CN114667347A - 用于生产乙醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于生产乙醇的方法，所述方法包括用重组酵母发酵碳源组合物，其中所述碳源组合物包含至少葡萄糖和阿拉伯糖；并且其中所述重组酵母包含阿拉伯糖异构酶活性、核酮糖激酶活性、磷酸核酮糖差向异构酶活性、甘油摄取活性和甘油转换能力；并且其中所述重组酵母还包含导致具有甘油流出活性的同源蛋白的活性降低、下调、抑制和/或消除的遗传修饰；并且其中所述葡萄糖和所述阿拉伯糖中的每一者都被转换成乙醇。此外，本发明涉及一种可用于此类方法的重组酵母。

Description

用于生产乙醇的方法
技术领域
本发明涉及一种用于生产乙醇的方法。
背景技术
生物乙醇是一种补充或甚至替代基于化石的运输用燃料的可持续方式，因为它结合了低碳足迹和与当前内燃机技术的兼容性。
第一代生物乙醇与1.5代或第二代生物乙醇之间有区别。所谓的第一代工业生物乙醇生产方法例如基于水解玉米淀粉或甘蔗蔗糖的发酵。葡萄糖，一种己糖，是由此类玉米淀粉或甘蔗蔗糖水解产生的主要糖产物。这种葡萄糖随后可用酵母发酵以产生乙醇。
所谓的1.5代或第二代生物乙醇可由含纤维素和/或半纤维素的生物质生产。特别是植物生物质的级分的水解在经济上是有吸引力的。植物生物质的级分可水解成包含不同类型的游离单糖(包括己糖和/或戊糖)的水解产物。此类己糖(即六碳糖)的示例是葡萄糖。戊糖(即五碳糖)的示例包括木糖和阿拉伯糖。此外，此类水解产物可含有甘油和/或乙酸。
第二代乙醇生产中的主要挑战是包含在此类水解产物中的混合碳源(例如葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘油和/或乙酸)的发酵。
酵母是乙醇工业中选择的生物体，但是例如常用的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)不能利用生物质原料的半纤维素组分中所包含的五碳(C5)糖。半纤维素可占生物质的20-30％，其中木糖和阿拉伯糖是最丰富的五碳糖。可以对酵母进行遗传修饰以增加发酵例如五碳糖的能力，但是混合碳源组合物的转换需要多种遗传修饰，其中一种修饰可能影响另一种修饰，反之亦然。此外，对于每种不同的碳源，转换率可能不同。
另一个主要挑战是葡萄糖阻遏方面。葡萄糖阻遏是指生长在葡萄糖上的酵母细胞阻遏替代碳源的代谢所需的许多基因的表达的现象。在混合糖组合物的现有技术发酵中，酵母优先利用葡萄糖，而木糖和阿拉伯糖仅在葡萄糖几乎完全耗尽时才被使用。
US9551015描述了葡萄糖阻遏现象和从包含葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的糖组合物生产发酵产物如乙醇的方法。所述方法包括：a)在属于酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)和/或耶氏酵母属(Yarrowia)的重组酵母存在下发酵所述糖组合物，以及b)回收所述发酵产物，其中所述重组酵母包含基因araA、araB和araD，其中所述葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖中的每一这个被转换成至少一种发酵产物，例如乙醇。
尽管用US9551015中所述的酵母细胞和方法获得了商业上令人感兴趣的结果，但是期望具有戊糖如阿拉伯糖的更快和/或更完全的转换。可能还期望转换除上述糖以外的碳源，例如甘油和/或乙酸或其任何乙酸盐。
WO2015/028583描述了经遗传修饰的酵母细胞，该经遗传修饰的酵母细胞包含：a)一个或多个编码甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)的核酸序列；b)一个或多个编码二羟基丙酮激酶(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)的核酸序列，和c)一个或多个编码甘油转运体的核酸序列。此外，细胞可包含一个或多个编码NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶的核酸序列。WO2015/028583进一步描述了一种方法，该方法包括从乙酸盐和从可发酵碳水化合物—特别是选自由葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖组成的组的碳水化合物—制备发酵产物，该制备在厌氧条件下使用上述酵母细胞进行。
WO2015/028583解释说，由于乙酸往往被认为是水解产物中存在的最毒化合物，因此希望进一步降低水解产物中的乙酸盐(乙酸)浓度。提到一种增加酵母的厌氧乙酸转换潜力的方式是通过引入甘油转换途径，该甘油转换途径例如转换外部添加的甘油，从而迫使酵母细胞转换更多的乙酸来维持氧化还原平衡。
在实施例和表11中，WO2015/028583说明了特别是转化体T5，包括来源于鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycs rouxii)的甘油转运体STL1，导致相对于参照菌株更多甘油的转换。也消耗了更多的乙酸。然而，在这种T5的情况下，乙醇效价不是最高的，因为不是所有的糖都被消耗掉了。因此，尽管用WO2015/028583中描述的酵母细胞和方法获得了良好的结果，但仍有进一步改进的空间，例如在戊糖(例如木糖和/或阿拉伯糖)的转换中。
Kyung Ok Yu等人在他们发表于Journal of Biotechnology第150卷(2010)，第209-214页的题为“Reduction of glycerol production to improve ethanol yield inan engineered Saccharomyces cerevisiae using glycerol as a substrate”的文章中描述了一种经遗传修饰的酵母菌株。为了提高乙醇生产率，使天然甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶过表达，并使基因FPS1和GPD2缺失。所述菌株仅在葡萄糖上进行了测试，并且没有研究所述菌株对于混合碳源(例如还包含戊糖、甘油和/或乙酸或乙酸盐)转换的适用性。
WO2015/023989描述了一种重组微生物，所述重组微生物包含：作为组分a)的一种或多种天然和/或异源蛋白，其功能是将甘油导入重组微生物中，其中所述一种或多种天然和/或异源蛋白质被激活、上调或过表达；和作为组分b)的一种或多种天然和/或异源酶，其在一种或多种经工程化的代谢途径中起作用以将碳水化合物源转换成醇，其中所述一种或多种天然和/或异源酶被激活、上调、过表达或下调。
作为组分a)的一个示例，WO2015/023989的说明书提到了酿酒酵母甘油活性转运体，并且顺便提及了来自其他酵母(例如白假丝酵母(C.albicans)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)和毕赤酵母(Pichia sorbitophila))的一些异源转运体。对于组分b)，文中提到了几种不同的替代品。
WO2015/0023989提到重组微生物可进一步包含一种或多种天然和/或异源蛋白，其功能是从微生物输出甘油，其中所述一种或多种天然和/或异源酶可被激活、上调或下调。说明书提到FPS1是此类酶的示例。然而，在工作实施例中没有例示FPS1的激活、上调或下调，并且没有解释其功能。
WO2015/023989中例示的经遗传修饰的菌株在葡萄糖上以及葡萄糖、蔗糖和果糖的混合物上(即在甘蔗糖浆和甘蔗糖蜜上)进行测试。图17B进一步说明了经遗传修饰的菌株中的一种经遗传修饰的菌株的甘油减少，但是这种经遗传修饰的菌株的活力似乎降低了，如图17C所示。没有研究菌株用于转换混合碳原料(例如还包含戊糖和/或乙酸或乙酸盐)的适用性。
在本领域中进步的将是提供一种用于生产乙醇的酵母细胞和/或方法，所述酵母细胞和/或方法允许转换混合碳源组合物，包括葡萄糖和阿拉伯糖以及任选的非糖碳源(例如甘油和/或乙酸或其盐)。在本领域中进步的还将是提供一种允许在葡萄糖存在下增加阿拉伯糖转换的量和/或速率的酵母细胞和/或方法。在本领域中进步的还将是提供一种酵母细胞，所述酵母细胞可用于此类混合碳源组合物的转换，所述酵母细胞仍具有商业上令人感兴趣的活力。
发明内容
现已令人惊讶地发现，混合碳源组合物可以用根据本发明的方法以令人满意的方式转换。
因此，本发明提供一种用于生产乙醇的方法，所述方法包括：
用重组酵母发酵碳源组合物，
其中所述碳源组合物包含至少葡萄糖和阿拉伯糖；并且
其中所述重组酵母包含阿拉伯糖异构酶活性、核酮糖激酶活性、磷酸核酮糖差向异构酶活性、甘油摄取活性和甘油转换能力；并且
其中所述重组酵母还包含导致具有甘油流出活性的同源蛋白的活性降低、下调、抑制和/或消除的遗传修饰。
合适地，葡萄糖和阿拉伯糖中的每一者都可被转换成乙醇。此外，该方法适合在厌氧条件下进行。
上述方法令人惊讶地允许在葡萄糖存在下增加阿拉伯糖转换的量和/或速率。这可以有利地允许人们转换混合碳源组合物，包括葡萄糖和阿拉伯糖，以及任选的非糖碳源(例如甘油和/或乙酸或其盐)。
此外，本发明提供了一种重组酵母，所述重组酵母包含：编码具有阿拉伯糖异构酶活性的异源蛋白的基因；编码具有核酮糖激酶活性的异源蛋白质基因；编码具有磷酸核酮糖差向异构酶活性的异源蛋白的基因；编码具有甘油摄取活性的异源蛋白的基因；编码具有NAD+依赖性甘油脱氢酶活性的异源蛋白的基因；以及
导致具有甘油流出活性的同源蛋白的活性降低、下调、抑制和/或消除的遗传修饰。
令人惊讶的是，所述重组酵母可用于混合碳源组合物的转换，与此同时仍维持商业上令人感兴趣的活力。
如实施例中所示，根据本发明的重组酵母和方法有利地避免了葡萄糖阻遏。它们有利地允许几种碳源中的每一种碳源的转换，所述碳源包括己糖如葡萄糖、戊糖如阿拉伯糖和/或木糖、甘油和乙酸或其盐。
进一步认为，即使在厌氧条件下，根据本发明的重组酵母和方法也可以有利地允许己糖如葡萄糖和戊糖如阿拉伯糖和/或木糖的共转换。
序列表的简要说明
SEQ ID NO:1来自粟酒裂殖酵母(S.pombe)的甘油转运体的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2来自恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的甘油转运体的氨基酸序列；
SEQ ID NO:3来自斑马鱼(Danio rerio)的甘油转运体的氨基酸序列；
SEQ ID NO:4来自热带爪蟾(Xenopus tropicalis)的甘油转运体的氨基酸序列；
SEQ ID NO:5来自鲁氏接合酵母(Z.rouxii)的甘油转运体的氨基酸序列；
SEQ ID NO:6来自大肠杆菌(E.coli)的乙酰化乙醛脱氢酶(adhE)的氨基酸序列；
SEQ ID NO:7来自大肠杆菌的甘油脱氢酶gldA的氨基酸序列；
SEQ ID NO:8来自酿酒酵母的二羟基丙酮DAK1的氨基酸序列；
SEQ ID NO:9来自酿酒酵母的二羟基丙酮DAK2的氨基酸序列；
SEQ ID NO:10来自植物乳杆菌(L.plantarum)的阿拉伯糖异构酶(araA)的氨基酸序列；
SEQ ID NO:11来自植物乳杆菌的L-核酮糖激酶(araB)的氨基酸序列；
SEQ ID NO:12来自植物乳杆菌的L-核酮糖-5-P-4-差向异构酶(araD)的氨基酸序列；
SEQ ID NO:13来自大肠杆菌的乙醇胺利用蛋白(Ec_eutE)的氨基酸序列；
SEQ ID NO:14来自酿酒酵母的FPS1水甘油通道蛋白(aquaglyceroporines)的氨基酸序列。
在本专利申请的上下文中，上述蛋白质/氨基酸序列中的每一者优选地由为在酿酒酵母中表达而进行密码子对优化的DNA/核酸序列编码。此类优化可以通过本领域技术人员熟知的方法进行。
为了达到最佳表达，可以加入一种或多种启动子。启动子可以从强到弱调节，并且可包括TDH3、FBA1、ENO2、PGK1、TEF1、HTA1、HHF2、RPL8A、CHO1、RPS3、EFT2、HTA2、ACT1、PFY1、CUP1、ZUO1、VMA6和/或ANB1、HEM13、YHK8、FET4、TIR4、AAC3中的一者或多者。
具体实施方式
在整个说明书和所附权利要求书中，词语“包括(comprise)”和“包含(include)”以及诸如“包括(comprises/comprising)”和“包含(includes/including)”的变型将被包含性地解释。也就是说，在上下文允许的情况下，这些词语旨在传达可能包括未具体叙述的其他要素或整数。
冠词“一(a/an)”在本文中用于指代一个(种)或多于一个(种)(即，一个(种)或至少一个(种))该冠词的语法对象。举例来说，“要素”可以表示一个要素或多于一个要素。当以单数形式提及名词(例如化合物、添加剂等)时，意味着包括复数。因此，当提及例如“基因”之类的特定部分时，这意味着该基因中的“至少一种”，例如“至少一种基因”，除非另有说明。
当提及存在几种异构体(例如D对映体和L对映体)的化合物时，该化合物原则上包括该化合物的所有可用于本发明的特定方面的对映异构体、非对映异构体和顺式/反式异构体；特别地当提及诸如化合物时，该化合物包括天然异构体。
术语“碳源”是指碳的来源，优选是包含碳的化合物或分子。合适地，碳源可选自由以下组成的组：单糖、二糖和/或多糖、多元醇、酸和酸式盐。更优选地，碳源是选自以下组的化合物：葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、果糖、甘油和乙酸或其盐。优选地，碳源是碳水化合物。
术语“碳水化合物”在本文中被理解为由碳、氧和氢组成的有机化合物。合适地，碳水化合物可选自由以下组成的组：单糖、二糖和/或多糖、多元醇、酸和酸式盐。更优选地，碳水化合物是选自以下组的化合物：葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、果糖、甘油、糖醇以及乙酸或其盐。
术语“发酵”及其变体，例如“发酵”和/或“发酵性的”，在本文中以经典意义使用，即表示过程在厌氧条件下进行或已经在厌氧条件下进行。厌氧条件在本文中被定义为没有任何氧的条件或重组细胞(特别是重组酵母细胞)基本上不消耗氧的条件，并且合适地对应于小于5mmol/l.h-1的氧消耗，特别是小于2.5mmol/l.h-1或小于1mmol/l.h-1的氧消耗。更优选地，消耗0mmol/L/h(即，氧消耗为不可检测的)。这合适地对应于培养物发酵液中的溶氧浓度小于空气饱和度的5％，更合适地溶氧浓度小于空气饱和度的1％或小于空气饱和度的0.2％。
术语“消耗”及其变体，例如“耗费”在本文中用于表示某种饲料或饲料组分被“转换”、“利用”或“用尽”。例如，如果某种糖被酵母“消耗”，则该糖因此被“用尽”，即被酵母转换。当某些饲料组分(例如葡萄糖和阿拉伯糖)被“共消耗”时，这可以是指其中此类组分中的一种组分(例如阿拉伯糖)的至少一部分被(至少部分地)转换，而与此同时另一种组分(例如葡萄糖)的至少部分也被(至少)转换的情况。
术语“转换”、和/或“经转换的”在本文中被理解为一种化合物被(正在被)变成另一种化合物。此类转换可发生在细胞内或细胞外。
短语“共转换”和/或“经共转换的”在本文中被理解为一种化合物的至少一部分正在被转换(即正在改变)，而与此同时另一种化合物的至少一部分也正在被转换。当某些饲料组分(例如葡萄糖和阿拉伯糖)被“共转换”时，这可以是指其中此类组分中的一种组分(例如阿拉伯糖)的至少一部分被(至少部分地)转换，而与此同时另一种组分(例如葡萄糖)的至少部分也被(至少)转换的情况。优选地，此类共转换同时发生。
术语“细胞”是指优选作为单个细胞存在的真核生物或原核生物。在本发明中，重组细胞是重组酵母细胞。也就是说，重组细胞选自由酵母组成的属的组。
术语“酵母”和“酵母细胞”在本文中可互换使用，并且是指一组系统发生不同的单细胞真菌，所述单细胞真菌中的大多数为子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)。芽殖酵母(“真酵母”)被分类为酵母(Saccharomycetales)目。最优选地，重组酵母是来源于酵母属的重组酵母细胞。更优选地，重组酵母或重组酵母细胞来源于酿酒酵母物种的酵母细胞。
术语“重组的”，例如提及本文所用的“重组酵母”、“重组细胞”、“重组微生物”和/或“重组菌株”，分别是指含有作为一种或多种遗传修饰的结果的核酸的酵母、细胞、微生物或菌株。简而言之，所述酵母、细胞、微生物或菌株含有与其亲本(中的任一者)不同的核酸组合。为了构建重组酵母、细胞、微生物或菌株，可以使用重组DNA技术和/或另一种诱变技术。特别地，重组酵母和/或重组酵母细胞可包含对应的野生型酵母和/或细胞中不存在的核酸，所述核酸已经使用重组DNA技术引入到该酵母和/或酵母细胞中(即转基因酵母和/或细胞)，或者所述不存在于所述野生型酵母和/或细胞中的核酸是存在于所述野生型酵母和/或酵母细胞中的核酸序列(例如编码野生型多肽的基因)—例如使用重组DNA技术或另一种诱变技术，例如紫外照射—进行一个或多个突变的结果，或者其中基因的核酸序列已经被修饰以将多肽产物(编码该多肽产物)靶向另一个细胞区室。此外，术语“重组的”可以适当地涉及已经例如使用重组DNA技术从中去除了核酸序列的酵母、细胞、微生物或菌株。
包含或具有某种活性的重组酵母在本文中被理解为重组酵母可包含一个或多个编码具有此类活性的蛋白质的核酸序列。因此允许重组酵母功能性地表达此类蛋白质。
如本文所用的术语“转基因的”，例如提及“转基因酵母”和/或“转基因细胞”，分别是指这样的酵母和/或细胞，所述酵母和/或细胞含有非天然存在于所述酵母和/或细胞中的核酸，并且所述核酸已使用重组DNA技术引入所述酵母和/或细胞中，例如重组酵母和/或细胞。
如本文所用的关于蛋白质或多肽的术语“突变的”是指野生型或天然存在的蛋白质或多肽序列中的至少一个氨基酸已经经由对编码这些氨基酸的核酸进行诱变而被不同的氨基酸取代、插入，或从该序列中缺失。诱变是本领域中众所周知的方法，并且包括例如借助于PCR或经由寡核苷酸介导的诱变进行的定点诱变，如在Sambrook等人，MolecularCloning-A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷(1989)中所述。如本文所用的关于基因的术语“突变的”是指该基因的核酸序列或该基因的调控序列中的至少一个核苷酸已经被不同的核苷酸取代，或者已经经由诱变从该序列中缺失，从而导致对具有定性改变的功能的蛋白质序列的转录或对该基因的敲除。在本发明的上下文中，“改变的基因”具有与突变基因相同的含义。
本文所用的术语“基因”是指这样的核酸序列，所述核酸序列可转录成mRNA，然后所述mRNA被翻译成蛋白质。编码某种蛋白质的基因是指一个或多个编码此类蛋白质的核酸序列。
如本文所用的术语“核酸”是指对单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物(即多核苷酸)，并且除非另有限制，否则涵盖具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物，因为所述已知类似物以类似于天然存在的核苷酸(例如肽核酸)的方式与单链核酸杂交。多核苷酸可以是天然或异源的结构或调控基因的全长序列或子序列。除非另有说明，否则该术语包括对指定序列及其互补序列的提及。因此，具有出于稳定性或其他原因而被修饰的主链的DNA或RNA是“多核苷酸”，如该术语在本文中所用的。此外，仅举两个示例，包含不常见碱基(诸如肌苷)或经修饰的碱基(诸如三苯甲基化碱基)的DNA或RNA是如本文所使用的术语的多核苷酸。应当理解，已经对DNA和RNA进行了多种修饰，该多种修饰用于本领域技术人员已知的许多有用目的。本文采用的术语多核苷酸包括这种化学、酶促或代谢修饰形式的多核苷酸，以及病毒和细胞(尤其包括简单细胞和复杂细胞)特有的DNA和RNA的化学形式。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，用于指代氨基酸残基的聚合物。该术语适用于这样的氨基酸聚合物，在所述氨基酸聚合物中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物；以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。天然存在的氨基酸的这种类似物的基本性质是，当掺入蛋白质中时，该蛋白质对针对相同但完全由天然存在的氨基酸组成的蛋白质被激发的抗体为特异性反应的。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”还包含修饰，该等修饰包括但不限于糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP核糖基化。
当参考酶分类(EC)提及酶时，该酶分类是基于由国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union ofBiochemistry and Molecular Biology,NC-IUBMB)提供的酶命名法，酶被分类为或可分类为的类别，该命名法可在http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/处找到。还包括没有(尚未)被分类为特定类别但可如此分类的其他合适的酶。
如果在本文中通过引用登录号来提及蛋白质或核酸序列(诸如基因)，则除非另有说明，否则该数字特别地用于指代具有可经由www.ncbi.nlm.nih.gov/(在2019年11月1日可得)找到的序列的蛋白质或核酸序列(基因)。
本文中编码多肽的每个核酸序列也包括其任何经保守修饰的变体。这包括参照遗传密码，所述遗传密码描述了所述核酸的每一种可能的沉默变异。术语“经保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指由于遗传密码子的简并性而编码氨基酸序列的相同或保守修饰的变体的那些核酸。术语“遗传密码子的简并性”是指大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白质的事实。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个由密码子指定的丙氨酸位置处，可以在不改变编码的多肽的情况下将密码子改变为所述的任何对应密码子。这种核酸变异是“沉默变异”并且代表一种保守修饰的变异。
编码本文的酶的任何外源基因包含编码与任何SEQ ID NO:X具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中SEQ IDNO:X是本申请的序列表中的蛋白质序列中的任何蛋白质序列。编码酶的外源基因也可包含编码与任何SEQ ID NO:X的氨基酸序列相比具有一个或几个取代、插入和/或缺失的氨基酸序列的核苷酸序列。优选地，与SEQ ID NO:X相比，所述氨基酸序列具有不超过300个、250个、200个、150个、100个、75个、50个、40个、30个、20个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸取代、插入和/或缺失。
编码本文酶的任何外源基因包含与任何SEQ ID NO:Y具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸(DNA)序列同一性的核苷酸序列，其中SEQ ID NO:Y是本申请的序列表中的任何核苷酸(DNA)序列。
如本文所用，术语具有特定序列(例如“SEQ ID NO:X”)的多肽的“功能同源物”(或简称“同源物”)是指包含所述特定序列的多肽，前提条件是一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入，并且该多肽具有(定性地)用于底物转换的相同酶功能。该功能可以通过使用包含重组细胞的测定系统来测试，该重组细胞包含用于在酵母中表达同源物的表达载体，所述表达载体包含可操作地连接到酵母中的功能性启动子的异源核酸序列，并且所述异源核酸序列编码酶促活性为在待测试的细胞中将乙酰辅酶A转换为乙醛的同源多肽，以及评定所述转换是否发生在所述细胞中。关于核酸序列，术语功能同源物意指包括由于遗传密码子的简并性而与另一核酸序列不同但编码相同多肽序列的核酸序列。
序列同一性在本文中定义为两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。通常，在所比较的序列的全长上比较序列同一性或相似性。在本领域中，“同一性”还意指氨基酸或核酸序列(视情况而定)之间的序列相关性程度，如通过具有此类序列的链之间的匹配所确定的。
氨基酸或核苷酸序列当表现出一定的相似性水平时，被认为是同源的。两个同源的序列表示共同的进化起源。两个同源序列是密切相关还是更远距离相关由“同一性百分比”或“相似性百分比”表示，密切相关和更远距离相关分别为高或低“同一性百分比”或“相似性百分比”。尽管存在争议，但为了表示“同一性百分比”或“相似性百分比”，“同源性水平”或“同源性百分比”经常互换使用。可以使用数学算法来完成序列的比较和对两个序列之间的同一性百分比的确定。本领域技术人员将意识到以下事实：几种不同的计算机程序可用于比对两个序列并确定这两个序列之间的同源性(Kruskal,J.B.(1983)An overviewof sequence comparison，在D.Sankoff和J.B.Kruskal(编辑)，Time warps,string editsand macromolecules:the theory and practice of sequence comparison，第1-44页，Addison Wesley中)。两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法来确定。(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。该算法比对氨基酸序列以及核苷酸序列。Needleman-Wunsch算法已在计算机程序NEEDLE中实现。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS程序包的NEEDLE程序(2.8.0版或更高版本，EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)，第276-277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，使用EBLOSUM62来用于取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。可以指定其他矩阵。用于比对氨基酸序列的任选参数是空位开放罚分10和空位延伸罚分0.5。技术人员将理解，当使用不同的算法时，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但是两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。
同源性或同一性是在包括任何空位或延伸的整个比对区域上两个完整序列之间匹配的同一性百分比。两个比对序列之间的同源性或同一性计算如下：两个序列在比对中显示出相同氨基酸的对应位置的数目除以包括空位的总比对长度。如本文所定义的同一性可以从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“IDENTITY”。
两个比对序列之间的同源性或同一性计算如下：在两个序列中显示相同氨基酸的比对中对应位置的数目除以减去比对中的空位总数后的比对总长度。如本文所定义的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“最长同一性”。
本文所公开的核苷酸或氨基酸序列的变体还可以定义为与(例如，在序列表中)本文特别公开的核苷酸或氨基酸序列相比具有一个或多个取代、插入和/或缺失的核苷酸或氨基酸序列。
任选地，在确定氨基酸相似性程度时，技术人员还可以考虑所谓的“保守性”氨基酸取代，如本领域技术人员所清楚的。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。在一个实施方式中，保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代变体是这样的变体，在该等变体中已去除了所公开序列中的至少一个残基并在该至少一个残基的位置插入不同残基。优选地，氨基酸变化是保守性的。在一个实施方式中，每种天然存在的氨基酸的保守取代如下：Ala至Ser；Arg至Lys；Asn至Gln或His；Asp至Glu；Cys至Ser或Ala；Gln至Asn；Glu至Asp；Gly至Pro；His至Asn或Gln；Ile至Leu或Val；Leu至Ile或Val；Lys至Arg；Gln或Glu；Met至Leu或Ile；Phe至Met、leu或Tyr；Ser至Thr；Thr至Ser；Trp至Tyr；Tyr至Trp或Phe；以及Val至Ile或Leu。
本发明的核苷酸序列还可以按照它们分别在中等杂交条件下或优选在严格杂交条件下与本文所述的特定核苷酸序列的各部分杂交的能力来定义。严格杂交条件在本文中被定义为这样的条件，该等条件允许具有至少约25个核苷酸，优选约50个核苷酸、75个或100个核苷酸，以及最优选约200个或更多个核苷酸的核酸序列在约65℃的温度下在包含约1M盐(优选6×SSC)的溶液或具有相当离子强度的任何其他溶液中进行杂交，并在65℃下在包含约0.1M或更少的盐(优选0.2×SSC)的溶液或具有相当离子强度的任何其他溶液中洗涤。优选地，执行杂交过夜，即至少10小时，并且优选地执行洗涤至少一小时，其中洗涤溶液至少更换两次。这些条件将通常允许具有约90％或更高序列同一性的序列的特异性杂交。
中等条件在本文中定义为这样的条件，该等条件允许具有至少50个核苷酸，优选约200个或更多个核苷酸的核酸序列在约45℃的温度下在包含约1M盐(优选6×SSC)的溶液或具有相当离子强度的任何其他溶液中杂交，并在室温下在包含约1M盐(优选6×SSC)或具有相当离子强度的任何其他溶液中洗涤。优选地，执行杂交过夜，即至少10小时，并且优选地执行洗涤至少一小时，其中洗涤溶液至少更换两次。这些条件将通常允许具有高达50％序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员将能够修改这些杂交条件，以便特异性地鉴定同一性在50％至90％之间变化的序列。
“表达”是指将基因转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或信使RNA(mRNA)，随后翻译成蛋白质。“过表达”是指重组细胞对基因的表达超过所述基因在对应野生型细胞中的表达。此类过表达可以例如通过以下方式布置：增加一种或多种核酸序列的转录频率，例如通过将核酸序列可操作地连接到重组细胞内有功能的启动子上；和/或通过增加某种核酸序列的拷贝数。
与上文类似，本领域技术人员将理解，降低、下调、抑制和/或消除某种蛋白质的某种活性，意味与对应的野生型细胞相比，重组细胞中这种蛋白质的活性已被降低、下调、抑制和/或消除。
核酸序列(即多核苷酸)或蛋白质(即多肽)可以与宿主细胞的基因组同源或异源。
与宿主细胞“同源”是指核酸序列天然存在于宿主细胞的基因组中，或者蛋白质是由该细胞天然产生的。同源蛋白表达可以是例如过表达或在不同启动子控制下的表达。在本发明中，宿主细胞是酵母。
关于宿主细胞，术语“异源的”是指多核苷酸不是天然存在于宿主细胞的基因组中，或者多肽不是由该细胞天然产生的。异源蛋白表达涉及不是在宿主细胞中天然产生的蛋白质的表达。如本文所用，“异源的”可指核酸或蛋白质是源自外来物种的核酸或蛋白质，或者如果源自相同物种，则为通过刻意的人为干预而在其组成和/或基因组基因座方面相对于其天然形式发生实质性改变的。例如，与异源结构基因可操作地连接的启动子来自与该结构基因所来源于的物种不同的物种，或者如果来自相同物种，则它们中的一者或两者为相对于它们的来源形式发生实质性改变的。异源蛋白质可以源自外来物种，或者如果来自相同物种，则为通过刻意的人为干预而相对于其原始形式发生实质性改变的。
术语“异源表达”是指异源核酸在宿主细胞中的表达。异源蛋白质在诸如酵母之类的真核宿主细胞系统中的表达是本领域技术人员熟知的。包含编码具有特定活性的酶的基因的核酸序列的多核苷酸可以在这种真核系统中表达。在一些实施方式中，转化/转染的细胞可以用作用于表达酶的表达系统。异源蛋白质在酵母中的表达是众所周知的。Sherman,F.等人，Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory(1982)是描述了可用于在酵母中表达蛋白质的各种方法的公知工作。两种被广泛利用的酵母是酿酒酵母和毕赤酵母(Pichia pastoris)。用于在酿酒酵母和毕赤酵母中表达的载体、菌株和方案是本领域中已知的，并且可从商业供应商(例如，Invitrogen)获得。合适的载体通常具有表达控制序列，诸如启动子，根据需要包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶，以及复制起点、终止序列等。
如本文所用，“启动子”是指导(结构)基因转录的DNA序列。通常，启动子位于基因的5'区域中，靠近(结构)基因的转录起始位点。启动子序列可以是组成型的、诱导型的或阻抑型的。在一个实施方式中，不需要(外部)诱导物。
如本文所用的术语“载体”包括对常染色体表达载体和对用于整合到染色体中的整合载体的提及。
术语“表达载体”是指线性或环状的DNA分子，该线性或环状的DNA分子包含编码感兴趣的多肽的区段，该区段在提供用于其转录的附加核酸区段的控制下(即可操作地连接到所述附加核酸区段)。此类附加区段可包括启动子序列和终止子序列，并且可任选地包括一个或多个复制起点、一个或多个选择性标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或可含有两者的元件。具体地，表达载体包含这样的核酸序列，该核酸序列包含在5'至3'方向上并可操作地连接的以下项：(a)酵母识别的转录和翻译起始区，(b)感兴趣的多肽的编码序列，以及(c)酵母识别的转录和翻译终止区。“质粒”是指自主复制的染色体外DNA，其未整合到微生物的基因组中并且通常实质上是环状的。
“整合载体”是指线性或环状的DNA分子，该线性或环状的DNA分子可以并入到微生物的基因组中并提供编码感兴趣的多肽的基因的稳定遗传。整合载体通常包含这样的一个或多个区段，该一个或多个区段包含在提供用于基因序列转录的附加核酸区段的控制下(即可操作地连接到该等附加核酸区段)编码感兴趣的多肽的基因序列。此类附加区段可包括启动子序列和终止子序列，以及通常通过同源重组过程来驱动将感兴趣的基因并入到靶细胞基因组中的一个或多个区段。通常，整合载体将为可转移到靶细胞中的载体，但该载体具有在该生物体中无功能的复制子。如果在包含感兴趣的基因的区段内包含适当的标记，则可以选择整合该区段。
“宿主细胞”在本文中被理解为细胞，例如酵母细胞，该细胞将用一个或多个编码一种或多种异源蛋白质的核酸序列转化，以构建经转化的细胞，也称为重组细胞。例如，转化的细胞可包含载体，并且可支持该载体的复制和/或表达。
如本文所用，“转化(transformation/transforming)”是指将外源多核苷酸(即外源核酸序列)插入宿主细胞中，而不管用于该插入的方法(例如，直接摄取、转导、f-接合(f-mating)或电穿孔)如何。外源多核苷酸可以保持为非整合载体，例如质粒，或者可以整合到宿主细胞基因组中。
“破坏”在本文中被理解为任何活性破坏，包括但不限于被破坏的基因的缺失、突变和亲和力降低以及与此类被破坏的基因互补的RNA的表达。它包括所有核酸修饰，例如核苷酸缺失或取代、基因敲除，以及其他影响对应多肽的翻译或转录和/或影响酶促(特异性)活性、酶的底物特异性和/或稳定性的动作。它还包括可靶向编码序列或基因的启动子的修饰。基因缺失菌株(gene disruptant)是具有对酵母天然的相应基因的一次或多次破坏的细胞。对酵母天然的在本文中被理解为基因在破坏前存在于酵母细胞中。
术语“编码”具有与“用于编码”相同的含义。因此，举例来说，“一种或多种编码甘油脱氢酶的异源基因”具有与“一种或多种用于编码甘油脱氢酶的异源基因”相同的含义。就编码酶的基因而言，短语“一种或多种编码X的异源基因”具有与“一种或多种编码具有X活性的酶的异源基因”相同的含义，其中X表示酶。因此，举例来说，“一种或多种编码甘油脱氢酶的异源基因”具有与“一种或多种编码具有甘油脱氢酶活性的酶的异源基因”相同的含义。
缩写“NADH”是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原氢化形式。缩写“NAD+”是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化形式。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸可充当所谓的辅因子，协助细胞中的生化反应和/或转化。
NADH依赖性酶在本文中被理解为专门依赖于作为辅因子的NADH或主要依赖于作为辅因子的NADH的酶。“专门NADH依赖性”酶在本文中被理解为对NADH的绝对需求超过NADPH的酶。也就是说，它只有在NADH被作为辅因子应用时才有活性。“主要NADH依赖性”酶在本文中被理解为对作为辅因子的NADH比对作为辅因子的NADPH具有更高特异性和/或更高催化效率的酶。
该酶的特异性特征可由下式描述：
1<KmNADP+/KmNAD+<∞(无穷)
其中Km是所谓的米氏常数。
对于主要NADH依赖性酶，优选地KmNADP+/KmNAD+在1与1000之间、1与500之间、1与200之间、1与100之间、1与50之间、1与10之间、5与100之间、5与50之间、5与20之间或5与10之间。使用已知的分析技术、计算和方案，本文中酶的Km可以分别针对NAD+和NADP+被确定为酶特异性的。这些描述于例如Lodish等人，Molecular Cell Biology第6版，Freeman编著，第80页和第81页，例如图3至图22中。
对于主要NADH依赖性酶，优选地作为辅因子的NADPH/NADP+的催化效率(kcat/Km)NADP+与作为辅因子的NADH/NAD+的催化效率(kcat/Km)NAD+之比，即催化效率比(kcat/Km)NADP+:(kcat/Km)NAD+，大于1:1，更优选地等于或大于2:1，还更优选地等于或大于5:1，甚至更优选地等于或大于10:1，还甚至更优选地等于或大于20:1，甚至还更优选地等于或大于100:1，最优选地等于或大于1000:1。
不存在上限，但出于实际原因，主要NADH依赖性酶的催化效率比(kcat/Km)NADP+:(kcat/Km)NAD+可等于或小于1000000000:1(即109:1)。
“葡萄糖耐受基因”或“葡萄糖耐受核酸序列”在本文中被理解为编码酶合成的核酸序列，该核酸序列不会遭受葡萄糖失活和/或葡萄糖阻遏，或者其中葡萄糖失活或葡萄糖阻遏减少。减少在本文中优选理解为与对应的野生型细胞相比的减少。
碳源组合物
碳源组合物在本文中被理解为包含一种或多种碳源的组合物。根据本发明的碳源组合物至少包含葡萄糖和阿拉伯糖。任选地，碳源组合物可包含其他糖，例如木糖、半乳糖和/或其他糖。优选地，碳源组合物还包含甘油和/或乙酸和/或其盐。乙酸的盐在本文中也称为乙酸盐。这些不同的碳源所含的碳量可不同。例如，葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和乙酸包含约40重量％的碳，而甘油包含约39重量％的碳。产物乙醇包含约52重量％的碳。
优选地，碳源组合物衍生自包含纤维素和/或半纤维素的材料，例如木质纤维素材料。此类包含纤维素和/或半纤维素的材料可水解成水解产物，也称为纤维素和/或半纤维素水解产物。此类水解产物可含有一种或多种单糖，例如上述的葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖和/或甘露糖。此外，此类水解产物可包含除糖以外的碳源，例如甘油和/或乙酸。优选地，碳源组合物包含和/或衍生自水解产物，优选纤维素、半纤维素和/或木质纤维素水解产物。水解产物优选衍生自生物质，更优选衍生自植物生物质。
木质纤维素材料可包括纤维素、半纤维素和/或木质素。单糖可衍生自木质纤维素材料的纤维素和/或半纤维素部分。合适的木质纤维素材料可在以下列表中找到：果园底料(orchard primings)、树丛(chaparral)、磨坊废弃物(mill waste)、城市木材废弃物、市政废弃物、伐木废弃物、森林疏伐废弃物、短期轮种木本作物、工业废弃物、小麦秸、燕麦秸、水稻秸、大麦秸、黑麦秸、亚麻秸、大豆壳、稻壳、水稻秸、玉米谷蛋白饲料、燕麦壳、甘蔗、玉米秸秆、玉米杆、玉米芯、玉米纤维、玉米壳、柳枝稷、芒草、甜高粱、芸苔茎、大豆茎、草原禾草、鸭茅状摩擦禾、狐尾草；甜菜粕、柑橘果实浆、种子壳、纤维素动物粪便、草坪修剪废弃物、棉花、海藻、树木、软木材、硬木材、白杨、松树、灌木丛、草、小麦、小麦秸、甘蔗渣、玉米、玉米壳、玉米棒、玉米粒、来自玉米粒的纤维、来自谷物湿磨或干磨的产物和副产物、城市固体废弃物、废纸、庭院废弃物、草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废弃物、废纸、纸浆、造纸厂残余物、树枝、灌木、甘蔗、玉米、玉米壳、能源作物、森林、水果、鲜花、谷物、草、草本作物、树叶、树皮、针叶、原木、根、树苗、灌木丛、柳枝稷，树木、蔬菜、水果皮、藤蔓、甜菜粕、小麦麸皮、燕麦壳、硬木材或软木材、由农业加工产生的有机废弃物材料，林业木材废弃物，或它们中的任意两种或更多种的组合。包含半纤维素和/或纤维素的材料的优选示例包括玉米芯、玉米纤维、稻壳、瓜皮、甜菜浆、小麦秸秆、甘蔗渣、木材、草和橄榄压榨物。
表1中给出了衍生自包含纤维素和/或半纤维素的材料的一些合适的糖组合物及其水解产物的糖组成的概述。除了糖之外，此类水解产物还可包含甘油和/或乙酸。
表1：来自木质纤维素材料的糖组成的概述。Gal＝半乳糖，Xyl＝木糖，Ara＝阿拉伯糖，Man＝甘露糖，Glu＝谷氨酸，Rham＝鼠李糖。半乳糖的百分比(％Gal)。
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Figure BDA0003628942000000191
重组酵母
“重组酵母”在本文中也可称为“重组酵母细胞”或简称为“酵母细胞”或“宿主细胞”。已知酵母是真核微生物并且包括真菌亚门的所有物种(Yeasts:characteristics andidentification,J.A.Barnett,R.W.Payne,D.Yarrow,2000，第3版，Cambridge UniversityPress,Cambridge UK；和The yeasts,a taxonomic study,C.P.Kurtzman和J.W.Fell(编著)1998，第4版，Elsevier Science Publ.B.V.,Amsterdam,The Netherlands)，酵母主要以单细胞形式生长。酵母可通过单细胞菌体的出芽生长，或可通过生物体的分裂生长。用于本发明的优选酵母细胞属于以下属：酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、酒香酵母属(Brettanomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属、克勒克酵母属、许旺酵母属和耶氏酵母属。也就是说，优选地，所述重组酵母是来自以下属中的一个属的酵母：酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、接合酵母属、酒香酵母属、伊萨酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、克勒克酵母属、许旺酵母属和耶氏酵母属。
优选地，酵母细胞能够厌氧发酵，更优选地厌氧酒精发酵。
由于用于工业过程的酵母属物种的许多吸引人的特征，包括高耐酸性、高乙醇耐受性和高渗透压耐受性、厌氧生长能力，当然还有其高酒精发酵能力，更优选地重组酵母来自属于酵母属的酵母。更优选地，重组酵母来源于选自由以下组成的组的酵母：酿酒酵母(S.cerevisiae)、少孢酵母(S.exiguus)、贝酵母(S.bayanus)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。最优选地，重组酵母来源于酿酒酵母。
酵母细胞可以合适地充当宿主细胞，所述宿主细胞可以用一种或多种包含编码任何异源蛋白的基因的核酸构建体转化以构建重组酵母。编码任何此类异源蛋白的基因和/或核酸序列在下文逐一描述。重组酵母可包含如下文所述的活性、基因和/或核酸序列的任何合适的组合。
阿拉伯糖异构酶、核酮糖激酶和磷酸核酮糖差向异构酶
本发明中的重组酵母适当地包含阿拉伯糖异构酶(araA)活性、核酮糖激酶(araB)活性和磷酸核酮糖差向异构酶(araD)活性。
优选地，重组酵母包含：一个或多个编码具有阿拉伯糖异构酶(araA)活性的蛋白质的核酸序列；一个或多个编码具有核酮糖激酶(araB)活性的蛋白质的核酸序列；和一个或多个编码具有磷酸核酮糖差向异构酶(araD)活性的蛋白质的核酸序列。更优选地，所述重组酵母包含编码具有阿拉伯糖异构酶活性的异源蛋白的细菌基因；编码具有核酮糖激酶活性的异源蛋白的细菌基因；以及编码具有磷酸核酮糖差向异构酶活性的异源蛋白的细菌基因，从而合适地允许重组酵母功能性地表达此类蛋白质。
因此，重组酵母可为能够将L-阿拉伯糖转换成L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或所需的发酵产物如乙醇。
能够从L-阿拉伯糖生产乙醇的重组酵母，例如来源于酿酒酵母菌株的重组酵母，可以通过引入来自合适来源的araA(L-阿拉伯糖异构酶)、araB(L-核酮糖激酶)和araD(L-核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因以修饰细胞而产生。可以引入此类基因来使酵母能够使用阿拉伯糖。引入此类基因的方法是本领域中已知的，并描述于WO2003/095627、WO2011/003893和WO2011/131667中，这些文献以引用方式并入本文。优选地，可以使用来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantanum)的araA、araB和araD基因，或具有与其具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％核酸序列同一性的核酸序列的其功能同源物，如WO2008/041840中所述，该专利以引用方式并入本文。也可以使用来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的araA基因，或具有与其具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％核酸序列同一性的核酸序列的其功能同源物，以及来自大肠杆菌(Escherichia coli)的araB和araD基因，如EP1499708中所公开的，该专利以引用方式并入本文。还可能的是araA、araB和araD基因可来源于棒形杆菌属(Clavibacter)、节细菌属(Arthrobacter)和/或革兰菌属(Gramella)中的至少一种，特别是番茄细菌性溃疡病菌(Clavibacter michiganensis)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)和/或弗塞特革兰菌(Gramella forsetii)中的一种，如在WO 2009011591中所公开的。
重组酵母可包含一个或多个拷贝的araA、araB和/或araD基因。优选地，重组酵母包含2个至15个范围内，更优选3个至10个范围内的拷贝的araA、araB和/或araD基因。
优选地，araA、araB和/或araD基因被结合到重组酵母的基因组中。
重组酵母还可包含编码具有阿拉伯糖转运体(araT)活性的异源蛋白的核酸序列。
所述核酸序列可以例如包含来源于选自由以下项组成的组的生物体的araT基因：单孢神食酵母(Ambrosiozyma monospora)(LAT2)、阿拉伯糖发酵假丝酵母(Candidaarabinofermentans)、单孢神食酵母(LAT1)、马克斯克鲁维酵母(Kluveromycesmarxianus)(LAT1)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermondii(LAT1)、季也蒙毕赤酵母(LAT2)、树干毕赤酵母(Pichia stipites)、单孢神食酵母(LAT2)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hensenii)、黄曲霉(Apergillus flavus)、土曲霉(Aspergillusterreus)、费氏新萨托菌(Neosartorya fischeri)、黑曲霉(Aspergillus niger)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、波萨达斯球孢子菌(Coccidioides posadasii)、玉米赤霉(Gibberella zeae)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、裂褶菌(Schizophyllumcommune)、树干毕赤酵母、酵母属(Saccaharomyces)HXT2、棒曲霉(Aspergillus clavatus)(ACLA_032060)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)(SS1G_01302)、苯海姆节皮菌(Arthroderma benhamiae)(ARB_03323)、马发癣菌(Trichophyton equinum)(TEQG_03356)、断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)(G_04876)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)(CIMG 0.09387)、波萨达斯球孢子菌(CPSG_03942)、波萨达斯球孢子菌(CPC735_017640)、灰葡萄孢菌(Botryotinia fuckeliana)(BC1G_08389)、偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis)(PTRG_10527)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)(UM03895.1)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)(CLUG_02297)、季也蒙毕赤酵母(LAT1)、季也蒙毕赤酵母(LAT2)、汉氏德巴利氏酵母(DEHA2E01166g)、树干毕赤酵母、白假丝酵母(candida albicans)、汉氏德巴利氏酵母(DEHA2B16082g)、马克斯克鲁维酵母(LAT1)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)(KLLA-ORF 10059)、耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)(KLTH0H13728g)、范德瓦尔托霉多孢菌(Vanderwaltozymapolyspora)(Kpol_281p3)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)(ZYRO0E03916g)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(0.1833)、阿拉伯糖发酵假丝酵母(Candidaarabinofermentans)(0.1378)、单孢神食酵母(LAT1)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)(ACLA_044740)、费氏新萨托菌(Neosartorya fischeri)(NFIA_094320)、黄曲霉(Aspergillus flavus)(AFLA_116400)、土曲霉(Aspergillus terreus)(ATEG_08609)、黑曲霉(Aspergillus niger)(ANI_1_1064034)、柄篮状菌(Telaromyces stipitatus)(TSTA124770)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)(Pc20g01790)、产黄青霉菌(Pc20g01790)2号、玉米赤霉(Gibberella zeae)(FG10921.1)、赤球丛赤壳菌(Nectriahematococco)和禾生小丛壳(Glomerella graminicola)(GLRG_10740)，或这些中的任一者的功能同源物，所述功能同源物的核酸序列与这些中的任一者具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％的核酸序列同一性。
最优选地，重组酵母包含：
-编码包含本文由SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列或本文SEQ ID NO:10的功能同源物的异源蛋白的基因，所述功能同源物与本文SEQ ID NO:10具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性；和/或
-编码包含本文由SEQ ID NO:11表示的氨基酸序列或本文SEQ ID NO:11的功能同源物的蛋白的基因，所述功能同源物与本文SEQ ID NO:11具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性；和/或
-编码包含本文由SEQ ID NO:12表示的氨基酸序列或本文SEQ ID NO:12的功能同源物的蛋白的基因，所述功能同源物与本文SEQ ID NO:12具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。
重组酵母也可能包含所谓的GAL2转运体。此类GAL2转运体的优选物如WO2014195376A3中所述，该专利以引用方式并入本文。
PPP基因
本发明中的重组酵母还可包含一种或多种增加戊糖磷酸途径的通量的遗传修饰。编码这种戊糖磷酸途径的基因在本文中也被称为“PPP”基因。
在优选的宿主细胞中，遗传修饰包括(非氧化部分)戊糖磷酸途径的至少一种酶的过表达。优选地，所述酶选自由以下组成的组：编码核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶的酶。(非氧化部分)戊糖磷酸途径的酶的各种组合可被过表达。例如，过表达的酶可以至少是核酮糖-5-磷酸异构酶和核酮糖-5-磷酸差向异构酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸异构酶和转酮醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸异构酶和转醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转酮醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转醛醇酶；或至少转酮醇酶和转醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转酮醇酶。
可能核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶中的每一者都在宿主细胞中过表达。更优选的是这样的宿主细胞，在所述宿主细胞中遗传修饰至少包括转酮醇酶和转醛醇酶两者的过表达。
酶“核酮糖5-磷酸差向异构酶”(EC 5.1.3.1)在本文中被定义为催化D-木酮糖5-磷酸差向异构化为D-核酮糖5-磷酸，反之亦然的酶。这种酶也被称为磷酸核酮糖差向异构酶；赤藓糖-4-磷酸异构酶；磷酸酮戊糖3-差向异构酶；木酮糖磷酸3-差向异构酶；磷酸酮戊糖差向异构酶；核酮糖5-磷酸3-差向异构酶；D-磷酸核酮糖-3-差向异构酶；D-核酮糖5-磷酸差向异构酶；D-核酮糖-5-P 3-差向异构酶；D-木酮糖-5-磷酸3-差向异构酶；戊糖-5-磷酸3-差向异构酶；或D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶。核酮糖5-磷酸差向异构酶可由其氨基酸序列进一步定义。同样，核酮糖5-磷酸差向异构酶可以由编码该酶的核苷酸序列以及由与编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的参考核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的核苷酸序列在本文中被命名为RPE1。
酶“核酮糖5-磷酸异构酶”(EC 5.3.1.6)在本文中被定义为催化D-核糖5-磷酸直接异构化为D-核酮糖5-磷酸，反之亦然的酶。这种酶也被称为磷酸戊糖异构酶；磷酸异构酶；核糖磷酸异构酶；5-磷酸核糖异构酶；D-核糖5-磷酸异构酶；D-核糖-5-磷酸酮醇-异构酶；或D-核糖-5-磷酸醛糖-酮糖-异构酶。核酮糖5-磷酸异构酶可由其氨基酸序列进一步定义。同样，核酮糖5-磷酸异构酶可以由编码该酶的核苷酸序列以及由与编码核酮糖5-磷酸异构酶的参考核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖5-磷酸异构酶的核苷酸序列在本文中被命名为RKI1。
酶“转酮醇酶”(EC 2.2.1.1)在本文中被定义为催化以下反应的酶：D-核糖5-磷酸+D-木酮糖5-磷酸<->景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸，反之亦然。这种酶也被称为乙醇醛转移酶或景天庚酮糖-7-磷酸:D-甘油醛-3-磷酸乙醇醛转移酶。转酮醇酶可以由其氨基酸进一步定义。同样，转酮醇酶可以由编码该酶的核苷酸序列以及由与编码转酮醇酶的参考核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码转酮醇酶的核苷酸序列在本文中被命名为TKL1。
“转醛醇酶”(EC 2.2.1.2)在本文中被定义为催化以下反应的酶：景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸<->D-赤藓糖4-磷酸+D-果糖6-磷酸，反之亦然。这种酶也被称为二羟基丙酮转移酶；二羟基丙酮合酶；甲醛转酮醇酶；或景天庚酮糖-7-磷酸:D-甘油醛-3-磷酸甘油酮转移酶。转醛醇酶可由其氨基酸序列进一步定义。同样，转醛醇酶可以由编码该酶的核苷酸序列以及由与编码转醛醇酶的参考核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码转酮醇酶的核苷酸序列在本文中被命名为TAL1。
木糖异构酶或木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因
除了葡萄糖和阿拉伯糖，碳源组合物还可包含木糖。木糖是一种类似于葡萄糖和阿拉伯糖的碳源。如果碳源组合物还包含木糖，则重组酵母优选包含一个、两个或更多个拷贝的编码一种或多种具有木糖异构酶活性的蛋白质的异源基因；和/或一个、两个或更多个拷贝的编码一种或多种具有木糖还原酶活性的蛋白质的异源基因；和/或一个、两个或更多个拷贝的编码一种或多种具有木糖醇脱氢酶活性的蛋白质的异源基因。
这两种或更多种遗传元件的存在赋予重组酵母通过异构化或还原转换木糖的能力。
“木糖异构酶”(EC 5.3.1.5)在本文中被定义为催化D-木糖直接异构化为D-木酮糖和/或反之亦然的酶。该酶也称为D-木糖酮异构酶。本文中的木糖异构酶也可以能够催化D-葡萄糖与D-果糖之间的转换(并且相应地可以由此称为葡萄糖异构酶)。本文的木糖异构酶可能需要二价阳离子，例如镁、锰或钴作为辅因子。因此，包含此类木糖异构酶的重组酵母能够将木糖异构化成木酮糖。通过用包含编码限定的木糖异构酶的核苷酸序列的核酸构建体转化宿主细胞，赋予了宿主细胞将木糖异构化成木酮糖的能力。重组酵母可通过将木糖直接异构化成木酮糖而将木糖异构化成木酮糖。木糖异构酶基因可具有多种来源，例如单鞭毛菌属种属(Pyromyces sp.)，如WO2006/009434中所公开，该专利以引用方式并入本文。其他合适的来源是拟杆菌属(Bacteroides)，特别是单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)，如PCT/EP2009/52623中所述，该专利以引用方式并入本文；芽孢杆菌属(Bacillus)，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，如PCT/EP2009/052625中所述，该专利以引用方式并入本文。
也可以将两个或更多个拷贝的一种或多种木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶基因引入重组酵母的基因组中。在这种情况下，木糖的转换可以以分别由木糖还原酶和木糖醇脱氢酶催化，经由木糖醇中间体的木糖至木酮糖的两步转换进行。例如，木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XDH)和木酮糖激酶(XK)可以被过表达，并且任选地编码产生NADPH的酶的基因中的一个或多个基因被上调和/或编码消耗NADH的酶的基因中的一个或多个基因被上调，如WO 2004085627中所公开的，该专利以引用方式并入本文。
XKS1基因
本发明中的重组酵母还可包含一种或多种增加特异性木酮糖激酶活性的遗传修饰。优选地，该一种或多种遗传修饰引起木酮糖激酶的过表达，例如通过编码木酮糖激酶的核苷酸序列的过表达。编码木酮糖激酶的基因可以是对于宿主细胞内源的，或者可以是对于宿主细胞异源的木酮糖激酶。用于在本发明的宿主细胞中过表达木酮糖激酶的核苷酸序列是编码具有木酮糖激酶活性的多肽的核苷酸序列。
酶“木酮糖激酶”(EC 2.7.1.17)在本文中被定义为催化反应ATP+D-木酮糖＝ADP+D-木酮糖5-磷酸的酶。这种酶也被称为磷酸化木酮糖激酶、D-木酮糖激酶或ATP:D-木酮糖5-磷酸转移酶。本发明的木酮糖激酶可由其氨基酸序列进一步定义。同样，木酮糖激酶可以由编码该酶的核苷酸序列以及由与编码木酮糖激酶的参考核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。
增加特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰可以与如上所述的任何增加戊糖磷酸途径通量的修饰进行组合。然而，这不是必需的。
因此，本发明中的重组酵母可以仅包含一种或多种增加特异性木酮糖激酶活性的遗传修饰。本领域中可用于实现和分析木酮糖激酶在本发明的宿主细胞中的过表达的各种手段与如上上述用于戊糖磷酸途径的酶的手段相同。优选地，在本发明的宿主细胞中，与除了引起过表达的遗传修饰之外在遗传上相同的菌株相比，待过表达的木酮糖激酶被过表达至少约1.1倍、约1.2倍、约1.5倍、约2倍、约5倍、约10倍或约20倍。应当理解的是，这些过表达水平可适用于酶活性的稳态水平、酶蛋白的稳态水平以及编码该酶的转录物的稳态水平。
醛糖还原酶(GRE3)基因缺失
如果XI被用作转换木糖的基因，则降低醛糖还原酶活性可能是有利的。在这种情况下，重组酵母可包含一种或多种降低宿主细胞中的非特异性醛糖还原酶活性的遗传修饰。优选地，通过一种或多种减少编码非特异性醛糖还原酶的基因的表达或使该基因失活的遗传修饰来降低宿主细胞中的非特异性醛糖还原酶活性。优选地，所述遗传修饰减少宿主细胞中编码非特异性醛糖还原酶的每个内源拷贝的基因的表达或使该基因失活(在本文中称为GRE3缺失)。作为二倍性、多倍性或非整倍性的结果，宿主细胞可包含多个拷贝的编码非特异性醛糖还原酶的基因，和/或宿主细胞可包含几种具有醛糖还原酶活性的不同(异构)酶，所述(异构)酶在氨基酸序列上不同并且各自由不同的基因编码。此外，在这种情况下，优选地，每种编码非特异性醛糖还原酶的基因的表达被降低或该基因被失活。优选地，通过使该基因的至少部分缺失或破坏该基因来使该基因失活，由此在这种情境中，术语基因还包括编码序列上游或下游的任何非编码序列，该非编码序列的(部分)缺失或失活导致宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性的表达减少。
优选地，编码要在重组酵母中活性降低的醛糖还原酶的核苷酸序列是编码具有醛糖还原酶活性的多肽的核苷酸序列。
酶“醛糖还原酶”(EC 1.1.1.21)在本文中被定义为能够将木糖或木酮糖还原成木糖醇的任何酶。在本发明的情境中，醛糖还原酶可以是任何对于本发明的宿主细胞是天然的(内源性的)并且能够将木糖或木酮糖还原成木糖醇的非特异性醛糖还原酶。非特异性醛糖还原酶催化以下反应：
Figure BDA0003628942000000271
这种酶具有广泛的特异性，并且也被称为醛糖还原酶；多元醇脱氢酶(NADP+)；醛糖醇:NADP氧化还原酶；醛糖醇:NADP+1-氧化还原酶；NADPH-醛戊糖还原酶；或NADPH-醛糖还原酶。
此类对于酿酒酵母是内源性的并由GRE3基因编码的非特异性醛糖还原酶的具体示例(Traff等人，2001,Appl.Environ.Microbiol.67:5668-74)。因此，本发明的醛糖还原酶可以由其氨基酸序列进一步定义。同样，醛糖还原酶可以由编码该酶的核苷酸序列以及与编码醛糖还原酶的参考核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。
甘油摄取蛋白质和甘油-质子同向转运体
重组酵母适当地包含甘油摄取活性。甘油摄取活性在本文中被理解为将甘油从培养基运输到酵母细胞中的活性。
如下文详细解释的，优选地，重组酵母包含甘油-质子同向转运体活性。更优选地，重组酵母包含一个或多个编码具有甘油-质子同向转运体活性的蛋白质的核酸序列。更优选地，重组酵母包含编码具有甘油-质子同向转运体活性的异源蛋白的耐葡萄糖基因，从而适当地允许该重组酵母功能性地表达此类蛋白质。
如今，许多甘油转运体(例如通道、易化子和同向转运体)已经被鉴定、生化地表征，并且对应的基因已经被克隆(Neves，2004，以引用方式并入本文)。
如WO2015/028583中所解释的，在酿酒酵母的情况下，四种不同的基因已经与甘油转运有关(参见WO2015/028583的表4，该专利以引用方式并入本文)：FPS1、GUP1、GUP2和STL1。
由于如在WO2015/028583中解释的许多原因，这四种酿酒酵母膜蛋白中的一种酿酒酵母膜蛋白的过表达预计不会促进在发酵条件下跨越质膜摄取甘油。FPS1、GUP1和GUP2在甘油摄取中不起作用。来自酿酒酵母的STL1编码甘油-质子同向转运体，但被认为在转录水平上遭受葡萄糖阻遏，并且在蛋白质水平上遭受葡萄糖失活。
在WO2015/028583中，选择了与酿酒酵母异源的五种替代蛋白。这些作为易化子、通道、单向转运体或同向转运体的甘油转运体在具有厌氧甘油和乙酸转换途径的菌株中过表达时，都显示出导致酵母细胞中甘油摄取活性提高。
优选地，本发明中的重组酵母包含一种或多种如下表2中所列的核酸序列和/或对应蛋白质，或这些核酸序列和/或对应蛋白质中的任一者的功能同源物，所述功能同源物具有的核酸序列或氨基酸序列分别与这些核酸序列和/或对应蛋白质具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％的核酸序列同一性或氨基酸序列同一性。表3(a)至3(e)中总结了具有甘油摄取活性的合适蛋白质的具体示例及其与首先列出的蛋白质的序列同一性。
表2：优选的甘油摄取蛋白和编码此类蛋白的基因：
Figure BDA0003628942000000281
Figure BDA0003628942000000291
Figure BDA0003628942000000301
Figure BDA0003628942000000311
表3a)来自粟酒裂殖酵母的SPAC977.17和具有相似的氨基酸序列同一性的蛋白质。
Figure BDA0003628942000000312
Figure BDA0003628942000000321
表3b)来自恶性疟原虫的CAC88373和具有相似的氨基酸序列同一性的蛋白质。
Figure BDA0003628942000000322
表3c)来自斑马鱼的AQP9(NP_001171215)和具有相似的氨基酸序列同一性的蛋白质。
Figure BDA0003628942000000331
表3d)来自热带爪蟾(Xenopus tropicalus)的NP_001087946和具有相似的氨基酸序列同一性的蛋白质。
Figure BDA0003628942000000332
表3e)来自鲁氏接合酵母的ZYRO0E01210p和具有相似的氨基酸序列同一性的蛋白质。
Figure BDA0003628942000000333
Figure BDA0003628942000000341
如上所述，重组酵母优选地包含甘油-质子同向转运体活性。也就是说，重组酵母优选地包含一个或多个编码具有甘油-质子同向转运体活性的异源蛋白的核酸序列。这种甘油-质子同向转运体蛋白的一个示例是STL1蛋白。
更优选地，重组酵母包含一个或多个编码一种或多种具有甘油-质子同向转运体活性的异源蛋白的耐葡萄糖核酸序列。
因此，优选地，重组酵母包含编码包含本文由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列或本文SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的功能同源物的蛋白的基因，所述功能同源物与本文SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。
更优选地，重组酵母包含一个或多个耐葡萄糖的STL基因。最优选地，重组酵母包含一个或多个编码由SEQ ID NO:5表示的异源蛋白或SEQ ID NO:5的功能同源物的核酸序列，从而适当地允许所述重组酵母功能性地表达此类蛋白质，所述功能同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:5具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％的氨基酸序列同一性。
编码甘油摄取蛋白的核酸序列(例如基因)可以适当地结合到重组酵母的基因组中，例如如在WO2015/028583的实施例中所述，该专利以引用方式并入本文。
降低或破坏一种或多种具有甘油流出活性的同源蛋白的活性
在重组酵母中，一种或多种具有甘油流出活性的同源蛋白的活性被适当地降低、下调、抑制和/或消除。本领域技术人员将理解，与对应的亲本或野生型酵母相比，如本文所述的这种减少、下调、抑制和/或消除是合适的。甘油流出活性在本文中被理解为将甘油从细胞转运到周围培养基中，例如转运到发酵培养基中的活性。
同源蛋白质在本文中被理解为对于酵母是天然的蛋白质。
如今，许多甘油转运体(例如通道、易化子和同向转运体)已经被鉴定、生化地表征，并且对应的基因已经被克隆。
现已令人惊讶地发现，如上所述用异源蛋白引入甘油摄取活性与降低、下调、抑制和/或消除一种或多种同源蛋白的甘油流出活性的组合，可以令人惊讶地提高阿拉伯糖转换的量和速率。
如在WO2015/028583中还指出的，在酿酒酵母的情况下，四种不同的基因FPS1、GUP1、GUP2和STL1与甘油转运有关。在WO2015/028583中，提供了由FPS1、GUP1、GUP2和STL1编码的蛋白质的蛋白质功能的更详细描述，如摘自www.yeastgenome.org)
在本发明中的重组酵母中，优选降低、下调、抑制和/或消除一种或多种具有甘油流出活性的同源水甘油通道蛋白的活性。水甘油通道蛋白是介导水和小分子溶质的通量的膜通道。
更优选地，一种或多种具有甘油流出活性的同源水甘油通道蛋白的活性被降低、下调或消除。
也就是说，优选地，与亲本酵母(或野生型酵母)相比，编码此类水甘油通道蛋白的基因或核酸序列是经遗传修饰或被敲除的。这继而可适当地导致对酵母的天然水甘油通道蛋白的缺失或破坏。
最优选地，降低、下调、抑制和/或消除由FPS1编码的蛋白质(fps1)或类似蛋白质的活性。FPS1(例如来自例如酿酒酵母的FPS1基因)的核酸序列的示例可见于Van Aelst等人(1991,EMBO J.，第10卷，第2095-2104页)，并且来自包括乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母和鲁氏接合酵母在内的其它酵母的直系同源物由Neves等人(2004,FEMS Yeast Res.，第5卷，第51-62页)描述，这些文献以引用方式并入本文。
根据WO2015/023989，fps1是位于酵母(例如酿酒酵母)的质膜中的通道蛋白，其控制酵母渗透调节中甘油的积累和释放。WO2015/023989表明，这种菌株的无效突变体积累了大量的细胞内甘油并因此生长得比野生型慢得多，并且以更慢的速率消耗糖底物(参考Tamas,M.J.等人，Mol.Microbiol.57:1087-1004(1999))。然而，令人惊讶的是，发明人现已发现，对于根据本发明的方法和重组酵母，阿拉伯糖转换成乙醇的速率实际上已经得到提高。
为了降低、下调、抑制或消除一种或多种具有甘油流出活性的同源蛋白，合适的是水甘油通道蛋白，优选由FPS1基因编码的蛋白质的活性，重组酵母可包含一种或多种降低宿主细胞中(即天然酵母细胞中)的甘油流出活性的遗传修饰。
例如，可以通过一种或多种减少编码fps1蛋白的FPS1基因的表达或使该基因失活的遗传修饰来降低宿主细胞中的甘油流出活性。优选地，遗传修饰减少每个内源拷贝的FPS1基因的表达或使该基因失活(本文称为FPS1缺失)。优选地，通过使该基因的至少部分缺失或破坏该基因来使该基因失活，由此在这种情境中，术语基因还包括编码序列上游或下游的任何非编码序列，该非编码序列的(部分)缺失或失活导致宿主细胞中甘油流出活性的表达减少。
优选地，一种或多种具有甘油流出活性的同源蛋白的活性通过一种或多种编码此类同源蛋白的基因的全部或部分破坏或缺失(例如上文针对FPS1缺失所举例说明的)而被降低、下调、抑制和/或消除。然而，一种或多种具有甘油流出活性的同源蛋白质的活性也可以以不太直接的方式(例如通过使蛋白质去稳定或通过抑制基因的表达)被降低、下调、抑制和/或消除。例如，如Mollapour等人，2007所述，水甘油通道蛋白可以通过直接MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)磷酸化而去稳定化。令人惊讶的是，虽然Mollapour等人描述了对于他们的文章中描述的酵母，Fps 1的破坏下调了未解离的乙酸到细胞中的被动流入，但是本发明的实施例说明了对于根据本发明的酵母细胞，乙酸至乙醇的转换实际上得到了改善。
或者，不是缺失或破坏一种或多种编码具有甘油流出活性的蛋白质的同源基因，而是可以插入来自其他生物体的异源基因或人工核酸序列来取代此类同源基因，从而下调甘油流出活性。
最优选地，重组酵母包含遗传修饰(即，与亲本或野生型酵母相比)，从而导致包含由本文SEQ ID NO:14表示的氨基酸序列或本文SEQ ID NO:14的功能同源物的同源蛋白的缺失或破坏，该功能同源物与本文SEQ ID NO:14具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。
甘油脱氢酶
除了葡萄糖和阿拉伯糖，碳源组合物还可包含甘油。甘油是一种碳源，其碳含量与葡萄糖和阿拉伯糖相似。然而，甘油不是糖，而是所谓的多元醇。
重组酵母适当地包含甘油转换能力，在本文中也称为甘油转换活性。“甘油转换能力”或“甘油转换活性”在本文中被理解为重组酵母包含一个或多个核酸序列，该一个或多个核酸序列编码一种或多种能够转换甘油，即具有甘油转换活性的蛋白质，优选异源蛋白。此类核酸序列，优选外源核酸序列的存在允许重组酵母功能性地表达此类蛋白质。优选地，此类一种或多种能够转换甘油的异源蛋白是所谓的甘油转换途径的一部分，从而允许重组酵母将甘油转换成二羟基丙酮，该二羟基丙酮随后可通过对于酵母天然的途径转换成乙醇。
重组酵母优选包含一个、两个或多个拷贝的编码一种或多种具有甘油脱氢酶活性的异源蛋白的外源基因。因此允许重组酵母功能性地表达此类蛋白质。
具有甘油脱氢酶活性的蛋白质通常也被称为甘油脱氢酶。甘油脱氢酶可使用NAD+或NADP+作为受体。优选地，重组酵母包含一个或多个核酸序列，优选外源核酸序列，该一个或多个核酸序列编码一种或多种具有NAD+依赖性甘油脱氢酶活性的蛋白质，优选异源蛋白。也就是说，优选地，重组酵母中的甘油脱氢酶是NAD+依赖性甘油脱氢酶(EC1.1.1.6)，也称为NAD+连接的甘油脱氢酶。
NAD+依赖性甘油脱氢酶是一种催化以下化学反应(I)的酶：
Figure BDA0003628942000000371
这种酶的其他常用名称包括甘油脱氢酶和甘油:NAD+2-氧化还原酶。glyceron的另一个常用名称是二羟基丙酮。
由内源性酵母GCY1基因编码的甘油脱氢酶似乎对辅因子NADP+(EC1.1.1.72)而不是NAD+(EC 1.1.1.6)具有特异性。酵母(例如酿酒酵母)似乎缺乏NAD+依赖性甘油脱氢酶活性(1.1.1.6)(参见例如KEGG途径00561)。因此，优选地，重组酵母包含一个或多个核酸序列，该一个或多个核酸序列编码一种或多种具有NAD+依赖性甘油脱氢酶活性的异源蛋白。所述重组酵母优选包含在酵母细胞中引入NAD+依赖性甘油脱氢酶活性的遗传修饰。这可以允许对重组酵母异源的NAD+依赖性甘油脱氢酶的表达。
优选地，用于在重组酵母中表达异源甘油脱氢酶的核酸序列是编码使用NAD+作为辅因子的细菌甘油脱氢酶(EC 1.1.1.6)的核酸序列。
用于在本发明的重组酵母中表达的细菌NAD+依赖性甘油脱氢酶的合适示例是在大肠杆菌中表达的NAD+依赖性甘油脱氢酶，例如由Truniger和Boos(1994,JBacteriol.176(6):1796-1800)所述的来自大肠杆菌的gldA基因，已经报道了其在酵母中的表达(Lee和Dasilva，2006,Metab Eng.8(1):58-65)。
更优选地，重组酵母中编码异源甘油脱氢酶的核酸序列是编码与来自大肠杆菌的gldA、来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的gldA、来自产气肠杆菌(Enterococcus aerogenes)的gldA或来自阿氏耶尔森氏菌(Yersinia aldovae)的gldA具有至少45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
最优选地，编码异源甘油脱氢酶的核酸序列包含编码与SEQ ID NO:7具有至少45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核酸序列，或者编码与SEQ ID NO:7相比具有一个或几个取代、插入和/或缺失的氨基酸序列的核酸序列。在一个优选实施方式中，编码异源甘油脱氢酶的经密码子优化的(参见上文)核酸序列，例如编码SEQ ID NO:7的甘油脱氢酶的氨基酸序列的经密码子优化的核酸序列，被过表达。
为了过表达编码甘油脱氢酶的核酸序列，可以将(待过表达的)核酸序列置于表达构建体中，在该表达构建体中该核酸序列可操作地连接到合适的表达调控区/序列以确保在将表达构建体转化到重组酵母中时过表达甘油脱氢酶。用于(过)表达用于编码具有甘油脱氢酶活性的酶的核酸序列的合适启动子包括优选对分解代谢物(葡萄糖)阻遏不敏感的启动子、在厌氧条件下具有活性的启动子和/或优选不需要木糖或阿拉伯糖诱导的启动子。上面给出了此类启动子的示例。核酸序列在重组酵母中的表达优选产生至少0.2、0.5、1.0、2.0或5.0U min-1(mg蛋白)-1的特异性NAD+连接的甘油脱氢酶活性，如于30℃在转化的酵母细胞的细胞提取物中测定的。
合适的甘油脱氢酶的其它示例在表4(a)至表4(d)中列出。在每张表的顶部指示了特定的甘油脱氢酶，例如在表4(a)中列出了来源于大肠杆菌的甘油脱氢酶(gldA)。对于每个表中的其他示例，指示了与首个列出的示例的氨基酸序列同一性。
表4(a)：来自大肠杆菌的gldA和具有相似的氨基酸序列同一性的甘油脱氢酶。
Figure BDA0003628942000000391
表4(b)：来自肺炎克雷伯氏菌的gldA和具有相似的氨基酸序列同一性的甘油脱氢酶。
Figure BDA0003628942000000392
Figure BDA0003628942000000401
表4(c)：来自产气肠杆菌的gldA和具有相似的氨基酸序列同一性的甘油脱氢酶。
Figure BDA0003628942000000402
表4(d)：来自阿氏耶尔森氏菌的gldA和具有相似的氨基酸序列同一性的甘油脱氢酶。
Figure BDA0003628942000000403
Figure BDA0003628942000000411
二羟基丙酮激酶
优选地，重组酵母还包含一个或多个编码一种或多种具有二羟基丙酮激酶活性的蛋白质的核酸序列。
二羟基丙酮激酶是一种催化以下化学反应(II)的酶：
Figure BDA0003628942000000412
这种酶的其他常用名称包括甘油酮激酶、ATP:甘油酮磷酸转移酶和(磷酸化)丙酮醇激酶。甘油的另一个常用名称是二羟基丙酮。
重组酵母可能已包含同源的二羟基丙酮激酶，即对于酵母是天然的。转录组数据已显示，内源性DAK1二羟基丙酮激酶已经在酿酒酵母中高水平表达。因此，本发明的细胞中的二羟基丙酮激酶活性的进一步增加可能不是绝对必要的。然而，在一个优选实施方式中，为了最佳的转换率，本发明的酵母细胞可包含增加细胞中二羟基丙酮激酶的比活性的遗传修饰。优选地，此类遗传修饰引起二羟基丙酮激酶的过表达，例如通过过表达编码二羟基丙酮激酶的核酸序列。
编码二羟基丙酮激酶的核酸序列可以是对于细胞内源的，或者可以是编码对于细胞外源的二羟基丙酮激酶的核酸序列。可用于在本发明的细胞中过表达二羟基丙酮激酶的核苷酸序列是例如来自例如由Molin等人(2003,J.Biol.Chem.278:1415-1423)描述的酿酒酵母(DAK1)和(DAK2)的二羟基丙酮激酶基因。
更优选地，编码本发明的酵母细胞中的异源甘油脱氢酶的核酸序列是编码与来自酿酒酵母的DAK1、来自肺炎克雷伯氏菌的dhaK、来自解脂耶氏酵母的DAK1或来自粟酒裂殖酵母的DAK1具有至少45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。还更优选地，重组酵母包含酿酒酵母的DAK1和/或DAK2。
最优选地，编码二羟基丙酮激酶的核酸序列包含与SEQ ID NO:8(酿酒酵母的DAK1)和SEQ ID NO:9(酿酒酵母的DAK2)中的至少一者具有至少45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一个优选实施方式中，编码二羟基丙酮激酶的经密码子优化的(参见上文)核酸序列，例如编码SEQ ID NO:8所示的二羟基丙酮激酶的经密码子优化的核酸序列或编码SEQID NO:9所示的二羟基丙酮激酶的经密码子优化的核酸序列，被过表达。用于过表达二羟基丙酮激酶的优选核酸序列是编码包含与SEQ ID NO:8(酿酒酵母(DAK1))中的至少一者具有至少45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性或与SEQ ID NO:8相比具有一个或多个取代、插入和/或缺失的氨基酸序列的二羟基丙酮激酶的核酸序列。
可用于在本发明的细胞中过表达异源二羟基丙酮激酶的核苷酸序列是例如编码细菌二羟基丙酮激酶的序列，例如由Daniel等人(1995,J.Bacteriol.177:4392-4401)描述的来自弗氏柠檬酸杆菌的dhaK基因。优选地，编码异源二羟基丙酮激酶的核酸序列包含编码与SEQ ID NO:8具有至少45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核酸序列，或者编码与SEQ ID NO:8相比具有一个或几个取代、插入和/或缺失的氨基酸序列的核酸序列。在一个优选实施方式中，编码异源二羟基丙酮激酶的经密码子优化的(参见上文)核酸序列，例如编码SEQ ID NO:8的二羟基丙酮激酶的氨基酸序列的经密码子优化的核酸序列，被过表达。
为了过表达编码二羟基丙酮激酶的核酸序列，将该(待过表达的)核酸序列置于表达构建体中，在该表达构建体中该核酸序列可操作地连接到合适的表达调控区/序列，以确保在将表达构建体转化到本发明的酵母细胞(参见上文)中后过表达二羟基丙酮激酶。用于(过)表达用于编码具有二羟基丙酮激酶活性的酶的核酸序列的合适启动子包括优选对分解代谢物(葡萄糖)阻遏不敏感的启动子、在厌氧条件下具有活性的启动子和/或优选不需要木糖或阿拉伯糖诱导的启动子。上面给出了此类启动子的示例。在本发明的细胞中，除了基因修饰引起过表达外，与遗传上相同的菌株相比，将要被过表达的二羟基丙酮激酶优选过表达至少1.1、1.2、1.5、2、5、10或20倍。优选地，除了基因修饰引起过表达外，与遗传上相同的菌株相比，二羟基丙酮激酶在厌氧条件下过表达至少1.1、1.2、1.5、2、5、10或20倍。应理解，这些过表达水平可适用于酶活性(细胞中的比活性)的稳态水平、酶蛋白的稳态水平，并且适用于用于编码细胞中的酶的转录物的稳态水平。该核酸序列在酵母细胞中的过表达产生至少0.002、0.005、0.01、0.02或0.05U min-1(mg蛋白质)-1的特异性二羟基丙酮激酶活性，如于30℃在转化的酵母细胞的细胞提取物中测定的。
合适的二羟基丙酮激酶的其它示例在表5(a)至表5(d)中列出。在每张表的顶部指示了特定的二羟基丙酮激酶，例如在表5(a)中列出了来自酿酒酵母的DAK1。对于每个表中的其他示例，指示了与首个列出的示例的氨基酸序列同一性。
表5(a)：来自酿酒酵母的DAK1和具有相似的氨基酸序列同一性的二羟基丙酮激酶。
Figure BDA0003628942000000431
表5(b)：来自肺炎克雷伯氏菌的dhaK和具有相似的氨基酸序列同一性的二羟基丙酮激酶。
Figure BDA0003628942000000441
表5(c)：来自解脂耶氏酵母的DAK1和具有相似的氨基酸序列同一性的二羟基丙酮激酶。
Figure BDA0003628942000000442
表5(d)：来自粟酒裂殖酵母的DAK1和具有相似的氨基酸序列同一性的二羟基丙酮激酶。
Figure BDA0003628942000000443
Figure BDA0003628942000000451
辅因子平衡
厌氧条件下的甘油生产主要与酵母细胞的NAD+/NADH辅因子平衡有关。在例如酿酒酵母的厌氧生长期间，经由醇发酵而发生糖异化。在该方法中，在糖酵解甘油醛-3-磷酸脱氢酶反应中形成的NADH可通过转换乙醛而被再氧化，该乙醛是经由NAD+依赖性醇脱氢酶将丙酮酸脱羧成乙醇而形成的。当在代谢中的其他地方发生NAD+至NADH的净还原时，该氧化还原-中性异化途径的固定化学计量引起问题。
在厌氧条件下的常规方法中，酿酒酵母中的NADH再氧化严格依赖于将糖还原成甘油。甘油形成通过将糖酵解中间体磷酸二羟丙酮还原成甘油3-磷酸而引发，该还原是由NADH依赖性甘油3-磷酸脱氢酶催化的反应。随后，在该反应中形成的甘油3-磷酸被甘油-3-磷酸酶水解，以得到甘油和无机磷酸盐。当这种甘油不被转运出酵母细胞，而是被例如NAD+依赖性甘油脱氢酶转换成二羟基丙酮时，这可能导致NAD+/NADH辅因子失衡。
在根据本发明的酵母细胞中，这种潜在的NAD+/NADH辅因子失衡优选通过将一个或多个编码异源NADH氧化酶或NADH氧化途径的核酸序列引入酵母细胞来解决。因此，优选地，重组酵母还包含一个或多个编码异源NADH氧化酶或酶促途径的核酸序列。
优选地，碳源组合物还包含乙酸或其盐；并且优选地，重组酵母还包含：编码具有乙酰辅酶A合酶活性的异源蛋白的基因；和/或
编码具有乙酰化乙醛脱氢酶活性的异源蛋白的基因，并且优选地乙酸或其盐被转换成乙醇。
更优选地，重组酵母包含一个或多个编码一种或多种具有异源乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的核酸序列，合适地为外源核酸序列；
优选地，根据本发明的酵母细胞包含一个或多个编码具有将乙酰辅酶A还原成乙醛的能力的蛋白质的外源核酸序列，该基因赋予细胞将乙酰辅酶A(和/或乙酸)转换成乙醇的能力。具有将乙酰辅酶A还原成乙醛的能力的酶在本文中被理解为催化以下反应的酶(ACDH；EC 1.2.1.10)：
Figure BDA0003628942000000461
因此，所述酶催化将乙酰辅酶A转换成乙醛(反之亦然)，并且也被称为(乙酰化NAD依赖性)乙醛脱氢酶或乙酰辅酶A还原酶。该酶可以是进一步催化将乙醛转换成乙醇的双功能酶(反之亦然；参见下文)。
为方便起见，我们在本文中将至少具有将乙酰辅酶A还原成乙醛或乙醇的能力的酶称为“乙醛脱氢酶”。此处还应理解的是，细胞具有内源性醇脱氢酶活性，这使得具有乙醛脱氢酶活性的细胞能够完成乙酰辅酶A至乙醇的转换。此外，该细胞具有内源性或外源性乙酰辅酶A合酶，该酶允许具有乙醛脱氢酶活性的细胞完成乙酸(通过乙酰辅酶A)至乙醇的转换。
外源基因可编码仅具有乙醛脱氢酶活性的单功能酶(即仅具有将乙酰辅酶A还原成乙醛的能力的酶)，例如由大肠杆菌mhpF基因编码的乙醛脱氢酶。表6中提供了包含具有乙醛脱氢酶活性的单功能酶的原核生物的合适示例。这些单功能酶的氨基酸序列可在公共数据库中获得，并且可由技术人员用来设计编码对应的单功能酶的经密码子优化的核苷酸序列。
表6：具有乙醛脱氢酶活性的合适的酶和与大肠杆菌mhpF的同一性
Figure BDA0003628942000000462
Figure BDA0003628942000000471
在一个实施方式中，重组酵母包含编码具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶的外源基因，该基因赋予细胞将乙酰辅酶A转换成乙醇的能力。使用具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶而不是针对乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性中的每一者的单独酶的优点在于，其允许在催化途径中的连续反应的酶之间直接引导中间体，提供了有效、唯一和受保护的代谢物递送手段的可能性。因此，底物通道减少了中间体的传输时间，防止中间体因扩散而损失，保护不稳定的中间体免受溶剂影响，并阻止中间体进入竞争性代谢途径。因此，与单独的乙醛脱氢酶和醇脱氢酶相比，双功能酶允许更有效地将乙酰辅酶A转换成乙醇。使用双功能酶的另一个优点是，它也可以用于在所用条件(例如厌氧条件和/或分解代谢物阻遏条件)下具有很少或没有醇脱氢酶活性的细胞中。
具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶在原核生物和原生动物领域中是已知的，包括例如由大肠杆菌adhE和痢疾变形虫(Entamoeba histolytica)ADH2基因编码的双功能酶(参见例如Bruchaus和Tannich，1994,J.Biochem.303:743-748；Burdette和Zeikus,1994,J.Biochem.302:163-170；Koo等人，2005,Biotechnol.Lett.27:505-510；Yong等人，1996,Proc Natl Acad Sci USA,93:6464-6469)。具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶是由约900个氨基酸组成的较大蛋白质，并且它们是双功能的，因为它们表现出乙醛脱氢酶(ACDH；EC 1.2.1.10)活性和醇脱氢酶(ADHEC 1.1.1.1)活性两者。大肠杆菌adhE和痢疾变形虫ADH2显示出45％的氨基酸同一性。
表7：具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的合适双功能酶以及与大肠杆菌adhE的同 一性
Figure BDA0003628942000000481
Figure BDA0003628942000000491
表8：具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的合适双功能酶以及与痢疾变形虫ADH2的 同一性
Figure BDA0003628942000000492
为了表达编码具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶或具有乙醛脱氢酶活性的酶的核苷酸序列，将(待表达的)核苷酸序列置于表达构建体中，在该表达构建体中该核苷酸序列可操作地连接到合适的表达调控区/序列，以确保在表达构建体转化到本发明的细胞中时酶的表达(参见上文)。用于表达编码具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶或具有乙醛脱氢酶活性的酶的核苷酸序列的合适启动子包括优选对分解代谢物(葡萄糖)阻遏不敏感、在厌氧条件下有活性和/或优选不需要木糖或阿拉伯糖进行诱导的启动子。上面给出了此类启动子的示例。
优选地，编码具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶或具有乙醛脱氢酶活性的酶的核苷酸序列适于针对所讨论的细胞的密码子使用来优化该核苷酸序列的密码子使用(如上所述)。
优选地，重组酵母包含编码大肠杆菌adhE的外源基因，从而允许此类蛋白质在重组酵母中功能性地表达。
能够催化乙酰辅酶A至乙醛的NADH依赖性还原的已知NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶通常可以分为三种类型的NADH依赖性乙酰化乙醛脱氢酶功能同源物：
1)催化乙酰辅酶A可逆转换为乙醛，以及随后乙醛可逆转换为乙醇的双功能蛋白。此类蛋白质的示例是大肠杆菌中的AdhE蛋白质(GenBank编号：NP-415757)。AdhE似乎是基因融合的进化产物。AdhE蛋白的NH2末端区域与醛:NADH氧化还原酶高度同源，而COOH末端区域与Fe2+依赖性乙醇:NADH氧化还原酶家族同源(Membrillo-Hernandez等人，(2000)J.Biol.Chem.275:33869-33875)。大肠杆菌AdhE经受金属催化氧化，因此对氧敏感(Tamarit等人，(1998)J.Biol.Chem.273:3027-32)。
2)在严格或兼性厌氧微生物中催化将乙酰辅酶A可逆转换成乙醛但不具有醇脱氢酶活性的蛋白质。在克氏梭菌(Clostridium kluyveri)中已经报道了这种类型的蛋白质的示例(Smith等人，(1980)Arch.Biochem.Biophys.203:663-675)。在克氏梭菌DSM 555(GenBank编号：EDK33116)的基因组中已经注释了乙酰化乙醛脱氢酶。在植物乳杆菌的基因组中标识了同源蛋白质AcdH(GenBank编号：NP-784141)。这种类型的蛋白质的另一个示例是在拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRL B593中的所述基因产物(Toth等人，(1999)Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980,GenBank编号：AAD31841)。
3)是参与4-羟基-2-酮戊酸酯分解代谢的双功能醛缩酶-脱氢酶复合物的部分的蛋白质。此类双功能酶催化儿茶酚的间位切割途径的最后两个步骤，儿茶酚是许多细菌物种中酚类、甲苯甲酸酯、萘、联苯和其他芳香族化合物降解的中间体(Powlowski和Shingler(1994)Biodegradation 5,219-236)。首先通过4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶将4-羟基-2-酮戊酸转换成丙酮酸和乙醛，随后通过乙酰化乙醛脱氢酶将乙醛转换成乙酰辅酶A。这种类型的乙酰化乙醛脱氢酶的示例是假单胞菌属(Pseudomonas sp.)CF600中的DmpF蛋白质(GenBank编号：CAA43226)(Shingler等人，(1992)J.Bacteriol.174:711-24)。大肠杆菌MphF蛋白质(Ferrandez等人，(1997)J.Bacteriol.179:2573-2581,GenBank编号：NP-414885)与假单胞菌属CF600中的DmpF蛋白质同源。
合适的核酸序列可以尤其存在于选自由以下项组成的组的生物中：埃希氏菌属(Escherichia)，尤其是大肠杆菌；分支杆菌属(Mycobacterium)，尤其是海鱼分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)，尤其是高温嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)；内变形虫属(Entamoeba)，尤其是痢疾变形虫(Entamoeba histolytica)；志贺氏菌属(Shigella)，尤其是宋内志贺菌(Shigellasonnei)；伯克霍尔德菌属(Burkholderia)，尤其是类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，尤其是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)；固氮菌属(Azotobacter)，尤其是棕色固氮菌(Azotobacter uinelandii)；固氮弓菌属(Azoarcus sp)；贪铜菌属(Cupriauidus)，尤其是台湾贪铜菌(Cupriauidustaiwanensis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，尤其是假单胞菌属(Pseudomonas sp.)CF600；丙酸氧化菌(Pelomaculum)，尤其是嗜热丙酸氧化菌(Pelotomaculumthermopropionicum)。优选地，编码NADH依赖性乙酰化乙醛脱氢酶的核酸序列源自埃希氏菌属，更优选地源自大肠杆菌。
特别合适的是来自大肠杆菌的mhpF基因，或其功能同源物。该基因描述于Ferrandez等人，(1997)J.Bacteriol.179:2573-2581中。已经利用酿酒酵母获得了良好的结果，其中已整合了来自大肠杆菌的mhpF基因。
在另一个有利的实施方式中，编码(乙酰化)乙醛脱氢酶的核酸序列来自尤其是来自假单胞菌属种属CF600的假单胞菌属dmpF。
原则上，编码NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶的核酸序列可以是野生型核酸序列。优选的核酸序列编码由WO2011010923中的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:29表示的NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶，或WO2011010923中的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:29的功能同源物。特别地，核酸序列包含根据WO2011010923中的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:28的序列，或WO2011010923中的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:28的功能同源物。
此外，乙酰化乙醛脱氢酶(或编码此类活性的核酸序列)可以例如选自由以下项组成的组：大肠杆菌adhE、痢疾变形虫adh2、金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)adhE、瘤胃壶菌属(Piromyces sp.)E2 adhE、克氏梭菌EDK33116、植物乳杆菌acdH和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)YP001268189。对于这些酶的序列，编码这些酶的核酸序列以及将所述核酸序列掺入宿主细胞中的方法，请参考WO 20091013159，特别是实施例3，表1(第26页)和其中提及的序列ID编号，其中公开表1和所述表中提及的序列ID编号表示的序列通过引用方式并入本文。
此处还应理解的是，在一个优选实施方式中，重组酵母具有内源性醇脱氢酶活性，这使得具有乙醛脱氢酶活性的细胞能够完成乙酰辅酶A至乙醇的转换。此外还优选的是宿主细胞具有内源性乙酰辅酶A合酶，该酶允许具有乙醛脱氢酶活性的细胞完成乙酸(通过乙酰辅酶A)至乙醇的转换。
合适的酶的示例是大肠杆菌的adhE、植物乳杆菌的acdH、大肠杆菌的eutE、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)的Lin1129和来自金黄色酿脓葡萄球菌的adhE。关于这些酶请参见下表11(a)至表11(e)，给出了在以下实施例中测试的合适的替代醇/乙醛脱氢酶。
表11(a)来自大肠杆菌的adHE和具有相似的氨基酸序列同一性的蛋白质。
Figure BDA0003628942000000521
表11(b)来自植物乳杆菌的acdH和具有相似的氨基酸序列同一性的蛋白质。
Figure BDA0003628942000000522
Figure BDA0003628942000000531
表11(c)来自大肠杆菌的eutE和具有相似的氨基酸序列同一性的蛋白质。
Figure BDA0003628942000000532
表11(d)来自英诺克李斯特菌(Listeria innocua)的Lin1129和具有相似的氨基酸序列同一性的蛋白质。
Figure BDA0003628942000000533
Figure BDA0003628942000000541
表11(e)来自金黄色酿脓葡萄球菌的adhE和具有相似的氨基酸序列同一性的蛋白质。
Figure BDA0003628942000000542
在一个实施方式中，重组酵母还包含一个或多个编码乙酰辅酶A合酶(E.C.6.2.1.1)的核苷酸序列。
乙酰辅酶A合酶(也称为乙酸辅酶A连接酶和乙酰活化酶)是一种存在于原核生物和真核生物两者中的普遍存在的酶，其可催化从乙酸、辅酶A(CoA)和ATP形成乙酰辅酶A，如下所示：
ATP+乙酸酯+CoA＝AMP+二磷酸酯+乙酰辅酶A
优选地，内源性ACS在酵母细胞中过表达。
表12中列出了合适的ACS的示例。
表12来自酿酒酵母的ACS2和具有相似的氨基酸序列的蛋白质。
Figure BDA0003628942000000551
在根据本发明的方法和/或根据本发明的重组酵母中，可以包括上述蛋白质和/或核酸序列的任何组合。
最优选地，重组酵母包含这样的基因，所述基因编码包含由SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:13表示的氨基酸序列的蛋白质、或SEQ ID NO:6的功能同源物、或SEQ ID NO:13的功能同源物，所述SEQ ID NO:6的功能同源物具有与SEQ ID NO:6的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性，所述SEQ ID NO:13的功能同源物具有与SEQ ID NO:13的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。
最优选的重组酵母
如上所述，最优选地，本发明提供了一种重组酵母，所述重组酵母包含：
-编码具有阿拉伯糖异构酶活性的异源蛋白的基因；
-编码具有核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；
-编码具有磷酸核酮糖差向异构酶活性的蛋白质的基因；
-编码具有乙醛脱氢酶活性，优选乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的基因；
-编码具有甘油脱氢酶活性的蛋白质的基因；
-编码具有甘油-质子同向转运体活性的蛋白质，优选STL1蛋白质的基因，优选地耐葡萄糖基因；
-导致编码具有二羟基丙酮激酶活性的同源或异源蛋白质的核酸序列过表达的遗传修饰；
和
-导致具有甘油流出活性的同源蛋白，优选地对酵母天然的fps1蛋白的缺失或破坏的遗传修饰。
有利地发现，即使在葡萄糖存在下，上述特征的特定组合也允许重组酵母快速转换阿拉伯糖。此外，令人惊讶的是，上述组合被认为还可允许阿拉伯糖和葡萄糖的共转换，其中一些阿拉伯糖已经被转换，而葡萄糖还没有耗尽。这种现象在本文中也被称为同时转换，其中一些阿拉伯糖和一些葡萄糖被同时转换。
优选地，重组酵母还包含一个、两个或更多个拷贝的编码一种或多种具有木糖异构酶活性的蛋白质的异源基因；和/或一个、两个或更多个拷贝的编码一种或多种具有木糖还原酶活性的蛋白质的异源基因；和/或一个、两个或更多个拷贝的编码一种或多种具有木糖醇脱氢酶活性的蛋白质的异源基因，如下文所详述。
此外，重组酵母优选还包含一种或多种用于使(非氧化部分)戊糖磷酸途径的一种或多种酶过表达的遗传修饰，如上文详细描述的。
进一步的优选项如以上描述中针对重组酵母所述。
例如，重组酵母可合适地是包含以下的重组酵母：
-编码包含由SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列或SEQ ID NO:10的功能同源物的异源蛋白的基因，所述功能同源物与SEQ ID NO:10具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性；
-编码包含由SEQ ID NO:11表示的氨基酸序列或SEQ ID NO:11的功能同源物的蛋白的基因，所述功能同源物与SEQ ID NO:11具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性；
-编码包含由SEQ ID NO:12表示的氨基酸序列或SEQ ID NO:12的功能同源物的蛋白的基因，所述功能同源物与SEQ ID NO:12具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性；
-编码包含由SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:13表示的氨基酸序列的蛋白质、或SEQ IDNO:6的功能同源物、或SEQ ID NO:13的功能同源物的基因，所述SEQ ID NO:6的功能同源物具有与SEQ ID NO:6的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性，所述SEQ ID NO:13的功能同源物具有与SEQ ID NO:13的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。
-编码包含由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列或SEQ ID NO:7的功能同源物的蛋白的基因，所述功能同源物与SEQ ID NO:7具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性；
-编码包含由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5表示的氨基酸序列或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的功能同源物的蛋白的基因，所述功能同源物与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性；
-导致编码包含由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9表示的氨基酸序列的蛋白质、或SEQID NO:8的功能同源物、或SEQ ID NO:9的功能同源物的核酸序列过表达的遗传修饰，所述SEQ ID NO:8的功能同源物具有与SEQ ID NO:8的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性，所述SEQ ID NO:9的功能同源物具有与SEQ ID NO:9的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性；
-导致包含由SEQ ID NO:14表示的氨基酸序列或SEQ ID NO:14的功能同源物的同源蛋白缺失或破坏的遗传修饰，所述功能同源物与SEQ ID NO:14具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。
同样，进一步的优选项如以上描述中针对重组酵母所述。
发酵
在根据本发明的方法和/或根据本发明的重组酵母中，可包括上述蛋白质和/或核酸序列的任何组合，并且上面针对重组酵母提及的优选项可应用于根据本发明的方法以及根据本发明的重组酵母两者。
根据本发明的方法包括用重组酵母发酵碳源组合物。如上所述，除了葡萄糖和阿拉伯糖之外，碳源组合物还可包含非糖类化合物，例如甘油和/或乙酸或其盐(乙酸盐)。
如果碳源组合物包含葡萄糖、阿拉伯糖和甘油，则优选地，此类葡萄糖、阿拉伯糖和甘油中的每一者都被转换成乙醇。
如果碳源组合物包含葡萄糖、阿拉伯糖和乙酸(或其盐)，优选地此类葡萄糖、阿拉伯糖和乙酸(或其盐)中的每一者都被转换成乙醇。
如果碳源组合物包含葡萄糖、阿拉伯糖、甘油和乙酸(或其盐)，优选地此类葡萄糖、阿拉伯糖、甘油和乙酸(或其盐)中的每一者都被转换成乙醇。
因此，本发明还提供了如上所述的方法，其中进一步，碳源组合物至少包含葡萄糖、阿拉伯糖和甘油；并且其中进一步，所述重组酵母包含阿拉伯糖异构酶活性、核酮糖激酶活性和磷酸核酮糖差向异构酶活性、甘油脱氢酶活性、二羟基丙酮激酶活性和甘油-质子同向转运体活性；并且其中进一步，所述重组酵母包含导致一种或多种具有甘油流出活性的同源蛋白的活性降低、抑制或消除的遗传修饰；并且其中葡萄糖、阿拉伯糖和甘油中的每一者都被转换成乙醇。
此外，本发明提供了如上所述的方法，其中进一步，所述碳组合物还包含乙酸或其盐；并且其中所述重组酵母还包含一个或多个编码一种或多种具有异源乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的核酸序列；并且其中乙酸或其盐被转换成乙醇。
并且此外，本发明提供了如上所述的方法，其中所述碳组合物还包含乙酸或其盐；并且其中所述重组酵母还包含一个或多个编码一种或多种具有异源乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的核酸序列；并且其中乙酸或其盐被转换成乙醇。
重组酵母有利地允许阿拉伯糖和葡萄糖的厌氧同时消耗。此外，本发明涉及一种方法，其中相对于对应的野生型酵母的发酵，有利地减少了葡萄糖和/或阿拉伯糖和/或甘油和/或乙酸(或其盐)的基本上完全发酵的发酵时间。在优选的方法中，阿拉伯糖的发酵时间减少了20％或更多，优选40％或更多。在优选方法中，戊糖和葡萄糖被共发酵。在优选方法中，总乙醇产率比使用对应野生型酵母的方法的总乙醇产率高至少约10％、至少约20％、至少约50％或约100％。
在优选方法中，碳源组合物包含木质纤维素材料的水解产物。水解产物可以是木质纤维素材料的酶促水解产物。
优选地，发酵优选在合适的发酵反应器中进行，优选在厌氧条件下进行，优选在无氧条件下进行，或者其中基本上不消耗氧气，优选地消耗小于约5mmol/L/h、约2.5mmol/L/h或约1mmol/L/h，更优选地0mmol/L/h的氧气(即检测不到氧气消耗)，并且其中有机分子充当电子供体和电子受体两者。
发酵过程优选在对重组酵母来说最佳的温度下进行。优选地，发酵在低于约42℃，优选低于约38℃的温度下进行。优选地，发酵在低于约35℃、约33℃、约30℃或约28℃的温度和高于约20℃、约22℃或约25℃的温度下进行。
基于包含在碳源组合物中的碳源，合适地以碳计进行计算乙醇产率优选为至少50重量％，更优选至少60重量％，还更优选至少70重量％，甚至更优选至少75重量％，还甚至更优选至少80重量％，还甚至更优选至少85重量％，最优选至少90重量％。以碳计进行计算因此应理解为：乙醇产物中碳分子的重量除以碳源组合物中的碳源中的碳分子的组合重量。
该过程可以以分批、补料分批或连续方式进行。也可以采用单独进行水解和发酵(SHF)的方法或同时进行糖化和发酵(SSF)的方法。这些发酵方法模式的组合也可能实现最佳生产率。
对于乙醇和其他产物如DDGS的回收，可以使用现有技术。从发酵混合物中回收乙醇的合适方法包括分馏和吸附技术。例如，啤酒仍然可以用于处理发酵产物(其在含水混合物中含有乙醇)，以产生富含乙醇的混合物，然后将该富含乙醇的混合物进行分级(例如，分馏或其他类似技术)。接下来，可以使含有最高浓度的乙醇的级分通过吸附器，以从乙醇中去除大部分(如果不是全部)剩余水。
因此，如上所述，最优选地，本发明提供了一种用于生产乙醇的方法，此类方法包括用如上所述的重组酵母发酵至少包含葡萄糖、阿拉伯糖、甘油和乙酸(或其盐)的碳源，其中葡萄糖、阿拉伯糖、甘油和乙酸中的每一者都被转换成乙醇，并且其中最优选地，葡萄糖和阿拉伯糖同时被转换成乙醇。此类同时转换在本文中被理解为指阿拉伯糖中的至少一些阿拉伯糖正在被转换，与此同时一些葡萄糖也正在被转换的情况。甚至更优选地，碳源还包含木糖，该木糖也被转换成乙醇。
以下预言性的实施例是非限制性的，并且旨在仅为说明性的。
实施例
材料和方法
一般分子生物学技术
除非另有说明，否则使用的方法是标准生化技术。合适的通用方法教科书的示例包括Sambrook等人，Molecular Cloning,a Laboratory Manual(1989)和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995),John Wiley&Sons,Inc。
培养基
在实验中使用的培养基可以是例如如在实施例中所指示的补充有糖的YEP培养基(10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨)或固体YNB培养基(6.7g/l酵母基础氮源，15g/l琼脂)。对于固体YEP培养基，可以在灭菌前向液体培养基中加入15g/l琼脂。
在厌氧筛选实验中，可以使用矿质培养基。Verduyn等人已描述了矿质培养基的组成(Yeast(1992)，第8卷，第501-517页)。然而，可以省略硫酸铵的使用；替代地，可使用2.3g/l的尿素作为氮源。此外，还可添加麦角甾醇(0.01g/L)、Tween80(0.42g/L)和糖(如所指示的)。
菌株
在以下预言性实施例中用作参考的菌株包含阿拉伯糖异构酶活性、核酮糖激酶活性、磷酸核酮糖差向异构酶活性和甘油-质子同向转运体活性，以及还有木酮糖激酶活性、NAD+依赖性甘油脱氢酶活性、二羟基丙酮激酶活性和乙酰化乙醛脱氢酶活性。此类菌株、它们的构建和它们的基因型例如在WO2015/028583中描述为该专利的表11中的转化体T1、T2、T3、T4和T5的形式。对于以下预示性实施例，参考WO 2015/028583的表11中所列的转化体T5，其在下文中被进一步简称为“T5”。
菌株构建
在专利申请PCT/EP2013/056623中描述了菌株构建方法。它描述了这样的技术，该技术能够构建来自各种感兴趣的基因的表达盒，使得这些盒在转化酵母后组合成通路并整合到该酵母基因组的特定基因座中。
首先，可选择酵母基因组中的整合位点(例如INT1)。整合基因座的上游部分和下游部分的约500bp的DNA片段可用PCR扩增，该DNA片段侧接有连接物。这些连接物是50bp序列，其允许在酵母(例如酿酒酵母)中转化时进行途径的正确体内重组。感兴趣的基因以及选择性抗性标记(例如kanMX、natMX或等效物)可以通过PCR生成，从而在每个侧翼结合不同的连接物。在用DNA片段转化酵母细胞后，可在所需位置发生体内重组和整合到基因组中。这种技术允许途径调谐，因为来自该途径的一个或多个基因可以用(另一种)其它基因或遗传元件替换，只要允许同源重组的连接物保持恒定即可(专利申请PCT/EP2013/056623)。
表达盒构建
可以例如DNA 2.0(Menlo Park,CA 94025,USA)合成开放阅读框(ORF)、启动子序列和终止子。如Engler等人(2011)和其中的参考文献所述，可通过使用Golden Gate技术来重组启动子、ORF和终止子序列。可使用其中包含甘油转运体表达盒，如SEQ ID NO:36的质粒。
酵母细胞的表达盒扩增和转化
可以使用合适的引物通过PCR来扩增表达盒
酵母转化可以根据由Schiestl和Gietz(Current Genetics(1989)，第16卷，第339-346页)描述的方法进行。
微孔板中的厌氧生长实验
生长实验可以在平底NUNC微孔板(MTP)中执行。每个孔中可填充275μl培养基。
培养基的组成可以类似于WO2015/028583中所述的组成，还包含阿拉伯糖，如下：20g/l的葡萄糖；20g/l的木糖；20g/l的阿拉伯糖；10g/l的甘油；2g/l的乙酸。初始pH可以是pH 4.5。所有MTP都可用铝密封件密封。然后可以将MTP置于厌氧培养箱(Infors)中。在生长48小时后，可以从厌氧Infors中取出MTP。然后可以通过在微孔板离心机中以2750rpm离心10分钟来离心细胞。然后将150μl上清液转移到适于NMR分析的MTP中。
AFM实验
醇发酵监测器器(AFM；Halotec,Veenendaal,the Netherlands)是一款强大且用户友好的实验室平行生物反应器，其允许精确比较六个同步厌氧发酵的碳转换率和产量。AFM实验的起始培养物可含有50mg酵母(干重)。为了确定这一点，可以用RN1041菌株的生物质对比OD700来制作校准曲线。该校准曲线可在实验中用于确定50mg酵母(干重)所需的细胞培养物的体积。
在AFM实验开始之前，可适当地使预培养物生长。对于每个菌株，可以测量OD700，并且可将50mg酵母(干重)接种在补充有2.3g/l尿素(代替硫酸铵)和如实施例中所指示的碳源的400ml矿质培养基(Verduyn等人，Yeast(1992)，第8卷，第501-517页)中。
NMR分析
为了定量样品中的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘油、乙酸和乙醇，可以于27℃的温度，使用具有水峰压制的脉冲程序(功率对应于3Hz)，在配备有低温探针的Bruker AvanceIII 700MHz上记录1H NMR光谱。
预言性的比较例A：
菌株T5的发酵特性
为了产生预培养物，类似T5的菌株可以在有氧条件下在补充有2.3g/l的尿素、20g/l的葡萄糖；20g/l的木糖；20g/l的阿拉伯糖并且初始pH为4.5的矿质培养基中预生长。孵育可以在30℃和280rpm下过夜。第二天，可测定600nm处的光密度，并可将细胞通过离心沉淀。
随后，可以用转化体菌株T5接种每升含有约20克葡萄糖、20克木糖、20克阿拉伯糖、10克甘油和2克乙酸的400ml矿质培养基，以执行AFM实验。在48小时后，可以从上清液中分离细胞，并且可通过NMR分析上清液。
下表13给出了该实验的预言性结果。
表13：比较例A的预言性结果，代表与转化体菌株T5一起孵育48小时之前(培养基)和之后的平均培养基组成。
组分 时间＝0小时时的g/l 时间＝48小时时的g/l
葡萄糖 20 0.2
木糖 20 0.3
阿拉伯糖 20 9
甘油 10 7.6
乙酸 2 1.2
乙醇 0 25
转化体菌株T5可产生商业上感兴趣的产量，但是如果阿拉伯糖可以被更多和/或更快地转换，则乙醇产量甚至会更高。
预言性实施例1：
FPS1敲除转化体菌株T5-fps1Δ的构建
为了在实验上验证降低、抑制或消除一种或多种具有甘油流出活性的同源蛋白的活性的效果，可以例如经由如由Kyung Ok Yu等人在他们发表于Journal ofBiotechnology第150卷(2010)，第209-214页的题为“Reduction of glycerol productionto improve ethanol yield in an engineered Saccharomyces cerevisiae usingglycerol as a substrate”的文章中所例示的同源重组技术来使上述转化体菌株T5中的FPS1基因缺失。
FPS1缺失菌株在本文中被称为菌株T5-fps1Δ
菌株T5-fps1Δ的发酵特性
为了产生预培养物，敲除菌株T5-fps1Δ可以在有氧条件下在补充有2.3g/l的尿素、20g/l的葡萄糖；20g/l的木糖；20g/l的阿拉伯糖并且初始pH为4.5的矿质培养基中预生长。孵育可以在30℃和280rpm下过夜。第二天，可测定600nm处的光密度，并可将细胞通过离心沉淀。
随后，可以用敲除菌株T5-fps1Δ接种每升含有约20克葡萄糖、20克木糖、20克阿拉伯糖、10克甘油和2克乙酸的400ml矿质培养基，以执行AFM实验。在48小时后，可以从上清液中分离细胞，并且可通过NMR分析上清液。
下表14中给出了该实验的预言性结果。
表14：实施例1的预言性结果，代表与T5-fps1Δ一起孵育48小时之前(培养基)和之后的平均培养基组成。
组分 时间＝0小时时的g/l 时间＝48小时时的g/l
葡萄糖 20 0.2
木糖 20 0.3
阿拉伯糖 20 4.0
甘油 10 0.4
乙酸 2 0.4
乙醇 0 33
说明了在进料中作为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘油和乙酸供应的大量碳可以有利地被转换成乙醇。
实施例2：
为了在实验上验证上述预言性发现，构建实际酵母菌株，所述实际酵母菌株包含阿拉伯糖异构酶活性、核酮糖激酶活性、磷酸核酮糖差向异构酶活性和甘油-质子同向转运体活性，以及还有木酮糖异构酶活性、NAD+依赖性甘油脱氢酶活性、二羟基丙酮激酶活性和乙酰化乙醛脱氢酶活性。此外，FPS1基因被敲除。
该酵母菌株是通过在酿酒酵母宿主细胞中应用大量遗传修饰来构建的。这种酵母菌株在下文中称为YS1。
作为YS1菌株的基础，使用与WO2011/003893和WO2011/131667中描述的菌株相似的酿酒酵母菌株。也就是说，该基础菌株包含多个拷贝的araA、araB和araD基因以及多个拷贝的木糖异构酶基因(xylA)。此外，该基础菌株包含gpd1基因中的一种gpd1基因的缺失，其中此类gpd1基因被合成DNA取代，为在酿酒酵母中表达而进行密码子优化，编码乙醇胺利用蛋白，该乙醇胺利用蛋白是来自大肠杆菌的乙酰化乙醛脱氢酶(eutE)。第二gpd1基因保持存在。
随后使用CRISPR-Cas9技术(如DiCarlo等人的在2013年发表在Nucleic AcidsRes 41:4336-4343的题为“Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae usingCRISPR-Cas systems”的文章中针对酵母所描述的)对基础菌株进行遗传修饰，该技术目前为本领域技术人员所众所周知的。将表达Cas9的质粒和整合位点特异性的表达gRNA的质粒导入基础菌株。
通过克隆酿酒酵母来源的启动子与酿酒酵母来源的终止子之间的编码序列，在中间体宿主大肠杆菌中的质粒上产生四个用于在酿酒酵母中表达的表达盒。在质粒DNA分离后，将表达盒从质粒上切下或进行PCR扩增，并转化到酿酒酵母基础菌株中。
这些盒包括用于整合合成DNA的第一盒，其为在酿酒酵母中表达而经密码子优化，编码来自鲁氏接合酵母的甘油转运体，适当地具有SEQ ID NO:5所列的蛋白质序列。然而，如上所述，也可以使用具有如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中所列的蛋白质序列的甘油转运体。
所述盒还包括用于整合合成DNA的第二盒，其为在酿酒酵母中表达而经密码子优化，编码大肠杆菌的甘油脱氢酶(gldA)，适当地具有SEQ ID NO:7所列的蛋白质序列。然而，如上所述，也可以使用本文提及的其他甘油脱氢酶。
该盒还包括用于整合合成DNA的第三盒，其为在酿酒酵母中表达而经密码子优化，编码允许酿酒酵母的二羟基丙酮激酶1(DAK1)过表达的核酸序列，适当地具有SEQ ID NO:8所列的蛋白质序列。然而，如上所述，也可以使用本文提到的其它二羟基丙酮激酶。
此外，所述盒包括用于整合合成DNA的第四盒，其为在酿酒酵母中表达而经密码子优化，编码乙醇胺利用蛋白，适当地具有SEQ ID NO:13所列的蛋白质序列，所述乙醇胺利用蛋白是来自大肠杆菌的乙酰化乙醛脱氢酶(Ec_eutE)。然而，如上所述，也可以使用替代物，例如具有如SEQ ID NO:6所列的蛋白质序列的酶。
将四个盒置于基础菌株的fps1基因的位置，由此敲除FPS1蛋白。所得菌株被称为YS1。
微孔板生长实验
上述菌株YS1用于使用350μl培养基在深孔板96×1.2mL(VWR)(MTP)中执行的MTP生长实验。
首先执行预培养步骤，其中培养基由90％YEPh-D(10g/L酵母提取物+20g/L BBL植物蛋白胨、20g/L葡萄糖)和10％分离的玉米纤维水解产物组成。关于相关组分，玉米纤维水解产物的组成如下：约60g/l葡萄糖；25g/l木糖；20g/l阿拉伯糖；0g/l甘油；2-3g/l乙酸。在使用前，通过离心去除固体，并用氨水将pH设置为5.5。使用从琼脂上刮下的生物质接种MTP。将平板密封并在培养箱摇床(INFORS HT)中以32℃、750rpm、80％湿度孵育2天。
主发酵随后在由补充有50g/L葡萄糖的由分离的玉米纤维水解产物组成的培养基中执行。玉米纤维水解产物的组成如上所述，并且关于相关组分包括：约60g/l葡萄糖；25g/l木糖；20g/l阿拉伯糖；0g/l甘油；2-3g/l乙酸。向这种玉米纤维水解产物中加入50g/L附加葡萄糖。
将MTP平板密封以创造厌氧条件，并使培养物在培养箱摇床(INFORS HT)中以32℃、250rpm和80％湿度生长。在20h、26h或48h处执行取样。如下执行取样：通过在微孔板离心机中以2750rpm离心10分钟来离心沉淀MTP。在该实施例2中，从MTP平板中取出100μl上清液，并与100μl NMR内标溶液混合，并用500μl D2O稀释，如下面分析部分中所详述。
下表15中说明了YS1实现的葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘油和乙酸的转换率。
葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘油、乙酸和乙醇的分析
为了定量葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘油、乙酸和乙醇，将100μl上清液样品准确转移到合适的小瓶中。随后，向样品中加入100μl内标溶液(20g/l的马来酸、40g/l的EDTA、0.5g/L的4,4-二甲基-4-甲硅烷基戊烷-1-磺酸、氢氧化钠在D2O中的溶液，设置为pH6.40)。用500μl D2O进一步稀释这种混合物。
与上文所述的NMR方法相反，对于该实施例2，使用不同的NMR光谱仪，即BrukerAvance III光谱仪，其在400MHz的质子频率下操作。在于400MHz的质子频率下操作、配备有prodigy探针的该Bruker Avance III光谱仪上，使用具有水峰压制的脉冲程序(ZGCPPR，5Hz的溶剂峰压制功率)在300K的温度下，施加90度激励脉冲之后是2.0秒的采集时间和1.2秒的弛豫延迟，来记录澄清溶液的1D 1H NMR光谱。扫描次数设置为8次，在此之前进行4次虚拟扫描。
基于以下信号(δ相对于DSS)，使用以下公式计算分析物浓度(以克/升计)：
Px＝(Ax/Ast)×(nst/nx)×(Mwx/Mwst)×(Wst/Wx)×Pst
其中：
x＝待确定的化合物
st＝标准品
n＝所讨论的信号的质子数
Mw＝分子量
W＝经加权的量
P＝纯度
A＝面积
信号；
葡萄糖：来自β-H1葡萄糖信号的第二峰(d，4.63ppm，0.643H，J＝8Hz)在4.62ppm处，n＝0.3215H
木糖：来自β-H1的第二峰(d，4.56ppm，0.647H，J＝8Hz)在4.56ppm处，n＝0.3235H。
阿拉伯糖：α-H1(d，4.50ppm，0.622H，J＝8Hz)
甘油：来自H1/H3信号的第一峰(dd，3.55ppm，2H，J＝7Hz，12Hz)，在3.55ppm处，n＝0.7H
乙酸：(s，1.90ppm，3H)
乙醇：(t，1.17ppm，3H，J＝7Hz)
作为内标的信号，使用马来酸，其峰值在约6.10ppm(S,2H)处。
表15：实施例2的结果，代表用YS1发酵期间在0小时、20小时、26小时和48小时的平均培养基组成。
Figure BDA0003628942000000681
如表15中的结果所示，可以有利地避免葡萄糖阻遏。有利地，大量的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘油和乙酸中的每一者都被转换成乙醇。
关于甘油，需注意与正常发酵一致，甘油被认为是在发酵期间形成的。然而，随着甘油被迅速再次消耗，甘油的量永远不会达到检测极限。
此外，数据表明，有利且显著的是，在发酵20小时时，一些阿拉伯糖和/或木糖的转换可能已经开始，而葡萄糖尚未完全转换。这表明所要求保护的根据本发明的重组酵母和方法的特征的特定组合可以有利地允许戊糖如木糖和/或阿拉伯糖的共转换与己糖如葡萄糖转换的同时进行。
序列表
<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司(DSM IP Assets B.V.)
<120> 用于生产乙醇的方法
<130> 33591-WO-PCT
<150> EP19207963.0
<151> 2019-11-08
<160> 14
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 598
<212> PRT
<213> 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)
<220>
<223> 来自粟酒裂殖酵母(S. pombe)的甘油转运体的氨基酸序列
<400> 1
Met Ser Val Pro Leu Arg Phe Ser Thr Pro Ser Ser Ser Pro Ser Ala
1 5 10 15
Ser Asp Asn Glu Ser Val His Asp Asp Gly Pro Thr Thr Glu Leu Asp
20 25 30
Thr Phe Asn Thr Thr Asp Val Pro Arg Arg Val Asn Thr Thr Lys Ala
35 40 45
Arg Gln Met Arg Pro Lys Asn Thr Leu Lys Val Ala Phe Ser Ser Pro
50 55 60
Asn Leu Lys Gly Leu Asp Asn Thr Ala Asp Ser Asp Ser Gln Pro Trp
65 70 75 80
Leu Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Arg Leu Glu Asp Ile Ser Gly Gln Ser
85 90 95
Arg Arg Asn Tyr Val Asp Pro Tyr Tyr Glu Glu Leu Asn Ala Gly Arg
100 105 110
Arg Pro Asn Lys Pro Val Trp Ser Leu Asn Gly Pro Leu Pro His Val
115 120 125
Leu Gly Asn Ser Val Val Glu Lys Ile Ser Gln Lys Asn Gln Glu Ala
130 135 140
Arg Ser Arg Ala Asn Ser Arg Val Asn Ser Arg Ala Asn Ser Arg Ala
145 150 155 160
Asn Ser Ser Val Ser Leu Ala Gly Met Asp Gly Ser Pro Asn Trp Lys
165 170 175
Arg Lys Met Lys Ser Ala Val Phe Gly Ser Arg Val Lys Leu Asn Asp
180 185 190
Glu Glu Ala Gln Leu Pro Arg Asn Lys Ser Ser Val Ser Ile Ala Glu
195 200 205
Gln Ala Ala Ser Arg Pro Lys Val Ser Phe Ser Leu Gln Ser Ser Arg
210 215 220
Gln Pro Ser Ile Ala Glu Glu Gln Pro Gln Thr Gln Arg Lys Ser Ser
225 230 235 240
Ala Ile Thr Val Glu His Ala Glu Asn Ala Glu Pro Glu Thr Pro Arg
245 250 255
Asn Asn Val Ser Phe Ser Arg Lys Pro Ser Ile Ala Glu Gln Asp Ser
260 265 270
Ser Gln Asp Ile Thr Met Pro Pro Asn Glu Ile Ile Ala Glu Glu Ser
275 280 285
Leu Asp Ser Gly Ser Asp Thr Glu Thr Leu Tyr Leu Asn Tyr Trp Cys
290 295 300
Lys Ile Arg His Phe Phe Arg Glu Gly Phe Ala Glu Phe Leu Gly Thr
305 310 315 320
Leu Val Leu Val Val Phe Gly Val Gly Ser Asn Leu Gln Ala Thr Val
325 330 335
Thr Asn Gly Ala Gly Gly Ser Phe Glu Ser Leu Ser Phe Ala Trp Gly
340 345 350
Phe Gly Cys Met Leu Gly Val Tyr Ile Ala Gly Gly Ile Ser Gly Gly
355 360 365
His Val Asn Pro Ala Val Thr Ile Ser Leu Ala Ile Phe Arg Lys Phe
370 375 380
Pro Trp Tyr Lys Val Pro Ile Tyr Ile Phe Phe Gln Ile Trp Gly Ala
385 390 395 400
Phe Phe Gly Gly Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr His Trp Ser Ser Ile Thr
405 410 415
Glu Phe Glu Gly Gly Lys Asp Ile Arg Thr Pro Ala Thr Gly Gly Cys
420 425 430
Leu Tyr Thr Asn Pro Lys Pro Tyr Val Thr Trp Arg Asn Ala Phe Phe
435 440 445
Asp Glu Phe Ile Gly Thr Ala Val Leu Val Gly Cys Leu Phe Ala Ile
450 455 460
Leu Asp Asp Thr Asn Ser Pro Pro Thr Gln Gly Met Thr Ala Phe Ile
465 470 475 480
Val Gly Leu Leu Ile Ala Ala Ile Gly Met Ala Leu Gly Tyr Gln Thr
485 490 495
Ser Phe Thr Leu Asn Pro Ala Arg Asp Leu Gly Pro Arg Met Phe Ala
500 505 510
Trp Trp Ile Gly Tyr Gly Pro His Ser Phe His Leu Tyr His Trp Trp
515 520 525
Trp Thr Trp Gly Ala Trp Gly Gly Thr Ile Gly Gly Gly Ile Ala Gly
530 535 540
Gly Leu Ile Tyr Asp Leu Val Ile Phe Thr Gly Pro Glu Ser Pro Leu
545 550 555 560
Asn Tyr Pro Asp Asn Gly Phe Ile Asp Lys Lys Val His Gln Ile Thr
565 570 575
Ala Lys Phe Glu Lys Glu Glu Glu Val Glu Asn Leu Glu Lys Thr Asp
580 585 590
Ser Pro Ile Glu Asn Asn
595
<210> 2
<211> 258
<212> PRT
<213> 恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<220>
<223> 来自恶性疟原虫的甘油转运体的氨基酸序列
<400> 2
Met His Met Leu Phe Tyr Lys Ser Tyr Val Arg Glu Phe Ile Gly Glu
1 5 10 15
Phe Leu Gly Thr Phe Val Leu Met Phe Leu Gly Glu Gly Ala Thr Ala
20 25 30
Asn Phe His Thr Thr Gly Leu Ser Gly Asp Trp Tyr Lys Leu Cys Leu
35 40 45
Gly Trp Gly Leu Ala Val Phe Phe Gly Ile Leu Val Ser Ala Lys Leu
50 55 60
Ser Gly Ala His Leu Asn Leu Ala Val Ser Ile Gly Leu Ser Ser Ile
65 70 75 80
Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Ile Pro Val Tyr Phe Phe Ala Gln Leu
85 90 95
Leu Gly Ala Phe Val Gly Thr Ser Thr Val Tyr Gly Leu Tyr His Gly
100 105 110
Phe Ile Ser Asn Ser Lys Ile Pro Gln Phe Ala Trp Glu Thr Ser Arg
115 120 125
Asn Pro Ser Ile Ser Leu Thr Gly Ala Phe Phe Asn Glu Leu Ile Leu
130 135 140
Thr Gly Ile Leu Leu Leu Val Ile Leu Val Val Val Asp Glu Asn Ile
145 150 155 160
Cys Gly Lys Phe His Ile Leu Lys Leu Ser Ser Val Val Gly Leu Ile
165 170 175
Ile Leu Cys Ile Gly Ile Thr Phe Gly Gly Asn Thr Gly Phe Ala Leu
180 185 190
Asn Pro Ser Arg Asp Leu Gly Ser Arg Phe Leu Ser Leu Ile Ala Tyr
195 200 205
Gly Lys Asp Thr Phe Thr Lys Asp Asn Phe Tyr Phe Trp Val Pro Leu
210 215 220
Val Ala Pro Cys Val Gly Ser Val Val Phe Cys Gln Phe Tyr Asp Lys
225 230 235 240
Val Ile Cys Pro Leu Val Asp Leu Ala Asn Asn Glu Lys Asp Gly Val
245 250 255
Asp Leu
<210> 3
<211> 291
<212> PRT
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<220>
<223> 来自斑马鱼的甘油转运体的氨基酸序列
<400> 3
Met Glu Tyr Leu Glu Asn Ile Arg Asn Leu Arg Gly Arg Cys Val Leu
1 5 10 15
Arg Arg Asp Ile Ile Arg Glu Phe Leu Ala Glu Leu Leu Gly Thr Phe
20 25 30
Val Leu Ile Leu Phe Gly Cys Gly Ser Val Ala Gln Thr Val Leu Ser
35 40 45
Arg Glu Ala Lys Gly Gln Leu Leu Thr Ile His Phe Gly Phe Thr Leu
50 55 60
Gly Val Met Leu Ala Val Tyr Met Ala Gly Gly Val Ser Gly Gly His
65 70 75 80
Val Asn Pro Ala Val Ser Leu Ala Met Val Val Leu Arg Lys Leu Pro
85 90 95
Leu Lys Lys Phe Pro Val Tyr Val Leu Ala Gln Phe Leu Gly Ala Phe
100 105 110
Phe Gly Ser Cys Ala Val Tyr Cys Leu Tyr Tyr Asp Ala Phe Thr Glu
115 120 125
Phe Ala Asn Gly Glu Leu Ala Val Thr Gly Pro Asn Val Thr Ala Gly
130 135 140
Ile Phe Ala Ser Tyr Pro Arg Glu Gly Leu Ser Leu Leu Asn Gly Phe
145 150 155 160
Ile Asp Gln Val Ile Gly Ala Gly Ala Leu Val Leu Cys Ile Leu Ala
165 170 175
Val Val Asp Lys Lys Asn Ile Gly Ala Pro Lys Gly Met Glu Pro Leu
180 185 190
Leu Val Gly Leu Ser Ile Leu Ala Ile Gly Val Ser Met Ala Leu Asn
195 200 205
Cys Gly Tyr Pro Ile Asn Pro Ala Arg Asp Leu Gly Pro Arg Leu Phe
210 215 220
Thr Ala Ile Ala Gly Trp Gly Leu Thr Val Phe Ser Ala Gly Asn Gly
225 230 235 240
Trp Trp Trp Val Pro Val Val Gly Pro Met Val Gly Gly Val Val Gly
245 250 255
Ala Ala Ile Tyr Phe Leu Met Ile Glu Met His His Pro Glu Asn Asp
260 265 270
Lys Asn Leu Glu Asp Asp Asn Ser Leu Lys Asp Lys Tyr Glu Leu Asn
275 280 285
Thr Val Asn
290
<210> 4
<211> 292
<212> PRT
<213> 热带爪蟾(Xenopus (Silurana) tropicalis)
<220>
<223> 来自热带爪蟾的甘油转运体的氨基酸序列
<400> 4
Met Gly Arg Gln Lys Asp Phe Val Asn Lys Cys Asn Gln Met Leu Arg
1 5 10 15
Leu Arg Asn Lys Leu Leu Arg Gln Ala Leu Ser Glu Cys Leu Gly Thr
20 25 30
Leu Ile Leu Val Met Phe Gly Cys Gly Ser Val Ala Gln Val Val Leu
35 40 45
Ser Lys Gly Ser His Gly Gln Phe Leu Thr Val Asn Leu Ala Phe Gly
50 55 60
Phe Ala Val Met Leu Gly Ile Leu Ile Ser Gly Gln Val Ser Gly Gly
65 70 75 80
His Leu Asn Pro Ala Val Thr Phe Ala Leu Cys Ile Leu Ala Arg Glu
85 90 95
Pro Trp Val Lys Phe Pro Val Tyr Ser Ile Ala Gln Thr Leu Gly Ala
100 105 110
Phe Leu Gly Ala Gly Ile Ile Tyr Gly Leu Tyr Tyr Asp Ala Ile Trp
115 120 125
Tyr Phe Ala Asn Asp Gln Leu Tyr Val Thr Gly Glu Asn Gly Thr Ala
130 135 140
Gly Ile Phe Thr Thr Phe Pro Ser Asp His Leu Thr Leu Met Asn Gly
145 150 155 160
Phe Phe Asp Gln Phe Ile Gly Thr Ala Ala Leu Val Val Cys Val Leu
165 170 175
Ala Ile Val Asp Pro Asn Asn Asn Pro Ile Pro Arg Gly Leu Glu Ala
180 185 190
Phe Thr Val Gly Phe Val Val Leu Val Ile Gly Thr Ser Met Gly Phe
195 200 205
Asn Ser Gly Tyr Ala Val Asn Pro Ala Arg Asp Phe Gly Pro Arg Leu
210 215 220
Phe Thr Ser Leu Ala Gly Trp Gly Thr Glu Val Phe Trp Ala Gly Asn
225 230 235 240
Gln Trp Trp Trp Val Pro Ile Val Ser Pro Leu Leu Gly Ala Phe Ala
245 250 255
Gly Val Leu Val Tyr Gln Leu Met Ile Gly Cys His Ile Glu Pro Val
260 265 270
Pro Gln Ser Thr Glu Gln Glu Asn Ile Lys Leu Ala Asp Val Lys Pro
275 280 285
Lys Asp Arg Ile
290
<210> 5
<211> 592
<212> PRT
<213> 鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)
<220>
<223> 来自鲁氏接合酵母的甘油转运体的氨基酸序列
<400> 5
Met Gly Lys Arg Thr Gln Gly Phe Met Asp Tyr Val Phe Ser Arg Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ala Gly Leu Lys Gly Ala Arg Leu Arg Tyr Thr Ala Ala Ala
20 25 30
Val Ala Val Ile Gly Phe Ala Leu Phe Gly Tyr Asp Gln Gly Leu Met
35 40 45
Ser Gly Leu Ile Thr Gly Asp Gln Phe Asn Lys Glu Phe Pro Pro Thr
50 55 60
Lys Ser Asn Gly Asp Asn Asp Arg Tyr Ala Ser Val Ile Gln Gly Ala
65 70 75 80
Val Thr Ala Cys Tyr Glu Ile Gly Cys Phe Phe Gly Ser Leu Phe Val
85 90 95
Leu Phe Phe Gly Asp Ala Ile Gly Arg Lys Pro Leu Ile Ile Phe Gly
100 105 110
Ala Ile Ile Val Ile Ile Gly Thr Val Ile Ser Thr Ala Pro Phe His
115 120 125
His Ala Trp Gly Leu Gly Gln Phe Val Val Gly Arg Val Ile Thr Gly
130 135 140
Val Gly Thr Gly Phe Asn Thr Ser Thr Ile Pro Val Trp Gln Ser Glu
145 150 155 160
Met Thr Lys Pro Asn Ile Arg Gly Ala Met Ile Asn Leu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Ile Ala Phe Gly Thr Met Ile Ala Tyr Trp Leu Asp Phe Gly Phe
180 185 190
Ser Phe Ile Asn Ser Ser Val Gln Trp Arg Phe Pro Val Ser Val Gln
195 200 205
Ile Ile Phe Ala Leu Val Leu Leu Phe Gly Ile Val Arg Met Pro Glu
210 215 220
Ser Pro Arg Trp Leu Met Ala Lys Lys Arg Pro Ala Glu Ala Arg Tyr
225 230 235 240
Val Leu Ala Cys Leu Asn Asp Leu Pro Glu Asn Asp Asp Ala Ile Leu
245 250 255
Ala Glu Met Thr Ser Leu His Glu Ala Val Asn Arg Ser Ser Asn Gln
260 265 270
Lys Ser Gln Met Lys Ser Leu Phe Ser Met Gly Lys Gln Gln Asn Phe
275 280 285
Ser Arg Ala Leu Ile Ala Ser Ser Thr Gln Phe Phe Gln Gln Phe Thr
290 295 300
Gly Cys Asn Ala Ala Ile Tyr Tyr Ser Thr Val Leu Phe Gln Thr Thr
305 310 315 320
Val Gln Leu Asp Arg Leu Leu Ala Met Ile Leu Gly Gly Val Phe Ala
325 330 335
Thr Val Tyr Thr Leu Ser Thr Leu Pro Ser Phe Tyr Leu Val Glu Lys
340 345 350
Val Gly Arg Arg Lys Met Phe Phe Phe Gly Ala Leu Gly Gln Gly Ile
355 360 365
Ser Phe Ile Ile Thr Phe Ala Cys Leu Val Asn Pro Thr Lys Gln Asn
370 375 380
Ala Lys Gly Ala Ala Val Gly Leu Tyr Leu Phe Ile Ile Cys Phe Gly
385 390 395 400
Leu Ala Ile Leu Glu Leu Pro Trp Ile Tyr Pro Pro Glu Ile Ala Ser
405 410 415
Met Arg Val Arg Ala Ala Thr Asn Ala Met Ser Thr Cys Thr Asn Trp
420 425 430
Val Thr Asn Phe Ala Val Val Met Phe Thr Pro Val Phe Ile Gln Thr
435 440 445
Ser Gln Trp Gly Cys Tyr Leu Phe Phe Ala Val Met Asn Phe Ile Tyr
450 455 460
Leu Pro Val Ile Phe Phe Phe Tyr Pro Glu Thr Ala Gly Arg Ser Leu
465 470 475 480
Glu Glu Ile Asp Ile Ile Phe Ala Lys Ala His Val Asp Gly Thr Leu
485 490 495
Pro Trp Met Val Ala His Arg Leu Pro Lys Leu Ser Met Thr Glu Val
500 505 510
Glu Asp Tyr Ser Gln Ser Leu Gly Leu His Asp Asp Glu Asn Glu Lys
515 520 525
Glu Glu Tyr Asp Glu Lys Glu Ala Glu Ala Asn Ala Ala Leu Phe Gln
530 535 540
Val Glu Thr Ser Ser Lys Ser Pro Ser Ser Asn Arg Lys Asp Asp Asp
545 550 555 560
Ala Pro Ile Glu His Asn Glu Val Gln Glu Ser Asn Asp Asn Ser Ser
565 570 575
Asn Ser Ser Asn Val Glu Ala Pro Ile Pro Val His His Asn Asp Pro
580 585 590
<210> 6
<211> 891
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<223> 来自大肠杆菌的乙酰化乙醛脱氢酶的氨基酸序列
<400> 6
Met Ala Val Thr Asn Val Ala Glu Leu Asn Ala Leu Val Glu Arg Val
1 5 10 15
Lys Lys Ala Gln Arg Glu Tyr Ala Ser Phe Thr Gln Glu Gln Val Asp
20 25 30
Lys Ile Phe Arg Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Asp Ala Arg Ile Pro
35 40 45
Leu Ala Lys Met Ala Val Ala Glu Ser Gly Met Gly Ile Val Glu Asp
50 55 60
Lys Val Ile Lys Asn His Phe Ala Ser Glu Tyr Ile Tyr Asn Ala Tyr
65 70 75 80
Lys Asp Glu Lys Thr Cys Gly Val Leu Ser Glu Asp Asp Thr Phe Gly
85 90 95
Thr Ile Thr Ile Ala Glu Pro Ile Gly Ile Ile Cys Gly Ile Val Pro
100 105 110
Thr Thr Asn Pro Thr Ser Thr Ala Ile Phe Lys Ser Leu Ile Ser Leu
115 120 125
Lys Thr Arg Asn Ala Ile Ile Phe Ser Pro His Pro Arg Ala Lys Asp
130 135 140
Ala Thr Asn Lys Ala Ala Asp Ile Val Leu Gln Ala Ala Ile Ala Ala
145 150 155 160
Gly Ala Pro Lys Asp Leu Ile Gly Trp Ile Asp Gln Pro Ser Val Glu
165 170 175
Leu Ser Asn Ala Leu Met His His Pro Asp Ile Asn Leu Ile Leu Ala
180 185 190
Thr Gly Gly Pro Gly Met Val Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro
195 200 205
Ala Ile Gly Val Gly Ala Gly Asn Thr Pro Val Val Ile Asp Glu Thr
210 215 220
Ala Asp Ile Lys Arg Ala Val Ala Ser Val Leu Met Ser Lys Thr Phe
225 230 235 240
Asp Asn Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Val Val Val Val Asp
245 250 255
Ser Val Tyr Asp Ala Val Arg Glu Arg Phe Ala Thr His Gly Gly Tyr
260 265 270
Leu Leu Gln Gly Lys Glu Leu Lys Ala Val Gln Asp Val Ile Leu Lys
275 280 285
Asn Gly Ala Leu Asn Ala Ala Ile Val Gly Gln Pro Ala Tyr Lys Ile
290 295 300
Ala Glu Leu Ala Gly Phe Ser Val Pro Glu Asn Thr Lys Ile Leu Ile
305 310 315 320
Gly Glu Val Thr Val Val Asp Glu Ser Glu Pro Phe Ala His Glu Lys
325 330 335
Leu Ser Pro Thr Leu Ala Met Tyr Arg Ala Lys Asp Phe Glu Asp Ala
340 345 350
Val Glu Lys Ala Glu Lys Leu Val Ala Met Gly Gly Ile Gly His Thr
355 360 365
Ser Cys Leu Tyr Thr Asp Gln Asp Asn Gln Pro Ala Arg Val Ser Tyr
370 375 380
Phe Gly Gln Lys Met Lys Thr Ala Arg Ile Leu Ile Asn Thr Pro Ala
385 390 395 400
Ser Gln Gly Gly Ile Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Lys Leu Ala Pro Ser
405 410 415
Leu Thr Leu Gly Cys Gly Ser Trp Gly Gly Asn Ser Ile Ser Glu Asn
420 425 430
Val Gly Pro Lys His Leu Ile Asn Lys Lys Thr Val Ala Lys Arg Ala
435 440 445
Glu Asn Met Leu Trp His Lys Leu Pro Lys Ser Ile Tyr Phe Arg Arg
450 455 460
Gly Ser Leu Pro Ile Ala Leu Asp Glu Val Ile Thr Asp Gly His Lys
465 470 475 480
Arg Ala Leu Ile Val Thr Asp Arg Phe Leu Phe Asn Asn Gly Tyr Ala
485 490 495
Asp Gln Ile Thr Ser Val Leu Lys Ala Ala Gly Val Glu Thr Glu Val
500 505 510
Phe Phe Glu Val Glu Ala Asp Pro Thr Leu Ser Ile Val Arg Lys Gly
515 520 525
Ala Glu Leu Ala Asn Ser Phe Lys Pro Asp Val Ile Ile Ala Leu Gly
530 535 540
Gly Gly Ser Pro Met Asp Ala Ala Lys Ile Met Trp Val Met Tyr Glu
545 550 555 560
His Pro Glu Thr His Phe Glu Glu Leu Ala Leu Arg Phe Met Asp Ile
565 570 575
Arg Lys Arg Ile Tyr Lys Phe Pro Lys Met Gly Val Lys Ala Lys Met
580 585 590
Ile Ala Val Thr Thr Thr Ser Gly Thr Gly Ser Glu Val Thr Pro Phe
595 600 605
Ala Val Val Thr Asp Asp Ala Thr Gly Gln Lys Tyr Pro Leu Ala Asp
610 615 620
Tyr Ala Leu Thr Pro Asp Met Ala Ile Val Asp Ala Asn Leu Val Met
625 630 635 640
Asp Met Pro Lys Ser Leu Cys Ala Phe Gly Gly Leu Asp Ala Val Thr
645 650 655
His Ala Met Glu Ala Tyr Val Ser Val Leu Ala Ser Glu Phe Ser Asp
660 665 670
Gly Gln Ala Leu Gln Ala Leu Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Leu Pro Ala
675 680 685
Ser Tyr His Glu Gly Ser Lys Asn Pro Val Ala Arg Glu Arg Val His
690 695 700
Ser Ala Ala Thr Ile Ala Gly Ile Ala Phe Ala Asn Ala Phe Leu Gly
705 710 715 720
Val Cys His Ser Met Ala His Lys Leu Gly Ser Gln Phe His Ile Pro
725 730 735
His Gly Leu Ala Asn Ala Leu Leu Ile Cys Asn Val Ile Arg Tyr Asn
740 745 750
Ala Asn Asp Asn Pro Thr Lys Gln Thr Ala Phe Ser Gln Tyr Asp Arg
755 760 765
Pro Gln Ala Arg Arg Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Asp His Leu Gly Leu
770 775 780
Ser Ala Pro Gly Asp Arg Thr Ala Ala Lys Ile Glu Lys Leu Leu Ala
785 790 795 800
Trp Leu Glu Thr Leu Lys Ala Glu Leu Gly Ile Pro Lys Ser Ile Arg
805 810 815
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820 825 830
Ser Glu Asp Ala Phe Asp Asp Gln Cys Thr Gly Ala Asn Pro Arg Tyr
835 840 845
Pro Leu Ile Ser Glu Leu Lys Gln Ile Leu Leu Asp Thr Tyr Tyr Gly
850 855 860
Arg Asp Tyr Val Glu Gly Glu Thr Ala Ala Lys Lys Glu Ala Ala Pro
865 870 875 880
Ala Lys Ala Glu Lys Lys Ala Lys Lys Ser Ala
885 890
<210> 7
<211> 367
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<223> 来自大肠杆菌的甘油脱氢酶gldA的氨基酸序列
<400> 7
Met Asp Arg Ile Ile Gln Ser Pro Gly Lys Tyr Ile Gln Gly Ala Asp
1 5 10 15
Val Ile Asn Arg Leu Gly Glu Tyr Leu Lys Pro Leu Ala Glu Arg Trp
20 25 30
Leu Val Val Gly Asp Lys Phe Val Leu Gly Phe Ala Gln Ser Thr Val
35 40 45
Glu Lys Ser Phe Lys Asp Ala Gly Leu Val Val Glu Ile Ala Pro Phe
50 55 60
Gly Gly Glu Cys Ser Gln Asn Glu Ile Asp Arg Leu Arg Gly Ile Ala
65 70 75 80
Glu Thr Ala Gln Cys Gly Ala Ile Leu Gly Ile Gly Gly Gly Lys Thr
85 90 95
Leu Asp Thr Ala Lys Ala Leu Ala His Phe Met Gly Val Pro Val Ala
100 105 110
Ile Ala Pro Thr Ile Ala Ser Thr Asp Ala Pro Cys Ser Ala Leu Ser
115 120 125
Val Ile Tyr Thr Asp Glu Gly Glu Phe Asp Arg Tyr Leu Leu Leu Pro
130 135 140
Asn Asn Pro Asn Met Val Ile Val Asp Thr Lys Ile Val Ala Gly Ala
145 150 155 160
Pro Ala Arg Leu Leu Ala Ala Gly Ile Gly Asp Ala Leu Ala Thr Trp
165 170 175
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180 185 190
Gly Lys Cys Thr Gln Ala Ala Leu Ala Leu Ala Glu Leu Cys Tyr Asn
195 200 205
Thr Leu Leu Glu Glu Gly Glu Lys Ala Met Leu Ala Ala Glu Gln His
210 215 220
Val Val Thr Pro Ala Leu Glu Arg Val Ile Glu Ala Asn Thr Tyr Leu
225 230 235 240
Ser Gly Val Gly Phe Glu Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala His Ala Val
245 250 255
His Asn Gly Leu Thr Ala Ile Pro Asp Ala His His Tyr Tyr His Gly
260 265 270
Glu Lys Val Ala Phe Gly Thr Leu Thr Gln Leu Val Leu Glu Asn Ala
275 280 285
Pro Val Glu Glu Ile Glu Thr Val Ala Ala Leu Ser His Ala Val Gly
290 295 300
Leu Pro Ile Thr Leu Ala Gln Leu Asp Ile Lys Glu Asp Val Pro Ala
305 310 315 320
Lys Met Arg Ile Val Ala Glu Ala Ala Cys Ala Glu Gly Glu Thr Ile
325 330 335
His Asn Met Pro Gly Gly Ala Thr Pro Asp Gln Val Tyr Ala Ala Leu
340 345 350
Leu Val Ala Asp Gln Tyr Gly Gln Arg Phe Leu Gln Glu Trp Glu
355 360 365
<210> 8
<211> 584
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<223> 来自酿酒酵母的二羟基丙酮激酶DAK1的氨基酸序列
<400> 8
Met Ser Ala Lys Ser Phe Glu Val Thr Asp Pro Val Asn Ser Ser Leu
1 5 10 15
Lys Gly Phe Ala Leu Ala Asn Pro Ser Ile Thr Leu Val Pro Glu Glu
20 25 30
Lys Ile Leu Phe Arg Lys Thr Asp Ser Asp Lys Ile Ala Leu Ile Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly His Glu Pro Thr His Ala Gly Phe Ile Gly Lys
50 55 60
Gly Met Leu Ser Gly Ala Val Val Gly Glu Ile Phe Ala Ser Pro Ser
65 70 75 80
Thr Lys Gln Ile Leu Asn Ala Ile Arg Leu Val Asn Glu Asn Ala Ser
85 90 95
Gly Val Leu Leu Ile Val Lys Asn Tyr Thr Gly Asp Val Leu His Phe
100 105 110
Gly Leu Ser Ala Glu Arg Ala Arg Ala Leu Gly Ile Asn Cys Arg Val
115 120 125
Ala Val Ile Gly Asp Asp Val Ala Val Gly Arg Glu Lys Gly Gly Met
130 135 140
Val Gly Arg Arg Ala Leu Ala Gly Thr Val Leu Val His Lys Ile Val
145 150 155 160
Gly Ala Phe Ala Glu Glu Tyr Ser Ser Lys Tyr Gly Leu Asp Gly Thr
165 170 175
Ala Lys Val Ala Lys Ile Ile Asn Asp Asn Leu Val Thr Ile Gly Ser
180 185 190
Ser Leu Asp His Cys Lys Val Pro Gly Arg Lys Phe Glu Ser Glu Leu
195 200 205
Asn Glu Lys Gln Met Glu Leu Gly Met Gly Ile His Asn Glu Pro Gly
210 215 220
Val Lys Val Leu Asp Pro Ile Pro Ser Thr Glu Asp Leu Ile Ser Lys
225 230 235 240
Tyr Met Leu Pro Lys Leu Leu Asp Pro Asn Asp Lys Asp Arg Ala Phe
245 250 255
Val Lys Phe Asp Glu Asp Asp Glu Val Val Leu Leu Val Asn Asn Leu
260 265 270
Gly Gly Val Ser Asn Phe Val Ile Ser Ser Ile Thr Ser Lys Thr Thr
275 280 285
Asp Phe Leu Lys Glu Asn Tyr Asn Ile Thr Pro Val Gln Thr Ile Ala
290 295 300
Gly Thr Leu Met Thr Ser Phe Asn Gly Asn Gly Phe Ser Ile Thr Leu
305 310 315 320
Leu Asn Ala Thr Lys Ala Thr Lys Ala Leu Gln Ser Asp Phe Glu Glu
325 330 335
Ile Lys Ser Val Leu Asp Leu Leu Asn Ala Phe Thr Asn Ala Pro Gly
340 345 350
Trp Pro Ile Ala Asp Phe Glu Lys Thr Ser Ala Pro Ser Val Asn Asp
355 360 365
Asp Leu Leu His Asn Glu Val Thr Ala Lys Ala Val Gly Thr Tyr Asp
370 375 380
Phe Asp Lys Phe Ala Glu Trp Met Lys Ser Gly Ala Glu Gln Val Ile
385 390 395 400
Lys Ser Glu Pro His Ile Thr Glu Leu Asp Asn Gln Val Gly Asp Gly
405 410 415
Asp Cys Gly Tyr Thr Leu Val Ala Gly Val Lys Gly Ile Thr Glu Asn
420 425 430
Leu Asp Lys Leu Ser Lys Asp Ser Leu Ser Gln Ala Val Ala Gln Ile
435 440 445
Ser Asp Phe Ile Glu Gly Ser Met Gly Gly Thr Ser Gly Gly Leu Tyr
450 455 460
Ser Ile Leu Leu Ser Gly Phe Ser His Gly Leu Ile Gln Val Cys Lys
465 470 475 480
Ser Lys Asp Glu Pro Val Thr Lys Glu Ile Val Ala Lys Ser Leu Gly
485 490 495
Ile Ala Leu Asp Thr Leu Tyr Lys Tyr Thr Lys Ala Arg Lys Gly Ser
500 505 510
Ser Thr Met Ile Asp Ala Leu Glu Pro Phe Val Lys Glu Phe Thr Ala
515 520 525
Ser Lys Asp Phe Asn Lys Ala Val Lys Ala Ala Glu Glu Gly Ala Lys
530 535 540
Ser Thr Ala Thr Phe Glu Ala Lys Phe Gly Arg Ala Ser Tyr Val Gly
545 550 555 560
Asp Ser Ser Gln Val Glu Asp Pro Gly Ala Val Gly Leu Cys Glu Phe
565 570 575
Leu Lys Gly Val Gln Ser Ala Leu
580
<210> 9
<211> 591
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<223> 来自酿酒酵母的二羟基丙酮激酶DAK2的氨基酸序列
<400> 9
Met Ser His Lys Gln Phe Lys Ser Asp Gly Asn Ile Val Thr Pro Tyr
1 5 10 15
Leu Leu Gly Leu Ala Arg Ser Asn Pro Gly Leu Thr Val Ile Lys His
20 25 30
Asp Arg Val Val Phe Arg Thr Ala Ser Ala Pro Asn Ser Gly Asn Pro
35 40 45
Pro Lys Val Ser Leu Val Ser Gly Gly Gly Ser Gly His Glu Pro Thr
50 55 60
His Ala Gly Phe Val Gly Glu Gly Ala Leu Asp Ala Ile Ala Ala Gly
65 70 75 80
Ala Ile Phe Ala Ser Pro Ser Thr Lys Gln Ile Tyr Ser Ala Ile Lys
85 90 95
Ala Val Glu Ser Pro Lys Gly Thr Leu Ile Ile Val Lys Asn Tyr Thr
100 105 110
Gly Asp Ile Ile His Phe Gly Leu Ala Ala Glu Arg Ala Lys Ala Ala
115 120 125
Gly Met Lys Val Glu Leu Val Ala Val Gly Asp Asp Val Ser Val Gly
130 135 140
Lys Lys Lys Gly Ser Leu Val Gly Arg Arg Gly Leu Gly Ala Thr Val
145 150 155 160
Leu Val His Lys Ile Ala Gly Ala Ala Ala Ser His Gly Leu Glu Leu
165 170 175
Ala Glu Val Ala Glu Val Ala Gln Ser Val Val Asp Asn Ser Val Thr
180 185 190
Ile Ala Ala Ser Leu Asp His Cys Thr Val Pro Gly His Lys Pro Glu
195 200 205
Ala Ile Leu Gly Glu Asn Glu Tyr Glu Ile Gly Met Gly Ile His Asn
210 215 220
Glu Ser Gly Thr Tyr Lys Ser Ser Pro Leu Pro Ser Ile Ser Glu Leu
225 230 235 240
Val Ser Gln Met Leu Pro Leu Leu Leu Asp Glu Asp Glu Asp Arg Ser
245 250 255
Tyr Val Lys Phe Glu Pro Lys Glu Asp Val Val Leu Met Val Asn Asn
260 265 270
Met Gly Gly Met Ser Asn Leu Glu Leu Gly Tyr Ala Ala Glu Val Ile
275 280 285
Ser Glu Gln Leu Ile Asp Lys Tyr Gln Ile Val Pro Lys Arg Thr Ile
290 295 300
Thr Gly Ala Phe Ile Thr Ala Leu Asn Gly Pro Gly Phe Gly Ile Thr
305 310 315 320
Leu Met Asn Ala Ser Lys Ala Gly Gly Asp Ile Leu Lys Tyr Phe Asp
325 330 335
Tyr Pro Thr Thr Ala Ser Gly Trp Asn Gln Met Tyr His Ser Ala Lys
340 345 350
Asp Trp Glu Val Leu Ala Lys Gly Gln Val Pro Thr Ala Pro Ser Leu
355 360 365
Lys Thr Leu Arg Asn Glu Lys Gly Ser Gly Val Lys Ala Asp Tyr Asp
370 375 380
Thr Phe Ala Lys Ile Leu Leu Ala Gly Ile Ala Lys Ile Asn Glu Val
385 390 395 400
Glu Pro Lys Val Thr Trp Tyr Asp Thr Ile Ala Gly Asp Gly Asp Cys
405 410 415
Gly Thr Thr Leu Val Ser Gly Gly Glu Ala Leu Glu Glu Ala Ile Lys
420 425 430
Asn His Thr Leu Arg Leu Glu Asp Ala Ala Leu Gly Ile Glu Asp Ile
435 440 445
Ala Tyr Met Val Glu Asp Ser Met Gly Gly Thr Ser Gly Gly Leu Tyr
450 455 460
Ser Ile Tyr Leu Ser Ala Leu Ala Gln Gly Val Arg Asp Ser Gly Asp
465 470 475 480
Lys Glu Leu Thr Ala Glu Thr Phe Lys Lys Ala Ser Asn Val Ala Leu
485 490 495
Asp Ala Leu Tyr Lys Tyr Thr Arg Ala Arg Pro Gly Tyr Arg Thr Leu
500 505 510
Ile Asp Ala Leu Gln Pro Phe Val Glu Ala Leu Lys Ala Gly Lys Gly
515 520 525
Pro Arg Ala Ala Ala Gln Ala Ala Tyr Asp Gly Ala Glu Lys Thr Arg
530 535 540
Lys Met Asp Ala Leu Val Gly Arg Ala Ser Tyr Val Ala Lys Glu Glu
545 550 555 560
Leu Arg Lys Leu Asp Ser Glu Gly Gly Leu Pro Asp Pro Gly Ala Val
565 570 575
Gly Leu Ala Ala Leu Leu Asp Gly Phe Val Thr Ala Ala Gly Tyr
580 585 590
<210> 10
<211> 474
<212> PRT
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<220>
<223> 来自植物乳杆菌的阿拉伯糖异构酶(araA)的氨基酸序列
<400> 10
Met Leu Ser Val Pro Asp Tyr Glu Phe Trp Phe Val Thr Gly Ser Gln
1 5 10 15
His Leu Tyr Gly Glu Glu Gln Leu Lys Ser Val Ala Lys Asp Ala Gln
20 25 30
Asp Ile Ala Asp Lys Leu Asn Ala Ser Gly Lys Leu Pro Tyr Lys Val
35 40 45
Val Phe Lys Asp Val Met Thr Thr Ala Glu Ser Ile Thr Asn Phe Met
50 55 60
Lys Glu Val Asn Tyr Asn Asp Lys Val Ala Gly Val Ile Thr Trp Met
65 70 75 80
His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Asn Trp Ile Arg Gly Thr Glu Leu Leu
85 90 95
Gln Lys Pro Leu Leu His Leu Ala Thr Gln Tyr Leu Asn Asn Ile Pro
100 105 110
Tyr Ala Asp Ile Asp Phe Asp Tyr Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala His
115 120 125
Gly Asp Arg Glu Tyr Ala Tyr Ile Asn Ala Arg Leu Gln Lys His Asn
130 135 140
Lys Ile Val Tyr Gly Tyr Trp Gly Asp Glu Asp Val Gln Glu Gln Ile
145 150 155 160
Ala Arg Trp Glu Asp Val Ala Val Ala Tyr Asn Glu Ser Phe Lys Val
165 170 175
Lys Val Ala Arg Phe Gly Asp Thr Met Arg Asn Val Ala Val Thr Glu
180 185 190
Gly Asp Lys Val Glu Ala Gln Ile Lys Met Gly Trp Thr Val Asp Tyr
195 200 205
Tyr Gly Ile Gly Asp Leu Val Glu Glu Ile Asn Lys Val Ser Asp Ala
210 215 220
Asp Val Asp Lys Glu Tyr Ala Asp Leu Glu Ser Arg Tyr Glu Met Val
225 230 235 240
Gln Val Asp Asn Asp Ala Asp Thr Tyr Lys His Ser Val Arg Val Gln
245 250 255
Leu Ala Gln Tyr Leu Gly Ile Lys Arg Phe Leu Glu Arg Gly Gly Tyr
260 265 270
Thr Ala Phe Thr Thr Asn Phe Glu Asp Leu Trp Gly Met Glu Gln Leu
275 280 285
Pro Gly Leu Ala Ser Gln Leu Leu Ile Arg Asp Gly Tyr Gly Phe Gly
290 295 300
Ala Glu Gly Asp Trp Lys Thr Ala Ala Leu Gly Arg Val Met Lys Ile
305 310 315 320
Met Ser His Asn Lys Gln Thr Ala Phe Met Glu Asp Tyr Thr Leu Asp
325 330 335
Leu Arg His Gly His Glu Ala Ile Leu Gly Ser His Met Leu Glu Val
340 345 350
Asp Pro Ser Ile Ala Ser Asp Lys Pro Arg Val Glu Val His Pro Leu
355 360 365
Asp Ile Gly Gly Lys Asp Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Thr Gly Ser
370 375 380
Glu Gly Glu Ala Ile Asp Val Thr Val Ala Asp Phe Arg Asp Gly Phe
385 390 395 400
Lys Met Ile Ser Tyr Ala Val Asp Ala Asn Lys Pro Glu Ala Glu Thr
405 410 415
Pro Asn Leu Pro Val Ala Lys Gln Leu Trp Thr Pro Lys Met Gly Leu
420 425 430
Lys Lys Gly Ala Leu Glu Trp Met Gln Ala Gly Gly Gly His His Thr
435 440 445
Met Leu Ser Phe Ser Leu Thr Glu Glu Gln Met Glu Asp Tyr Ala Thr
450 455 460
Met Val Gly Met Thr Lys Ala Phe Leu Lys
465 470
<210> 11
<211> 533
<212> PRT
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<220>
<223> 来自植物乳杆菌的L-核酮糖激酶(araB)的氨基酸序列
<400> 11
Met Asn Leu Val Glu Thr Ala Gln Ala Ile Lys Thr Gly Lys Val Ser
1 5 10 15
Leu Gly Ile Glu Leu Gly Ser Thr Arg Ile Lys Ala Val Leu Ile Thr
20 25 30
Asp Asp Phe Asn Thr Ile Ala Ser Gly Ser Tyr Val Trp Glu Asn Gln
35 40 45
Phe Val Asp Gly Thr Trp Thr Tyr Ala Leu Glu Asp Val Trp Thr Gly
50 55 60
Ile Gln Gln Ser Tyr Thr Gln Leu Ala Ala Asp Val Arg Ser Lys Tyr
65 70 75 80
His Met Ser Leu Lys His Ile Asn Ala Ile Gly Ile Ser Ala Met Met
85 90 95
His Gly Tyr Leu Ala Phe Asp Gln Gln Ala Lys Leu Leu Val Pro Phe
100 105 110
Arg Thr Trp Arg Asn Asn Ile Thr Gly Gln Ala Ala Asp Glu Leu Thr
115 120 125
Glu Leu Phe Asp Phe Asn Ile Pro Gln Arg Trp Ser Ile Ala His Leu
130 135 140
Tyr Gln Ala Ile Leu Asn Asn Glu Ala His Val Lys Gln Val Asp Phe
145 150 155 160
Ile Thr Thr Leu Ala Gly Tyr Val Thr Trp Lys Leu Ser Gly Glu Lys
165 170 175
Val Leu Gly Ile Gly Asp Ala Ser Gly Val Phe Pro Ile Asp Glu Thr
180 185 190
Thr Asp Thr Tyr Asn Gln Thr Met Leu Thr Lys Phe Ser Gln Leu Asp
195 200 205
Lys Val Lys Pro Tyr Ser Trp Asp Ile Arg His Ile Leu Pro Arg Val
210 215 220
Leu Pro Ala Gly Ala Ile Ala Gly Lys Leu Thr Ala Ala Gly Ala Ser
225 230 235 240
Leu Leu Asp Gln Ser Gly Thr Leu Asp Ala Gly Ser Val Ile Ala Pro
245 250 255
Pro Glu Gly Asp Ala Gly Thr Gly Met Val Gly Thr Asn Ser Val Arg
260 265 270
Lys Arg Thr Gly Asn Ile Ser Val Gly Thr Ser Ala Phe Ser Met Asn
275 280 285
Val Leu Asp Lys Pro Leu Ser Lys Val Tyr Arg Asp Ile Asp Ile Val
290 295 300
Met Thr Pro Asp Gly Ser Pro Val Ala Met Val His Val Asn Asn Cys
305 310 315 320
Ser Ser Asp Ile Asn Ala Trp Ala Thr Ile Phe Arg Glu Phe Ala Ala
325 330 335
Arg Leu Gly Met Glu Leu Lys Pro Asp Arg Leu Tyr Glu Thr Leu Phe
340 345 350
Leu Glu Ser Thr Arg Ala Asp Ala Asp Ala Gly Gly Leu Ala Asn Tyr
355 360 365
Ser Tyr Gln Ser Gly Glu Asn Ile Thr Lys Ile Gln Ala Gly Arg Pro
370 375 380
Leu Phe Val Arg Thr Pro Asn Ser Lys Phe Ser Leu Pro Asn Phe Met
385 390 395 400
Leu Thr Gln Leu Tyr Ala Ala Phe Ala Pro Leu Gln Leu Gly Met Asp
405 410 415
Ile Leu Val Asn Glu Glu His Val Gln Thr Asp Val Met Ile Ala Gln
420 425 430
Gly Gly Leu Phe Arg Thr Pro Val Ile Gly Gln Gln Val Leu Ala Asn
435 440 445
Ala Leu Asn Ile Pro Ile Thr Val Met Ser Thr Ala Gly Glu Gly Gly
450 455 460
Pro Trp Gly Met Ala Val Leu Ala Asn Phe Ala Cys Arg Gln Thr Ala
465 470 475 480
Met Asn Leu Glu Asp Phe Leu Asp Gln Glu Val Phe Lys Glu Pro Glu
485 490 495
Ser Met Thr Leu Ser Pro Glu Pro Glu Arg Val Ala Gly Tyr Arg Glu
500 505 510
Phe Ile Gln Arg Tyr Gln Ala Gly Leu Pro Val Glu Ala Ala Ala Gly
515 520 525
Gln Ala Ile Lys Tyr
530
<210> 12
<211> 242
<212> PRT
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<220>
<223> 来自植物乳杆菌的L-核酮糖-5-P-4-差向异构酶(araD)的氨基酸序列
<400> 12
Met Leu Glu Ala Leu Lys Gln Glu Val Tyr Glu Ala Asn Met Gln Leu
1 5 10 15
Pro Lys Leu Gly Leu Val Thr Phe Thr Trp Gly Asn Val Ser Gly Ile
20 25 30
Asp Arg Glu Lys Gly Leu Phe Val Ile Lys Pro Ser Gly Val Asp Tyr
35 40 45
Gly Glu Leu Lys Pro Ser Asp Leu Val Val Val Asn Leu Gln Gly Glu
50 55 60
Val Val Glu Gly Lys Leu Asn Pro Ser Ser Asp Thr Pro Thr His Thr
65 70 75 80
Val Leu Tyr Asn Ala Phe Pro Asn Ile Gly Gly Ile Val His Thr His
85 90 95
Ser Pro Trp Ala Val Ala Tyr Ala Ala Ala Gln Met Asp Val Pro Ala
100 105 110
Met Asn Thr Thr His Ala Asp Thr Phe Tyr Gly Asp Val Pro Ala Ala
115 120 125
Asp Ala Leu Thr Lys Glu Glu Ile Glu Ala Asp Tyr Glu Gly Asn Thr
130 135 140
Gly Lys Thr Ile Val Lys Thr Phe Gln Glu Arg Gly Leu Asp Tyr Glu
145 150 155 160
Ala Val Pro Ala Ser Leu Val Ser Gln His Gly Pro Phe Ala Trp Gly
165 170 175
Pro Thr Pro Ala Lys Ala Val Tyr Asn Ala Lys Val Leu Glu Val Val
180 185 190
Ala Glu Glu Asp Tyr His Thr Ala Gln Leu Thr Arg Ala Ser Ser Glu
195 200 205
Leu Pro Gln Tyr Leu Leu Asp Lys His Tyr Leu Arg Lys His Gly Ala
210 215 220
Ser Ala Tyr Tyr Gly Gln Asn Asn Ala His Ser Lys Asp His Ala Val
225 230 235 240
Arg Lys
<210> 13
<211> 467
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<223> 来自大肠杆菌的乙醇胺利用蛋白(Ec_eutE)的氨基酸序列
<400> 13
Met Asn Gln Gln Asp Ile Glu Gln Val Val Lys Ala Val Leu Leu Lys
1 5 10 15
Met Gln Ser Ser Asp Thr Pro Ser Ala Ala Val His Glu Met Gly Val
20 25 30
Phe Ala Ser Leu Asp Asp Ala Val Ala Ala Ala Lys Val Ala Gln Gln
35 40 45
Gly Leu Lys Ser Val Ala Met Arg Gln Leu Ala Ile Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Glu Ala Gly Glu Lys His Ala Arg Asp Leu Ala Glu Leu Ala Val Ser
65 70 75 80
Glu Thr Gly Met Gly Arg Val Glu Asp Lys Phe Ala Lys Asn Val Ala
85 90 95
Gln Ala Arg Gly Thr Pro Gly Val Glu Cys Leu Ser Pro Gln Val Leu
100 105 110
Thr Gly Asp Asn Gly Leu Thr Leu Ile Glu Asn Ala Pro Trp Gly Val
115 120 125
Val Ala Ser Val Thr Pro Ser Thr Asn Pro Ala Ala Thr Val Ile Asn
130 135 140
Asn Ala Ile Ser Leu Ile Ala Ala Gly Asn Ser Val Ile Phe Ala Pro
145 150 155 160
His Pro Ala Ala Lys Lys Val Ser Gln Arg Ala Ile Thr Leu Leu Asn
165 170 175
Gln Ala Ile Val Ala Ala Gly Gly Pro Glu Asn Leu Leu Val Thr Val
180 185 190
Ala Asn Pro Asp Ile Glu Thr Ala Gln Arg Leu Phe Lys Phe Pro Gly
195 200 205
Ile Gly Leu Leu Val Val Thr Gly Gly Glu Ala Val Val Glu Ala Ala
210 215 220
Arg Lys His Thr Asn Lys Arg Leu Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Pro
225 230 235 240
Pro Val Val Val Asp Glu Thr Ala Asp Leu Ala Arg Ala Ala Gln Ser
245 250 255
Ile Val Lys Gly Ala Ser Phe Asp Asn Asn Ile Ile Cys Ala Asp Glu
260 265 270
Lys Val Leu Ile Val Val Asp Ser Val Ala Asp Glu Leu Met Arg Leu
275 280 285
Met Glu Gly Gln His Ala Val Lys Leu Thr Ala Glu Gln Ala Gln Gln
290 295 300
Leu Gln Pro Val Leu Leu Lys Asn Ile Asp Glu Arg Gly Lys Gly Thr
305 310 315 320
Val Ser Arg Asp Trp Val Gly Arg Asp Ala Gly Lys Ile Ala Ala Ala
325 330 335
Ile Gly Leu Lys Val Pro Gln Glu Thr Arg Leu Leu Phe Val Glu Thr
340 345 350
Thr Ala Glu His Pro Phe Ala Val Thr Glu Leu Met Met Pro Val Leu
355 360 365
Pro Val Val Arg Val Ala Asn Val Ala Asp Ala Ile Ala Leu Ala Val
370 375 380
Lys Leu Glu Gly Gly Cys His His Thr Ala Ala Met His Ser Arg Asn
385 390 395 400
Ile Glu Asn Met Asn Gln Met Ala Asn Ala Ile Asp Thr Ser Ile Phe
405 410 415
Val Lys Asn Gly Pro Cys Ile Ala Gly Leu Gly Leu Gly Gly Glu Gly
420 425 430
Trp Thr Thr Met Thr Ile Thr Thr Pro Thr Gly Glu Gly Val Thr Ser
435 440 445
Ala Arg Thr Phe Val Arg Leu Arg Arg Cys Val Leu Val Asp Ala Phe
450 455 460
Arg Ile Val
465
<210> 14
<211> 669
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<223> 来自酿酒酵母的FPS1水甘油通道蛋白的氨基酸序列
<400> 14
Met Ser Asn Pro Gln Lys Ala Leu Asn Asp Phe Leu Ser Ser Glu Ser
1 5 10 15
Val His Thr His Asp Ser Ser Arg Lys Gln Ser Asn Lys Gln Ser Ser
20 25 30
Asp Glu Gly Arg Ser Ser Ser Gln Pro Ser His His His Ser Gly Gly
35 40 45
Thr Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Asn Asn
50 55 60
Asn Asn Asn Gly Asn Asp Gly Gly Asn Asp Asp Asp Tyr Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Met Gln Asp Tyr Arg Pro Ser Pro Gln Ser Ala Arg Pro Thr Pro Thr
85 90 95
Tyr Val Pro Gln Tyr Ser Val Glu Ser Gly Thr Ala Phe Pro Ile Gln
100 105 110
Glu Val Ile Pro Ser Ala Tyr Ile Asn Thr Gln Asp Ile Asn His Lys
115 120 125
Asp Asn Gly Pro Pro Ser Ala Ser Ser Asn Arg Ala Phe Arg Pro Arg
130 135 140
Gly Gln Thr Thr Val Ser Ala Asn Val Leu Asn Ile Glu Asp Phe Tyr
145 150 155 160
Lys Asn Ala Asp Asp Ala His Thr Ile Pro Glu Ser His Leu Ser Arg
165 170 175
Arg Arg Ser Arg Ser Arg Ala Thr Ser Asn Ala Gly His Ser Ala Asn
180 185 190
Thr Gly Ala Thr Asn Gly Arg Thr Thr Gly Ala Gln Thr Asn Met Glu
195 200 205
Ser Asn Glu Ser Pro Arg Asn Val Pro Ile Met Val Lys Pro Lys Thr
210 215 220
Leu Tyr Gln Asn Pro Gln Thr Pro Thr Val Leu Pro Ser Thr Tyr His
225 230 235 240
Pro Ile Asn Lys Trp Ser Ser Val Lys Asn Thr Tyr Leu Lys Glu Phe
245 250 255
Leu Ala Glu Phe Met Gly Thr Met Val Met Ile Ile Phe Gly Ser Ala
260 265 270
Val Val Cys Gln Val Asn Val Ala Gly Lys Ile Gln Gln Asp Asn Phe
275 280 285
Asn Val Ala Leu Asp Asn Leu Asn Val Thr Gly Ser Ser Ala Glu Thr
290 295 300
Ile Asp Ala Met Lys Ser Leu Thr Ser Leu Val Ser Ser Val Ala Gly
305 310 315 320
Gly Thr Phe Asp Asp Val Ala Leu Gly Trp Ala Ala Ala Val Val Met
325 330 335
Gly Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Ser Ala Ile Ser Gly Ala His Leu Asn
340 345 350
Pro Ser Ile Thr Leu Ala Asn Leu Val Tyr Arg Gly Phe Pro Leu Lys
355 360 365
Lys Val Pro Tyr Tyr Phe Ala Gly Gln Leu Ile Gly Ala Phe Thr Gly
370 375 380
Ala Leu Ile Leu Phe Ile Trp Tyr Lys Arg Val Leu Gln Glu Ala Tyr
385 390 395 400
Ser Asp Trp Trp Met Asn Glu Ser Val Ala Gly Met Phe Cys Val Phe
405 410 415
Pro Lys Pro Tyr Leu Ser Ser Gly Arg Gln Phe Phe Ser Glu Phe Leu
420 425 430
Cys Gly Ala Met Leu Gln Ala Gly Thr Phe Ala Leu Thr Asp Pro Tyr
435 440 445
Thr Cys Leu Ser Ser Asp Val Phe Pro Leu Met Met Phe Ile Leu Ile
450 455 460
Phe Ile Ile Asn Ala Ser Met Ala Tyr Gln Thr Gly Thr Ala Met Asn
465 470 475 480
Leu Ala Arg Asp Leu Gly Pro Arg Leu Ala Leu Tyr Ala Val Gly Phe
485 490 495
Asp His Lys Met Leu Trp Val His His His His Phe Phe Trp Val Pro
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Val Cys Ile Tyr Gln Gly His Glu Ser Pro Val Asn Trp Ser Leu Pro
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Val Tyr Lys Glu Met Ile Met Arg Ala Trp Phe Arg Arg Pro Gly Trp
545 550 555 560
Lys Lys Arg Asn Arg Ala Arg Arg Thr Ser Asp Leu Ser Asp Phe Ser
565 570 575
Tyr Asn Asn Asp Asp Asp Glu Glu Phe Gly Glu Arg Met Ala Leu Gln
580 585 590
Lys Thr Lys Thr Lys Ser Ser Ile Ser Asp Asn Glu Asn Glu Ala Gly
595 600 605
Glu Lys Lys Val Gln Phe Lys Ser Val Gln Arg Gly Lys Arg Thr Phe
610 615 620
Gly Gly Ile Pro Thr Ile Leu Glu Glu Glu Asp Ser Ile Glu Thr Ala
625 630 635 640
Ser Leu Gly Ala Thr Thr Thr Asp Ser Ile Gly Leu Ser Asp Thr Ser
645 650 655
Ser Glu Asp Ser His Tyr Gly Asn Ala Lys Lys Val Thr
660 665

Claims (16)

1.一种用于生产乙醇的方法，所述方法包括
用重组酵母发酵碳源组合物，
其中所述碳源组合物包含至少葡萄糖和阿拉伯糖；并且
其中所述重组酵母包含阿拉伯糖异构酶活性、核酮糖激酶活性、磷酸核酮糖差向异构酶活性、甘油摄取活性和甘油转换能力；并且
其中所述重组酵母还包含导致具有甘油流出活性的同源蛋白的活性降低、下调、抑制和/或消除的遗传修饰；并且
其中所述葡萄糖和所述阿拉伯糖中的每一者都被转换成乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组酵母包含编码具有阿拉伯糖异构酶活性的异源蛋白的细菌基因；编码具有核酮糖激酶活性的异源蛋白的细菌基因；以及编码具有磷酸核酮糖差向异构酶活性的异源蛋白的细菌基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述重组酵母包含编码具有甘油-质子同向转运体活性的异源蛋白的耐葡萄糖基因。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述重组酵母包含一个或多个耐葡萄糖STL基因。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述重组酵母包含一个、两个或更多个拷贝的编码一种或多种具有木糖异构酶活性的蛋白质的异源基因；和/或一个、两个或更多个拷贝的编码一种或多种具有木糖还原酶活性的蛋白质的异源基因；和/或一个、两个或更多个拷贝的编码一种或多种具有木糖醇脱氢酶活性的蛋白质的异源基因。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述重组酵母中的一种或多种具有甘油流出活性的同源水甘油通道蛋白的活性被降低、抑制或消除。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述重组酵母中的同源fps1的活性被降低、抑制或消除。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述重组酵母的同源FPS1基因被破坏或敲除。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，
其中所述碳源组合物包含至少葡萄糖、阿拉伯糖和甘油；并且
其中所述重组酵母包含阿拉伯糖异构酶活性、核酮糖激酶活性和磷酸核酮糖差向异构酶活性、甘油脱氢酶活性、二羟基丙酮激酶活性和甘油-质子同向转运体活性；并且
其中所述重组酵母还包含导致一种或多种具有甘油流出活性的同源蛋白的活性降低、抑制或消除的遗传修饰；并且
其中所述葡萄糖、所述阿拉伯糖和所述甘油中的每一者都被转换成乙醇。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述重组酵母包含编码具有NAD+依赖性甘油脱氢酶活性的酶的核酸序列。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述重组酵母包含编码具有NAD+依赖性甘油脱氢酶活性的酶的细菌基因。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，
其中所述碳源组合物还包含乙酸或其盐；并且
其中所述重组酵母还包含
编码具有乙酰辅酶A合成酶活性的异源蛋白的基因；和/或
编码具有乙酰化乙醛脱氢酶活性的异源蛋白的基因；并且
其中所述乙酸或其盐被转换成乙醇。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述发酵的至少部分在厌氧条件下进行。
14.一种重组酵母，所述重组酵母包含：
-编码具有阿拉伯糖异构酶活性的异源蛋白的基因；
-编码具有核酮糖激酶活性的异源蛋白的基因；
-编码具有磷酸核酮糖差向异构酶活性的异源蛋白的基因；
-编码具有甘油摄取活性的异源蛋白的基因；
-编码具有NAD+依赖性甘油脱氢酶活性的异源蛋白的基因；以及
-导致具有甘油流出活性的同源蛋白的活性降低、下调、抑制和/或消除的遗传修饰。
15.根据权利要求14所述的重组酵母，所述重组酵母还包含：
-一个或多个编码异源NADH氧化酶或酶促途径的核酸序列。
16.根据权利要求14或15所述的重组酵母，所述重组酵母还包含：
-编码具有乙酰辅酶A合成酶活性的异源酶的基因；和/或
-编码具有乙醛脱氢酶活性，优选乙酰化乙醛脱氢酶活性的异源酶的基因。
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