JP6545676B2 - 改善された代謝能力を有する細菌 - Google Patents

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、2013年11月14日に出願された米国仮特許出願第61/904,298号の利益を主張し、当該出願の内容は本明細書において参考として援用される。
本発明は、発酵による核酸およびタンパク質の産生の増強に特に有用である改善された発酵特性を有する遺伝的に改変されたE.coli K株誘導体を対象とする。
Escherichia coli(E.coli)は、普遍的なクローニング宿主であり、研究および産業の両方においてタンパク質、核酸、代謝産物、および二次代謝産物の産生で使用される最も一般的な生物である。最も重要な新薬の多くは、E.coli内の発酵によって製造され、E.coliは、依然としてこのような分子の産生にとって利用可能な最も経済的かつ効率的プラットフォームである。特に、小分子薬物および他の伝統的な処置に対して難治性の健康問題に対処する治療剤。すべての生物治療剤の約3分の1は現在、単鎖抗体を含めてE.coli内で製造されており、これらは、開発しづらく、かつこれらが作製されるE.coli株からの限られた収率に部分的に起因して極めて高価である。増殖の停滞は、高密度発酵におけるE.coliパフォーマンスおよび産物形成を頻繁に制限する重大な問題である。
E.coli K−12株は、遺伝学および微生物生理機能における初期の進歩に貢献した。これらは、分子生物学の方法および技法の主力となるものとして機能を果たし続けている。E.coli B株はしばしば、StudierおよびMoffatによって開拓されたT7ポリメラーゼ発現系とともに使用するために操作された株の利用可能性に部分的に起因して、実験室規模でのタンパク質発現プラットフォームとして好まれている[StudierおよびMoffat、J. Mol. Biol.189巻:113頁(1986年);Studier、J. Mol. Biol.219巻:37頁(1991年)]。工業規模で、B株はまた、T7ポリメラーゼ以外のタンパク質発現系を用いてさえ、K−12株と比べて優れたタンパク質産生特性を有すると認識されている。それでもやはり、これらの株内の挿入配列エレメントおよびプロファージなどの大量の可動性遺伝子エレメントは、ストレス、特に不溶性のまたは有毒な標的を発現するとき遭遇するストレス下で産生問題を引き起こし得る。他方では、E.coli B株は、プラスミドDNAを産生することについてK株に劣ると一般に見られている。
E.coliのK株とB株との系統発生的関係はかなり近い。これまで、60超の多様なE.coli株が、完全にまたは少なくとも実質的に配列決定され、詳細な系統発生地図が、一連の保存遺伝子(adk、fumC、icd、gyrB、mdh、purA、およびrecA)内のこれらの株の間の差異に基づいて生成された。すべてのK−12株およびB株は、E.coli系統発生地図において単一のクレード内に入る[Lukjancenko、Wassenaar、およびUssery、Microb. Ecol.60巻:708頁(2010年)]。すべての現在のK−12株は、1920年代後期にPalo Altoのスタンフォード大学で最初に単離されたCharles E.Cliftonの元のK−12株(O16、λ、F)に由来すると考えられている[Neidhardt, F.C.ら、E.coli and S. typhimurium: Cellular and Molecular Biology. ASM Press、Washington D.C.1996年におけるBachman]。現存するB株は、1918年という早期にパリのパストゥール研究所で最初に単離されたFelix d’HerelleのBacillus coli株(O7、λ、F)に概ね由来する[Daegelenら、J. Mol Biol 394巻:634頁(2009年)]。K−12株とB株との近い系統発生的関係は、歴史的な観点から興味深い。しかし、細菌の進化およびどのように最新の株が祖先の腸内細菌から分岐してきたかの我々の理解の最近の進歩は、K株とB株との整然とした歴史的関係に質問を投げ掛ける[Studierら、J. Mol. Biol.394巻:653頁(2009年)]。とにかく、K−12株とB株との差異、ならびに異なる研究および産業上の用途についてのこれらの相対的な利点の認識は、概ね経験的な知見に基づく。
本分野では、K−12株の遺伝的取り扱いやすさおよび優れたDNA産生能力を伴ったB株の優れた増殖特性およびタンパク質産生特性を有する単一株プラットフォームが長く望まれている。このようなE.coli株は、多様なスペクトルの産物にわたって増殖を最適化し、収率を最大化するための標準的な発酵レジメンの開発を促進することができる。
StudierおよびMoffat、J. Mol. Biol.189巻:113頁(1986年) Studier、J. Mol. Biol.219巻:37頁(1991年) Lukjancenko、Wassenaar、およびUssery、Microb. Ecol.60巻:708頁(2010年) Neidhardt, F.C.ら、E.coli and S. typhimurium:Cellular and Molecular Biology. ASM Press、Washington D.C.1996年 Daegelenら、J. Mol Biol 394巻:634頁(2009年) Studierら、J. Mol. Biol.394巻:653頁(2009年)
本発明は、フェドバッチ発酵における増殖の改善ならびに組換えタンパク質および核酸の産生の改善を伴った遺伝的に改変されたE.coli K−12株を提供する。
E.coli K−12株を、(a)オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、(b)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生し、(c)iclRおよびarpA遺伝子産物の発現を低減するように改変する。
いくつかの実施形態では、本発明は、(a)オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、(b)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生し、(c)iclRおよびarpA遺伝子産物の発現を低減するように改変された低減ゲノムE.coli K−12株を提供する。一態様では、低減ゲノムE.coli K株のゲノムは、その天然親株のゲノムより約5%〜約30%小さいように遺伝子操作されており、すべての挿入配列を欠くゲノムを有する。低減ゲノム細菌は、細菌の天然親株から選択された遺伝子を欠失させることによって産生される場合があり、または例えば、予め選択された遺伝子のアセンブリーとして完全に合成され得る。本明細書の論述から直ちに明らかであるように、低減ゲノム細菌は、それが比較される天然親株中に見つかる遺伝子の相補物の全てより少ない数量を有し、比較される天然親株一定の必須の遺伝子を共有する。
本発明の改変E.coli K−12株を使用してポリペプチドを産生するための方法も提供される。一実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドを発現するのに適した条件下で、発現制御配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードする核酸を含む改変E.coli K−12株を培養することによって産生される。一態様では、核酸は、異種タンパク質をコードする。関連した態様では、タンパク質は、本明細書に記載の改変を含まないE.coli K−12株より高いレベルで、本発明の改変E.coli株内で産生される。さらに別の態様では、タンパク質産生は、このような改変細胞が同じ増殖条件下で達することができるより高い細胞数によって、本明細書に記載の改変を含まないE.coli K−12株からより高いレベルで増大する。
本発明の改変E.coli K−12株を使用する異種核酸(例えば、プラスミドなどのベクター)を増幅するための方法も提供される。一実施形態では、核酸は、適当な栄養条件下で異種核酸を含む改変E.coli K株を培養し、それにより核酸を増幅することによって産生される。さらに別の態様では、核酸産生は、このような改変細胞が同じ増殖条件下で達することができるより高い細胞数によって、本明細書に記載の改変を含まないE.coli K−12株からより高いレベルで増大する。
本発明のこれらおよび他の実施形態を、以下で本明細書により詳細に記載する。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
(a)非改変親E.coli K−12株と比べてオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、
(b)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生し、
(c)非改変親E.coli K−12株と比べてiclRおよびarpA遺伝子産物の発現を低減する
ように改変されている、改変Escherichia coli K−12株またはその誘導体。
(項目2)
機能的なrecA(b2699)遺伝子を欠く、項目1に記載の改変E.coli K−12株。
(項目3)
rph遺伝子を欠失させることによってオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強するように改変されている、項目1または2に記載の改変E.coli K−12株。
(項目4)
ilvG遺伝子における天然の−2フレームシフト突然変異を補完する突然変異の導入によって活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生するように改変されている、前記項目のいずれかに記載の改変E.coli K−12株。
(項目5)
iclR遺伝子およびarpA遺伝子を欠失させることによって前記iclRおよびarpA遺伝子産物の発現を低減するように改変されている、前記項目のいずれかに記載の改変E.coli K−12株。
(項目6)
前記非改変親E.coli株が、E.coli K株MG1655、W3110、DH1、DH10B、DH5α、Invα、Top10、Top10F、JM103、JM105、JM109、MC1061、MC4100、XL1−Blue、EC100、BW2952、およびEC300からなる群から選択される、前記項目のいずれかに記載の改変E.coli K株。
(項目7)
前記非改変親E.coli株が、E.coli K株MG1655またはW3110である、項目6に記載の改変E.coli K株。
(項目8)
前記非改変親E.coli株が、E.coli株MG1655より約2%〜約40%小さい、好ましくは約5%〜約30%小さいように遺伝子操作されたゲノムを有する低減ゲノムE.coli細菌である、項目1から5のいずれか一項に記載の改変E.coli K株。
(項目9)
前記非改変親E.coli株が、少なくとも以下のDNAセグメント:E.coli K−12株MG1655のb0245〜b0301、b0303〜b0310、b1336〜b1411、b4426〜b4427、b2441〜b2450、b2622〜b2654、b2657〜b2660、b4462、b1994〜b2008、b4435、b3322〜b3338、b2349〜b2363、b1539〜b1579、b4269〜b4320、b2968〜b2972、b2975〜b2977、b2979〜b2987、b4466−4468、b1137〜b1172、b0537〜b0565、b0016〜b0022、b4412〜b4413、b0577〜b0582、b4415、b2389〜b2390、b2392〜b2395、b0358〜b0368、b0370〜b0380、b2856〜b2863、b3042〜b3048、b0656、b1325〜b1333、b2030〜b2062、b2190〜b2192、b3215〜b3219、b3504〜b3505、b1070〜b1083、b1878〜b1894、b1917〜b1950、b4324〜b4342、b4345〜b4358、b4486、b0497〜b0502、b0700〜b0706、b1456〜b1462、b3481〜b3484、b3592〜b3596、b0981〜b0988、b1021〜b1029、b2080〜b2096、b4438、b3440〜b3445、b4451、b3556〜b3558、b4455、b1786、b0150〜b0153、およびb2945が自己から欠失している低減ゲノムE.coli細菌である、項目8に記載の改変E.coli K株。
(項目10)
前記非改変親E.coli株が、少なくとも以下のDNAセグメント:E.coli K−12株MG1655のb2481〜b2492、b2219〜b2230、b4500、b3707〜b3723、b0644〜b0650、b4079−4090、b4487、b4092〜b4106、b0730〜b0732、b3572〜b3587、b1653、b2735〜b2740、b2405〜b2407、b3896〜b3900、b1202、b4263〜b4268、b0611、b2364〜b2366、b0839、b0488〜b0500、b0502が自己からさらに欠失している低減ゲノムE.coli細菌である、項目9に記載の改変E.coli K株。
(項目11)
前記非改変親E.coli株が、低減ゲノムE.coli株MDS42である、項目9に記載の改変E.coli K株。
(項目12)
前記非改変親E.coli株が、低減ゲノムE.coli株MDS69である、項目10に記載の改変E.coli K株。
(項目13)
前記relA遺伝子のコード配列の547もしくは548位における少なくとも1つの点突然変異を有するrelA遺伝子をコードし、前記突然変異が、547位におけるG→A突然変異、547位におけるG→T突然変異、548位におけるC→G突然変異、または548位におけるC→T突然変異の1つまたは複数から選択される、前記項目のいずれかに記載の改変E.coli K株。
(項目14)
機能的なpolB(b0060)、dinB(b0231)、およびumuDC(b1183〜b1184)遺伝子を欠く、前記項目のいずれかに記載の改変E.coli K株。
(項目14)
異種核酸を含む、前記項目のいずれかに記載の細菌。
(項目15)
前記異種核酸が、発現制御配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードする核酸を含む、項目14に記載の細菌。
(項目16)
ポリペプチドを産生するための方法であって、前記ポリペプチドを発現させるのに適した条件下で項目15に記載の細菌をインキュベートすることと、前記ポリペプチドを収集することとを含む、方法。
図1は、非改変親低減ゲノムE.coli K株(MDS42、MDS42recA、T69、およびT69recA)と比較し、かつ天然の親K12株MG1655およびB株BL21(DE3)と比較した、低減ゲノムE.coli K−12株(MDS42(meta)、MDS42recA(meta)、T69(meta)、およびT69recA(meta))に対する代謝突然変異(rphおよびilvGフレームシフト突然変異の補正ならびにiclRおよびarpA遺伝子の欠失)の効果を例示する。対数期におけるE.coliの増殖は、式M(t)=M(0)eμtに従い、式中、M(t)は、hrでの時間の関数としての細胞量であり、eは、自然対数の底であり(約2.7183)、mu(μ)は、hr−1での指数関数的な増殖速度として定義される。Mu(μ)は、増殖曲線データをこの関数にフィッティングすることによって測定することができる。E coliの株の固有増殖速度は、ここで行ったような希釈培養液(OD600<1)中に37℃の.2%グルコースを含むナイトハルトのMOPS最少培地中、100rpmでの振盪フラスコ内などの標準条件下で測定されるmu(μ)である。図1では、固有増殖速度(x軸)および最大発酵OD(発酵性、すなわち、発酵生産性)(y軸)が、矢印で接続して示した同質遺伝子対(改変を除いて同じ遺伝的背景を有する株)でプロットされている。T69は、MDS69、MDS42の全ての欠失および27の追加の欠失を含む複数欠失株である。標準条件下での固有増殖速度と発酵性との間の絶対相関の欠如に留意されたい。一部の例では、より高い発酵性を有する株は、より低い固有増殖速度を呈する。より高い増殖速度を実現するためのゲノム改変は、必ずしもより良好な産生株(すなわち、標的収率の増大)をもたらさない場合があり、したがって経験的に試験されなければならない。
図2は、コンピュータ制御ポンプを介してグルコースを供給されたKorz最少培地(Korz DJら、J. Biotechnol.、39巻(1号):59〜65頁(1995年))中で10Lスケールにて実施した3つの並列の発酵(#105、#102、および#98)を例示する。IPTGで誘導されると試験タンパク質を発現するIPTG誘導プロモーターを担持するプラスミドを担持するE.coli MDS69recA(meta)を、7時間のバッチ相、その後の0.3hrのmuでの14時間の指数関数的グルコース供給によって250〜300のOD600まで21時間以内に増殖させた。次いでIPTGを75マイクロモルまで添加し、供給を、示したような3つの異なる一定の生産供給速度に調整した。OD600を対数尺度で左のy軸に沿ってプロットし、時間をx軸に沿ってプロットする。発酵槽内の1リットル当たりのグラムでの産物形成(右のy軸上の均等目盛)を、誘導時間後の20〜48時間についてプロットする。産物は、ゲル対BSA標準をスキャンすることによって測定した。例えば、示した時点での産物形成を示す挿入図のゲル写真は、発酵番号105、試験した最大供給速度についてである。誘導後、細胞量は、代謝的に活性なままであり、産生は、多くの時間にわたって継続し、非常に高い産物レベルを実現し、ODは、低下しない。
発酵番号105の最後に、細胞生存能を、LIVE/DEAD(登録商標)BacLight(商標)Bacterial Viability Kit(LifeTechnologies、Grand Island、NY 14072)、その後顕微鏡検査を使用して評価した(図3)。アッセイは、死細胞および細胞溶解がほとんどまったく観察されなかったことを示す。これは、標的タンパク質の収率の増大と相まって、標的タンパク質誘導が、以前は細胞増殖のみに充てられた細胞リソースを標的産生へと再指示することを確認する。具体的には、細菌細胞をBaclight(商標)試薬で15分間処置し、次いでLeica DMI 3000蛍光顕微鏡を使用して画像化した。ヨウ化プロピジウム(緑色、左パネル)またはSYTO9(赤色、右パネル)で染色された細胞は、それぞれ生細胞または死細胞を示した。パーセント生細胞は、99%超であった。フェドバッチ発酵は、Korz最少培地中で26時間であった。
本発明は、様々な形態で具現化することができるが、いくつかの実施形態の以下の記載を、本開示が、本発明の例証として見なされるべきであり、本発明を例示した具体的な実施形態に限定するように意図されていないという理解で行う。表題は、便宜のためだけに示されており、いずれの様式でも本発明を限定するように解釈されるべきでない。いずれかの表題の下で例示した実施形態は、任意の他の表題の下で例示した実施形態と組み合わせてもよい。
本願で指定される様々な範囲内の数値の使用は、別段に明白に示されていない限り、述べた範囲内の最小値および最大値がともに、単語「約」が前に付いているように近似として述べられている。このようにして、述べた範囲より上および下のわずかな変動を、範囲内の値と実質的に同じ結果を実現するように使用することができる。本明細書において使用する用語「約」および「およそ」は、数値を指す場合、問題となっている関係する技術分野における当業者にとってその平易な通常の意味を有するものとする。また、範囲の開示は、列挙した最小値と最大値との間のあらゆる値を含む連続的な範囲、およびこのような値によって形成され得る任意の範囲として意図されている。これは、有限の上方境界および/または下方境界を含む、または含まない形成され得る範囲を含む。これは、所与の開示した数字を除して別の開示される数字にすることによって導き出せる比も含む。したがって、当業者は、多くのこのような比、範囲、および比の範囲を、本明細書に提示のデータおよび数から明白に導出することができ、すべてが本発明の様々な実施形態を代表することを察知するであろう。
「低減ゲノム」細菌は、本明細書において、そのゲノム(例えば、タンパク質コード遺伝子)の約1%〜約75%が欠失した、例えば、ゲノムの約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、または約60%が欠失した細菌を意味する。一実施形態では、本発明の実行において使用される低減ゲノム細菌は、好ましくは、天然親株のゲノムより少なくとも2パーセント(2%)および最大で20パーセント(20%)(その間の任意の数を含む)小さいように遺伝子操作されているゲノムを有する。好ましくは、ゲノムは、天然親株のゲノムより少なくとも5パーセント(5%)および最大で30パーセント(30%)小さい。より好ましくは、ゲノムは、天然親株のゲノムより8パーセント(8%)〜14パーセント(14%)〜20パーセント(20%)(その間の任意の数を含む)、またはそれより小さい。代わりに、ゲノムは、天然親株のゲノムより20%未満、30%未満、40%未満、または50%未満小さいように操作され得る。用語「天然親株」は、株系統の原種を代表すると科学界によって一般に理解されており、かつそのゲノムの一連の欠失がより小さいゲノムを有する菌株を生成するように行われ得る自然環境または天然環境において見つかる菌株を意味する。天然親株は、操作された株が比較される株も指し、操作された株は、天然親株の相補物の全てより少ない量を有する。ゲノムが一連の欠失後により小さくなった百分率は、「すべての欠失の後の欠失した塩基対の総数」を、「すべての欠失の前のゲノム中の塩基対の総数」によって除し、次いで100を乗じることによって計算される。同様に、ゲノムが天然親株より小さい百分率は、より小さいゲノムを有する株(それが産生されるプロセスにかかわらず)中のヌクレオチドの総数を、天然親株中のヌクレオチドの総数によって除し、次いで100を乗じることによって計算される。
一実施形態では、「低減ゲノム」細菌は、上記量のゲノムの除去が最少培地上で増殖する生物の能力に容認しがたく影響しない細菌を意味する。本脈絡において2個またはそれ超の遺伝子の除去が最少培地上で増殖する生物の能力に「容認しがたく影響する」か否かは、具体的な用途に依存する。例えば、増殖速度の30%の低減は、一用途については許容される場合があるが、別の用途については許与されない場合がある。さらに、ゲノムからDNA配列を欠失させることの有害作用は、培養条件の変更などの対策によって低減され得る。このような対策は、さもなければ容認できない有害作用を許容されるものに変えることができる。一実施形態では、増殖速度は、親株とおよそ同じである。しかし、親株の増殖速度より約5%、10%、15%、20%、30%、40%〜約50%低い範囲の増殖速度は、本発明の範囲内にある。より具体的には、本発明の細菌の倍加時間は、約15分〜約3時間に及びうる。適当な低減ゲノム細菌の非限定的な例、およびE.coliなどの細菌からDNAを欠失させるための方法は、米国特許第6,989,265号、同第7,303,906号、同第8,119,365号、同第8,039,243号、および同第8,178,339号に開示されており、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれている。
本明細書で使用する用語「b番号」は、Blattnerら、Science 277巻:1453〜1474頁(1997年)に記載されたK−12MG1655株の各遺伝子に割り当てられたユニークなIDを指す。
いくつかの実施形態では、(a)オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、(b)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生し、(c)iclRおよびarpA遺伝子産物の発現を低減するように遺伝的に改変されたE.coli K−12株細菌が提供される。改変のこの組合せを含むE.coli K株細菌は、同じ遺伝的背景を有するが、改変のこの組合せを含まないE.coli K−12株細菌と比較して、実質的に改善された発酵性(すなわち、発酵生産性)および増殖特性を呈することが判明した。改変E.coli K株細菌は、意外にも、特に最少培地中で増殖される場合、タンパク質を産生させ、核酸を広めるのに有用である。
ピリミジンヌクレオチドの合成を触媒する酵素であるE.coliオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、b番号b3642であるpyrE遺伝子によってコードされる。pyrE遺伝子は、二価陽イオンおよびリン酸に依存性のtRNAプロセシング酵素であるリボヌクレアーゼPHをコードするrph遺伝子を含むオペロン中に存在する。rph遺伝子(b3643)は、pyrEの上流に位置する。pyrE遺伝子は、転写をトランケートし、下流のpyrE遺伝子の極性発現欠陥を引き起こすrph遺伝子のコード領域内の−1フレームシフト突然変異に起因して、MG1655およびW3310などのE.coli K−12株中では最適未満のレベルにて発現される。この突然変異は、Jensen、J. Bacteriol.175巻:3401頁(1993年)において最初に記載された。その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第8,293,505号には、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物中のL−アミノ酸の産生が記載されている。オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼを増強するためのU.S.8,293,505に記載の方法のいずれも、本発明の改変E.coli K−12株細菌を創製するのに使用され得る。本発明の改変E.coli K−12株細菌を産生するために補正することができるrphフレームシフト突然変異を持つE.coli K−12株の代表例としては、E.coli K−12株MG1655、E.coli K−12株CR63、E.coli K−12株K、E.coli K−12株W33450、E.coli K−12株W3623、E.coli K−12株594、E.coli K−12株IAM1264、およびE.coli K−12株W3110がある。
本発明の改変E.coli K−12株中のオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の増強は、野生型(例えば、MG1655)もしくは非改変株のものと比較した1細胞当たりのオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ分子の数の増加、または野生型もしくは非改変株の細胞ものと比較した細胞内のオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の増大に対応する。オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の増強は、細菌によって産生されるオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの比活性を測定することによって、例えば、Schwartz, M.およびNeuhard、J. Bacteriol.121巻:814〜822頁(1975年)に記載の酵素アッセイ、またはPoulsenら、Eur. J. Biochem.、135巻:223〜229頁(1983年)の方法によって評価することができる。rphフレームシフト突然変異を含むE.coli K−12株は、約5〜20単位のオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を生じさせ、一方、野生型rph遺伝子(フレームシフト突然変異を含まない)を有するE.coli株は、約30〜90単位のオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ比活性レベルを呈する。好ましくは、本発明の改変E.coli K−12株は、少なくとも約30単位のオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ比活性を呈する。
いくつかの態様では、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性は、野生型株などの親株またはその他の点では同じ遺伝的背景を有する非改変株と比べてコード遺伝子の発現を増大させる改変によって増強することができる。E.coli K12株rph−pyrEオペロンのヌクレオチド配列は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第8,293,505号の配列番号11に記載されている。rphのコード領域は、ヌクレオチド1〜687に対応し、pyrEのコード領域は、配列番号11のヌクレオチド782〜1423に対応する。−1フレームシフト突然変異は、配列番号11の667位と671位との間のrph遺伝子の3’末端で起こり、pyrE遺伝子産物の翻訳の減少をもたらす。
一態様では、E.coli K−12株を遺伝子操作して、天然のrph遺伝子配列を−1フレームシフト突然変異を含有しないE.coli株に由来するrph遺伝子の配列に置き換えることができる。例えば、E.coli K−12 Q13株およびE.coli K−12 30(E+)株のrphは、フレームシフト突然変異を含有しないrph遺伝子を持つ。さらに、野生型rph−pyrEオペロン(フレームシフト突然変異を含まない)のヌクレオチド配列が、受託番号X00781およびX01713の下でGenBank/EMBLから利用可能である。
別の態様では、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性は、rph遺伝子のコード領域内の天然の−1フレームシフト突然変異を相殺する(すなわち、補完する)突然変異を導入することによって増強することができる。例えば、+1または−2突然変異は、670位と671位との間の単一ヌクレオチドの挿入など、rph遺伝子の3’末端の下流およびpyrE遺伝子の上流の領域中に導入することができる。関連した態様では、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性は、フレームシフトを補正し、rphのコード領域をpyrEの翻訳開始部位のより近くに動かす効果を有するアテニュエーターの上流の領域中の欠失によって増強することができる。例えば、米国特許第8,293,505号の配列番号11の610〜691のヌクレオチド配列を欠失させることができ、rph−pyrEオペロンの得られるヌクレオチド配列は、米国特許第8,293,505号の配列番号14に記載されている。さらに別の態様では、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性は、rphコード配列を完全に除去して、rph−pyrEオペロンのプロモーターをpyrEの翻訳開始部位のより近くに動かす欠失によって増強することができる。この実施形態では、米国特許第8,293,505号の配列番号11のヌクレオチド1〜687が欠失する。意外にも、rphコード領域全体の欠失は、細胞増殖または生存能に対して有害な効果を有さない。
アセトヒドロキシ酸シンターゼは、細菌内の分枝鎖アミノ酸の合成における最も早いステップを触媒する。アセトヒドロキシ酸シンターゼの3種のアイソザイム:アセトヒドロキシ酸シンターゼI、II、およびIIIがE.coli中に存在する。E.coliアセトヒドロキシ酸シンターゼIIは通常、ilvG遺伝子によってコードされる大きいサブユニット、およびilvM遺伝子(b3769)によってコードされる小さいサブユニットからなる。E.coli K−12株MG1655のilvG配列は、原形が損なわれており、実際には、GenBank受託番号AAC77488.1に示された偽遺伝子(b番号b4488)である。ilvG偽遺伝子は、2つの別個のコード配列、ilvG_1(b3767)およびilvG_2(b3768)からなる。MG1655などのK−12株中のilvG偽遺伝子配列は、他のE.coli株(例えば、B株、O株など)中に見つかるインタクトなilvG遺伝子と比べて、983位および984位でヌクレオチドGTの欠失を含む。これらのヌクレオチドの欠失は、フレームシフト突然変異をもたらし、K−12 ilvG偽遺伝子配列の982位〜984位のヌクレオチドTGAは、ilvG_1に対応するilvGのトランケート型をもたらす早発性終止コドンとして機能を果たす。したがって、ilvGの通常の遺伝子産物は発現されず、アセトヒドロキシ酸シンターゼIIは、E.coli K−12株中に存在しない。
E.coli K−12株は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第7,300,776号の方法のいずれかによって、活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生するように改変することができる。一態様では、E.coli K−12株は、それが欠失突然変異を有さないilvG遺伝子(例えば、米国特許第7,300,776号の配列番号3および5で記載されたものなどの野生型ilvG遺伝子配列に対応する配列を有するilvG遺伝子)を宿すように改変される。代わりに、突然変異は、−2フレームシフト突然変異を補正するilvG偽遺伝子中に導入することができる。一態様では、GTは、米国特許第7,300,776号の配列番号1(E.coli K−12 ilvGヌクレオチド配列に対応する)中の982位のTと983位のGとの間に挿入される。別の態様では、終止コドンを導入しないこの領域内の任意の2つの塩基挿入は、リーディングフレームを正しいフレーム中にシフトして戻す機能を果たすことができる。例えば、982位におけるATジヌクレオチドの挿入は、活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIタンパク質の発現を回復させることになる。さらに他の態様では、E.coli K−12 ilvG遺伝子は、ilvG遺伝子の984位の上流の領域内の1または4つのヌクレオチドを欠失させて、TGAコドンをフレームから取り除くことによって、活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生するように改変することができる。例えば、979位のヌクレオチドCが欠失し得る。
本発明の改変E.coli K株内のインタクトな全長アセトヒドロキシ酸シンターゼIIの産生は、例えば、抗体を使用するウエスタンブロッティングによって改変E.coli K−12株細菌内のilvG遺伝子によってコードされるタンパク質の産生を測定することによって評価することができる。さらに、アセトヒドロキシ酸シンターゼII活性は、Lawtherら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、78巻:922〜925頁(1981年)に記載されているように、イソロイシンを補充することなく過剰のバリンの存在下で増殖するE.coli株の能力によって容易に検出することができる。
E.coli K株のiclR遺伝子およびarpA遺伝子は、それぞれグリオキシル酸シャント酵素およびアセチル−CoAシンテターゼの発現をモジュレートする調節タンパク質をコードする隣接する遺伝子である。iclR(イソクエン酸リアーゼ制御因子)遺伝子、b番号b4018は、NCBI Entrez GeneID No.948524に記載されている。arpA(アンキリン様制御因子タンパク質)遺伝子、b番号b4017は、NCBI Entrez GeneID No.944933に記載されている。arpA遺伝子は、K−12株配列と比べてBL21DE3およびREL606などのB株のゲノム配列中で部分的に欠失していることが判明した。
E.coli K−12株は、コード配列中の突然変異(すなわち、野生型配列と比較した1つまたは複数のヌクレオチドの変化)を導入することによって、例えば、iclRおよびarpA遺伝子産物の機能の低減または機能の喪失をもたらす1つまたは複数のヌクレオチドの置換、反転、欠失、または挿入によってiclRおよびarpA遺伝子産物の発現を低減するように改変することができる。一態様では、ナンセンスまたはミスセンス突然変異が核酸コード配列中に導入される場合があり、それによりコドンが終止コドンに変更され、またはそれによりコドンが異なるアミノ酸のコードに変更され、いずれの場合も低減された機能または機能喪失を有する得られるタンパク質をもたらす。他の態様では、フレームシフト突然変異が導入される場合があり、その結果、mRNA配列のリーディングフレームが変更され、異なるアミノ酸配列、および同時に低減された機能または機能の喪失を有するタンパク質をもたらす。他の態様では、調節配列(例えば、プロモーター)中の突然変異が導入される場合があり(すなわち、1つまたは複数のヌクレオチドが野生型配列と比べて変更される)、その結果、遺伝子の転写が低減または排除される。好適な態様では、iclR遺伝子およびarpA遺伝子は、iclRおよびarpAの遺伝子配列のすべてまたは一部の欠失によって、例えば、米国特許第6,989,265号の8列、45行〜14列、41行で記載されている「傷跡のない」欠失法によって不活化される(すなわち、非機能的にされる)。
限定することなく、MG1655(ATCC No.47076)、W3110(ATCC No.27325)、DH1、DH10B、DH5α、Invα、Top10、Top10F、JM103、JM105、JM109、MC1061、MC4100、XL1−Blue、EC100、BW2952、EC300などのK−12株を含めた任意の親E.coli K−12株を改変して本発明の改変E.coli K−12株を創製することができる。好適な一実施形態では、親E.coli K−12株は、MG1655またはW3110である。親E.coli K−12株のゲノムのヌクレオチド配列は、部分的または完全に公知である場合がある。いくつかのE.coli K−12株の完全なゲノム配列が公知である(例えば、Blattnerら、Science、277巻:1453〜74頁(1997年);GenBank受託番号U00096;NCBIデータベース、受託番号AP009048(W3110)、EMBL受託番号CP000948(DH10B)、EMBL受託番号CP001637(DH1)、およびEMBL受託番号CP001396(BW2952)を参照、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれている)。
特に好適な実施形態では、本発明の細菌を創製するように改変されているE.coli K−12株は、低減ゲノム株である。E.coli低減ゲノム細菌は、好ましくは、天然親株E.coli K−12株のゲノムより、5%から30%の間などの少なくとも2パーセント(2%)および最大で40パーセント(40%)(その間の任意の数を含む)小さいように遺伝子操作されたゲノムを有する。低減ゲノム株を創製するように遺伝子操作された(次いで低減ゲノム株は、本発明の改変E.coli K−12株細菌を創製するようにさらに改変される)天然親E.coli K−12株は、部分的または完全に公知の配列を有する任意の利用可能なE.coli K−12株細菌であり得る。好適な実施形態では、低減ゲノムE.coliを創製するのに使用される天然親E.coli K−12株は、4,639,674塩基対を有するゲノムを有するK−12株MG1655(注釈付きバージョンm56、NCBI受託番号U000961)である。別の好適な実施形態では、低減ゲノム細菌は、4.41Mbから3.71Mbの間、4.41Mbから3.25Mbの間、または4.41Mbから2.78Mbの間であるゲノムを有する。
様々なタンパク質コード遺伝子を欠失させて低減ゲノム細菌を形成することができる。E.coliおよび他の細菌では、欠失し得るDNA配列のタイプには、一般に、生物またはその生物の遺伝子産物の安定性に悪影響するものが含まれる。不安定性を生じさせるエレメントとしては、限定することなく、転位エレメント、挿入配列、およびゲノム不安定性に役割を果たし得る他の「利己的DNA」エレメントがある。例えば、挿入配列(IS)エレメントおよびこれらの関連した転位体(transpose)は、しばしば細菌ゲノム中に見つかり、したがって欠失の標的である。IS配列は、E.coli中で共通であり、これらのすべてが欠失してもよい。本文献における明確さの目的で、本発明者らは、ゲノム中の一ポイントから別のポイントに移動することができる、インタクトであっても欠損していてもDNAエレメントを指すのに一般的に用語ISエレメントおよび転位エレメントを使用する。科学および技術におけるISエレメントの有害な効果の一例は、これらが、配列決定のための伝播中に宿主E.coliのゲノムからプラスミド中にホップし得るという事実である。この人為結果は、すべてのISエレメントの宿主細胞からの欠失によって防止することができる。具体的な用途について、ゲノム不安定性に関連した他の特定の遺伝子、例えば、活性および不活性プロファージなども欠失し得る。
本発明の低減ゲノム細菌は、例えば、限定することなく、細菌の増殖および代謝に不要なある特定の遺伝子、偽遺伝子、プロファージ、望ましくない内因性制限改変遺伝子、病原性遺伝子、毒素遺伝子、線毛遺伝子、周辺質タンパク質遺伝子、インベイシン遺伝子、リポ多糖遺伝子、クラスIII分泌系、ファージ毒性決定基、ファージ受容体、病原性島、RHSエレメント、未知の機能の配列、ならびに細菌の同じ天然親種の2つの株間で共通して見つからない配列を欠いているように操作される場合もある。細胞生存に要求されない他のDNA配列も欠失または省略され得る。
特に好適な実施形態では、天然親E.coli K株のゲノムより5パーセント(5%)から30パーセント(30%)の間で小さいゲノムを有し、すべての挿入配列(IS)エレメントを欠き、(a)オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、(b)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生し、(c)iclRおよびarpA遺伝子産物の発現を低減するように改変された低減ゲノムE.coliが提供される。E.coli MG1655のゲノム地図上のISエレメントの位置は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第8,178,339号の図1および表2に示されている。E.coli中で一般に起こり、除去されてもよい挿入配列エレメントとしては、限定することなく、IS1、IS2、IS3、IS4、IS5、IS30、IS150、IS186、IS600、IS911、およびIS10がある。好ましくは、天然親E.coli K−12株は、E.coli K−12株MG1655である。
関連した実施形態では、(a)オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、(b)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生し、(c)iclRおよびarpA遺伝子産物の発現を低減するように改変され、米国特許第8,178,339号の表2〜20に列挙された遺伝子の1種または複数を欠く低減ゲノムE.coli K−12株。好適な実施形態では、低減ゲノムE.coli K−12株は、少なくとも以下の遺伝子(Blattnerら、Science、277巻:1453〜74号、およびGenBank受託番号400096に示された指定に基づく「b」番号によって同定される):低減ゲノム(または複数の欠失)株MDS39を創製するためにE.coli K−12MG1655から欠失させる遺伝子である、b0245〜b0301、b0303〜b0310、b1336〜b1411、b4426〜b4427、b2441〜b2450、b2622〜b2654、b2657〜b2660、b4462、b1994〜b2008、b4435、b3322〜b3338、b2349〜b2363、b1539〜b1579、b4269〜b4320、b2968〜b2972、b2975〜b2977、b2979〜b2987、b4466〜b4468、b1137〜b1172、b0537〜b0565、b0016〜b0022、b4412〜b4413、b0577〜b0582、b4415、b2389〜b2390、b2392〜b2395、b0358〜b0368、b0370〜b0380、b2856〜b2863、b3042〜b3048、b0656、b1325〜b1333、b2030〜b2062、b2190〜b2192、b3215〜b3219、b3504〜b3505、b1070〜b1083、b1878〜b1894、b1917〜b1950、b4324〜b4342、b4345〜b4358、b4486、b0497〜b0502、b0700〜b0706、b1456〜b1462、b3481〜b3484、b3592〜b3596、b0981〜b0988、b1021〜b1029、b2080〜b2096、b4438、b3440〜b3445、b4451、b3556〜b3558、およびb4455を欠く。別の好適な実施形態では、低減ゲノムE.coli K−12株は、以下の遺伝子:低減ゲノム株MDS40を創製するためにMDS39から欠失させる遺伝子であるb1786をさらに欠く。別の好適な実施形態では、低減ゲノムE.coli K−12株は、以下の遺伝子:MDS41を創製するためにMDS40から欠失させる遺伝子であるb0150〜b01530をさらに欠く。さらに別の好適な実施形態では、低減ゲノムE.coli K−12株は、以下の遺伝子:低減ゲノム株MDS42を創製するためにMDS41から欠失させる遺伝子であるb2945(endA)をさらに欠く。さらに別の実施形態では、低減ゲノムE.coli K−12株は、以下の遺伝子:低減ゲノム株MDS43を創製するためにMDS42から欠失させる遺伝子であるb0315〜b0331およびb0333〜b0354をさらに欠く。さらに別の実施形態では、低減ゲノムE.coli K−12株は、以下の遺伝子:MDS60を創製するためにMDS43から欠失させる遺伝子であるb2481〜b2492、b2219〜b2230、b4500、b3707〜b3723、b0644〜b0650、b4079−4090、b4487、b4092〜b4106、b0730〜b0732、b3572〜b3587、b1653、b2735〜b2740、b2405〜b2407、b3896〜b3900、b1202、b4263〜b4268、b0611、b2364〜b2366、b0839、b0488〜b0500、b0502をさらに欠く。さらに別の実施形態では、低減ゲノムE.coli K−12株は、以下の遺伝子:MDS69を創製するためにMDS60から欠失させる遺伝子であるb0566〜b0575、b2209、b0160〜b0161、b1431〜b1444、b3643、b1037〜b1043、b0383、b0226〜b0234、b2115〜b2132をさらに欠く。ある特定の実施形態では、低減ゲノムE.coli K−12株MDS41、MDS42、MDS60、またはMDS69は、本発明の改変E.coli K−12株を創製するために改変される。
他の実施形態では、(a)オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、(b)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生し、(c)iclRおよびarpA遺伝子産物の発現を低減するように改変されている親E.coli K−12株は、機能的なrecA遺伝子(b2699)を欠く。一態様では、MG1655またはW3110などのE.coli K−12株は、iclR/arpAの欠失、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の増強、およびアセトヒドロキシ酸シンターゼII活性の回復によって改変されて本発明の改変E.coli K−12株が産生され、その後、改変E.coli K−12株からの遺伝子の完全または部分的欠失によってb2699が不活化される。別の態様では、低減ゲノムE.coli株、例えば、株MDS40、MDS41、MDS42、またはMDS69などは、iclR/arpAの欠失、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の増強、およびアセトヒドロキシ酸シンターゼII活性の回復によって改変されて本発明の改変E.coli K−12株が産生され、その後、改変E.coli K−12株からの遺伝子の完全または部分的欠失によってb2699が不活化される。
他の実施形態では、本発明の改変E.coli K−12株(すなわち、(a)オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、(b)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生し、(c)iclRおよびarpA遺伝子産物の発現を低減するように改変されている)は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第8,367,380号に記載の突然変異のいずれかを含有するrelA遺伝子を含む。
他の実施形態では、本発明の改変E.coli K−12株(すなわち、(a)オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、(b)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生し、(c)iclRおよびarpA遺伝子産物の発現を低減するように改変されている)は、その内容が参照により本明細書に組み込まれているWIPO公開第2013/059595号に記載のPol II、Pol IV、およびPol Vをコードする遺伝子からなる群から選択される1種または複数の非機能遺伝子を含む。一実施形態では、改変E.coli K−12株細菌は、非機能的polB(b0060、E.coli K12 MG1655ゲノム上の座標63429〜65780)、dinB(b0231、MG1655ゲノム上の座標250898〜251953)、およびumuDC遺伝子(b1183〜b1184、MG1655ゲノム上の座標1229990〜1231667)を有する。好ましくは、遺伝子(複数可)は、完全または部分的な欠失によって不活性にされる。
本発明の改変E.coli K−12株細菌は、ポリペプチドをコードする異種核酸を含み得る。ポリペプチドは、治療タンパク質、例えば、インスリン、インターロイキン、サイトカイン、成長ホルモン、増殖因子、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、インターフェロン、または抗体などであり得る。異種核酸は、プラスミドなどのベクター内に配置され、プロモーターおよび任意選択で追加の調節配列に作動可能に連結される場合がある。
本発明の改変E.coli K−12株細菌((a)オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、(b)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生し、(c)iclRおよびarpA遺伝子産物の発現を低減するように改変された)は、ポリペプチドを産生するのに使用され得る。簡単に言えば、上述した、発現制御配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードする異種核酸を含む本発明の細菌は、ポリペプチド産物の発現を可能にするのに十分な条件下でインキュベートされ得る。本発明の改変E.coli K−12株細菌中のポリペプチドの産生の増大を、改変を含まないE.coli K−12株細菌と比較して(野生型MG1655もしくはW3110と比較して、または同じ遺伝的背景を有するが、改変を含まないE.coli K−12株細菌と比較してなど)実現することができる。さらに、同一の発酵条件下で産生され得る非改変E.coli K−12細菌の数に対して、培養液中で産生される改変E.coli K−12株細菌の数が増加すると、ポリペプチドの産生が増大する。ポリペプチドの産生の増大は、最少培地を使用するフェドバッチ発酵において特に重要であり得る。一態様では、ポリペプチドは、単鎖抗体である。
組換えタンパク質は、周辺質または細胞質内で発現され得る。周辺質内でのタンパク質の発現は、工業的使用で日常的に使用され、Hanahan、J. Mol. Biol.、166巻:557〜580頁(1983年);Hockney、Trends Biotechnol.、12巻:456〜632頁(1994年);およびHannigら、Trends Biotechnol.、16巻:54〜60頁(1998年)に総説されている。これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれている。組換えタンパク質は、これらが細胞膜周辺腔内への分泌を引き起こすシグナルペプチドに付着されている融合タンパク質を発現させることによって周辺質内で産生され得る。そこで、シグナルペプチドは、特異的シグナルペプチダーゼによって切断され得る。細胞膜周辺腔内に輸送されるタンパク質は、生物学的に活性であり得る。
組換えタンパク質は、シャペロン/ジスルフィド結合形成酵素とともに同時発現される場合があり、それは、組換えタンパク質の適切なフォールディングをもたらし得る。組換えタンパク質の周辺質発現に有用なタンパク質の核酸配列としては、限定することなく、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている米国特許第5,747,662号、同第5,578,464号、および同第6,022,952号に記載のものがある。
本発明の改変E.coli K−12株細菌はまた、核酸を増幅するための宿主として特に有用である。簡単に言えば、異種核酸を含む本発明の細菌は、核酸産物の複製を可能にするのに十分な条件下でインキュベートされ得る。本発明の改変E.coli K−12株細菌中の核酸の産生の増大を、改変を含まないE.coli K−12株細菌と比較して(野生型MG1655もしくはW3110と比較して、または同じ遺伝的背景を有するが、改変を含まないE.coli K−12株細菌と比較してなど)実現することができる。さらに、同一の発酵条件下で産生され得る非改変E.coli K−12細菌の数に対して、培養液中で産生される改変E.coli K−12株細菌の数が増加すると、所望の核酸分子の産生が増大する。核酸分子の産生の増大は、最少培地を使用するフェドバッチ発酵において特に重要であり得る。
(実施例1)
改変E.coli K株の産生
E.coli K−12株MG1655のゲノム配列を、B株とK株との間の表現型の差異を特定の遺伝子の特徴と相関させるために、E.coli B株BL21/DE3およびREL606のゲノム配列と比較した。E.coli株K−12MG1655およびB株BL21/DE3の整列により、MG1655中に存在するおよそ4,400遺伝子のうちの1,415が同一であることが明らかになった。残りの遺伝子のうち、464遺伝子が挿入または欠失を含有し、2,106遺伝子が単一の塩基変化を含有し、単一の塩基変化のうち1,249がアミノ酸レベルで非同義変化をもたらす。残りは、破断したまたは失われた遺伝子から構成され、一般に、レムナントプロファージ(remnant prophage)などの大規模な特徴内でクラスター化している。K株MG1655とB株REL606との間の同様の整列により、1,423の同一の遺伝子、挿入または欠失を含有する472遺伝子、および1,277がアミノ酸レベルで非同義変化をもたらす、単一の塩基変化を有する2,128遺伝子が明らかになった。展望を提供するために、2種のB株BL21/DE3およびREL606の整列は、4078の同一の遺伝子があり、わずか26遺伝子が挿入または欠失を含有することを示す。単一の塩基変化を有する105の遺伝子があり、このうち66が非同義変化をもたらす。したがって、予期されるように、B株ゲノムとK−12株ゲノムとの間の差異は、2種のB株間の差異よりはるかにより著しい。
株同士間の多数の遺伝子の差異を、工業発酵条件下で増殖特性に影響を与える可能性が最も高い遺伝子および遺伝子産物に注目することによって狭めた。E.coli B株とK−12株との間の遺伝子型および表現型の差異を相関させる最近の報告は、K−12株増殖を改善するための候補としてのいくつかの遺伝子を同定している[Yoonら、Genome Biology、13巻:R37頁(2012年)]。残念ながら、Yoonらによって報告されたデータの多くは、リッチ(Luriaブロス)培地中で増殖される培養液に由来し、工業発酵にとって妥当でない。LB培地は、研究室内で一般に使用されるが、これは、2つの対向する理由のために大規模工業発酵において好まれない。飼料工業用バルクアミノ酸などの低価値商品の生産については、LBは、単に高価すぎ、一方、高価値の医薬品またはファインケミカル生産については、LB培地は、動物副産物を含有するために禁止されているか、または化学的に複雑すぎ、産物回収を複雑にする。したがって、実質的にすべての大規模工業発酵において、最少培地組成が好適である。
3つの別個の遺伝的改変を、最少培地上で増殖するE.coli K−12株の能力を改善するのに特に有望であると同定した。改変は、B株と比較して劣った産生宿主であると考えられているE.coli K−12株にB株のような増殖特性を付与し、それにより、タンパク質の産生および遺伝子操作において使用するのに最適なB株およびK−12株の特徴を組み合わせる株を創製する試みを代表する。遺伝的改変を、カノニカルE.coli K−12株MG1655に由来する低減ゲノムE.coli株に対して行った。これらの低減ゲノム株は、最少培地中で増殖する場合の典型的なK−12株の特性、例えば、代謝産物オーバーフロー、無酸素サイクリング、ならびにピリミジンおよび他の代謝産物の部分的な飢餓などを呈する。したがって、これらの株は、B株の遺伝的差異の選択的組込みによる改善の良好な候補である。
低減ゲノム株MDS39を、参照により本明細書に組み込まれている国際特許公開第WO2003/070880号に記載されているように産生した。簡単に言えば、一連の低減ゲノム株(MDS01〜MDS39)を、親株E.coli MG1655に由来する核酸配列の一連の39の累積的欠失(ゲノムのおよそ14.1%)を行うことによって産生した。
K−12配列およびISデータベース中のすべての配列を含有するゲノムスキャニングチップ(NimbleGen Systems、Madison、WI)へのハイブリダイゼーションは、MDS39、すべてのISエレメントを欠くように設計された最初の株が、予想外に、その産生中に新しい場所に転座していたISエレメントの追加のコピーを含有することを明らかにした。これらのISエレメントは、MDS40を産生するために欠失させた。fhuACDB(tonA遺伝子座)は、MDS41を産生するためにMDS40から欠失させた。MDS01〜MDS41を産生するのに行ったそれぞれの累積的な欠失の場所および機能は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第8,178,339号の表2に見つけることができる。次いでendA遺伝子を、MDS42を産生するためにMDS41から欠失させた。27の追加の核酸欠失をMDS42において行ってMDS69を創製した。これらの場所および機能は、米国特許第8,178,339号の表2に見つけることができる。
以下の改変を、別個および組合せの両方でMDS42およびMDS69に行った:(i)iclR遺伝子およびarpA遺伝子の欠失、(ii)rph遺伝子の欠失、(iii)ilvGフレームシフト突然変異の補正、ならびに(iv)recA遺伝子の欠失。改変は、フランキングプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および配列決定によって検証し、後に全ゲノム配列決定によって確認した。
米国特許第6,989,265号およびFeherら、Methods Mol. Biol.、416巻:251〜259頁(2008年)に記載されている自殺プラスミドベース法を使用して、iclR遺伝子およびarpA遺伝子をMDS42細菌およびMDS69細菌のゲノムから欠失させた。簡単に言えば、iclR遺伝子およびarpA遺伝子のすぐ上流および下流の配列の2つの領域を、別個にゲノムDNAから最初に増幅させ、次いで二次増幅において、o−DAF 57 OLプライマー内でコードされる共通配列をアニールすることによって組み換えて所望の欠失接合部を形成した。最初の増幅は、プライマー、o−DAF57 OL−L(5’−GCATCTGTGGTAAAAACCCTCGATACATTGCGGAGAAAAATT−3’)と対形成したSCG803(5’−AATGGTGATGTTGGTGTTTACGCTGC−3’)、およびo−DAF57 OL−R(5’−AATGTATCGAGGGTTTTTACCACAGATGCGTTTATGCCAGTATG−3’)と対形成したSCG362(5’−GCCCCAGCGCACAGTTCAGG−3’)を使用した。個々のPCR産物をo−DAF 57 OLプライマー内でコードされる共通配列をアニールすることによって組み換えて所望の欠失接合部を形成し、プライマーo−DAF57 L spe(5’−ATGAACTAGTTGTGATTCGCCATCTTTATATTGAGCG−3’)およびo−DAF57 R ecoR(5’−ATGAGATTCTCCACCAGCGCTTTGGTGGAC−3’)を用いて増幅して、欠失接合部を包含する単一の組み合わせた断片を産生した。この組み合わせた断片を自殺プラスミド中にクローニングしてプラスミドpSG5483を形成した。染色体中にpSG5483を挿入し、同時組込み体を分解した後、プライマーSCG803およびSCG362を使用して、単離したコロニーからのゲノムDNAのPCR分析によって欠失を確認した。1,614塩基対のPCR産物は、標的遺伝子の欠失を示した一方、5,024塩基対のPCR産物は、インタクトなiclR/arpAの保持を示した。欠失の忠実度を、欠失PCR産物を配列決定することによって確認して、予期された配列が存在することを保証した。
オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強するために、rph遺伝子をMDS42細菌およびMDS69細菌のゲノムから欠失させた。下流のpyrE遺伝子の転写レベルを、rph遺伝子内のフレームシフトによって引き起こされる極性を除去することによって増大させた。簡単に言えば、上述した欠失ストラテジーの後、rph遺伝子の上流および下流の配列の2つの領域を最初に別個に増幅し、次いで二次増幅において、o−DAF rphプライマー内でコードされる共通配列をアニールすることによって組み換えて所望の欠失接合部を形成した。最初の増幅は、プライマー、o−DAF rph L(5’−GTTTCAAGCCGGAGATTTCAATATGAAACCATATCAGCGCCAG−3’)と対形成したSCG3679(5’−GCTCATACTAGTGCGCCTGCGTCTGATTGTGTTG−3’)、および0−DAF rph R(5’−CTGATATGGTTTCATATTGAAATCTCCGGCTTGAAACAAATGT−3’)と対形成したSCG3680(5’−CTTACGAAGCTTCGGCATATGGGAGCGGACTTTG−3’)を使用した。次いで組み合わせた、アニールした断片を、プライマーSCG3679およびSCG3680を用いて増幅し、欠失接合部をコードする得られたPCR産物を自殺プラスミド中にクローニングしてプラスミドpSG5787を形成した。pSG5787を染色体中に挿入し、同時組込み体を分解した後、プライマーSCG3682(5’−CTCGCGCATCTGCTCAATCAACACTT−3’)およびSCG3681(5’−GAAAAGGAACCGTCGCGAGGAAATACT−3’)を使用して、単離したコロニーのPCR分析によって欠失を確認した。2,224塩基対のPCR産物は、rph遺伝子の欠失を示した一方、3,005塩基対のPCR産物は、インタクトなrphの保持を示した。欠失の忠実度を、欠失PCR産物を配列決定することによって確認して、予期された配列が存在することを保証した。
ilvG遺伝子配列中のフレームシフト突然変異(983位および984位におけるGTの欠失)をMDS42細菌およびMDS69細菌中で修正し、その結果、全長の機能的なアセトヒドロキシ酸シンターゼIIを改変ilvG遺伝子から発現させた。この場合、染色体のilvG領域の増幅により982位のATジヌクレオチドを挿入することによって、フレームシフトを逆戻りさせた。手順では、挿入点の上流および下流の重複配列をコードし、改変を含む2つの断片を最初に別個に増幅し、次いで二次増幅において、o−DAF ilvGプライマー内でコードされる共通配列をアニールすることによって組み換えて所望のAT挿入接合部を形成した。最初の増幅は、プライマー、o−DAF ilvG L(5’−CTGCCAGTCATATTGATTTAACGGCTGCTGTAATGCTGGTAAC−3’)と対形成したSCG3684(5’−CTGCTAACTAGTGCGGCTATCGGTTATGCTCGTGCTAC−3’)、およびo−DAF ilvG R(5’−CAGCAGCCGTTAAATCAATATGACTGGCAGCAACACTGCGCGC−3’)と対形成したSCG3685(5’−GGCATAGAAGCTTGCTCAGGCGCGGATTTGTTGTG−3’)を使用した。次いで組み合わせた、アニールした断片を、プライマーSCG3684およびSCG3685を用いて増幅し、得られた挿入鋳型を自殺プラスミド中にクローニングしてプラスミドpSG5855を形成した。pSG5855を染色体中に挿入し、同時組込み体を分解した後、候補コロニーを、0.2%のグルコースおよび40μg/mlのバリンを補充した最少培地上で増殖するこれらの能力についてスクリーニングすることによって欠失を確認した。欠失の忠実度を、バリン耐性クローンのilvG遺伝子座を配列決定することによって確認して、予期された配列が存在することを保証した。
最後に、MDS42細菌およびMDS69細菌を、それらが、これらの改変の3つすべて(iclR、arpA、およびrph遺伝子の欠失、ならびにilvGフレームシフト突然変異の補正)を宿すように改変した。欠失は、iclR/arpAの欠失から始め、その後rphを欠失させ、次いでilvGを修復して逐次的にアセンブルして各meta株誘導体を産生した。最終ステップにおいて、recA遺伝子(recA1819対立遺伝子)を、MDS42meta株およびMDS69meta株中の欠失によって不活化して、株のrecAバージョンを形成した。欠失は、プライマー、DAF recA L(5’−CATCTACAGAGAAATCATACAGTATCAAGTGTTTTGTAGAAATTGT−3’)と対形成したSCG251(5’−GAATCCAAGCACTAGTCACAGCACCCATTACGCAATGGC−3’)、およびDAF recA R(5’−CACTTGATACTGTATGATTTCTCTGTAGATGATAGCGAAGGCGTA−3’)と対形成したSCG252(5’−GGCCCTCGAGAAGCTTCTATGGAAAAAGTCGAGAAACGCCTGAC−3’)を使用して、iclr/arpAおよびrphの遺伝子欠失について記載した同じ2ステップ手順によって産生した。次いで組み合わせた、アニールした断片を、プライマーSCG251およびSCG252を用いて増幅し、得られた挿入鋳型を自殺プラスミド中にクローニングしてプラスミドpSG2857を形成した。pSG2857を染色体中に挿入し、同時組込み体を分解した後、プライマーSCG225(5’−GCCTGCTGCGTCTGGATGTTGG−3’)およびSCG226(5’−ACTGGTTCATCCCGGCGTTGGTA−3’)を使用して、単離したコロニーのPCR分析によって欠失を確認した。1,688塩基対のPCR産物は、recA遺伝子の欠失を示す一方、2,767塩基対のPCR産物は、インタクトなrecAの保持を示す。欠失の忠実度を、欠失PCR産物を配列決定することによって確認して、予期された配列が存在することを保証した。組換え突然変異誘発は、RecAによって促進され、したがってrecA1819欠失突然変異を含有する株は、米国特許第6,989,265号およびFeherら、Methods Mol. Biol.、416巻:251〜259頁(2008年)に記載の方法によるさらなる欠失突然変異誘発に適していない。
(実施例2)
改変E.coli K株の増殖特性
増殖および発酵性(すなわち、発酵生産性)に対する各改変の効果を、MDS42、MDS69、MDS42recA、およびMDS69recAの細菌において別個に試験した。改変の効果を試験するために、「発酵性」を測定するための客観的な方法を設計して、一貫性のない発酵条件および培地組成などの変数の効果を制御した。この試験によって、異なる株の発酵性を、細胞が標準化されたフェドバッチ発酵(本事例では、最小限の塩培地(微量元素とともに完全に規定された最小限の塩でわずかに修正されたKorz培地を用いた37℃での10リットルのフェドバッチ発酵)で増殖することができる最大光学密度(OD)を測定することによって比較する。グルコースを0.5%までバッチ相に添加し、細胞増殖速度を、フェドバッチ相中0.3hr−1の一定の指数関数的供給速度でグルコースを供給することによって限定した。溶解酸素を発酵全体にわたって40%に維持し、pHをアンモニアの添加によって6.9で一定に保つ。各E.coliは、カナマイシン耐性遺伝子を有する誘導されていないタンパク質発現プラスミドを含有し、製造状況のストレスを模倣するためにカナマイシンを培地に添加した。細胞がますますより高い密度に増殖するにつれて、増殖速度を維持する細胞の代謝能が超過し、細胞がグルコースをもはや消費することができないポイントに最終的に到達する。フェドバッチ発酵では、グルコースを特定の供給速度で発酵槽内に導入する。細胞が、グルコースが容器内に供給されてすぐにグルコースをもはや消費することができないとき、残留グルコース濃度が急速に増大し、いわゆるグルコーススパイクをもたらす。グルコーススパイクは、発酵がその最大限界に到達したことを示す。標準条件下で所与の株についてグルコーススパイク前に到達され得る最高ODは、その株の発酵性を定義する。グルコースを監視し、グルコーススパイクが観察された場合、発酵性を、これが起こったODとして解釈した。グルコーススパイクが観察されず、誘導因子を添加し、供給速度を下げることによって細胞が誘導された場合、誘導時のODは、株の発酵性の下界として機能を果たした。誘導を過ぎたODの増大は、発酵性の判定に考慮しなかった。実行が、実験的な緊急性、例えば、供給の不足、設備障害、または酸素を送達する能力もしくは冷却する能力の超過などによって終わった場合、これらの事象が起こったODも、発酵性の最小限の推定として使用した。
MDS42、MDS69、MDS42recA、およびMDS69recAの増殖および発酵性に対する単一改変の効果は、有意でなかった。しかし意外にも、3つすべての改変をMDS42、MDS69、MDS42recA、およびMDS69recAに行った場合、発酵性は、有意に増大した。図1から分かるように、改変を含有するすべての株は、非改変親MDS42、MDS69、MDS42recA、およびMDS69recA株と比べて、かつ野生型K−12株(MG1655)および野生型B株(BL21(DE3))の両方と比較して、有意に改善された発酵性特性を呈する。さらに、図1は、株MDS42recA(Lowmut)、dinB、umuDC、およびpolB遺伝子によってコードされる誤りがちなポリメラーゼを欠くMDS42recA誘導体の発酵性も示す。MDS42recA(Lowmut)は、参照により本明細書に組み込まれている国際特許公開第WO2013/059595号に記載されている。改変K株(MDS42 meta、MDS42 Meta loMut、MDS42 meta recA、およびMDS42 meta LoMut recA)の、これらの非改変親株と比較した最少培地中の倍加時間およびMuを、以下の表1に例示する。
表1
代謝突然変異(ivlGフレームシフト突然変異の補正、ならびにrph、iclR、およびarpA遺伝子の欠失)は、試験したすべての株において発酵性を有意に高め、意外にも、代謝突然変異を欠く株(meta)より生産的にした。株の生産性の改善を、以下に記載するプラスミドおよびタンパク質産生の増大で実証する。
(実施例3)
改変E.coli K株からの核酸産生
核酸の産生の改善を表2に示す。株MDS42recA(発酵番号141)およびMDS42 meta recA(発酵番号139)をそれぞれ、組換えプラスミドgWIZ(商標)(Genlantis、San Diego、CA 92121)で形質転換した。各株を、上述したように、10リットルの発酵槽内で、最少培地中で増殖させた。細胞を収穫し、プラスミドDNAをアルカリ溶菌法によって調製し、分光光度法(UV吸光度260/280)によって定量化した。
スーパーコイルとしてのパーセントプラスミドを、ゲル電気泳動およびスキャニングデンシトメトリーによって判定した。これらの発酵からの代表的なプラスミド回収率を以下の表2に示す。
(実施例4)
改変E.coli K株からのタンパク質産生
次に、タンパク質産生宿主としての改変E.coli株の有用性を試験した。株T69recA metaおよびT69 meta(それぞれivlGフレームシフト突然変異を補正し、rph、iclR、およびarpA遺伝子を欠失させるように改変された、それぞれ親株MDS69recAおよびMDS69)を、IPTG誘導プロモーターpT5/lacに由来するヒトゲルゾリン遺伝子を発現するプラスミド(pT5lacSO−GSNと呼ぶ)で形質転換した。プラスミドpT5lacSO−GSNは、LanzerおよびBujard、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、85巻:8973〜8977頁(1988年)に記載のPA1/o5プロモーターと同様の細菌プロモーターを含む。ヒトゲルゾリンの配列は公知である(例えば、GenBank受託番号NM_000177を参照)。pUC複製起点を含むプラスミド骨格、カナマイシン耐性遺伝子、およびlacI抑制因子遺伝子は、DNA2.0、Menlo Park、CA 94025から入手可能なpJ441−01に由来する。
形質転換した株を、約8のOD600まで37℃でバッチ供給発酵に、その後、T69recA metaの場合では約300のOD600(上記で判定した株T69recA metaの発酵性)までMu=0.3の指数関数的供給に付し、その後ゲルゾリンタンパク質産物の産生を、一定のグルコース供給でIPTGを添加することによって誘導した。ゲルゾリン、細菌の細胞質内で産生される85kDの可溶性タンパク質を、細菌の微小流動化、その後の陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質の収率をゲル電気泳動によって評価し、非改変親株(T69/MDS69)のフェドバッチ発酵後のものと比較した。以下の表2から分かるように、タンパク質の収率は、改変株において有意に増大した。同様の結果が供給培地中にグリセロールを使用して得られた。
まとめると、表2および3は、図1に示した非改変E.coli K−12(MG1655)およびB(BL21/DE3)株に典型的な発酵性の範囲と併せて、E.coli K−12細胞系統内の代謝突然変異(ivlGフレームシフト突然変異の補正、ならびにrph、iclR、およびarpA遺伝子の欠失)の存在が、改善された増殖速度(より速い倍加時間、より高いMu)を付与し、より高い細胞密度、ならびに核酸およびタンパク質の産生の改善をもたらすことを実証する。
(実施例5)
定常期改変E.coli K株からのタンパク質産生
図2は、バイオマスの同時の産生を伴わない定常期におけるタンパク質を産生する改変E.coli株の能力を例示する。図のメインプロットは、増殖曲線(時間(hours)単位の時間(time)によるOD600)である。挿入図プロットは、生産性(時間(hours)単位の時間(time)によるg/Lの産物タンパク質)に関する。左の軸は、OD600に関し、右の軸は、g/Lの産物タンパク質である。追加の挿入図グラフィックは、示された時点におけるタンパク質の産生を表示するゲルである。産物タンパク質の濃度は、ゲルから、かつ総タンパク質測定から推定する。
図2に示した発酵のそれぞれにおいて、発酵は、約21時間で定常期に到達し、この時点で組換えタンパク質の転写をIPTGに添加によって誘導する。誘導した後、グルコースの供給速度を、3つの培養液(それぞれ313、80、および21g/hのグルコースを受けた発酵番号105、102、および98)の間で変更する。興味深いことに、新しく利用可能なグルコースをバイオマスに変換することによって増殖を再開するのではなく、グルコースは、産物タンパク質にほとんどもっぱら変換される。

Claims (15)

  1. 改変Escherichia coli K−12株またはその誘導体であって、
    (a)rph遺伝子内の天然の−1フレームシフト突然変異を補完する突然変異の導入により、またはrph遺伝子の欠失により、非改変親E.coli K−12株と比べてオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、
    (b)ilvG遺伝子における天然の−2フレームシフト突然変異を補完する突然変異の導入によって活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生し、
    (c)iclR遺伝子およびarpA遺伝子のすべてまたは一部の欠失によって非改変親E.coli K−12株と比べてiclRおよびarpA遺伝子産物の発現を低減するように改変されている、改変E. coli K−12株またはその誘導体。
  2. 機能的なrecA(b2699)遺伝子を欠く、請求項1に記載の改変E.coli K−12株。
  3. 前記非改変親E.coli K−12株が、E.coli K−12株MG1655、W3110、DH1、DH10B、DH5α、Invα、Top10、Top10F、JM103、JM105、JM109、MC1061、MC4100、XL1−Blue、EC100、BW2952、およびEC300からなる群から選択される、請求項1または2に記載の改変E.coli K−12株。
  4. 前記非改変親E.coli K−12株が、E.coli K−12株MG1655またはW3110である、請求項3に記載の改変E.coli K−12株。
  5. 前記非改変親E.coli K−12株が、E.coli K−12株MG1655より2〜40%小さいように遺伝子操作されたゲノムを有する低減ゲノムE.coli細菌である、請求項1または2に記載の改変E.coli K−12株。
  6. 前記非改変親E.coli K−12株が、E.coli K−12株MG1655より5%〜30%小さいように遺伝子操作されたゲノムを有する低減ゲノムE.coli細菌である、請求項5に記載の改変E.coli K−12株。
  7. 前記非改変親E.coli K−12株が、少なくとも以下のDNAセグメント:E.coli K−12株MG1655のb0245〜b0301、b0303〜b0310、b1336〜b1411、b4426〜b4427、b2441〜b2450、b2622〜b2654、b2657〜b2660、b4462、b1994〜b2008、b4435、b3322〜b3338、b2349〜b2363、b1539〜b1579、b4269〜b4320、b2968〜b2972、b2975〜b2977、b2979〜b2987、b4466−4468、b1137〜b1172、b0537〜b0565、b0016〜b0022、b4412〜b4413、b0577〜b0582、b4415、b2389〜b2390、b2392〜b2395、b0358〜b0368、b0370〜b0380、b2856〜b2863、b3042〜b3048、b0656、b1325〜b1333、b2030〜b2062、b2190〜b2192、b3215〜b3219、b3504〜b3505、b1070〜b1083、b1878〜b1894、b1917〜b1950、b4324〜b4342、b4345〜b4358、b4486、b0497〜b0502、b0700〜b0706、b1456〜b1462、b3481〜b3484、b3592〜b3596、b0981〜b0988、b1021〜b1029、b2080〜b2096、b4438、b3440〜b3445、b4451、b3556〜b3558、b4455、b1786、b0150〜b0153、およびb2945が自己から欠失している低減ゲノムE.coli細菌である、請求項5または6に記載の改変E.coli K−12株。
  8. 前記非改変親E.coli K−12株が、少なくとも以下のDNAセグメント:E.coli K−12株MG1655のb2481〜b2492、b2219〜b2230、b4500、b3707〜b3723、b0644〜b0650、b4079−4090、b4487、b4092〜b4106、b0730〜b0732、b3572〜b3587、b1653、b2735〜b2740、b2405〜b2407、b3896〜b3900、b1202、b4263〜b4268、b0611、b2364〜b2366、b0839、b0488〜b0500およびb0502が自己からさらに欠失している低減ゲノムE.coli細菌である、請求項6に記載の改変E.coli K−12株。
  9. 前記非改変親E.coli K−12株が、少なくとも以下のDNAセグメント:E.coli K−12株MG1655のb0245〜b0301、b0303〜b0310、b1336〜b1411、b4426〜b4427、b2441〜b2450、b2622〜b2654、b2657〜b2660、b4462、b1994〜b2008、b4435、b3322〜b3338、b2349〜b2363、b1539〜b1579、b4269〜b4320、b2968〜b2972、b2975〜b2977、b2979〜b2987、b4466〜4468、b1137〜b1172、b0537〜b0565、b0016〜b0022、b4412〜b4413、b0577〜b0582、b4415、b2389〜b2390、b2392〜b2395、b0358〜b0368、b0370〜b0380、b2856〜b2863、b3042〜b3048、b0656、b1325〜b1333、b2030〜b2062、b2190〜b2192、b3215〜b3219、b3504〜b3505、b1070〜b1083、b1878〜b1894、b1917〜b1950、b4324〜b4342、b4345〜b4358、b4486、b0497〜b0502、b0700〜b0706、b1456〜b1462、b3481〜b3484、b3592〜b3596、b0981〜b0988、b1021〜b1029、b2080〜b2096、b4438、b3440〜b3445、b4451、b3556〜b3558、b4455、b1786、b0150〜b0153およびb2945が自己から欠失している低減ゲノムE.coliである、請求項6に記載の改変E.coli K−12株。
  10. 前記非改変親E.coli K−12株が、少なくとも以下のDNAセグメント:E.coli K−12株MG1655のb0315〜b0331、b0333〜b0354、b0566〜b0575、b2209、b0160〜b0161、bl431〜bl444、b3643、bl037〜bl043、b0383、b0226〜b0234およびb2115〜b2132が自己からさらに欠失している低減ゲノムE.coli細菌である、請求項に記載の改変E.coli K−12株。
  11. relA遺伝子のコード配列の547もしくは548位における少なくとも1つの点突然変異を有するrelA遺伝子をコードし、前記突然変異が、547位におけるG→A突然変異、547位におけるG→T突然変異、548位におけるC→G突然変異、または548位におけるC→T突然変異の1つまたは複数から選択される、請求項1から10のいずれかに記載の改変E.coli K−12株。
  12. 機能的なpolB(b0060)遺伝子、機能的なdinB(b0231)遺伝子、および任意選択で機能的なumuDC(b1183〜b1184)遺伝子のうちの1つまたは複数を欠く、請求項1から11のいずれかに記載の改変E.coli K−12株。
  13. 異種核酸を含む、請求項1から12のいずれかに記載の細菌。
  14. 前記異種核酸が、発現制御配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項13に記載の細菌。
  15. ポリペプチドを産生するための方法であって、前記ポリペプチドを発現させるのに適した条件下で請求項14に記載の細菌をインキュベートすることと、前記ポリペプチドを収集することとを含む、方法。
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