JPH09511406A

JPH09511406A - 異化代謝産物非抑制性の基質限定性酵母菌株

Info

Publication number: JPH09511406A
Application number: JP8516168A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ドミンゲス，デビッド
Original assignee: ザピルスバリーカンパニー
Priority date: 1994-11-08
Filing date: 1995-11-07
Publication date: 1997-11-18
Also published as: CA2178508A1; EP0738318B1; BR9506461A; HK1012410A1; US5744330A; CN1140469A; DE69533158D1; EP0738318A1; MX9602665A; WO1996015221A1; ES2224141T3; CA2178508C; DE69533158T2; ATE269400T1

Abstract

(57)【要約】本発明はグルコースの存在下で炭水化物供給源としてガラクトースのみを利用することができる属種がサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）である酵母細胞を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】異化代謝産物非抑制性の基質限定性酵母菌株本出願は、係属している米国特許出願第０７／８２９４５３号の一部継続出願である１９９３年１０月２７日に出願された係属している米国特許出願第０８／１４４２３６号の一部継続出願である。本出願はまた、係属している米国特許出願第０８／０２６９２７号の一部継続出願である１９９３年７月２日に出願された係属している米国特許出願第０８／０８７６１６号の一部継続出願である。出願番号０７／８２９４５３号および０８／０２６９７７号は米国特許出願第０７／７３２０８１号の一部継続出願であり、今は放棄されている。発明の背景本発明はグルコースの存在下で炭水化物供給源としてガラクトースのみを利用する酵母細胞に関する。慣用の酵母細胞は該酵母細胞が種々の糖を代謝可能であるようにする活性化し得る酵素を有する。糖はグルコース、マルトースおよびガラクトースを包含する。酵素の活性の制御は酵素活性の選択的活性化および抑圧に基づいている。グルコース以外の糖の代謝を補助する酵素の活性は、酵母細胞のための炭水化物供給源としてグルコースを含有する培地中で酵母細胞を増殖させる場合に抑制される。酵素活性の抑圧は２つのメカニズムのうちの１つにより生じる。第１のメカニズム、グルコース不活性化はタンパク質の修飾および／または変性によりいくつかの酵素およびその他のタンパク質の機能を迅速に阻害する。第２のメカニズム、グルコース抑制は、酵素を作ったり、また転写レベルで酵素活性を制御する多くの遺伝子の発現を低下させる。酵母細胞におけるグルコース抑制は大腸菌において「異化（代謝）産物抑制」と命名される代謝プロセスに類似している。「異化（代謝）産物抑制」という用語は、Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．26: 249(1962)所収の“Catabol ite repression”にB．Magasanicにより記載されるように遺伝子転写の抑制がグルコース自体によりそれほど引き起こされないが、グルコース異化代謝産物により引き起こされるという確信を反映している。本願において、「グルコース抑制」という用語は「異化産物抑制」と互いに同じ意味で使用される。非常に多くの酵母細胞遺伝子の発現はグルコース抑制に晒される。しかしながら、グルコース抑制の程度は遺伝子毎に異なる。例えば、ガラクトース利用に包含される遺伝子、ガラクトース遺伝子（ＧＡＬ遺伝子）の発現はグルコースにより少なくとも１０００倍抑制される。マルトース代謝に包含される遺伝子、マルトース遺伝子の発現はM．Johnston 等によりThe Molecular and Cellular Biolo gy of the Yeast Saccharomyces（1992）の 226頁に記載されるように約１５倍抑制される。グルコースはＧＡＬ遺伝子の発現に２つの作用を有すると考えられる。第１の作用はガラクトースをベースとする基質培地へのグルコースの添加がガラクトース富化培地で増殖する酵母培養体にほぼ完全ではあるが一時的なＧＡＬ遺伝子発現の抑制を引き起こすというものである。第２の作用は、文献“Identification of glucokinase in Saccharomyces cerevisiae: Kinet ics of induction and glucose effects”，J．Bacteriol III: 308(1972)にAda ms により記載されるように、ＧＡＬ酵素合成が低下した速度で実質的に再開するものである。グルコース抑制のために、The Molecular and Cellular Biology of the Yeas t Saccharomyces(1992)にE．Jones等により記載されるように、慣用の酵母培養体はバッチ培養液中、３相でグルコース上に増殖する。増殖の第１または急速相において、グルコースは遺伝子発現の同時に起こるグルコース抑制を伴って発酵される。グルコースが消尽される直前に、培養体は第２の増殖相に入り、その相の間、グルコース抑制遺伝子が抑制解除（脱抑制）になり、グルコース利用の間に蓄積するエタノール異化産物の引き続く酸化に培養体を適合させる。いくつかの酵素の合成の脱抑制はグルコース消尽の十分前に開始し、そしてエタノール上での増殖の間に最大レベルに達する。第３または最終相での増殖は遅く、そして利用可能なエタノールの消尽と共に終了する。通常、酵母菌株の幅広い適合性および有用性の故に、酵母菌株が複雑な栄養基質に暴露される場合、特定の酵母菌株の挙動を予測することはかなり困難であった。一方、酵母菌株が炭水化物、例えばガラクトースに対する嗜好を有するかもしれないけれども、ガラクトースに対する酵母菌株の嗜好は、酵母がある濃度のグルコースを有する基質に暴露された時、漸減する。グルコースの単なる存在はガラクトース代謝を抑制する傾向がある。酵母菌株はあらゆる炭水化物の利用が全く防止され得る。また、酵母菌株はグルコース代謝に復帰し得る。発明の要約本発明はグルコースの存在下で炭水化物供給源としてガラクトースのみを利用することができる属種サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisi ae）の酵母細胞を包含する。本発明はまた、栄養マトリックス中に少なくとも約６重量％の濃度のエタノールに対する許容性を有する酵母細胞を包含する。本発明はさらに、プロテイナーゼＡおよびプロテイナーゼＢおよびカルボキシペプチダーゼＹの酵素活性が実質的にない酵母細胞を包含する。図面の説明図１は候補体である異化代謝産物非抑制性ＣＡＴ−半数体酵母菌株に対するパン生地（ドウ，dough）の膨化(プルーフ，proof)時間を示すグラフである。図２はＣＡＴ−グルコース基質限定性ＧＳＬ菌株１、２、３および４および非ＣＡＴ制御菌株に対する、各酵母菌株の培養物の６００ナノメーター（ｎｍ）での吸光度により測定される増殖速度を示すグラフである。図３はＣＡＴ−ＧＳＬ菌株６、７、８および９および対照菌株に対する、各酵母菌株の培養物の６００ｎｍでの吸光度により測定される増殖速度を示すグラフである。図４はＣＡＴ−ＧＳＬ菌株１０、１２、１５および１６および対照菌株に対する、各酵母菌株の培養物の６００ｎｍでの吸光度により測定される増殖速度を示すグラフである。図５はＣＡＴ−ＧＳＬ菌株１７、１８、１９および２０および対照菌株に対する、各酵母菌株の培養物の６００ｎｍでの吸光度により測定される増殖速度を示すグラフである。図６はＣＡＴ−ＧＳＬ菌株２４、２３、２７および３５および対照菌株に対する、各酵母菌株の培養物の６００ｎｍでの吸光度により測定される増殖速度を示すグラフである。図７はＣＡＴ−ＧＳＬ菌株３６、３７、４０および４１および対照菌株に対する、各酵母菌株の培養物の６００ｎｍでの吸光度により測定される増殖速度を示すグラフである。図８は二倍体１０×５４酵母の３種の増殖培地上での、各酵母菌株の培養物の６００ｎｍでの吸光度により測定される増殖速度を示すグラフである。好ましい態様の詳細な説明本発明はグルコースの存在下で炭水化物供給源としてガラクトースのみを利用する属種サッカロミセス・セレビシアエの二倍体酵母細胞を包含する。本発明の酵母菌株を用いて製造された栄養マトリックス、例えばパン生地は唯一の炭水化物供給源としてガラクトースを利用する慣用の酵母、ＧＡＬ＋酵母を用いて製造されたパン生地に対する約２分の１である時間以内に制御可能に膨化され得る。生地を制御可能に膨化する能力は生地が密閉容器、例えばボール紙カン内に充填される場合に特に重要である。１つの態様において、本発明のガラクトース利用性酵母菌株はまた、慣用のパン酵母またはＧＡＬ＋酵母のいずれかのエタノール許容性に比べ、より大きいエタノールに対する許容性を有する。ガラクトース利用性酵母細胞はパン生地、特に冷蔵可能なパン生地の膨張（発酵，leavening）および膨化（proofing）における用途を有する。酵母のエタノール許容性はまた、酵母で製造されたパン生地の膨化時間を短縮する。ガラクトース利用性酵母細胞はまた、食品廃棄物加工における用途を有する。チーズ製造は、実質的にラクトースと水である大量のホエー（乳漿，乳清）を生じる。慣用のプロセスは酵母を用いラクトースをグルコースとガラクトースに加水分解し、さらにそれらはエタノールに加水分解される。慣用の酵母細胞はガラクトースよりグルコースを優先的に発酵する。結果的にガラクトースはプロセスの２次的最終製品である。本発明の酵母細胞は、グルコースをそのまま残し、ガラクトースをエタノールに選択的に変換するために使用され得、また、慣用の細菌株と組み合わせてグルコースとガラクトースを同時にエタノールに変換するために使用され得る。１つのその他の態様において、本発明の酵母細胞は慣用の酵母細胞と比較して減少されているプロテイナーゼ活性をさらに包含する。酵母細胞はプロテイナーゼＡ、プロテイナーゼＢおよびカルボキシペプチダーゼＹの活性が実質的にないので、プロテイナーゼ活性が低下されている。これらの酵素活性の消失は慣用の酵母細胞に比し後溶菌タンパク質分解活性の９０％低下を結果として生じた。酵母細胞のこの性質は該酵母細胞を例えば冷蔵可能な生地の膨張および膨化における用途により適するものとする。プロテイナーゼはパン生地構造におけるグルテンマトリックスを分解し、液体のシロップ状物への生地の全体的分解を引き起こす。酵母細胞中のプロテイナーゼ活性を低下させることにより、細胞溶菌の際に生地中に放出される酵素を減少させるだけでなく、生地膨化時間がＧＡＬ＋酵母を有する生地に比べ約５０％短縮される。発酵に包含されるタンパク質は通常の細胞制御の間のように分解されないと考えられている。「慣用の酵母」とはグルコース、ガラクトース、マルトースおよびフルクトースを包含する炭水化物を代謝し得る属種サッカロミセス・セレビシアエの酵母細胞を意味する。グルコース以外の炭水化物の代謝を行う酵素の活性は、慣用の酵素がグルコースを含有する培地中で増殖される場合に低下される。１つの慣用の酵母はパン酵母である。慣用のガラクトース基質限定性（ＧＳＬ）酵母は、グルコースの存在下でガラクトースを実質的に発酵できないガラクトース基質限定性酵母を意味する。本発明の酵母細胞は純粋なガラクトースならびに加水分解されたラクトースの基質を利用することができる。上記したように、本発明の酵母細胞の前に、ガラクトース基質限定性（ＧＳＬ）酵母菌株等を包含する多くの酵母は大量のグルコースに暴露されると代謝的に損なわれた。結果として、酵母菌株はラクトース誘導基質、例えば加水分解ラクトースシロップ中に存在するガラクトースを有効に代謝することができなかった。この欠点はグルコース誘導異化産物抑制に起因すると考えられている。ＧＡＬ基質限定性酵母菌株の代謝損傷はいくつかの因子によっていた。第１の因子は異化産物酵素の合成の抑制および／または異化産物酵素のタンパク質分解である。代謝損傷に対する第２の因子はミトコンドリア構造の分解に起因していた。第３の因子は第１の因子と第２の因子との組合せである。代謝損傷の全体の作用は酵母細胞が、グルコース濃度がある重要なレベルより下に下降するように十分なグルコースが代謝されるまで、グルコース以外の糖を二酸化炭素に有効に変換できなかったことである。ガラクトース基質限定性酵母菌株はグルコースを代謝することができない。従って、グルコースおよびグルコース異化産物の存在下で、ＧＡＬ基質限定性酵母菌株は代謝を停止する。ここで、本発明のＧＡＬ基質限定性酵母菌株がグルコースの存在下で異化代謝産物抑制を示さないということは、慣用のＧＡＬ基質限定性酵母に比べ大きな改良である。本発明の二倍体酵母細胞は、選択された半数体（単相体）酵母細胞の交雑、酵母コロニー中で酵母細胞の胞子形成を促進する条件の作成、酵母コロニーの単離、所望の特徴に対する酵母コロニーから酵母試料のスクリーニングおよび選択されたコロニーの増殖による酵母菌株の作成、該菌株から二倍体酵母細胞の作成および栄養マトリックス、例えばパン生地中での二倍体酵母細胞の評価の工程を包含する方法により創製される。典型的には、７００種の半数体酵母の候補体から２種の酵母菌株が栄養マトリックス中での評価のために最終的に選択される。本願の場合、３種の酵母菌株がガラクトース基質限定的特異性および非復帰の優れた保存を有することが見出されている。二倍体菌株が遺伝物質の量の倍化のために、より強靭であるので、本発明において二倍体酵母菌株が半数体菌株より好ましい。二倍体酵母菌株は一般に半数体酵母菌株に比べより迅速に増殖し、そして二酸化炭素を発生する。相補性が二倍体菌株における遺伝子発現の保存を高め、そしてそれらを強靭にする。二倍体菌株はまた、半数体酵母菌株に比べ、より有効に商業的に製造され、そしてより迅速にパン生地を膨化する。本発明の二倍体酵母菌株は以下の実施例に記載されるように創製される。これらの実施例は本発明の種々の態様を例示するために提示されるものであり、そして本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用されるように、Ｄ３０８．３菌株は色がピンクのコロニーであり、アデニン突然変異を有するサッカロミセス・セレビシアエの半数体ガラクトース基質限定性（ＧＳＬ）菌株を意味する。菌株ＭＳＬ．１はＤ３０８．３の非アデニン要求復帰変異体である。この菌株のコロニーはピンクではない。菌株ａ／αＧＳＬ♯３３は二倍体ＧＳＬ菌株である。菌株ＧＳＬ♯３３はＧＳＬである半数体菌株である。菌株ＣＡＴ−１５は異化産物非抑制性である半数体ＧＳＬ菌株であり、そして加水分解されたラクトースシロップを発酵することができる。菌株１０×５４は異化産物非抑制性である二倍体ＧＳＬ菌株である。菌株ＣＡＴ −１５および１０×５４は加水分解されたラクトース基質を含有する生地を膨化する能力を有する。菌株ＭＳＬ．１およびａ／αＧＳＬ♯３３は加水分解されたラクトースシロップ上で有効に発酵および増殖することができない。菌株Ｄ３０８．３は米国メリーランド２０８５２，ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９３年３月５日に寄託され、そして受託番号７４２１１を有する。この寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って行われた。実施例Ｉ半数体菌株ＭＳＬ．１およびＧＳＬ♯３３を、グルコースおよびガラクトースを含有する培地上で増殖させた。上記のようにＭＳＬ．１およびＧＳＬ♯３３の野生型酵母菌株はラクトースを代謝することができなかった。異化産物非抑制性半数体酵母菌株を上記したようにこれらの菌株から培養した。要求される材料は対応する遺伝子型を有する以下の酵母菌株を包含する：酵母菌株遺伝子型ＭＳＬ．１ hxk1 hxk2 glk1 trp1 his2 met14 ａＧＳＬ♯３３ hxk1 hxk2 glk1 met14 his2 lys2^* ^* 種々の欠落培地プレートでの増殖性に基づいた遺伝子型および親菌株の遺伝子型。酵母抽出ペプトン培地（ＹＥＰ）およびガラクトースの５０ｍｌｓの量が２つのオートクレーブされた培養フラスコに注がれた。１つのフラスコに単離された酵母菌株ＭＳＬ．１のコロニーが接種され、他方のフラスコに単離された酵母菌株「ａ」ＧＳＬ♯３３のコロニーが接種された。接種後の培養液は３０℃シェーカーインキュベーター内に置かれ、そして震盪させながら保温された。ＭＳＬ．１培養液は４８時間保温され、活性に欠ける「ａ」ＧＳＬ♯３３試料は７２時間保温された。保温期間に引続き、上記酵母培養液の１０^ー1、１０^ー2、１０^-3および１０^-4希釈物１００マイクロリットルの量が以下のアガー組成を有する６０％グルコース／４０％ガラクトースＹＥＰプレート上に広げてプレーティングされた：６０％グルコース／４０％ガラクトースＹＥＰアガーバクト−イースト（１％）１０グラムバクト−ペプトン（２％）２０グラムグルコース（１．２％）１２グラムガラクトース（０．８％）８グラムバクト−アガー（２％）２０グラム蒸留水１０００ｍｌさらに、各培養液の１０^ー5ないし１０^ー8希釈物がＹＥＰ培地およびガラクトース含有培地上にそれぞれ広げてプレーティングされた。全てのプレートが３０℃ で保温された。酵母コロニーが数えられた。滴定結果は、ＭＳＬ．１培養液が約１．３×１０⁸ ＣＦＵ／ｍｌの細胞密度を有し、そして「ａ」ＧＳＬ♯３３の密度が約６×１０⁷ ＣＦＵ／ｍｌに等しいことを示した。候補体異化産物非抑制性（ＣＡＴ−）復帰変異コロニーは６０％グルコース／４０％ガラクトースプレート上で活発に増殖し、代謝的に損傷のある「野生」型対照コロニーは判然としない薄いフィルムとして現れた。３０℃での約５日間の保温の後、全体で８２の可能性のあるＭＳＬ．１および６８の「ａ」ＧＳＬ♯３３ＣＡＴ−コロニーが６０％グルコース／４０％ガラクトースＹＥＰ選択プレートから単離された。ガラクトース基質限定性であるが、異化産物抑制性ではないコロニーから、もはやガラクトース基質限定性ではない復帰変異コロニーを分離するために、全ての候補体ＣＡＴ−ＧＳＬ菌株がデキストロースを有する酵母抽出ペプトン培地（ＹＥＰＤ培地）および６０％グルコース／４０％ガラクトースＹＥＰ培地を含有するプレート上で格子状にプレーティングされた。プレートは３０℃で約１週間保存された。プレーティングされた６８の「ａ」ＧＳＬ♯３３ＣＡＴ−候補体のうち、４３が６０％グルコース／４０％ガラクトースＹＥＰプレート上で増殖したが、ＹＥＰＤプレート上では増殖し得なかった。これらの酵母コロニーはＣＡＴ−ＧＳＬ酵母菌株であると考えられた。残りの２４のコロニーはＹＥＰＤ上で容易に増殖し、そしてもはやガラクトース基質限定性であるとは考えられなかった。候補体ＭＳＬ．１ＣＡＴ−コロニーの中でＣＡＴ−であると明らかにされたものはなかった。試験された全ての候補体は６０％グルコース／４０％ガラクトースおよびＹＥＰＤ培地上で同様に十分に増殖した。４３のＣＡＴ−ＧＳＬ候補体が液体培地炭水化物利用性に対して試験された。単離された推定上のＣＡＴ−ＧＳＬコロニーの非抑制の程度、コロニーが無糖液体ＹＥＰ、ＹＥＰＤ培地、ＹＥＰＤおよびガラクトース培地、そしてＹＥＰおよび５０％グルコース／５０％ガラクトース液体培地中で増殖する能力もまた評価された。ＹＥＰおよびガラクトース１０ｍｌｓを含有する試験管試料に候補体のＣＡＴ −ＧＳＬ酵母ペーストの単離コロニーが接種された。試料は次にシェーカーインキュベーター中３０℃で震盪させながら約２４時間保温された。対照「ＧＳＬ♯ ３３およびＧＳＬ♯３３」α／Ａ試料もまたＹＥＰおよびガラクトース培地中で調製された。保温期間に引続き、無糖ＹＥＰ培地、ＹＥＰＤ培地、ＹＥＰおよびガラクトース培地、およびＹＥＰおよび５０％グルコース／５０％ガラクトース培地１０ｍｌｓを含有する試験管試料に評価される各菌株の対数期出発物（スターター）１００マイクロリットルが接種された。接種に引続き、吸光度測定が各試料に対し６００ナノメーター（ｎｍ）で分光計により、３０℃インキュベーター中に試料を入れる前に行われた。吸光度測定は酵母増殖の定量のために９日間にわたって記録された。評価された４３のＣＡＴ−ＧＳＬ候補体のうち約２４が、二倍体対照ａＧＳＬ♯３３または半数体ＭＳＬ．１親ＧＳＬ菌株のいずれよりも、５０％グルコース／５０％ガラクトース液体培地上で急速かつ活発に増殖することが明らかだった。２４の候補体は以下のように命名された：ＣＡＴ−ＧＳＬ♯１，２，３，４，６，７，８，９，１０，１２，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２４，２６，２７，３５，３６，３７，４０および４１。別の２つの候補体２３および２５はまた、より高い増殖能を示した。これらの菌株の増殖速度は図２−７に示されている。速度は分あたりのガス発生０．０２５ｍｌｓの最も近い値に対して概数で示されている。プロットは図２ないし７に示されている。これらの候補体はパン生地における挙動がスクリーニングされた。スクリーニング試験は、各酵母菌株がパン生地を膨張および膨化させる能力を評価するためのリソグラフガス発生試験を包含していた。候補体の酵母菌株で膨張および膨化させたパン生地からのリソグラフガス発生および生地生成物膨化時間試験は、ＣＡＴ−ＧＳＬ酵母菌株の多くが二倍体対照酵母または親の半数体ＧＳＬ酵母菌株のいずれよりも、より高い速度での二酸化炭素を発生し、そして顕著に多い全二酸化炭素を製造することを示した。ＣＡＴ−ＧＳＬ酵母菌株がグルコースの存在下に有効にガラクトースを代謝したことは、食品規格の加水分解ラクトースシロップを用いるＧＳＬ酵母混合生地製品の膨化において特に重要である。上で命名された２６の酵母コロニーはパン生地の膨張および膨化における挙動がスクリーニングされた。下の表１には候補体酵母菌株を用いて製造されたパン生地の膨化時間、ガス発生速度、全ガス発生量および細胞収量をまとめて示す。表１はスクリーニング試験においてその他の候補体よりすぐれ、そして対照ａ／αＧＳＬ♯３３よりすぐれていた５−７菌株を各カテゴリーに示す。表２は各候補体菌株が表１に記載されるような最も好ましい性能範囲を示した頻度を示す。記号は膨化時間（Ｐ）、ガス発生速度（Ｒ）、全ガス発生量（Ｔ）および収量（Ｙ）を示す。表１および２に示されるように、いくつかの菌株が１より多い基準においてすぐれていた。ＣＡＴ−３７が４種全ての基準を満たし、そしてＣＡＴ−２およびＣＡＴ−１５が３種の基準において成功した。これらの基準のうち、膨化時間はパン生地の性能を決定するのに最も重要だった。ＣＡＴ−１０は膨化時間においてのみすぐれていた。この表の菌株のいくつかは異化産物非抑制性のＧＳＬ二倍体酵母菌株を創製するための交雑プロトコルにおいて後に用いられた。図１は試験された全ての菌株の生地膨化時間を示す棒グラフである。対照菌株ａ／αＧＳＬ♯３３が６．６時間という最長の膨化時間を有していた。全ての候補体が対照菌株よりすぐれていたということは、これらの候補体が実際に異化産物非抑制性であったことを示す。最短の膨化時間を有する候補体はＣＡＴ−１０、ＣＡＴ−１５、ＣＡＴ−１、ＣＡＴ−３７およびＣＡＴ−４０であった。ＣＡＴ−１０およびＣＡＴ−１５は膨化時間が対照酵母の約半分だった。候補体はまた二酸化炭素産生に対して試験された。候補体は粉（小麦粉）および水と混合されパン生地が製造された。ＣＡＴ−１５およびＣＡＴ−３７は考慮された全ての菌株の中で最大の二酸化炭素産生速度を有していた。菌株ＣＡＴ− ２５、ＣＡＴ−２４、ＣＡＴ−２３、ＣＡＴ−２およびＣＡＴ−１２は菌株ＣＡＴ−１５およびＣＡＴ−３７の速度よりわずかに低い二酸化炭素産生速度を有していた。パン生地中の全ガス発生量における最も好ましい候補体は最良の二酸化炭素発生速度を有する候補体と常に一致するわけではなかった。上位６種の全ＣＯ₂発生体のうち、ＣＡＴ−３７、ＣＡＴ−２およびＣＡＴ−１５のみがすぐれたＣＯ₂ 発生速度を有していた。パン生地におけるＣＡＴ−菌株のガス発生量は慣用のパン酵母により生じる全ガス量および速度に比べ実質的に低かった。このことは冷蔵可能なパン生地の製造に使用される酵母菌株の望ましい性質である。それは酵母菌株が生地を貯蔵する容器を破壊することなしに容器内で生地を膨張および膨化させるために使用されることを可能にする。細胞収量に関し、全てのＣＡＴ−候補体はａ／αＧＳＬ♯３３対照菌株に比べより低い収量だった。これはａ／αＧＳＬ♯３３が二倍体菌株であり、試験された全てのその他の菌株が半数体菌株であることによると考えられる。二倍体菌株が１つではなく２コピーの遺伝情報を有するので、ａ／αＧＳＬ♯３３酵母細胞はより迅速に増殖することができた。相補性および栄養要求変異性マーカーの存在が半数体菌株に対して二倍体対照の増殖速度を高めた。半数体菌株の中には、リットルあたりほぼ２０グラムであるいくつかの菌株があった。これは一般に高い収量だった。実施例II プロテイナーゼ欠損突然変異がガラクトース基質限定性（ＧＳＬ）酵母菌株に導入された。プロテイナーゼ欠損酵母菌株、α ｐｅｐ♯４−３が実施例１に記載された半数体ＧＳＬ酵母菌株ａＧＳＬ♯３３ＣＡＴ−１０に成功裏に交雑された。この交雑から得られたヘテロ接合性倍数体コロニーが胞子形成培地上にプレーティングされた。半数体胞子生成コロニーが単離された。半数体コロニーはガラクトース基質限定、すなわちグルコースではなくガラクトース上での増殖、および異化産物非抑制、すなわちグルコースの存在下で増殖する能力がスクリーニングされた。全部で７３の半数体ＧＳＬ異化産物非抑制性（ＣＡＴ−）候補体が単離された。この半数体候補体はＰＥＰ♯４−３突然変異がスクリーニングされた。プロテイナーゼＡ活性に対するアッセイおよびプロテイナーゼＢ活性に対する第２のアッセイが半数体候補体のスクリーニングのために使用された。半数体菌株は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９４年１１月７日に寄託され、そして受託番号７４３０６、７４３０７および７４３０９を有する。実施例III 倍数体ＧＳＬ／ＣＡＴ−酵母菌株の創製のためのＧＳＬ／ＣＡＴ−半数体酵母候補体の単離において、低温感受性突然変異を有する酵母菌株１ｔｓ♯８がＧＳＬ半数性候補体プールの中にα交雑型遺伝子を導入するために使用された。全部で３６の半数体ＧＳＬ／ＣＡＴ−候補体菌株が単離された。１０の半数体菌株が十分に低温感受性であることが判明した。これらの菌株は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。上記菌株は以下のようなＡＴＣＣ受託番号およびかっこ内の同定番号を有し、１９９２年１月３１日に寄託された：７４２１３（ｃｄｃ１９），７４１２４（ＸＡ６−９Ｃ−ｌｔｓ１），７４１２５（ＡＸＣ−９４Ｂ−ｌｔｓ２），７４１２６（ＸＡ７７−３４Ｂ−ｌｔｓ３），７４１２７（ＸＡ９９−１３Ｃ−ｌｔｓ４），７４１２８（ＸＡ９８−３Ｄ−ｌｔｓ５），７４１２９（ＸＡ８８−３Ａ−ｌｔｓ６），７４１３０（ＸＡ８９−２Ａ−ｌｔｓ７）および７４１３１（ＸＡ３３−５Ａ−ｌｔｓ８）。実施例IV 慣用のパン酵母培養物を用いて製造されたパン生地は典型的には、乳酸菌増殖を阻害し、生地カン圧を安定化し、そして生地内の流動学的な保存寿命変化を最低限に抑えるために生地に少なくとも２％のエタノールが添加されている。不都合なことに、エタノールはまた酵母の増殖およびガス産生を阻害する。ＧＳＬ菌株がエタノール許容性を示す冷蔵可能な生地用に単離された。この単離は６％エタノールの存在下に増殖した安定期培養物から得られる生酵母コロニーの連続的な単離および再接種により行われた。上記単離は単離されたコロニーがより高いエタノール許容性であればあるほど、そのコロニーがエタノールの存在下でより速く増殖するであろうという前提に基づいている。２つの可能性のあるエタノール許容性候補体が単離され、そして冷蔵生地系において試験された。結果はエタノール許容性コロニーが実施例５に記載される親の１０×５４酵母菌株に比べより迅速に生地試料を膨化することができることを示した。膨化時間は２分の１の１時間まで短縮された。エタノール許容性コロニーの１つＥ３５♯１は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された。この寄託は１９９４年１１月７日に行われ、そして受託番号７４３１０を有する。実施例Ｖ可能な最も代謝的に強靭なＧＳＬ／ＣＡＴ−倍数体酵母菌株を創製するために、ＹＥＰ（無糖）培地、ＹＥＰＤ培地、ＹＥＰ＋ガラクトース培地、および５０／５０モル％ガラクトース／グルコースＹＥＰ液体培地上での増殖に対する推定上の半数体ＧＳＬ／ＣＡＴ−酵母菌株のスクリーニングが行われた。５０／５０ガラクトース／グルコース培地上で最も容易に増殖することが見出された半数体酵母菌株が倍数体ＧＳＬ／ＣＡＴ−酵母菌株を創製するために交雑された。候補体の倍数体ＧＳＬ／ＣＡＴ−菌株の二酸化炭素を発生する能力および冷蔵可能生地を膨化させる能力が評価された。最も有効な菌株がさらに分析された。有効な半数体菌株には以下のものが包含される：ａＧＳＬ３３ＣＡＴ−（ａ．ｋ．ａ．３３）♯：１，２，３，４，６，７，８，９，１０，１２，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２４，２５，２７，２９，３１，３２，３３，３５，３６，３９，４０，４１ａＧＳＬ３３ＣＡＴ−１５×ａｌｔｓ８（ａ．ｋ．ａ１５×８）♯：１，２，３，４，７，８，９，１０，１２，１５，１６，１７，１８，１９，２２，２３ａＧＳＬ３３ＣＡＴ−１０×ｐｅｐ４−３（ａ．ｋ．ａ．１０×４−３）♯：１−７４評価された酵母菌株の中で、１３のみがＧＳＬ／ＣＡＴ−表現型を保有し、そして相補性を介する交雑に適する栄養要求変異マーカーを有することが見出された。スクリーニングされた表現型はこれらの特徴を包含していた：ｉ．酵母は、ＹＥＰ＋Ｇａｌ培地中で容易に増殖した；ii．ＹＥＰ＋５０％ｇａｌ／５０％グルコース培地中で容易に増殖した；iii．ＹＥＰ＋デキストロース培地中で容易に増殖しなかった（ＹＥＰ（無糖）対照培地において観察された増殖速度と比較した場合）。適合し得る交雑タイプおよび相補性栄養要求変異マーカーの組合せに基づいて、表３に挙げた以下の酵母菌株交雑対が同定された。酵母菌株の栄養要求変異マーカーに基づいた最小選択培地も挙げられている。表３に挙げた半数体交雑酵母菌株対はＹＥＰ＋Ｇａｌ培地上に線状にプレーティングが行われ、そして３０℃で２４時間保温された。線状プレートは次に、ＹＥＰ＋Ｇａｌ上に垂直な方向で直交レプリカプレーティングが行われ、そして３０℃で２４時間保温された。直交レプリカプレートは次にリジン補足をした、またはしない合成ガラクトース最小培地上にレプリカプレーティングが行われた。プレートは次に３０℃で１−４日間保温された。二倍体酵母コロニー増殖は「＋」として挙げた交雑対組合せに対して明らかだった。表４に挙げた推定上の二倍体ＧＳＬ／ＣＡＴ−コロニーがリジンを含むか、または含まない新たな合成ガラクトース最小培地上にプレーティングすることにより単離され、次に単離されたコロニーを新たなＹＥＰ＋ガラクトースプレート上にプレーティングした。推定上の二倍体ＧＳＬ／ＣＡＴ−酵母菌株がガラクトースおよび／またはグルコースを利用する能力はＹＥＰ培地、およびガラクトースおよびＹＥＰＤ培地プレート上に希釈緩衝液３ミリリットル（ｍｌｓ）中の１ループの酵母ペースト１００マイクロリットルのヘビー接種を広げてプレーティングすることにより評価された。半数体ＧＳＬ／ＣＡＴ−酵母菌株試料ＣＡＴ−１５が対照として調製された。プレートが３０℃で約４日間保存された。評価された全ての候補体である２倍体酵母菌株はＹＥＰおよびガラクトース培地上で容易に増殖し、そしてＹＥＰＤ培地プレート上では増殖を徴候を示さなかったか、またはわずかの復帰変異コロニーを示した。上記の観察に基づいて、単離された二倍体ＧＳＬ／ＣＡＴ−酵母菌株はガラクトース基質限定されていることが結論づけられた。菌株はまた、その他の炭水化物を代謝する能力、液体ＹＥＰ培地、ＹＥＰＤ培地、ＹＥＰ＋ガラクトース培地およびＹＥＰ＋５０％グルコース／５０％ガラクトース培地中での増殖、および８時間以内にパン生地試料が膨張および膨化する能力がスクリーニングされた。３種の推定上の二倍体菌株５×５４、５９×５８および１０×５４がスクリーニング試験の全てに関して適合可能性を示した。１０×５４に対する増殖が図８にグラフで示されている。菌株１０×５４は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９９４年１１月７日に寄託され、そして受託番号７４３０８を有する。これら３種の菌株は酵母菌株をＹＥＰ＋ガラクトースの培地上に接種することによりグルコース利用性への復帰が試験された。結果は表５に示されている。上に計算されたような観察された復帰頻度は点突然変異に対して観察された復帰頻度の代表例である。３種の二倍体菌株はまた栄養要求変異性の栄養要求がスクリーニングされた。菌株は合成ガラクトース最小増殖培地上にプレーティングされた。全ての菌株が最小培地上で増殖することができた。本発明の酵母菌株は、パン生地中に混入された場合、酵母混入（発酵）および酵母膨化された冷蔵可能な生地を製造することが見出された。本発明の生地から焼かれたパンは慣用のパン酵母から製造されたパンに十分に匹敵するものである。本発明は好ましい態様について記載されているけれども、当業者は本発明の精神および範囲から逸脱することなしに変更が形式的かつ詳細になされ得ることを認識するであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 7/08 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＪＰ，ＭＸ

Claims

【特許請求の範囲】１．グルコースの存在下で炭水化物供給源としてガラクトースのみを利用することができる属種サッカロミセス・セレビシアエの酵母細胞。２．酵母細胞が二倍体である請求項１記載の酵母細胞。３．少なくとも約６重量％のエタノール濃度を有する混合物中で増殖することができる請求項１記載の酵母細胞。４．酵母細胞のための栄養物を有するマトリックスをさらに含有し、酵母細胞が該マトリックス内に散在されている請求項１記載の酵母細胞。５．マトリックスがパン生地であり、そして酵母は該パン生地を膨張および膨化させる請求項４記載の酵母細胞。６．酵母が、慣用のガラクトース基質限定された酵母を用いて製造されたパン生地に対する時間の約２分の１である時間内に生地を膨化させる請求項５記載の酵母細胞。７．マトリックスがホエーである請求項４記載の酵母細胞。８．マトリックスが炭水化物供給源としてグルコースを利用することができる酵母細胞をさらに含有する請求項７記載の酵母細胞。９．酵母細胞がプロテイナーゼＡ、ＢおよびカルボキシペプチダーゼＹの活性を実質的にもたない請求項１記載の酵母細胞。１０．唯一の炭素供給源として加水分解されたラクトースをさらに利用することができる請求項１記載の酵母細胞。１１．摂氏約１０度未満の温度で実質的に停止する増殖能をさらに有する請求項１記載の酵母細胞。１２．少なくとも６重量％のエタノール濃度を有する混合物中で増殖することができる属種サッカロミセス・セレビシアエの酵母細胞。１３．プロテイナーゼＡ、プロテイナーゼＢおよびカルボキシペプチダーゼＹの活性が実質的にない属種サッカロミセス・セレビシアエの酵母細胞。１４．混合物がパン生地である請求項１２記載の酵母細胞。１５．酵母細胞が散在されているパン生地をさらに含有する請求項１１記載の酵母細胞。１６．グルコースの存在下で炭水化物供給源としてガラクトースのみを利用することができる属種サッカロミセス・セレビシアエの酵母細胞を準備し、該酵母細胞をホエー中に散在させ、そしてホエーに対する酵母細胞の作用により産生されたグルコースおよびエタノールを抽出する、ことからなるホエーをグルコースおよびエタノールに変換する方法。１７．炭水化物供給源としてガラクトースのみを利用することができる属種サッカロミセス・セレビシアエの酵母細胞および慣用のパン酵母細胞を準備し、該酵母細胞をホエー中に散在させ、そしてホエー上の酵母細胞の作用により産生されたエタノールを抽出する、ことからなるホエーをエタノールに変換する方法。１８．グルコースの存在下で唯一の炭水化物供給源としてガラクトースを利用することができ、そして少なくとも約６重量％のエタノール濃度を有する混合物中で増殖することができる属種サッカロミセス・セレビシアエの酵母細胞を準備し、該酵母を生地マトリックス中に散在させ、そして酵母を有する生地を該生地が膨化される容器に移す、ことからなるパン生地の膨化時間を短縮する方法。