CN103279689B - 基于fk506生产菌筑波链霉菌基因组尺度代谢网络模型指导下次级途径改造方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于FK506生产菌筑波链霉菌基因组尺度代谢网络模型指导下次级途径改造方法，模型基于注释基因和生理生化信息，通过与天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）基因组比较分析，发现代谢基因是高度保守的；对基因组尺度代谢网络进行代谢通量分析，模型预测了提高生产水平的突变菌次级途径基因簇改造策略。本发明采用基因组尺度代谢网络模型预测FK506菌株次级途径基因簇特殊结构基因的改造方法，改造后菌株的生产水平提高了20%‑90%。扩增基因簇中的特殊结构基因来提高生产能力，在微生物免疫抑制剂生产菌株的次级途径理性改造中有较大的应用价值，为菌株优化提供一种高效、系统的方法。

Description

基于FK506生产菌筑波链霉菌基因组尺度代谢网络模型指导 下次级途径改造方法

技术领域

本发明属于微生物菌株代谢工程分子改造技术领域，特别涉及FK506生产菌筑波链霉菌基因组尺度代谢网络模型指导下次级途径改造方法。

背景技术

FK506，又名他克莫司，是筑波链霉菌合成的一种具有高度免疫抑制作用的23元聚酮大环内酯类化合物。FK506广泛应用于特应性皮炎、变应性接触性皮炎、银屑病、红斑狼疮、扁平苔癣、白癜风、Nethenton综合症和抑制宿主病等自身免疫疾病的治疗。目前临床应用于预防肝脏或肾脏移植术后的移植物排斥反应，治疗肝脏、胰腺、肾脏、心脏、肺等实体器官移植术后应用其他免疫抑制药物无法控制的移植物排斥反应。由于它的免疫抑制作用比环孢素A强100倍，因而大大降低了临床使用剂量，可降低原治疗费用1/3-1/2,同时不良反应也明显降低。随着我国器官移植手术的逐渐普及，我国的免疫抑制剂市场最终规模可达180-200亿元，FK506已经成为一种极为重要的一线临床药物。

筑波链霉菌较低的发酵单位限制了FK506的高成本生产和其在临床上的广泛应用。许多科研人员做了大量工作以提高FK506的生产水平，这些工作还基于随机突变和筛选方法。通过对原始菌株的基因改造，可以构建出保证菌体生长和产物生成的前体平衡菌株。然而，由于缺少对菌株胞内所有酶的动力学和代谢途径通量分配的系统性认识，常会产生无效的和盲目的改造，而且由于代谢途径是高度交互作用的，拓扑结构十分复杂，单纯操作一个基因可能会对其他途径甚至整个细胞产生未知的结果。重要的是，由于工程改造通常是局部的，对菌株优化的剧烈结果存在很大局限。

基因组尺度代谢网络模型在代谢工程领域发挥了重要作用[1]。基因组尺度代谢网络模型可以全面理解细胞的代谢网络，包括组成代谢途径的结构基因、细胞代谢复杂的调节机制，以及遗传和环境扰动对细胞全局代谢的影响，从而建立基因组规模的代谢模型^[2]，对可能的代谢工程改造靶点进行评价和预测，并基于基因工程改造后获得的菌株进行代谢网络分析，从而更好地指导代谢工程改造，改进细胞的生理功能和生产性状。目前基因组尺度代谢网络模型已经成功用于重要工业产品的代谢工程靶点识别。

由于菌种的特殊性，许多微生物次级代谢物的合成前体位于次级途径的合成基因簇上，因而其前体水平对次级代谢物的合成十分关键。通常情况下，次级途径代谢是特殊前体的主要供给方式，前体可以通过利用初级途径中间代谢物来合成。由于特殊前体物直接作为结构单元参与目标产物的聚合反应，因此通过对次级途径关键基因和关键酶的识别和基因操作可以优化特殊前体水平，直接提高目标产物的浓度。对于次级代谢产物生物合成过程，最有效的方法是扩增基因簇的整条次级代谢途径，或者强化表达次级途径的关键酶，也可以单独扩增基因簇中的限速步骤基因来提高生产能力，或者通过调节启动子的表达强度来改变基因的转录水平从而调节下游酶蛋白活性。Li等人^[3]扩增了华光霉素合成基因sanU和sanV，使该菌株的华光霉素产量比野生菌株提高了1.8倍。Zheng等人^[4]用红霉素强启动子ermEp*将杰多霉素jad基因簇上3.4kb的调节区域以及生物合成基因jadJ的自身启动子替换掉，结果显示杰多霉素发酵单位提高了2倍。闻建平等人^[5]将玫瑰孢链霉菌中编码达托霉素生物合成途径的基因簇上的非核糖体蛋白合成酶（NRPS）基因上下游附属关键基因dptE、dptF、dptG、dptH、dptI、dptJ，克隆到原始菌株中，筛选可直接用于达托霉素的工业化生产的转化菌株，最终其产量提高了20%-30%。Murrell等人^[6]将编码NDP-葡萄糖合酶基因sgc（参与4-脱氧-4-二甲氨基-5,5-二甲基-吡喃核糖的合成）在S.globisporus过表达，使得烯二炔抗肿瘤类药物C-1027提高了2倍，而同时扩增sgc基因和cagA基因（编码脱辅基蛋白）后C-1027产量可以提高4倍。

本文的专利发明点是根据筑波链霉菌基因组尺度目标基因模型预测的次级途径基因簇特殊结构基因作为改造靶点，进而指导菌株的次级途径基因簇特殊结构基因合成途径环己烷二羧酸合成途径、哌克酸合成途径、FK506后修饰途径分子改造，以此提高FK506的生产水平。因此，通过构建筑波链霉菌高精度基因组尺度代谢网络，确定次级途径结构扩增基因fkbO、fkbL、fkbP、fkbM、fkbD，进而通过对菌株的分子改造强化环己烷二羧酸、哌克酸、后修饰合成。

[1]Kim,T.Y.,S.B.Sohn,Y.B.Kim,et al.,Recent advances in reconstruction and applications ofgenome-scale metabolic models,Current Opinion in Biotechnology,2012,23(4):617-623.

[2]闻建平，王国英，贾晓强，黄笛，达托霉素生产菌玫瑰孢链霉菌的代谢网络分析方法，201010103477.4

[3]Li,Y.,H.Ling,W.Li,et al.,Improvement of nikkomycin production by enhanced copy of sanU and san Vin Streptomyces ansochromogenes and characterization of a novel glutamate mutase encoded by sanU andsan V,Metabolic Engineering,2005,7(3):165-173.

[4]Zheng,J.-T.,S.-L.Wang,and K.-Q.Yang,Engineering a regulatory region of jadomycin gene cluster toimprove jadomycin B production in Streptomyces venezuelae,Applied Microbiology and Biotechnology,2007,76(4):883-888.

[5]闻建平，宇光海，贾晓强,玫瑰孢链霉菌基因工程菌的构建方法及其应用，201010236729.0

[6]Murrell,J.M.,W.Liu,and B.Shen,Biochemical characterization of the SgcA1alpha-D-glucopyranosyl-1-phosphate thymidylyltransferase from the enediyne antitumor antibioticC-1027biosynthetic pathway and overexpression of sgcA1in Streptomyces globisporus to improveC-1027production,Journal of Natural Products,2004,67(2):206-213.

发明内容

本发明的目的是根据FK506生产菌基因组尺度目标基因预测的次级途径关键基因作为改造靶点，以此改造菌株的次级途径基因簇特殊途径（环己烷二羧酸合成途径、哌克酸合成途径、FK506后修饰途径）结构基因，进而提高FK506的生产水平。

本发明的技术方案如下：

一种基于FK506生产菌筑波链霉菌基因组尺度代谢网络模型指导下次级途径改造方法，步骤如下：

1)模型基于注释基因和生理生化信息，通过与天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）基因组比较分析，发现代谢基因是高度保守的；

2)对基因组尺度代谢网络进行代谢通量分析，模型预测了提高生产水平的突变菌次级途径基因簇改造策略。

本发明以蛋白胨、酵母提取物和黄豆饼粉为氨基酸唯一氮源。

按照f_PH的计算公式筛选FK506生物合成的次级途径扩增靶基因，

$f_{\mathrm{PH}}\≡\left(f_{\mathrm{biomass}}\right)\left(f_{\mathrm{FK}506}\right)=\left(\frac{v_{\mathrm{biomass},\mathrm{overexpression}}}{v_{\mathrm{biomass},\mathrm{wild}}}\right)\left(\frac{v_{\mathrm{FK}506,\mathrm{overexpression}}}{v_{\mathrm{FK}506,\mathrm{wild}}}\right).$

FK506生物合成的次级途径扩增靶基因为fkbO、fkbL、fkbP、fkbM和fkbD。

FK506生物合成的次级途径扩增靶基因簇改造策略是扩增分支酸水合还原酶、赖氨酸环化酶、NRPS肽合酶、C9羟基化酶和C31甲基化酶。

FK506生物合成的次级途径扩增靶基因步骤如下：

1）对次级途径基因fkbO、fkbL、fkbP、fkbM和fkbD进行基因扩增；

2）将基因改造菌株进行摇瓶前体补料培养，考察菌株改造前后FK506产量变化。

对预测出的关键基因，采用基因扩增的分子改造方法，构建扩增质粒pFKBO、pFKBL、pFKBP、pFKBM和pFKBD，将含目标基因质粒转入大肠杆菌ET12567，利用接合转移方法转入筑波链霉菌D852中，利用安普霉素抗性筛选和PCR验证方法获得基因扩增菌株HT-FKBO、HT-FKBL、HT-FKBP、HT-FKBM和HT-FKBD。

对改造的菌株进行摇瓶前体补料发酵培养，在摇瓶中28℃、220rpm培养168小时；产量比野生型提高了20%-90%；使用的培养基组成为：淀粉60g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨2.5g/L，黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，pH6.8，豆油和乳酸分别以5g/L和15g/L的终浓度于24h和36h添加，莽草酸、分支酸、赖氨酸和哌克酸分别以0.5g/L、0.25g/L、1.0g/L和0.25g/L的终浓度于48h添加，琥珀酸、异亮氨酸和缬氨酸分别以1.5g/L、1.0g/L和1.5g/L的终浓度于96h添加。

发明原理及方法具体说明如下：

FK506生产菌筑波链霉菌基因组尺度代谢网络模型，注释基因和生理生化信息，包括865个生化反应、621个代谢物。该网络有735个反应是唯一的，其余则是同工酶编码的相同反应。通过与天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）基因组比较分析，发现代谢基因是高度保守的。该模型主要包括糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸循环，丙酮酸代谢，乙醛酸循环代谢，生物量前体合成，辅酶合成，氮硫代谢以及卟啉等相关反应，此外还包括FK506及其副产物FK520、FK506D的合成途径反应，菌体合成反应。

对基因组尺度代谢网络进行代谢通量分析，模型预测了可以提高生产水平的突变菌次级途径基因簇改造策略，包括对分支酸水合还原酶、赖氨酸环化酶、NRPS肽合酶、C9羟基化酶和C31甲基化酶的单基因扩增。

以蛋白胨、酵母提取物和黄豆饼粉为氨基酸唯一氮源。

根据通量平衡分析计算获得的筑波链霉菌初始胞内通量分配，将每个非零通量反应分别扩大一倍，利用MOMA算法获得扩增后每个模拟菌株的胞内通量分配，按照f_PH的计算公式筛选FK506生物合成的次级途径扩增靶基因。

$f_{\mathrm{PH}}\≡\left(f_{\mathrm{biomass}}\right)\left(f_{\mathrm{FK}506}\right)=\left(\frac{v_{\mathrm{biomass},\mathrm{overexpression}}}{v_{\mathrm{biomass},\mathrm{wild}}}\right)\left(\frac{v_{\mathrm{FK}506,\mathrm{overexpression}}}{v_{\mathrm{FK}506,\mathrm{wild}}}\right)$

公式中，f_PH：表示菌体比生长速率和FK506比生成速率加权之积，f_biomass和f_FK506：表示菌体比生长速率和FK506比生成速率加权值，f_{biomass,overexpression}和f_{FK506,overexpression}表示预测目的基因扩增后菌体比生长速率和FK506比生成速率，f_biomass,wild和f_FK506,wild表示野生型菌体比生长速率和FK506比生成速率。

本发明的FK506生产菌筑波链霉菌基因组尺度代谢网络模型进行次级途径基因簇特殊结构基因分子改造，其特征步骤如下：

对预测得出的次级途径基因fkbO、fkbL、fkbP、fkbM和fkbD进行基因扩增；

将基因改造菌株进行摇瓶前体补料培养，考察菌株改造前后FK506产量变化。

对预测出的次级途径基因簇特殊结构基因，以S.tsukubaensis基因组为模板，分别以fkbO-F/fkbO-R，fkbL-F/fkbL-R，fkbP-F/fkbP-R，fkbM-F/fkbM-R，fkbD-F/fkbD-R为引物（下划线为酶切位点），扩增fkbO基因、fkbL基因、fkbP基因、fkbM基因和fkbD基因，PCR产物包括各个基因自身所带的核糖体结合位点。分别将fkbO基因、fkbL基因、fkbP基因、fkbM基因和fkbD基因PCR产物以NdeI-XbaI双酶切后连入同样酶切过的pIB139，连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞JM109或DH5α，转化后涂布到含有50μg/mL安普霉素的筛选平板上过夜培养。挑取单菌落活化，提质粒做双酶切或者PCR验证，最终获得质粒pFKBO、pFKBL、pFKBP、pFKBM和pFKBD。将含目标基因质粒转入大肠杆菌ET12567，利用接合转移方法转入筑波链霉菌D852中，利用安普霉素抗性筛选和PCR验证方法获得基因扩增菌株HT-FKBO、HT-FKBL、HT-FKBP、HT-FKBM和HT-FKBD。

对改造的菌株进行摇瓶前体补料发酵培养，在摇瓶中28℃、220rpm培养168小时；产量比野生型提高了50%-90%；使用的培养基组成为：淀粉60g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨2.5g/L，黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，pH6.8，豆油和乳酸分别以5g/L和15g/L的终浓度于24h和36h添加，莽草酸、分支酸、赖氨酸和哌克酸分别以0.5g/L、0.25g/L、1.0g/L和0.25g/L的终浓度于48h添加，琥珀酸、异亮氨酸和缬氨酸分别以1.5g/L、1.0g/L和1.5g/L的终浓度于96h添加。

改造菌株发酵产量比野生型提高了20%-90%，说明实验效果提高显著；最大FK506产量达到160-280mg/L。

本发明利用FK506生产菌筑波链霉菌基因组尺度目标基因预测次级途径基因簇特殊结构基因以提高菌株生产水平，实现菌株的途径分子改造方法。基于基因组尺度代谢网络模型，利用通量平衡分析和最小代谢调节分析预测了能够提高FK506产量的靶基因。根据菌株的实际生理代谢状态，从次级途径筛选到合理的基因改造策略，包括对分支酸水合还原酶、赖氨酸环化酶、NRPS肽合酶、C9羟基化酶和C31甲基化酶的单基因扩增。对预测出的五个次级途径基因簇特殊结构基因进行改造；对改造的菌株进行摇瓶前体补料发酵培养，产量比野生型提高了20%-90%，说明实验效果提高显著；最大FK506产量达到160-280mg/L。本发明采用基因组尺度目标基因预测筑波链霉菌次级途径基因簇特殊结构基因的改造方法，改造后菌株的生产水平提高了20%-90%。扩增基因簇中的特殊结构基因来提高生产能力，在微生物免疫抑制剂生产菌株的次级途径理性改造中有较大的应用价值，为菌株优化提供一种高效、系统的方法。

附图说明

图1筑波链霉菌FK506合成途径及模型预测的次级途径基因（fkbO、fkbL、fkbP、fkbM和fkbD）。

图2靶基因扩增质粒（pFKBO，pFKBL，pFKBP，pFKBM，pFKBD）的构建。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

模型基于注释基因和生理生化信息，包括865个生化反应、621个代谢物。该网络有735个反应是唯一的，其余则是同工酶编码的相同反应。通过与天蓝色链霉菌（Streptomycescoelicolor）基因组比较分析，发现代谢基因是高度保守的。该模型主要包括糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸循环，丙酮酸代谢，乙醛酸循环代谢，生物量前体合成，辅酶合成，氮硫代谢以及卟啉等相关反应，此外还包括FK506及其副产物FK520、FK506D的合成途径反应，菌体合成反应（图1）。

实施例2

根据实施例1预测次级途径基因簇特殊途径基因，由通量平衡分析计算获得的筑波链霉菌初始胞内通量分配，将每个非零通量反应分别扩大一倍，利用MOMA算法获得扩增后每个模拟菌株的胞内通量分配，按照f_PH的计算公式筛选FK506生物合成的次级途径扩增靶基因（图1）。

$f_{\mathrm{PH}}\≡\left(f_{\mathrm{biomass}}\right)\left(f_{\mathrm{FK}506}\right)=\left(\frac{v_{\mathrm{biomass},\mathrm{overexpression}}}{v_{\mathrm{biomass},\mathrm{wild}}}\right)\left(\frac{v_{\mathrm{FK}506,\mathrm{overexpression}}}{v_{\mathrm{FK}506,\mathrm{wild}}}\right)$ ，目标基因是fkbO、fkbL和fkbP、fkbM和fkbD。

实施例3

根据实施例2预测次级途径基因簇特殊途径基因——环己烷二羧酸合成途径基因fkbO、哌克酸合成途径基因fkbL和fkbP、FK506后修饰途径结构基因fkbM和fkbD，对筑波链霉菌进行分子改造。以S.tsukubaensis基因组为模板，分别以fkbO-F/fkbO-R，fkbL-F/fkbL-R，fkbP-F/fkbP-R，fkbM-F/fkbM-R，fkbD-F/fkbD-R为引物（表1），扩增fkbO基因、fkbL基因、fkbP基因、fkbM基因和fkbD基因，PCR产物包括各个基因自身所带的核糖体结合位点。分别将fkbO基因、fkbL基因、fkbP基因、fkbM基因和fkbD基因PCR产物以NdeI-XbaI双酶切后连入同样酶切过的pIB139，连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞JM109或DH5α，转化后涂布到含有50μg/mL安普霉素的筛选平板上过夜培养。挑取单菌落活化，提质粒做双酶切或者PCR验证，最终获得质粒pFKBO、pFKBL、pFKBP、pFKBM、pFKBD（图2）。将含目标基因质粒转入大肠杆菌ET12567，利用接合转移方法转入筑波链霉菌D852中，利用安普霉素抗性筛选和PCR验证方法获得基因扩增菌株HT-FKBO、HT-FKBL、HT-FKBP、HT-FKBM和HT-FKBD。

表1本研究中用到的引物

下划线为酶切位点

实施例4

对实施例3环己烷二羧酸合成途径特殊结构基因fkbO扩增菌株HT-FKBO进行摇瓶前体补料发酵培养，在摇瓶中28℃、220rpm培养168小时；产量比野生型提高了50%-90%；使用的培养基组成为：淀粉60g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨2.5g/L，黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，pH6.8，豆油和乳酸分别以5g/L和15g/L的终浓度于24h和36h添加，莽草酸、分支酸、赖氨酸和哌克酸分别以0.5g/L、0.25g/L、1.0g/L和0.25g/L的终浓度于48h添加，琥珀酸、异亮氨酸和缬氨酸分别以1.5g/L、1.0g/L和1.5g/L的终浓度于96h添加。环己烷二羧酸合成途径特殊结构基因fkbO扩增菌株HT-FKBO的最大生长量约为原始菌株的60%-80%，FK506产量比野生型提高了70%-90%。

实施例5

对实施例3哌克酸合成途径特殊结构基因fkbL扩增菌株HT-FKBL进行摇瓶前体补料发酵培养，在摇瓶中28℃、220rpm培养168小时；产量比野生型提高了50%-90%；使用的培养基组成为：淀粉60g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨2.5g/L，黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，pH6.8，豆油和乳酸分别以5g/L和15g/L的终浓度于24h和36h添加，莽草酸、分支酸、赖氨酸和哌克酸分别以0.5g/L、0.25g/L、1.0g/L和0.25g/L的终浓度于48h添加，琥珀酸、异亮氨酸和缬氨酸分别以1.5g/L、1.0g/L和1.5g/L的终浓度于96h添加。哌克酸合成途径特殊结构基因fkbL扩增菌株HT-FKBL的最大生长量约为原始菌株的60%-80%，FK506产量比野生型提高了60%-80%。

实施例6

对实施例3哌克酸合成途径特殊结构基因fkbP扩增菌株HT-FKBP进行摇瓶前体补料发酵培养，在摇瓶中28℃、220rpm培养168小时；产量比野生型提高了50%-90%；使用的培养基组成为：淀粉60g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨2.5g/L，黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，pH6.8，豆油和乳酸分别以5g/L和15g/L的终浓度于24h和36h添加，莽草酸、分支酸、赖氨酸和哌克酸分别以0.5g/L、0.25g/L、1.0g/L和0.25g/L的终浓度于48h添加，琥珀酸、异亮氨酸和缬氨酸分别以1.5g/L、1.0g/L和1.5g/L的终浓度于96h添加。哌克酸合成途径特殊结构基因fkbP扩增菌株HT-FKBP的最大生长量约为原始菌株的60%-80%，FK506产量比野生型提高了20%-50%。

实施例7

对实施例3FK506后修饰途径特殊结构基因fkbM扩增菌株HT-FKBM进行摇瓶前体补料发酵培养，在摇瓶中28℃、220rpm培养168小时；产量比野生型提高了50%-90%；使用的培养基组成为：淀粉60g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨2.5g/L，黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，pH6.8，豆油和乳酸分别以5g/L和15g/L的终浓度于24h和36h添加，莽草酸、分支酸、赖氨酸和哌克酸分别以0.5g/L、0.25g/L、1.0g/L和0.25g/L的终浓度于48h添加，琥珀酸、异亮氨酸和缬氨酸分别以1.5g/L、1.0g/L和1.5g/L的终浓度于96h添加。FK506后修饰途径特殊结构基因fkbM扩增菌株HT-FKBM的最大生长量约为原始菌株的60%-80%，FK506产量比野生型提高了30%-60%。

实施例8

对实施例3FK506后修饰途径特殊结构基因fkbD扩增菌株HT-FKBD进行摇瓶前体补料发酵培养，在摇瓶中28℃、220rpm培养168小时；产量比野生型提高了50%-90%；使用的培养基组成为：淀粉60g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨2.5g/L，黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，pH6.8，豆油和乳酸分别以5g/L和15g/L的终浓度于24h和36h添加，莽草酸、分支酸、赖氨酸和哌克酸分别以0.5g/L、0.25g/L、1.0g/L和0.25g/L的终浓度于48h添加，琥珀酸、异亮氨酸和缬氨酸分别以1.5g/L、1.0g/L和1.5g/L的终浓度于96h添加。FK506后修饰途径特殊结构基因fkbD扩增菌株HT-FKBD的最大生长量约为原始菌株的60%-80%，FK506产量比野生型提高了30%-60%。

经过试验，本发明在下述条件范围内，可达到需要的效果。

构建FK506生产菌筑波链霉菌基因组代谢网络模型，根据构建的代谢网络模型次级途径（环己烷二羧酸合成途径、哌克酸合成途径、FK506后修饰途径）筛选到合理的基因改造策略，包括对分支酸水合还原酶、赖氨酸环化脱氨酶、NRPS肽合酶、C9羟基化酶和C31甲基化酶的单基因扩增。对预测的目标基因进行分子改造，改造菌株在装有100mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，160-220rpm，25-30℃条件下培养120-196h，豆油和乳酸分别以5g/L和15g/L的终浓度于24h和36h添加，莽草酸、分支酸、赖氨酸和哌克酸分别以0.5g/L、0.25g/L、1.0g/L和0.25g/L的终浓度于48h添加，琥珀酸、异亮氨酸和缬氨酸分别以1.5g/L、1.0g/L和1.5g/L的终浓度于96h添加，可提高FK506的产量20%-90%。

Claims (8)

1.一种基于FK506生产菌筑波链霉菌基因组尺度代谢网络模型指导下次级途径改造方法，其特征步骤如下：

1)模型基于注释基因和生理生化信息，通过与天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)基因组比较分析，发现代谢基因是高度保守的；模型主要包括糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸循环、丙酮酸代谢、乙醛酸循环代谢、生物量前体合成、辅酶合成、氮硫代谢以及卟啉相关反应，此外还包括FK506及其副产物FK520、FK506D的合成途径反应、菌体合成反应；

2)对基因组尺度代谢网络进行代谢通量分析，模型预测了提高生产水平的突变菌次级途径改造基因。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：以蛋白胨、酵母提取物和黄豆饼粉为氨基酸唯一氮源。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：按照f_PH的计算公式筛选FK506生物合成的次级途径扩增靶基因，公式中，f_PH：表示菌体比生长速率和FK506比生成速率加权之积，f_biomass和f_FK506：表示菌体比生长速率加权值和菌体FK506比生成速率加权值，v_{biomass,overexpression}和v_{FK506,overexpression}表示预测目的基因扩增后菌体比生长速率和预测目的基因扩增后菌体FK506比生成速率，v_{biomass, wild}和v_FK506,wild表示野生型菌体比生长速率和野生型菌体FK506比生成速率。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于FK506生物合成的次级途径扩增靶基因为fkbO、fkbL、fkbP、fkbM和fkbD。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：FK506生物合成的次级途径扩增靶基因簇改造策略是扩增分支酸水合还原酶、赖氨酸环化酶、NRPS肽合酶、C9羟基化酶和C31甲基化酶。

6.根据权利要求5的方法，其特征是FK506生物合成的次级途径扩增靶基因步骤如下：

1)对FK506生物合成的次级途径扩增靶基因fkbO、fkbL、fkbP、fkbM和fkbD进行基因扩增；

2)将基因改造菌株进行摇瓶前体补料培养，考察菌株改造前后FK506产量变化。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：对预测出的关键基因，采用基因扩增的分子改造方法，构建扩增质粒pFKBO、pFKBL、pFKBP、pFKBM和pFKBD，将含目标基因质粒转入大肠杆菌ET12567，利用接合转移方法转入筑波链霉菌D852中，利用安普霉素抗性筛选和PCR验证方法获得基因扩增菌株HT-FKBO、HT-FKBL、HT-FKBP、HT-FKBM和HT-FKBD。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于：对改造的菌株进行摇瓶前体补料发酵培养，在摇瓶中28℃、220rpm培养168小时；产量比野生型提高了20％-90％；使用的培养基组成为：淀粉60g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨2.5g/L，黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，CaCO₃ 0.5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，pH 6.8，豆油和乳酸分别以5g/L和15g/L的终浓度于24h和36h添加，莽草酸、分支酸、赖氨酸和哌克酸分别以0.5g/L、0.25g/L、1.0g/L和0.25g/L的终浓度于48h添加，琥珀酸、异亮氨酸和缬氨酸分别以1.5g/L、1.0g/L和1.5g/L的终浓度于96h添加。