondente a 339 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem uma hidrofobicidade da cadeia lateral de -30 a 10 ΔtR e um volume de van der Waals entre 80 e 120 Â3 (N, Q, H).

[0225]Em uma forma de realização, um polipeptídeo possui uma substituição na posição correspondente a 339 e em que o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem uma hidrofobicidade da cadeia lateral de -30 a 10 ΔtR e um volume de van der Waals entre 80 e 120 Â3 (N, Q).

[0226]Em uma forma de realização, a substituição é M339G, M339S, M339N, M339Q, M339H, M339K, M339R ou M339V.

[0227]Em uma forma de realização o polipeptídeo tem um ou mais aminoácidos correspondentes a 339 N/V e/ou 376I/M/V.

[0228]As permeases pertencem ao Superfamília de Facilitadores Principais (MFS). Isto é definido a seguir. Sistemas de transporte celulares permitem a absorção de nutrientes e íons essenciais e excreção de produtos do metabolismo e substâncias deletérias. Além disso, os sistemas de transporte desempenham um papel na comunicação entre as células e o meio ambiente. Além disso, eles são uma parte essencial do sistema celular para produzir ou consumir moléculas de fornecimento de energia, tal como ATP.

[0229]O transporte de solutos por transportadores ativos primários é, em primeiro lugar, direcionado por energia tal como por energia fornecida a partir de hidrólise de ATP, absorção de fótons, fluxo de elétrons, descarboxilação de substrato ou transferência de metila. Se moléculas carregadas são bombeadas em uma direção como uma consequência do consumo de energia de uma fonte celular primária, um potencial eletroquímico é o resultado. O gradiente quimiosmótico resultante pode então ser utilizado para conduzir o transporte de moléculas adicionais através de estruturas transportadoras secundárias que apenas facilitam o transporte de uma ou mais moléculas através da membrana.

[0230]Nas últimas duas décadas, a existência de um grande número de famílias de proteínas previamente desconhecidas de transportadores primários e secundários tem sido esclarecida pelo surgimento de estratégias genômicas e fazendo uso dos muitos estudos de genética bioquímica e molecular realizados. As duas principais famílias de transportadores dos quais proteínas foram encontradas por todo organismo vivo são da superfamília de cassete de ligação de ATP (ABC) e a superfamília de facilitadores principais (MFS), também conhecida como a família uniporte-simporte-antiporte. Enquanto as permeases da família ABC consistem em vários componentes e são transportadores ativos primários capazes de transportar ambas pequenas moléculas e macromoléculas apenas após a geração de energia por meio de hidrólise de ATP, os transportadores MFS consistem de um único polipeptídeo de um transportador secundário que facilita o transporte de pequenos solutos em resposta a um gradiente de de íon quimiosmótico. A superfamília ABC e proteínas MFS são responsáveis por quase metade dos transportadores de soluto codificados dentro dos genomas de micróbios (revisados por Pao et al., 1998, Microbiol Mol Biol Rev.; 62 páginas 1-34, e Saier et al., 1999, J Mol Microbiol Biotechnol, 1 páginas 257-279).

[0231] Sequências polipeptídicas de permease adequadas podem conter um ou mais das seguintes porções: a) G-r-x(3)-G-x(3)-G-x(11)-E-x(5)-[LIVM]-R-G-x(12)- [GA]; b) R-x(14)-G-x(2)-Y-x(2)-[YF]-[YF]-[GSAL]; c) V-x(15)-[GNR]-[RH]-R-x(2)-[LM]-x(2)-[GA]

[0232]A porção (a) é corresponde aos resíduos 179-221 na Gal2; a porção (b) é corresponde aos resíduos 330-353 na Gal2; a porção (c) é corresponde aos resíduos 375-399 na Gal2.

[0233]Em uma forma de realização, o polipeptídeo compreende uma porção G-r-x(3)-G-x(3)-G-x(11)-E-x(5)- [LIVM]-R-G-x(12)-[GA].

[0234]O método reivindicado compreende modelar uma sequência de polipeptídeo de permease para a estrutura cristalina publicada de permease de xilose XylE de Escherichia coli ligada a xilose ou glicose (respectivamente, PDB código 4GBY & 4GBZ na base de dados PDB, http://www.pdb.org) para identificar as posições de aminoácidos no canal da permease que interagem diretamente com o açúcar ligado (chamados resíduos de primeira camada na arte), e os resíduos que interagem com resíduos de primeira camada (chamados o resíduos de segunda camada na arte). Programas de computador de modelagem adequados para a construção de tais modelos são YASARA, Prime (Schrodinger Inc.) ou MODELLER utilizando as configurações padrão. Alternativamente, as posições de aminoácido da primeira e segunda camadas que alteram a especificidade de açúcar em uma sequência polipeptídica de permease podem ser identificadas por um alinhamento par a par global da sequência de permease com a sequência Gal2 SEQ ID NO: 59 utilizando o protocolo NEEDLE descrito abaixo. Um exemplo de alinhamento para Gal2 e Hxt a partir de Saccharomyces cerevisiae é dado na Figura 10, que mostra como o alinhamento pode ser utilizado para identificar as posições de aminoácido correspondentes nos diferentes hxt de leveduras. As posições de aminoácidos aqui referem-se, portanto, à SEQ ID NO: 59 que descreve Gal2 ou posições de aminoácidos correspondentes em outros polipeptídeos, em particular outros polipeptídeos de permease. Por exemplo, a posição correspondente da posição N376 em Gal2 (SEQ ID NO: 59) em Hxt1 é N370, em Hxt2 é N361, em Hxt3 é N367, em Hxt4SC é N376, em Hxt4RN é N376, em Hxt5 é N391, em Hxt6/7 é N370, em Hxt8 é N372, em Hxt9 é N366, em Hxt10 é N354, em Hxt11 é N366, em Hxt12 é N256, em Hxt13 é N363, em Hxt14 é N387, em Hxt15 é N366, em Hxt16 é N366 e em Hxt17 é N363. Do mesmo modo, a posição correspondente a N346 em Gal2 (SEQ ID NO: 9) em Hxt1 é D340, em Hxt2 é N331, em Hxt3 é D337, em Hxt4SC é D346, em Hxt4RN é D346, em Hxt5 é D361, em Hxt6/7 é D340, em Hxt8 é D342, em Hxt9 é D336, em Hxt10 é C324, em Hxt11 é D336, em Hxt12 é D226, em Hxt13 é E333, em Hxt14 é I357, em Hxt15 é E336, em Hxt16 é E336 e em Hxt17 é E333. Isto pode ser feito de forma similar para outros transportadores da superfamília MFS, de modo que as posições correspondentes nestes polipeptídeos correspondentes às posições na SEQ ID NO: 59 podem ser obtidas. Isto é apoiado pelos dados dos Exemplos 6-20.

[0235]Uma pessoa versada na técnica pode, posteriormente, mutar as posições de aminoácidos identificadas no polipeptídeo de permease para todos os outros 19 aminoácidos, e rastrear para melhorar a absorção de açúcar C5 e/ou reduzir a absorção de açúcar C6 da permease mutante, tal como descrito nos Exemplos 4 e 5.

[0236] Por exemplo, para um polipeptídeo possuindo uma mutação em uma posição correspondente a uma ou mais das posições correspondentes a N376 da SEQ ID NO: 59, as mutações nas posições correspondentes a N376 podem ser uma substituição com C, P, G, A, V, L, I, M, F, W, Y, H, S, T, N, Q, D, E, K, R ou uma deleção. X pode ser qualquer aminoácido, X(2) significa dois X.

[0237]Aqui, Gal2 é um transportador de difusão facilitada necessária para ambos os processos de transporte de galactose de elevada afinidade dependente de galactoquinase e baixa afinidade independente de galactoquinase. Ele pertence à família de transportador de açúcar da superfamília de facilitadores principais (TC 2.A.1.1). "Polipeptídeo de permease", também é aqui designado como "polipeptídeo permease" ou "polipeptídeo". "Polinucleotídeo de polipeptídeo de permease", é aqui um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de permease.

[0238]Em uma forma de realização da invenção, o polipeptídeo de permease tem, pelo menos, 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59.

[0239]Mutações, aqui, são indicadas por aminoácidos de uma só letra e as posições destes aminoácidos. Por exemplo, A6, aqui, indica um aminoácido (código de uma letra) a uma certa posição na SEQ ID NO: 59, aqui A (alanina) na posição 6 da proteína. A6 (L/N/Q/G/V/I/Y/S/E/K) indica, aqui, mutação de aminoácido em uma determinada posição, aqui A (alanina) na posição 6 da proteína é trocada por qualquer de L (leucina), N (Asparagina), Q (glutamina), G (glicina), V (valina), I (isoleucina), Y (tirosina), S (serina), E (ácido glutâmico) ou K (Lisina).

[0240]Em uma forma de realização, o polipeptídeo tem uma atividade de transporte de xilose.

[0241]Em uma forma de realização, o polipeptídeo tem afinidade à glicose reduzida comparado com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 59.

[0242]O polipeptídeo de permease da invenção pode ter uma ou mais atividades alternativas e/ou complementares diferentes da atividade da permease de açúcar.

[0243] Tal como estabelecido acima, um polipeptídeo de permease da invenção terá, tipicamente, atividade de permease de açúcar. No entanto, um polipeptídeo de permease da invenção pode ter uma ou mais das atividades acima referidas, em adição a, ou alternativa para, essa atividade.

Sequência Polinucleotídica

[0244] Com o polipeptídeo de permease e a sua sequência de aminoácidos, tal como aqui divulgado, o versado na técnica pode determinar polinucleotídeos adequados que codificam o polipeptídeo de permease.

[0245]Em uma forma de realização o polinucleotídeo é um polinucleotídeo variante tendo, pelo menos, 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56, e codifica para o polipeptídeo, tal como descrito nas reivindicações 1 a 11.

[0246] Por conseguinte, a invenção proporciona sequências de polinucleotídeos que compreendem o gene que codifica o polipeptídeo de permease, assim como a sua sequência de codificação.

[0247]Os polinucleotídeos da invenção podem ser isolados ou sintetizados. Os polipeptídeos de permease e polinucleotídeos de polipeptídeo de permeasse aqui descritos podem ser polipeptídeos sintéticos, respectivamente, polinucleotídeos. Os polinucleotídeos sintéticos podem ser otimizados na utilização de códons, de preferência de acordo com os métodos descritos na WO2006/077258 e/ou PCT/EP2007/055.943, que são aqui incorporados por referência. PCT/EP2007/055943 endereça a otimização de par de códon.

[0248]O termo refere-se a uma molécula de polinucleotídeo, que é um ácido ribonucleico (ARN) ou ácido desoxirribonucleico (ADN), quer de cadeia simples ou de cadeia dupla. Um polinucleotídeo pode estar presente tanto na forma isolada quanto ser composto de moléculas ou vetores de ácidos nucleicos recombinantes, ou estar composto em uma célula hospedeira.

[0249]O termo "polipeptídeo" é utilizado aqui para cadeias contendo mais de sete resíduos de aminoácido. Todas as fórmulas ou sequências oligopeptídicas e polipeptídicas aqui são escritas da esquerda para a direita e no sentido de terminal amino à terminal carboxila. O código de uma letra dos aminoácidos utilizado aqui é comumente conhecido na técnica.

[0250] Por polipeptídeo ou proteína "isolado", destina- se um polipeptídeo, ou uma proteína, removidos do seu ambiente nativo. Por exemplo, polipeptídeos e proteínas produzidos de forma recombinante expressos em células hospedeiras são considerados isolados para a finalidade da invenção, tal como são os polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram substancialmente purificados por qualquer técnica adequada tal como, por exemplo, o método de purificação de um só passo descrito em Smith e Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

[0251]Os polinucleotídeos da presente invenção, tal como um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de permeasse, pode ser isolado ou sintetizado utilizando técnicas de biologia molecular convencionais e a informação de sequência aqui proporcionada.

[0252]O polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de permease da invenção pode ser amplificado utilizando ADNc, ARNm ou, em alternativa, ADN genômico, como um molde e iniciadores oligonucleotídicos adequados de acordo com técnicas convencionais de amplificação por PCR. O ácido nucleico assim amplificado pode ser clonado em um vetor apropriado e caracterizado por análise da sequência de ADN. Transformação

[0253]Os polinucleotídeos, de acordo com a invenção, podem ser expressos em um hospedeiro adequado. A invenção refere-se, assim, a uma célula hospedeira transformada. Em uma forma de realização, a célula hospedeira pode ser transformada com um construto de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de acordo com a invenção, definido antes. Por conseguinte, podem ser utilizadas técnicas de transformação padrão.

[0254]Em uma forma de realização a célula hospedeira transformada compreende um nucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou codifica um polipeptídeo possuindo substituição F85Q/V, T89V, V187A/F, I218S, T219A, Q341S/A, N346V, T380A, F444LA, T448A, T449F, T451G ou W455M da SEQUÊNCIA ID NO: 59, e em uma forma de realização da mesma a célula hospedeira é Saccharomyces cerevisiae.

[0255]Em uma forma de realização o hospedeiro transformado é transformado com um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é um mutante de um polipeptídeo que é nativo na célula hospedeira não transformada.

[0256]Em uma forma de realização o polipeptídeo que é nativo na célula hospedeira não transformado é um membro dos transportadores da superfamília de facilitadores principais (MFS), em uma forma de realização um polipeptídeo transportador de hexose.

[0257]Em uma forma de realização, o polipeptídeo que é nativo na célula hospedeira não transformada é um polipeptídeo transportador escolhido a partir da lista que consiste em Gal2, Hxt1, Hxt2, Hxt3, Hxt4, Hxt5, Hxt6, Hxt7, Hxt8, Hxt9, Hxt10, Hxt11, Hxt12, Hxt13, Hxt14, Hxt15, Hxt16 e Hxt17.

[0258]Em uma forma de realização, no polipeptídeo da invenção não tem o resíduo de aminoácido X (X pode ser qualquer aminoácido) em uma dada posição A (A pode ser qualquer posição específica no polipeptídeo na SEQ ID NO: 59), onde X é uma mutação na SEQ ID NO: 59, quando X é nativo em A para uma posição correspondente em um segundo polipeptídeo da família MFS.

[0259]Em uma forma de realização, o polipeptídeo não tem o resíduo de aminoácido S, que corresponde à M339S na SEQ ID NO: 59, na posição correspondente na Hxt1 (isto é, não 333S em Hxt1), em Hxt2 (isto é, não 324S em Hxt2), em Hxt3 (isto é, não 330S em Hxt3), em Hxt4 (isto é, não 339S em Hxt4), em Hxt5 (isto é, não 354S em Hxt5), em Hxt6 ou em Hxt7 (isto é, não 333S em Hxt6 ou Hxt7), em Hxt8 (isto é, não 335S em Hxt8), em Hxt9 (isto é, não 329S em Hxt9), em Hxt10 (isto é, não 317S em Hxt10) ou em Hxt11 (isto é, não 329S em Hxt11).

[0260]Em uma forma de realização, o polipeptídeo é um Hxt3-6 mutante e tem uma ou mais substituições em Hxt3-6, em uma forma de realização da mesma, o polipeptídeo tem substituições correspondentes a N367A/C/D/F/G/I/L/M/S/T/V da SEQ ID NO: 126. Em uma forma de realização, o polipeptídeo tem substituições correspondentes a N367A/I da SEQ ID NO: 126. Em uma forma de realização, o polipeptídeo tem substituições correspondentes a N367A da SEQ ID NO: 126.

[0261]Em uma forma de realização, o polipeptídeo é um Hxt11 mutante e tem uma ou mais substituições em Hxt11, em uma forma de realização da mesma, o polipeptídeo tem substituições correspondentes a N366A/C/D/F/G/I/L/M/S/T/V da SEQ ID NO: 123. Em uma forma de realização, o polipeptídeo é um Hxt11 mutante. Em uma forma de realização, o polipeptídeo tem substituições correspondentes a N366/M/I/L/M/T/V da SEQ ID NO: 123. Em uma forma de realização, o polipeptídeo tem substituições correspondentes a N366D/M/T da SEQ ID NO: 123. Em uma forma de realização, o polipeptídeo tem substituições correspondentes a N366M/T da SEQ ID NO: 123. Em uma forma de realização o polipeptídeo tem substituições correspondentes a N366M/T ou N366T da SEQ ID NO: 123.

Co-consumo

[0262]Em uma forma de realização o hospedeiro transformado é capaz de co-consumação de glicose e, pelo menos, uma pentose. Esta pentose pode ser arabinose ou xilose, em uma forma de realização é xilose. Co-consumo (ou co-fermentação) de dois substratos é aqui definido como a absorção simultânea e a conversão intracelular de duas fontes de carbono diferentes (por exemplo, xilose e glicose), em um nível apreciável. Referidas fontes de carbono são simultaneamente convertidas em produtos, tal como por exemplo, biomassa, etanol, glicerol e semelhantes.

[0263]O co-consumo de uma célula é aqui quantificado e expresso como índice de co-consumo. O índice de co-consumo é aqui, o índice de co-consumo de glicose e xilose e é calculado como a soma ao longo do intervalo de tempo de 0-24 horas (medido a 0, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 horas) da diferença absoluta da taxa de captação de glicose (Qg) e a taxa de absorção de xilose (Qx), expresso em gramas de açúcar consumidos por unidade de tempo, em uma fermentação anaeróbia de cultura em lotes a 1,0 g/L de levedura seca, 30 graus C de temperatura e em que o meio de fermentação contém 71,8 gramas de glicose por litro e 40,0 gramas de xilose por litro, no início da fermentação. Veja exemplos 16-18.

[0264]Em uma forma de realização, o índice de co- consumo da célula hospedeira transformada é de 27 g/h ou menos, 25 g/h ou menos, 23 g/h ou menos, 20 g/h ou menos, 18 g/h ou menos, 16 g/h ou menos, 14 g/h ou menos, ou 12 g/h ou menos.

[0265]A invenção refere-se ainda a um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo como descrito antes, por exemplo, um vetor.

[0266]Outro aspecto da invenção refere-se, assim, a vetores, incluindo a clonagem e vetores de expressão, compreendendo um polinucleotídeo da invenção que codifica para uma proteína polipeptídica de permease ou um seu equivalente funcional e métodos de crescimento, transformação ou transfecção de tais vetores em uma célula hospedeira adequada, por exemplo em condições em que a expressão de uma permease da invenção ocorre. Tal como aqui utilizado, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado.

[0267]Os polinucleotídeos da invenção podem ser incorporados em um vetor recombinante replicável, por exemplo um vetor de clonagem ou expressão. O vetor pode ser utilizado para replicar o ácido nucleico em uma célula hospedeira compatível. Assim, em uma outra forma de realização, a invenção proporciona um método de preparação de polinucleotídeos da invenção através da introdução de um polinucleotídeo da invenção em um vetor replicável, introduzindo o vetor em uma célula hospedeira compatível e crescendo a célula hospedeira sob condições que provocam a replicação do vetor. O vetor pode ser recuperado da célula hospedeira. As células hospedeiras adequadas são descritas abaixo.

[0268] Será apreciado por aqueles versados na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores tal como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, etc. Os vetores, tal como vetores de expressão, da invenção podem ser introduzidos nas células hospedeiras para, desse modo, produzir proteínas ou peptídeos codificados por ácidos nucleicos, tal como aqui descrito. Os vetores, tal como vetores de expressão recombinantes, da invenção podem ser concebidos para expressão de proteínas polipeptídicas de permease em células procarióticas ou eucarióticas.

[0269] Por exemplo, polipeptídeos de permease podem ser expressos em células bacterianas tal como E. coli, células de inseto (utilizando vetores de expressão de baculovírus), fungos filamentosos, células de levedura ou células de mamíferos. As células hospedeiras adequadas são mais discutidas em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Os exemplos representativos de hospedeiros adequados são descritos daqui em diante.

[0270]Os meios de cultura e condições apropriados, para as células hospedeiras acima descritas, são conhecidos na técnica.

[0271] Para a maioria dos fungos filamentosos e leveduras, o vetor ou construto de expressão é, de preferência, integrado no genoma da célula hospedeira de forma a obter transformantes estáveis. No entanto, para certas leveduras, vetores epissômicos adequados também estão disponíveis nos quais a construto de expressão pode ser incorporado para expressão estável e elevado nível, exemplos destes incluem vetores derivados de plasmídeos 2μ e pKD1 de Saccharomyces e Kluyveromyces, respectivamente, ou vetores contendo uma sequência AMA (por exemplo, AMA1 de Aspergillus). No caso dos construtos de expressão serem integrados no genoma de células hospedeiras, os construtos são tanto integrados em loci aleatórios no genoma, quanto em loci alvo predeterminados utilizando recombinação homóloga, caso no qual os loci alvo compreendem, preferencialmente, um gene altamente expresso.

[0272] Consequentemente, vetores de expressão úteis na presente invenção incluem vetores derivados de cromossomos, epissomas e vírus, por exemplo, vetores derivados de plasmídeos bacterianos, bacteriófago, epissoma de leveduras, elementos cromossômicos de levedura, vírus tal como baculovírus, vírus papova, adenovírus, vírus vaccinia, vírus varíola aviária, vírus da pseudo-raiva e retrovírus, e vetores derivados de combinações destes, tal como os derivados de elementos genéticos de plasmídeo e de bacteriófagos, tal como cosmídeos e fagemídeos.

[0273]Quando o polipeptídeo de acordo com a invenção é para ser segregado a partir da célula hospedeira para o meio de cultura, uma sequência de sinal apropriado pode ser adicionada ao polipeptídeo, de modo a direcionar o polipeptídeo sintetizado de novo para a via de secreção da célula hospedeira. O versado na técnica sabe escolher uma sequência de sinal adequada para um hospedeiro específico.

[0274]O vetor pode ainda incluir sequências que flanqueiam o polinucleotídeo dando origem a ARN que compreende sequências homólogas às sequências genômicas eucarióticas ou sequências genômicas virais. Isso permitirá a introdução dos polinucleotídeos da invenção no genoma de uma célula hospedeira.

[0275]Um vetor de clonagem integrativo pode integrar em um locus aleatório ou a um de alvo predeterminado no (s) cromossoma (s) da célula hospedeira em que é para ser integrado.

[0276]O sistema de vetor pode ser um único vetor, tal como um plasmídeo único, ou dois ou mais vetores, tal como dois ou mais plasmídeos, que em conjunto contêm o ADN total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira.

[0277]O vetor pode conter um polinucleotídeo da invenção orientado em uma direção anti-sentido, em que proporciona a produção de ARN anti-sentido.

[0278] DNA vetor pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas através de técnicas de transformação ou transfecção convencionais. Tal como aqui utilizados, os termos "transformação" e "transfecção" pretendem referir-se a uma variedade de técnicas reconhecidas na arte para a introdução de ácido nucleico estranho (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira, incluindo co-precipitação de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transdução, infecção, lipofecção, transfecção lipomediada catiônica ou eletroporação. Métodos adequados para transformação ou transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook, et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a, Ed Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) e outros manuais de laboratório.

[0279] Tal como indicado antes, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado tendo a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 59 com as mutações indicadas na reivindicação 1.

[0280]O polipeptídeo de permeasse, de acordo com a invenção, pode ser recuperado e purificado a partir de culturas de células recombinantes por métodos conhecidos na arte. Mais preferivelmente, a cromatografia líquida de alta eficiência ("CLAE") é utilizada para a purificação.

[0281]Os polipeptídeos da presente invenção incluem produtos naturalmente purificados, produtos de procedimentos sintéticos químicos e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro procariota ou eucariota, incluindo, por exemplo, bacteriana, de levedura, de plantas superiores, de insetos e células de mamíferos. Dependendo do hospedeiro empregue em um procedimento de produção recombinante, os polipeptídeos da presente invenção podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Além disso, os polipeptídeos da invenção podem também incluir um resíduo de metionina inicial modificado, em alguns casos como resultado de processos mediados pelo hospedeiro.

[0282]A invenção também apresenta fragmentos biologicamente ativos dos polipeptídeos de acordo com a invenção.

[0283] Também são fornecidas células hospedeiras que compreendem um polinucleotídeo ou vetor da invenção. O polinucleotídeo pode ser heterólogo ao genoma da célula hospedeira. O termo "heterólogo", usualmente em relação à célula hospedeira, significa que o polinucleotídeo não ocorre naturalmente no genoma da célula hospedeira ou que o polipeptídeo não é naturalmente produzido por essa célula.

[0284]Em uma outra forma de realização, a invenção apresenta células, por exemplo, células hospedeiras transformadas ou células hospedeiras recombinantes, que contêm um ácido nucleico abrangido pelo invento. Uma "célula transformada" ou "célula recombinante" é uma célula na qual (ou em um ancestral da qual) foi introduzido, por meio de técnicas de ADN recombinante, um ácido nucleico de acordo com a invenção. Ambas as células procariotas e eucariotas são incluídas, por exemplo, bactérias, fungos, leveduras e semelhantes, especialmente preferidos são células de levedura, incluindo por exemplo, Saccharomyces, por exemplo Saccharomyces cerevisiae.

[0285]Uma célula hospedeira pode ser escolhida que modula a expressão das sequências inseridas, ou modifique e processe o produto do gene de um modo específico desejado. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos proteicos podem facilitar o funcionamento ótimo da proteína.

[0286]Várias células hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para o processamento e modificação pós-tradução de proteínas e produtos de genes. As linhas celulares ou sistemas hospedeiros apropriados familiares aos versados na técnica de biologia molecular e/ou microbiologia podem ser escolhidos para assegurar a modificação correta e desejada e o processamento da proteína estranha expressa. Para este fim, as células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para o processamento adequado do transcrito primário, glicosilação, e fosforilação do produto do gene podem ser utilizadas. Tais células hospedeiras são bem conhecidas na técnica.

[0287] Se desejado, uma célula tal como descrita acima, pode ser utilizada para a preparação de um polipeptídeo de acordo com a invenção. Tal método, normalmente, compreende o cultivo de uma célula hospedeira (por exemplo, transformada ou transfectada com um vetor de expressão como descrito acima) sob condições para proporcionar a expressão (pelo vetor) de uma sequência de codificação que codifica o polipeptídeo, e, opcionalmente, recuperação do polipeptídeo expresso. Os polinucleotídeos da invenção podem ser incorporados em um vetor recombinante replicável, por exemplo, um vetor de expressão. O vetor pode ser utilizado para replicar o ácido nucleico em uma célula hospedeira compatível. Assim, em uma outra forma de realização, a invenção proporciona um método de preparação de um polinucleotídeo da invenção através da introdução de um polinucleotídeo da invenção em um vetor replicável, introdução do vetor em uma célula hospedeira compatível e crescimento da célula hospedeira sob condições que permitam a replicação do vetor. O vetor pode ser recuperado da célula hospedeira.

[0288]Os vetores podem ser transformados ou transfectados para uma célula hospedeira adequada tal como descrito acima, para proporcionar a expressão de um polipeptídeo da invenção. Este processo pode compreender a cultura de uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão, conforme descrito acima, sob condições para proporcionar a expressão pelo vetor de uma sequência de codificação que codifica o polipeptídeo.

[0289]Aqui são utilizadas técnicas de isolamento padrão, de hibridação, de transformação e de clonagem (por exemplo, tal como descrito em Sambrook, J., Fritsh, E.F., e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a, Ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold. Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Homologia & Identidade

[0290]As sequências de aminoácidos ou nucleotídeos são consideradas homólogas quando exibem um certo grau de similaridade. Duas sequências sendo homólogas indica uma origem evolucionária. Se duas sequências homólogas estão intimamente relacionadas ou mais distantemente relacionadas é indicado por "percentagem de identidade" ou "percentagem de semelhança", que é alta ou baixa, respectivamente. Embora contestado, para indicar "a percentagem de identidade" ou "percentagem de similaridade", "nível de homologia" ou "percentagem de homologia" são, frequentemente, utilizados alternadamente.

[0291]Uma comparação de sequências e de determinação da percentagem de identidade entre duas sequências pode ser realizada utilizando um algoritmo matemático. O especialista estará ciente do fato de que diversos programas de computador diferentes estão disponíveis para alinhar duas sequências e determinar a homologia entre duas sequências (Kruskal, J.B. (1983) Na overview of sequence compatison in D. Sankoff and J.B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and amcromolecules: the theory and pactice of sequence comparison (Uma visão geral de comparação de sequência em D. Sankoff e J.B. Kruskal, (Ed.), urdiduras de tempo, edições de cordas e macromoléculas: a teoria e a prática de comparação de sequência), páginas 1-44 Addison Wesley). A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências. (Needleman, S.B. e Wunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). O algoritmo alinha sequências de aminoácidos, bem como sequências de nucleotídeos. O algoritmo de Needleman-Wunsch foi implementado no programa de computador NEEDLE. Para os fins da presente invenção, o programa NEEDLE do pacote EMBOSS foi utilizado (versão 2.8.0 ou superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. e Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) páginas 276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Para sequências de proteína, EBLOSUM62 é utilizado para a matriz de substituição. Para as sequências de nucleotídeos, EDNAFULL é utilizado. Outras matrizes podem ser especificadas. Os parâmetros opcionais utilizados para o alinhamento de sequências de aminoácidos são uma penalidade de lacuna aberta de 10 e uma penalidade de extensão de lacuna de 0,5. O versado irá apreciar que todos esses parâmetros diferentes irão produzir resultados ligeiramente diferentes, mas que a percentagem de identidade global de duas sequências não é alterada, significativamente, quando se usam diferentes algoritmos.

Definição de homologia global

[0292]A homologia ou identidade é a percentagem de correspondências idênticas entre as duas sequências completas sobre a região alinhada total incluindo eventuais lacunas ou extensões. A homologia ou identidade entre as duas sequências alinhadas é calculada como segue: Número de posições correspondentes no alinhamento mostrando um aminoácido idêntico em ambas as sequências, dividido pelo comprimento total do alinhamento, incluindo as lacunas. A identidade como aqui definida pode ser obtida a partir de NEEDLE e é rotulada na saída do programa como "IDENTIDADE". Definição de Identidade Mais Longa

[0293]A homologia ou identidade entre as duas sequências alinhadas é calculada como segue: Número de posições correspondentes no alinhamento mostrando um aminoácido idêntico em ambas as sequências, dividido pelo comprimento total do alinhamento, após subtração do número total de lacunas no alinhamento. A identidade, tal como aqui definido, pode ser obtida a partir de NEEDLE utilizando a opção NOBRIEF e é rotulada na saída do programa como "identidade mais longa".

[0294]As várias formas de realização da invenção aqui descritas podem ser combinadas cruzadas.

A composição de açúcar

[0295]A composição de açúcar, de acordo com a invenção, compreende glicose, arabinose e xilose. Qualquer composição de açúcar pode ser utilizada na presente invenção que satisfaça esses critérios. Açúcares opcionais na composição de açúcar são galactose e manose. Em uma forma de realização preferida, a composição de açúcar é um hidrolisado de um ou mais material lignocelulósico. Lignocelulose, aqui, inclui hemicelulose e partes de hemicelulose de biomassa. Também, lignocelulose inclui frações lignocelulósicas de biomassa. Materiais lignocelulósicos adequados podem ser encontrados na lista a seguir: podas de pomar, chaparral, resíduos de moinho, resíduos de madeira urbana, resíduos urbanos, resíduos de exploração de madeira, desbastes florestais, culturas lenhosas de curta rotação, resíduos industriais, palha de trigo, palha de aveia, palha de arroz, palha de cevada, palha de centeio, palha de linho, casca de soja, casca de arroz, palha de arroz, farelo de glúten de milho, casca de aveia, cana-de-açúcar, resíduos do milho, pé de milho, espigas de milho, palha de milho, switch grass, miscanthus, sorgo doce, hastes de canola, haste de soja, grama pradaria, gamagrass, rabo-de-raposa; polpa de beterraba, polpa de citrinos, cascas de sementes, resíduos de animais celulósicos, recortes de grama, casca de algodão, algas, árvores, madeira macia, madeira de lei, álamo, pinheiros, arbustos, gramíneas, trigo, palha de trigo, bagaço de cana- de-açúcar, milho, palha de milho, espiga de milho, grãos de milho, fibra de kernels, produtos e subprodutos da moagem úmida ou seca de grãos, resíduos sólidos urbanos, resíduos de papel, resíduos de quintal, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos urbanos, resíduos de papel, celulose, resíduos de fábricas de papel, galhos, arbustos, bastões, milho, palha de milho, uma cultura energética, floresta, uma fruta, uma flor, um grão, uma grama, uma cultura herbácea, uma folha, casca, uma agulha, uma tora, um raiz, um rebento, um arbusto, switch grass, uma árvore, um legume, cascas de frutas, uma videira, polpa de beterraba, farelo de trigo, casca de aveia, madeira dura ou macia, material de resíduos orgânicos gerados a partir de um processo de agricultura, resíduos de madeira de silvicultura, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais destes.

[0296]Uma visão geral de algumas composições de açúcar adequadas derivadas de lignocelulose e a composição de açúcar dos seus hidrolisados é dada na Tabela 1. As lignoceluloses listadas incluem: espigas de milho, fibra de milho, cascas de arroz, cascas de melão, polpa de beterraba sacarina, palha de trigo, bagaço de cana-de-açúcar, madeira, grama e prensagens da azeitona. Tabela 1: Visão geral de composições de açúcar a partir de materiais lignocelulósicos. Gal = galactose, Xyl = xilose, Ara = arabinose, Man = manose, Glu = glicose, Rham = ramnose. A porcentagem de galactose (% Gal) e fonte de literatura é dada.

[0297]É evidente, a partir da tabela 1, que, nestas lignoceluloses, uma quantidade elevada de açúcar está presente na forma de glicose, xilose, arabinose e galactose. A conversão da glicose, xilose, arabinose e galactose ao produto da fermentação é, portanto, de grande importância econômica. Também, manose está presente em alguns materiais de lignocelulose sendo, geralmente, em quantidades inferiores às dos açúcares mencionados anteriormente. De um modo vantajoso, por conseguinte, manose também é convertida pela célula hospedeira transformada.

A célula hospedeira transformada

[0298]Em uma forma de realização, a célula hospedeira transformada pode compreender uma ou mais cópias do gene de isomerase de xilose e/ou uma ou mais cópias de xilose redutase e/ou xilitol desidrogenase, e duas a dez cópias de araA, araB e araD, genes, em que estes genes são integrados no genoma da célula.

[0299]Em uma forma de realização, a célula hospedeira transformada compreende genes, por exemplo, o gene acima de xilose isomerase e/ou uma ou mais cópias de xilose redutase e/ou xilitol desidrogenase, e duas a dez cópias de araA, araB e araD, genes, são integrados no genoma da célula hospedeira transformada.

[0300]O número de cópias pode ser determinado pelo versado na técnica por qualquer método conhecido. Nos exemplos, um método adequado é descrito.

[0301]Em uma forma de realização, a célula hospedeira transformada é capaz de fermentar glicose, arabinose, xilose e galactose.

[0302]Em uma forma de realização, a célula é capaz de converter 90% ou mais de glicose, xilose, arabinose, galactose e manose disponíveis, a um produto de fermentação. Em uma forma de realização, a célula é capaz de converter 91% ou mais, 92% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 100% de toda a glicose, arabinose, xilose, galactose e manose disponíveis, a um produto de fermentação.

[0303]Em uma forma de realização da invenção, a célula hospedeira transformada é capaz de fermentar um ou mais açúcar adicional, de preferência açúcar C5 e/ou C6, por exemplo, manose. Em uma forma de realização da invenção, a célula hospedeira transformada compreende um ou mais dos seguintes: um gene xylA-, gene XYL1 e gene XYL2 e/ou gene XKS7, para permitir a célula hospedeira transformada a fermentar xilose; deleção do gene da aldose-redutase (GRE3); a sobre-expressão de genes PPP-TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1 para permitir o aumento do fluxo através da via de fosfato pentose na célula.

[0304]Em uma forma de realização, a célula hospedeira transformada é uma célula industrial, mais preferencialmente uma levedura industrial. Uma célula industrial e célula de levedura industrial pode ser definida como se segue. Os ambientes de vida das células (levedura) em processos industriais são significativamente diferentes daqueles no laboratório. Células de levedura industrial devem ser capazes de funcionar bem sob várias condições ambientais que podem variar durante o processo. Tais variações incluem as alterações em fontes de nutrientes, pH, concentração de etanol, temperatura, concentração de oxigênio, etc., que em conjunto têm potencial impacto sobre o crescimento celular e produção de etanol de Saccharomyces cerevisiae. Sob condições industriais adversas, as linhagens tolerantes ambientais devem permitir um crescimento robusto e produção. Estirpes de leveduras industriais são, geralmente, mais robustas em relação a estas mudanças nas condições ambientais que podem ocorrer nas aplicações que são utilizadas, tal como na indústria de panificação, indústria de fabricação de cerveja, vinificação e indústria do etanol. Em uma forma de realização, a célula hospedeira transformada industrial é construída com base em uma célula hospedeira industrial, em que a construção é realizada tal como a seguir descrito. Exemplos de levedura (S. cerevisiae) industrial são Etanol Red® (Fermentis), Fermiol® (DSM) e Thermosacc® (Lallemand).

[0305]Em uma forma de realização a célula hospedeira transformada é tolerante a inibidor. A tolerância a inibidor é a resistência a compostos inibidores. A presença e o nível de compostos inibidores de lignocelulose pode variar amplamente com a variação de materiais de alimentação, método de pré-tratamento e processo de hidrólise. Exemplos de categorias de inibidores são os ácidos carboxílicos, furanos e/ou compostos fenólicos. Exemplos de ácidos carboxílicos são o ácido láctico, ácido acético ou ácido fórmico. Exemplos de furanos são furfural e hidroxi-metilfurfural. Exemplos de compostos fenólicos são vanilina, ácido siríngico, ácido ferúlico e ácido cumárico. As quantidades típicas de inibidores para ácidos carboxílicos são: várias gramas por litro, até 20 gramas por litro ou mais, dependendo da matéria-prima, do pré- tratamento e das condições de hidrólise. Para furanos: várias centenas de miligramas por litro até vários gramas por litro, dependendo da matéria-prima, do pré-tratamento e das condições de hidrólise.

[0306] Para fenólicos: várias dezenas de miligramas por litro até um grama por litro, dependendo da matéria-prima, do pré-tratamento e das condições de hidrólise.

[0307]As células hospedeiras transformadas, de acordo com a invenção, podem ser tolerantes a inibidor, isto é, elas podem suportar inibidores comuns ao nível que eles têm tipicamente com as condições de pré-tratamento e de hidrólise comuns, de modo que as células hospedeiras transformadas podem encontrar uma vasta aplicação, isto é têm alta aplicabilidade para diferentes matérias-primas, diferentes métodos de pré-tratamento e diferentes condições de hidrólise.

[0308]Em uma forma de realização, a célula hospedeira transformada industrial é construída com base em uma célula hospedeira tolerante a inibidor, em que a construção é conduzida tal como descrito a seguir. As células hospedeiras tolerantes a inibidor podem ser selecionadas pela triagem de estirpes quanto ao crescimento em materiais que contenham inibidores, conforme ilustrado em Kadar et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847858, em que uma estirpe de S. cerevisiae tolerante a inibidor ATCC 26602 foi selecionada.

[0309]Em uma forma de realização, a célula hospedeira transformada é livre de marcador. Tal como aqui utilizado, o termo "marcador" refere-se a um gene que codifica para um traço ou um fenótipo que permite a seleção de, ou o rastreio para, uma célula hospedeira contendo o marcador. Livre de marcador significa que os marcadores estão, essencialmente, ausentes na célula hospedeira transformada. Ser livre de marcador é particularmente vantajoso quando os marcadores antibióticos têm sido utilizados em construção de célula hospedeira transformada e são removidos subsequentemente. A remoção dos marcadores pode ser feita utilizando qualquer técnica apropriada da técnica anterior, por exemplo, recombinação intramolecular. Um método adequado de remoção de marcador é ilustrado nos exemplos.

[0310]Uma célula hospedeira transformada pode ser capaz de converter biomassa vegetal, celuloses, hemiceluloses, pectinas, amido, derivados de amido, por exemplo, a açúcares fermentáveis. Assim, uma célula hospedeira transformada pode expressar uma ou mais enzimas, tal como uma celulase (uma endocelulase ou um exocelulase), uma hemicelulase (uma endo ou exo-xilanase ou arabinase), necessárias para a conversão da celulose em monômeros de glicose e hemicelulose em monômeros de xilose e arabinose, uma pectinase capaz de converter pectinas em ácido glucurônico e ácido galacturônico ou uma amilase para converter o amido em monômeros de glicose.

[0311]A célula hospedeira transformada pode ainda compreender aquelas atividades enzimáticas necessárias para a conversão de piruvato em um produto de fermentação desejado, tal como etanol, butanol, ácido láctico, di- terpeno, di-terpeno glicosilado, ácido 3-hidroxi- propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, uma β-lactama ou uma cefalosporina.

[0312]Em uma forma de realização, a célula hospedeira transformada é uma célula que é naturalmente susceptível a fermentação alcoólica, de preferência, fermentação alcoólica anaeróbia. Uma célula hospedeira transformada, de um modo preferido, tem uma elevada tolerância ao etanol, uma alta tolerância a baixo pH (isto é, capaz de um crescimento a um pH menor do que cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, ou cerca de 2,5) e em direção a orgânico e/ou uma alta tolerância a temperaturas elevadas.

[0313]Qualquer uma das características ou atividades de uma célula hospedeira transformada acima pode estar presente, naturalmente, na célula ou pode ser introduzida ou alterada por modificação genética. Construto da célula hospedeira transformada

[0314] De acordo com uma forma de realização, os genes podem ser introduzidos na célula hospedeira introduzindo em uma célula hospedeira: a) um grupo consistindo dos genes araA, araB e araD sob o controle de um forte promotor constitutivo b) um grupo que consiste em genes PPP como TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1, opcionalmente sob o controle do promotor constitutivo forte; e deleção de um gene de aldose- redutase; c) um grupo consistindo de um gene xylA e um gene XKS7 sob o controle de um forte promotor constitutivo; d) um construto compreendendo um gene xylA sob o controle de um forte promotor constitutivo, o qual tem a capacidade de se integrar no genoma em múltiplos loci; e evolução adaptativa para produzir a célula hospedeira transformada. A célula acima pode ser construída utilizando técnicas de expressão recombinantes.

A expressão recombinante

[0315]A célula hospedeira transformada é uma célula recombinante. Isto é, uma célula hospedeira transformada compreende, ou é transformada com, ou está geneticamente modificada com, uma sequência de nucleotídeos que não ocorre naturalmente na célula em questão.

[0316] Técnicas para a expressão recombinante de enzimas em uma célula, bem como para as modificações genéticas adicionais de uma célula hospedeira transformada, são bem conhecidas aos versados na técnica. Tipicamente, tais técnicas envolvem a transformação de uma célula com construto de ácido nucleico compreendendo a sequência relevante. Tais métodos são, por exemplo, conhecidos a partir de manuais padrão, tal como Sambrook e Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ou F. Ausubel et al., eds., "Current Protocols in molecular biology", Publicação verde e Wiley Interscience, Nova Iorque (1987). Métodos para a transformação e a modificação genética de células hospedeiras são conhecidos a partir por exemplo, EP-A-0635 574, WO 98/46772, WO 99/60102, WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0.481.008, EP-A- 0.635.574 e US 6.265.186.

[0317] Tipicamente, a construto de ácido nucleico pode ser um plasmídeo, por exemplo, um plasmídeo de cópia baixa ou um plasmídeo de cópia alta. A célula, de acordo com a presente invenção, pode compreender uma única ou múltiplas cópias da sequência de nucleotídeos que codificam uma enzima, por exemplo, por múltiplas cópias de um construto de nucleotídeos ou pelo uso de construto que tem múltiplas cópias da sequência de enzima.

[0318]O construto de ácido nucleico pode ser mantido epissomicamente e, assim, compreender uma sequência de replicação autônoma, tal como uma sequência de replicação autossômica. Um construto de ácido nucleico epissomal adequado pode ser, por exemplo, baseado na levedura 2μ ou plasmídeos PKD1 (Gleer et al., 1991, Biotechnology 9:968-975), ou os plasmídeos AMA (Fierro et al., 1995, Curr Genet 29:482-489). Alternativamente, cada construto de ácido nucleico pode ser integrado em um ou mais cópias no genoma da célula. A integração no genoma da célula pode ocorrer ao acaso por recombinação não homóloga, mas de um modo preferido, o construto de ácido nucleico pode ser integrado no genoma da célula através de recombinação homóloga, como é bem conhecido na técnica (ver por exemplo, WO90/14423, EP-A-0.481.008, EP-A-0635 574 e US 6.265.186).

[0319]A maior parte dos plasmídeos epissomais ou 2μ são relativamente instáveis em levedura, sendo perdido em cerca de 10-2 ou mais células após cada geração. Mesmo sob condições de crescimento seletivo, apenas 60% a 95% das células retêm o plasmídeo epissomal. O número de cópias da maioria dos plasmídeos epissomais varia de 20-100 por célula de hospedeiros cir+. No entanto, os plasmídeos não são distribuídos igualmente entre as células, e existe uma elevada variância do número de cópias por célula em populações. As estirpes transformadas com os plasmídeos integrativos são extremamente estáveis, mesmo na ausência de pressão seletiva. No entanto, a perda de plasmídeo pode ocorrer a frequências de cerca de 10-3 a 10-4 de recombinação homóloga entre o ADN repetido em tandem, levando a perda por saída de alça da sequência de vetor. De um modo preferido, a concepção do vetor no caso de integração estável é, assim, que após a perda dos genes marcadores de seleção (que também ocorre por recombinação intramolecular, homóloga), que a perda por saída de alça do construto integrado não é mais possível. De preferência, os genes são, desta forma, estavelmente integrados. A integração estável é aqui definida como a integração no genoma, em que a saída do construto integrado não é mais possível. De preferência, marcadores de seleção estão ausentes. Tipicamente, a sequência codificadora da enzima vai estar operativamente ligada a uma ou mais sequências de ácidos nucleicos, capazes de proporcionar, ou ajudar, a transcrição e/ou tradução da sequência de enzima.

[0320]O termo "operativamente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar no seu modo pretendido. Por exemplo, um promotor ou potenciador está operativamente ligado a uma sequência de codificação, se o referido promotor ou potenciador afeta a transcrição da sequência de codificação.

[0321] Tal como aqui utilizado, o termo "promotor" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar a transcrição de um ou mais genes, localizado a montante em relação à direção de transcrição do local de iniciação de transcrição do gene, e é estruturalmente identificado pela presença de um local de ligação para a polimerase de ARN dependente de ADN, locais de iniciação de transcrição e outras sequências de ADN são conhecidas a um versado na técnica. Um promotor "constitutivo" é um promotor que é ativo sob a maior parte das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor "induzível" é um promotor que é ativo sob regulamentação ambiental ou de desenvolvimento.

[0322]O promotor que pode ser utilizado para conseguir a expressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma enzima de acordo com a presente invenção, pode ser não nativo para a sequência de nucleotídeos que codifica para a enzima a ser expressa, isto é, um promotor que é heterólogo em relação à sequência de nucleotídeos (sequência de codificação) para o qual ele está operacionalmente ligado. O promotor pode, no entanto, ser homólogo, isto é endógeno, à célula hospedeira.

[0323] Promotores estão amplamente disponíveis e são conhecidas ao versado na técnica. Os exemplos adequados de tais promotores incluem, por exemplo promotores de genes glicolíticos, tal como a fosfofrutoquinase (PFK), triose fosfato isomerase (TPI), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD, TDH3 ou GAPDH), piruvato quinase (PYK), fosfoglicerato-quinase (PGK) promotores de leveduras ou fungos filamentosos; mais detalhes sobre tais promotores de leveduras podem ser encontrados em (WO 93/03159). Outros promotores úteis são os promotores de genes que codificam proteínas ribossomais, o promotor do gene da lactase (LAC4), promotores de álcool desidrogenase (ADH1, ADH4, e semelhantes) e o promotor da enolase (ENO). Outros promotores ambos induzíveis e constitutivos, e potenciadores a montante ou sequências ativadoras, serão conhecidos aos versados na técnica. Os promotores utilizados nas células hospedeiras da invenção podem ser modificados, se desejado, para afetar as suas características de controle. Os promotores adequados neste contexto incluem ambos os promotores constitutivos e induzíveis naturais, bem como promotores de engenharia, os quais são bem conhecidos ao versado na técnica. Os promotores adequados em células hospedeiras eucarióticas podem ser GAL7, GAL10, ou GAL1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO1, TPI1 e AOX1. Outros promotores adequados incluem PDC1, GPD1, PGK1, TEF1 e TDH3.

[0324]Em uma célula hospedeira transformada, o terminal 3' da sequência de ácido nucleotídico que codifica a enzima, de preferência, está operativamente ligado a uma sequência de terminação da transcrição. De preferência, a sequência de terminação é operável em uma célula hospedeira de escolha, tal como por exemplo as espécies de leveduras de escolha. Em qualquer caso, a escolha do terminador não é crítica; ele pode ser, por exemplo, a partir de qualquer gene de levedura, embora terminadores possam, por vezes, funcionar se a partir de um gene eucariótico de não- levedura. Normalmente, uma sequência de nucleotídeos que codifica a enzima compreende um terminador. De preferência, tais terminadores são combinados com as mutações que impedem a decomposição do ARNm mediada por nonsense na célula hospedeira transformada (ver, por exemplo: Shirley et al., 2002, Genetics 161:1465-1482).

[0325]A sequência de terminação da transcrição, de um modo mais preferido, compreende um sinal de poliadenilação.

[0326]Opcionalmente, um marcador selecionável pode estar presente em um construto de ácido nucleico adequado para utilização na invenção. Tal como aqui utilizado, o termo "marcador" refere-se a um gene que codifica para um traço ou um fenótipo, que permite a seleção de, ou o rastreio para, uma célula hospedeira contendo o marcador. O gene marcador pode ser um gene de resistência a antibiótico, em que o antibiótico adequado pode ser utilizado para selecionar para células transformadas de entre as células que não são transformadas. Exemplos de marcadores de resistência a antibióticos adequados incluem por exemplo, di-hidrofolato redutase, higromicina-B- fosfotransferase, 3'-O-fosfotransferase II (resistência a canamicina, neomicina e G418). Marcadores de resistência a antibióticos podem ser mais convenientes para a transformação de células hospedeiras poliploides. Também podem ser utilizados marcadores de resistência a não- antibióticos, tal como marcadores auxotróficos (URA3, TRP1, LEU2) ou o gene TPI de S. pombe (descrito por Russell P.R., 1985, Gene 40:125-130). Em uma forma de realização preferida, as células hospedeiras transformadas com os construtos de ácido nucleico são livres de gene marcadores. Métodos para a construção de células hospedeiras microbianas livres de genes marcadores recombinantes são descritos em EP-A-0 635 574 e são baseados na utilização de marcadores bidirecionais, tal como gene amdS (acetamidase) de A. nidulans ou os genes de levedura URA3 e LYS2. Alternativamente, um marcador detectável, tal como uma Proteína Fluorescente Verde, IacL, luciferase, cloranfenicol-acetiltransferase, beta-glicuronidase, pode ser incorporado nos construtos de ácido nucleico da invenção permitindo o rastreio de células transformadas.

[0327]Outros elementos opcionais que podem estar presentes no construto de ácido nucleico adequados para uso na invenção incluem, mas não estão limitados a, uma ou mais sequências líder, estimuladores, elementos de integração, e/ou genes repórter, sequências de íntron, centrômeros, telômeros e/ou sequências de ligação à matriz (MAR). Os construtos de ácido nucleico da presente invenção podem ainda compreender uma sequência de replicação autônoma, tal como uma sequência ARS.

[0328]O processo de recombinação pode, assim, ser executado com técnicas de recombinação conhecidos. Vários meios são conhecidos aos versados na técnica para a expressão e a sobre-expressão de enzimas em uma célula hospedeira transformada. Em particular, uma enzima pode ser sobre-expressa pelo aumento do número de cópias do gene que codifica para a enzima na célula hospedeira, por exemplo, através da integração de cópias adicionais do gene no genoma da célula hospedeira, através da expressão do gene a partir de um vetor de expressão de múltiplas cópias episômico ou através da introdução de um vetor de expressão episômico que compreende múltiplas cópias do gene.

[0329]Alternativamente, a sobre-expressão de enzimas nas células hospedeiras da invenção pode ser alcançada por meio de um promotor que não é nativo à sequência de codificação para a enzima a ser sobre-expressa, isto é, um promotor que é heterólogo em relação à sequência codificadora à qual está operativamente ligado. Embora, de preferência, o promotor seja heterólogo em relação à sequência codificadora à qual está operativamente ligado, é também preferido que o promotor seja homólogo, isto é endógeno em relação à célula hospedeira. De preferência, o promotor heterólogo é capaz de produzir um nível de estado estacionário mais elevado de transcrição que compreende a sequência de codificação (ou seja capaz de produzir mais moléculas de transcrição, ou seja, moléculas de ARNm, por unidade de tempo) do que é o promotor que é nativo para a sequência de codificação. Os promotores adequados neste contexto incluem ambos os promotores constitutivos e induzíveis naturais, bem como os promotores modificados.

[0330]Em uma forma de realização, a célula hospedeira transformada é livre de marcador, o que significa que nenhum marcador auxotrófico ou dominante, em particular marcadores de resistência a antibióticos, está presente no genoma ou extra-cromossomicamente.

[0331]A sequência de codificação para a sobre-expressão das enzimas acima mencionadas pode ser, de um modo preferido, homóloga à célula hospedeira. No entanto, as sequências de codificação que são heterólogas ao hospedeiro podem ser utilizadas.

[0332]A sobre-expressão de uma enzima, quando se refere à produção da enzima em uma célula geneticamente modificada, significa que a enzima é produzida a um nível mais elevado de atividade enzimática específica, em comparação com a célula hospedeira não modificada, sob condições idênticas. Geralmente, isto significa que a proteína enzimaticamente ativa (ou proteínas no caso de enzimas de múltiplas subunidades) é produzida em maiores quantidades, ou melhor, a um nível de estado estacionário mais elevado em comparação com a célula hospedeira não modificada, sob condições idênticas. Da mesma forma isto significa, normalmente, que a codificação do mRNA para a proteína enzimaticamente ativa é produzida em maiores quantidades, ou, de novo, sim a um nível estável mais elevado, em comparação com a célula hospedeira não modificada sob condições idênticas. De um modo preferido, em um hospedeiro, uma enzima a ser sobre-expressa é sobre- expressa em, pelo menos, um fator de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10 ou cerca de 20, em comparação com uma estirpe que é geneticamente idêntica, exceto para a modificação genética que causa a sobre-expressão. É para ser entendido que estes níveis de sobre-expressão podem aplicar-se ao nível de estado estacionário de atividade da enzima, o nível de estado estacionário da proteína da enzima, bem como com o nível de estado estacionário de transcrição que codifica para a enzima.

Adaptação

[0333]A adaptação é o processo evolutivo pelo qual uma população se torna mais adequada (adaptada) ao seu habitat ou habitats. Esse processo ocorre ao longo de vários para muitas gerações, e é um dos fenômenos básicos da biologia.

[0334]O termo adaptação também pode se referir a uma característica que é especialmente importante para a sobrevivência de um organismo. Essas adaptações são produzidas em uma população variável pelas formas mais adequadas produzindo com mais êxito, por seleção natural.

[0335]Mudanças nas condições ambientais alteram o resultado da seleção natural, afetando os benefícios seletivos de posteriores adaptações que melhoram a aptidão de um organismo sob as novas condições. No caso de uma mudança extrema do ambiente, a aparência e a fixação de adaptações benéficas pode ser essencial para a sobrevivência. Um grande número de diferentes fatores, tal como por exemplo, disponibilidade de nutrientes, temperatura, disponibilidade de oxigênio, etc., pode conduzir a evolução adaptativa. Adequação

[0336]Há uma clara relação entre adaptabilidade (o grau em que um organismo é capaz de viver e reproduzir-se em um determinado conjunto de habitats) e adequação. Adequação é uma estimativa e um preditor da taxa de seleção natural. Mediante a aplicação de seleção natural, as frequências relativas de fenótipos alternativos irá variar com o tempo, se elas são hereditárias.

Alterações genéticas

[0337]Quando a seleção natural atua sobre a variabilidade genética da população, as alterações genéticas são o mecanismo subjacente. Por este meio, a população se adapta geneticamente às suas circunstâncias. As alterações genéticas podem resultar em estruturas visíveis, ou pode ajustar a atividade fisiológica do organismo de uma forma que se adapte ao habitat alterado.

[0338] Pode ocorrer que os habitats mudem com frequência. Portanto, segue-se que o processo de adaptação nunca está finalmente completo. Com o tempo, pode acontecer que o ambiente mude gradualmente, e as espécies venham a ajustar seus arredores melhor e melhor. Por outro lado, pode acontecer que modificações no ambiente ocorram de forma relativamente rápida, e, em seguida, as espécies torna-se menos bem adaptadas. A adaptação é um processo genético, o que acontece durante todo o tempo, em certa medida, também quando a população não muda o habitat ou ambiente.

A evolução adaptativa

[0339]As células hospedeiras transformadas podem, em sua preparação, ser submetidas a evolução adaptativa. Uma célula hospedeira transformada pode ser adaptada para a utilização de açúcar por seleção de mutantes, quer espontânea ou induzida (por exemplo, produtos químicos ou radiação), para o crescimento no açúcar desejado, de preferência, como única fonte de carbono, e mais de preferência em condições anaeróbias. A seleção de mutantes pode ser realizada por meio de técnicas incluindo a transferência de série de culturas como por exemplo, descritos por Kuyper et al., (2004, FEMS Yeast Res. 4:655-664) ou por cultura sob pressão seletiva em uma cultura em quimiostato. Por exemplo, em uma célula hospedeira preferida, pelo menos, uma das modificações genéticas descritas acima, incluindo modificações obtidas por seleção de mutantes, confere à célula hospedeira a capacidade de crescer sobre a xilose como fonte de carbono, preferencialmente como única fonte de carbono, e de preferência em condições anaeróbicas. Quando XI é utilizado como gene para converter xilose, de preferência, a célula produz, essencialmente, nenhum xilitol, por exemplo, o xilitol produzido é abaixo do limite de detecção, ou por exemplo, menos do que cerca de 5, cerca de 2, cerca de 1, cerca de 0,5, ou cerca de 0,3% de carbono consumido em uma base molar.

[0340]Evolução adaptativa também é descrita por exemplo em Wisselink H.W. et al., Applied and Environmental Microbiology, agosto de 2007, páginas 4881-4891

[0341]Em uma forma de realização de evolução adaptativa, o regime consistindo de cultivo de lote repetido com ciclos repetidos de crescimento consecutivos em diferentes meios é aplicado, por exemplo, três meios com diferentes composições (glicose, xilose e arabinose; xilose e arabinose. Veja Wisselink et al., (2009) Applied and Environmental Microbiology, fevereiro de 2009, páginas 907914.

Transformação de levedura e estabilidade genética

[0342]A engenharia genética, isto é, a transformação de células de levedura com ADN recombinante, tornou-se possível pela primeira vez em 1978 [Beggs, 1978; Hinnen et al., 1978]. A tecnologia de DNA recombinante em levedura estabeleceu-se desde então. Uma multidão de diferentes construtos de vetores está disponível. Geralmente, estes vetores de plasmídeo, chamados vetores de transporte, contêm material genético derivado de vetores de E. coli que consistem de uma origem de replicação e um marcador selecionável (frequentemente o gene βlactamase, ampR), que lhes permitir ser propagado em E. coli antes da transformação em células de levedura. Além disso, os vetores de transporte contêm um marcador selecionável para seleção em levedura. Os marcadores podem ser genes que codificam enzimas para a síntese de um determinado aminoácido ou nucleotídeo, de modo que as células que transportam a deleção genômica correspondente (ou mutação) são complementadas por auxotrofia ou autotrofia. Alternativamente, estes vetores contêm marcadores de resistência dominante heterólogos, o que fornece as células de levedura recombinantes (isto é, as células que captaram o ADN e expressam o gene marcador) resistência a certos antibióticos, como G418 (geneticina), higromicina B ou fleomicina. Além disso, estes vetores podem conter uma sequência de locais de restrição (combinado) (local de clonagem múltipla ou MCS), que permitirá a clonagem de ADN estranho nestes locais, embora existam métodos alternativos também.

[0343] Tradicionalmente, os quatro tipos de vetores de transporte podem ser distinguidos pela ausência ou pela presença de elementos genéticos adicionais: • plasmídeos integrativos (YIp) que através de recombinação homóloga são integrados no genoma do hospedeiro no loci do marcador ou outro gene, quando isto é aberto por restrição e o DNA linearizado é utilizado para a transformação das células de levedura. Isto resulta, geralmente, na presença de uma cópia do ADN estranho inserido neste local particular no genoma. • plasmídeos epissômicos (YEp) que transportam parte da sequência de ADN do plasmídeo 2μ necessária para replicação autônoma em células de levedura. As cópias múltiplas do plasmídeo transformado são propagadas na célula de levedura e mantidas como epissomas. • plasmídeos de replicação autônoma (YRp) que carregam uma origem de levedura de replicação (ARS, sequência replicada autonomamente) que permite aos plasmídeos transformados a serem propagados várias centenas de vezes. • plasmídeos CEN (YCp) que transportam, em adição a uma sequência ARS, uma sequência centromérica (derivada a partir de um dos cromossomas nucleares), o que normalmente garante a segregação mitótica estável e, geralmente, reduz o número de cópias do plasmídeo auto-replicado para apenas um.

[0344]Estes plasmídeos estão sendo introduzidos nas células de levedura por transformação. A transformação de células de leveduras pode ser alcançada por diversas técnicas diferentes, como a permeabilização das células com acetato de lítio (Ito et al., 1983) e os métodos de eletroporação.

[0345]Na aplicação comercial de microrganismos recombinantes, instabilidade do plasmídeo é o problema mais importante. A instabilidade é a tendência das células transformadas em perder suas propriedades projetadas por causa de alterações de, ou perda de, plasmídeos. Esta questão é discutida em detalhe por Zhang et al., (Plasmid stability in recombinant Saccharomyces cerevisiae - Estabilidade de plasmídeo em Saccharomyces cerevisiae recombinante). Biotechnology Advances, Vol. 14, No. 4, péginas 401-435, 1996). As estirpes transformadas com os plasmídeos integrativos são extremamente estáveis, mesmo na ausência de pressão seletiva (Sherman, F. http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/levedura/9.htm l e referências aí contidas).

[0346]O ADN heterólogo é, normalmente, introduzido no organismo na forma de plasmídeos extra-cromossômico (YEp, YCp e YRp). Infelizmente, verificou-se com ambas as bactérias e leveduras que as novas características não podem ser retidas, especialmente se a pressão de seleção não é aplicada continuamente. Isto é devido à instabilidade segregacional do plasmídeo híbrido quando células recombinantes crescem durante um longo período de tempo. Isto leva a heterogeneidade da população e variabilidade genética, e, eventualmente, a uma população de células em que a maioria das células perdeu as propriedades que foram introduzidas por transformação. Se vetores com marcadores auxotróficos estão sendo utilizados, cultivo em meios ricos muitas vezes leva a uma perda rápida do vetor, uma vez que o vetor é apenas mantido em meio mínimo. A alternativa, o uso de marcadores de resistência a antibióticos dominantes, muitas vezes não é compatível com os processos de produção. O uso de antibióticos pode não ser desejado a partir de um ponto de vista de registro (a possibilidade de que pequenas quantidades de antibiótico acabam no produto final) ou por razões econômicas (custos do uso de antibióticos em escala industrial).

[0347]A perda de vetores leva a problemas em situações de produção em grande escala. Existem métodos alternativos para a introdução de ADN em leveduras, tal como a utilização de plasmídeos integrantes (YIp). O ADN é integrado no genoma do hospedeiro por recombinação, resultando em alta estabilidade. (Caunt, P. Stability of recombinant plasmids in yeast - Estabilidade dos plasmídeos recombinantes em levedura. Journal of Biotechnology 9(1988) 173-192). Verificou-se que um método de integração utilizando os transpósons hospedeiros são uma boa alternativa. Em uma forma de realização, genes podem ser integrados no genoma da célula hospedeira transformada. A introdução inicial (isto é antes de evolução adaptativa) de múltiplas cópias é executada de qualquer forma conhecida na técnica, que conduz a introdução dos genes. Em uma forma de realização, isto pode ser conseguido utilizando um vetor com partes homólogas de sequências repetidas (transpósons) da célula hospedeira. Quando a célula hospedeira é uma célula de levedura, as sequências repetidas adequadas são as repetições terminais longas (LTR) do elemento Ty, conhecido como sequência delta. Elementos Ty se dividem em duas subfamílias bastante similares chamadas Ty1 e Ty2. Estes elementos são de cerca de 6 quilobases (kb) de comprimento e são delimitados por repetições terminais longas (LTR), sequências de cerca de 335 pares de bases (Boeke J.D. et al., The Saccharomyces cerevisiae Genome Contains Functional and Nonfunctional Copies of Transposon Ty1 - O Genoma de Saccharomyces cerevisiae contém cópias funcionais e não funcionais de Transposon Ty1. Molecular e Cellular Biology, Abril de 1988, páginas 1432-1442 Vol. 8, N°4). Na estirpe de S. cerevisiae completamente sequenciada, S288c, os mais abundantes são os transpósons Ty1 (31 cópias) e Ty2 (13 cópias) (Gabriel A., Dapprich J., Kunkel M., Gresham D., Pratt S.C., et al., (2006) Global mapping of transposon location - Mapeamento global de localização de transpóson. PLoS Genet 2(12): e212.doi:10.1371/journal.pgen.0020212). Estes transpósons consistem em dois quadros de leitura abertos (ORFs) sobrepostos, cada um dos quais codifica várias proteínas. As regiões de codificação são flanqueadas pelos LTRs quase idênticos acima mencionados. Outros elementos de Ty, porém menos abundantes e mais distintos, em S. cerevisiae compreendem Ty3, Ty4 e Ty5. Para cada família de elementos de Ty de comprimento total, há uma ordem de magnitude mais de solo elementos LTR dispersos através do genoma. Estes são pensados surgir por recombinação LTR-LTR de elementos de comprimento total, com saída das regiões de codificação de proteínas internas.

[0348]O mecanismo de retrotransposição do retrotranspóson Ty tem sido explorado para integrar múltiplas cópias por todo o genoma (Boeke et al., 1988; Jacobs et al., 1988). As repetições terminais longas (LTR) do elemento Ty, conhecidas como sequências delta, são também bons alvos para integração através de recombinação homóloga, tal como existem em cerca de 150-200 cópias que são tanto associados a Ty ou locais individuais (Boeke, 1989; Kingsman e Kingsman, 1988). (Parekh R.N. (1996). An Integrating Vector for Tunable, High Copy, Stable Integration into the Dispersed Ty DELTA Sites of Saccharomyces cerevisiae - Um vetor de integração para integração estável, de alta cópia, ajustável nos locais Ty DELTA dispersos de Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Prog., 1996, 12, 16-21). Por evolução adaptativa, o número de cópias pode mudar.

A célula hospedeira

[0349]A célula hospedeira pode ser qualquer célula hospedeira adequada para a produção de um produto útil. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula adequada, tal como uma célula procariótica, tal como uma bactéria ou uma célula eucariótica. Tipicamente, a célula irá ser uma célula eucariótica, por exemplo, uma levedura ou um fungo filamentoso.

[0350]As leveduras são aqui definidas como microrganismos eucarióticos e incluem todas as espécies da subdivisão Eumycotina (Alexopoulos, C.J., 1962, Em: Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque) que crescem predominantemente na forma unicelular.

[0351]As leveduras podem crescer tanto por brotamento de um talo unicelular como podem crescer por fissão do organismo. Um fermento preferido como uma célula hospedeira transformada pode pertencer aos gêneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces ou Yarrowia. De preferência, a levedura é um capaz de fermentação anaeróbica, mais preferencialmente, uma capaz de fermentação alcoólica anaeróbia.

[0352]Os fungos filamentosos são aqui definidos como microrganismos eucarióticos que incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina. Estes fungos são caracterizados por um micélio vegetativo constituído por quitina, celulose e outros polissacarídeos complexos.

[0353]Os fungos filamentosos adequados para utilização como uma célula da presente invenção são morfologicamente, fisiologicamente e a partir de leveduras geneticamente distinta. Células de fungos filamentosos podem ser vantajosamente utilizadas uma vez que a maioria dos fungos não requer condições estéreis para propagação e são insensíveis às infecções de bacteriófagos. O crescimento vegetativo por fungos filamentosos é pelo alongamento das hifas e catabolismo de carbono da maioria dos fungos filamentosos é, obrigatoriamente, aeróbio. Fungos filamentosos preferidos como uma célula hospedeira podem pertencer ao gênero Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremoniurra, Fusarium ou Penicillium. Mais preferencialmente, a célula de fungo filamentoso pode ser uma célula de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, uma de Penicillium chrysogenum ou Rhizopus oryzae.

[0354]Em uma forma de realização, a célula hospedeira pode ser levedura.

[0355] De preferência, o hospedeiro é um hospedeiro industrial, mais preferencialmente uma levedura industrial. Um hospedeiro industrial e célula de levedura industrial pode ser definido como se segue. Os ambientes de vida das células de levedura em processos industriais são, significativamente, diferentes das que no laboratório. Células de levedura industrial devem ser capazes de funcionar bem sob várias condições ambientais que podem variar durante o processo. Tais variações incluem as alterações em fontes de nutrientes, pH, concentração de etanol, temperatura, concentração de oxigênio, etc., que em conjunto têm potencial impacto sobre o crescimento celular e produção de etanol de Saccharomyces cerevisiae. Em condições industriais adversas, as estirpes de tolerância ambiental devem permitir um crescimento e produção robustos. Estirpes de leveduras industriais são, geralmente, mais robustas em relação a estas mudanças nas condições ambientais que podem ocorrer nas aplicações que são utilizadas, tal como na indústria de panificação, indústria de fabricação de cerveja, vinificação e indústria do etanol. Exemplos de levedura industrial (S. cerevisiae) são Etanol RED® (Fermentis), Fermiol® (DSM) e Thermosacc® (Lallemand).

[0356]Em uma forma de realização, o hospedeiro é tolerante a inibidor. As células hospedeiras tolerantes a inibidor podem ser selecionadas pelo rastreio de estirpes quanto ao crescimento em inibidores que contenham materiais, como ilustrado na Kadar et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847-858, em que uma estirpe de S. cerevisiae tolerante a inibidor ATCC 26602 foi selecionada.

Genes araA, araB e araD

[0357]Uma célula hospedeira transformada é capaz de utilizar arabinose. Uma célula hospedeira transformada é, por conseguinte, capazes de converter a L-arabinose em L- ribulose e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado, por exemplo um daqueles aqui mencionados.

[0358]Os organismos, por exemplo, estirpes de S. cerevisiae, capazes de produzir etanol a partir de L- arabinose podem ser produzidos por modificação de uma célula introduzindo os genes araA (L-arabinose isomerase), araB (L-ribulocinase) e araD (L-ribulose-5-P4-epimerase) de uma fonte adequada. Tais genes podem ser introduzidos em uma célula hospedeira transformada de forma que ele é capaz de utilizar a arabinose. Tal abordagem dada é descrita na WO2003/095627. Os genes araA, araB e araD a partir de Lactobacillus plantarum podem ser utilizados e são divulgados em WO2008/041840. O gene araA de Bacillus subtilis e os genes araB e araD a partir de Escherichia coli podem ser utilizados e são divulgados na EP1499708. Em uma outra forma de realização, os genes araA, araB e araD podem ser derivados de, pelo menos, um do gênero Clavibacter, Arthrobacter e/ou Gramella, em particular um de Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens e/ou Gramella forsetii, conforme divulgado na WO 2009011591. Genes PPP

[0359]Uma célula hospedeira transformada pode compreender uma ou mais modificações genéticas que aumenta o fluxo da via da pentose-fosfato. Em particular, a (s) modificação (ões) genética (s) pode (m) levar a um aumento do fluxo através da parte não-oxidativa da via da pentose- fosfato. Uma modificação genética que causa um aumento do fluxo da parte não oxidativa da via das pentoses-fosfato é aqui entendida significar uma modificação que aumenta o fluxo de, pelo menos, um fator de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10 ou cerca de 20, em comparação com o fluxo de uma estirpe que é geneticamente idêntica, exceto para a modificação genética que causa o aumento do fluxo. O fluxo da parte não- oxidativa da via das pentoses-fosfato pode ser medido através do crescimento do hospedeiro modificado em xilose como única fonte de carbono, que determina a taxa de consumo de xilose específica e subtraindo a taxa de produção de xilitol específica a partir da taxa específica do consumo de xilose, se xilitol for produzido. No entanto, o fluxo da parte não-oxidativa da via das pentoses-fosfato é proporcional à taxa de crescimento em xilose como única fonte de carbono, de preferência com a taxa de crescimento anaeróbio em xilose como única fonte de carbono. Existe uma relação linear entre a taxa de crescimento em xilose como única fonte de carbono (μmax) e o fluxo da parte não- oxidativa da via da pentose-fosfato. A taxa de consumo específica de xilose (Qs) é igual à taxa de crescimento (μ), dividido pelo rendimento da biomassa em açúcar (YXS), porque o rendimento de biomassa em açúcar é constante (sob um dado conjunto de condições: anaeróbio, meio de crescimento, pH, base genética da estirpe, etc., isto é; Qs = μ/YXS). Por conseguinte, o aumento do fluxo da parte não- oxidativa da via das pentoses-fosfato pode ser deduzido a partir do aumento na taxa de crescimento máxima sob estas condições, exceto transporte (captação é limitante).

[0360]Um ou mais modificações genéticas que aumentam o fluxo da via das pentoses-fosfato podem ser introduzidas na célula hospedeira de várias formas. Estes incluem, por exemplo, alcançar maiores níveis estáveis de xilulose quinase e/ou uma ou mais das enzimas da parte não-oxidativa da via das pentoses-fosfato e/ou um nível de estado estacionário reduzido de atividade de aldose-redutase inespecífica. Estas alterações nos níveis de atividade de estado estacionário podem ser realizadas por seleção de mutantes (espontânea ou induzida por produtos químicos ou radiação) e/ou por tecnologia de ADN recombinante, por exemplo, por sobre-expressão ou inativação, respectivamente, dos genes que codificam as enzimas ou fatores que regulam estes genes.

[0361]Em uma célula hospedeira preferida, a modificação genética compreende a sobre-expressão de pelo menos uma enzima da (parte não-oxidativa) via da pentose-fosfato. De preferência, a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em enzimas que codificam para a ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transaldolase e transcetolase. Várias combinações de enzimas da (parte não- oxidativa) via das pentoses-fosfato podem ser sobre- expressas. Por exemplo, as enzimas que são sobre-expressas podem ser, pelo menos, as enzimas de ribulose-5-fosfato- isomerase e ribulose-5-fosfato epimerase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e transcetolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e transaldolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5- fosfato epimerase e transcetolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase e transaldolase; ou, pelo menos, as enzimas transcetolase e transaldolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase, transaldolase e transcetolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, transaldolase e transcetolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5- fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase e transaldolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5- fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase e transcetolase. Em uma forma de realização da invenção, cada uma das enzimas de ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose- 5-fosfato epimerase, transaldolase e transcetolase são sobre-expressas na célula hospedeira. Mais preferida é uma célula hospedeira em que a modificação genética compreende, pelo menos, a sobre-expressão de ambas as enzimas transcetolase e transaldolase, de tal forma que a célula hospedeira já seja capaz de um crescimento anaeróbio em xilose. Na verdade, em algumas condições, células hospedeiras sobre-expressando apenas a transketolase e transaldolase já têm a mesma taxa de crescimento anaeróbio em xilose como as células hospedeiras que sobre-expressam todas as quatro enzimas, isto é, a ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transaldolase e transcetolase. Além disso, as células hospedeiras que sobre-expressam ambas os enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e e ribulose-5-fosfato epimerase são preferidas em relação às células hospedeiras que sobre-expressam apenas a isomerase ou apenas a epimerase uma vez que a sobre-expressão de apenas uma destas enzimas pode produzir desequilíbrios metabólicos.

[0362]A enzima "ribulose-5-fosfato epimerase" (CE 5.1.3.1) é aqui definida como uma enzima que catalisa a epimerização de D-xilulose 5-fosfato em na D-ribulose 5- fosfato e vice-versa. A enzima também é conhecida como fosforibulose epimerase; eritrose-4-fosfato isomerase; fosfocetopentose 3-epimerase; xilulose fosfato 3-epimerase; fosfocetopentose epimerase; ribulose 5-fosfato 3-epimerase; D-ribulose fosfato-3-epimerase; D-ribulose-5-fosfato epimerase; D-ribulose-5-P 3-epimerase; D-xilulose-5-fosfato 3-epimerase; pentose-5-fosfato 3-epimerase; ou D-ribulose- 5-fosfato 3-epimerase. A ribulose-5-fosfato epimerase pode ser ainda definida pela sua sequência de aminoácidos. Da mesma forma uma ribulose-5-fosfato epimerase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeos que codifica a enzima, bem como por uma sequência de nucleotídeos que hibrida com uma sequência de nucleotídeos de referência que codifica uma ribulose-5-fosfato epimerase. A sequência nucleotídica que codifica para a ribulose-5-fosfato epimerase é aqui designada RPE1.

[0363]A enzima "ribulose-5-fosfato isomerase" (CE 5.3.1.6) é aqui definida como uma enzima que catalisa a isomerização direta de D-ribose 5-fosfato em D-ribulose-5- fosfato e vice-versa. A enzima também é conhecida como fosfopentosisomerase; fosforiboisomerase; ribose fosfato isomerase; 5-fosforibose isomerase; D-ribose-5-fosfato isomerase; D-ribose-5-fosfato ketol-isomerase; ou D-ribose- 5-fosfato aldose-cetose-isomerase. A ribulose-5-fosfato isomerase pode ser ainda definida pela sua sequência de aminoácidos. Da mesma forma uma ribulose-5-fosfato isomerase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeos que codifica a enzima, bem como por uma sequência de nucleotídeos que hibrida com uma sequência de nucleotídeos de referência que codifica um ribulose-5- fosfato isomerase. A sequência nucleotídica que codifica para a ribulose-5-fosfato isomerase é aqui designada RKI1.

[0364]A enzima "transcetolase" (CE 2.2.1.1) é aqui definida como uma enzima que catalisa a reação: D-ribose 5- fosfato + D-xilulose 5-fosfato <-> sedoeptulose 7-fosfato + D-gliceraldeído-3-fosfato e vice versa. A enzima também é conhecida como glicolaldeídotransferase ou sedoeptulose-7- fosfato:gliceralaldeído-3-fosfato glicolaldeídotransferase. Uma transcetolase pode ser ainda definida pelo seu aminoácido. Da mesma forma, uma transcetolase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeos que codifica a enzima, bem como por uma sequência de nucleotídeos que hibrida com uma sequência de nucleotídeos de referência que codifica uma transcetolase. A sequência de nucleotídeos que codifica para transcetolase é aqui designada TKL1.

[0365]A enzima "transaldolase" (CE 2.2.1.2) é aqui definida como uma enzima que catalisa a reação: sedoeptulose 7-fosfato + D-gliceraldeído-3-fosfato <-> D- eritrose 4-fosfato + D-frutose 6-fosfato e vice-versa. A enzima também é conhecida como dihidroxiacetonatransferase; di-hidroxiacetona-sintase; formaldeído transcetolase; ou sedoeptulose-7-fosfato:D-gliceraldeído-3-fosfato glicerone- transferase. Um transaldolase pode ser ainda definida pela sua sequência de aminoácidos. Da mesma forma um transaldolase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeos que codifica a enzima, bem como por uma sequência de nucleotídeos que hibrida com uma sequência de nucleotídeos de referência que codifica um transaldolase. A sequência de nucleotídeos que codifica para transcetolase de é aqui designada por TAL1.

Genes de xilose isomerase ou xilose redutase

[0366] De acordo com a invenção, uma ou mais cópias de um ou mais genes de xilose isomerase e/ou um ou mais xilose redutase e xilitol desidrogenase são introduzidos no genoma da célula hospedeira. A presença destes elementos genéticos confere à célula a capacidade de converter xilose por isomerização ou redução.

[0367]Em uma forma de realização, a um ou mais cópias de um ou mais genes de xilose isomerase são introduzidos no genoma da célula hospedeira.

[0368]Uma "xilose isomerase" (CE 5.3.1 0,5) é aqui definida como uma enzima que catalisa a isomerização direta de D-xilose em D-xilulose e/ou vice-versa. A enzima também é conhecida como um D-xilose cetoisomerase. A xilose isomerase aqui pode também ser capaz de catalisar a conversão entre a D-glicose e D-frutose (e, consequentemente, pode, portanto, ser referida como uma isomerase de glicose). A xilose isomerase aqui pode exigir um cátion bivalente, tal como magnésio, manganês ou cobalto, como um cofator.

[0369] Por conseguinte, uma tal célula hospedeira transformada é capaz de isomerização de xilose em xilulose. A capacidade de isomerização de xilose em xilulose é conferida à célula hospedeira por transformação da célula hospedeira com um construto de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma xilose isomerase definida. Uma célula hospedeira transformada isomeriza xilose em xilulose pela isomerização direta de xilose em xilulose.

[0370]Uma unidade (U) de atividade de xilose isomerase pode ser aqui definida como a quantidade de enzima que produz 1 nmol de xilulose por minuto, sob condições tal como descrito por KUYPER et al., (2003, FEMS Yeast Res. 4:69-78).

[0371]O gene que isomeriza xilose pode ter várias origens, tal como, por exemplo Piromyces sp. tal como descrito em WO2006/009434. Outras origens adequadas são Bacteroides, em particular Bacteroides uniformis como descrito na PCT/EP2009/52623, Bacillus, em particular Bacillus stearothermophilus, conforme descrito na PCT/EP2009/052625.

[0372]Em outra forma de realização, uma ou mais cópias de um ou mais genes de xilose redutase e xilitol desidrogenase são introduzidos no genoma da célula hospedeira. Nesta forma de realização, a conversão de xilose é conduzida em uma conversão de dois passos de xilose em xilulose por meio de um intermediário, como xilitol, catalisada por xilose redutase e xilitol desidrogenase, respectivamente. Em uma forma de realização, a mesma xilose redutase (XR), xilitol desidrogenase (XDH) e xylokinase (XK) pode ser sobre-expressa e, opcionalmente, um ou mais dos genes que codificam enzimas de produção de NADPH são regulados positivamente e um ou mais dos genes que codificam enzimas de consumo de NADH são regulados positivamente, tal como divulgado na WO 2004085627.

Gene XKS1

[0373]Uma célula hospedeira transformada pode compreender uma ou mais modificações genéticas que aumentam a atividade de xilulose quinase específica. De preferência, a modificação, ou modificações, genética faz com que a sobre-expressão de uma xilulose quinase, por exemplo, por sobre-expressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma xilulose quinase. O gene que codifica a xilulose quinase pode ser endógeno à célula hospedeira ou pode ser uma xilulose quinase que é heteróloga em relação à célula hospedeira. Uma sequência de nucleotídeos utilizadas para a sobre-expressão da xilulose quinase na célula hospedeira é uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade de xilulose quinase.

[0374]A enzima "xilulose quinase" (CE 2.7.1.17) é aqui definida como uma enzima que catalisa a reação de ATP + D- xilulose = ADP + D-xilulose 5-fosfato. A enzima também é conhecida como um xiluloquinase de fosforilação, D- xiluloquinase ou ATP:D-xilulose 5-fosfotransferase. A xilulose quinase da invenção pode ser ainda definida pela sua sequência de aminoácidos. Da mesma forma uma xilulose quinase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeos que codifica a enzima, bem como por uma sequência de nucleotídeos que hibrida com uma sequência de nucleotídeos de referência que codifica uma xilulose quinase.

[0375]Em uma célula hospedeira transformada, uma modificação, ou modificações, genética que aumenta (m) a atividade específica de xilulose quinase pode ser combinada com qualquer uma das modificações que aumentam o fluxo da via das pentoses-fosfato, tal como descrito acima. Esta não é, contudo, essencial.

[0376]Assim, uma célula hospedeira pode compreender apenas uma modificação genética ou modificações que aumentam a atividade de xilulose quinase específica. Os vários meios disponíveis na arte para alcançar e analisar a sobre-expressão de uma xilulose quinase nas células hospedeiras da invenção são os mesmos que os descritos acima para as enzimas da via da pentose-fosfato. De preferência, nas células hospedeiras da invenção, uma xilulose quinase a ser sobre-expressa é sobre-expressa em, pelo menos, um fator de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10 ou cerca de 20, em comparação com uma estirpe que é geneticamente idêntica, exceto para a (s) modificação (ões) genética (s), provocando a sobre-expressão. É para ser entendido que estes níveis de sobre-expressão podem ser aplicados ao nível de estado estacionário de atividade da enzima, nível de estado estacionário da proteína da enzima, bem como com o nível de estado estacionário de transcrição que codifica para a enzima.

Deleção do gene de aldose-redutase (GRE3)

[0377]Na forma de realização, em que XI é utilizado como gene para converter xilose, pode ser vantajoso reduzir a atividade da aldose-redutase. Uma célula hospedeira transformada pode, portanto, compreender um ou mais modificações genéticas que reduzem a atividade da aldose- redutase inespecífica na célula hospedeira. De um modo preferido, a atividade da aldose-redutase não específica é reduzida na célula hospedeira através de uma ou mais modificações genéticas que reduzem a expressão de, ou inativa um gene que codifica, uma aldoses-redutase inespecífica. De preferência, a modificação genética (s) reduz ou inativa a expressão de cada cópia de um gene endógeno que codifica uma aldoses-redutase inespecífica na célula hospedeira (aqui chamado de deleção GRE3). As células hospedeiras transformadas podem compreender múltiplas cópias de genes que codificam a aldoses-redutase inespecífica como resultado de di-, poli- ou aneuploidia, e/ou a célula hospedeira pode conter vários (iso)enzimas diferentes com atividade de aldose-redutase que diferem na sequência de aminoácido e que são cada uma delas codificadas por um gene diferente. Além disso, nestes casos, de preferência, a expressão de cada gene que codifica uma aldose-redutase não específica é reduzida ou inativada. De um modo preferido, o gene é inativado por deleção de, pelo menos, uma parte do gene ou por ruptura do gene, por meio de que, neste contexto, o termo gene inclui também qualquer sequência não codificante a montante ou a jusante da sequência de codificação, deleção ou inativação (parcial) o que resulta em uma redução da expressão da atividade da aldose-redutase inespecífica na célula hospedeira.

[0378]Uma sequência de nucleotídeos que codifica uma atividade da aldose-redutase, cuja é para ser reduzida na célula hospedeira, é uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade de aldose-redutase.

[0379]Assim, uma célula hospedeira que compreende apenas uma modificação genética ou modificações que reduzem a (s) atividade (s) da aldose-redutase inespecífica na célula hospedeira está especificamente incluída na invenção.

[0380]A enzima "aldose-redutase" (CE 1.1.1.21) é aqui definida como qualquer enzima que seja capaz de reduzir a xilose a xilitol ou xilulose. No contexto da presente invenção, uma aldose-redutase pode ser qualquer aldose- redutase inespecífica que é nativa (endógena) a uma célula hospedeira da invenção e que é capaz de reduzir a xilose a xilitol ou xilulose. Aldoses-redutases inespecíficas catalisam a reação: aldose + NAD(P H + H+ θ alditol + NAD(P)+

[0381]A enzima tem uma especificidade ampla e é também conhecida como aldose-redutase; poliol desidrogenase (NADP+); alditol:NADP oxidoredutase; alditol:NADP+ 1- oxidoreductase; NADPH-aldopentose redutase; ou NADPH aldose-redutase.

[0382]Um exemplo particular de uma aldose-redutase tal inespecífica que é endógena a S. cerevisiae e que é codificada pelo gene GRE3 (Traff et al., 2001, Appl Environ Microbiol 67:5668-74). Assim, uma aldoses-redutase da invenção pode ser ainda definida pela sua sequência de aminoácidos. Da mesma forma uma aldose-redutase pode ser definida pelas sequências de nucleotídeos que codificam a enzima, bem como por uma sequência de nucleotídeos que hibrida com uma sequência de nucleotídeos de referência que codifica uma aldose-redutase.

Produção de bioprodutos

[0383]Ao longo dos anos foram feitas sugestões para a introdução de vários organismos para a produção do bioetanol a partir de açúcares de culturas. Na prática, no entanto, todos os principais processos de produção de bioetanol continuaram a utilizar as leveduras do gênero Saccharomyces como produtor de etanol. Isto é, devido às muitas características atraentes de espécies de Saccharomyces para processos industriais, ou seja, uma alta tolerânica ácida, a etanol e osmótica, capacidade de crescimento anaeróbio, e, claro, a sua elevada capacidade fermentativa alcoólica. Espécies de levedura preferidas como células hospedeiras incluem S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus ou K. fragilis.

[0384]Uma célula hospedeira transformada poderá ser uma célula adequada para a produção de etanol. Uma célula hospedeira transformada pode, no entanto, ser apropriada para a produção de outros produtos de fermentação de etanol.

[0385] Tais produtos de fermentação não etanólicos incluem, em princípio, qualquer volume ou química fina que pode ser produzida por um microrganismo eucariota, tal como uma levedura ou um fungo filamentoso.

[0386]Uma célula hospedeira transformada, que pode ser utilizada para a produção de produtos de fermentação não etanólicos, é uma célula hospedeira que contenha uma modificação genética que resulta na diminuição da atividade de álcool desidrogenase.

[0387]Em uma forma de realização a célula hospedeira transformada pode ser utilizada em um processo em que os açúcares provenientes de lignocelulose são convertidos em etanol.

Lignocelulose

[0388]A lignocelulose, que pode ser considerada como uma matéria-prima renovável potencial, compreende, geralmente, os polissacarídeos celulose (glicanos) e hemicelulose (xilanos, heteroxilanos e xiloglicanos). Além disso, algumas hemiceluloses podem estar presentes como glicomananas, por exemplo, matérias-primas derivadas da madeira. A hidrólise enzimática destes polissacarídeos em açúcares solúveis, incluindo ambos os monômeros e multímeros, por exemplo glicose, celobiose, xilose, arabinose, galactose, frutose, manose, ramnose, ribose, ácido galacturônico, ácido glucorônico e outras hexoses e pentoses, ocorre sob a ação de diferentes enzimas atuando em conjunto.

[0389]Além disso, pectinas e outras substâncias pécticas, tal como arabinanos, pode compor consideravelmente a proporção de massa seca de paredes celulares tipicamente a partir de tecidos de plantas não- lenhosas (cerca de um quarto até a metade da massa seca podem ser pectinas). Pré-tratamento

[0390]Antes do tratamento enzimático, o material lignocelulósico pode ser pré-tratado. O pré-tratamento pode compreender a exposição do material lignocelulósico com um ácido, uma base, um solvente, calor, um peróxido, ozônio, trituração mecânica, esmerilhamento, moagem ou despressurização rápida, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais destes. Este pré-tratamento químico é, frequentemente, combinado com pré-tratamento térmico, por exemplo, entre 150-220°C durante 1 a 30 minutos. A hidrólise enzimática

[0391]O material pré-tratado é, normalmente, submetido a hidrólise enzimática para liberar açúcares que podem ser fermentados de acordo com a invenção. Isto pode ser executado com métodos convencionais, por exemplo, contatando com celulases, por exemplo celobiohidrolase (s), endoglicanase (s), beta-glucosidase (s) e, opcionalmente, outras enzimas. A conversão com as celulases pode ser executada à temperatura ambiente ou por temperaturas mais elevados, em um tempo de reação suficientes para liberar quantidades de açúcar (es). O resultado da hidrólise enzimática é o produto de hidrólise compreendendo açúcares C5/C6, aqui designados como a composição de açúcar. Fermentação

[0392]O processo de fermentação pode ser um processo de fermentação anaeróbica ou aeróbico. Um processo de fermentação anaeróbica é aqui definido como uma execução de processo de fermentação na ausência de oxigênio ou em que, substancialmente, nenhum oxigênio é consumido, de preferência menos do que cerca de 5, cerca de 2,5 ou cerca de 1 mmol/L/h, mais preferencialmente, 0 mmol/L/h é consumido (isto é, consumo de oxigênio não é detectável), e em que as moléculas orgânicas servem como doadores de elétrons e aceitadores de elétrons. Na ausência de oxigênio, o NADH produzido na formação de glicólise e biomassa não pode ser oxidado por fosforilação oxidativa. Para resolver este problema muitos microrganismos usam piruvato, ou um de seus derivados, como um aceptor de elétron e hidrogênio regenerando assim NAD+.

[0393]Assim, em um processo de fermentação anaeróbia preferido, piruvato é utilizado como um elétron (e aceitador de hidrogênio) e é reduzido a produtos de fermentação, tal como etanol, butanol, ácido láctico, di- terpeno, di-terpeno glicosilado, ácido 3-hidroxi- propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico β- lactama e uma cefalosporina.

[0394]O processo de fermentação é, de preferência, realizado a uma temperatura que é ótima para a célula. Assim, para a maioria das leveduras ou células hospedeiras de fungos, o processo de fermentação é realizado a uma temperatura que é inferior a cerca de 42°C, de preferência inferior a cerca de 38°C. Para levedura ou células hospedeiras de fungos filamentosos, o processo de fermentação é, preferivelmente, realizado a uma temperatura que é inferior a cerca de 35, cerca de 33, cerca de 30 ou cerca de 28°C e a uma temperatura que é mais elevada do que cerca de 20, cerca de 22, ou cerca de 25°C.

[0395]O rendimento de etanol em xilose e/ou glicose no processo é, de preferência, pelo menos, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 95 ou cerca de 98%. O rendimento de etanol é aqui definido como uma percentagem do rendimento máximo teórico.

[0396]A invenção também se refere a um processo para a produção de um produto de fermentação.

[0397]O processo de fermentação, de acordo com a presente invenção, pode ser executado sob condições aeróbicas e anaeróbicas. Em uma forma de realização, o processo é realizado sob condições micro-aerofílicas ou oxigênio limitado.

[0398]Um processo de fermentação anaeróbia é aqui definido como uma execução de processo de fermentação na ausência de oxigênio ou em que, substancialmente, nenhum oxigênio é consumido, de preferência menos do que cerca de 5, cerca de 2,5 ou cerca de 1 mmol/L/h, e em que moléculas orgânicas servem como ambos doadores de elétrons e aceptores de elétrons.

[0399]Um processo de fermentação de oxigênio limitado é um processo em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo gasoso contínuo, bem como as propriedades de transferência de mistura/massa real do equipamento de fermentação utilizado. De um modo preferido, em um processo sob condições limitadas de oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é de, pelo menos, cerca de 5,5, mais preferivelmente pelo menos cerca de 6, tal como pelo menos 7 mmol/L/h. Um processo da invenção pode compreender a recuperação do produto de fermentação.

[0400]Em um processo preferido, a célula fermenta ambas xilose e glicose, de preferência simultaneamente, caso em que, de preferência, uma célula é utilizada que é insensível à repressão de glicose para prevenir o crescimento diáuxico. Além de uma fonte de xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação irá ainda compreender o ingrediente apropriado necessário para o crescimento da célula. As composições de meios de fermentação para crescimento de microrganismos, tal como leveduras, são bem conhecidas na arte

[0401]Os processos de fermentação podem ser realizados em modo contínuo, em lotes ou semi-contínuo. Um processo de hidrólise de fermentação (SSF) separado ou um processo de sacarificação e fermentação (SHF) simultâneo pode também ser aplicado. Uma combinação destes modos de processo de fermentação pode também ser possível para uma produtividade ótima. Estes processos são descritos a seguir em mais detalhe.

Modo SSF

[0402] Por modo de sacarificação e fermentação simultânea (SSF), o tempo de reação para o passo de liquefação/hidrólise ou pré-sacarificação é dependente do tempo para realizar o rendimento desejado, isto é, rendimento de conversão de celulose em glicose. Tal rendimento é, de preferência, tão alta quanto possível, de preferência 60% ou mais, 65% ou mais, 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 96 % ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais, 99,5% ou mesmo mais ou 99,9% ou mais.

[0403] De acordo com a invenção, concentrações muito elevadas de açúcar no modo SHF e concentrações muito altas de produtos (por exemplo etanol) no modo SSF são realizados. Em operação SHF, a concentração de glicose é de 25 g/L ou mais, 30 g/L ou mais, 35 g/L ou mais, 40 g/L ou mais, 45 g/L ou mais, 50 g/L ou mais, 55 g/L ou mais, 60 g/L ou mais, 65 g/L ou mais, 70 g/L ou mais, 75 g/L ou mais, 80 g/L ou mais, 85 g/L ou mais, 90 g/L ou mais, 95 g/L ou mais, 100 g/L ou mais, 110 g/L ou mais, 120 g/L ou mais, ou pode por exemplo ser de 25 g/L - 250 g/L, 30 g/L - 200 g/L, 40g/L - 200 g/L, 50g/L - 200 g/L, 60g/L - 200 g/L, 70g/L - 200 g/L, 80g/L - 200 g/L, 90 g/L, 80 g/L - 200g/L. Concentração do produto no modo SSF

[0404]Na operação de SSF, a concentração do produto (g/L) é dependente da quantidade de glicose produzida, mas isto não é visível uma vez que os açúcares são convertidos em produto em SSF, e concentrações de produto pode ser relacionada com a concentração de glicose subjacente através da multiplicação com o rendimento máximo teórico (Yps max em grama de produto por grama de glicose).

[0405]O rendimento teórico máximo (Yps max em gramas de produto por grama de glicose) de um produto de fermentação pode ser derivado a partir de livro de bioquímica. Para o etanol, 1 mol de glicose (180 g) rende, de acordo com a via de fermentação de glicólise normal em levedura, 2 mols de etanol (= 2 x 46 = 92 g de etanol. O rendimento máximo teórico de etanol sobre a glicose é portanto 92/180 = 0,511 g de etanol/g de glicose.

[0406] Para Butanol, (PM 74 g/mol) ou isso-butanol, o rendimento teórico máximo é de 1 mol de butanol por mole de glicose. Assim, Ypsmax para (iso)butanol = 74/180 = 0,411 g de (iso) butanol /g de glicose.

[0407] Para o ácido láctico, o rendimento de fermentação para a fermentação homoláctica é de 2 mols de ácido láctico (peso molecular = 90 g/mol) por mol de glicose. De acordo com esta estequiometria, o Yps max = 1 g de ácido láctico/g de glicose.

[0408] Para outros produtos de fermentação, um cálculo similar pode ser feito.

Modo SSF

[0409]Em operação SSF, a concentração do produto é de 25 g * Yps g/L/L ou mais, 30 * Yps g/L ou mais, 35 g * Yps/L ou mais, 40 * Yps g/L ou mais, 45 * Yps g/L ou mais, 50 * Yps g/L ou mais, 55 * Yps g/L ou mais, 60 * Yps g/L ou mais, 65 * Yps g/L ou mais, 70 * Yps g/L ou mais, 75 * Yps g/L ou mais, 80 * Yps g/L ou mais, 85 * Yps g/L ou mais, 90 * Yps g/L ou mais, 95 * Yps g/L ou mais, 100 * Yps g/L ou mais, 110 * Yps g/L ou mais, 120 g/L * Yps ou mais, ou pode, por exemplo, ser de 25 * Yps g/L - 250 * Yps g/L, 30 * Yps g/L - 200 * Yps g/L, 40 * Yps g/L - 200 * Yps g/L, 50 * Yps g/L - 200 * Yps g/L, 60 * Yps g/L - 200 * Yps g/L, 70 * Yps g/L - 200 * Yps g/L, 80 * Yps g/L - 200 * Yps g/L, 90 * Yps g/L, 80 * Yps g/L - 200 * Yps g/L.

[0410] Por conseguinte, a invenção proporciona um método para a preparação de um produto de fermentação, método esse que compreende: a. degradar lignocelulose utilizando um método tal como aqui descrito; e b. fermentar o material resultante, assim, para preparar um produto de fermentação. Produto de fermentação

[0411]O produto de fermentação da presente invenção pode ser qualquer produto útil. Em uma forma de realização, é um produto selecionado a partir do grupo que consiste em etanol, n-butanol, isobutanol, ácido láctico, di-terpeno, di-terpeno glicosilado, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacônico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido adípico, um aminoácido, tal como lisina, metionina, triptofano, treonina e ácido aspártico, 1,3- propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactama e uma cefalosporina, vitaminas, produtos farmacêuticos, suplementos para alimentação animal, especialidades químicas, matérias-primas químicas, plásticos, solventes, combustíveis, incluindo biocombustíveis e biogás ou polímeros orgânicos, e uma enzima industrial, tal como uma protease, uma celulase, uma amilase, uma glicanase, uma lactase, uma lipase, uma liase, uma oxidorredutases, uma transferase ou uma xilanase. Por exemplo, os produtos de fermentação podem ser produzidos por células de acordo com a invenção, seguindo os métodos e processos de fermentação de preparação de células da técnica anterior, que exemplos no entanto, não devem ser aqui interpretados como limitativos, n-butanol, pode ser produzido por células, tal como descrito em WO2008121701 ou WO2008086124; ácido láctico, tal como descrito em US2010137551 ou US201 1.053.231; ácido 3-hidroxi-propiônico tal como descrito em WO2010010291; ácido acrílico, tal como descrito em WO2009153047.

Recuperação do produto de fermentação

[0412] Para a recuperação do produto de fermentação tecnologias existentes são utilizadas. Para diferentes produtos de fermentação diferentes processos de recuperação são adequados. Os métodos existentes de recuperação do etanol a partir de misturas aquosas, geralmente, utilizam técnicas de fracionamento e de adsorção. Por exemplo, uma cerveja pode ainda ser utilizada para processar um produto fermentado que contém etanol em uma mistura aquosa, para produzir uma mistura contendo etanol enriquecido que é então submetida a fracionamento (por exemplo, destilação fracionada ou outras técnicas semelhantes). Em seguida, as frações que contêm as concentrações mais elevadas de etanol podem ser passadas através de um adsorvente para remover a maior parte, se não a totalidade, da água residual a partir do etanol.

[0413]Os exemplos seguintes ilustram a invenção: EXEMPLOS

Métodos

[0414]Técnicas e química de biologia molecular. As enzimas de restrição e ligase de DNA de T4 foram adquiridas a partir de Fermentas. Antibióticos higromicina (HG), fleomicina (phleo) e geneticina (G418) foram adquiridos da Invivogen. pYL16 e nourseothricin (Nour) foram adquiridos da Werner Bioagentes. Ampicilina e canamicina foram adquiridos da Sigma-Aldrich.

[0415] Para as amplificações de PCR, Polimerase de ADN de Alta Fidelidade Phusion® foi utilizada (Finnzymes). Os fragmentos de PCR foram sub-clonados utilizando o Kit TA TOPO® Cloning® ou o kit de clonagem de PCR Zero Blunt® TOPO® (ambos a partir de Life Technologies). Os oligonucleotídeos utilizados para a construção de estirpe foram adquiridos da Sigma-Aldrich.

[0416]Os plasmídeos foram amplificados e mantidos em células TOP10 quimicamente competentes (Kit TOPO® TA Cloning®, Life Techonologies) seguindo as instruções do fabricante. Os plasmídeos foram isolados a partir de mini- culturas de E. coli utilizando o kit de plasmídeo miniprep GeneJET™ (Fermentas). O ADN genômico foi isolado a partir de levedura utilizando o Kit de ADN genômico YeaStar™ (ZymoResearch) seguindo as instruções do fabricante.

[0417]As técnicas padrão de biologia molecular e genética de leveduras foram conduzidas de acordo com livros de texto incluindo Sambrook et al., (1989) e Ausubel et al., (1995).

[0418]Estirpes e manutenção. Para o armazenamento das estirpes utilizadas no presente trabalho (Tabela 2), culturas em frascos de agitação foram realizadas em meio rico (YP), que consiste em 10 gL-1 de extrato de levedura (Oxoid) e 20 gL-1 de peptona (BD Difco), suplementado com quer 2% de glicose (YPD), 2% de maltose (YPM), ou 3% xilose (YPX). As culturas foram mantidas a 30°C em um agitador orbital até que as culturas atingissem a fase de crescimento estacionário. Após a adição de glicerol a 30% (v/v), amostras a partir de culturas em frasco de agitação foram armazenadas em alíquotas de 2 mL a -80°C. Tabela 2: estirpes utilizadas ou aqui preparadas

[0419]Análise de DO600 e CLAE em cultura de frasco de agitação. As culturas em frascos de agitação foram amostradas regularmente durante a cultura. Para medições de DO600, as culturas foram diluídas de forma adequada para uma medição precisa e a densidade ótica foi medida a 600 nm de comprimento de onda em um instrumento Espectrofotômetro À2 da Perkin Elmer. O restante da amostra foi filtrado para separar o meio da levedura.

[0420]O filtrado foi inserido nos frascos apropriados para a análise de CLAE. As concentrações de glicose, xilose, glicerol, etanol e ácido acético no meio foram determinadas utilizando um sistema de CLAE Shimadzu. O sistema é equipado com coluna de forno CTO-I10A-VP e auto- injetor SIL-10AD-VP com uma pré-coluna (cartucho Bio-Rad H, Bio-Rad) e uma coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm; BioRad). A eluição ocorreu a 80°C com 5 mM de H2SO4 em 0,6 mL/min. O eluato foi monitorado utilizando um detector de índice refrativo RID-10A (Shimadzu).

[0421]Cultura em placa de micro-poço para o perfis da curva de crescimento. Para cultura de micro-poços de estirpes, o Bioscreen C (Growth Curves Ltd.) foi utilizado. Pré-culturas de pernoite foram sedimentadas, lavadas com água desmineralizada e diluídas em água desmineralizada a duas vezes da DO600 desejada para inoculação. O meio foi preparado em duas vezes da concentração desejada. Em um poço de uma placa de poços de favo de mel, 150 μL de meio foram misturados com 150 μL de suspensão de células. As medições foram realizadas em triplicado. Definições para o Bioscreen C foram mantidas a 30°C de incubação T, medições a cada 15 minutos, agitando a tipo contínuo, máxima amplitude e velocidade normal. A agitação foi definida para parar 5 segundos antes da medição.

[0422]Transformação automatizada e colheita de colônia. Para a geração de transformação de uma biblioteca de mutagênese de saturação nas estirpes modelo as culturas de frasco agitado foram realizadas em qualquer YPM para RN1053, ou YPX para YD01227 (ver abaixo). As células de levedura foram sedimentadas e, subsequentemente, utilizada em um protocolo de transformação automatizado baseado em Schiestl e Gietz (1989). Misturas de transformação foram plaqueadas em meio de seleção consistindo em base nitrogenada de levedura (Sigma-Aldrich; 6,7 g L-1), agar (BD Biosciences; 15 gL-1), suplementada com 2% de maltose (transformações RN1053) ou 3% xilose (transformações YD01227). Placas de transformação foram incubadas a 30°C, e após a formação de colônias, as colônias foram re- plaqueadas utilizando um processo automatizado de transferência de colônias para placas de microtitulação de 96 poços (MTP), contendo o meio de seleção acima referido. MTPs com transformantes foram incubadas a 30°C, até se observar o crescimento claro.

[0423]A análise por RMN. Para a quantificação da glicose, xilose, glicerol, etanol e ácido acético na amostra, 100 μL de amostra são transferidos para um frasco de precisão adequado. Subsequentemente, 100 μL de solução de padrão interno, contendo ácido maleico (20 g/L), EDTA (40 g/L) e quantidades vestigiais de DSS (ácido 4,4- dimetil-4-silapentane-1-sulfônico) em D2O, e 450 μL de D2O, são adicionados.

[0424]Os espectros 1D de RMN de 1H são registados em um Bruker Avance III 700 MHz, equipado com uma sonda de crio, utilizando um programa de pulso com supressão de água (energia correspondente a 3 Hz) a uma temperatura de 27°C.

[0425]As concentrações dos analitos são calculadas com base nos seguintes sinais (δ relativo ao DSS): • pico de α-glicose a 5,22 ppm (d, 0,38 H, J = 4 Hz), • pico de α-xilose a 5,18 ppm (d, 0,37 H, J = 4 Hz), • pico de glicerol a 3,55 ppm (dd, 2H, J1,2 = 6 Hz e J1a,1b = 12 Hz), • pico de ácido acético a 1,91 ppm (s, 3H), • pico de etanol a 1,17 ppm (t, 3H, J = 7 Hz), • O sinal utilizado para o padrão: • pico de ácido maleico a 6,05 ppm (s, 2H) Exemplo 1 - deleções de gene de transporte de hexose

[0426]Construção de cassetes de deleção. Os iniciadores utilizados em construções de plasmídeos são apresentados na Tabela 3; plasmídeos gerados são apresentados na Tabela 4. Esquemas com locais de restrição utilizados para a clonagem e os locais utilizados para liberar construções de deleção do esqueleto de plasmídeo são mostrados na Tabela 5. Tabela 3: iniciadores (oligonucleotídeos) utilizados nos exemplos

Tabela 4: Plasmídeos utilizados na construção da estirpe

Tabela 5: esquema de clonagem

[0427]O marcador kanMX foi amplificado a partir do plasmídeo pFA6-kanMX4 (http://www- sequence.stanford.edu/qroup/yeast_deletion_project/kanmx4.t xt) utilizando os iniciadores das SEQ ID Nos 1 e 2. Subsequentemente, o marcador kanMX foi floxado através da adição de flancos de loxP através de amplificação por PCR com iniciadores das SEQ ID NOs 3 e 4. A re-amplificação foi feita com os iniciadores das SEQ ID NOs 5 e 6. O fragmento loxP-kanMX-loxP resultante foi clonado em pCR-BLUNT resultando em pRN201 (NO ID NO: 7).

[0428] Para a construção de pRN251 (SEQ ID NO: 8), hphMX foi isolado a partir pGRE3:hphMX (KUYPER et al., 2005). Para eliminar um local de Mlul como local de restrição adequado na vizinhança de hphMX, pGRE3:hphMX foi cortado com Eco32l e re-ligado. Posteriormente, hphMX foi clonado como fragmento Xhol-Mlul em pRN201 digerido com Sall e Mlul para substituir kanMX.

[0429] Para a construção de pRN365 (SEQ ID NO: 9), o gene de Streptomyces noursei nat1 foi amplificado por PCR a partir de pYL16 (Werner Bioagentes) utilizando iniciadores com as SEQ ID NOs: 10 e 11. O fragmento PScl-Scal nat1, juntamente com o fragmento pRN201 Acc651-Ncol, foram clonados em pRN201, já linearizado com Acc651 e Scal, a fim de substituir kanR para nat1.

[0430] Para a construção de pRN447 (SEQ ID NO: 12), pRN201 foi digerido com Pmll. Isso serviu duas extremidades. Em primeiro lugar, os Streptoalloteichus hindustanus ble (zeocina ou o gene de resistência à fleomicina) ORF foi isolado, e em segundo lugar, após a re- ligação do pRN201 digerido com Pmll um local de Ncol foi deletado. Subsequentemente, ble como fragmento Ncol-Pmll e como parte de pRN201 como fragmento de vetor BamHl-Ncol foram clonados no pRN201 re-ligado (faltando ble), digerido com BamHl e Scal resultando em pRN447.

[0431] Para o construto de deleção de HIS3, iniciadores da SEQ ID 13-14 foram utilizados para amplificar o loci HIS3 partir de DNA genômico de levedura. Locais utilizados para cortar os flancos HIS3 e ligá-las ao marcador kanMX floxado são mostrados na Tabela 5. O produto de ligação foi digerido com Sacl e Apal e clonado em pCR-Blunt digerido com Sacl e Apal. O plasmídeo resultante é pRN247 (SEQ ID NO: 15).

[0432] Para a deleção dos oito principais transportadores de hexoses (Hxt1-7 e GAL2) em S. cerevisiae, quatro construtos de deleção foram gerados (ver Tabela 4). Cada construto de deleção continha um marcador de resistência dominante floxado diferente. Para cada gene Hxt 400-700 pb flancos foram amplificados utilizando os iniciadores listados na Tabela 3 (SEQ ID NOs: 16-31), utilizando ADN genômico RN1001como molde. O flanco a montante, o marcador de resistência dominante e o marcador a jusante foram ligados utilizando os fragmentos e clonagem de locais listados pela Tabela 5. As ligações foram amplificadas utilizando os iniciadores do flanco a montante e o iniciador inverso do flanco a jusante (combinações de iniciadores SEQ ID NOs: 16 + 19, SEQ ID NOs: 20 + 27, SEQ ID NOs: 24 + 23, e SEQ ID NOs: 28 + 31). Os fragmentos de PCR clonados foram fundidos em pCR-Blunt para obter pRN485, pRN566, pRN569, pRN635 (SEQ ID NOs: 32-35, respectivamente). Para obter elevados rendimentos de plasmídeo de ADN, os plasmídeos foram isolados a partir de 50 mL de culturas de E. coli utilizando o kit Midi NucleoBond® Xtra (Bioke, Leiden, Países Baixos). Antes de transformação a levedura, construtos de deleção foram liberados a partir da espinha dorsal do plasmídeo por digestão com os locais de restrição de liberação listados na Tabela 5.

[0433]Construção de estirpe. A estirpe de fermentação de xilose RN1001 foi feita histidina auxotrófica pela inserção de loxP-anMX-loxP (liberado a partir pRN247; SEQ ID 15) no loci HIS3. Subsequentemente, o marcador foi removido por meio de expressão transiente do plasmídeo pRN187 (derivado de pSH65 expressando induzível por galactose antes da recombinase; SEQ ID NO: 60). Introdução de pRN187 foi selecionada em expressão de phleo e CRE recombinase foi induzida em meio de YP suplementado com galactose. A estirpe his3:loxP resultante foi nomeada RN1041. Os transportadores de hexoses foram suprimidos na seguinte ordem: 1) grupo Hxt3-Hxt6-Hxt7, 2) grupo Hxt5-Hxt1 -Hxt4, 3) GAL2, 4) Hxt2. As construções de deleção foram linearizadas ou liberadas a partir da espinha dorsal do plasmídeo por corte com as combinações de enzimas listadas na Tabela 5, as quais foram integradas no genoma de RN1041. Todas as transformações foram plaqueadas em extrato de levedura (10 g/L), meio de peptona (20 g/L) de agar (15g/L) suplementado com 20 g/L de maltose. A maltose foi adicionada ao meio, porque a absorção deste dissacarídeo passa através de um sistema de transporte alternativo ao sistema de transporte de glicose (Wieczorke et al., 1999). Com cada eliminação de um (conjunto de) gene (s) Hxt, um marcador adicional foi inserido na ordem: 1) hphMX, 2) natMX, 3) zeoMX, 4) kanMX. Com cada marcador adicional inserido, o respectivo antibiótico foi adicionalmente suplementado ao meio na seguinte ordem: 1) HG, 2) HG e Nour, 3) HG, Nour e phleo, 4) HG, Nour, phleo e G418. Após a integração de todos os quatro construtos de deleção, uma única colônia foi isolada sob a seleção de todos os quatro antibióticos. Integrações corretas foram verificadas por análise de PCR em ADN genômico isolado. Foram utilizados iniciadores externos do local de integração (combinações de SEQ ID NOS: 36 + 37, SEQ ID NOs: 38 + 39, SEQ ID NOS: 40 + 41, SEQ ID NOs: 42 + 43; sequências listadas na Tabela 3).

[0434]A caracterização da estirpe. Para caracterizar as estirpes (intermediárias) transportadoras de hexose, culturas em frascos de agitação foram realizadas. As culturas foram inoculadas a DO600 = 0,1. A estirpe resultante, RN1053 (Δhxt1-7; Gal2-mutante RN1041; ver Tabela 2 para o genótipo exato), mostrou um padrão de crescimento retardado em Verduyn-ureia (meio mineral de acordo com Verduyn utilizando ureia como fonte de nitrogênio; Luttik et al., 2001) suplementado com 0,2 gL-1 de histidina (Sigma-Aldrich; Verduyn-ureia-his; para complementar a auxotrofia para a histidina) e 15 gL-1 de glicose e 20 gL-1 xilose apenas começando a crescer lentamente em glicose somente após 60 horas; curiosamente, quando a glicose estava presente no meio, xilose também foi terminada após 150 horas (Figura 1), indicando que um ou mais dos genes transportadores de hexoses críticos (Hxt8- 17) foi induzido em glicose e facilitou o transporte de xilose (Figura 1). No entanto, em xilose como fonte única de carbono RN1053 não cresce em Verduyn-ureia (+ 20 g de 1 1% de xilose, durante o período de cultura (Figura 2), indicando que a estirpe é utilizável como modelo para o ensaio de estirpe transportadora de xilose putativa. RN10153 foi, adicionalmente, mantida em YPM. Exemplo 2 - Deleções de genes de hexoquinase

[0435]Construto de cassetes de deleção. Para a deleção de genes de hexoquinase, oligonucleotídeos foram concebidos (SEQ ID NOs: na tabela 3) compreendidos por 60 nucleotídeos que flanqueiam as sequências homólogas ao loci do gene de hexoquinase e de 20 nucleotídeos homólogos a uma cassete de marcador de resistência dominante floxado. Os oligonucleotídeos foram utilizados para amplificar os construtos de deleção. Os produtos de PCR subsequentes foram purificados em coluna de filtração (Fermentas GeneJet Kit) e utilizado para as experiências de transformações. Foram utilizados três tipos de cassetes de deleção: em primeiro lugar, para deleções de Glk1 e Hxk2 um sistema bipartido foi utilizado. Um fragmento consistiu de um local lox66, KanMX, a montante do promotor GAL1 de CRE, e a parte 5' de CRE (CRE1) amplificado a partir de pSUC227 com um iniciador específico do gene (SEQ ID NO: 44 para Glk1 e SEQ ID NO: 45 para Hxk2) e um iniciador específico do pSUC227 (SEQ ID NO: 46); O segundo fragmento consistiu da parte 3' de CRE (CRE2) com sobreposição em CRE1, e um local lox71, amplificado com os iniciadores de pSUC225 com, novamente, um iniciador específico de gene (SEQ ID NO: 47 para Glk1 e SEQ ID 48 para HXK2) e um específico do pSUC225 SEQ ID NO: 49. Através de recombinação homóloga, os dois fragmentos integram como lox66-kanMX-CRE-lox71 no loci da hexoquinase (sequências pSUC225 e pSUC227 e método fornecido no documento PCT/EP2013/055047). Em segundo lugar, para deleções de Hxk1 (iniciadores SEQ ID NOs: 50-51) e GAL1 (iniciadores SEQ ID NOs: 52-53), um marcador de resistência dominante floxado (DRM) foi amplificado com sequências homólogas que flanqueiam a respectiva hexoquinase para substituir a região de codificação no loci; como moldes para as amplificações de PCR dos cassetes DRM de pRN774 (loxP-hphMX-loxP; SEQ ID NO: 54) e pRN775 (loxP-natMx-loxP, SEQ ID NO: 55) foram utilizados, respectivamente. Em terceiro lugar, para a deleção de HIS3 permitir para complementação do fenótipo auxotrófico por plasmídeos epissomais transportadores, um construto semelhante com flancos homólogos a HIS3 foi integrado conforme foi utilizado para gerar RN1041 (RN1001 -his3:loxP, na família de estirpe RN 1053; veja acima Exemplo 1). Neste caso, o construto carregou natMX como marcador de resistência dominante, em vez de kanMX (SEQ ID NO: 61).

[0436]Construto de estirpe. Para a geração de uma estirpe incapaz de metabolismo de hexose, mas capaz de transporte de hexose, deleções de genes de hexoquinase foram ralizadas na estirpe RN1014 de fermentação de xilose (Tabela 2; a Figura 3 para o esquema de eliminação).

[0437] Conforme mencionado, no caso de Glk1 e Hxk2, os cassetes de ruptura foram bipartidas. Através de recombinação homóloga, os dois fragmentos integram como lox66-kanMX-CRE-lox71 no loci de hexoquinase. A integração foi selecionada em YPD suplementado com G418. Os cassetes de interrupção para Hxk1 e GAL1 consistiram de um fragmento: tanto loxP-natMX-loxP quanto loxP-hphMX-loxP, respectivamente. RN1014 foi transformada com os produtos de PCR purificados e a integração foi selecionada com o antibiótico apropriado. Além disso, HIS3 foi interrompida com um construto semelhante (SEQ ID NO: 61) utilizado para a geração de RN 1053. Neste caso, natMX foi o marcador de seleção em vez de kanMX.

[0438]Os genes foram deletados na seguinte ordem: 1) Glk1, 2) Hxk1, 3) GAL1, 4) Hxk2 e 5) HIS3. Após a eliminação de Glk1 e Hxk1, ambos os marcadores foram reciclados através de recombinação mediada por Cre induzida por galactose. Após a exclusão de Hxk2, a estirpe intermediária foi mantida em meio rico contendo xilose (YPX). Após eliminação, HIS3 os marcadores hphMX e kanMX integrados foram removidos por recombinação de CRE induzida por galactose. Para assegurar o crescimento da estirpe, 2% de xilose foi adicionado ao YP a 2% de galactose + nourseotricina (YPGX). Seleção com nourseotricina assegurou a manutenção do marcador natMX no loci HIS3 deixando um traço de seleção para ser utilizado, possivelmente, mais tarde. Após isolamento de colônia única, a estirpe foi verificada para as suas deleções e perfil de sequência delta por PCR de colônia, e nomeada YD01227.

[0439] Caracterização de estirpe. Em experimentos de cultura em frasco de agitação aeróbicos utilizando Verduyn- his-ureia, outra colônia com o mesmo genótipo (col 2) nocaute (KO) de hexokinase quadruple como YD01227 foi caracterizado por uma pré-triagem para a sua capacidade de consumir xilose na ausência e na presença de um excesso de glicose (10%), e para a sua capacidade em consumir glicose (Figura 4). As culturas foram inoculadas a DO600 = 0,1. Ambos RN1014 e a KO de hexoquinase quádruplo são capazes de crescer em, e consumir, xilose (dados não mostrados). E esperadamente, a KO de hexoquinase quádruplo nem cresce nem consome glicose, enquanto que RN 1014 sim (dados não mostrados). Além disso, o excesso de glicose (10%) impede o crescimento em, e consumo de, xilose por, pelo menos, 96 horas, ao passo que RN1014 utiliza xilose (Figura 4).

[0440]Em experiências Bioscreen C, YD01227 e o acima mencionado col 2 foram testados relativamente ao crescimento em Verduyn-ureia-His suplementado com diferentes açúcares e misturas de açúcar. As culturas foram inoculadas a DO600 = 0,05. YD01227 cresceu em xilose, mas não foi capaz de crescer em glicose, galactose ou maltose (dados não mostrados). As misturas de glicose-xilose foram selecionadas para apoiar uma escolha de composição do meio adequado para a seleção para transportadores específicos de pentoses. Como pode ser visto na Figura 5, com uma proporção de glicose:xilose de 5:1 mostrou que a inibição ótima de crescimento em xilose para estirpe YD01227. Este foi o caso de tanto uma elevada (10:2), como para uma carga baixa de açúcar (2,5:0,5). YD01227 foi ainda mantido em YPX para armazenamento e manuseio. Exemplo 3. Biblioteca de mutagênese de saturação GAL2 e outros construtos.

[0441]Um construto de ADN sintético para o tipo selvagem (WT) GAL2 foi encomendado pelo GeneArt (SEQ ID NO: 56; Invitrogen) e foi utilizado como molde para a mutagênese dirigida ao local. A construto de ADN WT GAL2 sintético foi clonado para pRN993 (SEQ ID NO: 57) como fragmento Xbal-BssHll trocando outro ORF para a construto WT GAL2 sintético para gerar pDB1250 (SEQ ID NO: 58). pDB1250 é um vetor de transporte de levedura baseado em pRS313, tendo como características mais proeminentes, além da sinteticamente feitos GAL2 ORF: 1) uma cassete de expressão de HIS3, para complementar a auxotrofia histidina, 2) um CEN.ARSH para manter 1-2 cópias (baixo número de cópias) do vetor de expressão em células de levedura, 3) o promotor de Hxt7 truncado (-491 pb), resultando em níveis de expressão de meio a jusante da ORF, 4) terminador de ADH1, e 5) o gene de resistência à ampicilina (ampr) para seleção em células de E. coli TOP10 (ver acima) para fins de clonagem (Figura 6). A biblioteca e mutagênese de saturação para, pelo menos, 13 aminoácidos do tipo não-selvagem altera 30 posições de aminoácidos em Gal2p foi encomendado a partir de Invitrogen Life Technologies. (http//www.invitrogen.com/site/us/em/home/Products-and- Services/Applications/Cloning/gene-synthesis/directd- evolution/GeneArt-Site-Saturaion-Mutaqenesis.html); para as posições e as alterações de aminoácidos para a sequência de aminoácidos de tipo selvagem Gal2p (SEQ ID NO: 59) ver Tabela 6. Tabela 6: Biblioteca de Mutagênese de Saturação site único GAL2

[0442]Os construtos resultantes foram inseridos por clonagem feito sob encomenda no GeneArt (Invitrogen, Regensburg, Alemanha) em pDB1250 (SEQ ID NO: I D58). Exemplo 4: Contagem de triagem da Atividade de Transporte de Glicose

[0443]Alvo. Utilizando a tela (GTAC) de contagem de atividade de transporte de glicose, ou seja, transformando estirpe YD01227 hexoquinase-mutante como hospedeiro para introduzir variantes GAL2 e rastreio dos transformantes resultantes em meio de crescimento e no consumo de xilose na presença de uma quantidade 5 vezes maior de glicose, as mutações podem ser identificadas que favorescem xilose acima na presença de uma glicose excedente na variante Gal2p (isto é, uma afinidade mais elevada para xilose do que para a redução de glicose ou, mais preferivelmente, remoção total da capacidade de transporte de glicose, enquanto mantendo a capacidade de transporte de xilose mais ou menos intacta).

[0444]Transformação e colheita de colônia. YD01227 foi transformado com um total de 497 construtos, cada um tendo um GAL2 mutante. Um construto com sequência de GAL2 do tipo selvagem (pDB1250; SEQ ID NO: 58) foi incluído como controle. Para cada transformação, 3 colônias, quando disponíveis, foram re-banhadas a MTPs meio de agar no montante de 1450 transformantes. Os 1450 transformantes foram pesquisados em três partes. Para cada parte da triagem, GAL2 do tipo selvagem foi incluído como controle.

[0445]Pré-cultura e triagem. Para pré-cultura, transformantes foram transferidos por processo automatizado de seleção MTPs em meio de agar para placas de 96 poços semi-fundos (96HDWP) contendo meio de seleção líquido consistindo em meio mineral (de acordo com Verduyn, com ureia como fonte de nitrogênio) suplementado com 3% de xilose. Os 96 HDWPs foram cultivados durante 3 dias de pré- cultura em um agitador orbital a 30°C e 750 rpm. Subsequentemente, para cada poço, 20 μL de cultura foram transferidos por processo automatizado para placas de 24 poços profundos (24 DWPs) contendo 2,5 mL de Verduyn-ureia suplementado com a mistura de açúcar glicose:xilose em uma proporção de 5:1 com as seguintes concentrações: 10 g de glicose e 2 g de xilose (meio YD10). Para cada um dos três pontos de amostragem, uma série de 24DWPs foi inoculada. Em cada 24DWP, um controle do crescimento RN1001 foi inoculado para ter uma indicação de efeitos da variação de placa. Após 24 horas, 72 horas e 96 horas, amostragem automática e transferência para 96HDWP foi conduzida para medição de OD automatizada a 600 nm de comprimento de onda.

[0446]Após a última medição de OD após 96 horas, as células foram sedimentadas, após a centrifugação e 100 μL de sobrenadante foram recolhidos por processo automatizado para a análise de fluxos-RMN constituintes residuais no meio após cultura (ver acima para a descrição do método). Para cada construto e cada ponto de tempo, as concentrações de glicose e xilose residuais medidas para as diferentes réplicas foram em tiradas média. A fim de comparar as diferentes partes da tela, um valor relativo foi calculado com base na diferença da concentração de xilose residual do tipo selvagem medida na parte específica da tela GTAC, de acordo com a seguinte fórmula:

[0447]Resultados. Enquanto RN1001 apresenta o consumo completo de glicose e xilose, transformantes YD01227 de tipo selvagem e construtos GAL2 de biblioteca de mutagênese não consomem glicose e exibiram um espectro de concentrações de xilose residual que representa a sua capacidade individual para consumir xilose na presença de glicose (Figura 7A). Como mostrado na Figura 7B, o consumo de xilose exibiu uma elevada correlação (R2 = 0,93) com as medidas de crescimento (DO600). Uma vez que a triagem foi conduzida em condições aeróbicas, e pouca formação de etanol foi mostrada (dados não mostrados) e o crescimento exibiu elevada correlação com o consumo de xilose, as concentrações residuais de xilose foram usadas como parâmetro principal para comparar variantes GAL2 com o tipo selvagem. A comparação de todas as variantes GAL2 mutantes testadas versus GAL2 tipo selvagem no consumo de xilose (média RelXyl) durante 96 horas é apresentado na Tabela 7. Todas as mutações que afetam o transporte de glicose para o benefício do transporte de xilose têm RelXyl> 0 (Tabela 7). As posições de topo para direcionar para um segundo ciclo de mutagênese foram classificadas com base em sua pontuação média RelXyl por mutação; mutações específicas foram classificadas na preferência baseada em pontuação RelXyl também (Tabela 8). Tabela 7. DO600 Relativa (RelDO600) e consumo de xilose (RelXyl) de triagem GTAC. O construto pDB1250 de GAL2 do tipo selvagem foi definido para 0. Os valores RelDO600 são as médias de 1-3 repetições e são valores relativos, em comparação com o tipo selvagem.

[0448]As mutações mais proeminentes foram encontradas na posição 376, quando o aminoácido Asn do tipo selvagem foi trocado por aminoácidos com cadeias laterais grandes hidrofóbicas, tal como Phe, lie, Leu, Met, Thr, ou Val; estas variantes facilitaram o crescimento claro e o consumo de xilose quase completo e quase nenhuma atividade de transporte de glicose na triagem de GTAC (Figura 8). Verificou-se que os aminoácidos vantajosos na posição 376 têm um volume van der Waals de 85 a 138 Â3 e uma hidrofobicidade de 10 a 100 ΔtR, ou, em uma forma de realização, um volume de van der Waals de 100 a 138 Â3 e uma hidrofobicidade de 10 a 100 ΔtR. Uma outra forma de realização importante é constituída pelos aminoácidos específicos na posição 339, onde encontramos um aminoácido que possui uma hidrofobicidade de -30 a -10 ΔtR resultad em mutantes com atividade de transporte de glicose reduzida. Isto é ilustrado pela figura 11.

[0449]Os valores para o volume van der Waals (Â3) para os aminoácidos são aqui utilizados como descrito em: http://www.proteinsandproteomics.org/content/free/tables_1/ table08.pdf. A literatura correspondente é N.J. Darby, Thomas E. Creighton, Protein Structure (1993) Oxford University Press. Os valores de hidrofobicidade (ΔtR) de aminoácidos são aqui utilizados tal como descrito em http: //onlinelibrary.wilev.eom/doi/10.1002/psc.310010507/pdf. A referência que corresponde a esta é Monera, O.D. et al., Journal of Peptide science Vol. 1 319-329 (1995). Exemplo 5: Triagem de Atividade de Transporte de Xilose

[0450]Alvo. Utilizando a triagem (XTA) de Atividade de Transporte de Xilose, ou seja, utilizando estirpe mutante transportadora de hexose RN1053 como anfitrião para introduzir variantes GAL2 e rastreio dos transformantes resultantes em meio para o crescimento em baixa concentrações de xilose (1 g L-1), mutações podem ser identificadas que aumentam a atividade de transporte de xilose na variante Gal2p. Atividade de transporte pode ser definida por mais do que um parâmetro, por exemplo, a afinidade do transportador (expressa pela constante de Michaelis, ou seja, Km), ou a taxa do transportador (expresso como Vmax). É também possível que uma mutação aumente a expressão do transportador, e melhore, assim, a atividade de transporte de xilose na célula hospedeira.

[0451]Transformação e colheita de colônia. RN1053 foi transformado com um total de 468 construtos, cada uma tendo um GAL2 mutante. Um construto com sequência de GAL2 do tipo selvagem (SEQ. ID58) foi incluído como controle. Para cada transformação, 1-3 colônias foram re-banhadas a MTPs meio de agar no montante de 1229 transformantes. Os 1229 transformantes foram selecionados em duas partes. Para cada parte da triagem, GAL2 do tipo selvagem foi incluído como controle.

[0452]Pré-cultura e triagem. Para a pré-cultura, os transformantes resultantes da transformação automatizada e colheita de colônia foram transferidos por processo automatizado de seleção de PTMs em meio de agar para 96HDWP contendo em cada poço 250 μL de Verduyn-ureia suplementado com 2% de maltose. Após 3 dias de pré-cultura em um agitador orbital a 30°C e 750 rpm, 5 μL da cultura foram transferidos para três 96HDWP diferentes contendo 250 μL de Verduyn-ureia suplementado com 1 gL-1 xilose (meio RN01), cada 96 HDWP representando um ponto de amostragem. Em cada placa (24 DWP ou 96 HDWP) pelo menos um controle do crescimento RN1001 foi inoculado para ter uma indicação dos efeitos placa-a-placa. Após 24 horas, 72 horas e 96 horas, uma série de 96HDWPs foi colhido para medição automatizada de OD a 600 nm. Para cada construto, cada ponto de tempo e os valores de DO600 para as diferentes réplicas, foi em média. A fim de comparar as diferentes partes da triagem, um valor relativo foi calculado com base na diferença para o valor de DO600 de tipo selvagem medido na parte particular da triagem XTA, de acordo com a seguinte fórmula:

[0453]Resultados. Em ambas as partes da triagem de XTA, RN1001 faz parte das posições Top15 com base no perfil de crescimento em comparação com o Gal2p do tipo selvagem; RN1001 tem o complemento total de transportadores de hexoses e a presença de RN1001 na Top15 em ambas as partes da triagem XTA (Figura 9), indica que um ou mais transportadores de hexoses endógenos em levedura facilitam absorção de xilose de alta afinidade em contraste com o Gal2 do tipo selvagem RN1053-transformantes que apresentavam perfis de crescimento mais pobres. As variantes mutantes com uma única alteração de aminoácidos presentes no TOP15 exibiram uma maior afinidade para xilose em comparação com o Gal2p do tipo selvagem e desenvolveram em relação ao perfil de crescimento RN1001 ou mesmo mostraram características de crescimento semelhantes ou melhoradas em baixas concentrações de xilose. Interessantemente, quando se alinha sequências de aminoácidos do transportador de hexose da família S. cerevisiae, algumas das mutações encontradas no Gal2p Top15, por exemplo, N346D e M339S, são para serem encontradas nas sequências de tipo selvagem de Hxt2 (S324) e Hxt11 (D336 e S329), respectivamente. A comparação de todas as variantes GAL2 mutantes testadas versus GAL2 do tipo selvagem em crescimento (RelDO600 média) durante 96 horas é apresentado na Tabela 8. Todas as mutações com RelDO600> 0 são propostas para ter um efeito positivo sobre a afinidade de xilose. Tabela 9. Valores de RelDO600 médios para os Gal2p mutantes exibidos na triagem XTA.

Tabela 10. Posições e mutações Gal2p identificadas na triagem XTA são ordenados por preferência. Pontuação máxima HIT é a pontuação RelXyl para a substituição de aminoácido em uma posição produzindo o melhoramento mais nítido em comparação com o Gal2p do tipo selvagem. Isto permite uma triagem das mutações mais influentes e posições relevantes para alvejar em Gal2p para aumentar a atividade de transporte de xilose.

EXEMPLOS 6 a 15 Métodos

[0454]Técnicas e químicas de biologia molecular. As enzimas de restrição e ligase de DNA T4 foram adquiridas a partir de Fermentas (Fisher Scientific, Landsmeer, Países Baixos). Os iniciadores utilizados nos estudos (SEQ ID NO: 1 -55) estão indicados na Tabela 11. As técnicas padrão de biologia molecular e genética de leveduras foram conduzidas de acordo com livros de texto incluindo Sambrook et al., (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, NY, EUA) e Ausubel et al., (1995; Current Protocols in Molecular Biology).

[0455]Amplificação por PCR e clonagem. Para amplificações da PCR, mistura máster de PCR de Alta Fidelidade Phusion® com tampão de HF foi utilizada (Finnzymes; Fisher Scientific, Landsmeer, Países Baixos). Os iniciadores utilizados para a clonagem e sequenciamento são indicados na Tabela 11 (SEQ ID NO: 37-55). Os fragmentos de PCR Hxt2, Hxt3-6, e Hxt11 foram clonados no vetor de expressão de levedura pRS313-P7T7 (SEQ ID NO: 56), com base no pRS313 vetor de trasnporte (Sikorski e Hieter, 1989, A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae - Um sistema de vetores de transporte e estirpes hospedeiras de levedura concebido para a manipulação eficiente de ADN em Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 122, págins 19-27). O construto pRS313-P7T7 carrega o promotor de Hxt7 truncado (Hauf et al., 2000, Simultaneous genomic overexpression of seven glycolytic enzymes in the yeast Saccharomyces cerevisiae - Sobre-expressão genômica simultânea de sete enzimas glicolíticas em levedura de Saccharomyces cerevisiae. Enzyme Microb Technol., 26: 688 698) e o terminador Hxt7. Entre o promotor e o terminador, um local de clonagem múltipla (MCS) existe. Os fragmentos de PCR resultantes foram digeridos por enzimas de restrição diferentes (como indicado mais adiante nos Exemplos abaixo) e clonadas por técnicas de biologia molecular convencionais no vetor de expressão de levedura. Hxt11 também foi clonado em pRS313-P7T7-GFP (resultando em SEQ ID NO: 57) para estudos de localização de proteína Hxt11 marcada com GFP utilizando microscopia de fluorescência (Exemplo 5). pDB1250 continha o GAL2 ORF (SEQ ID NO: 60) entre o promotor de Hxt7 truncado e o terminador de ADH1 (para referência de pDB1250 sequência, ver SEQ ID NO: 58. Os plasmídeos foram amplificados e mantidos em células DH5a seguindo as instruções do fabricante Os plasmídeos foram isolados a partir de mini culturas de E. coli utilizando o kit de plasmídeo miniprep GeneElute (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Holanda). As sequências de genes/proteínas e construtos utilizados e gerados durante estes estudos estão listados na Tabela 12. Tabela 11: oligonucleotídeos utilizados nos exemplos

* Em itálico a sequência que flanqueia HXT11, e sublinhado a sequência de HIS3.

[0456] Extração de ARN e síntese de cDNA. O ARN total foi isolado a partir de células de levedura em fase exponencial por um processo de extração de Trizol/rompimento de esferas de vidro. Peletes de levedura a partir de 2 mL de cultura de células foram misturados com 0,2 mL de pérolas de vidro (diâmetro, 0,45 mm) e 0,9 mL de Trizol com 125 μL de clorofórmio, e rompidas em uma FastPrep FP120 (Bio-101, Thermo Savant, Califórnia, EUA) por uma explosão de 45 segundos a uma velocidade 6. 1 μg de ARN total foi utilizado para sintetizar ADNc, utilizando o kit de iScript (Bio-Rad, Veenendaal, Holanda).

[0457]PCR em tempo real. O Hxt1-Hxt17 e GAL2 específicos de PCR em tempo real foram realizados, respectivamente, utilizando SYBR SensiMix & kit de fluoresceína (GC Biotech, Alphen den aan Rijn, Holanda) e o instrumento MyiQ iCycler de PCR em Tempo Real (Bio-Rad, Veenendaal, Países Baixos). Cada reação de 25 μL continha 12,5 μL de SYBR verde Master Mix, 4 μL cDNA, 0,5 μL de cada iniciador (10 nM) e 7,5 μL de água deionizada estéril. As condições de PCR foram de 10 min a 95°C, seguido por 39 ciclos de amplificação (15 s a 95°C, 30 s a 60°C, 30 segundos a 72°C). Os iniciadores apresentados na Tabela 11 foram utilizados para amplificar os fragmentos de ADNc por amplificação por PCR (SEQ ID NO'S 1 -36).

[0458]PCR propensa a erro. Experiências de PCR propensa a erros foram realizadas seguindo as indicações fornecidas pela Taq DNA polimerase (Thermo Fischer), utilizando 10 ng de modelo em 100 μL de mistura de PCR contendo 5,5 mM de MgCl2 e 0,15 mM de MnCl2.

[0459]Manutenção de estirpe, cultivo e engenharia evolutiva. As estirpes geradas nestes estudos estão listadas na Tabela 13. Para o armazenamento das estirpes utilizadas no presente trabalho (Tabela 2), culturas em frascos de agitação foram realizadas em meio rico (YP), que consiste em 10 g de um extrato de levedura (Oxoid) e 20 gL- 1 de peptona (Difco BD), suplementado com 2% de glicose (YPD), 2% de maltose (YPM; no caso de derivados de RN1053), ou 3% xilose (YPX; no caso de derivados de YD01227). As culturas foram mantidas a 30°C em um agitador orbital até que as culturas atingiram a fase de crescimento estacionário. Após a adição de glicerol 30% (v/v), amostras de culturas em frasco de agitação foram armazenadas em alíquotas de 2 mL a -80°C.

[0460] Para caracterização da estirpe e engenharia evolutiva, cultivos foram realizados utilizando meio mineral de acordo com Verduyn utilizando ureia como fonte de nitrogênio (Verduyn-ureia Luttik et al., 2001, J Bacteriol, 182: 501 -517) a pH 4,5 suplementado com o açúcar desejado (misturas). Em culturas de estirpes modelo RN1053 ou YD01227, Verduyn-ureia foi suplementado com 0,2 gL-1 de histidina (Sigma-Aldrich; Verduyn-ureia-His), para complementar a auxotrofia para a histidina.

[0461] Cultivos de estirpes para caracterização de crescimento e perfis de consumo de açúcar foram conduzidos em frascos de agitação, um leitor Bioscreen C utilizando placas de poços de favo de mel (Grouth Curves Ltd, representada pela Thermo Fisher Scientific BV, Breda, Holanda). As culturas foram mantidas a uma temperatura de 30°C. Especificamente para fins de engenharia evolutiva, culturas em quimiostato foram cultivadas em biorreator de tanque agitado de 3 L (Applikon, Schiedam, Países Baixos) cheio com 500 mL de Verduyn-ureia-His suplementado com as fontes de carbono necessárias, a uma temperatura de 30°C. O valor de partida de oxigênio dissolvido (DO) era de 5% l, a agitação foi realizada a 400 rpm e a DO600 inicial foi de 0,2. Tabela 12: Plasmídeos e sequências de genes/proteínas

Tabela 13: estirpes utilizadas ou preparadas aqui

[0462]Métodos analíticos. O crescimento celular foi monitorado por densidade ótica (DO) a 600 nm utilizando espectrofotômetro de UV-visível (Novaspec PLUS). As concentrações de glicose, xilose, etanol foram medidas no sobrenadante de culturas (a partir de sedimento de células separadas após centrifugação a 4000 rpm durante 5 min) por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (Shimadzu, Quioto, Japão), utilizando uma coluna Aminex HPX-87H (Bio- Rad) e um detector de índice de refração (Shimadzu, Quioto, Japão). A temperatura da coluna e detector foi mantida a 65°C. A fase móvel era de 0,005 N H2S04 a uma taxa de fluxo de 0,55 mL/min.

[0463]Medição da Captação de açúcar. A absorção de xilose radiomarcad foi medida como se segue: as células foram cultivadas durante 24 horas em frascos de agitação em Verduyn-ureia suplementado com 2% de xilose e 0,05% de maltose e foram recolhidos por centrifugação (3.000 rpm, 3 minutos, 20°C ), lavadas e re-suspensas em Verduyn-ureia. [14C] xilose ou [14C] glicose (CAMPRO científica, Veenendaal, os estoques da Holanda foram adicionados à suspensão de células. A reação foi parada, para xilose depois de 1 minuto e glicose após 15 segundos, por adição de 5 mL de 0,1 M cloreto de lítio, e a suspensão celular foi filtrada (filtro de membrana HV de 0,45 μm, Millipore, França). Os filtros foram lavados com mais 5 mL de cloreto de lítio e contados com contador de cintilação líquida no cintilador emulsionante plus (Perkin-Elmer, EUA). Os experimentos de incorporação para YD01227-ori e YD01227-evo foram realizados com 0,5, 2, 6, 20, 40 mM de xilose ou 0,1, 0,4, 1,5, 6, 20, 80 mM de glicose. Os estudos de competição de glicose para RN1053 e-Hxt3-6 RN1053-mHxt3-6 (N367I), RN 1053-Hxt11 e RN1053-mHxt11 (N366D) foram realizados com estoque de [14C] xilose e com glicose não marcada. As concentrações finais de xilose e glicose foram de 50 mM e 50-500 mM, respectivamente.

[0464]Microscopia de fluorescência. O plasmídeo pRS313- P7T7-Hxt1 -GFP 1 (SEQ ID NO: 57) foi transformado na estirpe RN1053 e RN1041. Colônias frescas foram inoculadas em meio mínimo com glicose ou xilose. Uma cultura de células fresca líquida tomada em fase de crescimento exponencial (a uma densidade ótica de 10 a 600 nm) foi submetida a microscopia de fluorescência com um microscópio Nikon Eclipse-Ti equipado com uma objetiva de imersão em óleo de 100X, um conjunto de filtros para GFP e uma câmara arrefecida Nikon DS-5mC. Examinou-se rotineiramente, pelo menos, 100 células por amostra, e cada experiência foi repetida, pelo menos, três vezes.

[0465]Transformação automatizada e colheita de colônia. Para a geração de uma biblioteca de transformação de mutagênese de saturação em YD01227, as culturas foram realizadas em qualquer YPM para RN1053, ou YPX para YD01227 (ver abaixo) em frascos de agitação. As células de levedura foram sedimentadas e, subsequentemente, utilizadas em um protocolo de transformação automatizado baseado em Gietz, RD e Woods, RA (Gietz, RD e Woods, RA 2006, Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method - Transformação de levedura pelo método de LiAc/SS portador de DNA/PEG. Methods Mol. Biol., 313: 107-120). Misturas de transformação foram plaqueadas em meio de seleção consistindo em base nitrogenada de levedura (Sigma-Aldrich; 6,7 g I-1), agar (BD Biosciences; 15 gL-1), suplementada com 2% de maltose (transformações RN1053) ou 3% xilose (transformações YD01227). Placas de transformação foram incubadas a 30°C, e após a formação de colônias, as colônias foram re-plaqueadas utilizando um processo automatizado de transferência de colônias para placas de microtitulação de 96 poços (MTP), contendo o meio de seleção acima referido. MTPs com transformantes foram incubadas a 30°C até se observar o crescimento claro.

[0466]Análise por RMN. Para a quantificação da glicose, xilose, glicerol, etanol e ácido acético na amostra, 100 μL de amostra são transferidos para um frasco de precisão adequado. Subsequentemente, 100 μL de solução de padrão interno, contendo ácido maleico (20 g/L), EDTA (40 g/L) e quantidades vestigiais de DSS (4, 4-sulfônico-dimetil-4- silapentane-1) em D2O, e 450 μL D2O, são adicionados.

[0467]Os espectros 1D de RMN de 1H são registados em um Bruker Avance III 700 MHz, equipado com uma sonda de crio, utilizando um programa de pulso com supressão de água (energia correspondente a 3 Hz) a uma temperatura de 27°C.

[0468]As concentrações dos analitos são calculadas com base nos seguintes sinais (δ relativo ao DSS): • pico de α-glicose a 5,22 ppm (d, 0,38 H, J = 4 Hz), • pico de α-xilose a 5,18 ppm (d, 0,37 H, J = 4 Hz), • pico de glicerol a 3,55 ppm (dd, 2H, J1,2 = 6 Hz e J1a,1b = 12 Hz), • pico de ácido acético a 1,91 ppm (s, 3H), • pico de etanol a 1,17 ppm (t, 3H, J = 7 Hz), • O sinal utilizado para o padrão: • pico de ácido maleico a 6,05 ppm (s, 2H).

Exemplo 6 Expressão elevada de s. Cerevisiae hxt11 em evoluído estirpe de transporte negativo de xilose com capacidade restaurado para crescer em xilose

[0469]Cultura quimioestática de RN1053. A absorção de xilose em Saccharomyces cerevisiae é facilitada por um subgrupo distinto de transportadores de hexoses (Hamacher et al., 2002, Characterization of the xylose-transporting properties of yeast hexose transporters and their influence on xylose utilization -Caracterização das propriedades de transporte de xilose de transportadores de hexose de levedura e a sua influência sobre a utilização de xilose., Microbiology, 148: 2783-2788). Nós construímos um mutante de deleção com capacidade de fermentar xilose (RN1053) que não tem os principais transportadores de hexoses Hxt1-Hxt7 e GAL2. Como resultado das deleções, RN1053 não é capaz de utilizar xilose (tal como descrito no Exemplo 1). Saccharomyces cerevisiae possui mais genes Hxt do que os oito mais importantes (Hxt8-17), dos quais não se sabe muito além de sua expressão ser baixa ou insignificante (Sedlak & Ho, 2004 Characterization of the effectiveness of hexose transporters for transporting xylose during glucose and xylose co-fermentation by a recombinant Saccharomyces yeast. - Caracterização da eficácia dos transportadores de hexoses para o transporte de xilose durante a co- fermentação de glicose e xilose por uma levedura de Saccharomyces recombinante, Yeast 21, páginas 671 -684) ou que tenham sido ligados a outros que o transporte de açúcar (Nourani et al., 1997 Multiple-drug-resistance phenomenon in the yeast Saccharomyces cerevisiae: involvement of two hexose transporters - Fenômeno de resistência a múltiplos medicamentos na levedura de Saccharomyces cerevisiae: envolvimento de dois transportadores de hexoses. Mol Cell Biol., 17: 5453-5460). Por isso nos referimos a eles como os genes Hxt enigmáticos. Foi feita uma tentativa de selecionar possíveis mutações espontâneas em loci de Hxt enigmático resultando em maior expressão ou, possivelmente, afinidade melhorada para a xilose. A fim de fazer isso, a estirpe RN1053 foi crescida em uma cultura de quimiostato anaeróbio, limitada de xilose a uma taxa de diluição de 0,05 h-1. As linhagens evoluídas por cultivo quimioestático, RN1053-X2, foram isoladas em placa de 2% de xilose. Uma única colônia foi selecionada por cultivo em frasco de agitação aeróbica em Verduyn-ureia-His suplementado com 2% de xilose por 96 h, para comparação com a estirpe RN1053 original. As curvas de crescimento de estirpe RN1053 e RN1053-X2 foram representadas na Fig. 12A. A estirpe RN1053-X2 evoluída foi capaz de crescer em 2% de xilose, ao passo que a linhagem original RN1053 não cresceu no meio de xilose. Uma razão pode ser que um ou mais dos genes HXT enigmáticos (Hxt8-Hxt17) foi regulado em meio xilose durante a cultura quimioestática, facilitando a absorção de xilose.

[0470]Perfil de expressão de RN1053-X2 evoluído. Os padrões de expressão de Hxt8-Hxt17 na estirpe RN1053-X2 evoluída e linhagem original RN1053 foram comparados durante cultivo em batelada em 2% de meio de xilose. O nível de transcrição de Hxt11 e Hxt12 foram dramaticamente aumentados, até 8 vezes na estirpe evoluída RN1053-X2, desde o início da fase exponencial (Fig. 12B) e atingiu um nível máximo no Dia 3, comparado com a estirpe RN 1053 original. A quimioestática foi eficaz para a evolução de mutantes para aumentar o consumo de xilose por expressar Hxt11 e/ou genes transportadores de Hxt12 em estirpe RN1053. No entanto, o nível de outros genes HXT (ou seja Hxt8-Hxt10, e Hxt13-Hxt17) foram expressos reprimidos em meio de xilose, em comparação com RN 1053 do tipo selvagem.

[0471]O primeiro passo do metabolismo da xilose limitante é o seu transporte através da membrana plasmática (P Kahar, Tak K, Tanaka S, 2011. Enhancement of xylose uptake in 2-deoxyglucose tolerant mutant of Saccharomyces cerevisiae - Aperfeiçoamento de absorção de xilose em mutantes tolerantes a 2-desoxiglicose de Saccharomyces cerevisiae., J. Biosci. Bioeng. 111:557-63). Foi relatado que a expressão de genes transportadores de Hxt de S. cerevisiae foi regulamentado em resposta a diferentes níveis de glicose extracelular (Ozcan & Johnston, 1999. Function and regulation of yeast hexose transporters. - Função e regulação de transportadores de hexoses levedura. Microbiol Mol Biol Rev. 63: 554- 569). Possivelmente, mutações nos genes promotores ou reguladores estão na base de uma maior expressão dos genes Hxt críticas na estirpe RN1053-X2 evoluída na cultura de quimiostato em xilose. Exemplo 7 Hxt11 knock out/down em RN1053 evoluído abole a capacidade recentemente adquirida para crescer em xilose

[0472]Knockout e silenciamento de Hxt11 na estirpe RN1053-X2. Para a construto de deleção de Hxt11, cassete de expressão PHIS3-HIS3-THIS3 foi amplificada a partir do plasmídeo molde pRS313-P7T7 (SEQ ID NO: 117) utilizando oligonucleotídeos KOP11 (SEQ ID NO: 98) e KOT11 (SEQ ID NO: 99) que consiste em sequências de flanqueamento Hxt11 para a integração no loci de Hxt11 e a sequência de HIS3 para amplificar a cassete de expressão.

[0473]A fim de determinar se Hxt11p era responsável pelo crescimento espontâneo em xilose, Hxt11 foi deletado na estirpe RN1053-X2 evoluída por uma sucessão de passos para a deleção do gene complementando o marcador HIS3 mediante eliminação de Hxt11. Níveis de Hxt11 mRNA diminuíram consideravelmente após construto de knockout ter sido introduzido (Figura 13a). Quando Hxt11 foi interrompido na estirpe RN1053-X2, a estirpe perdeu sua capacidade recém-adquirida para crescer em meio xilose (Figura 13b). Além disso, o nível de expressão de estirpes knockout Hxt11 diminuiu para 60%. Muito provavelmente, níveis de Hxt11 ainda foram medidos uma vez que também expressou Hxt12 transcritos na estirpe RN1053-X2 são cerca de 98% homólogos à Hxt11 (Figura 13a).

[0474] Técnica de ARN anti-sentido é muito útil para a repressão da tradução de uma proteína alvo por varrimento ARNm alvo em microrganismos. A repressão da tradução pode ser promovida por sequências anti-sentido que hibridam com ARN mensageiro. O mecanismo de anti-sentido envolve a interferência do ribossoma, em que o ribossoma não pode ligar-se aos nucleotídeos do mRNA (Park et al 2001. Inibição anti-sentido da arginase mediada [CAR1] a expressão de genes em Saccharomyces cerevisiae J. Biosci Bioeng 92:481-484). Este método é mais conveniente para a inibição da expressão do gene do que o método de rompimento do gene. Para a expressão de Hxt11 inversa (iHxt11), iHxt11 foi amplificado utilizando iniciadores iHxt11F (SEQ ID NO: 100) e iHxt11R (SEQ ID NO: 101) e clonado como fragmento BamHl-Xbal inversamente entre o promotor Hxt7 truncado e terminador Hxt7 no vetor pRS313-P7T7 (Figura 13C; SEQ ID NO: 117). O construto foi introduzido no RN1053-X2 anti- sentido para expressar ARN de Hxt11 que impede a tradução do ARNm em proteína Hxt11. O iHxt11 foi sobre-expresso na estirpe RN1053-X2, e a estirpe perdeu sua capacidade de crescer em meio de xilose (Figura 13d).

[0475]Estas experiências knock-out/knock-down indicam claramente que a estirpe RN1053-X2 evoluída começou a consumir xilose devido ao aumento na expressão de Hxt11 e a expressão funcional provável de Hxt11p na membrana de levedura.

Exemplo 8 Sobre-expressão de hxt11 em rn1053 restaura crescimento em xilose

[0476]Sobre-expressão de Hxt11 e Hxt12 em RN1053. Para determinar se as estirpes que expressam Hxt11 ou Hxt12 são capazes de crescimento em xilose, tanto genes HXT foram expressos individualmente na estirpe RN1053 original, que é incapaz de crescer em xilose por causa da supressão dos oito principais transportadores de hexoses (Hxt1-Hxt7 e GAL2). Para estes experimentos RN1041 vazio, RN1053 vazio, RN1053-Hxt11 e RN1053-Hxt12 foram utilizados (ver Tabela 13). RN1053-Hxt11 e RN1053 Hxt12 foram construídos da seguinte maneira: os quadros de leitura aberta para os genes Hxt11 e Hxt12 foram amplificados por PCR a partir de ADNc do tipo selvagem RN1053 utilizando iniciadores Hxt11 F (SEQ ID NO: 102), Hxt12F (SEQ ID NO: 103) e Hxt11/12R (SEQ ID NO: 104); Os fragmentos de PCR foram sequenciados e verificou-se 100% de homologia com as respectivas sequências de genes CEN.PK1 13-7D (Base de Dados do Genoma de Saccharomyces, www.yeastgenome.org; Hxt11 sequência SEQ ID NO: 119); os fragmentos de PCR foram cortados com as enzimas de restrição Xbal e BamHl e clonados no vetor de expressão de levedura pRS313-P7T7 (SEQ ID NO: 117; Figura 13C; Tabela 12). Os construtos de expressão Hxt11 e Hxt12 dos transportadores foram transformados em RN1053 utilizando uma técnica genética de levedura padrão de acordo com o método Gietz (Gietz e Woods 2006, Ttransformação de levedura pelo método de LiAc/SS portador de DNA/PEG. Métodos Mol.Biol 313 páginas 107-120). Os transformantes isolados a partir de colônias individuais resultaram em estirpes RN1053-Hxt11 e RN1053-Hxt12. Ambas as estirpes foram inoculadas em meio de maltose, seguido de culturas em balão de agitação em meio líquido contendo 2% de xilose e/ou 2% de glicose. Apenas RN1053-Hxt11 e RN1041 exibiu crescimento claro dentro de 48 horas, enquanto que RN1053-vazio e RN 1053-Hxt12 exibiu quase nenhum crescimento nesse período (Figura 14a). O crescimento de RN1053-Hxt11 começou mais cedo e mais rápido do que o crescimento exibido pela estirpe de referência RN1041 vazio (com fundo de Hxt do tipo selvagem) em meio de xilose (Figura 14b). No entanto, a introdução de sequência Hxt12 em RN1053 não permite o crescimento em meio de xilose. Na base de dados do genoma de Saccharomyces, estirpe de referência S288C, Hxt12 é considerado um pseudogene devido a uma mutação de mudança de quadro (www.veastqenome.org; ORFs YIL170W e YIL171W).

[0477]Esta experiência mostrou claramente que o crescimento espontâneo em xilose de RN1053-X2 foi causada pelo aumento da expressão de Hxt11 e que Hxt11 é um transportador de xilose eficiente, se expresso.

Exemplo 9 Hxt1 p facilita o transporte xilose com maior nível intrínseco de especificidade de xilose do que Hxt2p

[0478]Absorção de xilose por Hxt11 p. Para determinar se Hxt11 é capaz de transporte de xilose na ausência e na presença de glicose, foram realizados estudos de captação radiomarcados utilizando 14C-xilose. Para estas experiências as estirpes RN1053 vazios, RN1053-Hxt11 e RN1053-Hxt2 foram utilizadas (ver Table13). Hxt2 é conhecida por suas capacidades de transporte de xilose (Saloheimo et al., 2007, Estudos de transporte Xilose com estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizando xilose que expressam permeases heterólogas e homólogas. Appl Microbiol Biotechnol 74: 1041 -1052; Ho Sedlak e de 2004, Caracterização da eficácia dos transportadores de hexoses para o transporte de xilose durante co-fermentação de glicose e xilose por uma levedura recombinante de Saccharomyces. Yeast, 21:671-684). Construto de RN1053- Hxt11 foi descrito no exemplo anterior. RN1053-Hxt2 foi construído da seguinte maneira: Hxt2 (SEQ ID NO: 120) foi amplificado por PCR a partir de genoma de RN1001 (Tabela 12) utilizando iniciadores F Hxt2 Xbal (SEQ ID NO: 107) e R Hxt2 Cfr9l (SEQ ID NO: 108). O fragmento resultante de PCR teve a sequência verificada e clonada em pRS313-P7-T7 (SEQ ID NO: 117) na forma de fragmento Xbal-Cfrdl. RN1053 foi transformada com a construto resultante pRS313-P7T7-Hxt2 (ver Tabela 12), gerando um transformante derivado de uma única colônia denominado estirpe RN-1053 Hxt2 (Tabela 13). Para determinar se Hxt11p aumentou a absorção de xilose na estirpe RN1053, a absorção de xilose foi determinada utilizando 14C nas células que expressam os transportadores. Na presença de glicose, estirpes que expressam Hxt11 acumularam até 50% mais xilose em comparação com estirpes que expressam Hxt2 na presença de glicose (Figura 15). Além disso, a absorção de xilose RN1053-Hxt11 foi aumentada até 4,5 vezes, em comparação com RN1053-Hxt2 (Figura 15). Estas experiências mostram que Hxt11p é capaz de transportar xilose através da membrana plasmática de levedura. Ainda mais, Hxt11p aproveita uma maior especificidade intrínseca para com xilose que não poderia ser facilmente competida pela glicose, em comparação com transportadores de xilose previamente identificados no genoma da levedura, tal como Hxt2p.

Exemplo 10 Hxt11p é funcionalmente expresso na membrana plasmática de levedura

[0479]Expressão funcional de Hxt11 em RN1053. Detecção do Hxt11p por análise de imunotransferência não irá demonstrar completamente a expressão funcional da proteína. Para a expressão funcional de uma proteína transportadora de hexose, ela deve residir na membrana plasmática. A fim de controlar a expressão e a segmentação de Hxt11p, uma proteína quimérica Hxt11p-GFP foi manipulada e examinada por fluorometria e microscopia de fluorescência. Para estes estudos RN1053-Hxt11-GFP, RN1041-Hxt11-GFP, RN1053-Hxt11 e RN1053 vazio foram utilizados (Tabela 13). Para a construção das estirpes que expressam Hxt11-GFP, RN1053 e RN1041 foram transformados com o vetor de expressão portador da proteína Hxt11-GFP quimérica (pRS313-P7T7- Hxt11-GFP; SEQ ID NO: 118; Tabela 12). A proteína de fusão Hxt11p+GFP é um transportador de hexoses funcional: ela restaurou o crescimento em 2% de xilose com a estirpe RN1053 (Figura 16a). Além disso, fluorescência de Hxt11p + GFP de RN1053-Hxt11-GFP e RN1041 -Hxt11-GFP foi localizada na membrana do plasma ou xilose em meio de glicose (Figura 16b).

[0480]Estas experiências mostram que Hxt11p-GFP é funcional como transportador de xilose e que Hxt11P é expresso funcionalmente na membrana plasmática. Exemplo 11 Expressão de Hxt11 em RN1053 facilita co-fermentação mais rápida de glicose e xilose em concentrações industrialmente relevantes

[0481]Perfil de fermentação de RN1053-Hxt11 em misturas de glicose-xilose. Para determinar o comportamento de fermentação com uma mistura de glicose-xilose de uma estirpe que expressa funcionalmente Hxt11 em um fundo de deleção de Hxt (hxt1-7, Gal2) em comparação com uma estirpe que expressa o Hxt paisagem de tipo selvagem, as fermentações foram conduzidas em Verduyn-ureia suplementado com concentrações de glicose-xilose industrialmente relevantes (80 e 40 g L-1 respectivamente). Por estas fermentações RN1053-Hxt11 e RN 1041 vazio foram utilizados (ver Tabela 13).

[0482] Como mostrado na Figura 17a, xilose de RN1041 não foi co-fermentados com a glicose; enquanto o grau de co- fermentação de glicose-xilose foi melhorado na estirpe RN1053-Hxt11 como mostrado na Figura 17b. Além disso, a fermentação de xilose foi completamente exaurida em Hxt11- RN1053, ao passo que 10 g/L de xilose ainda estava permanecendo em RN1041 em 40 h; além disso, o consumo de xilose de RN1053-Hxt11 foi aumentado dramaticamente em 2% de glicose residual, e a concentração de etanol foi aumentada de 63,92 g/L a 72,33 g/L no final da fermentação (Figura 17ab).

[0483]Este exemplo mostra que uma estirpe, em que os principais transportadores de hexoses são excluídos mas expressando Hxt11, exibe xilose mais rapidamente do que a utilização de uma estirpe com um fundo de transportador de hexose do tipo selvagem sem Hxt11.

Exemplo 12 A expressão de hxt11 do tipo selvagem apoia o crescimento em xilose na triagem de contagem de atividade de transporte de glicose

[0484]Alvo. Utilizando a triagem (GTAC) de contagem de atividade de transporte de glicose, ou seja, transformando estirpe YD01227 hexoquinase-mutante como hospedeiro para introduzir transportadores e rastreio dos transformantes resultantes em meio de crescimento e no consumo de xilose na presença de uma quantidade 5 vezes mais elevados de glicose, transportadores de xilose podem ser identificados que exibem uma capacidade melhorada para transportar xilose na presença de um excesso de glicose (isto é, uma afinidade mais elevada para xilose do que para a glicose, uma redução ou eliminação total, mais preferivelmente, da capacidade de transporte de glicose, enquanto mantendo a capacidade de transporte de xilose, ao menos ao mesmo nível).

[0485]Transformação e colheita de colônia. YD01227 foi transformada com construtos carregando construtos GAL2 do tipo selvagem (pDB1250, EPA-29355;), Hxt2 (PDB1 162; ver Exemplo 9 para a construto de plasmídeo) e Hxt11 (pRS313- P7T7-Hxt11, ver para a construto Exemplo 8). Para cada transformação, 3 colônias, quando disponível, foram re- plaqueadas utilizando colheita de colônia automatizada para YNB + 3% de agar e PTMs em meio de xilose cultivadas a 30°C até o crescimento das colônias ser visível na punção de agar.

[0486]Pré-cultura e triagem. Para pré-cultura, transformantes foram transferidos pelo processo automatizado de seleção de MTPs em meio de agar para placas de 96 poços semi-fundas (96HDWP) contendo meio de seleção líquido consistindo em meio mineral (de acordo com Verduyn, com ureia como fonte de nitrogênio) suplementado com 3% de xilose. Os 96 poços HDWPs foram incubados durante 3 dias (pré-cultura) em um agitador orbital a 30°C e 750 rpm. Subsequentemente, para cada amostra, 20 μL de cultura foram transferidos para placas de 24 poços de poços profundos (24 DWPs) contendo 2,5 mL Verduyn-ureia suplementado com glicose a mistura de açúcar: xilose em uma proporção de 5:1 com as seguintes concentrações: 10 g L-1 de glicose e 2 g L- 1 de xilose (YD10-forma). Para cada um dos três pontos de amostragem, uma série de 24 DWPs bem foi inoculado. Em cada 24DWP, um RN 1001 de controle de crescimento foi inoculado para ter uma indicação de efeitos da variação da placa entre diferentes 24DWPs. Após 24 horas, 72 horas e 96 horas de amostragem automática, transferência para 96HDWP foi conduzida para medição automatizada da OD a 600 nm de comprimento de onda. Após a última medição de OD após 96 horas, as células foram sedimentadas, após a centrifugação e 100 μL do sobrenadante foi recolhido para análise de fluxo-RMN de açúcares residuais e a formação de etanol no meio, depois da incubação (ver acima para a descrição do método).

[0487]Resultados. Enquanto RN1001 exibiu crescimento de 24 horas em diante (Figura 18a) e consumo completo de glicose e xilose (Figura 18b, 18c), YD01227 transformantes que expressam GAL2, Hxt2 e Hxt11 construtos não consumem glicose (Figura 18c), devido à supressão de hexo-atividades e glucoquinase. Estas últimas estirpes também exibiram diversos perfis de crescimento (Figura 18a) ao longo do tempo e diversas concentrações de xilose residual, representando a sua capacidade individual para consumir xilose (Figura 18b), na presença de glicose. YD01227 expressando a construto Hxt11 (YD01227-Hxt11) apresentou crescimento claro às 72 horas (Figura 18-A) e consumo de xilose substancial com 4,83 ± 1,26 g L-1 (n = 3) de xilose residente no meio após 96 horas a partir da 22,7 ± 0,12 g L-1 (n = 43) presente no meio no início da experiência; YD01227-GAL2 e YD01227-Hxt2 exibiu quase nenhum crescimento e não muita xilose foi consumida em comparação com YD01227- Hxt11, com respectivamente 18,34 ± 0,39 e 21,29 ± 0,32 g L- 1 de xilose residente no médio após 96 horas de incubação (Figura 18b).

[0488]Este exemplo mostra que Hxt11 suporta a formação de biomassa considerável e consumo de xilose na presença de glicose, indicando que a expressão de Hxt11 na hexoquinase mutante YD01227 permite um componente mais específico de xilose no transporte de açúcar do que o exercido pela expressão de GAL2 ou Hxt2, ambos comprovados transportadores de xilose no transportome deS. cerevisiae (Saloheimo et al., 2007, Estudos de transporte de xilose com estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizando xilose expressando permeases homólogas e heterólogas. Appl Microbiol Biotechnol, 74: 1041 -1052; Sedlak e Ho, 2004, Caracterização da eficiência do transportadores de hexoses para o transporte de xilose durante a co-fermentação glicose e xilose por uma levedura de Saccharomyces recombinante. Yeast 21:671 -684; Hamacher et al., 2002, Caracterização das propriedades do transportadores de hexoses para o transporte de xilose durante a co- fermentação glicose e xilose por uma levedura de Saccharomyces recombinante Microbiology, 148: 2783-2788). Exemplo 13 Mutante hxt11 melhorado obtido da biblioteca propensa a erro hxt11 exibida em YD01227

[0489] Para melhorar a absorção de xilose, na presença de glicose, foi realizado PCR propensa a erro para gerar uma biblioteca mutante Hxt11 de codificação de variantes de Hxt11p, que foram rastreados para o transporte de xilose competitivo na presença de glicose na estirpe YD01227 (ver Tabela 3 aqui apresentada). A concentração de Mn2+ na mistura de reação de PCR foi de 0,15 mM, e foi adicionado seguindo o protocolo de PCR propenso a erro padrão (Cirino, PC et al., 2003. A geração de bibliotecas de mutantes utilizando PCR propensa a erros. Methods Mol. Biol., 231, páginas 3-9) utilizando iniciadores Hxt11F (SEQ ID NO: 41), e Hxt11/12R (SEQ ID NO: 43). A biblioteca foi clonada em pRS313-P7T7 como fragmentos Xbal-BamHl. A estirpe YD01227 foi transformada com a biblioteca de Hxt11 e três mil transformantes foram rastreados em meio de Verduyn-ureia suplementado com uma proporção de 1:15 de xilose (1%) e glicose (15%) em formato de placa de 96 poços, utilizando Sinergia MX (BioTek Instruments, Inc, EUA). A partir destes 3000 mutantes, oito mutantes foram obtidos pela performance de tipo selvagem Hxt11p sobre o rastreio médio. Um clone representativo foi mostrado na Figura 19a. Os plasmídeos foram isolados a partir YD01227 utilizando o protocolo de acordo com Chowdhury (Chowdhury, K. 1991. Um passo do método 'miniprep' para o isolamento de DNA de plasmídeo. Nucl Acids Res. 19, páginas 2792), e re-sequenciados. Todos os oito mutantes foram encontrados carregar um plasmídeo tendo sequências mutantes que traduzido em uma proteína contendo a mesma mutação em Hxt11 (sequência de aminoácidos de tipo selvagem Hxt11 P SEQ ID NO: 62), levam a mudança de aminoácido na posição 366 Asn (N) para Asp (D). Em experiências em balão de agitação, a N366D mutante (YD01227-mHxt11 [N366D]; ver Tabela 13) também apresentou um crescimento mais rápido no meio de triagem em comparação com YD01227-Hxt11, como mostrado na Figura 19-A. o construto pRS313-P7T7-mHxt11 (N366D) foi re-transformado em RN1053 resultando em RN1053-mHxt11 (N366D). A RN1053 expressando Hxt11-N366D mutante não foi afetada no que diz respeito à utilização de xilose em 2% de meio de xilose, em comparação com a expressão do gene RN1053 Hxt11 do tipo selvagem, uma vez que curvas de crescimento semelhantes foram observadas (Figura 19b).

[0490]Absorção de açúcar de estirpe RN1053 com Hxt11 e N366D mutante. A cinética de transporte de xilose e glicose foi determinada utilizando xilose em S. cerevisiae estirpe RN1053 expressando os transportadores Hxt11 e mHxt11p- (N366D). A taxa de transporte de xilose medida foi plotada contra glicose ou concentração de xilose. A afinidade para a glicose de RN1053-mHxt11 (N366D) foi fortemente diminuída em até 2 vezes em comparação com RN1053 Hxt1-1, enquanto que a afinidade para xilose da RN1053-mHxt11 (N366D), também foi ligeiramente diminuída até 1,2 vezes, em comparação com RN1053-Hxt11 (Figura 19c, 19d). Além disso, na presença de concentrações crescentes de estirpes que expressam o mutante de glicose N366D acumulou até 75% mais xilose em comparação com estirpes que expressam Hxt11 (Figura 19e).

[0491]Fermentação de xilose na presença de glicose. Experimentos de fermentação de misturas de açúcar foram realizados comparando RN1053-mHxt11 (N366D) com RN1053- Hxt11 e RN1041 vazio.

[0492]Em um primeiro experimento em Verduyn-ureia suplementado com 100 g/L de glicose e 60 g/L de xilose, como se mostra na Figura 19f, 19g, 19h e 19i utilizando glicose, a formação de biomassa (DO600), e a produção de etanol de RN1053-mHxt11 (N366D) foram atrasados durante a fermentação, em comparação com RN1041 e RN1053-Hxt11. Parece que o consumo de glicose pelo RN1053-mHxt11 (N366D) foi fortemente diminuído na fase exponencial inicial em comparação com RN1053-Hxt11 (Figura 19g). Além disso, o consumo de xilose da RN1053-mHxt11 (N366D) não foi reduzido (Figura 19H), embora a densidade celular de RN1053-mHxt11 (N366D) tenha sido menor do que a de RN1041 e RN1053-Hxt11 (Figura 19F).

[0493]Em um segundo experimento de fermentação em Verduyn-ureia suplementado com concentrações mais baixas de açúcar (80 g L-1 de glicose e 40 g L-1 de xilose) comparando RN1053-mHxt11 (N366D) a RN1053-Hxt11, uma clara diferença entre o perfil de consumo de açúcar foi observada (Figura 19j, 19k, 191). Enquanto o perfil de consumo de glicose exibiu uma taxa de consumo de glicose mais rápida durante a fase em que o declínio da glicose é rápido (entre 0 e 35 horas; qgluc(RN1053-HxtH) 2,22 g/L/h vs qgluc(RN1053-mHxt11)[N366D])) 2,04 g/L/h, 8,5% de diminuição em qgluc), ao passo que a taxa de consumo de xilose aumentou significativamente durante essa mesma janela de tempo (qgluc(RN1053-HxtH) de 0,23 g/L/h vs. qgluc(RN1053-mHxt11)[N366D]) de 0,38 g/L/h, 65% de inclinação em qxyl). Durante a fase em que principalmente xilose foi fermentada, (35-73 horas) as taxas de consumo de xilose foram quase idênticas (qxyl(RN1053-Hxt11) de 0,36 g/L/h vs. qxyl(RN1053-mHxt11)[N366D] de 0,37 g/L/h). A taxa de consumo de xilose máxima foi maior e atingiu mais cedo a fermentação para RN1053-mHxt11 (N366D) (0,65 g/L/h a 23 h) do que para RN1053-Hxt11 (0,50 g/L/h a 35 h). No final da corrida de fermentação (período de 72 horas típicos para fermentações industriais) a RN1053-Hxt11 consumiu 51% da xilose, enquanto RN1053 mHxt1-1 (N366D) consumiu 63%. Os títulos de etanol medidos no final da fermentação, foram de 4,4% mais elevados para o RN1053 expressando o N366D mutante do que para RN1053 expressando Hxt11 do tipo selvagem. Considerando que a entrada de açúcares para a fermentação foi quase idêntica, pode-se imaginar que os rendimentos mais elevados foram obtidos a partir desta mistura de glicose-xilose com concentrações de açúcar típicas para fermentações descontínuas industrialmente relevantes, e mais especificamente rendimentos mais elevados a partir da fração de xilose.

[0494]Estas experiências indicam de fermentação indicam que em comparação com a sua sequência de referência de tipo selvagem, na presença de uma variante de transportador específico de xilose concebida a partir de transportador de hexose de S. cerevisiae Hxt11 na membrana aumenta a taxa de consumo de xilose durante a fase de glicose, em que a taxa de consumo de glicose desce ligeiramente, e que, no final, rendimentos mais elevados de etanol foram obtidos em uma mistura típica de glicose-xilose, típico para hidrolisados industrialmente relevantes pertinentes.

Exemplo 14 O mutante de hexoquinase evoluído consume xilose na presença de glicose

[0495]Engenharia evolutiva da estirpe YD01227. Para a engenharia evolutiva, a estirpe YD01227 foi utilizada para a engenharia evolutiva em misturas de glicose-xilose a evoluir para a assimilação xilose na presença de glicose com o objetivo de isolar mutantes espontâneos no transporte de hexoses ou a regulação da expressão e/ou atividade de transporte de hexoses.

[0496]YD01227 foi inoculada durante 16 horas em frascos de agitação com Verduyn-ureia-His suplementado com 2% de xilose. No início da engenharia evolutiva, YD01227 foi diluída até um DO600 de 0,2 e DO do ponto de ajuste com 5% em Verduyn-ureia-his contendo 1% de xilose, glicose a 3%. Dióxido de carbono de saída foi monitorado. Em vários pontos de tempo foram recolhidas amostras para a análise das concentrações de glicose e xilose. Foi determinado se YD01227 estirpe estava crescendo exclusivamente em xilose ou em ambos glicose e xilose. A glicose a razão de xilose, no início da engenharia evolutiva, foi mantida para baixo a uma razão (3% de glicose, 1% de xilose), que ainda permitiu YD01227 crescimento no início da experiência. No entanto, esta foi a taxas de crescimento significativamente mais baixos se comparados com o crescimento em apenas 1% de xilose. Nesta configuração a estirpe consome a xilose, que leva a uma maior glicose: proporções de xilose e, por conseguinte, uma queda na taxa de crescimento. Quando o a produção de CO2 caiu, xilose adicional (5 mL de 50% do volume do fermentador de xilose 500 ml) foi adicionada para manter o crescimento. Em uma DO600 de 20, que foi atingida, em média, após 5-6 dias, a cultura foi diluída em fresco Verduyn-ureia-His em uma proporção de glicose mais elevada para xilose, se as taxas de crescimento tinham melhorado significativamente no ciclo anterior. No total, em um período de tempo de 27 dias, a estirpe foi diluída em série de 5 vezes em 1% de Xil/3% Glc (1:3), 1 0,5% de Xil/9% Glc (1:6), 1% de Xil/8% Glc (1:8), 1% de Xil/10% Glc (1:10) e 0,57% de Xil/10% Glc (1:15), respectivamente. Antes da inoculação, em 1% de xilose e 8% de glicose para o ponto de ajuste de OD foi reduzido para 0% (crescimento anaeróbio), a fim de manter uma taxa de crescimento inferior. Na figura 20, o esquema para a relação glicose/xilose em meio Verduyn-ureia-his durante o cultivo quimioestático (dias) de YD01227 é dado. Após 27 dias, amostras foram tiradas da estirpe YD01227 evoluída e banhadas a 1% de xilose e glicose a 10% com o YD01227 originais como controle negativo. Considerando que a YD01227 original mostrou apenas pequenas colônias, as colônias da estirpe YD01227 evoluída foram 10-15 vezes maior.

[0497]Crescimento de xilose e absorção de xilose com/sem concorrência glicose. Após re-rastreas a estirpe YD01227 evoluída em uma placa de xilose 1% e 10% de glicose, três colônias (EVOA, EvoB e Evoc) foram analisados para o crescimento em balões de agitação em 1% de xilose, na presença de, respectivamente, 0%, 3%, 6% e 10% de glicose. YD01227 EvoB teve a maior taxa de crescimento em xilose em 6% e 10% de glicose e foi comparada com a estirpe YD01227 original (Figura 21 a, 21 b). Na estirpe YD01227 inicial (YD01227 ORI na figura 21 b), a taxa de crescimento é já parcialmente inibida a 3% de glicose e inibiu completamente a 6% e 10% de glicose no entanto, a estirpe YD01227 EvoB mostra apenas inibição menor na taxa de crescimento em todas as concentrações de glicose e isto parece ser relacionado com a quantidade de glicose adicionada (Figura 21-A). As mesmas duas estirpes foram usadas em um experimento de 14C xilose (50 mM) em que a absorção de xilose é inibida por glicose (Figura 21 C). A absorção de xilose, sem a adição de glicose em ambas as estirpes é a mesma no entanto, logo que a glicose foi adicionada a ambas as estirpes a absorção de xilose na estirpe YD01227 EvoB não foi tão inibida como a absorção na estirpe YD01227 original. Em uma proporção de 1:10, a absorção de xilose na estirpe YD01227 inicial é completamente abolida enquanto que na estirpe YD01227 EvoB ainda 5 nmol/mgDW.min é retomado.

Exemplo 15 Polimorfismo de nucleotídeo único em HXT3-6 chimera permite para a xilose o consumo na presença de glicose em hexokinase mutante evoluída

[0498]Expressão dos Hxts na estirpe YD01227 evoluída. Os níveis de expressão de Hxt1-17 e GAL2 na estirpe YD01227 EvoB evoluída e YD01227 original foram comparados durante o cultivo em batelada em Verduyn-ureia-his contendo 1% de xilose e 3% de glicose (Figura 22a). Os iniciadores (SEQ ID NO: 2-37) foram utilizados na caracterização de PCR em tempo real da expressão de Hxts em YD01227 e derivado evoluído. Além disso, os níveis de expressão na estirpe YD01227 EvoB também foram analisados em Verduyn-ureia-his contendo 1% de xilose e 10% de glicose. Os valores de C absoluto (t) (dados não apresentados) demonstram que os genes Hxt1-7 são os únicos genes Hxt que são intermediários ou altamente expressos em que a quimera Hxt3-6 (supressão específica na linhagem estirpe Hxt3 intragénica e intergénica e sequências Hxt6 resultando em uma sequência quimérica Hxt36) tem os maiores níveis de expressão. Nenhum dos transportadores de açúcar analisados é sobre-regulado na estirpe YD01227 EvoB em comparação com a estirpe YD01227original. A sobre-regulação vista no gene Hxt1 na YD01227 EvoB 1% de xilose e 10% de glicose é causada pela alta concentração de glicose nessa amostra, que é bastante conhecida (Ozcan & Johnston, 1995, Três mecanismos reguladores diferentes permitem genes de transporte de hexose (Hxt) de levedura a serem induzidos por diferentes níveis de glicose. Mol Cell Biol 15, páginas 1564-1572). Esta alta concentração de glicose também leva à diminuição da regulação de Hxt2 e Hxt7 em YD01227 EvoB. Ambas a sobre- regulação em Hxt1 e supra-regulação da Hxt2 e Hxt7, são descritas na literatura (Boles & Hollenberger 1997, Caracterização cinética de transportadores de hexoses individuais de Saccharomyces cerevisiae e sua relação com os mecanismos desencadeantes da repressão por glicose, FEMS Microbiol Rev 21, páginas 85-111).

[0499]Sequenciamento dos genes Hxt altamente expressos. Hxt1-7 foram amplificados a partir de ADNc, que foi isolado a partir da cultura YD01227 EvoB em 1% de xilose e 3% de glicose, utilizando os iniciadores SEQ ID NO: 49-60. Os produtos de PCR a partir destes genes foram sequenciados. Nenhuma mutação foi revelada em Hxt1, Hxt2 e Hxt4, uma mutação silenciosa em Hxt5 e Hxt7 e uma mutação que leva ao amino ácido mudança na posição 367 (Asn na mentira; N367I) em quimera Hxt3-6. Em algum lugar na linhagem da estirpe YD01227 uma deleção ocorreu entre o loci vizinho de Hxt3 e Hxt6 em que intragênico e sequências intergênicas foram suprimidas (parte da parte 3' de Hxt3 ORF, terminador Hxt3, promotor Hxt6, Hxt6 ORF) resultando em uma sequência quimérica Hxt36 que está na moldura e pode ser expressa como ARNm e traduzida em proteína funcional. A proteína quimérica traduzida Hxt3-6p, das quais os primeiros 438 aminoácidos são idênticos aos da sequência de aminoácidos CEN.PK Hxt3p, enquanto que os 130 aminoácidos para com o terminal C são idênticos aos Hxt6p em CEN.PK. Rearranjos genômicos no locus Hxt3-6-7 têm sido documentados no passado, por exemplo, sequências quiméricas Hxt6/7 resultantes a partir de culturas em quimiostato de concentrações baixas de glicose, e são propostos serem causados por recombinação homóloga, devido aos estiramentos altamente homólogos de sequências neste conjunto de transportadores de hexoses (Brown et al 1998. Múltiplas duplicações de genes de transporte de hexoses de levedura em resposta à seleção em um ambiente limitado glicose Mol Biol Evol 15:931 -942). A mutação pontual N367I está localizado no domínio transmembranar (TMD) 8, o qual é conhecido por conter resíduos responsáveis pela afinidade para a glicose (Kasahara & Kasahara, 2003. Os segmentos transmembranares 1, 5, 7 e 8 são necessários para o transporte de glicose de alta afinidade por S. cerevisiae Hxt2 transportador Biochem J. 372:. 247-252, reconfirmada por este pedido de patente).

EXEMPLOS 16-18 MÉTODOS

[0500]Métodos não mencionados na secção de Exemplos 16 e 17 já foram descritos na seção Exemplos 6-15. Os oligonucleotídeos utilizados nos estudos descritos no Exemplo 16 e 17 estão representados na Tabela 14. A mutagênese saturada de posição N367 em Hxt36 foi feito utilizando PCR com Mistura mestra de PCR Phusion® de alta- fidelidade com tampão de HF utilizando pares de iniciadores F Hxt36 Bcul (SEQ ID NO: 127)/R Hxt36 367NNN (SEQ ID NO: 128) e F Hxt36 367NNN (SEQ ID NO: 129)/R Hxt36 BamHl (SEQ ID NO: 130). Os fragmentos de pares de bases 1119 e 1623 foram, subsequentemente, utilizados em uma sobreposição de PCR utilizando os iniciadores externos F Hxt36 Bcul e R Hxt36 BamYW e clonado utilizando pRS313P7T7 Bcul e BamHl. Sequenciamento de 48 clones de E. coli produziram N367S (tec), N367P (CCC), N367G (GGG), N367Y (tac), N367A (GEC), N367H (cac), N367R (total), N367F (TTT), N367E (gag) e N367V (GTG). Os 8 aminoácidos restantes na posição 367 foram amplificados e clonados com sobreposição de PCR utilizando iniciadores específicos, em que a NNN foi substituído por TTA (G), TGT (C), TGG (W), ATG (M), ato (t), aag (K), gat (D) e cag (Q).

[0501]As fusões de GFP do terminal carboxila com Hxt36 e Hxt36-N367I mutante foram feitas por amplificação dos genes correspondentes com a Mistura mestra de PCR Phusion® de alta-fidelidade (tampão HF) utilizando iniciadores F Hxt36 Bcul (SEQ ID NO: 127) e R Hxt36 BamHl-stop (ID SEQ NO 131). O próprio gene GFP foi amplificado com F GFP BamHl (SEQ ID NO: 132) e R GFP Clal (SEQ ID NO: 133). Hxt36 e HX736-N367I foram digerido com as enzimas de restrição Bcul e BamHl e GFP foi digerido com BamHl e Clal. Os genes foram ligados separadamente Hxt36 em uma ligação de dois fragmentos em conjunto com GFP em pRS313-P7T7 que foi cortado com Bcul e Clal.

[0502] Para as fermentações do Exemplo 18, as estirpes foram cultivadas, em duplicado, em 50 mL de frascos Schott cheios até a borda com 68 mL de meio de fermentação contendo 0,5% de D-glicose e 0,5% de D-xilose e mantida completamente fechada a 30°C em uma banho d'água. Velocidade de agitação, com um agitador magnético, foi de 200 rpm e as estirpes foram inoculadas a uma DO600 inicial de aproximadamente 8,0. A intervalos regulares foram retiradas amostras para medições de DO600 e análise por CLAE. Tabela 14. Os oligonucleotídeos utilizados na clonagem e sequenciamento.

Exemplo 16 Diminuição do Vmax de HXT3-6 N367I não é o resultado da expressão menor de mutante como demonstram os estudos de marcação de gfp

[0503] Para assegurar que esta menor Vmax não é devido a uma diminuição na expressão, foram feitas quimeras em que a GFP foi fundida com a extremidade C-terminal do Hxt36 e o mutante Hxt36-N367I. Ambas as fusões foram transformadas para a estirpe RN1053, e imagens de fluorescência revelou que as proteínas são distribuídas uniformemente sobre a membrana do plasma (fig. 23A e 23B). Uma vez que os mesmos níveis de GFP foram registrados, Hxt36p e Hxt36p-N367I são expressos em graus semelhantes. (Figura 23C). Exemplo 17 Mutagênese de saturação sobre a posição asparagina-367 in HXT3-6 chimera para a exploração do espaço de sequência revela alanina como resíduo potente no transporte melhorado com capacidade de transporte de xilose melhorada

[0504] Para explorar o espaço de sequência de posição N367 (correspondente à posição N376 na SEQ ID NO: 59), todas as substituições de aminoácidos foram introduzidas individualmente no gene Hxt36. Os mutantes individuais Hxt36-N367X foram transformados para a estirpe de eliminação YD01227 hexoquinase e testadas relativamente ao crescimento em meio mínimo contendo 1% de D-xilose e 10% de D-glicose. O transformante tendo o mutante Hxt36-N367I original mostrou uma OD 600 de 0,56 após 24 horas, enquanto que o de tipo selvagem Hxt36 foi incapaz de crescer sob estas condições (Fig. 24). O transformante de crescimento mais rápido carrega o mutante Hxt36p N367A, que atingiu um OD 600 de quase 2. Além disso, os transformantes que expressam os mutantes Hxt36 as outras substituições de aminoácidos não polares (alifático glicina, valina, leucina e metionina) que capaz de crescer em D- xilose na presença de 10% D-glicose. Por outro lado, os mutantes de fenilalanina e histidina mostraram uma taxa de crescimento reduzida forte enquanto que as substituições de aminoácidos polares e carregados não suportam o crescimento (Fig. 24). Estes dados mostram que o N367 (correspondente a N376 e N366 na Gal2p em Hxt11 P) é um resíduo crítico na determinação da especificidade para Hxt36p de glicose em função xilose.

[0505]Os mutantes Hxt36p N367A e N367I foram ainda analisados para determinar sua cinética de transportadores. Aqui, os transportadores foram expressos em RN1053 estirpe que está equipado com uma atividade de transporte de glicose baixo fundo. O Km e Vmax para a absorção de D- glicose por Hxt36 foi de cerca de 6 mM e 32 nmol/mgDW.min, respectivamente (Tabela 15 e Figura 25). Surpreendentemente, o mutante Hxt36p N367I foi completamente deficiente na absorção de D-glicose, enquanto que a afinidade para a absorção de D-xilose foi melhorada 2,7 vezes (ou seja, a partir de 108 para 40 mm) em comparação com Hxt36p (Tabela 15). A mutação, no entanto, também causou uma diminuição de perto de 3 vezes na Vmax para a absorção de D-xilose.

[0506] Também a atividade de transporte do mutante Hxt36p-N367A foi examinada que mostrou o crescimento mais rápido em D-xilose. Este transportador ainda mostrou alguma captação de glicose, embora com um Km muito pobre (171 mM contra 6 mM). Em comparação com o mutante N367I, a mutação N367A causou tanto uma melhoria dos valores de Km e Vmax de absorção de D-xilose a 25 mM e 15,3 nmol/mgDW.min, respectivamente. Exemplo 18 Co-fermentação de d-glicose e d-xilose por uma estirpe concebida de s. Cerevisiae com características de transporte alteradas

[0507]A fim de investigar a co-fermentação de D-glicose e D-xilose, a estirpe RN1053 albergando o tipo selvagem de Hxt36, Hxt36-N367l e Hxt36p-N367A, foram cultivadas em 5 gL-1 D-glicose/5 e gL-1 D-xilose, em uma maior OD 600 de partida, industrialmente relevante, de aproximadamente 8,0. O consumo de açúcar e concentrações de etanol foram seguidos ao longo do tempo (Fig. 26). A estirpe contendo o transportador Hxt36-N367l cresce em D-xilose, mas devido ao grave defeito de absorção de D-glicose (Fig. 26B), que mostra apenas um nível de fundo de consumo de D-glicose, é semelhante ao da estirpe RN1053 inicial sem qualquer transportador re-introduzido (dados não mostrados). A estirpe que alberga o mutante Hxt36-N367A mostrou um co- consumo de D-glicose e D-xilose (Fig. 26C), em comparação com a estirpe contendo o Hxt36 de tipo selvagem do transportador (Fig. 26A) melhorada. Além disso, também o consumo total de açúcar aumentado, devido à co-consumo de glicose e xilose pelo RN1053 expressando Hxt36p-N367A obtendo-se uma concentração de etanol superior (2,83 gL-1) do que RN1053 de tipo selvagem expressando Hxt36p (2,67 gL- 1) após 9 horas de fermentação. Tabela 15. valores de Km e Vmax para D-glicose e D-xilose por transportadores Hxt36p expresso na estirpe RN1053.

a Não pôde ser determinado.

EXEMPLOS 19 e 20 Material e métodos

[0508]Métodos não mencionados na seção de Exemplos 19 e 20 já foram descritas nas seções dos Exemplos 6-18. Os oligonucleotídeos utilizados nos estudos descritos no Exemplo 19 e 20 estão representados na Tabela 16.

[0509]Mutagênese de N366X. A mutagênese saturada de posição N366 em Hxt11 foi feita utilizando PCR com mistura Master de PCR Phusion® de Alta Fidelidade com tampão de HF utilizando pares de iniciadores F Hxt11 Xbal/R Hxt11 366NNN e F Hxt11 366NNN/R Hxt11 BamHI (ver Tabela 16). Os fragmentos de pares de bases 1113 e 1591 foram, subsequentemente, utilizados em uma sobreposição de PCR utilizando os iniciadores externos F Hxt11 Xbal e R Hxt11 BamHI e clonado no pRS313P7T7 utilizando Xbal e BamHI. Sequenciamento de 48 clones de E. coli produziram N367S (TCT), N367P (CCA), N367G (GGT), N367A (gcc), N367H (cac), N367R (CGC), N367L (ttg), N367C (TGT), N367T (ACG), N367D (gat), N367Q (CAA), e N367V (GTG). Os 6 aminoácidos restantes na posição 366 foram amplificados e clonados tal como acima referido, com a sobreposição de PCR utilizando iniciadores específicos, em que a NNN foi substituído por ttt (F), gag (E), tgg (W), atg (M), aaa (K), e N367Y (TAT).

[0510]Utilizando as sequências variantes de Hxt11 geradas pela mutagênese de saturação de PCR, construtos de fusão Hxt77-N366x-GFP para estudar a localização celular das variantes Hxt11 foram preparados de modo semelhante (com oligonucleotídeos, sítios de restrição e pRS313-P7T7- GFP espinha dorsal) como descrito no método para o Exemplo 10.

[0511]Experiências de fermentação. Culturas de levedura foram pré-cultivadas em meio mineral contendo 2% de maltose. As células na fase mid-exponencial foram colhidas e inoculadas, após lavagem duas vezes com água esterilizada. Fermentação experiências foram realizadas utilizando 100 mL de meio mineral contendo 7% de glicose e 4% de xilose em 120 mL frasco a 30°C, com uma DO600 inicial de 5 sob condições limitadas de oxigênio. Velocidade de agitação, com um agitador magnético, foi de 200 rpm. Todas as experiências de fermentação frasco foram repetidos de forma independente. Tabela 16. Iniciadores utilizados para mutagênese de saturação de S. cerevisiae Hxt11.

n é qualquer nucleotídeo

Exemplo 19 Mutações N366 em hxt11 melhoram utilização de xilose na presença de glicose.

[0512]A mutação N366D em Hxt11 melhorou a absorção de xilose na presença de glicose devido a uma redução na afinidade de transporte de glicose. De modo a avaliar a importância desta posição, N366 foi substituído com cada um dos outros 19 aminoácidos para gerar uma série de mutantes de N366X. Os genes correspondentes foram expressos na estirpe YD01227 e avaliados quanto à sua capacidade de utilizar 1% de xilose, na presença de 10% de glicose, utilizando placas de 96 poços. Aqui, 10% da glicose foi utilizada em vez de 15% para aumentar a sensibilidade do ensaio, a fim de discriminar entre o desempenho dos vários mutantes. As taxas de crescimento em xilose, na presença de uma dobra em 10 excesso de glicose foi melhorada quando N366 foi substituída por uma metionina (M) ou treonina (T) resíduo (Figura 21K), e foi até 3 vezes mais elevada do que a substituição N366D. Os aminoácidos com uma cadeia lateral hidrofóbica carregada positiva ou volumosos não suportar o crescimento em xilose sob a condição de triagem. Os mutantes também foram testados em relação ao crescimento em glicose e, expressos na estirpe RN1053. Os mutantes Hxt11 N366M e N366T mostraram crescimento em glicose ou semelhante, em comparação com a de tipo selvagem Hxt11 (Figura 27B e 27C). Além disso, o nível de todos os mutantes individuais expressão foi determinada utilizando 1 Hxt1 proteínas GFP (Figura 28). Todas as proteínas Hxt11- GFP foram altamente expressas na membrana, exceto que com as proteínas Hxt11-GFP N366W e N366Y, uma localização citosólica e vacuolar parece provável aparente. Isto sugere enrolamento incorreto da proteína defeituosa e direcionamento para a membrana por estes mutantes que explicam a baixa atividade nas experiências de crescimento com glicose e xilose. No entanto, o tipo selvagem e proteína Hxt1 mutante N366M e N366T localizada na membrana de plasma. No geral, estes dados indicam que o N366 é um resíduo crítico na determinação da especificidade de Hxt11 para a xilose contra glicose.

[0513]A cinética de transporte de xilose e glicose via Hxt11 e o N366T e N366M Hxt11 mutantes foi determinada para os genes expressos na xilose utilizando RN1053 de estirpe S. cerevisiae. Em comparação com Hxt11 do tipo selvagem, a afinidade para o transporte de glicose por N366T e N366M Hxt11 foi reduzido até 5 e 4 vezes, respectivamente. Em contraste, a afinidade para a xilose por estes mutantes foi melhorada em até 2 vezes (Tabela 17) em relação ao Hxt11. A Vmax para a captação de glicose pelo N366T Hxt11 mutante foi aumentada em cerca de 40% em comparação com o tipo selvagem Hxt11, enquanto o Vmax foi inalterado para a proteína N366M Hxt11. Importante, o Vmax para a xilose dos mutantes manteve praticamente inalterado em comparação com Hxt11. Tabela 17. valores de Km e Vmax para captação de D-glicose e D-xilose por transportadores Hxtls expressos na estirpe RN1053.

n.d não determinado

Exemplo 20 Co-fermentação de d-glicose e d-xilose pela concepção de estirpes de S. Cerevisiae que expressam variantes de hxt11

[0514] Por causa dos efeitos marcantes das mutações N366 em Hxt11 no transporte de glicose, sem interferir com o transporte de xilose, os mutantes foram examinadas quanto à sua capacidade para co-metabolizam xilose e glicose em condições industriais, ou seja, 7% de glicose e 4% de xilose, respectivamente. Nisto, os mutantes foram expressos na estirpe RN1053, e o crescimento foi comparado com a Hxt1 de tipo selvagem e uma estirpe RN1001 contendo um complemento completo dos transportadores endógenos. Os dois mutantes suportado um perto de co-consumo perfeito de glicose e xilose (Figura 29A e 29B) em contraste com o RN1001 estirpe (Figura 29C) e RN1053 de tipo selvagem Hxt11 (Figura 29D) e que demonstrou o prolongamento consumo de xilose. Estes dados demonstram que a mutagênese da posição de N366 Hxt11 produz mutantes que medeiam uma absorção equilibrada de glicose e xilose apoiando assim o co-consumo de hexoses e pentoses. Os melhores resultados foram obtidos para N366T mutante Hxt11. Co-consumo

[0515]A co-consumo de uma célula é, aqui, quantificado e expresso como índice de co-consumo. O índice de co- consumo foi aqui o índice de co-consumo de glicose e xilose e foi calculado como a soma ao longo do intervalo de tempo de 0-24 horas (foi medido a 0, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 horas) da diferença absoluta da taxa de captação de glicose (Qg) e a taxa de absorção de xilose (Qx), expresso em gramas de açúcar consumidos por unidade de tempo. A fermentação era um lote de fermentação de cultura anaeróbica em 1,0 g/L de levedura seca, a temperatura de 30 graus C e em que o meio de fermentação contém 71,8 gramas de glicose por litro e 40,0 gramas por litro de xilose, no início da fermentação. Um valor baixo para o índice de co- consumo indica alta co-consumo, um valor elevado menos co- consumo.

[0516]Estes dados de fermentação e cálculos para as estirpes RN1001, RN1053 Hxt11, RN1053 Hxt11 (N366M) e RN1053 Hxt11 (N366T) são apresentados na Tabela 18. Tabela 18: Dados de fermentação e cálculo do índice de co- consumo para as estirpes RN1001, RN1053 Hxt11, RN1053 Hxt11 (N366M) e RN1053 Hxt11 (N366T)

[0517]O índice de co-consumo das estirpes RN1001, RN1053 Hxt11, RN1053 Hxt11 (N366M) e RN 1053 Hxt11 (N366T) foi determinado como na Tabela 18. Em resumo, os resultados para o índice de co-consumo são apresentados na tabela 19. Tabela 19: Índice de Co-consumo de estirpes

REFERÊNCIAS 1. Ausubel et al., 1995 Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos Atuais em Biologia Molecular), John Wiley & Sons, Inc. 2. Becker J., Boles E., 2003 A modified Saccharomyces cerevisiae strain that consumes L-Arabinose and produces ethanol (Um Saccharomyces cerevisiae modificado que consome L-Arabinose e produz etanol). Appl. Environ. Microbiol. 69:4144-4150. 3. Hamacher T., Becker J., Gárdonyi M., Hahn- Hagerdal B., Boles E., 2002 Characterization of the Xilose- transporting properties of yeast hexose transporters and their influence on Xilose utilization (Caracterização das propriedades de transporte de xilose de transportadores de hexoses de levedura e sua influência sobre a utilização da xilose). Microbiology 148:2783-2788. 4. Kasahara T., Kasahara M., 2000, Three aromatic amino acid residues critical for galactose transport in yeast Gal2 transporter (Três resíduos de aminoácidos aromáticos críticos para o transporte galactose no transportador de Gal2 de levedura). J Biol Chem. 275:4422-4428. 5. Kasahara T., Maeda M., Boles E., Kasahara M., 2009, Identification of a key residue determining substrate affinity in the human glicose transporter GLUT1 (Identificação de um resíduo chave de determinação da afinidade de substrato no transportador de glicose humana GLUT1). Biochim Biophys Acta. 1788:1051-1055. 6. Kasahara T., Kasahara M., 2010, Identification of a key residue determining substrate affinity in the yeast glicose transporter Hxt7: a two-dimensional comprehensive study (Identificação de um resíduo chave na determinação da afinidade de substrato no transportador de glicose de levedura Hxt7: um estudo abrangente bidimensional). J Biol Chem. 285: 26263-26268. 7. Kuyper M., Hartog M.M., Toirkens M.J., Almering M.J., Winkler A.A., van Dijken J.P., Pronk J.T., 2005, Metabolic engineering of a Xilose-isomerase-expressing Saccharomyces cerevisiae strain for rapid anaerobic Xilose fermentation (Engenharia metabólica de uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae expressando xilose isomerase para uma rápida fermentação da xilose anaeróbia). FEMS Yeast Research 5:399-409. 8. Luttik M.A., Kotter P., Salomons F.A., van der Klei I.J., van Dijken J.P., Pronk J.T., 2000, The Saccharomyces cerevisiae ICL2 gene encodes a mitochondrial 2-metilisocitrate lyase involved in propionyl-coenzyme A metabolism (O gene ICL2 de Saccharomyces cerevisiae codifica uma liase 2-metil-isocitrato mitocondrial envolvida no metabolismo de propionil-coenzima A). Journal of Bacteriology 182:7007-7013. 9. Nelissen B., De Wachter R., Goffeau A., 1997, Classification of all putative permeases and other membrane plurispanners of the major facilitator superfamily encoded by the complete genome of Saccharomyces cerevisiae (Classificação de todas as permeases putativas e outros “plurispanners” de membrana da superfamília de facilitadores principais codificados pelo genoma completo de Saccharomyces cerevisiae). FEMS Microbiol Rev. 21:113134. 10. Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, a Laboratory Manual (Clonagem molecular, um Manual de Laboratório). 11. Schiestl R.H. e Gietz R.D., 1989, High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier (Transformação de alta eficiência de células de levedura intactas utilizando ácidos nucleicos de cadeia simples como um transportador). Current Genetics 16:339-346. 12. Wieczorke R., Krampe S., Weierstall T., Freidel K., Hollenberg C.P., Boles E., 1999. Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae (Knock-out concomitante de, pelo menos, 20 genes transportadores é necessário para bloquear a absorção de hexoses em Saccharomyces cerevisiae). FEBS Letters 464:123-128.

[0518]Young E., Poucher A., Comer A., Bailey A., Alper H., 2011, Functional survey for heterologous sugar transport proteins, using Saccharomyces cerevisiae as a host (Pesquisa funcional para proteínas de transporte de açúcar heterólogas utilizando Saccharomyces cerevisiae como um hospedeiro). Appl. Environ. Microbiol. 77:3311-3319.

Claims

1. Polipeptídeo possuindo uma ou mais substituições em uma posição correspondente à posição 339 ou 376 da SEQ ID NO: 59, CARACTERIZADO por o polipeptídeo ser um membro da superfamília de facilitadores principais (MFS), em que o polipeptídeo é polipeptídeo de permease de hexose, em que, quando a substituição é na posição correspondente a 376, o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem um volume de van der Waals de 80 a 138 Â3 e uma hidrofobicidade de cadeia lateral de 10 a 100 ΔtR, em que a substituição correspondente à posição 376 da SEQ ID NO: 59 é selecionada do grupo que consiste em N376M, N376T, N376C, N376L, N376I, N376F e N376V, e quando a substituição é na posição correspondente a 339, o aminoácido nessa posição é substituído por um aminoácido que tem uma hidrofobicidade de cadeia lateral de -30 a 10 ΔtR e um volume de van der Waals de 80 a 160 Â3, em que a substituição correspondente à posição 339 da SEQ ID NO: 59 é selecionada do grupo que consiste em M339G, M339S, M339N, M339Q, M339H, M339K, M339R e M339V.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por ter um ou mais aminoácidos correspondentes a 339N/V ou 376I/M/V.

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO por o polipeptídeo ter uma atividade de transporte de glicose reduzida em comparação com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 59.

4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO por o polipeptídeo ter uma atividade de transporte de xilose melhorada em comparação com o polipeptídeo da SED ID NO: 59.

5. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por o polipeptídeo ter atividade de transporte de glicose reduzida e atividade de transporte de xilose melhorada em comparação com o polipeptídeo tendo a SEQ ID NO: 59.

6. Polipeptídeo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO por compreender sequências que contêm um ou mais das seguintes porções de aminoácidos: a) G-r-x(3)-G-x(3)-G-x(11)-E-x(5)-[LIVM]-R-G-x(12)- [GA]; b) R-x(14)-G-x(2)-Y-x(2)-[YF]-[YF]-[GSAL]; e/ou c) V-x(15)-[GNR]-[RH]-R-x(2)-[LM]-x(2)-[GA] em que os fragmentos em (a) a (c) no polipeptídeo correspondem às posições na SEQ ID NO: 59.

7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO por compreender uma porção (a) G-R-x(3)-G-x(3)-G-x(11)-E-x(5)-[LIVM]-R-G-x(12)- [GA].

8. Polinucleotídeo CARACTERIZADO por ter a SEQ ID NO: 56, que codifica o polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Construto de ácido nucleico CARACTERIZADO por compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 8.

10. Célula hospedeira transformada com o construto de ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 9 CARACTERIZADA por ser levedura.

11. Célula hospedeira transformada, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA por pertencer ao gênero Saccharomyces, em particular à espécie Saccharomyces cerevisiae.

12. Célula hospedeira transformada CARACTERIZADA por compreender um nucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou codifica um polipeptídeo possuindo substituição M339S ou N376C da sequência ID NO: 59.

13. Célula hospedeira transformada, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA por, no polinucleotídeo, codificar um polipeptídeo que é um mutante de um polipeptídeo que é nativo na célula hospedeira não transformada.

14. Célula hospedeira transformada, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, CARACTERIZADA por o polipeptídeo que é nativo na célula hospedeira não transformada ser um membro da superfamília de facilitadores principais (MFS).

15. Célula hospedeira transformada, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, CARACTERIZADA por o polipeptídeo que é nativo na célula hospedeira não transformada ser um polipeptídeo transportador de hexose.

16. Célula hospedeira transformada, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA por o polipeptídeo que é nativo na célula hospedeira não transformada ser um polipeptídeo transportador escolhido a partir da lista que consiste em Gal2, Hxt1, Hxt2, Hxt3, Hxt4, Hxt5, Hxt6, Hxt7, Hxt8, Hxt9, Hxt10, Hxt11, Hxt12, Hxt13, Hxt14, Hxt15, Hxt16 e Hxt17.

17. Uso de um polipeptídeo possuindo substituição correspondente a N376T da SEQ ID NO: 59, como um transportador de xilose, CARACTERIZADO por o polipeptídeo ser um membro da superfamília de facilitadores principais (MFS) e em que o polipeptídeo é polipeptídeo de permease de hexose.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO por o polipeptídeo ser expresso em uma célula eucariótica e a célula eucariótica ser utilizada para fermentar xilose na presença de glicose.

19. Processo para a degradação de material lignocelulósico ou hemicelulose, CARACTERIZADO por o material lignocelulósico ou hemicelulósico ser contatado com uma composição de enzima, em que um ou mais de açúcar é produzido, e em que o açúcar produzido é fermentado para se obter um produto de fermentação, em que a fermentação é realizada com uma célula hospedeira transformada, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 16.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO por o açúcar produzido compreender xilose e glicose e em que a célula co-fermenta xilose e glicose.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO por o produto da fermentação ser um ou mais de etanol, butanol, ácido láctico, um plástico, um ácido orgânico, um solvente, um suplemento de alimentos para animais, um produto farmacêutico, uma vitamina, um aminoácido, uma enzima ou uma matéria-prima química.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO por o produto da fermentação ser um ou mais de etanol, butanol, ácido láctico, di-terpeno, di-terpeno glicosilado, um plástico, um ácido orgânico, um solvente, um suplemento de alimentos para animais, um produto farmacêutico, uma vitamina, um amino ácido, uma enzima ou uma matéria-prima química.