CN1969038B - L-氨基酸生产细菌和生产l-氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
通过修饰大肠杆菌K12菌株或其衍生物从而成为对L-缬氨酸有抗性,并具有生产选自由L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸和L-脯氨酸构成的组中的一种或多种L-氨基酸的能力,来培育大肠杆菌的L-氨基酸生产菌株。
Description
技术领域
本发明涉及使用大肠杆菌(Escherichia coli)生产L-氨基酸的方法。具体地,本发明涉及生产L-色氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸或L-脯氨酸的方法。这些是工业上有用的L-氨基酸。即,L-色氨酸和L-赖氨酸作为动物饲料添加剂、保健食品的成分和氨基酸输注剂(infusion)是有用的。L-苯丙氨酸作为动物饲料以及作为天冬苯丙二肽酯(aspartame)的前体是有用的。L-酪氨酸作为生产肾上腺素(adrenaline)的原料是有用的。L-谷氨酸作为调味材料、作为氨基酸输注剂以及作为氨基酸制剂的成分是有用的。L-组氨酸作为肝功能促进药物和作为组胺(histamine)的前体是有用的。L-半胱氨酸作为食品添加剂以及作为药物和化妆品的成分是有用的。L-脯氨酸作为氨基酸输注剂是有用的。
背景技术
属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌已经被用于L-氨基酸的发酵生产(Amino Acid Fermentation,Japan Scientific Societies Press,1986,p.77 to 84)。用于发酵生产的L-氨基酸生产细菌一般地通过使用重组DNA技术进行修饰来增强L-氨基酸生物合成酶的活性,或通过使细菌菌株突变来赋予L-氨基酸生产能力来培育。例如,已通过用诱变剂(mutagen)例如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍处理菌株来导入一个或多个突变。然而,这种方法有时产生问题,例如,突变被导入到目标基因之外的基因,例如,对于生长很重要的基因中,因而突变的菌株成为对某些营养物是营养缺陷的。另一方面,当增强L-氨基酸生物合成途径中目标酶的活性时,仅某些代谢途径被激活,这可导致能量不平衡以及营养物质如目标L-氨基酸之外的L-氨基酸的缺乏。在这种情况下,需要在补充有该营养缺陷菌株所需营养物的培养基中进行发酵。然而,这可能产生在从培养基收集目标L-氨基酸的过程中这些营养物可作为污染物残留的问题。
大肠杆菌K12菌株是用于培育L-氨基酸生产细菌的菌株的代表。作为从大肠杆菌K12菌株培育的L-氨基酸生产细菌,例如,具有改变的代谢活性的突变菌株以及通过重组DNA技术修饰从而使L-氨基酸生物合成酶的活性增强的菌株已经被报道(US6653111或JP3185261B)。
K12菌株对L-缬氨酸敏感,并在含有L-缬氨酸的培养基中它的生长受抑制。也就是说,当它在含有L-缬氨酸的培养基中培养时,与在不含L-缬氨酸的培养基中培养物相比,它的生长未被观察到或被延迟。当该菌株在不含L-缬氨酸的培养基中培养时,不产生支链L-氨基酸例如L-异亮氨酸和L-亮氨酸,导致更差的生长。因此,为了避免更差的生长,需要在含有L-异亮氨酸和L-亮氨酸的培养基中培养它,L-异亮氨酸和L-亮氨酸与L-缬氨酸一样被分类为支链L-氨基酸。然而,当生产L-异亮氨酸或L-亮氨酸之外的L-氨基酸时,添加L-异亮氨酸或L-亮氨酸是不可取的。
大肠杆菌含有乙酰羟酸合酶(AHAS),其催化支链L-氨基酸的生物合成途径中的第一个步骤。在大肠杆菌中存在AHAS的三种同工酶(isozyme):AHASI、AHASII和AHASIII。K12菌株在ilvG基因中具有移码突变,从而正常的ilvG基因不表达,所述ilvG基因编码同工酶AHASII的大亚基(Proc.Natl.Acad.Sci USA,1981,vol.78:p922-925)。
已经报道了,通过导入赋予K12菌株L-缬氨酸抗性的突变,正常ilvG基因的表达可以被恢复(E.coli and Salmonella 2nd Edition 1996,vol.1,p442-457)。此外,已经报道了使用K12菌株生产L-异亮氨酸或L-亮氨酸的方法,在所述K12菌株中导入了含有ilvG基因的ilvGMEDA操纵子,所述ilvG基因没有所述导入的移码突变(US5,998,178或JP-A2001-346578)。已经报道了使用被赋予L-缬氨酸抗性的K12菌株生产L-亮氨酸的方法(JP-A2000-116393)。
然而,使用来源于K12菌株的L-氨基酸生产细菌,所述细菌已经被修饰以具有L-缬氨酸抗性或回复(reverse)ilvG基因的移码突变,用于L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸和L-脯氨酸的生产还从未被报道过。
发明内容
本发明的目的是通过修饰K12菌株来提供能有效地生产L-氨基酸,例如L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸和L-脯氨酸的菌株。本发明的又一个目的是提供使用这种菌株生产L-氨基酸的方法。
本发明的发明人为了实现上述目的已经进行了广泛的研究。结果,他们发现,K12菌株的衍生菌株SV164/pGH5菌株,在将支链L-氨基酸添加到培养基中时,更有效地产生L-色氨酸。此外,他们发现,当通过恢复ilvG基因的移码突变赋予菌株L-缬氨酸抗性时,SV164/pGH5菌株生产支链L-氨基酸以外的L-氨基酸,尤其是L-色氨酸的能力得到改善,由此完成了本发明。
本发明的目的是提供可通过修饰大肠杆菌K12菌株或其衍生物获得的大肠杆菌的分离的菌株,其中所述分离的菌株对L-缬氨酸有抗性,并具有生产选自由L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸和L-脯氨酸构成的组中的一种或多种L-氨基酸的能力。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的菌株,其中所述菌株具有在含有20mg/L的L-缬氨酸的培养基中生长的能力。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的菌株,其中通过增强细胞内乙酰羟酸合酶活性以使其高于未修饰的K12菌株中的细胞内乙酰羟酸合酶活性,来将所述分离的菌株修饰成为L-缬氨酸抗性的。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的菌株,其中所述分离的菌株被修饰从而产生有活性的乙酰羟酸合酶II。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的菌株,其中所述有活性的乙酰羟酸合酶II是由包含SEQ ID NO:3或5的核苷酸序列的基因编码的蛋白。
本发明的进一步的目的是提供生产L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸或L-脯氨酸的方法,其包括在培养基中培养如上所述的菌株,并从培养基或细菌细胞中收集L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸或L-脯氨酸。
附图说明
图1显示L-亮氨酸和L-异亮氨酸对SV164/pGH5菌株和L-缬氨酸抗性菌株中L-色氨酸积累的影响。符号●、■、▲和○分别代表SV164/pGH5菌株、M6菌株、M9菌株和T2菌株。
图2显示没有添加L-亮氨酸和L-异亮氨酸时SV164/pGH5菌株和L-缬氨酸抗性菌株(T2)的生长。符号●和○分别代表SV164/pGH5和T2菌株。
优选实施方式的详细说明
以下,将详细描述本发明。
<1>本发明的微生物
本发明的微生物是大肠杆菌的菌株,其是可通过修饰大肠杆菌K12菌株或其衍生物以对L-缬氨酸有抗性,并具有生产选自由L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸和L-脯氨酸组成的组中的一种或多种L-氨基酸的能力而获得的。待生产的L-氨基酸优选为芳香族L-氨基酸,例如L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸。
大肠杆菌K12菌株在1922年在斯坦福大学(Stanford University)分离,是入噬菌体的溶原性细菌。另外,它是具有F因子的多用途菌株,通过接合、基因扩增等等可以从它构建遗传重组菌株。此外,已经确定了大肠杆菌K12菌株的基因组序列,因此它的基因信息是可用的(Science277(5331),1453-1474(1997))。大肠杆菌K12菌株和其衍生物可从美国典型培养物保藏所(ATCC,地址:P.O.Box1549,Manassas,VA20108,美国)获得。
本发明的K12菌株的衍生物没有具体的限制,只要它具有源自K12菌株的ilvG基因,即具有如下所述的移码突变的ilvG基因。其实例包括大肠杆菌MG1655菌株(ATCCNo.47076)、W3110菌株(ATCCNo.27325)和SV164菌株(JP 3032013 B)。
为了获得本发明的大肠杆菌菌株,首先,将上述的K12菌株或其衍生物修饰以对L-缬氨酸有抗性。术语“对L-缬氨酸有抗性”意思是该菌株具有在含有高浓度L-缬氨酸的培养基中生长的能力。在本说明书中,术语“高浓度”是指,例如,20mg/L或更高,优选100mg/L。
可以如下进行这样的修饰,例如,将大肠杆菌K12菌株或其衍生物经过突变处理,从得到的突变菌株中选择能在含有高浓度L-缬氨酸的培养基中生长的菌株。获得L-缬氨酸抗性菌株的突变处理没有具体的限制,而其实例包括用紫外辐射处理或用通常在这种突变处理中使用的诱变剂来处理,例如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸。
例如,将已经在液体培养基中培养直到对数生长期或稳定期的突变菌株培养物用新鲜的液体培养基、盐水等等稀释,并将得到的细菌细胞悬浮液施加到含有L-缬氨酸的固体培养基,在最适生长温度,例如在37℃培养1到3天。然后,选择出现的菌落作为L-缬氨酸抗性菌株。添加到培养基的L-缬氨酸的量是,例如,20mg/L或更高,优选大约100mg/L。
可用于选择L-缬氨酸抗性菌株的培养基的实例包括基本培养基。含有L-缬氨酸的基本培养基的实例包括具有以下成分的培养基:4g/L葡萄糖、12.8g/L磷酸氢二钠、3g/L磷酸二氢钾、1g/L氯化钠、1g/L氯化铵、5mM硫酸镁、0.1mM氯化钙、1mg/L硫胺素和20mg/LL-缬氨酸。
如果必要,基本培养基可以含有生长必需的营养物。例如,当赋予L-色氨酸的突变菌株L-缬氨酸抗性时,培养基优选以生长所必需的量含有L-苯丙氨酸和L-酪氨酸,因为大多数L-色氨酸生产突变菌株具有减弱的L-苯丙氨酸和L-酪氨酸生物合成途径,并且对L-苯丙氨酸和L-酪氨酸是营养缺陷的。
此外,通过基因重组技术可以赋予L-缬氨酸抗性。例如,可通过增强L-缬氨酸生物合成酶,例如乙酰羟酸合酶的细胞内活性的修饰,以使其高于未修饰的K12菌株中的活性,来赋予K12菌株或其衍生物L-缬氨酸抗性。可以通过Westerferd,W.W(1945)J.Biol.Chem,161,495-502中描述的方法测定乙酰羟酸合酶的活性。
已知大肠杆菌中存在乙酰羟酸合酶(乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase))的三种同工酶AHASI、AHASII和AHASIII。在这些中,AHASII由大亚基和小亚基组成,其分别由ilvG和ilvM基因编码。
来自MG 1655菌株(其为大肠杆菌K12菌株的衍生物)的ilvG基因的核苷酸序列在SEQ ID NO:1中示出(GenBank登记号No.AAC77488)。如在SEQID NO:1中所示,在来自K12菌株或其衍生物的ilvG基因中,来自其他大肠杆菌菌株(O菌株、B菌株等)的ilvG基因(例如,具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的基因;以下称为正常的ilvG基因)的位置983和984处的核苷酸GT被删除,从而发生移码突变,而且在SEQ ID NO:1的位置982到984的核苷酸TGA充当翻译终止密码子。出于这一原因,正常的ilvG基因不表达,而且在K12菌株或其衍生物中AHASII活性被消除。
因此,为了提高大肠杆菌K12菌株或其衍生物中的AHAS活性,优选地将菌株修饰以产生有活性的AHASII。为了这个目的,将菌株优选地修饰,以使其携带不具有移码突变的ilvG基因(例如,具有SEQ ID NO:3或5的核苷酸序列的基因)。具体地,在其中SEQ ID NO:1的ilvG基因的位置982到984处的TGA不起翻译终止密码子作用的基因,被优选地导入以回复移码突变。例如,K12菌株的ilvG基因可以被正常的ilvG基因(SEQ ID NO:3或5)替代。优选地,GT被插入到SEQ ID NO:1中位置982处的T和位置983处的G之间。这种插入可以使用PCR通过定点诱变来实现。
此外,SEQ ID NO:1的位置982到984处的核苷酸可以通过P1转导被替换为来自正常ilvG基因(SEQ ID NO:3)的位置982-986处的核苷酸。此外,K12菌株的全长ilvG基因可以被全长的正常ilvG基因替代。
导入不具有移码突变的ilvG基因可以通过缺失ilvG基因位置982到984上游的区域中一个或四个核苷酸以将TGA移出框外来实现。具体地,SEQ IDNO:1中位置979处的核苷酸C可以被删除。这种ilvG基因的实例包括具有SEQ ID NO:5的核苷酸序列的基因。
此外,修饰K12菌株从而产生有活性的AHASII可以通过使用遗传重组技术增加正常ilvG基因(SEQ ID NO:3)的拷贝数来进行。为了有效地提高AHASII活性,还优选地导入编码AHASII的小亚基的ilvM基因(例如,GenBank登记号X04890;2374-2637)。可以分开地导入正常的ilvG和ilvM基因,但它们也可以作为正常ilvGM基因(例如,GenBank登记号X04890;731-2637)被同时导入。此外,它们可以作为含有正常ilvG基因的ilvGMEDA操纵子(例如,GenBank登记号X04890)被导入。
可用于增加正常ilvG基因的拷贝数的基因可以是在严格条件下与上述正常ilvG基因(SEQ ID NO:3或5)通过形成与ilvM基因产物的复合物杂交的基因,只要它编码显示AHAS活性的蛋白。如在此使用的“严格条件”是这样的条件,在这些条件下形成所谓的特异性杂交体,而不形成非特异性杂交体。严格条件的实例包括这样的条件,在该条件之下,具有高同源性的DNA相互杂交,例如,具有不低于70%、优选不低于80%、更优选不低于90%、特别优选不低于95%的同源性的DNA相互杂交,而且具有低于70%的同源性的DNA不相互杂交,和这样的条件,在该条件下,在通常的Southern杂交洗涤的盐浓度下,即,用1xSSC、0.1%SDS在60℃,优选0.1x SSC、0.1%SDS在60℃,更优选0.1 x SSC、0.1%SDS在68℃下洗涤一次或优选2-3次的条件下,DNA相互杂交。
为了导入正常ilvG基因(或ilvGM、ilvGMEDA基因),可以如下进行转化:将含有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列的DNA片段插入到能在K-12菌株中复制的载体中,优选多拷贝载体,从而制备重组DNA。然后将该重组DNA导入K-12菌株中。能在K-12菌株中复制的载体的实例包括能在大肠杆菌中自主复制的质粒载体。
能在大肠杆菌K-12菌株中自主复制的载体的实例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184、(pHSG和pACYC可从TAKARABIOINC.获得)、RSF1010、pBR322和pMW219(pMW可从NIPPON GENETICCo.,Ltd.获得)。
将如上制备的重组DNA导入K-12菌株或其衍生物可以通过已知的转化方法进行。转化方法的实例包括,用氯化钙处理受体细胞以提高DNA的透过性,对于将该处理用于大肠杆菌K-12已进行了报道(Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)),从处在生长期的细胞制备感受态细胞,随后用DNA转化,对于将该处理用于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)已进行了报道(Duncan,C.H.,Wilson,GA.and Young,F.E.,Gene,1,153(1977)),等等。除这些方法之外,可以采用已被报道适合于枯草芽孢杆菌、放线菌(actinomycetes)和酵母的(Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Gen.Genet.,168,111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,GR.,Proc.Natl.Sci.,USA,75,1929(1978))将重组DNA导入原生质体(protoplast)或原生质球(spheroplast)样受体细胞的方法。此外,微生物的转化也可以通过电脉冲方法(JP2-207791A)进行。
正常ilvG的拷贝数也可以通过将正常ilvG基因的多个拷贝整合到大肠杆菌K12菌株的染色体DNA中来增加。为了将基因的多个拷贝整合到大肠杆菌K12菌株的染色体DNA中,可以通过靶向在染色体DNA上以多拷贝存在的序列,进行同源重组(Experiments in Molecular Genetlcs,Cold Spring HarborLab.,1972)。转座子末端的重复DNA和反向重复序列(inverted repeats)可被用作以多拷贝存在于染色体DNA上的序列。可选择地,如在EP0332488B中公开的,也可能将正常ilvG基因掺入到转座子中,并容许其被转移,以将多拷贝的基因整合到染色体DNA中。此外,正常ilvG基因也可以通过使用Mu噬菌体掺入到宿主染色体中(EP0332488B)。
增强正常ilvG基因的表达也可以通过将染色体DNA上或质粒上的表达调控序列,例如基因的启动子替换为更强的来实现,如在WO00/18935中所公开的。例如,lac启动子、trp启动子、trc启动子、pL启动子等等被称为强启动子。此外,也可能将几个核苷酸取代导入基因的启动子区域使得所述启动子更强。表达调控序列的取代可以例如使用温度敏感性质粒,以与基因取代相同的方式来进行。具有大肠杆菌的温度敏感性复制起点的载体的实例包括在WO99/03988中描述的质粒pMAN997,等等。此外,表达调控序列的取代也可以通过使用入噬菌体的Red重组酶(Datsenko,K.A.,PNAS,97(12),6640-6645,2000)来进行。表达调控序列的修饰可以与增加基因的拷贝数组合。此外,由于已知在核糖体结合位点(RBS)和翻译起始密码子之间的间隔区序列,尤其是紧靠起始密码子上游的几个核苷酸,对翻译效率有很大的影响,可以修饰这个序列。ilvG基因的表达调控序列可以使用用于启动子鉴定的载体或遗传分析软件例如GENETYX来鉴定。
本发明的菌株优选的是这样的菌株,作为赋予L-缬氨酸抗性的结果,当与对照菌株(包括K12菌株的亲本菌株)相比时,在基本上不存在支链L-氨基酸的情况下它显示了改善的生长。在本说明书中,术语“支链L-氨基酸”是指L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸。此外,术语“基本上不存在支链L-氨基酸的情况下”是指培养基中支链L-氨基酸的浓度为1g/L或更低,优选100mg/L或更低,更优选50mg/L或更低,特别优选为0。基本上不存在支链L-氨基酸的情况下赋予L-缬氨酸抗性的菌株和对照菌株的生长评估可以在液体和固体培养基中进行。
例如,将在其中L-缬氨酸抗性菌株或对照菌株已经培养直到对数生长期或稳定期的培养基用培养基、盐水等等稀释,将得到的细菌细胞悬浮液施加到不含有支链L-氨基酸的固体培养基上,在最适生长温度,例如在37℃将这些菌株培养1到3天。如果出现的L-缬氨酸抗性菌株菌落的大小比对照菌株的大,就认为L-缬氨酸抗性菌株的生长好于对照菌株的生长。添加到固体培养基的支链L-氨基酸的量是,例如,50mg/L或更低,优选10mg/L或更低,更优选为0。
可选择地,可将已经如上所述培养和稀释了的L-缬氨酸抗性菌株或对照菌株的细菌细胞悬浮液接种到基本上不存在支链L-氨基酸的液体培养基中,并在最适生长温度,例如在37℃下培养约几个小时到1天,优选约6小时。待添加到培养基的支链L-氨基酸的量是,例如,50mg/L或更低,更优选10mg/L或更低,优选为0。如果L-缬氨酸抗性菌株的光密度(opticaldensity)(OD)或浊度(turbidity)在对数生长期或稳定期高于对照菌株,就认为L-缬氨酸抗性菌株的生长好于对照菌株的生长。如果L-缬氨酸抗性菌株达到对数生长期或OD的最大值早于对照菌株,也认为L-缬氨酸抗性菌株的生长更好。上述的术语“对数生长期”是指细胞数目对数性地增加的阶段。同时,术语“稳定期”是指由于在对数生长期之后分裂和增殖停止而观察不到细胞数目增加的阶段。
通过给上述L-缬氨酸抗性菌株赋予生产选自由L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸和L-脯氨酸组成的组中的一种或多种L-氨基酸的能力,可以获得本发明的菌株。可选择地,可以首先赋予生产L-氨基酸的能力,随后赋予L-缬氨酸抗性。
在本发明中,术语“生产L-氨基酸的能力”是指当在培养基中培养本发明的菌株时,产生和导致L-氨基酸在培养基或细菌细胞中积累的能力。具有生产L-氨基酸的能力的菌株可以是原本就具有生产L-氨基酸的能力的菌株,或是通过使用突变方法或重组DNA技术进行修饰以具有生产L-氨基酸的能力的菌株。本发明的菌株可以是通过增强上述的正常ilvG基因的表达被赋予生产L-氨基酸的能力的菌株。本发明的菌株也可以具有生产选自由L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸和L-脯氨酸组成的组中的两种或更多种L-氨基酸的能力。
为了赋予生产L-氨基酸的能力,可以使用在培育包括棒状杆菌细菌和埃希氏菌属细菌的L-氨基酸生产微生物中所通常采用的方法。例如,这些方法包括产生营养缺陷突变体菌株、类似物抗性菌株、或代谢调控突变菌株,以及产生其中L-氨基酸生物合成酶的活性增强的重组菌株(参见AminoAcid Fermentation,p.77 to 100,Japan Scientific Societies Press,first editionpublication:May 30,1986)。在本发明中,营养缺陷突变、类似物抗性突变和代谢调控突变可以在L-氨基酸生产菌株的培育期间单独地或组合地导入。此外,可以增强两种或多种L-氨基酸生物合成酶的活性。此外,导入营养缺陷突变、类似物抗性突变和代谢调控突变可以与增强L-氨基酸生物合成酶的活性组合。
可以如下获得具有生产L-氨基酸的能力的营养缺陷突变菌株、类似物抗性菌株和代谢调控突变菌株。通过一般的突变处理,即,用X射线或紫外线照射或者通过用诱变剂,例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍处理,来处理K12菌株或其衍生物,并从得到的突变菌株中选择显示营养缺陷、类似物抗性或代谢调节突变并且具有生产L-氨基酸的能力的菌株。
以下,将描述来自K12菌株并具有L-氨基酸生产能力的菌株的实例。因此,L-缬氨酸抗性可以被赋予以下菌株。然而,L-氨基酸生产菌株不限于以下菌株。
作为具有L-色氨酸生产能力的菌株,可以使用其中选自邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)、 磷酸甘油酸脱氢酶(phosphoglyceratedehydrogenase)和色氨酸合酶(tryptophan synthase)的一种或多种酶活性增强的菌株。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶都受到L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制,因而可以将使反馈抑制脱敏(desensitize)的突变导入到这些酶中。具体地,例如,将邻氨基苯甲酸合酶基因(trpE)和/或磷酸甘油酸脱氢酶基因(serA)突变从而不受到反馈抑制,并将得到的突变基因导入K12菌株或其衍生物。这种菌株的具体实例包括大肠杆菌SV164菌株,其带有脱敏的邻氨基苯甲酸合酶,和通过将质粒pGH5导入大肠杆菌SV164菌株获得的转化体菌株(参见WO94/08031),其含有编码反馈脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶的突变serA基因。
其中导入了含有色氨酸操纵子的重组DNA的菌株也优选地用作L-色氨酸生产菌株。它的具体实例包括其中已导入了色氨酸操纵子的大肠杆菌菌株,所述色氨酸操纵子含有编码脱敏感的邻氨基苯甲酸合酶的基因(JP-A57-71397,JP-A62-244382,US 4,371,614)。此外,通过增强色氨酸操纵子中编码色氨酸合酶的基因(trpBA)的表达,可以赋予L-色氨酸生产能力。色氨酸合酶由分别由trpA和trpB编码的α和β亚基组成。
此外,L-色氨酸生产菌株的实例包括对L-苯丙氨酸和L-酪氨酸是营养缺陷的菌株(大肠杆菌AGX17(pGX44)[NRRLB-12263]菌株),以及携带含色氨酸操纵子的质粒pGX50的菌株(AGX6(pGX50)aroP[NRRL B-12264]菌株)(参见US4,371,614)。
L-苯丙氨酸生产菌株的实例包括大肠杆菌菌株AJ12739(tyrA∷Tn10,tyrR);携带pheA34基因的大肠杆菌菌株HW1089(ATCC登记号55371)(US5,354,672);突变体MWEC101-b菌株(KR8903681);菌株NRRL B-12141、NRRLB-12145、NRRLB-12146和NRRL B-12147(US4,407,952)等等。L-苯丙氨酸生产菌株的实例还包括大肠杆菌菌株K-12[W3110(tyrA)/pPHAB]、大肠杆菌菌株K-12[W3110(tyrA)/pPHAD]、大肠杆菌菌株K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm]和称为AJ12604的大肠杆菌菌株K-12「W3110(tyrA)/pBR-aroG4,pACMAB]等等(欧洲专利EP488424B1),以及其中扩增了涉及苯丙氨酸分泌的yddG基因和yedA基因的菌株(WO03/044192)。
L-酪氨酸生产菌株的实例包括在其中磷酸烯醇丙酮酸产生能力或常用芳香族途径的酶活性增强的大肠杆菌菌株(EP0877090A)等等。对芳香族氨基酸生物合成有用的基因包括芳香族酸的常用途径的基因,例如,aroF、aroG、aroH、aroB、aroD、aroE、aroK、aroL、aroA和aroC基因。
L-赖氨酸生产菌株的实例包括大肠杆菌AJ11442菌株(FERM BP-1543、NRRL B-12185;参见JP56-18596 A和US 4346170)和大肠杆菌VL611菌株(JP2000-189180A)。此外,WC196菌株(参见WO96/17930)也可以被用作L-赖氨酸生产菌株。WC196菌株是通过赋予W3110菌株AEC(S-(2-氨乙基)半胱氨酸)抗性而获得的,W3110菌株来源于大肠杆菌K-12。该菌株被命名为大肠杆菌AJ13069菌株,于1994年12月6日保藏在通商产业省,工业科技局,国立生命科学和人类技术研究所(当前,国家先进工业科技研究所,国立生命科学和人类技术研究所;1-3,Higashi 1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566,Japan),并给予FERM P-14690的登记号。该保藏物于1995年9月29日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏,并给予FERM BP-5252的登记号。
L-组氨酸生产菌株的实例包括用载体转化的大肠杆菌菌株,所述载体含有编码L-组氨酸生物合成酶的基因(FERM-P5038,FERM-P5048;JP56-005099A),其中导入了氨基酸分泌基因rht基因的菌株(EP 1016710A),和对磺胺胍(sulfaguandine)、D,L-1,2,4-三唑-3-丙氨酸和链霉素有抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270,俄罗斯专利2119536)。
作为来自大肠杆菌K-12菌株的L-半胱氨酸生产菌株,可以使用具有降低的胱硫醚-β-裂解酶活性的菌株(JP2003-169668A)和携带对L-半胱氨酸的反馈抑制脱敏的丝氨酸乙酰基转移酶的菌株(JP-A11-155571)等等。
作为来源于大肠杆菌K-12菌株的L-脯氨酸生产菌株,可以使用对3,4-脱羟基脯氨酸和azatidine-2-羧化物(azatidine-2-carboxylate)有抗性的702菌株(VKPMB-8011),和通过破坏702菌株中的ilvA基因获得的702ilvA菌株(VKPMB-8012菌株)(JP 2002-300874A)。
具有生产L-谷氨酸的能力的大肠杆菌也可以通过增强L-谷氨酸生物合成酶的活性来获得。L-谷氨酸生物合成酶的实例包括谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶(aconitatehydratase)、柠檬酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇酶(enolase)、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、果糖二磷酸醛缩酶(fructosebisphosphate aldolase)、果糖磷酸激酶、磷酸葡糖异构酶,等等。
具有生产L-谷氨酸的能力的大肠杆菌也可以通过降低或消除催化以下反应的一种或多种酶的活性来获得,所述反应引起从L-谷氨酸的合成分支并产生除L-谷氨酸以外的化合物。这种酶包括异柠檬酸裂解酶、α-酮戊二酸脱氢酶、磷酸转乙酰酶(phosphate acetyltransferase)、乙酸激酶(acetatekinase)、乙酰羟酸合酶(acetohydroxy acid synthase)、乙酰乳酸合酶、甲酸转乙酰酶(formate aectyltransferase)、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-焦磷酸酯脱氢酶,等等。具体地,其中α-酮戊二酸脱氢酶活性被降低的大肠杆菌的实例包括JP5-244970A或JP7-203980A中公开的大肠杆菌菌株。
<2>生产L-氨基酸的方法
通过在培养基中培养以上获得的大肠杆菌菌株来在培养基中或细菌细胞中产生和导致L-氨基酸的积累,并从培养基或细菌细胞收集L-氨基酸,可以生产选自由L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸和L-脯氨酸组成的组中的L-氨基酸。当基本上不存在支链L-氨基酸时本发明的菌株的生长得到改善,从而即使当基本上不存在支链L-氨基酸时也可以有效地生产L-氨基酸。
本发明的菌株可以被培养在通常用于L-氨基酸的发酵生产的培养基中。也就是说,可以使用含有碳源、氮源、无机离子,和如果需要,其他有机成分的普通培养基。碳源的实例包括:糖类例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解产物;醇类例如甘油和山梨醇;和有机酸例如反丁烯二酸(fumaric acid)、柠檬酸和丁二酸(succinic acid)。氮源的实例包括:无机铵盐例如硫酸铵、氯化铵、和磷酸铵;有机氮物质例如大豆水解产物;氨气;和氨水。作为痕量的有机营养物,可以优选地以合适的量添加营养缺陷营养物,例如,维生素B1和L-高丝氨酸、酵母提取物等等。除了这些物质,如有必要,少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。在本发明中使用的培养基可以是天然培养基或合成培养基,只要它是含有碳源、氮源、无机离子,和如果需要,其他有机营养物的培养基。
培养优选在需氧条件下进行1到7天。培养温度优选为24℃到37℃,而pH值是5到9。可以使用无机或有机的酸性或碱性物质以及氨气等等来调节pH值。可以通过包括离子交换树脂法、沉淀法等等的方法,从发酵液收集L-氨基酸。在L-氨基酸在细菌细胞中积累的情况下,例如,可以通过超声处理来破坏细菌细胞,并通过离心除去细菌细胞,随后使用离子交换树脂法等等进行收集,来收集L-氨基酸。
实施例
在下文中,将参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。
参考实施例1
使用L-色氨酸生产菌株SV164/pGH5,研究了添加支链L-氨基酸对L-色氨酸积累的影响。
SV164/pGH5菌株是通过将质粒pGH5导入SV164菌株中获得的L-色氨酸生产菌株,质粒pGH5含有编码反馈脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶的突变体serA基因(参见WO94/08031)。SV164菌株(JP3032013 B)是通过将突变导入YMC9菌株(ATCC 33927)中编码邻氨基苯甲酸合酶的TrpE基因的等位基因中获得的菌株,所述YMC9菌株是源自K12菌株的菌株。
将预定量的L-异亮氨酸和L-亮氨酸添加到用于L-色氨酸生产的培养基(40g/L葡萄糖、1.5g/LKH2PO4、0.5g/LNaCl、15g/L(NH4)2SO4、0.3g/LMgSO4·7H2O、14.7mg/LCaCl2·2H2O、75mg/LFeSO4·7H2O、0.15mg/LNa2MoO4·7H2O、0.7mg/LCoCl2·7H2O、1.6mg/L MnCl2·7H2O、2.5mg/LH3BO3、0.25mg/LCuSO4·7H2O、0.3mg/L ZnSO4·7H2O、1g/L柠檬酸三钠(Na3Citrate)、125mg/LL-苯丙氨酸、125mg/LL-Tyr、5 mg/L硫胺素·HC1、1g/L酵母提取物、2g/L玉米浸渍固体(corn steep solid)、30g/L CaCO3、20rng/L四环素、pH7.1(NH4OH))中,将SV164/pGH5菌株培养40小时。残余的糖、L-色氨酸的积累量、和每份糖消耗的L-色氨酸产率(yield)在表1中示出。
表1 添加L-异亮氨酸(Ile)和L-亮氨酸(Leu)对L-色氨酸(Trp)积累的影响
结果显示,当不添加L-异亮氨酸和L-亮氨酸时,SV164/pGH5菌株的生长、糖消耗和生产的L-色氨酸的量降低了。
实施例1.L-缬氨酸抗性菌株的获得和评估
(1-1)L-缬氨酸抗性菌株的获得
通过P1转导引入L-缬氨酸抗性。将MI162菌株(Lawther et al.,J.Bacteriol.,149,294-(1982))和TDH7菌株(EP-0593792-B1,VKPM B-5318)用作L-缬氨酸抗性的供体菌株。在MI162菌株中涉及缬氨酸抗性的突变位于ilvG基因中,其已经被鉴定为ilvG603。MI162菌株的ilvG基因在SEQ ID NO:3中示出,而且在K12菌株的ilvG基因中观察到的移码突变已经被回复了。同时,TDH7被突变,以使SEQ ID NO:1中位置979处的C被缺失,K12菌株的ilvG基因中观察到的移码突变被回复。TDH7菌株的ilvG基因在SEQ ID NO:5中示出。以上描述的SV164/pGH5菌株被用作受体菌株。
根据常规方法,进行P1转导实验。将每种细菌施加到含有L-缬氨酸的基本培养基(4g/L葡萄糖、12.8g/L Na2HPO4·7H2O、3g/L KH2PO4、0.5g/LNaCl、1g/L NH4Cl、5mM MgSO4、0.1mM CaCl2、1mg/L硫胺素、20mg/lL-苯丙氨酸、20mg/L L-酪氨酸、20mg/L L-甲硫氨酸、3mg/L吡哆醇(pyridoxine)、20mg/L L-缬氨酸、20mg/L四环素),随后在37℃培养3天。然后,选择出现的菌落作为L-缬氨酸抗性菌株。
使用三种L-缬氨酸抗性菌株进行以下的分析,它们是,用MI162菌株作为供体获得的M6和M9菌株,和用TDH7菌株作为供体获得的T2菌株。
(1-2)添加L-异亮氨酸和L-亮氨酸对L-缬氨酸抗性菌株的L-色氨酸积累的影响
使用所获得的L-缬氨酸抗性菌株和亲本菌株(SV164/pGH5菌株),研究了添加L-异亮氨酸和L-亮氨酸对它们的L-色氨酸生产能力的影响。将每种菌株在LB培养基平板(10g/L聚胨(polypeptone)、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl、20mg/L四环素、20g/L琼脂)中在30℃培养24小时,将出现的菌落接种到含有4mlLB培养基的试管中,随后在30℃摇动培养24小时。将每种培养物接种到含有40ml生产培养基(40g/L葡萄糖,1.5g/L KH2PO4,0.5g/L NaCl,15g/L(NH4)2SO4,0.3g/L MgSO4·7H2O,14.7mg/L CaCl2·2H2O,75mg/L FeSO4·7H2O,0.15mg/L Na2MoO4·7H2O,0.7mg/L CoCl2·7H2O,1.6mg/LMnCl2·7H2O,2.5mg/L H3BO3,0.25mg/L CuSO4·7H2O,0.3mg/L ZnSO4·7H2O,1g/L柠檬酸三钠(Na3Citrate),30mg/L吡哆醇,50mg/L L-甲硫氨酸,125mg/L L-苯丙氨酸,125mg/L L-Tyr,5mg/L硫胺素·HC1,1g/L酵母提取物,2g/L玉米浸渍固体,30g/L CaCO3,20mg/L四环素,pH7.1(NH4OH))的坂口(sakaguchi)烧瓶(体积:500ml)中,随后在30℃摇动培养40小时。培养之后,分析每个菌株的L-色氨酸积累(图1)。
在对照菌株(SV164/pGH5菌株)中,发现当不添加L-异亮氨酸和L-亮氨酸时积累的L-色氨酸很低,而在每种L-缬氨酸抗性菌株(M6、M9和T2)中,发现当不添加L-异亮氨酸和L-亮氨酸时积累的L-色氨酸的量与添加L-异亮氨酸和L-亮氨酸时几乎相同。
此外,详细地研究了在没有支链L-氨基酸(L-异亮氨酸和L-亮氨酸)的基本培养基中,所获得的L-缬氨酸抗性菌株(T2菌株)和对照菌株的生长。将SV164/pGH5菌株或T2菌株接种在基本培养基(4g/L葡萄糖,12.8g/LNa2HPO4·7H2O,3g/L KH2PO4,0.5g/L NaCl,1g/L NH4Cl,5mM MgSO4,0.1mM CaCl2,1mg/L硫胺素,20mg/L四环素)中,向所述培养基中添加了20mg/L的除L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-色氨酸以外的每种氨基酸,随后在30℃摇动培养。然后,通过随时间测量OD660来监测每种菌株的生长(图2)。结果,在含有L-异亮氨酸、L-亮氨酸或L-缬氨酸的培养基中,SV164/pGH5菌株的生长被延迟,而L-缬氨酸抗性菌株(T2菌株)的生长没有延迟,这表明在L-缬氨酸抗性菌株中,生长期间支链L-氨基酸的缺乏被减轻(reduced)。结果显示,通过使用赋予了L-缬氨酸抗性的K12衍生的菌株,可以有效地生产包括L-色氨酸的L-氨基酸而不用添加支链L-氨基酸。
工业实用性
本发明的菌株可以在基本上不存在支链L-氨基酸的情况下很好地生长。因此,当使用本发明的菌株时,即使在基本上不存在支链L-氨基酸的情况下,可以有效地产生L-氨基酸,例如L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸和L-脯氨酸。
Claims (3)
1.可通过修饰大肠杆菌K12菌株、MG1655菌株、W3110菌株或SV164菌株获得的大肠杆菌的修饰的菌株,其中所述修饰的菌株具有在含有20mg/L的L-缬氨酸的培养基中生长的能力,并具有生产L-色氨酸的能力,其中将所述菌株进行修饰以产生有活性的乙酰羟酸合酶II,其中所述有活性的乙酰羟酸合酶II由大肠杆菌ilvG基因编码,在该基因中处于SEQ ID NO:1的位置982至984的TGA不起翻译终止密码子的作用。
2.根据权利要求1的修饰的菌株,其中所述有活性的乙酰羟酸合酶II是由基因编码的蛋白,该基因由SEQ ID NO:3或5的核苷酸序列组成。
3.用于生产L-色氨酸的方法,该方法包括在培养基中培养权利要求1到2的任一项中所定义的菌株,并从培养基或细菌细胞中收集L-色氨酸。
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Ronald C. Wek et al.Rho-dependent Transcriptional Polarity in the ilvGMEDAOperon of Wild-type Escherichia coli K12.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY262 31.1987,262(31),15257页左栏第3段. * |
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