CN102768713A - 异丁醇合成菌基因组尺度代谢网络模型及分子改造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及异丁醇合成菌基因组尺度代谢网络模型及分子改造方法;网络模型计算出菌体生长和异丁醇合成的必需途径,通过对该代谢网络模型进行基元模式分析,计算各个基因的标准差系数,确定不同基因对异丁醇生物合成的得率大小;根据标准差系数>0.35预测出对异丁醇生物合成最重要的两个关键基因—乳酸脱氢酶基因ldh与丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基编码基因pdhC,这两个基因的标准差系数分别在2.5-3和1.5-2;这两个基因的敲除能够提高异丁醇的得率,达到0.5-0.6C-mol/C-mol葡萄糖。利用相对通量值获得了对异丁醇生物合成最重要的关键基因作为改造靶点,指导异丁醇合成菌的分子改造,提高异丁醇的得率。
Description
技术领域
本发明属于微生物合成菌代谢工程分子改造技术领域,特别涉及异丁醇合成菌基因组尺度代谢网络模型及分子改造方法。
背景技术
目前,能源危机与环境问题已经迫在眉睫,迫切需要改变当今社会发展对于化石燃料过度依赖的现状。随着生物技术的不断进步与发展,生物乙醇、生物柴油与生物丁醇等的研究日益广泛。绿色燃料的开发与利用对于缓解能源危机、解决环境问题,实现可持续发展具有长远意义。
异丁醇是一种四碳平台化合物,广泛应用于化工、医药与能源等众多工业生产领域。此外,异丁醇是一种高级支链醇,具有能量密度高、吸水性低、辛烷值高,以及能利用现有的管道设备运输等优点,与传统的生物燃料相比较,是一种更具有应用前景的石油替代品。枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性模式菌株。与其他菌种相比,该菌株对异丁醇具有更高的耐受性。此外,该菌株遗传背景清楚、基因工程可操作性强、无密码子偏好性,并且是被美国食品药品管理局(FDA)认可的安全微生物。因此,利用枯草芽孢杆菌被认为是一种理想的异丁醇生物合成宿主。然而,枯草芽孢杆菌自身不存在异丁醇合成途径,不能合成异丁醇。
合成生物学作为一个新兴的前沿学科,由于其巨大的潜在应用价值而成为各国政府争相抢占的资助领域和各科研机构的研究热点。近年来,合成生物学在生物能源、生物医药和生命合成等领域取得了长足发展和重要突破。2008年,Liao领导的研究组从酿酒酵母、乳酸乳球菌及丙酮丁醇梭菌中引入2-酮酸脱氢酶,从酿酒酵母中引入2-乙醇脱氢酶,通过基因优化和重构,实现大肠杆菌内全新的高级醇合成路径,研究结果发表在《Nature》杂志上(Atsumi S,Hanai Liao JC.Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols asbiofuels.Nature,2008,451:86-89.)。2009年,通过对细长聚球蓝细菌的基因工程改造,增加1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的表达量,并将来自乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌及大肠杆菌的相关基因进一步导入工程菌,使之利用CO2和光生产异丁醛,成功实现利用光来生产生物能源分子(Atsumi S,Higashide Liao JC.Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde.NatBiotechnol,2009,27:1177-1180.)。2010年,Liao研究组利用乙酰羧酸合成酶链延长模块和酮酸脱羧酶,在蓝细菌PCC7942中构建了由丙酮酸到异丁醛的合成途径(Li H,Cann AE Liao JC.Biofuels:biomolecular engineering fundamentals andadvances.Annu Rev Chem Biornol Eng,2010,l:19-36.)。合成的异丁醛是平台代谢物,可以生成一系列具有重要功能的生物分子。2010年,美国LS9生物技术公司利用在蓝细菌中发现的脂酰ACP还原酶和醛脱羰酶以原核生物脂肪酸合成途径的中问代谢物脂酰ACP为底物,合成烷烃类和烯烃类,论文发表在2010年《Science》杂志上(Schirmer A,Rude MA,Li X,et a1.Microbial biosynthesis ofalkanes.Science,2010,329(5991):559-562.)。基于此,我们利用合成生物技术对枯草芽孢杆菌引进一条异源途径——Ehrlich途径,并通过扩增乙酰乳酸合酶强化了2-酮异戊酸前体合成途径(Li SS.,Wen JP*.,Jia XQ.Engineering Bacillussubtilis for isobutanol production by heterologous Ehrlich pathway construction andthe biosynthetic 2-ketoisovalerate precursor pathway overexpression.Appl MicrobiolBiotechnol.,2011,91:577-589.),使野生枯草芽孢杆菌成为异丁醇合成菌,产量达到了2.62g/L。
目前,国外有很多科研小组利用合成生物学方法对菌株进行代谢工程改造从而使其能够创造性的具有生物合成高级脂肪醇类(正丁醇、异丁醇、2-苯乙醇)和抗癌药物类(紫杉二烯)的能力。Atsumi等(Atsumi S.,Hanai T.,Liao JC*.Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols asbiofuels.Nature,2008,451:86-90.)与Blombach等(Blombach B.,Riester T.,Wieschalka S.,Ziert C.,Youn JW.,Wendisch VF.,Eikmanns BJ*.Corynebacteriumglutamicum tailored for efficient isobutanol production.Applied and EnvironmentalMicrobiology,2011,77:3300-3310.)分别在大肠杆菌与谷氨酸棒杆菌中扩增异丁醇生物合成的前体途径,并敲除竞争性途径,得到异丁醇得率为86%的大肠杆菌与48%的谷氨酸棒杆菌异丁醇生物合成菌株。2010年,代谢工程(MetabolicEngineering)杂志主编Stephanopoulos领导的研究小组成功地在大肠杆菌中合成了抗癌药物紫杉醇的前体物紫杉二烯(Ajikumar PK,Xiao WH,Tyo KE,et a1.Isoprenoid pathway optimization for taxol precursor overproduction in Escherichiacoli.Science,2010,330:70-74.)。他们将大肠杆菌自身生成异戊烯焦磷酸的途径作为上游模块,将异源的萜类化合物形成途径作为下游模块,通过微调上下游模块之间的表达量,使紫杉二烯的产量达到1000mg/L,与原来的菌株相比,产量提高了15000倍。
通过传统的代谢工程改造方法可以提高异丁醇的产量,然而,由于缺少对异丁醇合成菌胞内所有酶的动力学和代谢途径通量分配的系统性认识,常会产生无效的和盲目的改造,导致很难进一步提高异丁醇合成菌的产量。因此,通过构建异丁醇合成菌株高精度基因组尺度代谢网络,系统解析各个途径扩增或者敲除对异丁醇合成的影响,进而识别关键基因关键酶对于指导异丁醇合成菌株的分子改造具有重要意义,在异丁醇合成菌的理性设计中起到关键作用。随着高通量测序的发展,各个物种的基因组信息越来越完善。人们对于生物体的认识由孤立的表观生理状态发展到系统生物的分子水平。截至目前,已经有3173个菌种完成了测序工作(http://www.genomesonline.org/cgi-bin/GOLD/index.cgi),其中126个菌种的基因组尺度代谢网络模型已经构建完毕。在此基础上,系统研究菌株的生物合成行为,结合模拟分析手段,能够快速,精确地识别提高菌种生物合成能力的靶点基因。Unrean等(Unrean P.,Trinh CT.,Srienc F*.Rational design andconstruction of an efficient E.coli for production of diapolycopendioic acid.Metabolic Engineering,2010,12:112-122.)利用大肠杆菌的代谢网络模型计算出29,532个基元模式,基于这些基元模式预测提高菌株类胡萝卜素生物合成的靶点glk、gapA、pgmA、pfkA、fbaA、tpiA、ppc、pgi、gltA、acnA、rpiA等15个基因,在此指导下对其中的ldhA、frdA、poxB、pta、adhE、pykF、zwf、maeB做了基因敲除,获得的工程菌株类胡萝卜素浓度达到0.83mg/L,是原始野生菌的5倍,得率0.17mg/g葡萄糖,为野生菌株的4倍。Brochado等(Brochado AR.,Matos C.,Moller B.,Hansen J.,Mortensen UH.,Patil KR*.Improved vanillin production inbaker’s yeast through in silico design.Microbial Cell Factories.2010,9:84.)以酵母菌代谢网络为基础,模拟了不同的基因R3得分,结合手动评估基因,预测了提高香草醛产量的靶基因丙酮酸脱羧酶pdc1和谷氨酸脱氢酶gdh1,通过敲除改造这两个预测基因pdcl和gdhl,工程菌株的香草醛得率达到15.3mg/g葡萄糖,比改造前提高了1.5倍,原儿茶酸和原儿茶醛则达到13.9和5.8mg/g葡萄糖。而截至目前,未见有利用异丁醇合成菌(枯草芽孢杆菌)基因组尺度代谢网络模型预测关键基因关键酶,进而指导工程菌株分子改造的相关专利与文献报道。本文的专利发明点是构建异丁醇合成菌基因组尺度代谢网络模型,该网络模型能够理性分析代谢途径各个反应对异丁醇得率的影响,利用相对通量值获得对异丁醇生物合成最重要的关键基因作为改造靶点,进而指导异丁醇合成菌的分子改造,以此提高异丁醇的得率。
发明内容
本发明的目的是构建异丁醇合成菌基因组尺度代谢网络模型,该网络模型能够理性分析代谢途径各个反应对异丁醇得率的影响,利用相对通量值获得了对异丁醇生物合成最重要的关键基因作为改造靶点,进而指导异丁醇合成菌的分子改造,以此提高异丁醇的得率。
本发明的技术方案如下:
一种异丁醇合成菌基因组尺度代谢网络模型,其特征是步骤如下:
1)网络模型计算出菌体生长和异丁醇合成的必需途径,包括糖酵解途径、戊糖磷酸途径、三羧酸循环、氨基酸合成、核苷酸合成、脂类合成、辅酶与能量合成、细胞壁合成与异丁醇合成的九个主要的亚系统,以及代谢物运输反应;
2)通过对该代谢网络模型进行基元模式分析,计算各个基因的标准差系数,确定不同基因对异丁醇生物合成的得率大小;根据标准差系数>0.35预测出对异丁醇生物合成最重要的两个关键基因——乳酸脱氢酶基因ldh与丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基编码基因pdhC,这两个基因的标准差系数分别在2.5-3和1.5-2;
3)模拟结果显示这两个基因的敲除能够提高异丁醇的得率,达到0.5-0.6C-mol/C-mol葡萄糖。
在代谢网络模型中,在枯草芽孢杆菌野生型菌株代谢网络模型中添加异丁醇生物合成的特征反应,以葡萄糖为唯一碳源,将代谢途径中线性途径简化为一个反应,向代谢网络模型中添加运输反应。
利用基元模式分析方法从异丁醇合成菌全部模式中确定异丁醇生物合成相关的模式,总共获得菌株胞内10000-12000个模式。
确定每一个反应在这些模式下的与异丁醇生物合成的线性相关性,由计算得到的标准差系数确定对异丁生物合成的影响最重要的两个基因。
本发明的异丁醇合成菌基因组尺度代谢网络模型进行分子改造,其特征是步骤如下:
1)对预测得出的异丁醇影响最大的基因ldh与pdhC进行基因敲除的分子改造;
2)将基因改造菌株进行摇瓶培养,考察异丁醇生物合成菌改造前后变化并与预测值进行比较。
对预测出的两个关键基因,采用基因敲除的分子改造方法,具体为分别构建含有ldh和pdhC基因上、下游同源臂片段的枯草芽孢杆菌整合型质粒,采用枯草化学转化法将质粒pUCLKan导入BSUL03,构建乳酸脱氢酶缺失菌株BSUL04,之后将质粒pUCPCm转化至BSUL04,构建丙酮酸脱氢酶复合体缺失菌株BSUL05;利用Kmr或Cmr抗生素筛选获得稳定的ldh与pdhC缺失菌株。7.如权利要求6所述的方法。其特征在于:对改造的菌株进行摇瓶发酵培养,在摇瓶中200rpm培养40小时;产量比野生型提高了60%-70%;使用的培养基组成为:蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖20g/L、K2HPO42g/L、KH2PO41g/L,以及103倍微量元素盐,初始pH为7.0。
说明如下:标准差系数以Vσ表示;
糖酵解途径、戊糖磷酸途径和三羧酸循环可以用中心碳代谢替换;
改造菌株发酵产量比野生型提高了60%-70%,说明实验效果提高显著;最大异丁醇得率达到0.35-0.45C-mol/C-mol葡萄糖,是改造前的2-3倍;对模拟的六个关键途径仅做了其中最重要的两个实验改造,与预测出的最大值相比相差15-18%,验证了模型预测的可信性。
本发明利用异丁醇合成菌基因组尺度代谢网络模型预测关键基因以提高菌株合成异丁醇产量,实现合成菌株的途径分子改造方法。根据枯草芽孢杆菌基因组序列,构建异丁醇合成菌基因组尺度代谢网络模型;网络模型计算出合成菌体生长和异丁醇合成的必需途径,包括糖酵解途径、戊糖磷酸途径、三羧酸循环、氨基酸合成、核苷酸合成、脂类合成、辅酶与能量合成、细胞壁合成与异丁醇合成的特征反应等九个主要的亚系统,以及代谢物运输反应;线性途径反应合并为一个总反应式,代谢网络共130-150个反应;对该代谢网络模型进行基元模式分析,总共获得菌株胞内10000-12000个模式;在这些模式中确定异丁醇生物合成相关的模式,根据模式中标准差系数(Vσ)大小(>0.35)确定两个对异丁醇生物合成最重要的关键节点关键酶——乳酸脱氢酶基因ldh与丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基编码基因pdhC;模拟结果显示这两个基因的敲除能够提高异丁醇的理论得率,达到0.5-0.6C-mol/C-mol葡萄糖;对预测出的六个关键途径中的两个关键基因ldh和pdhC进行基因改造——基因敲除;对改造的菌株进行摇瓶发酵培养,产量比野生型提高了60%-70%,说明实验效果提高显著;最大异丁醇得率达到0.35-0.45C-mol/C-mol葡萄糖,是改造前的2-3倍;对模拟的六个关键途径仅做了其中最重要的两个实验改造,与预测出的最大值相比相差15-18%,验证了模型预测的可信性。本发明采用基因组尺度代谢网络模型预测异丁醇合成菌株目标基因的改造方法,改造后菌株的异丁醇得率提高了90-150%。该基于代谢网络模型预测的方法,具有分析全面、预测准确、节省菌株改造时间等特点,与单纯的、盲目的菌株改造方法相比,采用基元模式分析结合通量靶点分析预测出的关键基因为异丁醇合成菌株的构建、研究和分析提供了高效的指导,以进一步有针对性地进行基因改造,在异丁醇合成菌改造的研究过程中具有很大的应用前景。
说明书附图
图1异丁醇生物合成菌基元模式分析。
图2异丁醇合成菌中心碳代谢途径在最优条件下相对碳流通量的变化模拟。
图3靶基因敲除质粒的构建与缺失突变菌株的构建。
图4不同异丁醇合成菌在微氧条件下细胞生长、异丁醇合成、能量ATP与胞内丙酮酸的关系。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
以枯草芽孢杆菌模式菌株代谢网络模型为基础,添加异丁醇生物合成的特征反应。模型以葡萄糖为唯一碳源,对除中心碳代谢(糖酵解、戊糖磷酸途径与三羧酸循环)外的其他亚系统,如氨基酸合成、核酸合成、脂类合成、能量与辅酶合成,以及细胞壁合成中的线性途径进行合并,添加底物吸收与产物分泌的相关运输反应,总共包含130-150个反应,获得异丁醇合成菌的代谢网络模型。
实施例2
将异丁醇合成菌代谢网络模型转化为可识别的数学矩阵模型,利用基元模式分析算法借助METATOOL工具(5.1版本,2008)获得菌株胞内可独立存在的所有相关模式。在EXCEL里从10000-12000个模式中确定有异丁醇合成的模式,其中异丁醇最大理论得率为0.6-0.7C-mol/C-mol,菌体得率最大理论值为0.5-0.6C-mol/C-mol(如图1)。对这些模式进行筛选后,计算每一个反应在这些模式下与目标反应的线性相关性。线性相关系数65-80%表示反应与异丁醇合成相关,正相关表示催化该反应的酶的编码基因对异丁醇有正效应,反之亦然。异丁醇影响该模型中各个基因的标准差系数在0-3之间,该值越大表示该基因对异丁生物合成的影响越大。模型模拟结果显示,敲除单基因ldh后,异丁醇和生物量得率从0.2和0.1C-mol/C-mol提高到0.4-0.45和0.15-0.2C-mol/C-mol,敲除双基因ldh和pdhC后,异丁醇得率进一步提高到0.6-0.65C-mol/C-mol。对于异丁醇得率为0.67C-mol/C-mol,生物量得率为零,因而不作为预测靶点。
圆圈代谢表基元模式分析结果。位于坐标轴上的点为仅有生物量或仅有异丁醇合成的极端途径。而三角形内部的点表示胞内能够合成异丁醇的可行途径。三角表示胞内异丁醇的最大理论得率(0.6-0.7C-mol/C-mol);六边形表示改造前菌株的最大异丁醇理论得率(0.15-0.25C-mol/C-mol);五角星表示ldh突变株的最大异丁醇理论得率(0.3-0.4C-mol/C-mol);正方形表示ldh与pdhC突变株的最大异丁醇理论得率(0.4-0.5C-mol/C-mol)。
实施例3
由实施例2得到的两个最重要关键基因,计算每一个反应在这些模式下碳流相对通量的平均值、方差以及标准差系数。每一个反应的碳流相对通量以葡萄糖吸收速率做基准,通过模拟对异丁醇合成影响最大的基因ldh与pdhC,确定基因敲除后对整个菌体胞内中心碳代谢各个反应通量的影响,如图2。与野生菌BSUL03相比,单基因改造BSUΔldh模拟出的中心代谢途径包括磷酸戊糖途径和柠檬酸循环途径通量要大40%-70%,糖酵解途径则变化不大,只降低了4%,异丁醇合成途径通量提高了1-1.5倍。对于双基因敲除模拟出的通量分配,磷酸戊糖途径提高了10-20倍,异丁醇合成途径则提高了2-3倍,依此确定影响异丁醇生物合成的靶标基因ldh与pdhC。
图2异丁醇合成菌中心碳代谢途径在最优条件下相对碳流通量的变化模拟。柱图表示异丁醇合成菌在异丁醇生物合成的最佳状态下中心碳代谢网络中各个反应的相对通量的变化。所有的通量值均以葡萄糖为基础进行归一化处理。模拟基因ldh缺失突变株(BSUΔldh)与基因ldhpdhC双缺失突变株(BSUΔldhΔpdhC)的相对通量的变化值以改造前的菌株BSUL03的碳流通量为参照获得。虚线表示简化的代谢反应途径;粗线条表示模拟敲除预测靶基因(×表示)后,通量显著提高的途径。负通量表示反应向相反的方向进行。
实施例4
根据实施例3预测敲除靶点,对异丁醇合成影响最大的基因ldh与pdhC做分子改造。分别构建含有ldh和pdhC基因上、下游同源臂片段的枯草芽孢杆菌敲除质粒pUCLKm和pUCPTet(图3a和c),采用枯草化学转化法(Spizizen)方法将质粒pUCLKm导入BSUL03,构建乳酸脱氢酶缺失菌株BSUL04,之后将质粒pUCPTet转化至BSUL04,构建丙酮酸脱氢酶复合体缺失菌株BSUL05。利用抗生素(Kmr,Tetr)筛选获得稳定的ldh与pdhC缺失菌株,通过扩增目的条带——Δldh为2kb,ΔpdhC为2.75kb(图3b和d),证实了基因ldh和pdhC基因从异丁醇合成菌——枯草芽孢菌基因组上敲除。
图3靶基因敲除质粒的构建与缺失突变菌株的构建。A图含有ldh基因上下游同源臂的ldh敲除质粒;B图ldh基因缺失突变菌株电泳验证;C图含有pdhC基因上下游同源臂的pdhC敲除质粒;D图pdhC基因缺失突变菌株电泳验证。
实施例5
对该缺陷型异丁醇合成菌在500mL摇瓶(工作体积为40%)中进行培养,观察菌株的生理特征。使用的培养基为LBGSM-I培养基(组成为:蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖20g/L、K2HPO42g/L、KH2PO41g/L,以及103倍微量元素盐,初始pH为7.0)。在摇瓶中200rpm培养40小时,气相色谱法检测发酵液中的异丁醇含量。改造后菌株BSUL05胞内ATP浓度降低了60%-80%,而胞内丙酮酸浓度提高了50-60倍(图4)。分子改造菌株的最大生长量约为原始菌株的60~85%,添加3g/L乙酸钠后异丁醇得率较原始菌株提高90~150%(图4),说明预测的改造靶点对异丁醇合成水平的提高具有明显的促进作用。
图4不同异丁醇合成菌在微氧条件下细胞生长、异丁醇合成、能量ATP与胞内丙酮酸的关系。BSUL03为异丁醇合成野生对照菌,BSUL04为BSUL03敲除ldh基因后的菌株,BSUL05为BSUL03敲除双基因ldh和pdhC后的菌株,BSUL05(+)为培养BSUL05时添加3g/L乙酸钠。
经过试验,本发明在下述条件范围内,可达到需要的效果。
构建异丁醇合成菌基因组代谢网络模型,进行基元模式分析,获得胞内全部10000-12000个模式总数。进一步确定与异丁醇生物合成相关的模式,计算在这些模式下,每一个反应与异丁醇生物合成的线性相关性、平均值、方差与标准差系数,确定代谢网络模型中不同基因对异丁醇生物合成的影响。选择影响最为显著的乳酸脱氢酶基因ldh与丙酮酸脱氢酶复合体基因pdhC进行分子改造。微氧条件下,在装有200mL液体发酵培养基的500mL摇瓶中,160~220rpm,33~37°C条件下培养36~60h,可提高异丁醇合成菌的得率与产量。对模拟的四个关键途径仅做了其中最重要的两个实验改造,与预测出的最大值相比相差15-18%,验证了模型预测的可信性。
Claims (7)
1.一种异丁醇合成菌基因组尺度代谢网络模型,其特征是步骤如下:
1)网络模型计算出菌体生长和异丁醇合成的必需途径,包括糖酵解途径、戊糖磷酸途径、三羧酸循环、氨基酸合成、核苷酸合成、脂类合成、辅酶与能量合成、细胞壁合成与异丁醇合成的九个主要的亚系统,以及代谢物运输反应;
2)通过对该代谢网络模型进行基元模式分析,计算各个基因的标准差系数,确定不同基因对异丁醇生物合成的得率大小;根据标准差系数>0.35预测出对异丁醇生物合成最重要的两个关键基因——乳酸脱氢酶基因ldh与丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基编码基因pdhC,这两个基因的标准差系数分别在2.5-3和1.5-2;
3)模拟结果显示这两个基因的敲除能够提高异丁醇的得率,达到0.5-0.6C-mol/C-mol葡萄糖。
2.如权利要求1所述的代谢网络模型,其特征在于:在枯草芽孢杆菌野生型菌株代谢网络模型中添加异丁醇生物合成的特征反应,以葡萄糖为唯一碳源,将代谢途径中的线性途径简化为一个反应,向代谢网络模型中添加运输反应。
3.如权利要求1所述的代谢网络模型,其特征在于:利用基元模式分析方法从异丁醇合成菌全部模式中确定与异丁醇生物合成相关的模式,总共获得合成菌株胞内的10000-12000个模式。
4.如权利要求1所述的代谢网络模型,其特征在于:确定每一个反应在这些模式下与异丁醇生物合成的线性相关性,由计算得到的标准差系数确定对异丁醇生物合成的影响最重要的两个基因。
5.根据权利要求1的异丁醇合成菌基因组尺度代谢网络模型预测基因进行分子改造,其特征是步骤如下:
1)对预测得出的异丁醇影响最大的基因ldh与pdhC进行基因敲除的分子改造;
2)将基因改造菌株进行摇瓶培养,考察异丁醇生物合成菌改造前后变化并与预测值进行比较。
6.如权利要求5所述的方法。其特征在于:对预测出的两个关键基因,采用基因敲除的分子改造方法,具体为分别构建含有ldh和pdhC基因上、下游同源臂片段的枯草芽孢杆菌整合型质粒,采用枯草芽孢杆菌化学转化法将质粒pUCLKan导入异丁醇合成菌株BSUL03,构建乳酸脱氢酶缺失菌株BSUL04,之后将质粒pUCPCm转化至BSUL04,构建丙酮酸脱氢酶复合体缺失菌株BSUL05;利用Kmr或Cmr抗生素筛选获得稳定的ldh与pdhC缺失菌株。
7.如权利要求6所述的方法。其特征在于:对改造的菌株进行摇瓶发酵培养,在摇瓶中200rpm培养40小时;使用的培养基组成为:蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖20g/L、K2HPO4 2g/L、KH2PO4 1g/L,以及103倍微量元素盐,初始pH为7.0;最终发酵产量比野生型提高了60%-70%。
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2012
- 2012-06-14 CN CN2012101946789A patent/CN102768713A/zh active Pending
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