CN103146593A

CN103146593A - 生产l-氨基酸的微生物和生产l-氨基酸的方法

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Publication number: CN103146593A
Application number: CN2012103856575A
Authority: CN
Inventors: 植田拓嗣; 中井勇太; 郡司义哉; 泷川里绘; 城永祐志
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2004-01-30
Filing date: 2005-01-28
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2025-01-28
Also published as: EP1664318B1; DK1664318T3; US8383363B1; US20060019355A1; DE602005016763D1; ZA200602484B; EP1664318A2; MXPA06003775A; WO2005073390A3; PL1664318T3; ATE443757T1; KR20060084446A; CN101243177A; BRPI0506369B1; CN101243177B; BRPI0506369A; WO2005073390A2; KR100786987B1; US7629142B2; CN103146593B

Abstract

通过培养具有生产L-氨基酸的能力、但被修饰以使ybjE基因的表达被增强的微生物，来生产L-氨基酸。从培养基或从微生物收集L-氨基酸。

Description

生产L-氨基酸的微生物和生产L-氨基酸的方法

本申请是2005年1月28日提交的题为“生产L-氨基酸的微生物和生产L-氨基酸的方法”的国家申请号为200580001394.1(PCT/JP2005/001650)的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及通过使用微生物进行发酵来生产L-氨基酸的方法。特别地，本发明涉及生产L-氨基酸，例如L-赖氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸的方法。这些是工业上有用的L-氨基酸。换句话说，L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-脯氨酸作为动物饲料添加剂、健康食品的成分和氨基酸注射液是有用的。L-精氨酸和L-鸟氨酸作为肝功能促进剂、氨基酸输注液和全面氨基酸制品的成分是有用的。L-组氨酸作为肝功能促进剂和作为组胺的前体是有用的。L-苯丙氨酸作为甜味剂的前体是有用的。

背景技术

L-氨基酸通过使用属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)等的微生物进行发酵来工业化生产。

已经在EP 0857784A、JP 11-192088A、WO00/53726和WO96/17930中报道了生产L-赖氨酸的方法。已经在EP 0999267A、EP 1170358A和JP 2002-017342A中报道了生产L-精氨酸的方法。在这些报道的方法中，使用了产生碱性L-氨基酸的细菌菌株，包括从其天然或人工突变的菌株、和具有碱性L-氨基酸生物合成酶的增强活性的重组菌株分离的菌株。

此外，也已经报道了使用属于嗜甲基菌属(Methylophilus)或甲基菌属(Methylobacillus)的突变的或遗传修饰的微生物菌株来从甲醇生产L-氨基酸的方法(WO00/61723和JP 2001-120269A)，甲醇用于发酵是可以低成本大量地获得的。

修饰细菌细胞中L-氨基酸的摄取和输出的方法是公知的，用来改善所述细菌的L-氨基酸生产能力。修饰L-氨基酸摄取的方法包括消除或降低L-氨基酸摄取进入细胞来增强L-氨基酸生产能力。特别地，这些方法包括删除gluABCD操纵子或其部分以消除或减弱L-谷氨酸摄取的方法(EP 1038970A)。

修饰输出体的方法包括消除或降低L-氨基酸生物合成的中间体或底物的输出，和增强生产的L-氨基酸的输出的方法。对于消除或降低L-谷氨酸生物合成的中间体输出的方法，突变或破坏α-酮基戊二酸通透酶基因以减少α-酮基戊二酸的输出的方法是已知的(WO01/005959)。

对于增强L-氨基酸输出的方法，增强棒杆菌属细菌的菌株中lysE(碱性L-氨基酸输出体的基因；J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，1999Nov；1(2)：327-36)的方法是已知的，用于生产L-赖氨酸(WO97/23597)或L-精氨酸(美国专利公开2003-0113899)。在埃希氏杆菌属细菌的细胞中增强rhtA、B、C基因(JP 2000-189177A)和yfiK、yahN基因(EP 1016710A)的表达的方法也是已知的，已经提示了这些基因涉及L-氨基酸的输出。

对于用于碱性L-氨基酸的输出的基因，上述的lysE基因是已知的。然而，当lysE基因在同化甲醇的细菌例如嗜甲基菌属细菌中扩增，并且产生的菌株被用于L-赖氨酸或L-精氨酸的生产时，来源于Coryneform(棒状杆菌)细菌的野生型lysE基因对于嗜甲基菌属细菌是致命的，因而必须导入容许宿主微生物生长的突变lysE基因(EP1266966A)。因此，当被导入到异体微生物中时，lysE基因不总是能在L-赖氨酸或L-精氨酸的输出方面起作用。因此，期望获得在各种异体宿主微生物中展现出分泌足够量的L-氨基酸、包括L-赖氨酸和L-精氨酸的能力的，用于L-氨基酸输出体和生产的基因。

ybjE基因位于大肠杆菌的基因组上，已经被预测编码推定的表面蛋白(Science，277(5331)：1453-74，1997)。然而，还没有报道该基因的克隆和通过在细菌细胞中表达进行分析，因而它的生理功能仍然是未知的。

发明概述

本发明的目的是提供能有效地生产L-氨基酸的菌株。本发明的另一个目的是提供使用这样的菌株有效地生产L-氨基酸的方法。

本发明的发明人勤勉地研究以实现上述的目的，结果，根据对高浓度L-赖氨酸的抗性，获得了ybjE基因，一种新型的L-氨基酸输出体基因。此外，他们还发现，L-氨基酸，包括碱性L-氨基酸例如L- 赖氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸和L-组氨酸；脂肪族的L-氨基酸例如L-异亮氨酸；羟基L-氨基酸例如L-苏氨酸；环状L-氨基酸例如L-脯氨酸；芳香族L-氨基酸例如L-苯丙氨酸；含硫的L-氨基酸例如L-半胱氨酸；和酸性L-氨基酸例如L-谷氨酸，可以使用在其中ybjE基因的表达被增强的微生物来有效地生产。

本发明的目的是提供具有L-氨基酸生产能力的微生物，其中所述微生物被修饰从而ybjE基因的表达被增强。

本发明的进一步的目的是提供如上所述的微生物，其中通过提高所述ybjE基因的拷贝数目，或通过修饰所述ybjE基因的表达调节序列来增强所述ybjE基因的表达。

本发明的进一步的目的是提供如上所述微生物，其中由所述ybjE编码的蛋白质的氨基酸序列选自SEQ 2、9和10，其中所述蛋白质具有L-氨基酸输出能力。

本发明的进一步的目的是提供如上所述微生物，其中所述ybjE基因选自：

(a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA；和

(b)在严格条件下与SEQ ID NO：1的核苷酸序列、或与可从SEQ ID NO：1的核苷酸序列制备的探针可杂交的DNA，并且其中所述DNA编码具有L-氨基酸输出能力的蛋白质。

(a)具有SEQ ID NO：1中核苷酸编号49到948的核苷酸序列的DNA；和

(b)在严格条件下与SEQ ID NO：1中核苷酸编号49到948的核苷酸序列、或与可从SEQ ID NO：1中核苷酸编号49到948的核苷酸序列制备的探针可杂交的DNA，并且其中所述DNA编码具有L-氨基酸输出能力的蛋白质。

本发明的进一步的目的是提供如上所述的微生物，其中所述微生物的所述L-氨基酸输出能力通过所述增强所述ybjE基因的表达来提高。

本发明的进一步的目的是提供如上所述的微生物，其中微生物对L-氨基酸或L-氨基酸类似物的抗性通过所述增强所述ybjE基因的表达来提高。

本发明的进一步的目的是提供如上所述微生物，其中所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸。

本发明的进一步的目的是提供如上所述微生物，其中所述微生物属于肠细菌家族。

本发明的进一步的目的是提供如上所述微生物，其中所述属于肠细菌家族的微生物是属于埃希氏杆菌属的微生物。

本发明的进一步的目的是提供如上所述微生物，其中所述微生物是Coryneform细菌。

本发明的进一步的目的是提供如上所述微生物，其中所述微生物是同化甲醇的微生物。

本发明的进一步的目的是提供如上所述微生物，其中所述同化甲醇的微生物属于嗜甲基菌属或甲基菌属。

本发明的进一步的目的是提供生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养如上所述的微生物来产生和引起所述L-氨基酸的积累，并从培养基或微生物收集所述L-氨基酸。

本发明的进一步的目的是提供生产L-氨基酸的方法，包括在含有甲醇作为主要碳源的液体培养基中培养如上所述的微生物来产生和引起所述L-氨基酸的积累，并从所述培养基或所述微生物收集所述L-氨基酸。

本发明的进一步的目的是提供如上所述方法，其中所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸。

附图的简要说明

附图1显示了用于在埃希氏菌属细菌中扩增ybjE基因的质粒的构建方案。

附图2显示了在存在高浓度L-赖氨酸的情况下对照菌株和扩增了ybjE基因的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)菌株的生长曲线。

附图3显示了在存在高浓度L-赖氨酸的情况下对照菌株和破坏了ybjE基因的大肠埃希氏菌菌株的生长曲线。

附图4显示了用于在同化甲醇的细菌中扩增ybjE基因的质粒的构建方案。

附图5显示了用于使用同化甲醇的细菌生产L-赖氨酸的质粒的构建方案。

附图6显示了在存在L-赖氨酸类似物的情况下对照菌株和扩增了ybjE基因的食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)菌株的生长曲线。

附图7显示了在存在高浓度L-异亮氨酸的情况下对照菌株和扩增了ybjE基因的大肠埃希氏菌菌株的生长曲线。

附图8显示了在存在高浓度L-谷氨酸的情况下对照菌株和扩增了ybjE基因的大肠埃希氏菌菌株的生长曲线。

附图9显示了在存在高浓度L-苏氨酸的情况下对照菌株和扩增了ybjE基因的大肠埃希氏菌菌株的生长曲线。

附图10显示了在存在高浓度L-组氨酸的情况下对照菌株和扩增了ybjE基因的大肠埃希氏菌菌株的生长曲线。

附图11显示了在存在高浓度L-脯氨酸的情况下对照菌株和扩增了ybjE基因的大肠埃希氏菌菌株的生长曲线。

附图12显示了在存在高浓度L-鸟氨酸的情况下对照菌株和扩增了ybjE基因的大肠埃希氏菌菌株的生长曲线。

附图13显示了在存在高浓度L-苯丙氨酸的情况下对照菌株和扩增了ybjE基因的大肠埃希氏菌菌株的生长曲线。

附图14显示了在存在高浓度L-半胱氨酸的情况下对照菌株和扩增了ybjE基因的大肠埃希氏菌菌株的生长曲线。

附图15显示了在存在高浓度L-精氨酸的情况下对照菌株和扩增了ybjE基因的大肠埃希氏菌菌株的生长曲线。

附图16显示了在存在高浓度L-赖氨酸的情况下对照菌株和扩增了ybjE(948bp或900bp)基因的大肠埃希氏菌菌株的生长曲线。

优选实施方式的详细说明

以下，将详细解释本发明。

<1>本发明的微生物

本发明的微生物具有生产L-氨基酸的能力，并已经被修饰从而ybjE基因的表达被增强。在此使用的用语“生产L-氨基酸的能力(L-氨基酸生产能力)”意思是，当本发明的微生物在培养基中培养时，引起L-氨基酸在培养基中或在微生物的细胞中积累的能力。本发明的微生物可以具有生产多种类型的L-氨基酸的能力。具有L-氨基酸生产能力的微生物可以是原本具有L-氨基酸生产能力的微生物，或可以是通过使用诱变技术或重组DNA技术修饰以下提及的微生物的亲本菌株使得微生物具有L-氨基酸生产能力的微生物。本发明的微生物也可以是已经通过增强ybjE基因表达获得了L-氨基酸生产能力的微生物。

在本发明中要生产的L-氨基酸没有特别的限制，包括碱性L-氨基酸例如L-赖氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-组氨酸和L-瓜氨酸；脂肪族的L-氨基酸例如L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-甘氨酸；羟基L-氨基酸例如L-苏氨酸和L-丝氨酸；环状的L-氨基酸例如L-脯氨酸；芳香族L-氨基酸例如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸；含硫的L-氨基酸例如L-半胱氨酸、胱氨酸和L-甲硫氨酸；和酸性L-氨基酸和它们的酰胺例如L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺。本发明的微生物可以具有生产两种或多种类型的这些L-氨基酸的能力。

<赋予L-氨基酸生产能力>

以下将描述在本发明中使用的具有L-氨基酸生产能力的微生物的实例。然而，微生物不局限于所述实例，而包括具有L-氨基酸生产能力的任何微生物。

对于本发明的微生物的亲本菌株，可以使用肠细菌家族例如埃希氏菌属细菌、泛菌属(Pantoea)细菌或Coryneform细菌等等。此外，也可以使用同化甲醇的细菌，例如嗜甲基菌属细菌和甲基菌属细菌，其能从甲醇生产L-氨基酸。此外，亲本菌株的实例包括属于γ-蛋白细菌的肠细菌家族，包括属于埃希氏菌属、泛菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)和摩根氏菌属(Morganella)的细菌，和其他细菌，包括脂环酸杆菌属 (Alicyclobacillus)细菌和芽孢杆菌属(Bacillus)细菌，和酵母，包括属于酵母菌属(Saccharomyces)、假丝酵母菌属(Candida)属的那些，等等。这些亲本菌株可以天生具有ybjE基因，或可以不是天生地具有ybjE基因并且当导入ybjE基因时展现出改善的L-氨基酸输出能力。

可以使用在Neidhardt等(Neidhardt，F.C.等人，大肠埃希氏菌and Salmonella Typhimurium，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1208，表1)中报道的埃希氏菌属细菌，例如大肠埃希氏菌。大肠埃希氏菌野生型菌株的实例包括，但不限于，K12菌株和其衍生物、大肠埃希氏菌MG1655菌株(ATCC No.47076)和W3110菌株(ATCC No.27325)。这些菌株可从美国典型培养物保藏所(ATCC，地址：P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，United Statesof America)获得。

肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等。泛菌属细菌的实例包括菠萝泛菌(Pantoea ananatis)等。尽管最初被分类为产气肠杆菌的某些细菌现在根据16S rRNA分析被分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)，在本发明中使用的属于肠杆菌家族的微生物可以是肠杆菌属细菌或者泛菌属细菌。菠萝泛菌(Pantoea ananatis)的具体实例包括Pantoea ananatis AJ13355(FERM BP-6614)、Pantoeaananatis AJ13356(FERM BP-6615)、Pantoea ananatis AJ13601(FERMBP-7207)，和它们的衍生物。这些菌株最初作为成团肠杆菌被鉴定和保藏，现在被分类为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)。

嗜甲基菌属细菌的实例包括，但不限于，食甲基嗜甲基菌，食甲基嗜甲基菌的典型实例包括AS1菌株(NCIMB10515)等。食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB 10515)可以从国家工业和海洋细菌保藏所(地址：NCIMB Lts.，Torry Research Station，135，Abbey Road，Aberdeen AB9 8DG，United Kingdom)获得。

甲基菌属细菌的实例包括，但不限于，糖原甲基菌(Methylobacillusglycogenes)，Methylobacillus flagellatum，等等。糖原甲基菌的实例包括T-11菌株(NCIMB 11375)、ATCC 21276菌株、ATCC 21371 菌株、ATR80菌株(Appl.Biotechnol.Biotechnol.，vol.42，pp.67-72(1994))、A513菌株(Appl.Microbiol.Biotechnol.，vol.42，pp.67-72(1994))，等等。甲基菌属glycogenes NCIMB 11375菌株可以从国家工业和海洋细菌保藏所(地址：NCIMB Lts.，Torry ResearchStation，135，Abbey Road，Aberdeen AB98DG，United Kingdom)获得。Methylobacillus flagellatum的实例包括KT菌株(Arch.Microbiol.，vol.149，pp.441-446(1988))等等。

Coryneform细菌是在Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology，8th Ed.，p.599(1974)中定义的一组微生物，可被用于本发明。这些微生物被分类为需氧的、格兰氏阳性的和不能形成孢子的非抗酸性杆菌。Coryneform细菌还包括那些迄今已经被分类到短杆菌属中、但是当前合并到棒杆菌属的那些细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))，以及属于短杆菌属或微杆菌属(Microbacterium)、与棒杆菌属近相关的细菌。

这种Coryneform细菌的实例如下所列。

嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)

Corynebacterium alkanolyticum

美棒杆菌(Corynebacterium callunae)

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)

Corynebacterium melassecola

Corynebacterium thermoaminogenes(Corynebacterium efficiens)

力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)

乳发酵短杆菌(Brevibacterium divaricatum)

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)

Brevibacterium immariophilum

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)

产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagens)

白色短杆菌(Brevibacterium album)

蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)

嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)

特别地，可以例举以下菌株。

嗜乙酰乙酸杆菌ATCC13870

醋谷棒杆菌ATCC 15806

Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511

美棒杆菌ATCC15991

谷氨酸棒杆菌ATCC13020，ATCC13032，ATCC13060

百合花棒杆菌ATCC15990

Corynebacterium melassecola ATCC 17965

Corynebacterium efficiens AJ12340(FERM BP-1539)

力士棒杆菌ATCC13868

乳发酵短杆菌ATCC14020

黄色短杆菌ATCC13826，ATCC14067，AJ12418(FERM BP-2205)

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068

乳发酵短杆菌ATCC13869(谷氨酸棒杆菌ATCC13869)

玫瑰色短杆菌ATCC13825

解糖短杆菌ATCC14066

生硫短杆菌ATCC19240

Corynebacterium ammoniagenes ATCC6871，ATCC6872

白色短杆菌ATCC15111

蜡状短杆菌ATCC15112

嗜氨微杆菌ATCC15354

这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏所获得。每个菌株被给予了一个唯一的登记号，其被列在美国典型培养物保藏所的目录中。使用这个登记号可以订购菌株。此外，AJ12340菌株根据布达佩斯条约的规定作为国际保藏于1987年10月27日保藏在国家生物科学和人类技术学会，工业科技机构，通产省(the National Institute ofBioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of International Trade and Industry)(目前，独立的管理机构，国家高级工业科技学会，国际专利保藏机构(TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，postal code：305-5466))，收到的登记号是FERM BP-1539。AJ12418菌株根据根据布达佩斯条约的规定作为国际保藏于1989年1月5日保藏在国家高级工业科技学会，国际专利保藏机构，收到的登记号是FERM BP-2205。

在下文中，将说明赋予如上所述的亲本菌株L-氨基酸生产能力的方法。

为了赋予L-氨基酸生产能力，可以使用通常用来培育属于埃希氏菌属或Coryneform细菌属的L-氨基酸生产细菌的方法。例如，可以使用用于获得具有L-氨基酸生产能力的营养突变菌株、类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株的方法，和用于产生具有增强的L-氨基酸生物合成酶活性的重组菌株的方法(″Amino Acid Fermentation″，theJapan Scientific Societies Press[Gakkai Shuppan Center]，1stEdition，published on May 30，1986，pp.77-100)。当使用这些方法培育L-氨基酸生产细菌时，可以赋予一种或多种性质，包括营养缺陷型、类似物抗性和代谢调节突变。

当产生重组菌株时，可以增强单个或多个L-氨基酸生物合成酶的活性。此外，赋予营养缺陷型、类似物抗性和代谢调节突变性质的方法可以与增强L-氨基酸生物合成酶活性的方法组合。

具有L-氨基酸生产能力的营养突变菌株、L-氨基酸类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株，可以通过使亲本或野生型菌株经历典型的诱变处理，例如X射线或紫外线照射、用例如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)的诱变试剂处理来获得。然后，可以从突变的菌株中挑选具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷菌株、类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株。

L-赖氨酸类似物的实例包括溶菌素、赖氨酸异羟肟酸盐S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺、正亮氨酸，等等。L-精氨酸类似物的实例包括精氨酸异羟肟酸盐、高精氨酸、D-精氨酸、刀豆氨酸、精氨酸异羟肟酸盐。

具有L-赖氨酸生产能力的L-赖氨酸类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株的具体实例包括大肠埃希氏菌AJ11442菌株(FERMBP-1543，NRRL B-12185、JP 56-18596A和美国专利4,346,170)，大肠埃希氏菌VL611菌株(JP 2000-189180A)，等等。此外，WC196菌株(WO96/17930)也可以被用作L-赖氨酸生产大肠埃希氏菌。WC196菌株最初是通过给W3110菌株赋予AEC(S-(2-氨乙基)半胱氨酸)抗性而培育的，W3110菌株来源于大肠埃希氏菌K-12。WC196菌株被命名为大肠埃希氏菌AJ13069菌株(Escherichia coliAJ13069)，于1994年12月6日保藏在独立的管理机构，国际专利保藏机构通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，postal code：305-8566))，收到的登记号是FERM P-14690。之后，于1995年9月29日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，收到的登记号是FERM BP-5252。

具有L-赖氨酸生产能力的Coryneform细菌的实例包括S-(2-氨乙基)半胱氨酸(在下文中“AEC”)-抗性突变菌株，包括乳发酵短杆菌(乳发酵短杆菌)AJ11082(NRRL B-11470)(在JP56-1914B、JP56-1915B、JP57-14157B、JP57-14158B、JP57-30474B、JP58-10075B、JP59-4993B、JP61-35840B、JP62-24074B、JP62-36673B、JP5-11958B、JP7-112437B和JP7-112438B中描述了)，对氨基酸例如L-高丝氨酸有营养缺陷的突变菌株(JP48-28078B和JP56-6499B)，对AEC有抗性和对氨基酸例如L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸和L-缬氨酸有营养缺陷的突变菌株(美国专利3,708,395和3,825,472)，对DL-α-氨基-ε-己内酰胺、α-氨基-月桂基内酰胺、天冬氨酸类似物、磺胺药、醌型化合物、和N-月桂酰亮氨酸有抗性的L-赖氨酸生产突变菌株，对草酰乙酸酯脱羧酶抑制物或呼吸道酶抑制物有抗性的L-赖氨酸生产突变菌株(JP50-53588A、JP50-31093A、JP52-102498A、JP53-9394A、JP53-86089A、JP55-9783A、JP55-9759A、JP56-32995A、JP56-39778A、JP53-43591B和JP53-1833B)，对环己六醇或乙酸有营养缺陷的L-赖氨酸生产突变菌株(JP55-9784A和JP56-8692A)，对氟丙酮酸或34℃或更高温度敏感的L-赖氨酸生产突变菌株(JP55-9783A和JP53-86090A)，对乙二醇有抗性的短杆菌属或棒杆菌属细菌的L-赖氨酸生产突变菌株(美国专利4,411,997)，等等。

L-氨基酸生产能力也可以通过增强编码L-氨基酸生物合成酶的基因的表达来赋予。

例如，L-赖氨酸生产能力可以通过增强编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因和编码天冬氨酸激酶的基因的表达来赋予。也就是说，通过将编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因片段和编码天冬氨酸激酶的基因片段连接到载体、优选的多拷贝载体中来制备重组DNA，所述载体在用于L-赖氨酸生产的宿主微生物中是可操作的。作为转化的结果，在宿主细胞中编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因和编码天冬氨酸激酶的基因的拷贝数增加，从而这些酶的活性增强。在下文中，二氢吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸激酶和天冬氨酸激酶III也按它们各自的缩写DDPS、AK和AKIII来称谓。

编码DDPS和AK的基因没有特别的限制，只要它们编码分别具有DDPS或AK活性的蛋白质。这种基因的实例包括大肠埃希氏菌、食甲基嗜甲基菌、谷氨酸棒杆菌等的基因。由于DDPS基因(dapA，Richaud，F.等人，J.Bacteriol.，(1986))和AKIII基因(lysC，Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.and Patte，J.C.，J.Biol.Chem.，261，1052(1986))的核苷酸序列是已知的，这些基因可以通过使用根据它们的核苷酸序列序列设计的引物进行PCR、从微生物例如E.coliK-12菌株的染色体DNA获得。在下文中，通过来源于E.coli的dapA和lysC来例示编码DDPS的基因和编码AK的基因，但是编码DDPS的基因和编码AK的基因不限于dapA和lysC。

已知的是，来源于大肠埃希氏菌的野生型DDPS受L-赖氨酸的反馈抑制，来源于大肠埃希氏菌的野生型AKIII受L-赖氨酸的抑制和反馈抑制。因此，当使用dapA和lysC时，优选的使用对L-赖氨酸的反馈抑制有抗性的编码DDPS和AK的突变基因。在下文中，具有免受L-赖氨酸的反馈抑制的突变的DDPS也可以被称为“突变DDPS”，编码突变DDPS的DNA也可被称为“突变dapA”或“dapA＊”。来源于大肠埃希氏菌具有消除L-赖氨酸的反馈抑制的突变的AKIII也可以被称为“突变AKIII”，编码突变AKIII的DNA也可被称为“突变lysC”。来源于Corynebacterium细菌的DDPS原本就对L-赖氨酸的反馈抑制有抗性，因而用于本发明的DDPS和AK不必是突变的。

编码对L-赖氨酸的反馈抑制有抗性的突变DDPS的DNA的实例包括编码具有一氨基酸序列的DDPS的DNA，所述氨基酸序列包括用酪氨酸取代118-组氨酸残基。(U.S.专利5,661,012和6,040,160)。此外，编码对L-赖氨酸的反馈抑制有抗性的突变AKIII的DNA的实例包括编码具有一氨基酸序列的AKIII的DNA，所述氨基酸序列包括用异亮氨酸取代352-苏氨酸残基。(U.S.专利5,661,012和6,040,160)。突变DNA可以通过使用PCR的定点诱变技术等来获得。

用于基因克隆的质粒可以是任何质粒，只要它可以在微生物中复制，其具体实例包括pBR322、pTWV228(Takara Bio)、pMW119(Nippon Gene)、pUC19，等等。

用于转化的、在宿主微生物中可操作的载体是可在每种微生物的细胞中自主复制的质粒。大肠埃希氏菌载体的具体实例包括pSTV29(Takara Bio)、RSF1010(Gene，vol.75(2)，pp.271-288，1989)、pUC19、pBR322、pMW119，等等。也可以使用噬菌体DNA载体。嗜甲基菌属细菌的载体，例如，是在嗜甲基菌属细菌的细胞中可自主复制的质粒。嗜甲基菌属细菌的载体的具体实例包括RSF1010和其衍生物，例如pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.Plasmid，16，161-167(1986))、pMFY42(Gene，44，53(1990))、pRP301和pTB70(Nature，287，396，(1980))。在Coryneform细菌中可操作的的载体的实例包括pAM330(JP58-67699A)、pHM1519(JP58-77895A)和pSFK6(JP2000-262288A)。此外，通过切除允许质粒在Coryneform细菌中自主复制的DNA片段，并将该片段插入到大肠埃希氏菌载体中所获得的质粒，可被用作所谓的穿梭载体，其在大肠埃希氏菌和Coryneform细菌中都是可自主复制的。

为了通过将dapA和lysC与任何上述载体连接制备重组DNA，可以使用限制性内切酶来消化含dapA和lysC的DNA片段以及所述载体。通常使用连接酶例如T4DNA连接酶来进行连接。dapA和lysC可以被掺入到独立的载体中或单个载体中。可用于限制性内切酶消化、DNA连接、染色体DNA制备、PCR、质粒DNA制备、转化、寡核苷酸引物设计等等的方法，可以是本领域技术人员公知的常规方法。在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.，″MolecularCloning A Laboratory Manual，Second Edition″，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等等中描述了这样的方法。为了将如上所述制备的重组DNA导入到微生物中，只要达到足够的转化效率，可以使用任何方法。例如，可以应用电穿孔(Canadian Journal ofMicrobiology，43，197(1997))。

可以使用广宿主范围的质粒RSFD80(美国专利6,040,160)作为含有编码突变DDPS的突变dapA和编码突变AKIII的突变lysC的质粒。用RSFD80转化的大肠埃希氏菌JM109菌株被称为AJ12396(美国专利6,040,160)，这个菌株于1993年10月28日被保藏在独立的管理机构，国家高级工业科技学会，国际专利保藏机构，收到的登记号是FERM P-13936。之后，于1995年11月1日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，收到的登记号是FERM BP-4859。RSFD80可以通过已知的方法从AJ12396菌株获得。

DDPS基因和AK基因的表达也可以通过将多个拷贝的dapA和lysC整合到微生物的染色体DNA中来增强。为了将多拷贝的dapA和lysC导入到微生物的染色体DNA中，可以通过靶向多拷贝存在于染色体DNA上的序列来进行同源重组。存在于转座元件末端的重复DNA或反向重复可被用作多拷贝存在于染色体DNA上的序列。做为选择，如在JP2-109985A中公开的，多拷贝的dapA和/或lysC可通过使用转座子导入到染色体DNA中。在这两种方法中，作为在转化的菌株中提高的dapA和lysC拷贝数的结果，DDPS和AK的活性增强了。

除了上述基因扩增方法之外，DDPS基因和AK基因的表达也可以通过用更强的序列替换表达调节序列，例如dapA和lysC的启动子来增强(JP1-215280A)。这种强启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、lambda噬菌体的P_R启动子和P_L启动子、tet启动子、amyE启动子、spac启动子，等等。插入这些启动子代替天然启动子增强了dapA和lysC的表达，引起DDPS和AK活性的增强。增强表达调节序列可以与扩大dapA和lysC的拷贝数相组合。

L-氨基酸生产能力也可以通过增强编码除DDPS和AK之外的L-氨基酸生物合成酶的基因的表达来赋予。这种酶的实例包括二氨基庚二酸酯合成途径的酶，例如二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱氢酶(WO96/40934)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(JP60-87788A)、天冬氨酸转氨酶(JP6-102028B)、二氨基庚二酸表异构酶(JP2003-135066A)和天冬氨酸半醛脱氢酶(WO00/61723)。这种酶的进一步的实例包括氨基己二酸途径酶，例如同型乌头酸水合酶(JP2000-157276A)等等。增强这些酶的基因表达可以与增强DDPS和AK基因的表达相组合。

此外，具有L-赖氨酸生产能力的微生物也可以通过降低或消除催化一反应的酶的细胞内活性来获得，所述反应用于合成除L-赖氨酸之外的化合物，并且是L-赖氨酸生物合成途径的分支。这种酶的实例包括高丝氨酸脱氢酶和赖氨酸脱羧酶。在WO95/23864和WO96/17930中描述了在其中这些酶的活性被降低的菌株。

降低或消除酶的细胞内活性的方法的实例包括突变或删除微生物的细胞内编码所述酶的基因，使得与非突变菌株相比细胞内活性被降低或消除。突变或删除基因的方法的实例包括修饰表达调节序列，例如启动子和Shine-Dalgarno(SD)序列，向开发阅读框中导入错义突变、非有义突变、或框架平移突变，和删除基因的部分(J Biol Chem.1997 272(13)：8611-7)。可以通过使用同源重组技术或通过使用转座子或IS因子将突变的基因导入到微生物中，在所述同源重组技术中染色体上的野生型基因被替换为所述突变的基因。同源重组技术包括使用线性DNA、温度敏感质粒和非可复制质粒的方法。在Proc NatlAcad Sci U S A.2000Jun 6；97(12)：6640-5.、美国专利6303383、JP05-007491A等中描述了这些方法。

增强和降低L-赖氨酸生物合成酶活性的方法适合于赋予另一种L-氨基酸生产能力。具有生产L-精氨酸能力的大肠埃希氏菌的具体实例包括对α-甲基甲硫氨酸、p-氟苯丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸异羟肟酸盐、S-（2-氨乙基）半胱氨酸、α-甲基丝氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、或磺胺胍有抗性的突变菌株（JP No.56-106598A），等等。此外，也可以使用大肠埃希氏菌237菌株（Escherichia coli 237），其是L-精氨酸生产细菌，具有赋予L-精氨酸反馈抑制抗性的突变，并展现出高的N-乙酰谷氨酸合酶活性（俄国专利申请No.2000117677）。这个菌株于2000年4月10日保藏在俄国工业微生物国家保藏所（VKPM），GNII Genetika，保藏号VKPM B-7925，于2001年5月18日根据布达佩斯条约的规定转成国际保藏。也可以使用来源于237菌株、并具有增强的醋酸盐同化能力的大肠埃希氏菌382菌株（JP2002-017342A）。大肠埃希氏菌382菌株于2000 年4月10日保藏在俄国工业微生物国家保藏所（VKPM），保藏号VKPM B-7926。

具有L-精氨酸生产能力的Coryneform细菌的实例包括不仅对2-噻唑丙氨酸有抗性、而且对于L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸或L-色氨酸也是营养缺陷的Coryneform细菌的菌株(JP54-44096A)，对酮丙二酸、氟丙二酸或单氟乙酸有抗性的Coryneform细菌的菌株(JP57-18989A)，对精氨醇有抗性的Coryneform细菌的菌株(JP62-24075A)，对X-胍有抗性的Coryneform细菌的菌株(X代表脂肪酸或脂肪链的衍生物，JP2-186995A)，对精氨酸异羟肟酸盐和6-氮尿嘧啶有抗性的Coryneform细菌的菌株(JP57-150381A)，ArgR(精氨酸生物合成酶的阻抑蛋白)有缺陷的Coryneform细菌的菌株(JP2002-51790A)，等等。

可以通过类似于用于L-赖氨酸生物合成酶的上述方法来增强L-精氨酸、L-组氨酸、L-鸟氨酸和其他L-氨基酸的生物合成酶的活性。

L-精氨酸生物合成酶的实例包括一种或多种选自以下的酶：N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨磷酸酯还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(argE)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(argF)、精氨基琥珀酸合酶(argG)、精氨基琥珀酸裂解酶(argH)和氨甲酰基磷酸酯合酶(carAB)。编码这些酶的基因的名称分别在酶的名字后的括号中给出。在其中这些酶的活性增强了的菌株的实例包括，例如，在JP2000-287693A、JP2000-197490A、JP07-028749B等等中描述的菌株。

也可以通过增强编码谷氨酸脱氢酶的基因的表达(EP1057893A)或增强谷氨酸合成酶活性(US2005-00142236)来赋予L-精氨酸生产能力。已知的是，L-精氨酸生物合成酶受L-精氨酸的抑制，因此L-精氨酸生产能力也可以通过删除精氨酸阻遏物或通过向N-乙酰谷氨酰胺合酶中导入赋予反馈抑制抗性的突变来(EP1154020A和EP1170361A)有效地增强。

此外，对组氨酸类似物或色氨酸类似物有抗性的Bacillus细菌(JP52-114092A)，对L-甲硫氨酸、L-组氨酸、L-苏氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、腺嘌呤、鸟嘌呤和尿嘧啶(或尿嘧啶前体) 的至少一个是营养缺陷的芽孢杆菌属细菌(JP52-99289A)，对精氨酸异羟肟酸盐有抗性的芽孢杆菌属细菌，对丁二酸是营养缺陷的或对核苷酸类似物有抗性的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)(JP58-9692A)，在代谢精氨酸的能力方面有缺陷的、对精氨酸拮抗物和刀豆氨酸有抗性的、对赖氨酸是营养缺陷的粘质沙雷氏菌(JP52-8729A)，对精氨酸、精氨酸异羟肟酸盐、高精氨酸、D-精氨酸、刀豆氨酸、精氨酸异羟肟酸盐和6-氮尿嘧啶有抗性的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(JP53-143288A)，对刀豆氨酸有抗性的热带假丝酵母(Candida tropicalis)(JP53-3586A)等等，也可被用作L-精氨酸生产菌株。

L-组氨酸生物合成酶的实例包括ATP磷酸核糖转移酶(hisG)、磷酸核糖AMP环水解酶(hisI)、磷酸核糖-ATP焦磷酸水解酶(hisIE)、磷酸核糖亚胺甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖酸异构酶(hisA)、氨基转移酶(hisH)、磷酸组氨醇转氨酶(hisC)组氨醇磷酸酶(hisB)、组氨醇脱氢酶(hisD)，等等。

已知的是，编码L-组氨酸生物合成酶(hisG，hisBHAFI)的基因受L-组氨酸抑制，因此L-组氨酸生产能力也可以通过向ATP磷酸核糖转移酶(hisG)中导入赋予反馈抑制抗性的突变来有效地增强(俄国专利2003677和2119536)。

具有L-组氨酸L-组氨酸能力的微生物的具体实例包括E.coli菌株FERM-P5038和5048，其已经导入了携带编码L-组氨酸生物合成酶的DNA的载体(JP56-005099A)，导入了rht，一种用于氨基酸输出的基因的菌株(EP1016710A)，赋予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和链霉素抗性的E.coli 80菌株(VKPM B-7270，俄国专利2119536)，等等。

L-鸟氨酸生物合成途径包括与L-精氨酸生物合成途径共有的几个酶。L-鸟氨酸生物合成酶的实例包括N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨磷酸酯还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(argE)，等等。

具有生产L-鸟氨酸的能力的细菌的实例包括已经导入了L-瓜氨酸或L-精氨酸营养缺陷突变的Coryneform细菌和节杆菌属 (Arthrobacter)细菌(JP02-283290A)，对维生素P样活性物质有抗性的Coryneform细菌AJ11589菌株(FERM-P5644，JP57-016696A)，等等。

具有L-苏氨酸生产能力的微生物的实例包括具有L-苏氨酸生产能力的6-二甲基氨基嘌呤-抗性突变株(JP5-304969A)，在其中具有增强酶活性的突变的苏氨酸生物合成酶基因用质粒来扩增的菌株(JP1-29559B，JP05-227977A)，在其中苏氨酸操纵子用质粒来扩增的菌株(JP2-109985A)，在其中扩增了编码丙酮酸羧化酶的基因和编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因的菌株(JP2002-51787A)，等等。

大肠埃希氏菌VKPM B-3996菌株(美国专利5,175,107)也可以被用作L-苏氨酸生产菌株。VKPM B-3996于1987年11月19日保藏在俄国工业微生物国家保藏所(VKPM)，GNII Genetika，登记号为VKPM B-3996。VKPM B-3996菌株携带质粒pVIC40(国际专利公开WO90/04636)，该质粒是通过向具有链霉素抗性标记基因的质粒pAYC32中插入苏氨酸操纵子(thrABC)获得的(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.，Plasmid，1986，16，161-167)。由包含在pVIC40中的突变thrA基因编码的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I不受L-苏氨酸的反馈抑制。

大肠埃希氏菌VKPM B-5318菌株(Escherichia coliTDH7\pPRT614)(EP 0593792B)也可被用作L-苏氨酸生产菌株。VKPMB-5318于1990年5月3日保藏在俄国工业微生物国家保藏所(VKPM)，GNII Genetika(VKPM GNII Genetika地址：Dorozhnyproezd 1，Moscow 113545，Russia)，登记号为VKPM B-5318。VKPMB-5318菌株对于L-异亮氨酸是自养的，编码苏氨酸生物合成酶的苏氨酸操纵子位于C1温度敏感阻遏物、PR-启动子和来源于λ噬菌体的Cro蛋白质N末端的下游，此外，该菌株携带构建的质粒DNA，使得苏氨酸生物合成基因的表达受到来源于λ噬菌体的启动子和阻遏物的调节。

此外，大肠埃希氏菌MG442菌株(US4,278,765)也可以用作L-苏氨酸生产菌株。MG442菌株作为CMIMB-1628保藏在俄国工业微生物国家保藏所(VKPM)。

具有生产L-苏氨酸的能力的细菌也可以通过增强L-苏氨酸生物合成酶的活性来获得。编码L-苏氨酸生物合成酶的基因的实例包括天冬氨酸激酶III基因、天冬氨酸半醛脱氢酶基因，等等。L-苏氨酸生物合成酶的活性可以在细菌中被增强，在所述细菌中苏氨酸降解酶的活性被抑制。在其中苏氨酸降解酶的活性被抑制的细菌的实例包括TDH6菌株，其是在苏氨酸脱氨酶活性方面有缺陷的(JP2001-346578A)。

具有生产L-谷氨酸的能力的细菌也可以通过增强L-谷氨酸生物合成酶的活性来获得。L-谷氨酸生物合成酶的实例包括谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、二磷酸果糖酶、果糖磷酸激酶、磷酸葡糖异构酶，等等。

特别地，具有这些L-谷氨酸生物合成酶的增强的活性的细菌包括在WO00/18935和JP2000-232890A中公开的Coryneform细菌的菌株，和在JP2001-333769A、JP2000-106869A、JP2000-189169A和JP2000-333769A中公开的肠杆菌家族的菌株。

具有生产L-谷氨酸的能力的细菌也可以通过降低或消除催化一反应的一种或多种酶的活性来获得，所述反应使得从L-谷氨酸的合成产生分支并产生L-谷氨酸以外的化合物。这种酶包括异柠檬酸裂解酶、α-酮戊二醛脱氢酶、磷酸酯转乙酰酶、乙酰激酶、乙酰醇酸合酶、乙酸乳酸合酶、甲酸酯转乙酰酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-焦磷酸酯脱氢酶，等等。

特别地，在其中α-酮戊二醛脱氢酶活性被降低的细菌包括在WO95/34672中公开的乳发酵短杆菌Δs菌株、在JP6-237779A中公开的乳发酵短杆菌AJ12821菌株(FERM BP-4172)、在JP5-244970A或JP7-203980A中公开的大肠埃希氏菌菌株，和在JP2001-333769A中公开的成团肠杆菌菌株。

具有生产L-半胱氨酸的能力的细菌的实例包括在其中胱硫醚β-裂解酶活性被降低的大肠埃希氏菌菌株(JP2003-169668A)和在其中丝氨酸乙酰基转移酶受L-半胱氨酸的反馈抑制被释放的大肠埃希氏菌的菌株(JP11-155571A)或Coryneform bacterium(JP2002-233384A)。

具有生产L-脯氨酸的能力的埃希氏菌属细菌的实例包括大肠埃希氏菌702菌株(VKPM B-8011)，其式对3，4-二羟基脯氨酸和azathidin-2-carboxylate有抗性的，和702ilvA菌株(VKPM B-8012)其是通过在702菌株中删除ilvA基因获得的(JP2002-300874A)。

具有生产L-苯丙氨酸的能力的埃希氏菌属细菌的实例包括在其中删除了tyrA和tyrR基因大肠埃希氏菌AJ12739菌株(tyrA::Tn10，TyrR；VKPM B-8197)，在其中导入了突变的pheA的大肠埃希氏菌HW1089菌株(美国专利5,354,672)和在其中扩增了yddG和yedA基因的大肠埃希氏菌菌株(WO 03/044192)。具有生产L-苯丙氨酸的能力的Coryneform细菌的实例包括对于酪氨酸是营养缺陷的和对L-苯丙氨酰-L-酪氨酸有抗性的菌株(JP5-49489A)。

具有生产L-色氨酸的能力的细菌可以通过增强L-色氨酸生物合成酶，包括磷酸甘油酸脱氢酶和邻氨基苯甲酸酯合酶的活性来获得。这些酶可以是对L-色氨酸或L-丝氨酸的反馈抑制有抗性的。例如，具有这些反馈抗性酶的细菌可以通过将质粒pGH5导入大肠埃希氏菌SV164菌株来获得，所述质粒pGH5含有编码L-色氨酸抗性磷酸甘油酸脱氢酶的突变serA基因，所述大肠埃希氏菌SV164菌株带有编码L-丝氨酸抗性邻氨基苯甲酸酯合酶的基因(WO94/08031)。

具有生产L-色氨酸的能力的细菌也可以通过增强由色氨酸操纵子编码的L-色氨酸生物合成酶的活性来获得。这种酶包括L-色氨酸操纵子色氨酸合酶和邻氨基苯甲酸酯合酶。这些细菌的实例包括在其中导入了色氨酸操纵子的大肠埃希氏菌菌株，所述色氨酸操纵子含有编码L-丝氨酸抗性邻氨基苯甲酸酯合酶的基因(JP57-71397A、JP62-244382A和美国专利4,371,614)。

此外，具有生产L-色氨酸的能力的细菌的实例包括对L-苯丙氨酸和L-酪氨酸是营养缺陷的大肠埃希氏菌AGX17AGX17(pGX44)[NRRL B-12263]菌株，和携带含有色氨酸操纵子的质粒pGX50的AGX6(pGX50)aroP[NRRL B-12264]菌株(美国专利4,371,614)。

具有生产L-异亮氨酸的能力的埃希氏菌属细菌的实例包括对6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突变菌株((JP5-304969A)，对L-异亮氨酸异羟肟酸盐、硫代异亮氨酸、DL-乙硫氨酸或精氨酸异羟肟酸盐有抗性的突变菌株((JP5-130882A)，和在其中编码苏氨酸脱氨酶和乙酰羟酸合酶的基因用质粒扩增了的重组菌株(JP2-458A、JP2-42988A和 JP8-47397A)。

具有生产L-缬氨酸的能力的细菌可以通过增强L-缬氨酸生物合成酶的活性来获得，所述L-缬氨酸生物合成酶包括由ilvGMEDA操纵子编码的那些，特别是由ilvG基因编码的乙酰羟酸合酶(JP02-748418B)。这些酶可以是对L-缬氨酸的反馈抑制有抗性的。

具有生产L-缬氨酸的能力的细菌可以是在其中乙酸乳酸合酶III基因(ilvIH基因)的表达被降低的细菌。

具有生产L-缬氨酸的能力的细菌可以是对氨基酸类似物有抗性的。这种细菌的实例包括对L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸是营养缺陷的并且对D-核糖、嘌呤核苷或嘧啶核糖核苷有抗性的突变菌株(FERMP-1841，P 5556；JP53-025034A)，和对聚酮(polyketonoid)有抗性的突变菌株(FERM P-9325；JP04-045314B)。

具有生产L-丙氨酸的能力的细菌的实例包括在H+-ATPase活性方面有缺陷的Coryneform细菌(Appl Microbiol Biotechnol.2001Nov；57(4)：534-40)，或在其中扩增了天冬氨酸β-脱羧酶基因的Coryneform细菌菌株(JP07-163383A)。

<增强ybjE基因的表达>

本发明的微生物可以通过修饰如上所述的具有L-氨基酸生产能力的微生物、使得ybjE基因的表达增强来获得。做为选择，可以先增强ybjE基因的表达，随后赋予L-氨基酸生产能力。

可以通过经由修饰表达调节序列，例如启动子来增强内源性ybjE基因的表达，或通过使用质粒等外源地导入ybjE基因，来增强ybjE基因的表达。可以组合这些技术。

可以通过northern杂交或RT-PCR(Molecular cloning：Coldspring Harbor Laboratory Press，Cold spring Harbor(USA)，2001)测量本发明的细菌中由ybjE基因表达出的RNA的数量，并于野生型或未修饰的菌株相比较，来确认ybjE基因表达的增强。在本发明的微生物中ybjE基因的表达被增强超过野生型或未修饰的菌株，优选的是野生型或未修饰的菌株的不少于1.5倍，更优选的不少于2倍，和最优选的不少于3倍。

ybjE基因可以来自大肠埃希氏菌或其同源物。来自大肠埃希氏菌的ybjE基因的实例包括编码具有SEQ ID NO：2中氨基酸编号17到315的氨基酸序列的蛋白质的基因，优选的是具有SEQ ID NO：1中核苷酸编号49到948的核苷酸序列的基因。尽管在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的位置1上Val的密码子是gtg，它可以被转化为Met，ybjE基因编码的蛋白质可以是具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列(1到315)的蛋白质。在这种情况下，优选的是使用含有SEQ ID NO：1的核苷酸编号1到948的核苷酸序列的DNA。然而，从实施例可以清楚地了解到，可用于本发明的生产方法的微生物可以通过使用含有核苷酸序列SEQ ID NO：1(49到948)的DNA来获得，不管哪个氨基酸残基是翻译起始密码子。

大肠埃希氏菌ybjE基因的同源物是指展现出与大肠埃希氏菌ybjE基因高度的结构相似性、并增强L-氨基酸输出能力或L-氨基酸抗性，和宿主微生物的L-氨基酸生产能力的基因。ybjE基因同源物的实例包括编码具有SEQ ID NO：9或NO：10的氨基酸序列的蛋白质的基因。SEQ ID NO：9的氨基酸序列是在大肠埃希氏菌的YbjE蛋白质(SEQ ID NO：2)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)LT2菌株的YbjE蛋白质之间保守的序列。SEQ ID NO：10的氨基酸序列是在大肠埃希氏菌的YbjE蛋白质和Yersinia pestis CO92YPO1361菌株的YbjE蛋白质之间保守的序列。

ybjE基因同源物可以是编码与SEQ ID NO：2的全部氨基酸序列或SEQ ID NO：2中氨基酸编号17到315的氨基酸序列具有70％或更高、优选的80％或更高、更优选的90％或更高、更优选的95％或更高、特别优选的98％或更高的同源性的蛋白质，并且具有L-氨基酸输出能力的基因。ybjE基因同源物的实例还包括具有SEQ ID NO：9或NO：10的氨基酸序列并具有L-氨基酸输出能力的蛋白质。氨基酸序列和DNA序列的同源性可以使用Karlin和Altschul的BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，and 5873(1993))和FASTA(MethodsEnzymol.，183，and 63(1990))算法来确定。根据这个算法BLAST开发了称为BLASTN和BLASTX的程序。(参考http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

来源于除大肠埃希氏菌以外的微生物的ybjE基因可以使用，包括来源于Shigella flexneri 2a str.2457T菌株的基因，其具有与GenBank 登记入册No.AE016980的核苷酸编号275793到276692或275793到276740互补的序列，来源于鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株的基因，其具有与GenBank登记入册No.AE008740的核苷酸编号97到996互补的序列，和来源于Yersinia pestis CO92菌株的基因，其具有与GenBank登记入册No.AJ414147的核苷酸编号197812到198708互补的序列。此外，可以根据与以上例举的基因的同源性，从Coryneform细菌例如谷氨酸棒杆菌和乳发酵短杆菌，假单胞菌属(Pseudomonas)细菌例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，分枝杆菌属(Mycobacterium)细菌例如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)等等克隆ybjE基因。

此外，本发明的ybjE基因不局限于野生型基因，而可以是突变或人工修饰的基因，所述基因编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列、SEQ ID NO：2中氨基酸编号17到315的氨基酸序列、或SEQ ID NO：9或10的氨基酸序列的蛋白质。编码的蛋白质可以包括在一个或多个位置替换、删除或插入一个或几个氨基酸残基，只要维持了编码的YbjE蛋白质的功能，即L-赖氨酸输出能力。尽管取决于三维结构中的位置或氨基酸残基的类型的不同而“几个”氨基酸残基的数目不同，其可以是2到20个，优选的2到10个，更优选的2到5个。氨基酸的替换优选的是保守替换，包括ser或thr对ala的替换，gln、his或lys对arg的替换，glu、gln、lys、his或asp对asn的替换，asn、glu或gln对asp的替换，ser或ala对cys的替换，asn、glu、lys、his、asp或arg对gln的替换，gly、asn、gln、lys或asp对glu的替换，pro对gly的替换，asn、lys、gln、arg或tyr对his的替换，leu、met、val或phe对ile的替换，ile、met、val或phe对leu的替换，asn、glu、gln、his或arg对lys的替换，ile、leu、val或phe对met的替换，trp、tyr、met、ile或leu对phe的替换，thr或ala对ser的替换，ser或ala对于thr的替换，phe或tyr对trp的替换，his、phe或trp对tyr的替换，met、ile或leu对val的替换。如上所述替换、删除或插入一个或几个核苷酸还包括起因于携带ybjE基因的微生物(突变体或变体)的个体差异和物种差异的天然发生的突变。

可以通过例如，位点特异性诱变来修饰SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或SEQ ID NO：1中核苷酸编号49到948的核苷酸序列获得这样的基因，从而将一个或多个替换、删除或插入导入到由该基因编码的蛋白质的特定位点上。

在SEQ ID NO：1的序列中具有突变的ybjE基因的实例包括，具有SEQ ID NO：1的序列、其中第三位置上的核苷酸(鸟嘌呤)被腺嘌呤替代的ybjE基因。

此外，这种基因也可以通过常规的诱变处理，例如以下所述的那些来获得。诱变处理的实例包括在体外用羟胺处理具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：1中核苷酸编号49到948的核苷酸序列的基因，和用紫外线照射或用于典型的突变处理的诱变试剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或EMS(甲磺酸乙酯)处理带有该基因的微生物，例如埃希氏菌属细菌。可以通过例如在适合的细胞中表达所述基因并确定输出到培养基中的L-氨基酸的数量是否升高，来确认这些基因编码的蛋白质是否具有L-氨基酸输出能力。可以通过将所述基因导入到宿主微生物中，在存在高浓度L-氨基酸的情况下培养该宿主，并与对照菌株比较微生物的生长情况，来确认这些基因是否给宿主微生物赋予L-氨基酸抗性。

ybjE基因还包括能在严格条件下与SEQ ID NO：1的核苷酸序列、SEQ ID NO：1中核苷酸编号49到948的核苷酸序列、或从这些序列制备的探针杂交，并且编码具有L-氨基酸输出能力的蛋白质的DNA。如在此使用的“严格条件”是这样的条件，在这些条件下形成所谓的特异性杂交，而不形成非特异性杂交。很难通过使用任何数值来清楚地表述这种条件。然而，严格条件的实例包括这样的条件，在该条件之下，相互具有高同源性的DNA，例如，具有不低于50％的同源性的DNA相互杂交，具有低于50％的同源性的DNA不相互杂交，和这样的条件，在该条件下，在运用典型Southern杂交洗涤的一定盐浓度下，例如在1×SSC、0.1％SDS在60℃，优选的0.1×SSC、0.1％SDS在60℃，更优选的0.1×SSC、0.1％SDS在68℃下洗涤一次或优选的2-3次，DNA相互杂交。

可以通过例如使用遗传重组技术提高ybjE基因在细胞中的拷贝数来增强ybjE基因的表达。例如，可以通过将含有ybjE基因的基因片段连接到能在宿主微生物中复制的载体，优选的多拷贝载体，并将产生的载体导入到宿主微生物中来制备重组DNA。

当使用大肠埃希氏菌的ybjE基因时，可以，例如使用根据SEQ IDNO：1的核苷酸序列设计的引物，例如具有SEQ ID NO：5或6的序列的引物，并使用大肠埃希氏菌的染色体DNA作为模板，通过PCR方法(聚合酶链式反应，参见White，T.J.等人，Trends Genet.，5，185(1989))来获得。也可以使用来自其他微生物的ybjE基因，可以通过使用根据它们的ybjE基因或其同源序列、或来自不同物种微生物的YbjE蛋白质设计的寡核苷酸引物进行PCR，或通过使用根据这样的序列信息制备的寡核苷酸探针进行杂交，从它们的染色体DNA或染色体DNA文库获得ybjE基因。可以通过例如Saito和Miura的方法(参见H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)，Text for Bioengineering Experiments，Edited by the Societyfor Bioscience and Bioengineering，Japan，pp.97-98，Baifukan，1992))从作为DNA供体的微生物制备染色体DNA。

然后，将ybjE基因连接到可在宿主微生物中操作的载体DNA来制备重组DNA。优选的，使用可在宿主微生物中自主复制的载体。

可在大肠埃希氏菌中自主复制的载体的实例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184(pHSG和pACYC可从Takara Bio获得)、RSF1010、pBR322、pMW219(pMW可从Nippon Gene获得)，等等。

可在Coryneform细菌中自主复制的载体的实例包括pAM330(JP58-67699A)、pHM1519(JP58-77895A)、pVK7(US2003-0175912)和pSFK6(JP2000-262288A)。此外，也可以使用在大肠埃希氏菌和Coryneform细菌中都可自主复制的所谓的穿梭载体。

可在嗜甲基菌属细菌中自主复制的载体的实例包括RSF1010和其衍生物，例如pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.Plasmid，16，pp.161-167(1986))、pMFY42(Gene，44，p.53(1990))、pRP301和pTB70(Nature，287，396，(1980))。

为了通过连接ybjE基因和任何上述载体来制备重组DNA，用限制性内切酶消化所述载体和含有所述ybjE基因的片段，并且通常通过使用连接酶，例如T4DNA连接酶进行连接。

为了将如上所述制备的重组DNA导入微生物中，可以采用迄今为止报道的任何已知转化方法。可以采用例如，用氯化钙处理受体细胞以提高DNA的透过性，针对大肠埃希氏菌已经报道了(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，并使用从生长细胞制备的感受态细胞来导入DNA，对于Bacillus subtilis已经报道了(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.E.，Gene，1，153(1977))。除这些方法之外，可以采用已经被报道适合于Bacillus subtilis、放线菌和酵母的方法(Chang，S.and Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA，75，1929(1978))将重组DNA导入原生质体或原生质体样受体细胞。此外，Coryneform细菌的转化也可以通过电脉冲方法(Sugimoto等人，JP2-207791A)进行。

ybjE基因的拷贝数也可以通过将多拷贝的基因整合到微生物的染色体DNA上来增加。为了将多拷贝的ybjE基因整合到微生物的染色体DNA上，可以通过靶向多拷贝存在于染色体DNA上的序列来进行同源重组。转座子末端的重复DNA和反向重复可被用作多拷贝存在于染色体DNA上的序列。做为选择，如在JP2-109985A中公开的，也有可能将ybjE基因掺入到转座子中，并容许其被转染，从而将多拷贝的基因整合到染色体DNA中。可以通过使用具有ybjE基因的部分序列的探针进行southern杂交来确认ybjE基因整合到染色体中。

也可以如WO00/18935中描述的通过用更强的表达调节序列替换染色体DNA或质粒上的表达调节序列，包括ybjE基因的启动子，通过扩增提高ybjE基因表达的调节因子，或删除或削弱降低ybjE基因表达的调节因子，来实现ybjE基因表达的增强。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子等等是已知的强启动子。此外，还有可能的是向ybjE基因的启动子区域导入几个核苷酸替换使得所述启动子更为强力。在Goldstein等人(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)中公开了评估启动子效力的方法和强力启动子的实例。此外，已知的是，在核糖体结合位点(RBS)和翻译起始密码子之间的间隔区序列，特别是紧靠起始密码子上游的几个核苷酸，对翻译效率有很大的影响。因此，可以修饰这种序列。ybjE基因的表达调节序列可以使用用于启动子鉴定的载体或基因分析软件例如GENETYX来鉴定。

通过这样的启动子替换或修饰来增强ybjE基因的表达。表达调节序列的替换也可以通过例如使用温度敏感质粒来实现。Coryneform细菌的温度敏感质粒的实例包括p48K和pSFKT2(JP2000-262288A)、pHSC4(参见法国专利Laid-open Publication No.2667875，1992和JP5-7491A)，等等。在Coryneform细菌中这些质粒至少可以在25℃的温度下自主复制，但在37℃的温度下不能自主复制。表达调节序列的修饰可以与提高ybjE基因的拷贝数相组合。

为了增强ybjE基因编码的蛋白质的活性，可以向ybjE基因中导入增强L-氨基酸输出能力的突变。提高ybjE基因编码的蛋白质(YbjE蛋白质)的活性的突变的实例包括，启动子序列中提高ybjE基因转录的突变和ybjE基因编码区中提高YbjE蛋白质的比活性的突变。

本发明的微生物优选的是在其中L-氨基酸输出能力由于引起ybjE基因表达增加的修饰而被增强的微生物。在此使用的用语“L-氨基酸生产能力被增强”意思是，当培养被修饰以增强ybjE基因表达的微生物时，由所述微生物输出到培养基中的L-氨基酸的数量超过从未修饰的菌株，例如亲本菌株或相应的野生型菌株输出的L-氨基酸的数量。通过测定培养基中L-氨基酸浓度的增加来观察L-氨基酸输出能力的增加。此外，也通过测定在ybjE基因导入微生物中时L-氨基酸的细胞内浓度的下降来观察L-氨基酸输出能力的增加。与从未修饰的菌株输出的L-氨基酸的数量相比较，从本发明的微生物输出的L-氨基酸的数量优选的增加10％或更多，更优选的30％或更多，特别优选的50％或更多。此外，也根据在ybjE基因导入微生物中时L-氨基酸的细胞内浓度的下降来观察L-氨基酸输出能力的增加。例如，可以如下测量L-氨基酸的细胞内浓度：向含有微生物细胞的培养基中添加具有1.07的比重的硅油，通过离心从培养基中收集细胞，优选的是在12,000rpm离心2分钟。然后用22％高氯酸处理细胞(A.Ishizaki et al，Biotech.Teqniq.(1995)Vol9，No.6，p409)。使用这样制备的细胞，可以测量L-氨基酸的细胞内浓度。此外，可以通过使用反转的(everted)膜囊测量放射性标记的L-氨基酸的细胞摄取来间接地检查“L-氨基酸输出能力”(J.Biol.Chem.，Vol.277，Issue 51，49841-49849)。例如，从在其中导入了ybjE基因的细胞制备反转的膜囊。然后，向所述囊添加提供驱动能量的ATP或其他底物，测量放射性标记的L-氨基酸的细胞摄取。做为选择，通过测量活性细胞中非标记氨基酸和标记氨基酸之间的转换反应速率来检测“L-氨基酸输出能力”。

此外，本发明的微生物优选的是由于引起ybjE基因表达增强的修饰而变得对L-氨基酸或L-氨基酸类似物更有抗性的微生物。也就是说，优选的本发明的微生物是在存在一定浓度的L-氨基酸或L-氨基酸类似物的情况下能够生长的微生物，在所述浓度下未修饰的菌株不能生长。可以在含有高浓度的L-氨基酸或L-氨基酸类似物，例如，0.3g/L或更高的基本培养基中，来证实在存在L-氨基酸或L-氨基酸类似物的情况下的细胞生长。可以通过测量含有高浓度L-氨基酸或L-氨基酸类似物的基本培养基中所述菌株的生长，并与亲本菌株或未修饰的菌株的生长进行比较来确认ybjE基因增强菌株的L-氨基酸或L-氨基酸类似物抗性。比较生长的方法包括比较每种菌株生长的培养基的580-660nm处光密度的方法。只要能抑制未修饰菌株的生长，添加到培养基中的L-氨基酸或L-氨基酸类似物的浓度没有特别的限制，优选的不少于0.3g/L。例如，以80g/L添加L-赖氨酸氢氯化物，以90g/L添加L-精氨酸氢氯化物，以45g/L添加L-鸟氨酸氢氯化物，以30g/L添加L-组氨酸氢氯化物，以12g/L添加L-异亮氨酸，以40g/L添加L-苏氨酸，以15g/L添加L-谷氨酸单钠，以8g/L添加L-苯丙氨酸，以85g/L添加L-脯氨酸，和以0.3g/L添加L-半胱氨酸。

此外，本发明的微生物可以是由于引起ybjE基因表达增强的修饰而变得对L-赖氨酸或L-赖氨酸类似物更有抗性的微生物。L-赖氨酸类似物的实例包括溶菌素、赖氨酸异羟肟酸盐、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺，等等，但不限于这些。可以按照与上述的L-氨基酸或L-氨基酸类似物抗性相同的方法确认L-赖氨酸抗性。

此外，本发明的微生物可以是由于引起ybjE基因表达增强的修饰而变得对L-精氨酸或L-精氨酸类似物更有抗性的微生物。L-精氨酸类似物的实例包括精氨酸异羟肟酸盐、高精氨酸、D-精氨酸、刀豆氨酸、精氨酸异羟肟酸盐，等等。可以按照与上述的L-氨基酸或L-氨基酸类似物抗性相同的方法确认L-精氨酸或L-精氨酸类似物抗性。

<2>生产L-氨基酸的方法

本发明的生产方法包括在培养基中培养本发明的微生物以生产和促使L-氨基酸在培养基或所述微生物的细胞中的积累，并从所述培养基或细胞收集L-氨基酸。

用于本发明的培养基可以选自通常用于利用微生物发酵的L-氨基酸发酵生产的公知的培养基。也就是说，可以使用含有碳源、氮源、无机离子，和如果有必要含有其他有机成分的普通培养基。对于碳源，可以使用糖类例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖或淀粉水解产物，醇类例如甘油或山梨醇，或有机酸例如反丁烯二酸、柠檬酸或丁二酸。对于氮源，可以使用无机铵盐例如硫酸铵、氯化铵或磷酸铵，有机氮例如大豆蛋白水解产物，氨气，氨水，等等。期望的是以合适的数量向培养基中添加物质例如维生素B1和L-高丝氨酸、酵母提取物等作为有机痕量营养物。除了上述的，如有必要，少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。本发明使用的培养基可以是天然培养基或合成培养基，只要它含有碳源、氮源、无机离子，和如有必要含有其他有机成分。

优选的在有氧条件下进行培养1到7天。在培养期间，培养温度优选的控制在24℃到37℃，pH值优选的控制在5到9。无机的或有机的酸性或碱性物质，以及氨气等，可被用于调整pH值。通常可以通过公知技术的组合，例如通过利用离子交换树脂、沉淀和其他技术从发酵肉汤收集L-氨基酸。当L-氨基酸在细胞中积累时，例如，可以通过超声破碎来破坏细胞，可以通过离心除去破坏的细胞，可以使用离子交换树脂等等从获得的上清液收集L-氨基酸。

如果在本发明的生产方法中使用甲醇作为主要碳源，降低了成本，因此具有同化甲醇的能力的微生物例如嗜甲基菌属和甲基菌属细菌是优选的。在这种情况下，可以根据典型的用于普通甲醇同化微生物的培养方法进行培养(参见，例如，WO00/61723，JP2001-120269A等等)。当使用甲醇作为主要碳源进行培养时，优选的以0.001到30％的浓度向培养基添加甲醇。对于甲醇同化微生物的培养，优选的向培养基中添加硫酸铵等等，并用作氮源。此外，优选的以少量添加痕量成分，例如磷酸钾、磷酸钠、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰。

甲醇同化微生物的培养优选的在伴随着用于通风的摇动或搅动的有氧条件下，在5到9的pH值范围，和在20到45℃的温度下，通常进行24到120小时。通常可以通过公知技术的组合，例如通过利用离子交换树脂、沉淀和其他技术从培养物收集L-氨基酸。从细胞收集L-氨基酸可以按照与如上所述相同的方法进行。

实施例

在下文中，将参考以下非限制性实施例更具体地说明本发明。除非另有说明，用于以下实施例的试剂是从Wako Pure Chemicals或Nakarai Tesque获得的。用于每个实施例的培养基的组成如下所示。对于所有的培养基用NaOH或HCl调整pH值。

L培养基：

Bacto trypton(Difco) 10g/L

酵母提取物(Difco) 5g/L

氯化钠 10g/L

pH 7.0

在120℃对这些培养基进行蒸气灭菌20分钟。

L琼脂培养基：

L培养基

Bacto琼脂 15g/L

在120℃对这些培养基进行蒸气灭菌20分钟。

基本培养基：(按照Molecular cloning Vol.3)

加至1L，调整pH 7.0。

5＊M9盐

加至1L

在加至1L以后，在115℃对这些培养基进行蒸气灭菌10分钟，在合适的时间添加L-赖氨酸。

基本琼脂培养基：

基本培养基

Bacto琼脂 15g/L

在115℃对这些培养基进行蒸气灭菌10分钟。

用于埃希氏菌属细菌的L-赖氨酸生产培养基：

用氢氧化钾调节pH值到7.0，在115℃使成分进行蒸气灭菌10分钟，除了葡萄糖和MgSO₄·7H₂O之外，这些单独地灭菌。对于抗生素，添加50mg/L氯霉素。

用于埃希氏菌属细菌的L-精氨酸生产培养基：

用氢氧化钾调节pH值到7.2，在115℃使成分进行蒸气灭菌10分钟，除了葡萄糖和MgSO₄·7H₂O之外，这些单独地灭菌。对于抗生素，添加50mg/L的氯霉素。

用于嗜甲基菌属细菌的L-赖氨酸生产培养基(SEII培养基)：

在121℃对除甲醇以外的成分进行蒸气灭菌15分钟，甲醇在成分充分地冷却之后添加。参考Journal of General Microbiology(1989)125，135，3153-3164，Silman N.J.，Carver M.A.&Jones C.W制备这个培养基。除了硫酸铵之外，使用1.18g乙酰胺，并以72mg/L的浓度添加氯化钙。

SEII琼脂培养基：

在121℃对除甲醇以外的成分进行蒸气灭菌15分钟，甲醇在成分充分地冷却之后添加。

用于Coryneform细菌的CM2S培养基：

用氢氧化钾调节pH值到7.2，在120℃使成分进行蒸气灭菌30分钟。然后将培养基用于平皿培养，添加20g/L的琼脂。

用于Coryneform细菌的L-赖氨酸生产培养基：

用氢氧化钾调节pH值到7.5，在115℃使成分进行蒸气灭菌10分钟，除了葡萄糖和MgSO₄·7H₂O之外，这些单独地灭菌。

实施例1：L-赖氨酸输出基因的筛选

L-赖氨酸输出基因的搜索如下进行。

<1-1>构建在其中导入了质粒文库的大肠埃希氏菌菌株

按常规的方式从通过在MG1655(ATCC 47076)菌株中删除lysA(二氨基庚二酸脱羧酶基因)获得的菌株提取染色体DNA。将用限制性内切酶Sau3AI部分消化染色体DNA获得的2到4kbp片段导入到载体pTWV229(Takara Bio)、pSTV28(Takara Bio)和pMW118(Nippon Gene)的每一个中，所有载体预先用BamHI消化，从而获得质粒文库。通过电穿孔将这些质粒文库的每一个导入到MG1655菌株中。

<1-2>L-赖氨酸抗性基因的筛选

在L培养基上对导入了质粒文库的MG1655菌株根据氨苄青霉素抗性挑选导入了pTWV229的菌株，根据氯霉素抗性挑选导入了pSTV28的菌株，和根据氨苄青霉素抗性挑选导入了pMW118的菌株。总共获得了约80,000个转化的菌落。将这些转化体平铺到含有60g/L盐酸赖氨酸的基本培养基上，如果有的话，在培养基上MG1655菌株可以形成非常少的菌落。

在37℃培养36小时之后，在含有高浓度赖氨酸的培养基上出现的约50个菌落被选出作为赖氨酸抗性菌株的候选者。为了确定插入到候选赖氨酸抗性菌株的载体中的序列，通过使用具有SEQ ID NO：3(M13正向引物)和SEQ ID NO：4(M13反向引物)的合成寡核苷酸进行PCR，并测定扩增的片段的序列，所述两个引物与位于质粒的克隆位点附近的DNA序列互补。

作为核苷酸序列测定的结果，发现了在L-赖氨酸抗性菌株中几乎所有的片段都含有ybjE，位于编号913181到914128。

分析从ybjE基因序列预测的氨基酸序列。当分析蛋白质的序列的疏水性质时，发现该蛋白是高度疏水的。因此，暗示由ybjE编码的蛋白质是膜蛋白，并且可能涉及氨基酸输出。

实施例2：在大肠埃希氏菌中ybjE基因扩增的影响

<2-1>构建用于ybjE扩增的质粒并将其导入到大肠埃希氏菌中

然后，为了研究ybjE基因的扩增的影响，构建用于扩增ybjE的载体并导入到MG1655中。已经报道了大肠埃希氏菌(大肠埃希氏菌K-12菌株)的染色体的全部核苷酸序列，因此，在上述文献中报道的ybjE基因的核苷酸序列的基础上制备SEQ ID NO：5的合成寡核苷酸和SEQ ID NO：6的合成寡核苷酸，分别用作5’引物和3’引物来进行PCR，其中SEQ ID NO：5的合成寡核苷酸具有与GenBank登记入册No.AE000189的核苷酸编号4085到4104的序列互补的序列，SEQID NO：6的合成寡核苷酸相应于同一核苷酸序列的核苷酸编号2689到2708的序列。使用大肠埃希氏菌MG1655菌株的染色体DNA作为模板。

将获得的PCR产物连接到已经用SmaI消化了的载体pSTV28(Takara Bio)来构建用于ybjE的扩增的质粒pSYBJE。构建方案在附图1中示出。在其中按照lac启动子的正向连接了ybjE基因的质粒被称为pSYBJE1，在其中按照反方向连接ybjE基因的质粒称为pSYBJE2。

按常规方式将用于ybjE基因扩增的质粒pSYBJE1、pSYBJE2和对照质粒pSTV28(Takara Bio)各自导入到MG1655(ATCC 47076)中。根据氯霉素抗性选择转化体，导pSYBJE1的菌株称为MG1655/pSYJE1，导pSYBJE2的菌株称为MG1655/pSYBJE2，导入pSTV28的菌株称为MG1655/pSTV28。

<2-2>在埃希氏菌属细菌中ybjE基因扩增的影响

使用导入了pSYBJE1或pSYBJE2的菌株检验ybjE基因的扩增对大肠埃希氏菌MG1655菌株针对各种氨基酸的抗性的影响。将MG1655/pSYBJE1、MG1655/pSYBJE2和对照MG1655/pSTV28菌株各自接种到5mL含有50μg/mL氯霉素D L培养基中，使用培养设备通过往复运动摇动培养约6小时。对在其中细胞已经增殖到OD600＝约1.0的混浊度的培养肉汤进行离心，然后用M9基本培养基洗涤细胞两次。然后，将细胞接种到含有50μg/mL氯霉素的M9基本培养基和含有80g/L盐酸赖氨酸的M9基本培养基中到OD600＝0.05的混浊度，培养约70小时。

结果在附图2中示出，其显示了与对照菌株相比，在存在高浓度L-赖氨酸的情况下，增强ybjE基因表达改善了早期的生长速率，以及对数生长期期间的细胞分裂速率。

实施例3：ybjE基因破坏对埃希氏菌属细菌的氨基酸抗性的影响

<3-1>ybjE基因破坏菌株的构建

通过Datsenko和Wanner开发的称为“红色驱动整合(Red-drivenintegration)”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，pp.6640-6645)来实现ybjE基因的删除。依据这种方法，使用在5’侧含有目的基因和在3’侧含有抗生素抗性基因的合成寡核苷酸获得PCR产物。使用这种方法，可以单步构建基因被破坏的菌株。依据这种方法，设计与ybjE基因或为模板质粒赋予抗生素抗性的基因附近的区域互补的引物，获得内源ybjE基因的PCR产物。通过使用质粒pACYC 184(NBL Gene Sciences Ltd.，U.K.，GenBank/EMBLAccession Number X06403)作为模板和具有SEQ ID NOS：7和8的序列的合成寡核苷酸作为引物，可以获得PCR产物。

在琼脂糖凝胶上纯化扩增的PCR产物，用来对大肠杆菌MG1655菌株进行电穿孔，大肠杆菌MG1655菌株带有具备温度敏感性复制能力的质粒pKD46。质粒pKD46(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，pp.6640-6645)含有由阿拉伯糖可诱导性ParaB启动子(GenBank/EMBL Accession No.J02459，第31088到33241位核苷酸)控制的λ噬菌体的2154核苷酸DNA片段，所述λ噬菌体含有λRed同源重组系统的基因(λ、β、exo基因)。质粒pKD46是将PCR产物掺入MG1655菌株的染色体中所必需的。

用于电穿孔的感受态细胞如下制备。在30℃在含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基上培养大肠埃希氏菌MG1655菌株过夜，然后用含有氨苄青霉素和L-阿拉伯糖(1mM)的5mL SOB培养基稀释100倍(Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Edition，Sambrook，J.等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。稀释的细胞在30℃通风生长直到OD600变成约0.6，然后浓缩100倍，用冰冷的去离子水洗涤三次，从而细胞可被用于电穿孔。通过使用70μl感受态细胞和约100ng PCR产物进行电穿孔。将电穿孔后的细胞添加到1mL的SOC培养基中(Molecular Cloning A LaboratoryManual，2nd Edition，Sambrook，J.等人，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))，在37℃培养2.5小时，然后在37℃平铺在L琼脂培养基上。照这样，挑选Cm(氯霉素)抗性重组菌株。然后，为了固化pKD46质粒，细胞在42℃在L琼脂培养基上传代培养两次，检验获得的菌落的氨苄青霉素抗性。照这样，获得了在其中固化了pKD46的氨苄青霉素敏感菌株。

通过PCR确认突变菌株中ybjE基因的破坏，其可以通过氯霉素抗性鉴定出来。使用ybjE基因被破坏的菌株MG1655ΔybjE::cat的细胞中的DNA获得的PCR产物的长度，比从野生型菌株获得的更长。因而，证实了氯霉素抗性基因被插入到ybjE基因中，这证实了ybjE基因已经被破坏。具有插入的氯霉素抗性基因的ybjE破坏菌株称为MG1655ΔybjE::Cm

<3-2>确认ybjE基因缺陷菌株的氨基酸抗性

检验ybjE基因缺陷菌株MG1655ΔybjE::Cm对氨基酸抗性的影响。通过在由往复运动来摇动的培养设备上在L培养基中培养MG1655ΔybjE::Cm和对照MG1655菌株约6小时获得培养肉汤(600OD≈1.0)，对培养肉汤进行离心。然后，细胞用M9基本培养基洗涤两次并接种到M9基本培养基或含有80g/L盐酸赖氨酸的M9基本培养基中到OD600＝0.05，培养约70小时。然后检查生长情况。

结果在附图3中示出。如附图3所示，与对照菌株相比，当存在高浓度的L-赖氨酸时，ybjE基因的删除降低了早期的生长。根据这个结果和实施例2的结果，揭示了ybjE基因赋予了对L-赖氨酸的抗性。

实施例4：ybjE扩增对埃希氏菌属细菌的L-赖氨酸生产的影响

对于大肠埃希氏菌L-赖氨酸生产菌株，使用WC196菌株(AJ13069(FERM BP-5252)，WO96/17930)，其是AEC(S-(2-氨乙基)半胱氨酸)抗性的。

用质粒pSYBJE1转化WC196菌株用于ybjE扩增。质粒pSTV28(Takara Bio)作为对照(如实施例2中)单独地进行转化。从而，获得氯霉素抗性菌株。证实质粒的引入，导入质粒pSYBJE1的菌株称为WC196/ybjE，导入对照质粒pSTV28的菌株称为WC196/pSTV28。

WC196/ybjE和WC196/pSTV28菌株各自在37℃在含有50mg/L氯霉素的L培养基中培养直到OD600变成约0.6。然后，向每个培养肉汤添加等体积的40％甘油溶液，搅拌，然后分成合适的体积，保存在-80℃。在此这些被称为甘油贮备液。

解冻这些菌株的甘油贮备液，将100μL的每个贮备液均一地平铺在含有50mg/L氯霉素的L平皿上，在37℃孵化24小时。将从平皿收集细胞的约1/8接种到500mL Sakaguchi烧瓶中20mL含有50mg/L氯霉素的发酵培养基(M9基本培养基)中，在往复运动摇动的培养设备上37℃培养27小时。培养之后，使用Biotech Analyzer AS210(Sakura Seiki)测量培养基中积累的赖氨酸数量。对于细胞中的L-赖氨酸浓度，将适当体积的培养肉汤添加到比重1.07的硅油中，通过在12000rpm离心2分钟收集细胞。然后，用22％高氯酸处理来破坏收集的细胞，测量赖氨酸的浓度。

24小时后L-赖氨酸的积累和产生以及细胞外与细胞内赖氨酸浓度的比例在表1中示出。用＊表示的细胞外与细胞内赖氨酸浓度的比例通过用细胞内赖氨酸浓度(mg/g细胞干重)除细胞外赖氨酸浓度(mg/g细胞干重)来确定。如表1所示，与没有被导入ybjE基因的WC196/pSTV28菌株相比，WC196/pSYBJE1菌株积累了大量的赖氨酸。此外，在导入了ybjE基因的WC196/pSYBJE1菌株中，由于相对对照WC196/pSTV28菌株的细胞内赖氨酸浓度的明显下降，细胞外L-赖氨酸浓度相对于细胞内L-赖氨酸浓度升高了，因而表明ybjE基因是L-赖氨酸输出基因。

表1

实施例5：ybjE扩增对埃希氏菌属细菌的L-精氨酸生产的影响

已经观察到，与对照菌株相比在ybjE基因扩增了的菌株中L-赖氨酸的积累和产生都提高了。还检验了ybjE扩增对L-精氨酸生产的影响，L-精氨酸是类似L-赖氨酸的已知碱性氨基酸。对于大肠埃希氏菌L-精氨酸生产细菌，使用具有释放了N-乙酰谷氨酸合酶的反馈抑制的237菌株(VKPM B-7925，俄国专利申请No.2000117677)。

<5-1>大肠埃希氏菌237菌株的ybjE基因扩增菌株的制备

通过使用与实施例4中相同的方法，制备ybjE基因扩增237/pSYBJE1菌株和对照237/pSTV28菌株。

<5-2>L-精氨酸的生产

通过使用如下所述的培养基、培养方法和分析方法，检验ybjE基因扩增对L-精氨酸生产的影响。对于前培养物，将100μL甘油贮备液接种在L琼脂培养基上，然后均一地平铺在含有50mg/L氯霉素的L平皿上，在32℃孵化24小时。将从平皿收集的细胞的约1/8接种到20mL精氨酸生产培养基中并在32℃培养90小时。导入了质粒的菌株的培养在添加氯霉素的情况下进行。

在培养期间取出1ml培养肉汤，测量细胞和培养肉汤中的葡萄糖浓度和L-精氨酸积累。为了确定培养肉汤中的葡萄糖浓度和L-精氨酸浓度，将培养肉汤在15,000rpm离心5分钟，获得的上清液适当地用水稀释，通过使用Biotech Analyzer(Sakura Seiki)和Amino AcidAnalyzerL-8500(Hitachi Instrument Service)测量稀释的上清液中的浓度。为了测定细胞中的L-精氨酸浓度，将适当体积的培养肉汤添加到比重1.07的硅油中，在12000rpm离心2分钟，然后通过22％高氯酸处理来破坏收集的细胞，测量L-精氨酸浓度。90小时后L-精氨酸的积累和产生以及细胞外与细胞内L-精氨酸浓度的比例在表2中示出。用＊表示的细胞外与细胞内的比例通过用细胞内L-精氨酸浓度(mg/g细胞干重)除细胞外L-精氨酸浓度(mg/g细胞干重)来确定。

表2：ybjE基因扩增的菌株的L-精氨酸生产

观察到，与对照菌株相比在ybjE基因扩增了的菌株中L-精氨酸的积累和产生都提高了。此外，细胞外与细胞内精氨酸还的比例也升高了。因而，表明该基因还涉及L-精氨酸的输出。

实施例6：将来源于埃希氏菌属细菌的ybjE基因导入嗜甲基菌属细菌中的影响

<6-1>用于ybjE扩增的质粒pRSybjE的构建

为了将ybjE基因导入到嗜甲基菌属细菌中，用已知质粒pRS(JP3-501682A)来构建用于ybjE表达的质粒pRSybjE。pRS是具有pVIC40质粒的载体片段的质粒，其是(WO90/04636，JP 3-501682A)通过删除编码苏氨酸操纵子的DNA区域获得的。质粒pVIC40来源于广宿主范围载体质粒pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.，Plasmid，1986，16，161-167)，其是RSF1010的衍生物。

首先，根据附图3和以下所示的方案从pRS构建含有tac启动子的质粒pRStac。用限制性内切酶EcoRI和PstI消化pRS载体，添加到苯酚/氯仿溶液中，混合以终止反应。在对反应混合物离心之后，收集上层，通过乙醇沉淀收集DNA，在0.8％琼脂糖凝胶上分离。通过使用EASY TRAP Ver.2(DNA collection kit，Takara Bio)收集约8千碱基对(在下文中“kbp”)的DNA片段。做为选择，使用pKK223-3质粒(表达载体，Pharmacia)作为模板，和具有SEQ ID NOS：16 和17的引物进行PCR(在94℃变性20秒、在55℃退火30秒、在72℃延长反应60秒的循环重复30个循环)来扩增tac启动子区域。使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)进行PCR。含有tac启动子的扩增的DNA片段使用PCR prep(Promega)进行纯化，然后用限制性内切酶EcoRI和EcoT22I消化，其识别位点已经设计在引物中了。然后，将反应混合物添加到苯酚/氯仿溶液中，混合以终止反应。在对反应混合物离心之后，收集上层，通过乙醇沉淀收集DNA，在0.8％琼脂糖凝胶上分离。通过使用EASY TRAP Ver.2收集约0.15kbp的DNA片段。

如上所述制备的pRS载体消化产物和tac启动子区域片段通过使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Bio)连接。这个连接反应溶液用于转化大肠杆菌(大肠埃希氏菌JM109感受态细胞，Takara Bio)。将细胞平铺在含有20mg/L链霉素的LB琼脂培养基上，在37℃孵化过夜。出现在琼脂培养基上的菌落各自接种到含有20mg/L链霉素的LB液体培养基中，在37℃摇动培养8小时。通过碱-SDS方法从每个培养物中提取质粒DNA，通过用限制性内切酶消化来确认每个质粒的结构。选择其中链霉素抗性基因和tac启动子的转录方向相同的质粒，称为pRStac。

如上所述获得的pRStac用Sse8387I(Takara Bio)消化，与苯酚/氯仿溶液混合以终止反应。在对反应混合物离心之后，收集上层，通过乙醇沉淀收集DNA，随后用DNA Blunting试剂盒进行末端钝化。

此外，如上所述的pSYBJE1用限制性内切酶PvuII消化，与苯酚/氯仿溶液混合以终止反应。在对反应混合物离心之后，收集上层，通过乙醇沉淀收集DNA，在0.8％琼脂糖凝胶上分离。使用EASY TRAPVer.2(DNA collection kit，Takara Bio)收集含有lac启动子和ybjE基因的约1.5kbp DNA片段。

如上所述制备的pRStac载体消化产物和ybjE基因区域片段使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Bio)连接到一起。这个连接反应溶液用于转化大肠杆菌(大肠埃希氏菌JM109感受态细胞，TakaraBio)。将细胞平铺在含有20mg/L链霉素的LB琼脂培养基上，在37℃孵化过夜。出现在琼脂培养基上的菌落各自接种到含有20mg/L链霉素的LB液体培养基中，在37℃摇动培养8小时。通过碱-SDS方法从每个培养肉汤中提取质粒DNA，通过用限制性内切酶消化和DNA测序来确认每个质粒的结构，以选择pRSybjE(附图4)。在pRSybjE质粒中，定位ybjE基因使得其按照与tac启动子相同的方向转录。

<6-2>将pRSybjE导入到嗜甲基菌属细菌中

通过电穿孔(Canadian Journal of Microbiology，43，197(1997))将如上所述获得的pRSybjE导入到食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)中。此外，还将pRS导入到AS1菌株中作为对照。根据链霉素抗性获得pRSybjE和pRS的转化体。

将带有pRS或pRSybjE的食甲基嗜甲基菌AS1菌株(AS1/pRS，AS1/pRSybjE)平铺到含有20mg/L链霉素的SEII平皿上并在37℃培养过夜。然后，从0.3cm²的培养基表面上刮下细胞，接种到含有20mg/L链霉素的SEII生产培养基(20mL)中，在37℃摇动培养34小时。在完成培养之后，通过离心除去细胞，通过使用氨基酸分析仪(Nihon Bunko，高效液相色谱法)测定培养物上清液中的L-赖氨酸浓度。结果在表3中示出。

表3

作为ybjE基因的扩增的结果，与对照AS1/pRS菌株相比，积累的L-赖氨酸和L-精氨酸数量明显增加了。因而，表明了ybjE也在食甲基嗜甲基菌中的碱性L-氨基酸输出方面起作用。

实施例7：评估食甲基嗜甲基菌，在其中导入了编码二氢吡啶二羧酸合酶反馈抑制释放型的基因和ybjE基因

由于发现在食甲基嗜甲基菌AS1菌株中导入ybjE基因促进了L-赖氨酸的输出，尝试在导入了ybjE基因的菌株中增强L-赖氨酸生物合成酶的活性来进一步改善L-赖氨酸生产。

<7-1>构建含有编码对L-赖氨酸反馈抑制有抗性的二氢吡啶二羧酸合酶的基因的质粒pRSdapA

根据附图2所示的构建方案制备含有编码对L-赖氨酸反馈抑制有抗性的二氢吡啶二羧酸合酶的基因(以下称为“dapA＊”)的质粒。

在实施例6中制备的pRStac用Sse8387I和XbaI消化，与苯酚/氯仿溶液混合以终止反应。在对反应混合物离心之后，收集上层，通过乙醇沉淀收集DNA，在0.8％琼脂糖凝胶上分离。结果，收集到约8.2kbp的DNA片段。

使用含有dapA＊基因的质粒RSFD80(参见美国专利6,040,160)作为模板和具有SEQ ID NOS：14和15的引物进行PCR(在94℃变性20秒、在55℃退火30秒，在72℃延长反应60秒)来扩增dapA＊基因片段。使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)进行PCR。使用PCR prep(Promega)纯化获得的dapA＊片段，然后用限制性内切酶Sse8387I和XbaI消化。然后，反应混合物与苯酚/氯仿溶液混合以终止反应。在对反应混合物离心之后，收集上层，通过乙醇沉淀收集DNA并在0.8％琼脂糖凝胶上分离。结果，收集到约1.0kbp的DNA片段。

如上所述制备的pRStac载体消化产物和dapA＊基因区域片段使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Bio)相互连接。这个连接反应溶液用于转化大肠杆菌(大肠埃希氏菌JM109感受态细胞，TakaraBio)。将细胞平铺在含有20mg/L链霉素的LB琼脂培养基上，在37℃孵化过夜。出现在琼脂培养基上的菌落各自接种到含有20mg/L链霉素的LB液体培养基中，在37℃摇动培养8小时。通过碱-SDS方法从每个培养肉汤中提取质粒DNA，通过用限制性内切酶消化和DNA测序来确认每个质粒的结构，以选择pRSdapA质粒。在pRSdapA质粒中，放置dapA＊基因使得其按照与tac启动子相同的方向转录。

用pRSdapA质粒转化的大肠埃希氏菌JM109菌株被称为AJ13831(Escherichia coli AJ13831)，这个菌株于2001年6月4日被保藏在独立的管理机构，国际专利保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，收到的登记号是FERM P-18370。之后，于2002年5月13日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，收到的登记号是FERMBP-8041。因此，pRSdapA质粒也可以从这个菌株获得。

<7-2>含有ybjE和dapA＊的质粒的构建

为了评估ybjE和dapA＊的组合的影响，根据附图5所示的方法来构建通过将ybjE基因插入到pRSdapA质粒获得的质粒。实施例6中制备的pRSybjE用限制性内切酶SapI消化，使用DNA Blunting试剂盒(Takara Bio)进行末端钝化。此外，质粒pRSdapA用EcoRI和SapI消化，在0.8％琼脂糖凝胶上分离含有tac启动子和dapA＊区域的约1kbp片段并用EASY TRAP Ver.2(Takara Bio)收集。按照如上所述相同的方法对这个片段进行末端钝化，使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Bio)与上述pRSybjE的消化产物连接。

这个连接反应溶液用于转化大肠杆菌(大肠埃希氏菌JM109感受态细胞，Takara Bio)。将细胞平铺在含有20mg/L链霉素的LB琼脂培养基上，在37℃孵化过夜。出现在琼脂培养基上的菌落各自接种到含有20mg/L链霉素的LB液体培养基中，在37℃摇动培养8小时。通过碱-SDS方法从所述培养肉汤中提取质粒DNA，通过用限制性内切酶消化和DNA测序来确认所述质粒的结构，以选择pRSybjEdapA质粒。在这个质粒中，定位ybjE基因dapA＊基因使得它们相互之间的按相同方向转录。

通过电穿孔分别将如上所述获得的pRSybjEdapA以及pRSybjEpRSdapA和对照质粒pRS导入食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)。

<7-3>通过携带ybjE和dapA＊的嗜甲基菌属细菌生产L-赖氨酸

如上所述获得的导入pRSybjEdapA、pRSybjE、pRSdapA或pRS的每个AS1菌株平铺在含有20mg/L链霉素的SEII平皿上并在37℃培养过夜。然后，从0.3cm²的培养基表面上刮下细胞，接种到含有20mg/L链霉素的SEII生产培养基(20mL)中，在37℃摇动培养34小时。在完成培养之后，通过离心除去细胞，通过使用氨基酸分析仪(Nihon Bunko，高效液相色谱法)测定培养物上清液中的L-赖氨酸浓度。结果在表4中示出。与仅导入pRSdapA或pRSybjE的菌株相比，导入了pRSybjEdapA的菌株显示了升高的L-赖氨酸积累，因而，发现了增强ybjE基因和dapA＊基因的表达在L-赖氨酸生产上具有协同效应。

表4

菌株	L-赖氨酸生产量(g/L)
		AS1/pRS	0.00
AS1/pRSybjE	0.7
		AS1/pRSdapA	0.12
AS1/pRSybjEdapA	1.38

实施例8：ybjE扩增对赖氨酸类似物抗性的影响

然后，检查ybjE基因扩增对赖氨酸类似物抗性的影响。将携带AS1/pRSybjE或对照pRS的上述食甲基嗜甲基菌AS1菌株各自在含有20mg/L链霉素的SEII培养基中培养过夜。将每个培养物以10％的体积接种到新鲜SEII培养基(含有20mg/L的链霉素)中，并在37℃下摇动培养直到细胞到达对数生长期。将每个培养物以4％的体积接种到含有20mg/L链霉素和0、3或5g/L的S-(2-氨乙基)半胱氨酸(AEC)的SEII培养基中，在37℃摇动培养。在培养期间，每30分钟测量660nm的OD值来检查菌株的AEC抗性程度。结果在附图6中示出。使用Advantec生产的生物图象记录仪TN-1506来测量抗性的程度，将5mL培养物放入试管中并进行分析。结果在附图6中示出。

结果，在添加AEC的情况下，AS1 pRSybjE菌株没有观察到生长延迟，二AS1/pRS菌株的生长被显著地延迟。因而，这揭示了ybjE基因的扩增不仅赋予了L-赖氨酸抗性，还赋予了L-赖氨酸类似物抗性。

实施例9：ybjE扩增对L-苏氨酸生产的影响

大肠埃希氏菌B-5318菌株(EP 0593792)被用作起始菌株。用如实施例2描述的质粒pSYBJE1或对照质粒pSTV28(TakaraBio)转化B-5318菌株以获得氯霉素抗性菌株。在序列测定之后，可以选择B-5318/pSYBJE1菌株和B-5318/pSTV28菌株。

这些菌株在含有50mg/L氯霉素的L-培养基中在37℃培养直到OD600变成约0.6。培养物与相同数量的40％甘油溶液混合，分成各自具有适合的体积的部分，保存在-80℃。

解冻甘油贮备液，将它的100ml均一地接种到含有50mg/L氯霉素的L-平皿上，在37℃孵化24小时。然后，从约八分之一的培养基表面收集细胞，接种到L-苏氨酸生产培养基中，在37℃摇动培养24小时。在完成培养之后，通过离心除去细胞，通过常规方法测定培养物上清液中的L-苏氨酸浓度。从而，可以获得在其中扩增了ybjE基因和具有增强的L-苏氨酸生产能力的菌株

实施例10：在Coryneform细菌中ybjE基因扩增的影响

<10-1>用于ybjE基因扩增的质粒的构建

如实施例2描述的pSYBJE2用EcoRI和PstI消化，将消化的片段连接到已经用相同的酶消化的pVK7(US 20030175912)上。获得的质粒称为pVYBJE1。

<10-2>ybjE基因扩增对使用Coryneform细菌生产L-赖氨酸的影响

谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)ATCC13861菌株被用作起始菌株。用质粒pVYBJE1或对照质粒pVK7转化ATCC13861菌株以获得卡那霉素抗性菌株。在序列测定之后，选择ATCC13861/pVYBJE1菌株和ATCC13861/pVK7菌株。

这些菌株在含有25mg/L卡那霉素的M-CM2S培养基中在31.5℃培养直到OD600变成约0.6。培养物与等量的40％甘油溶液混合，分成各自具有适合的体积的部分，保存在-80℃。

解冻甘油贮备液，将它的100ml均一地接种到含有25mg/L卡那霉素的M-CM2S平皿上，在31.5℃孵化24小时。然后，从约八分之一的培养基表面收集细胞，接种到含有25mg/L卡那霉素的20ml发酵培养基中，在31.5℃115rpm摇动培养42小时。在完成培养之后，通过离心除去细胞，通过使用Biotech Analyzer AS210(Sakura Seiki)测定培养物上清液中的L-赖氨酸浓度。在培养42小时后，在培养基中的所有葡萄糖都被完全地消耗。

结果在表5中示出。与对照ATCC13861/pVK7菌株相比，在其中扩增了ybjE基因的ATCC13861/pVYBJE1能够引起L-赖氨酸更高数量的积累。发现，ybjE基因在Coryneform细菌中的L-氨基酸输出和增强L-赖氨酸生产方面也起到作用。

表5

菌株	L-赖氨酸的生产量(g/L)
		ATCC13861/pVK7	1.1
ATCC13861/pVYBJE1	4.2

实施例11

ybjE基因扩增对高浓度L-氨基酸下生长的影响

用包括ybjE基因的pSYBJE1或对照质粒pTSV28(TakaraBio)转化大肠埃希氏菌MG1655菌株(ATCC47076)。此外，还用包括突变ybjE基因的pSYJE1＊2-1转化MG1655菌株，所述突变ybjE基因具有SEQ ID NO：1的序列，其中第三位置的核苷酸(鸟嘌呤)被替换为腺嘌呤。

根据氯霉素抗性选择导入了这些质粒的转化体，选出的菌株分别称为MG1655/pSYJE1、MG1655/pSYJE1＊2-1和MG1655/pSTV28。

pSYJE1＊2-1如下构建。通过各自具有SEQ ID NOS：5或6的序列的引物从E.coli的L-赖氨酸生产NVC578菌株的染色体DNA进行PCR，来扩增突变ybjE基因。对扩增的DNA测序，发现具有SEQ IDNO：1的序列，在其中第三位置的核苷酸(鸟嘌呤)被替换为腺嘌呤。扩增的DNA与用SmaI消化的pTV28连接，挑选出其中放置了突变ybjE基因、因而由lac启动子表达的质粒，称为pSYJE1＊2-1。

也可以使用例如重叠延伸PCR的方法(Nucleic Acids Res，25，2227-8.1997)，通过向野生型ybjE基因中导入突变来获得突变ybjE基因，其中用引物之一具有核苷酸替换的引物来扩增突变ybjE基因。

然后，检查在各自存在高浓度的L-氨基酸的情况下，MG1655/pSYJE1、MG1655/pSYJE1＊2-1和MG1655/pSTV28菌株的生长。

这些菌株在含有50mg/L氯霉素的5ml L-培养基中摇动培养约6小时。在培养基的OD600达到约1.0时，培养物进行离心，用M9基本培养基洗涤细胞两次，以OD600＝0.05接种到含有50mg/L氯霉素和各自的L-氨基酸(12g/L异亮氨酸、40g/L苏氨酸、15g/L谷氨酸钠、30g/L盐酸组氨酸、45g/L-鸟氨酸氢氯化物、90g/L盐酸精氨酸、8g/L苯丙氨酸、85g/L脯氨酸或0.3g/L半胱氨酸)的M9基本培养基中，培养70小时。选择L-异亮氨酸作为脂肪族L-氨基酸的代表，选择L-苏氨酸作为羟基L-氨基酸的代表，选择L-脯氨酸作为环形L-氨基酸的代表，选择L-苯丙氨酸作为芳香族L-氨基酸的代表，选择L-半胱氨酸作为含硫的L-氨基酸的代表，选择L-谷氨酸作为酸性L-氨基酸和它们的酰胺的代表。结果在附图7-15中示出。发现，在存在高浓度的L-氨基酸、特别是L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸和L-半胱氨酸的情况下，ybjE基因扩增改善了MG1655菌株的生长。还发现，突变ybjE基因比野生型ybjE基因更有效地给MG1655菌株赋予了氨基酸抗性。

实施例12：具有SEQ ID NO：1核苷酸编号49-948的核苷酸序列的ybjE基因的影响

使用具有SEQ ID NO：13或12的核苷酸序列的引物进行PCR从MG1655菌株的染色体DNA扩增ybjE基因，其具有SEQ ID NO：1的核苷酸编号49-948的核苷酸序列(在下文中称为ybjE-900)。还使用具有SEQ ID NO：11或12的核苷酸序列的引物进行PCR扩增了ybjE基因，其具有SEQ ID NO：1的核苷酸编号1-948的核苷酸序列，其中位置1的鸟嘌呤被替换为腺嘌呤(在下文中称为ybjE-948)。

对从每个反应获得PCR产物进行纯化，各自与SmaI消化的pTV28载体(Takara Bio)连接，从而获得用于扩增ybjE-900基因或ybjE-948基因的质粒。挑选其中放置了ybjE-900基因、因而由lac启动子表达的质粒，称为pSYBJE900，和挑选其中放置了ybjE-948基因、因而由lac启动子表达的质粒，称为pSYBJE948。

用pSYBJE900、pSYBJE948、用于实施例2的pSYBJE1或对照质粒pSTV28转化大肠埃希氏菌MG1655菌株(ATCC47076)。根据氯霉素抗性选择导入了这些质粒的转化体，选出的菌株分别称为MG 1655/pSYBJE900、MG1655/pSYBJE948、MG1655/pSYJE 1和 MG1655/pSTV28。

然后，检查在存在高浓度的L-氨基酸的情况下，MG1655/pSYBJE900、MG1655/pSYBJE948、MG1655/pSYJE1和MG1655/pSTV28菌株的生长。

这些菌株在含有50mg/L氯霉素的3ml L-培养基中摇动培养约6小时。在培养基的OD600变成约1.0之后，对培养物进行离心，细胞用M9基本培养基洗涤两次，以OD600＝0.05接种到含有50mg/L氯霉素和80g/L盐酸赖氨酸的M9基本培养基中，培养约20小时。结果在附图16中示出。发现，在存在高浓度L-赖氨酸的情况下，在早期生长期以及对数生长期，ybjE-900基因的扩增改善了MG1655菌株的生长，达到与ybjE-948和包含在pSYJE1中的ybjE基因几乎相同的程度。这些数据表明，在ybjE基因的序列(SEQ ID NO：1)中核苷酸编号49-948的序列足以发挥它们的L-氨基酸输出效果。

工业实用性

根据本发明，可以通过发酵有效地生产L-氨基酸，特别是L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸和L-谷氨酸。L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-脯氨酸作为动物饲料添加剂、健康食品的成分和氨基酸注射液是有用的。L-精氨酸和L-鸟氨酸作为肝功能促进剂、氨基酸注射液和全面氨基酸制品的成分是有用的。L-组氨酸作为肝功能促进剂和作为组胺的前体是有用的。L-苯丙氨酸作为甜味剂的前体是有用的。

序列表

<110> Ajinomoto Co., INC.

<120> C313OPC4257

<130> 生产L-氨基酸的微生物和生产L-氨基酸的方法

<150> JP 2004-23347

<151> 2004-01-30

<160> 17

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 948

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(948)

<223>

<400> 1

gtg tgt cat cgc gca ttt cga ctt cat ctt tgc aag gac tgg gtt ttc 48

Val Cys His Arg Ala Phe Arg Leu His Leu Cys Lys Asp Trp Val Phe

1 5 10 15

atg ttt tct ggg ctg tta atc att ctg gtt ccc ctg att gtg ggt tac 96

Met Phe Ser Gly Leu Leu Ile Ile Leu Val Pro Leu Ile Val Gly Tyr

20 25 30

ctc att ccg ctt cgc caa caa gct gcg tta aaa gtt att aat cag cta 144

Leu Ile Pro Leu Arg Gln Gln Ala Ala Leu Lys Val Ile Asn Gln Leu

35 40 45

tta agc tgg atg gtt tac ctt att ctc ttt ttt atg ggt atc agt ctg 192

Leu Ser Trp Met Val Tyr Leu Ile Leu Phe Phe Met Gly Ile Ser Leu

50 55 60

gcg ttt ctc gat aac ctc gcc agt aac ctg ttg gcg att ctg cat tat 240

Ala Phe Leu Asp Asn Leu Ala Ser Asn Leu Leu Ala Ile Leu His Tyr

65 70 75 80

tct gcc gtc agt att acc gtt att tta ctg tgt aat att gcc gcc ctg 288

Ser Ala Val Ser Ile Thr Val Ile Leu Leu Cys Asn Ile Ala Ala Leu

85 90 95

atg tgg ctg gag cga ggc ctg ccg tgg cgc aac cac cat cag caa gaa 336

Met Trp Leu Glu Arg Gly Leu Pro Trp Arg Asn His His Gln Gln Glu

100 105 110

aaa ctc ccg tcg cgt att gcg atg gcg ctg gag tcg cta aaa ctg tgc 384

Lys Leu Pro Ser Arg Ile Ala Met Ala Leu Glu Ser Leu Lys Leu Cys

115 120 125

ggc gta gta gtg att ggt ttt gcc att ggt cta agt gga ctg gct ttc 432

Gly Val Val Val Ile Gly Phe Ala Ile Gly Leu Ser Gly Leu Ala Phe

130 135 140

tta caa cac gcg acc gaa gcc agt gaa tac acg tta att ttg cta ctt 480

Leu Gln His Ala Thr Glu Ala Ser Glu Tyr Thr Leu Ile Leu Leu Leu

145 150 155 160

ttc ctc gtt ggt att cag ttg cgc aat aat ggc atg acc tta aag cag 528

Phe Leu Val Gly Ile Gln Leu Arg Asn Asn Gly Met Thr Leu Lys Gln

165 170 175

att gtc ctt aat cgc cgg gga atg att gtc gcc gtg gtg gtg gtt gtc 576

Ile Val Leu Asn Arg Arg Gly Met Ile Val Ala Val Val Val Val Val

180 185 190

agt tca tta att ggt ggt tta att aac gcc ttt att ctt gat ctc ccc 624

Ser Ser Leu Ile Gly Gly Leu Ile Asn Ala Phe Ile Leu Asp Leu Pro

195 200 205

atc aat acc gcg ctg gca atg gcc tcc ggt ttc ggc tgg tat tct ctt 672

Ile Asn Thr Ala Leu Ala Met Ala Ser Gly Phe Gly Trp Tyr Ser Leu

210 215 220

tcc ggt att tta ttg acc gaa tct ttt ggt ccg gta atc ggg agc gcg 720

Ser Gly Ile Leu Leu Thr Glu Ser Phe Gly Pro Val Ile Gly Ser Ala

225 230 235 240

gcg ttt ttt aat gat ctg gcc cgt gaa ctg att gct att atg ttg atc 768

Ala Phe Phe Asn Asp Leu Ala Arg Glu Leu Ile Ala Ile Met Leu Ile

245 250 255

cct ggg ctg att cgc cgc agc cgc tct act gca ctg ggc tta tgc ggt 816

Pro Gly Leu Ile Arg Arg Ser Arg Ser Thr Ala Leu Gly Leu Cys Gly

260 265 270

gcc aca tca atg gat ttc acc ctg ccc gtt ctt caa cgt act ggc ggg 864

Ala Thr Ser Met Asp Phe Thr Leu Pro Val Leu Gln Arg Thr Gly Gly

275 280 285

ctg gat atg gtc ccg gcg gca att gtt cac ggt ttt att ctt agc ctg 912

Leu Asp Met Val Pro Ala Ala Ile Val His Gly Phe Ile Leu Ser Leu

290 295 300

tta gtg ccg atc ctc atc gcc ttt ttc tct gcg taa 948

Leu Val Pro Ile Leu Ile Ala Phe Phe Ser Ala

305 310 315

<210> 2

<211> 315

<212> PRT

<213> 大肠埃希氏菌

<400> 2

Val Cys His Arg Ala Phe Arg Leu His Leu Cys Lys Asp Trp Val Phe

1 5 10 15

Met Phe Ser Gly Leu Leu Ile Ile Leu Val Pro Leu Ile Val Gly Tyr

20 25 30

Leu Ile Pro Leu Arg Gln Gln Ala Ala Leu Lys Val Ile Asn Gln Leu

35 40 45

Leu Ser Trp Met Val Tyr Leu Ile Leu Phe Phe Met Gly Ile Ser Leu

50 55 60

Ala Phe Leu Asp Asn Leu Ala Ser Asn Leu Leu Ala Ile Leu His Tyr

65 70 75 80

Ser Ala Val Ser Ile Thr Val Ile Leu Leu Cys Asn Ile Ala Ala Leu

85 90 95

Met Trp Leu Glu Arg Gly Leu Pro Trp Arg Asn His His Gln Gln Glu

100 105 110

Lys Leu Pro Ser Arg Ile Ala Met Ala Leu Glu Ser Leu Lys Leu Cys

115 120 125

Gly Val Val Val Ile Gly Phe Ala Ile Gly Leu Ser Gly Leu Ala Phe

130 135 140

Leu Gln His Ala Thr Glu Ala Ser Glu Tyr Thr Leu Ile Leu Leu Leu

145 150 155 160

Phe Leu Val Gly Ile Gln Leu Arg Asn Asn Gly Met Thr Leu Lys Gln

165 170 175

Ile Val Leu Asn Arg Arg Gly Met Ile Val Ala Val Val Val Val Val

180 185 190

Ser Ser Leu Ile Gly Gly Leu Ile Asn Ala Phe Ile Leu Asp Leu Pro

195 200 205

Ile Asn Thr Ala Leu Ala Met Ala Ser Gly Phe Gly Trp Tyr Ser Leu

210 215 220

Ser Gly Ile Leu Leu Thr Glu Ser Phe Gly Pro Val Ile Gly Ser Ala

225 230 235 240

Ala Phe Phe Asn Asp Leu Ala Arg Glu Leu Ile Ala Ile Met Leu Ile

245 250 255

Pro Gly Leu Ile Arg Arg Ser Arg Ser Thr Ala Leu Gly Leu Cys Gly

260 265 270

Ala Thr Ser Met Asp Phe Thr Leu Pro Val Leu Gln Arg Thr Gly Gly

275 280 285

Leu Asp Met Val Pro Ala Ala Ile Val His Gly Phe Ile Leu Ser Leu

290 295 300

Leu Val Pro Ile Leu Ile Ala Phe Phe Ser Ala

305 310 315

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 3

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 4

gagcggataa caatttcaca cagg 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 5

ggctctggcg aacaaaatcg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 6

gccggagtac ggatagtttg 20

<210> 7

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 7

ataaaaccgt gaacaattgc cgccgggacc atatcccagt gccaacatag taagcc 56

<210> 8

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 8

ggttacctca ttccgcttcg ccaacaagct gcgttacctg tggaacacct acatct 56

<210> 9

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 保守序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (22),(23),(27),(28),(31),(36),(59),(62),(71),(81),(86),(91),(110),

(117),(120),(127),(128),(142),(154),(169),(176),(180),(183),(193),

(194),(235),(244),(270),(273)..(275),(292),(294)

<223> Xaa=任何氨基酸残基

<400> 9

Met Phe Ser Gly Leu Leu Ile Ile Leu Val Pro Leu Ile Val Gly Tyr

1 5 10 15

Leu Ile Pro Leu Arg Xaa Xaa Ala Ala Leu Xaa Xaa Ile Asn Xaa Leu

20 25 30

Leu Ser Trp Xaa Val Tyr Leu Ile Leu Phe Phe Met Gly Ile Ser Leu

35 40 45

Ala Phe Leu Asp Asn Leu Ala Ser Asn Leu Xaa Ala Ile Xaa His Tyr

50 55 60

Ser Ala Val Ser Ile Thr Xaa Ile Leu Leu Cys Asn Ile Ala Ala Leu

65 70 75 80

Xaa Trp Leu Glu Arg Xaa Leu Pro Trp Arg Xaa His His Gln Gln Glu

85 90 95

Lys Leu Pro Ser Arg Ile Ala Met Ala Leu Glu Ser Leu Xaa Leu Cys

100 105 110

Gly Val Val Val Xaa Gly Phe Xaa Ile Gly Leu Ser Gly Leu Xaa Xaa

115 120 125

Leu Gln His Ala Thr Glu Ala Ser Glu Tyr Thr Leu Ile Xaa Leu Leu

130 135 140

Phe Leu Val Gly Ile Gln Leu Arg Asn Xaa Gly Met Thr Leu Lys Gln

145 150 155 160

Ile Val Leu Asn Arg Arg Gly Met Xaa Val Ala Val Val Val Val Xaa

165 170 175

Ser Ser Leu Xaa Gly Gly Xaa Ile Asn Ala Phe Ile Leu Asp Leu Pro

180 185 190

Xaa Xaa Thr Ala Leu Ala Met Ala Ser Gly Phe Gly Trp Tyr Ser Leu

195 200 205

Ser Gly Ile Leu Leu Thr Glu Ser Phe Gly Pro Val Ile Gly Ser Ala

210 215 220

Ala Phe Phe Asn Asp Leu Ala Arg Glu Leu Xaa Ala Ile Met Leu Ile

225 230 235 240

Pro Gly Leu Xaa Arg Arg Ser Arg Ser Thr Ala Leu Gly Leu Cys Gly

245 250 255

Ala Thr Ser Met Asp Phe Thr Leu Pro Val Leu Gln Arg Xaa Gly Gly

260 265 270

Xaa Xaa Xaa Val Pro Ala Ala Ile Val His Gly Phe Ile Leu Ser Leu

275 280 285

Leu Val Pro Xaa Leu Xaa Ala Phe Phe Ser Ala

290 295

<210> 10

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 保守序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2),(10),(14),(21)..(28),(31),(32),(39),(55),(56),(60),

(62),(63),(65)..(71),(74),(75),(77),(78),(81),(82),(86),

(87),(90)..(92),(94),(97),(102),(103),(116),(117),(120),

(121),(125)..(128),(131),(133)..(135),(138),(139),(142),

(154),(159),(168),(169),(172),(175),(176),(178),(180),

(183),(185),(187),(188),(190),(194),(196),(215),(216),

(235),(242),(244),(246),(270),(274),(285),(290),(294)

<223> Xaa=任何氨基酸残基

<400> 10

Met Xaa Ser Gly Leu Leu Ile Ile Leu Xaa Pro Leu Ile Xaa Gly Tyr

1 5 10 15

Leu Ile Pro Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Asn Xaa Xaa

20 25 30

Leu Ser Trp Met Val Tyr Xaa Ile Leu Phe Phe Met Gly Ile Ser Leu

35 40 45

Ala Phe Leu Asp Asn Leu Xaa Xaa Asn Leu Leu Xaa Ile Xaa Xaa Tyr

50 55 60

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Leu Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Ala Leu

65 70 75 80

Xaa Xaa Leu Glu Arg Xaa Xaa Pro Trp Xaa Xaa Xaa His Xaa Gln Glu

85 90 95

Xaa Leu Pro Ser Arg Xaa Xaa Met Ala Leu Glu Ser Leu Lys Leu Cys

100 105 110

Gly Val Val Xaa Xaa Gly Phe Xaa Xaa Gly Leu Ser Xaa Xaa Xaa Xaa

115 120 125

Leu Gln Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Ser Glu Xaa Xaa Leu Ile Xaa Leu Leu

130 135 140

Phe Leu Val Gly Ile Gln Leu Arg Asn Xaa Gly Met Thr Leu Xaa Gln

145 150 155 160

Ile Val Leu Asn Arg Arg Gly Xaa Xaa Val Ala Xaa Val Val Xaa Xaa

165 170 175

Ser Xaa Leu Xaa Gly Gly Xaa Ile Xaa Ala Xaa Xaa Leu Xaa Leu Pro

180 185 190

Ile Xaa Thr Xaa Leu Ala Met Ala Ser Gly Phe Gly Trp Tyr Ser Leu

195 200 205

Ser Gly Ile Leu Leu Thr Xaa Xaa Phe Gly Pro Val Ile Gly Ser Ala

210 215 220

Ala Phe Phe Asn Asp Leu Ala Arg Glu Leu Xaa Ala Ile Met Leu Ile

225 230 235 240

Pro Xaa Leu Xaa Arg Xaa Ser Arg Ser Thr Ala Leu Gly Leu Cys Gly

245 250 255

Ala Thr Ser Met Asp Phe Thr Leu Pro Val Leu Gln Arg Xaa Gly Gly

260 265 270

Leu Xaa Met Val Pro Ala Ala Ile Val His Gly Phe Xaa Leu Ser Leu

275 280 285

Leu Xaa Pro Ile Leu Xaa Ala Phe Phe Ser

290 295

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 11

ggcatatgtg tcatcgcgca tttcgac 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 12

ggctcgagtt acgcagagaa aaaggcg 27

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 13

ggcatatgtt ttctgggctg tta 23

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 引物

<400> 14

tgacctgcag gtttgcacag aggatggccc atgtt 35

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 引物

<400> 15

cattctagat ccctaaactt tacagcaaac cggcat 36

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 引物

<400> 16

agggaattcc ccgttctgga taatgttttt tgcgccgac 39

<210> 17

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 引物

<400> 17

cggatgcatc tagagttaac ctgcagggtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacac 58

1

Claims

1. 具有L-氨基酸生产能力的微生物，其中所述微生物被修饰从而ybjE基因的表达被增强。

2. 根据权利要求1的微生物，其中通过提高所述ybjE基因的拷贝数目，或通过修饰所述ybjE基因的表达调节序列增强了所述ybjE基因的表达。

3. 根据权利要求1的微生物，其中由所述ybjE基因编码的蛋白质的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2、9和10，其中所述蛋白质具有L-氨基酸输出能力。

4. 根据权利要求1的微生物，其中所述ybjE基因选自：

（a）包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA；和

（b）在严格条件下与SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与可从SEQ ID NO：1的核苷酸序列制备的探针可杂交的DNA，并且其中所述DNA编码具有L-氨基酸输出能力的蛋白质。

5. 根据权利要求1的微生物，其中所述ybjE基因选自：

（a）具有SEQ ID NO：1中核苷酸编号49到948的核苷酸序列的DNA；和

（b）在严格条件下与SEQ ID NO：1中核苷酸编号49到948的核苷酸序列或与可从SEQ ID NO：1中核苷酸编号49到948的核苷酸序列制备的探针可杂交的DNA，并且其中所述DNA编码具有L-氨基酸输出能力的蛋白质。

6. 根据权利要求1的微生物，其中所述微生物的所述L-氨基酸输出能力通过所述增强所述ybjE基因的表达来提高。

7. 根据权利要求1的微生物，其中所述微生物对L-氨基酸或L-氨基酸类似物的抗性通过所述增强所述ybjE基因的表达来提高。

8. 根据权利要求1到7任一项的微生物，其中所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸。

9. 根据权利要求1到7任一项的微生物，其中所述微生物属于肠杆菌家族。

10. 根据权利要求9的微生物，其中所述属于肠杆菌科家族的微生物是属于包括大肠杆菌（Escherichia coli）的埃希氏菌属的微生物。

11. 根据权利要求1到7任一项的微生物，其中所述微生物是包括谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的Coryneform细菌。

12. 根据权利要求1到7任一项的微生物，其中所述微生物是甲醇同化细菌。

13. 根据权利要求12的微生物，其中所述甲醇同化细菌是属于包括食甲基嗜甲基菌（Methylophilus methylotrophus）的嗜甲基菌属，或包括糖原甲基菌（Methylobacillus glycogenes）和Methylobacillus flagellatum的甲基菌属的微生物。

14. 生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养根据权利要求1到13任一项的微生物来产生和引起所述L-氨基酸的积累，并从所述培养基或所述微生物收集所述L-氨基酸。

15. 生产L-氨基酸的方法，包括在含有甲醇作为主要碳源的液体培养基中培养根据权利要求12或13的微生物来产生和引起所述L-氨基酸的积累，并从所述培养基或所述微生物收集所述L-氨基酸。

16. 根据权利要求14或15的方法，其中所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸。