WO2003072786A1 - Procede de production de l-threonine a l'aide d'une bacterie appartenant au genre escherichia - Google Patents

Procede de production de l-threonine a l'aide d'une bacterie appartenant au genre escherichia Download PDF

Info

Publication number
WO2003072786A1
WO2003072786A1 PCT/JP2003/002067 JP0302067W WO03072786A1 WO 2003072786 A1 WO2003072786 A1 WO 2003072786A1 JP 0302067 W JP0302067 W JP 0302067W WO 03072786 A1 WO03072786 A1 WO 03072786A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
bacterium
threonine
aspartate aminotransferase
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/002067
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Valery Zavenovich Akhverdian
Ekaterina Alekseevna Savrasova
Alla Markovna Kaplan
Andrey Olegovich Lobanov
Yuri Ivanovich Kozlov
Original Assignee
Ajinomoto Co.,Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co.,Inc. filed Critical Ajinomoto Co.,Inc.
Priority to MXPA04008302A priority Critical patent/MXPA04008302A/es
Priority to DE60320762T priority patent/DE60320762D1/de
Priority to KR1020047013394A priority patent/KR100976072B1/ko
Priority to JP2003571467A priority patent/JPWO2003072786A1/ja
Priority to EP03707063A priority patent/EP1479775B1/en
Priority to AU2003211697A priority patent/AU2003211697A1/en
Publication of WO2003072786A1 publication Critical patent/WO2003072786A1/ja
Priority to US10/673,786 priority patent/US20040132165A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)

Definitions

  • the present invention relates to biotechnology, specifically to a method for producing L_amino acids by a fermentation method, and more specifically to a gene derived from the bacterium Escherichia coli.
  • the gene is useful for improving the productivity of L-amino acids, for example, L-threonine.
  • L-amino acids are industrially produced by a fermentation method using a strain of a microorganism obtained from the natural world or a mutant strain modified to enhance the ability of the microorganism to produce L-amino acid.
  • strains used for the production of L-threonine by fermentation are known. That is, strains having increased activities of enzymes involved in L-threonine biosynthesis (US Pat. Nos. 5,175,107, 5,661,012, 5,705,371, 5,939,307). No., European Patent No. 0219027), strains resistant to chemicals such as L-threonine and its analogs (WO No. W001 U525A1, EP Patent No. 301572A2, US Patent No. 5,376,538) Strains with a target enzyme desensitized to feedback inhibition by L-amino acids or their by-products (US Patent Nos. 5,175,107, 5,661,012), inactivated threonine degradation Strains having enzymes (U.S. Pat. Nos. 5,939,307 and 6,297,031) are known.
  • VKPM B-3996 The known threonine producing strain VKPM B-3996 (US Pat. Nos. 5,175,107 and 5,705,371) is the best threonine producing strain at the moment. VKPM B-3996 shares For construction, various mutations and a plasmid described later were introduced into the parent strain Escherichia coli K-12 (VKPM B-7).
  • the mutant thrA gene (mutant thrA442) encodes aspartase-homoserine dehydrogenase I that is resistant to threonine feedback inhibition.
  • mutant ilvA gene encodes a low-activity threonine kinase, resulting in reduced isoleucine biosynthesis and a leaky phenotype of isoleucine starvation.
  • transcription of the thrABC operon is not suppressed by isoleucine, which is very effective for threonine production.
  • Inactivation of the tdh gene suppresses threonine degradation.
  • a sucrose assimilation determining gene was introduced into the strain.
  • plasmid pVIC40 carrying the mutant threonine operon thrA442BC was introduced into the intermediate strain TDH6.
  • the amount of L-threonine accumulated during fermentation of the strain reached 85 g / L.
  • the present inventors have obtained a mutant strain of thEscherichia coli K-12 having a thrR (herein referred to as rhtA23) which is a mutation involved in resistance to a high concentration of threonine or homoserine in a minimal medium.
  • rhtA23 a mutant strain of thEscherichia coli K-12 having a thrR
  • Due to this mutation, L-threonine (former US Pat. No. 974817), homoserine and glucomic acid (Astaurova, OB et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 27, 556-561), such as strain VKPM-3996, , 1991, Escherichia coli producing EP 1013765 A) improved their respective amino acid producing capacities.
  • the inventors conclude that the rhtA gene is located at 18 minutes on the Escherichia coli chromosome in close proximity to the glnHPQ operon, which encodes a component of the glutamine transport system, and that the rhtA gene has perB and ompX It is clear that it is identical to 0RF1 (ybiF gene, GenBank accession number AAA218541, gi: 440181, 764 to 1651) located between the genes.
  • the unit expressing the protein encoded by 0RF1 is called rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine).
  • aspartic acid is a carbon source for the synthesis of amino acids belonging to the aspartic acid family (threonine, methionine, lysine) or diaminopimelic acid, a constituent of the bacterial cell wall.
  • threonine, methionine, lysine amino acids belonging to the aspartic acid family
  • diaminopimelic acid a constituent of the bacterial cell wall.
  • These syntheses are performed by complex routes with several branch points and very sensitive regulatory mechanisms.
  • Aspartokinase-homoserine dehydrogenase I encoded by part of the thrABC operon, performs the first and third reactions of the threonine biosynthetic pathway.
  • aspartic acid aminotransferase aspartic acid transaminase
  • aspartase aspartic acid transaminase
  • Aspartic acid aminotransferase converts oxaacetic acid to aspartic acid.
  • Aspartase converts fumaric acid to aspartic acid.
  • the above object was achieved by finding that the aspC gene encoding aspartate aminotransferase cloned into a low-copy-number vector can enhance L-threonine-producing ability.
  • the present invention is as follows.
  • Aspartate aminotransferase is modified by increasing the copy number of the aspartate aminotransferase gene or by modifying the expression control sequence of the aspartate aminotransferase gene so as to enhance the expression of the gene.
  • the aspartate amino transferase gene is selected from the group consisting of Escherichia sp.
  • the bacterium according to any one of (2) to (4), which is derived from a bacterium.
  • the method according to (1) wherein the bacterium according to any one of (1) to (10) is cultured in a medium, L-threonine is generated and accumulated in the medium, and L-threonine is collected from the medium. Method for producing L-threonine.
  • the bacterium of the present invention is a bacterium belonging to Escherichia coli that produces L-threonine, and is a bacterium that has been modified so that the activity of aspartic acid aminotransferase is enhanced.
  • the bacterium belonging to the genus Escherichia that can be used in the present invention is not particularly limited.
  • bacteria described by Neidhardt, FC et al. Escherichia coli and Salmonel la typhimurium, American Society for Microbiology, Washington DC, 1208) , Table 1).
  • L-threonine-producing bacterium means a bacterium having the ability to accumulate L-threonine in the medium when the bacterium of the present invention is cultured in the medium. L-threonine-producing ability can be imparted or enhanced by breeding.
  • aminotransferase activity refers to the reaction of pyridoxal 5'-phosphate to generate L-aspartate from oxa-mouth acetic acid and L-glutamic acid and release ⁇ -ketoglutarate. Activity.
  • modified aspartic acid aminotransferase activity means that the activity per cell has become higher than that of an unmodified strain, eg, a wild strain.
  • an unmodified strain eg, a wild strain.
  • wild-type strains for comparison include Escherichia coli and E. coli-12.
  • Enhancement of aspartate aminotransferase activity in bacterial cells can be achieved by enhancing expression of the gene encoding aspartate aminotransferase.
  • aspartic acid amino transferase gene any of a gene derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia and a gene derived from another bacterium such as a coryneform bacterium can be used. Among these genes, genes derived from bacteria belonging to the genus Escherichia are preferable.
  • AspC a gene encoding aspartate aminotransferase from Escherichia coli, has already been identified (GenBank accession NC 000913. 1, gi: 16128895, 983742 to 984932). Therefore, the aspC gene can be obtained by PCR using a primer prepared based on the sequence of the gene (polymerase chain 'reaction: White, TJ et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)). ). Similarly, a gene encoding aspartate aminotransferase of another microorganism can be obtained.
  • the aspC gene originating in Escherichia coli includes a DNA encoding the following protein (A) or (B).
  • the number of "several" amino acids differs depending on the position or type of the amino acid residue in three dimensions of the protein. This number may be 2 to 30, preferably 2 to 15, and more preferably 2 to 5, for protein (A). This is for the following reasons. Some amino acids have a high degree of homology to each other, and such amino acid differences do not significantly affect the three-dimensional structure of the protein and its activity. Therefore, the protein (B) has a homology of 30 to 50% or more, preferably 50 to 70% or more, to all amino acid residues constituting aspartate aminotransferase, and It may have acid aminotransferase activity.
  • DNA encoding a protein substantially the same as the above-described aspartate aminotransferase can be obtained by, for example, site-directed mutagenesis of the base sequence of DNA (SEQ ID NO: 2) encoding aspartate aminotransferase. It can be obtained by modifying one or more amino acid residues at a specific site to include deletion, substitution, insertion or addition.
  • the modified DNA as described above can also be obtained by a generally known mutation treatment method. Examples of such a treatment include a method of treating a DNA encoding the protein of the present invention with hydroxylamine, or a method of irradiating a bacterium having the same DNA with ultraviolet light or N-methyl-N'-one-nitro-N-. Treat with a mutagen such as nitrosoguanidine or nitrous acid Method.
  • DNA encoding a protein substantially identical to aspartate aminotransferase can be obtained by expressing DNA having the above mutation in appropriate cells and examining the activity of the expressed product. .
  • a DNA encoding a protein substantially identical to aspartate aminotransferase can be obtained from a DNA encoding a mutated aspartate aminotransferase or a cell carrying the same, for example, in the sequence listing. Obtained by isolating a DNA which hybridizes with a probe having the nucleotide sequence shown as SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and encodes a protein having aspartate aminotransferase activity Can be.
  • stringent conditions are conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to clearly express these conditions numerically, for example, as stringent conditions, DNAs with high homology, for example, 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 90% or more of each other A condition is such that DNAs having the above homology are hybridized with each other, and DNAs having a lower homology are not hybridized with each other.
  • stringent conditions include the usual conditions for washing in Southern hybridizations, ie, at 60 ° C., 1 XSSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 XSSC, 0
  • the conditions under which DNA hybridizes with each other at a salt concentration corresponding to 1% SDS are exemplified.
  • a partial sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can also be used as a probe.
  • Such a probe can be prepared by using an oligonucleotide prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as a primer and a PCR using a DNA fragment having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as a ⁇ type.
  • washing conditions for hybridization include, for example, 50 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • nucleotide substitutions, deletions, insertions, or additions include, for example, mutations that occur naturally due to differences in the individual or in the species or genus of the bacterium having aspartate aminotransferase. Mutant or pariant).
  • "- The transformation of a bacterium with a DNA encoding a protein is, for example, a method for enhancing the expression of a gene encoding the protein of the present invention and enhancing the activity of the protein in bacterial cells by a conventional method. Introducing DNA into bacterial cells.
  • Methods for enhancing gene expression include methods for increasing gene copy number.
  • a gene By introducing a gene into a vector that functions in a bacterium belonging to the genus Escherichia, the copy number of the gene is increased.
  • a low copy number vector can be suitably used. Examples of low copy number vectors include pSC101, PM118, pMWl19, and the like.
  • the gene expression can also be enhanced by, for example, introducing multiple copies of the gene into the bacterial chromosome by a method such as homologous recombination.
  • a method such as homologous recombination.
  • any of the known methods reported so far can be employed.
  • a method described in Escherichia coli K-12, in which recipient cells are treated with calcium chloride to increase DNA permeability (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. ., 53, 159 (1970)).
  • enhancement of gene expression can also be achieved by placing the DNA of the present invention under the control of a strong promoter.
  • a strong promoter for example, lac promoter one, trp promoter Isseki one, trc promoter one, P R, P L promoter one lambda phage are known as strong promoters scratch.
  • the use of powerful promoters may be combined with gene copy number amplification.
  • the promoter can also be enhanced by introducing a mutation into the promoter so as to increase the transcription level of a gene located downstream of the promoter.
  • substitution of some bases in the splice region between the ribosome binding site (RBS) and the start codon, especially the base immediately upstream of the start codon can have a significant effect on mRNA translation. It has been known. For example, expression levels have been found to vary by a factor of 20 depending on the nature of the three nucleotides before the start codon (Gold et al., Annu. Rev. Mocrobiol., 35, 365).
  • a mutation may be introduced into the promoter region of the aspartate aminotransferase gene on the chromosome of the bacterium so as to be modified into a strong promoter.
  • the modification of the expression control sequence can be performed, for example, in the same manner as in gene replacement using a temperature-sensitive plasmid, as disclosed in International Publication W000 / 18935 and Japanese Patent Publication No. 215280.
  • the copy number of the aspartate aminotransferase gene can also be achieved by introducing multiple copies of the aspartate aminotransferase gene into bacterial chromosomal DNA.
  • homologous recombination is carried out using the multicopy sequence present on the target chromosomal DNA.
  • sequence present on the chromosome in multiple copies an inverted repeat present at the end of a transposable element can be used.
  • JP-A-2-109985 it is necessary to incorporate the aspartate aminotransferase gene into a transposon, transfer it, and introduce the gene into the chromosome DNA in multicopy. Can be.
  • the bacterium of the present invention can be obtained by introducing the above-described DNA into a bacterium originally having L-threonine-producing ability.
  • the bacterium of the present invention can be obtained by imparting L-threonine-producing ability to a bacterium already having the DNA.
  • Parent strains in which the activity of aspartic acid aminotransferase encoded by the aspC gene is enhanced include Escherichia coli and VKPM B-3996 (US Pat. No. 5,175,107, US Pat. No. 5,705). 371), Escherichia coli NRRL-21593 (US Pat. No. 5,939,307), Escherichia coli FERM BP-3756 (US Pat. No.
  • the B-3996 strain lacks the thrC gene, is sucrose-assimilating, and has a key mutation in the ilvA gene. This strain has a mutation in the rht gene that is involved in high tolerance to threonine and homoserine.
  • the B-3996 strain is a vector derived from RSF1010 containing the thrA * BC operon containing the mutant thrA gene encoding aspartokinase-homoserine dehydrogenase I, which has substantially eliminated threonine feedpack resistance. It retains the plasmid pVIC40 obtained by insertion into E. coli.
  • the B-3996 strain was deposited on April 7, 1987 with the Russian National Collection of Industria 1 Microorganisms (VKPM) at Dorozhny proezd. 1, Moscow 113545, Russia n Federation under the accession number B-3996. ing.
  • the bacterium of the present invention is preferably further modified so that the expression of one or more genes selected from the following group in addition to the aspC gene is enhanced.
  • the rhtA gene encoding a protein predicted to be a transmembrane protein The most preferred embodiment of the bacterium is modified so that the expression levels of the aspC gene, mutant thrA gene, thrB gene, thrC gene, and rhtA gene are increased.
  • Bacteria. comprises the steps of: culturing the bacterium of the present invention in a medium; Includes a method for producing L-threonine, producing and accumulating L-threonine from the same medium.
  • culturing, collection and purification of L-amino acid from the medium, and the like can be performed in the same manner as in a normal fermentation method for producing amino acids using microorganisms.
  • the culture medium used may be either a synthetic medium or a natural medium as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, minerals, and, if necessary, an appropriate amount of nutrients necessary for the growth of the microorganism.
  • Sources of carbon include various carbohydrates, such as glucose and sucrose, and various organic acids. Alcohols such as ethanol and glycerol can also be used, depending on the form of assimilation of the microorganism used.
  • Nitrogen sources include various ammonium salts such as ammonia and ammonium sulfate, other nitrogen compounds such as amines, natural nitrogen sources such as peptones, soybean hydrolysates and digests of enzymatic microorganisms. You. As inorganic substances, potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like are used. Thiamine, yeast extract and the like are used as vitamins.
  • the cultivation is preferably carried out under aerobic conditions such as shaking culture and aeration-agitation culture, at a temperature of 20 to 40 ° C, preferably 30 to 38 ° C.
  • the pH in the culture is usually between 5 and 9, preferably between 6.5 and 7.2.
  • the pH of the culture can be adjusted with ammonia, calcium carbonate, various acids, various bases, and buffers. Usually, after 1 to 5 days of culture, L-threonine accumulates in the culture.
  • Example 1 Cloning of aspC gene of Escherichia coli into PMW119 vector
  • the aspC gene was obtained from the chromosomal DNA of Escherichia coli K-12 strain by PCR using the primers shown in SEQ ID NOs: 3 and 4.
  • the resulting DNA fragment was treated with restriction enzymes PvuII and Stul, advance the restriction enzymes HincII and stable low copy plasmid was treated with EcoRI pMW119 (pSC101 Reburikon), connected so as to be under control of P l ac promoter did.
  • EcoRI pMW119 pSC101 Reburikon
  • the aspC gene instead of the P l ac promoter, was placed under the control of the P r promoter of powerful lambda phage.
  • the double-stranded DNA containing the Pr promoter was prepared using chemically synthesized 5'-phosphorylated oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 5 and 6 in the sequence listing. Subsequently, the double-stranded DNA, was ligated into pMW_P l ac -aspC plasmid previously treated with PvuII and Hindlll. In this way, it was constructed pM_P R _aspC plasmid.
  • Plasmid pMW-P l ac - aspC and pM_P R -aspC plasmid pM-P R - aspC is than a compatible plasmid PVIC40 (pRSFlOlO Reburikon), these two plasmids, pVIC40 and pMW- P l ac - asp or pVIC40 and pM- P R - aspC can be maintained simultaneously in bacteria.
  • Plasmid pMW_P l ac - aspC and pM- P R - aspC was introduced to each threonine productivity of streptomycin-resistant Eshierihia coli strain B-3996 (U.S. Patent No. 5, 175, 107 issue).
  • B- 3996 (pMW_P l ac - aspC) and B-3996 (pM- P R - aspC) were obtained.
  • Example 2 Effect of aspC gene amplification on threonine production
  • Eshierihia 'coli B- 3996 (pMW - P l ac _aspC) and B - 3996 the (pM - - P R aspC) , with L one-agar plates containing streptomycin (lOO ⁇ g / ml), 37 ° C For 18 to 24 hours.
  • One loopful of cells was then transferred to 50 ml of L-medium with the following composition: tryptone 10 g / l, yeast extract 5 g / l, NaCl 5 g / l.
  • L-threonine can be efficiently produced

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

明細書 ェシエリヒア属細菌を用いた L—スレオニンの製造法 技術分野
本発明はバイオテクノロジー、 具体的には発酵法による L _アミノ酸の製造法 に関し、 さらに具体的には、 細菌ェシエリヒア · コリ由来の遺伝子に関する。 該 遺伝子は L—アミノ酸、 例えば、 Lースレオニンの生産性の向上に有用である。 背景技術
従来、 L一アミノ酸は、 自然界より得られる微生物の菌株、 または同微生物を L一アミノ酸生産能を増強させるために改変された変異株を用いた発酵法により、 工業的に生産されている。
L一アミノ酸生産能を増強するために、 例えば、 組換え D N Aによる形質転換 によって微生物の生合成遺伝子を増幅させる方法が用いられてきた （例えば、 米 国特許 4, 278, 765を参照） 。 これらの技術は、 アミノ酸生合成系酵素の活性上昇 および/または生成する L—アミノ酸もしくはその副生物によるフィードパック 阻害に対する標的酵素の脱感作に基づいている （例えば、 特開昭 56-18596 (1981)、 国際公開 W095/16042、 または米国特許 5, 661， 012および 6, 040, 160参照） 。
発酵法による Lースレオニンの生産に用いられる種々の菌株が知られている。 すなわち、 Lースレオニン生合成に関与する酵素の活性を増加させた菌株 （米国 特許第 5, 175， 107号、 第 5, 661， 012号、 第 5， 705， 371号、 第 5, 939, 307号、 欧州特 許第 0219027号） 、 Lースレオニンおよびそのアナログ等の化学物質に耐性な菌 株 （国際公開第 W001 U525A1号、 欧州特許第 301572A2号、 米国特許第 5, 376， 538 号） 、 生成した L—アミノ酸又はその副生物によるフィードバック阻害に対して 脱感作された標的酵素を有する菌株 （米国特許第 5， 175, 107号、 第 5， 661， 012号） 、 不活性化したスレオニン分解酵素を有する株 （米国特許第 5, 939， 307号、 第 6， 297, 031号） が知られている。
既知のスレオニン生産株である VKPM B- 3996株 （米国特許第 5, 175, 107号および 第 5， 705， 371号） は、 現時点で最良のスレオニン生産株である。 VKPM B- 3996株の 構築のため、 親株であるェシエリヒア · コリ K- 12 (VKPM B-7) に種々の変異及 び後述のプラスミドが導入された。 変異型 thrA遺伝子 （変異型 thrA442) は、 ス レオニンによるフィードバック阻害に耐性なァスパル卜キナーゼ—ホモセリンデ ヒドロゲナ一ゼ Iをコードしている。 変異型 ilvA遺伝子 （変異 ilvA442) は、 低 活性のスレオニンデァミナ一ゼをコードしているため、 イソロイシン生合成が低 下し、 イソロイシン飢餓というリーキーな表現型を示す。 ilvA442変異を持つ細 菌では、 thrABCオペロンの転写はイソロイシンによって抑制されないため、 スレ ォニン生産に非常に有効である。 tdh遺伝子の不活性化は、 スレオニン分解を抑 制する。 スクロース同化の決定遺伝子 （scrKYABR遺伝子） が、 前記菌株に導入さ れた。 さらにスレオニン生合成を制御する遺伝子群の発現を増加させるため、 変 異スレオニンオペロン thrA442BCを持つプラスミド pVIC40が中間体菌株である TDH 6に導入された。 同菌株の発酵中に蓄積した L—スレオニンの量は、 85g/Lに達し た。
本発明者らは、 ェシエリヒア 'コリ K-12について、 最小培地中における高濃 度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性に関与する変異である thrR (ここ では rhtA23と呼ぶ） を有する変異株を取得している （Astaurova, O.B. et al.， Appl. Bioch. And Microbiol., 21， 611-616 (1985)) 。 この変異によって、 VKPM - 3996株のような、 L—スレオニン （旧ソ連特許 974817) 、 ホモセリンおよびグ ル夕ミン酸 （Astaurova, O.B. et al. , Appl. Bioch. And Microbiol. , 27, 556 -561, 1991、 EP 1013765 A) を生産するェシエリヒア . コリの、 それぞれのアミ ノ酸生産能が向上した。
さらに、 本発明者らは、 rhtA遺伝子が、 グルタミン輸送系の構成成分をコードす る glnHPQオペロンに近接するのェシエリヒア ·コリ染色体上 1 8分に存在するこ と、 および、 rhtA遺伝子が perBと ompX遺伝子の間に位置する 0RF1 (ybiF遺伝子、 GenBank accession number AAA218541， gi :440181の 764から 1651番） と同一であ ることを明らかにしている。 0RF1によりコードされるタンパク質を発現するュニ ットは、 rhtA (rht： resistance to homoser ine and threonine (ホモセリンお よびスレオニンに対する耐性） ） と称されている。 また、 本発明者らは、 rhtA23 変異が、 AT G開始コドンからマイナス 1位における Gから Aへの置換であるこ とを見い出した （ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the Am er ican Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, Ca lifornia August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A) 。
スレオニン生合成の主経路が研究され、 大幅に最適化された状態においては、 ァスパラギン酸のようなスレオニンの遠位前駆体を細菌に加える量を増加させる ことで、 スレオニン生産株のさらなる改良を行うことができる。
ァスパラギン酸が、 ァスパラギン酸ファミリ一に属するアミノ酸 （スレオニン、 メチォニン、 リジン） 、 または細菌の細胞壁の構成成分であるジアミノピメリン 酸の合成のための炭素供給源であることは既に知られている。 これらの合成は、 いくつかの分岐点を有し、 極めて鋭敏な調節機構を有する複雑な経路により行わ れる。 ァスパラギン酸、 ァスパラギン酸セミアルデヒド、 ホモセリンの分岐点に おいては、 この生合成ステップに由来する多くのアミノ酸が存在するように、 同 様に多くのアイソザィムが存在する。 thrABCオペロンの一部によりコードされる ァスパルトキナーゼ—ホモセリンデヒドロゲナ一ゼ Iは、 スレオニン生合成経路 の第一および第三の反応を行う。 スレオニンおよびイソロイシンは、 ァスパルト キナ一ゼ—ホモセリンデヒドロゲナ一ゼ Iの発現を制御し、 スレオニンは前記反 応を触媒する活性の両方を阻害する （Escherichia coli and Salmonella, Secon d Edition, Editor in Chief: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D. ， 1996) 。
ァスパラギン酸の合成には二つの遺伝子が関与する。 すなわち、 aspC遺伝子に よってコードされるァスパラギン酸ァミノ トランスフェラ一ゼ （ァスパラギン酸 トランスァミナ一ゼ） 、 および、 aspA遺伝子の産物であるァスパルターゼである。 ァスパラギン酸ァミノ トランスフェラ一ゼは、 ォキサ口酢酸をァスパラギン酸に 変換する。 ァスパルタ一ゼはフマル酸をァスパラギン酸に変換する。
ァスパラギン酸フアミリーのアミノ酸の一つである L—リジンの生成に対する、 aspC遺伝子増幅の効果が示されている。 aspC遺伝子の増幅は、 ェシエリヒア ' コ リによる L一リジン生産に用いられている （米国特許第 6， 040, 160号） 。 ァスパ ルトキナーゼを保持し、 ァスパラギン酸ァミノトランスフェラ一ゼを含む数種の 酵素をコードする D N Aの発現が増強されたコリネ型細菌が、 L—リジン生産に 用いられている （米国特許第 6， 004, 773号） 。
また、 ァスパラギン酸アミノトランスフェラ一ゼが、 コリネ型細菌による L— スレオニンおよび L一リジンの生産に有用であることが知られている （米国特許 4, 980, 285) 。
しかし今日まで、 L—スレオニン生産において、 ァスパルギン酸アミノトラン スフエラーゼ活性が増強されたェシェリヒア属細菌を使用したという報告はなさ れていない。 発明の開示 本発明は、 L—スレオニン生産菌の生産性を増強すること、 および、 これらの 株を用いた L—スレオニンの製造法を提供することを課題とする。
上記課題は、 低コピー数のベクタ一にクローン化されたァスパラギン酸ァミノ トランスフェラーゼをコ一ドする aspC遺伝子が、 Lースレオニン生産能を増強し 得ることを見出すことにより、 達成された。
すなわち、 本発明は以下のとおりである。
( 1 ) Lースレオニンを生産するェシエリヒア属する細菌であって、 ァスパラギ ン酸アミノトランスフエラ一ゼ活性が増強するように改変された細菌。
( 2 ) ァスパラギン酸ァミノ トランスフェラーゼ遺伝子の発現量が上昇すること によりァスパラギン酸ァミノ トランスフェラーゼ活性が増強された（1 )に記載の 細菌。
( 3 ) ァスパラギン酸ァミノ トランスフェラーゼ遺伝子のコピー数を上昇させる か、 又は、 ァスパラギン酸アミノ トランスフェラーゼ遺伝子の発現が増強するよ うに同遺伝子の発現調節配列が改変されることにより、 ァスパラギン酸ァミノ ト ランスフエラーゼ活性が増強された（1)に記載の細菌。
( 4 ) 前記遺伝子を含む低コピー数べクタ一による前記細菌の形質転換により、 前記コピー数が上昇した（3)に記載の細菌。
( 5 ) 前記ァスパラギン酸ァミノ トランスフェラーゼ遺伝子がェシエリヒア属細 菌由来である（2)〜（4)のいずれかに記載の細菌。
(6) 前記ァスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子が、 以下の （A) ま たは （B) のタンパク質をコードする（5)に記載の細菌：
(A) 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
(B) 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1もしくは数個の アミノ酸の欠失、 置換、 挿入または付加を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 ァス パラギン酸ァミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(7) 前記ァスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子が、 以下の （a) ま たは （b) の DNAを含む（5)に記載の細菌：
(a) 配列番号 1の塩基番号 1〜 1 196の塩基配列を有する DN A；
(b) 配列番号 1の塩基番号 1〜 1 1 96の塩基配列、 又は同塩基配列から調 製され得るプローブと、 ストリンジェン卜な条件でハイブリダイズすることがで き、 かつ、 ァスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を コードする DNA。
(8) 前記ストリンジェントな条件が、 1 X S S C、 0. 1 % SDSに相当す る塩濃度で、 60°Cで洗浄が行われる条件である、 （7)に記載の細菌。
(9) スレオニンによるフィードパック阻害に耐性なァスパルトキナ一ゼ—ホモ セリンデヒドロゲナーゼ Iをコードする変異型 t h r A遺伝子、 ホモセリンキナ —ゼをコードする、 t h r B遺伝子、 スレオニンシンターゼをコードする t h r C遺伝子、 及び、 膜貫通タンパク質と予想されるタンパク質をコードする r h t A遺伝子からなる群から選択される 1または 2以上の遺伝子の発現が増強される ようにさらに改変された（1)〜（8)のいずれかに記載の細菌。
(10) 変異型 t h r A遺伝子、 t h r B遺伝子、 t h r C遺伝子、 及び r h t A遺伝子の発現量が上昇するように改変された（9)に記載の細菌。
( 1 1) (1)〜（10)のいずれかに記載の細菌を培地中で培養して、 培地中に L一 スレオニンを生成、 蓄積させ、 同培地から L—スレオニンを採取することを特徴 とする Lースレオニンの製造法。 以下、 本発明を詳細に説明する。 本発明の細菌は、 L—スレオニンを生産するェシエリヒア属する細菌であって、 ァスパラギン酸ァミノ トランスフェラ一ゼ活性が増強するように改変された細菌 である。
本発明に使用することのできるェシエリヒア属細菌は、 特に制限されないが、 例えば Neidhardt, F.C. らにより記載されている細菌 （Escherichia coli and S almonel la typhimur ium, American Society for Microbiology, Washington D. C, 1208, Table 1) が挙げられる。
本明細書において、 「L—スレオニンを生産する細菌」 とは、 本発明の細菌を 培地で培養したときに、 同培地中に Lースレオニンを蓄積する能力を有する細菌 を意味する。 Lースレオニン生産能は、 育種によって付与又は増強され得る。
「ァスパラギン酸アミノ トランスフェラーゼ活性」 という用語は、 ピリ ドキサ ル 5 ' —リン酸を用いて、 ォキサ口酢酸及び L—グルタミン酸から L—ァスパラ ギン酸を生成し、 α—ケトグルタル酸を遊離する反応を触媒する活性を意味する。
「ァスパラギン酸ァミノ トランスフェラーゼ活性が増強するように改変され た」 という用語は、 細胞当たりの活性が、 非改変株、 例えば野生株の活性よりも 高くなつたことを意味する。 例えば、 細胞当たりのァスパラギン酸アミノ トラン スフエラ一ゼ分子の数が上昇する場合、 ァスパラギン酸ァミノトランスフェラ一 ゼ分子当たりの比活性が上昇する場合等が挙げられる。 さらに、 比較対照として の野生株としては、 例えば、 ェシエリヒア， コリ Κ- 12が挙げられる。 細胞内の ァスパラギン酸ァミノ トランスフェラーゼ活性が増強される結果、 培地に蓄積す る L—スレオニンの量が上昇するという効果が得られる。
細菌細胞内のァスパラギン酸ァミノトランスフェラ一ゼ活性の増強は、 ァスパ ラギン酸ァミノ トランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現を増強することに よって達成することができる。 ァスパラギン酸ァミノ トランスフェラ一ゼ遺伝子 としては、 ェシエリヒア属細菌由来の遺伝子、 及び、 コリネ型細菌等のような他 の細菌に由来する遺伝子のいずれも用いることができる。 これらの遺伝子の中で は、 ェシエリヒア属細菌由来の遺伝子が好ましい。
ェシエリヒア · コリのァスパラギン酸ァミノトランスフェラーゼをコードする 遺伝子である aspCはすでに明らかにされている （GenBank accession NC 000913. 1, gi: 16128895の配列の 983742〜984932番） 。 したがって、 aspC遺伝子は、 同遺 伝子の配列に基づいて調製したプライマーを用いた P CR (ポリメラーゼ ·チェ イン ' リアクション： White, T.J. et al.， Trends Genet., 5, 185 (1989)参 照） によって取得することができる。 同様にして、 他の微生物のァスパラギン酸 ァミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を取得することができる。
ェシエリヒア ·コリを起源とする aspC遺伝子は、 以下の （A) または （B) の タンパク質をコードする DNAが挙げられる。
(A) 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
(B) 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1もしくは数個の アミノ酸の欠失、 置換、 揷入または付加を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 ァス パラギン酸ァミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
ここで、 「数個」 のアミノ酸の数は、 前記タンパク質の三次元におけるァミノ 酸残基の位置または種類により異なる。 この数は、 タンパク質 （A) においては、 2〜3 0、 好ましくは 2〜 1 5、 さらに好ましくは 2〜 5であり得る。 これは、 以下の理由による。 いくつかのアミノ酸は互いに高い相同性を有し、 そのような アミノ酸の相違はタンパク質の三次元構造およびその活性にさほど影響を及ぼさ ない。 そのため、 タンパク質 （B) は、 ァスパラギン酸アミノトランスフェラー ゼを構成する全アミノ酸残基に対して、 3 0〜5 0 %以上、 好ましくは 5 0〜 7 0 %以上の相同性を持ち、 かつ、 ァスパラギン酸アミノトランスフェラ一ゼ活性 を有するものであってもよい。
上述のァスパラギン酸ァミノトランスフェラーゼと実質的に同一のタンパク質 をコードする DNAは、 例えばァスパラギン酸ァミノトランスフェラーゼをコ一 ドする DNA (配列番号 2) の塩基配列を、 例えば部位特異的変異法により、 1 又は 2以上の特定部位のアミノ酸残基が欠失、 置換、 挿入またほ付加を含むよう に改変することにより、 取得することができる。 上記のような改変された DN A は、 一般に知られた変異処理法によっても取得することができる。 このような処 理としては、 本発明のタンパク質をコードする DN Aをヒドロキシルァミンで処 理する方法、 または同 DN Aを保持する細菌を紫外線照射または N—メチルー N ' 一二トロ— N—二トロソグァ二ジンもしくは亜硝酸等の変異剤によって処理す る方法が挙げられる。
ァスパラギン酸ァミノトランスフェラーゼと実質的に同一のタンパク質をコー ドする DNAは、 上記のような変異を有する DNAを適当な細胞で発現させ、 発 現産物の活性を調べることにより、 取得することができる。 また、 ァスパラギン 酸ァミノトランスフェラ一ゼと実質的に同一のタンパク質をコードする DN Aは、 変異を有するァスパラギン酸ァミノトランスフェラーゼをコードする DN A又は それを保持する細胞から、 例えば、 配列表に配列番号 1として示す塩基配列を有 するプローブとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、 かつ、 ァスパラ ギン酸アミノトランスフェラ一ゼ活性を有するタンパク質をコードする DN Aを 単離することにより取得することができる。 ここで 「ストリンジェン卜な条件」 とは、 いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、 非特異的ハイブリッドが形成さ れない条件である。 この条件を数値で明確に表すことは困難であるが、 例えば、 ストリンジェン卜な条件としては、 高い相同性を有する DNA、 例えば、 互いに 50 %以上、 好ましくは 70 %以上、 より好ましくは 90 %以上の相同性を有す る DN A同士がハイプリダイズし、 それより低い相同性を有する DN A同士がハ ィブリダイズしない条件が挙げられる。 あるいは、 ストリンジェントな条件とし ては、 サザンハイブリダィゼ一シヨンにおける洗净の通常の条件、 すなわち、 6 0°Cで、 1 X S S C、 0. 1 %SDS、 好ましくは 0. 1 X S S C、 0. 1 % S D S相当する塩濃度で、 D N Aが互いに八ィブリダイズする条件が例示される。 プローブとしては、 配列番号 1の塩基配列の部分配列もまた使用することがで きる。 そのようなプローブは、 プライマーとして配列番号 1の塩基配列に基づい て調製されるオリゴヌクレオチド、 および、 铸型として配列番号 1の塩基配列を 有する DN A断片を用いた P CRにより調製され得る。 約 300 b p長の DNA 断片をプローブとして用いる場合、 ハイブリダィゼーシヨンの洗浄条件は、 例え ば、 50°C、 2 X S S C、 および 0. 1 %SDSを含む。
上記のようなヌクレオチドの置換、 欠失、 挿入、 または付加には、 例えば、 個 体における差異、 又はァスパラギン酸ァミノトランスフェラ一ゼを有する細菌の 種もしくは属における差異により、 天然に生じる変異 （ミュータントまたはパリ アント） も含まれる。 "― タンパク質をコードする DNAによる細菌の形質転換とは、 例えば、 通常の方 法により、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強し、 細菌細胞内 の同タンパク質の活性を増強するために、 前記 DN Aを細菌細胞へ導入すること を意味する。
遺伝子発現を増強させる方法には、 遺伝子コピー数を増加させる方法が含まれ る。 ェシエリヒア属細菌中で機能するベクターに遺伝子を導入することにより、 遺伝子のコピー数が増加する。 そのような目的のため、 低コピー数のベクタ一が 好適に用いられ得る。 低コピー数のベクター例としては、 pSC101、 PM 118, pMWl 19等が挙げられる。
また、 遺伝子発現の増強は、 例えば、 相同組換えなどの方法により、 細菌染色 体に遺伝子を多コピーで導入することによつても達成できる。 形質転換の方法と しては、 これまで報告されている公知のあらゆる方法を採用することができる。 例えば、 ェシエリヒア， コリ K- 12で報告されている、 受容菌細胞を塩化カルシ ゥムで処理し、 DNAの透過性を上昇させる方法 （Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) を採用することができる。
一方、 遺伝子発現の増強は、 本発明の DN Aを強力なプロモーターの制御下に 置くことによつても達成し得る。 例えば、 lacプロモータ一、 trpプロモ一夕一、 trcプロモータ一、 ラムダファージの PR、 PLプロモータ一は、 強力なプロモータ 一として知られている。 強力なプロモー夕一の使用は、 遺伝子コピー数の増幅と 組み合わせてもよい。
また、 例えば、 プロモーターの下流に位置する遺伝子の転写レベルを増加する ようにプロモーターに変異を導入することによつても、 プロモーターを増強する ことができる。 さらに、 リボソーム結合部位 （RB S) と開始コドンとの間のス ぺ一サ一領域のいくつかの塩基、 特に、 開始コドンのすぐ上流の塩基の置換が、 mRNA翻訳能に大きな影響を及ぼすことが知られている。 例えば、 開始コドンの前 の 3つのヌクレオチドの性質に応じて、 発現レベルが 2 0倍の範囲で変化するこ とが見い出されている （Gold et al. , Annu. Rev. Mocrobiol. , 35, 365-403, 1 981; Hui et aし， EMBO J" 3， 623-629, 1984) 。 本発明者らは、 以前に、 rhtA 23変異は、 AT G開始コドンからマイナス 1位における Gから Aへの置換である ことを示している （ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemist ry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457) 。 それによつて、 rhtA23 変異は、 rhtA遺伝子の発現を増強し、 その結果、 スレオニン、 ホモセリン、 およ び細胞外に輸送される他のいくつかの物質に対する耐性を増強することが示唆さ れる。
さらに、 細菌の染色体上のァスパラギン酸ァミノトランスフェラーゼ遺伝子の プロモーター領域に、 強力なプロモーターに改変されるような変異を導入しても よい。 発現調節配列の改変は、 例えば、 国際公開 W000/18935及び特公平卜 215280 に開示されているような、 温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にし て、 行うことができる。 ァスパラギン酸アミノトランスフェラ一ゼ遺伝子のコピ —数は、 細菌の染色体 DNAに、 ァスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝 子をマルチコピーで導入することによつても、 達成することができる。 ァスパラ ギン酸ァミノトランスフェラーゼ遺伝子をマルチコピーで細菌染色体に導入する には、 標的である染色体 DNA上に存在するマルチコピーの配列を利用した相同 組換えを行う。 染色体で上にマルチコピーで存在する配列としては、 転位因子の 末端に存在するインバ一テッドリピートを用いることができる。 また、 特開平 2- 109985に開示されているように、 ァスパラギン酸ァミノトランスフェラ一ゼ遺伝 子をトランスポゾンに組み込み、 それを転移させて染色体 DN Aに同遺伝子をマ ルチコピーで導入す'ることができる。
プラスミド DNAの調製、 DNAの消化とライゲーシヨン、 形質転換、 プライ マ一オリゴヌクレオチドの選択などの方法は、 当業者によく知られた通常の方法 で行うことができる。 これらの方法は、 例えば、 Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. , "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Editio n", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。
本発明の細菌は、 Lースレオニン生産能を元々有する細菌に、 前述の DNAを 導入することによって取得され得る。 あるいは、 本発明の細菌は、 すでに前記 D N Aを持つ細菌に、 Lースレオニン生産能を付与することにより取得され得る。 aspC遺伝子によりコードされるァスパラギン酸ァミノトランスフェラ一ゼの活 性が増強される親株としては、 ェシエリヒア， コリ VKPM B-3996株 （米国特許第 5, 175, 107号、 米国特許第 5， 705， 371号） 、 ェシエリヒア ' コリ NRRL- 21593株 (米国特許第 5， 939, 307号） 、 ェシエリヒア ·コリ FERM BP- 3756株 （米国特許第 5, 474,918号） 、 ェシエリヒア 'コリ FERM BP- 3519株および FERM BP- 3520株 （米 国特許第 5， 376， 538号） 、 ェシエリヒア 'コリ MG442 株 （Gusyatiner ei al., G enetika (in Russian), 14, 947-956 (1978)) 、 ェシエリヒア ' コリ VL643株及 び VL2055株 （EP 1149911 A) などの、 スレオニン生産性ェシエリヒア属細菌を用 いることができる。
B- 3996株は、 thrC遺伝子を欠損し、 スクロース資化性であり、 ilvA遺伝子にリ —キー変異を有している。 同株は、 スレオニン及びホモセリンに対する高度な耐 性に関与する rht遺伝子に変異を有している。 B- 3996株は、 スレオニンによるフ イードパック耐性が実質的に解除されたァスパル卜キナーゼ一ホモセリンデヒド 口ゲナ一ゼ Iをコードする変異型 thrA遺伝子を含む thrA*BCオペロンを RSF1010由 来のベクタ一に挿入することによって取得されたプラスミド pVIC40を保持してい る。 B- 3996株は、 1987年 4月 7日に、 Russian National Collection of Industria 1 Microorganisms (VKPM) (住所： Dorozhny proezd. 1， Moscow 113545, Russia n Federation) に、 B- 3996の受託番号で寄託されている。
本発明の細菌は、 aspC遺伝子に加えて、 以下の群から選択される 1または 2以 上の遺伝子の発現が増強されるようにさらに改変されていることが好ましい。
'スレオニンによるフィードバック阻害に耐性なァスパルトキナーゼーホモセ リンデヒドロゲナーゼ Iをコードする変異型 thrA遺伝子
•ホモセリンキナーゼをコードする、 thrB遺伝子
•スレオニンシンターゼをコードする thrC遺伝子
•膜貫通タンパク質と予想されるタンパク質をコードする rhtA遺伝子 前記細菌の最も好ましい態様は、 aspC遺伝子、 変異型 thrA遺伝子、 thrB遺伝子、 thrC遺伝子、 及び rhtA遺伝子の発現量が上昇するように改変された細菌である。 本発明の方法は、 本発明の細菌を培地で培養して、 培地中に Lースレオニンを 生成、 蓄積させ、 同培地から L—スレオニンを採取する、 Lースレオニンの製造 法を含む。 ' 本発明においては、 培養、 L一アミノ酸の培地からの採取および精製等は、 微 生物を用いてアミノ酸を生産する通常の発酵法と同様のやり方で行うことができ る。 培養に用いる培地は、 炭素源、 窒素源、 無機質、 及び、 必要に応じて微生物 が成育するために必要な適量の栄養分を含むものであれば、 合成培地または天然 培地のいずもでもよい。 炭素源としては、 グルコースおよびスクロースのような 種々の炭水化物、 および種々の有機酸が挙げられる。 用いる微生物の同化の形態 に応じて、 エタノールおよびグリセロールのようなアルコールも使用することが できる。 窒素源としては、 アンモニアおよび硫酸アンモニゥムのような種々のァ ンモニゥム塩、 ァミンのような他の窒素化合物、 ペプトン、 ダイズ水解物および 醱酵性微生物の消化物のような天然の窒素源が使用される。 無機物としては、 リ ン酸ーカリウム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガ ン、 塩化カルシウムなどが用いられる。 ビタミンとしては、 チアミン、 酵母抽出 物などが用いられる。
培養は、 振盪培養および通気撹拌培養のような好気的な条件下で、 温度は 2 0 から 4 0 °C、 好ましくは 3 0から 3 8 °Cの間で行うことが好ましい。 培養中の p Hは通常 5から 9、 好ましくは 6 . 5から 7 . 2の間である。 培養の p Hは、 ァ ンモニァ、 炭酸カルシウム、 種々の酸、 種々の塩基、 及び緩衝液で調整すること ができる。 通常、 1日から 5日間の培養で、 培養液中に Lースレオニンが蓄積す る。
培養の後に、 遠心分離や膜濾過により、 細胞のような固形物を培養液から取り 除き、 続いてイオン交換、 濃縮および結晶法により、 採取、 精製することができ る。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。 実施例 1 ェシェリヒア ' コリの aspC遺伝子の PMW1 1 9ベクターへのクローニング aspC遺伝子は、 配列番号 3及び 4に示すプライマーを用いた PCRにより、 ェシ エリヒア ·コリ K - 12株の染色体 DNAから取得した。 得られた DNA断片は、 制限酵素 PvuIIおよび Stulにより処理し、 予め制限酵素 HincII及び EcoRIで処理し た安定な低コピープラスミド PMW119 (PSC101レブリコン） に、 Pl acプロモーター の制御下となるように連結した。 こうして、 プラスミド pM-PR-aspCを構築した。 また、 aspC遺伝子を、 Pl acプロモーターの代わりに、 強力なラムダファージの Pr プロモーターの制御下に置いた。 Prプロモーターを含む二本鎖 DNAは、 配列表の 配列番号 5及び 6に示す化学合成した 5 ' —リン酸化ォリゴヌクレオチドを用い て作製した。 続いて、 この二本鎖 DNAを、 予め PvuII及び Hindlllで処理した pMW_P l ac-aspCプラスミドに連結した。 こうして、 pM_PR_aspCプラスミドを構築した。 これらのプラスミドを用いることにより、 aspC遺伝子を非制御、 かつ、 高レべ ルで発現させることができる。 プラスミド pMW-Pl ac- aspC及び pM_PR-aspCプラス ミド pM-PR- aspCは、 プラスミド PVIC40 (pRSFlOlOレブリコン） と和合性であるの で、 これらの 2つのプラスミド、 PVIC40および pMW- Pl ac- asp 又は pVIC40およ び pM- PR- aspCは、 細菌中で同時に維持され得る。
プラスミド pMW_Pl ac- aspC及び pM- PR- aspCは、 各々ストレプトマイシン耐性の スレオニン生産性ェシエリヒア · コリ B-3996株 （米国特許第 5， 175, 107号） に導 入された。 こうして、 B- 3996 (pMW_Pl ac- aspC)及び B-3996 (pM- PR- aspC)が得られ た。 実施例 2 スレオニン生産に対する aspC遺伝子増幅の効果
ェシエリヒア ' コリ B- 3996 (pMW - Pl ac_aspC)及び B - 3996 (pM - PR - aspC)を、 スト レプトマイシン （lOO^g/ml) を含む L一寒天プレート上で、 37°Cで 18〜24時間 培養した。 次いで、 一白金耳の細胞を、 下記組成の L—培地 50mlに移した： トリ プトン 10 g/l、 酵母抽出物 5 g/l、 NaCl 5 g/l。 振盪機 （240rpm) を用いて、 37 °Cで 5時間以内培養した細胞 （50ml、 OD540 : 2 o.u.) を、 450mlの発酵培地に接 種した。 1.0 L容量の研究用フアーメンターを用いて、 1200rpmで攪拌、 通気 （1/ 1 vvm) 下、 37ででバッチ発酵を行った。 pHは、 8 アンモニア水溶液を用いて、 自動的に 6.6に維持した。 結果を表 1に示す。 〔発酵培地の構成 （g/L) 〕
スクロ一ス 1 0 0. 0
NH4C 1 1. 7 5
KH2P 04 1. 0
Mg S〇4 · 7 H2O 0. 8
Figure imgf000015_0001
豆濃 （TN) 0. 1 5
B e t a i n e 1. 0
L—イソロイシン 0. 2 スクロースおよび硫酸マグネシウムは、 別個に滅菌した。 p Hは 6.6に調整し た'
Figure imgf000015_0002
産業上の利用の可能性
本発明により、 Lースレオニンを効率よく製造することができる,

Claims

請求の範囲
1. L—スレオニンを生産するェシエリヒア属する細菌であって、 ァスパラ ギン酸アミノトランスフエラーゼ活性が増強するように改変された細菌。
2. ァスパラギン酸ァミノ トランスフェラーゼ遺伝子の発現量が上昇するこ とによりァスパラギン酸ァミノ トランスフェラーゼ活性が増強された請求項 1に 記載の細菌。
3. ァスパラギン酸ァミノトランスフェラーゼ遺伝子のコピー数を上昇させ るか、 又は、 ァスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現が増強する ように同遺伝子の発現調節配列が改変されることにより、 ァスパラギン酸ァミノ トランスフェラーゼ活性が増強された請求項 1に記載の細菌。
4. 前記遺伝子を含む低コピー数ベクターによる前記細菌の形質転換により、 前記コピー数が上昇した請求項 3に記載の細菌。
5. 前記ァスパラギン酸ァミノ トランスフェラーゼ遺伝子がェシエリヒア属 細菌由来である請求項 2〜4のいずれか一項に記載の細菌。
6. 前記ァスパラギン酸アミノ トランスフェラーゼ遺伝子が、 以下の （A) または （B) のタンパク質をコードする請求項 5に記載の細菌：
(A) 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
(B) 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のァ ミノ酸の欠失、 置換、 挿入または付加を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 ァスパ ラギン酸ァミノ トランスフェラ一ゼ活性を有するタンパク質。
7. 前記ァスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子が、 以下の （a) または （b) の DN Aを含む請求項 5に記載の細菌：
(a) 配列番号 1の塩基番号 1〜 1 1 96の塩基配列を有する DN A；
(b) 配列番号 1の塩基番号 1〜 1 196の塩基配列、 又は同塩基配列から調製 され得るプローブと、 ストリンジェントな条件でハイブリダィズすることができ、 かつ、 ァスパラギン酸ァミノトランスフェラ一ゼ活性を有するタンパク質をコー ドする DNA。
8. 前記ストリンジェントな条件が、 1 X S S C、 0. 1 % SDSに相当 する塩濃度で、 6 0°Cで洗浄が行われる条件である、 請求項 7に記載の細菌。
9. スレオニンによるフィードバック阻害に耐性なァスパルトキナーゼ―ホ モセリンデヒドロゲナーゼ Iをコードする変異型 t h r A遺伝子、 ホモセリンキ ナーゼをコードする、 t h r B遺伝子、 スレオニンシンタ一ゼをコードする t h r C遺伝子、 及び、 膜貫通タンパク質と予想されるタンパク質をコードする r h t A遺伝子からなる群から選択される 1または 2以上の遺伝子の発現が増強され るようにさらに改変された請求項 1〜 8のいずれか一項に記載の細菌。
1 0. 変異型 t h rA遺伝子、 t h r B遺伝子、 t h r C遺伝子、 及び r h t A遺伝子の発現量が上昇するように改変された請求項 9に記載の細菌。
1 1. 請求項 1〜 10のいずれか一項に記載の細菌を培地中で培養して、 培地 中に L—スレオニンを生成、 蓄積させ、 同培地から Lースレオニンを採取するこ とを特徴とする Lースレオニンの製造法。
PCT/JP2003/002067 2002-02-27 2003-02-25 Procede de production de l-threonine a l'aide d'une bacterie appartenant au genre escherichia WO2003072786A1 (fr)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MXPA04008302A MXPA04008302A (es) 2002-02-27 2003-02-25 Procedimiento para producir l-treonina con el uso de bacterias que pertenecen al genero escherichia.
DE60320762T DE60320762D1 (de) 2002-02-27 2003-02-25 Verfahren zur produktion von l-threonin unter verwendung eines zur gattung escherichia gehörenden bakteriums
KR1020047013394A KR100976072B1 (ko) 2002-02-27 2003-02-25 에스세리키아속 세균을 사용하는 ｌ-트레오닌의 제조방법
JP2003571467A JPWO2003072786A1 (ja) 2002-02-27 2003-02-25 エシェリヒア属細菌を用いたｌ−スレオニンの製造法
EP03707063A EP1479775B1 (en) 2002-02-27 2003-02-25 Process for producing l-threonine with the use of bacterium beloniging to the genus escherichia
AU2003211697A AU2003211697A1 (en) 2002-02-27 2003-02-25 Process for producing l-threonine with the use of bacterium beloniging to the genus escherichia
US10/673,786 US20040132165A1 (en) 2002-02-27 2003-09-30 Method for producing L-threonine using bacteria belonging to the genus Escherichia

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2002104983/13A RU2244007C2 (ru) 2002-02-27 2002-02-27 Способ получения l-треонина, штамм escherichia coli - продуцент треонина (варианты)
RU2002104983 2002-02-27

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US10/673,786 Continuation US20040132165A1 (en) 2002-02-27 2003-09-30 Method for producing L-threonine using bacteria belonging to the genus Escherichia

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003072786A1 true WO2003072786A1 (fr) 2003-09-04

Family

ID=27764929

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/002067 WO2003072786A1 (fr) 2002-02-27 2003-02-25 Procede de production de l-threonine a l'aide d'une bacterie appartenant au genre escherichia

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20040132165A1 (ja)
EP (1) EP1479775B1 (ja)
JP (1) JPWO2003072786A1 (ja)
KR (1) KR100976072B1 (ja)
CN (1) CN1330763C (ja)
AT (1) ATE394476T1 (ja)
AU (1) AU2003211697A1 (ja)
DE (1) DE60320762D1 (ja)
ES (1) ES2305445T3 (ja)
MX (1) MXPA04008302A (ja)
RU (1) RU2244007C2 (ja)
WO (1) WO2003072786A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010092959A1 (ja) 2009-02-10 2010-08-19 協和発酵バイオ株式会社 アミノ酸の製造法

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5976843A (en) * 1992-04-22 1999-11-02 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of Escherichia coli BKIIM B-3996 as the producer of L-threonine
RU2212447C2 (ru) * 2000-04-26 2003-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты)
RU2229513C2 (ru) * 2001-11-23 2004-05-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
RU2245919C2 (ru) * 2002-09-06 2005-02-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислоты, штамм escherichia coli tdh7δ mlc::cat/pprt614-продуцент l-треонина
RU2273666C2 (ru) * 2003-02-26 2006-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот методом ферментации смеси глюкозы и пентоз
RU2276687C2 (ru) * 2003-07-16 2006-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-гистидина и способ получения l-гистидина
RU2276688C2 (ru) * 2003-08-29 2006-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia,- ПРОДУЦЕНТ L-ГИСТИДИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ГИСТИДИНА
US20050176033A1 (en) * 2003-11-10 2005-08-11 Klyachko Elena V. Mutant phosphoribosylpyrophosphate synthetase and method for producing L-histidine
RU2275424C2 (ru) * 2003-12-05 2006-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-треонина с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia
KR100608085B1 (ko) 2004-02-05 2006-08-02 씨제이 주식회사 ｔｙｒＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌 생성 미생물,그를 제조하는 방법 및 상기 미생물을 이용한Ｌ-쓰레오닌의 제조방법
US20050181488A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-18 Akhverdian Valery Z. Method for producing L-threonine using bacteria belonging to the genus Escherichia
US20050214913A1 (en) * 2004-03-16 2005-09-29 Marchenko Aleksey N Method for producing L-amino acids by fermentation using bacteria having enhanced expression of xylose utilization genes
US8003367B2 (en) * 2004-03-16 2011-08-23 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids by fermentation using bacteria having enhanced expression of xylose utilization genes
BRPI0509056A (pt) * 2004-03-31 2007-08-21 Ajinomoto Kk bactéria pertencendo ao gênero bacillus ou ao gênero escherichia, e, métodos para produzir um nucleosìdeo de purina, para produzir um nucleotìdeo de purina e para produzir ácido 5'-guanìlico
RU2004124226A (ru) 2004-08-10 2006-01-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Использование фосфокетолазы для продукции полезных метаболитов
US7915018B2 (en) * 2004-10-22 2011-03-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family
RU2004137198A (ru) * 2004-12-21 2006-06-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН yafA
RU2004137719A (ru) * 2004-12-23 2006-06-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
US7422880B2 (en) * 2005-01-19 2008-09-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family having a pathway of glycogen biosynthesis disrupted
EP1848810A1 (en) * 2005-02-18 2007-10-31 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family having expression of the bola gene attenuated
ATE417119T1 (de) 2005-02-18 2008-12-15 Ajinomoto Kk Verfahren zur herstellung einer nichtaromatischen l-aminosäure unter verwendung eines bakteriums der familie enterobacteriaceae mit abgeschwächter expression des csra-gens
EP1848811B1 (en) 2005-02-18 2009-08-05 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
DE602006004893D1 (de) * 2005-08-09 2009-03-05 Ajinomoto Kk VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINER L-AMINOSÄURE UNTER VERWENDUNG EINES BAKTERIUMS DER FAMILIE ENTEROBACTERIACEAE MIT ABGESCHWÄCHTER EXPRESSION DES ybiV-GENS
WO2007119574A2 (en) 2006-03-23 2007-10-25 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small rna
EP2007873B1 (en) * 2006-04-18 2015-11-18 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE
JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
EP2035569A1 (en) * 2006-06-01 2009-03-18 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of the rcsa gene
RU2337961C2 (ru) * 2006-07-04 2008-11-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН rspAB
JP5407858B2 (ja) * 2006-07-19 2014-02-05 味の素株式会社 腸内細菌科の細菌を用いたｌ−アミノ酸の製造方法
JP2010017081A (ja) * 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2008072761A2 (en) * 2006-12-11 2008-06-19 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an l-amino acid
RU2006143864A (ru) * 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
KR100850854B1 (ko) * 2006-12-13 2008-08-06 씨제이제일제당 (주) ｙｅｂＱ 유전자의 발현이 증가된 Ｌ-쓰레오닌 생산 미생물및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산 방법
KR100851745B1 (ko) * 2006-12-13 2008-08-11 씨제이제일제당 (주) ｙｄｊＫ 유전자의 발현이 증가된 Ｌ-쓰레오닌 생산 미생물및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산 방법
KR100850855B1 (ko) * 2006-12-13 2008-08-06 씨제이제일제당 (주) ｙｄｊＥ 유전자의 발현이 증가된 Ｌ-쓰레오닌 생산 미생물및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산 방법
RU2006145712A (ru) * 2006-12-22 2008-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной способностью к утилизации глицерина
JP2010110217A (ja) 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP5217780B2 (ja) * 2008-02-08 2013-06-19 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2515095C1 (ru) * 2012-11-19 2014-05-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") Бактерия рода escherichia - продуцент l-треонина и способ микробиологического синтеза l-треонина с ее использованием
KR101599802B1 (ko) * 2014-05-23 2016-03-04 씨제이제일제당 주식회사 세포내 에너지 수준이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 l-아미노산을 생산하는 방법
KR101704198B1 (ko) * 2015-05-14 2017-02-08 씨제이제일제당 (주) L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판의 제조 방법
CN104878051A (zh) * 2015-05-25 2015-09-02 天津科技大学 一种通过添加胆碱提高l-异亮氨酸发酵产量的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0116860A1 (en) * 1983-01-21 1984-08-29 The Nutrasweet Company The cloning and utilization of aminotransferase genes
WO1987000202A1 (en) * 1985-06-24 1987-01-15 The Nutrasweet Company Composite plasmids for amino acid synthesis
EP0219027A2 (en) * 1985-10-04 1987-04-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing amino acids
US4980285A (en) * 1984-10-04 1990-12-25 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids
US5175107A (en) * 1988-10-25 1992-12-29 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of escherichia coli bkiim b-3996 as the producer of l-threonine
WO1998004715A1 (en) * 1996-07-30 1998-02-05 Archer-Daniels-Midland Company Novel strains of escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production
US6004773A (en) * 1996-12-05 1999-12-21 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-lysine

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3823451C2 (de) * 1988-07-11 1997-02-20 Forschungszentrum Juelich Gmbh Rekombinante DNA, damit transformierte Mikrooganismen und Verwendung dieser Mikroorganismen zur Herstellung von L-Lysin mit Hilfe dieser Mikroorganismen
US5976843A (en) * 1992-04-22 1999-11-02 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of Escherichia coli BKIIM B-3996 as the producer of L-threonine
JP4032441B2 (ja) * 1995-08-30 2008-01-16 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造方法
RU2212447C2 (ru) * 2000-04-26 2003-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты)
RU2229513C2 (ru) * 2001-11-23 2004-05-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
RU2245919C2 (ru) * 2002-09-06 2005-02-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислоты, штамм escherichia coli tdh7δ mlc::cat/pprt614-продуцент l-треонина
RU2273666C2 (ru) * 2003-02-26 2006-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот методом ферментации смеси глюкозы и пентоз

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0116860A1 (en) * 1983-01-21 1984-08-29 The Nutrasweet Company The cloning and utilization of aminotransferase genes
US4980285A (en) * 1984-10-04 1990-12-25 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids
WO1987000202A1 (en) * 1985-06-24 1987-01-15 The Nutrasweet Company Composite plasmids for amino acid synthesis
EP0219027A2 (en) * 1985-10-04 1987-04-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing amino acids
US5175107A (en) * 1988-10-25 1992-12-29 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of escherichia coli bkiim b-3996 as the producer of l-threonine
WO1998004715A1 (en) * 1996-07-30 1998-02-05 Archer-Daniels-Midland Company Novel strains of escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production
US6004773A (en) * 1996-12-05 1999-12-21 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-lysine

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010092959A1 (ja) 2009-02-10 2010-08-19 協和発酵バイオ株式会社 アミノ酸の製造法
US9023622B2 (en) 2009-02-10 2015-05-05 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Method for producing L-amino acid using a microorganism with decreased aspartate aminotransferase activity

Also Published As

Publication number Publication date
ATE394476T1 (de) 2008-05-15
ES2305445T3 (es) 2008-11-01
CN1639341A (zh) 2005-07-13
MXPA04008302A (es) 2004-11-26
AU2003211697A1 (en) 2003-09-09
EP1479775A4 (en) 2006-04-26
KR100976072B1 (ko) 2010-08-17
EP1479775B1 (en) 2008-05-07
CN1330763C (zh) 2007-08-08
JPWO2003072786A1 (ja) 2005-06-23
KR20040088556A (ko) 2004-10-16
RU2244007C2 (ru) 2005-01-10
US20040132165A1 (en) 2004-07-08
DE60320762D1 (de) 2008-06-19
EP1479775A1 (en) 2004-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100976072B1 (ko) 에스세리키아속 세균을 사용하는 ｌ-트레오닌의 제조방법
US7186531B2 (en) L-threonine producing bacterium belonging to the genus Escherichia and method for producing L-threonine
EP2818556B1 (en) Method for producing a basic substance
EP1720993B1 (en) Method for producing l-threonine using bacteria belonging to the genus escherichia
US7618803B2 (en) Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia
KR101537508B1 (ko) Ｌ-리신의 제조법
EP1856269B1 (en) A METHOD FOR PRODUCING A NON-AROMATIC L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY HAVING EXPRESSION OF THE csrA GENE ATTENUATED
US20040229320A1 (en) Method for procucing L-amino acid using bacterium, belonging to the genus Escherichia, lacking active mlc gene
EP2089528B1 (en) A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the genus escherichia with attenuated expression of any of the cynt, cyns, cynx or cynr genes or a combination thereof
EP2185683B1 (en) Method for producing l-threonine using bacterium of enterobacteriaceae family, having attenuated expression of the yahn gene
EP1838850B1 (en) A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family having a pathway of glycogen biosynthesis disrupted
JP2009507505A (ja) 微生物を使用するアミノ酸産生法
KR101117513B1 (ko) 에스케리치아 속에 속하는 ｌ-트레오닌 생산 세균 및ｌ-트레오닌의 생산 방법
US20050106688A1 (en) Method for producing L-amino acid
MXPA06006334A (en) L-threonine producing bacterium belonging to the genus escherichia and method for producing l-threonine
VERFAHREN et al. ENTEROBACTERIACEAE FAMILY HAVING EXPRESSION OF THE csrA GENE ATTENUATED

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10673786

Country of ref document: US

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003707063

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: PA/a/2004/008302

Country of ref document: MX

Ref document number: 2003571467

Country of ref document: JP

Ref document number: 1020047013394

Country of ref document: KR

Ref document number: 20038046830

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020047013394

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003707063

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 2003707063

Country of ref document: EP