TWI421342B - 提高衣康酸表現量之基因修飾微生物及以此微生物生產衣康酸的方法 - Google Patents

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Description

提高衣康酸表現量之基因修飾微生物及以此微生物生 產衣康酸的方法
本發明係有關於一種基因修飾之E.coli品系，其衣康酸的產量高於野生型之E.coli品系。
衣康酸，為許多產物(如，聚丙烯纖維、橡膠、人工鑽石及鏡片)之必需前驅物，其廣泛地使用於化學工業上。傳統上，衣康酸是由土麴菌(Aspergillus terreus)中所分離出來。然而，土麴菌(A.terreus)生長緩慢，且在產孢時期並無法形成衣康酸。因此，業界亟需一種可大量生產衣康酸的方法。
在本發明之一範疇中，基因修飾微生物之特徵包括(i)一突變之內源性icd基因，其異檸檬酸脫氫酶的表現量低於其野生型的表現量，以及(ii)一外源性核酸序列，其編碼一順式烏頭酸脫羧酶(CAD)，且連接至一啟動子(可在微生物中進行基因轉錄)。經修飾的微生物可為黑麴菌(Aspergillus niger)、土麴菌(Aspergillus terreus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、擔子菌類酵母菌(Pseudozyma Antarctica)、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。此微生物可更包括至少一外源性核酸序列，其編碼下列3種酵素其中之一：(a)可將磷 酸烯醇丙酮酸轉變為草醯乙酸的酵素(例如，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶以及磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)，(b)可將草醯乙酸轉變為檸檬酸的酵素(例如，檸檬酸合成酶、2-甲基檸檬酸合成酶以及檸檬酸裂解酶)，以及(c)可將檸檬酸或異檸檬酸轉變為順式烏頭酸的酵素(例如，烏頭酸酶及2-甲基檸檬酸脫氫酶)。此3個外源性核酸序列連接至一適當的啟動子。
在本發明另一實施樣態中，基因修飾微生物之特徵包括(i)一第一外源性核酸序列，其編碼一順式烏頭酸脫羧酶(CAD)，(ii)一第二外源性核酸序列，其編碼上述酵素(a)或酵素(b)，以及選擇性(iii)一第三外源性核酸序列，其編碼上述酵素(c)。此外，此微生物包括(i)一第一外源性核酸序列，其編碼一順式烏頭酸脫羧酶(CAD)，(ii)一第二外源性核酸序列，其編碼上述酵素(a)，(iii)一第三外源性核酸序列，其編碼上述酵素(b)，以及選擇性(iv)一第四外源性核酸序列，其編碼上述酵素(c)。各個外源性核酸序列連接至一適當的啟動子，使上述酵素於微生物內表現。
在本發明之範疇中，更包括一種以上述任何基因修飾微生物表現衣康酸的方法。本發明之方法包括將此基因修飾微生物培養於一培養基中以產生衣康酸，收集培養基並純化此衣康酸產物。在一實施例中，培養基包括以葡萄糖作為基質以生產衣康酸，葡萄糖的濃度介於5-80g/L，較佳約10-40g/L。在另一實施例中，此培養基包括以檸檬酸作為基質以生產衣康酸，檸檬酸的濃度介於5-80g/L，較佳約10-40g/L。。當以檸檬酸作為基質時，基因修飾微生物較易經透化(permeabilize)處理。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：
本發明係提供一種基因修飾之微生物，其可高度表現順式烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase，CAD)，此酵素可將順式烏頭酸轉變為衣康酸。微物生包括，但不限於，麴菌(Aspergillus)、檸檬酸桿菌(Citrobacter)、棒狀桿菌(Corynebacterium)、德克酵母菌(Dekkera)、腸桿菌(Enterobacter)、腸球菌(Enterococcus)、大腸桿菌(Escherichia)、歐文氏菌(Erwinia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、乳酸菌(Lactobacillus)、乳酸球菌(Lactococcus)、摩根氏菌(Morganella)、團泛菌(Pantoea)、果膠桿菌(Pectobacterium)、青黴菌(Penicillum)、畢赤酵母菌(Pichia)、變形桿菌(Proteus)、假單胞菌(Pseudomonas)、二形性酵母菌(Pseudozyma)、膠紅酵母菌(Rhodotorula)、沙門氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)、志賀氏菌(Shigella)、酵母菌(Saccharomyces)、黑穗菌(Ustilago)、及耶氏酵母菌(Yarrowia)。
本發明所述之“順式烏頭酸脫羧酶”或“CAD”係指任何天然的順式烏頭酸脫羧酶(例如，土麴菌(A.terreus)之CAD，相關內容可參照Dwiarti et al.,J.Bioscience and Bioengineering,94(1)：29-33,2002以及WO2009/014437)，以及具相同功能的物質。下列核酸及胺基酸序列為土麴菌(A.terreus)核酸序列(序列識別號：1)及胺基酸序列(序列識別號：2)之一實施例。
A.terreus順式烏頭酸脫羧酶
本發明所述之與順式烏頭酸脫羧酶(例如，土麴菌(A.terreus)的CAD或本文中所述之任何酵素)具相同功能的物質為一聚胜肽，其具有與順式烏頭酸脫羧酶至少60%(例如，85%、90%或95%)的相似度，且具有與順式烏頭酸脫羧酶相同的酵素活性。
兩個胺基酸的相似性可藉由Karlin及Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68,1990演算法，以及Karlin及Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77,1993演算法來判斷。此演算法已寫入Altschul,et al.J.Mol.Biol.215：403-10,1990的BLASTN及BLASTX程式(2.0版)中。BLAST蛋白質搜尋可使用BLASTX程式，分數(score)為50，字串長度(wordlength)為3，以獲得與本發明同源的胺基酸序列。可使用Gapped BLAST(Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25：3389-3402,1997)來確定兩序列中的差異(gap)。當使用BLAST及Gapped BLAST程式時，也可使用各自程式(例如，BLASTX及BLASTN)的default參數。
上述之基因修飾微生物可具有一突變的內源性icd基因(編碼異檸檬酸脫氫酶)，使其相對於野生型的微生物，具有較低的異檸檬酸脫氫酶表現量。Icd基因存在於各種的微生物中，包括土麴菌(Aspergillus terreus)(基因銀行編號：XM_001210553及XP_001210553)、克氏檸檬酸桿菌(Citrobacter koseri)(基因銀行編號：YP_001453397)、醱酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)(基因銀行編號：NC_009792及YP_001843755)、釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)(基因銀行編號：NC_001146及NP_014361)、解 脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)(基因銀行編號：XM_503571及XP_503571)以及大腸桿菌(Escherichia coli)(基因銀行編號：NC_000913及NP_415654)。例如，E.coli其中一編碼區域如下所示：
E.coli icd基因的核酸及胺基酸序列
製備經內源性icd基因突變之微生物的方法已為此技術領域人士所習知。例如，以同源性重組造成icd基因的突變(如，插入、刪除、位置突變(site mutation))。
此外，基因修飾之微生物也可過度表現下列一個或複數個酵素：(a)可將磷酸烯醇丙酮酸轉變為草醯乙酸的酵素(例如，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶/羧激酶，其包括3種亞型EC4.1.1.32，EC4.1.1.38及EC4.1.1.49)，(b)可將草醯乙酸轉變為檸檬酸的酵素(例如，檸檬酸合成酶、2-甲基檸檬酸合成酶以及檸檬酸裂解酶)，以及(c)可將檸檬酸或異檸檬酸轉變為順式烏頭酸的酵素(例如，烏頭酸酶及2-甲基檸檬酸脫氫酶)。
本發明所述之“磷酸烯醇丙酮酸羧化酶/羧激酶”、“檸檬酸合成酶”、“2-甲基檸檬酸合成酶”、“檸檬酸裂解酶”、“烏頭酸酶”、以及“2-甲基檸檬酸脫氫酶”係指具有上述酵素活性的酵素，包括天然的酵素及具相同功能的物質。E.coli的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc基因)、檸檬酸合成酶(gltA基因)、烏頭酸酶A(acnA基因)、以及烏頭酸酶B(acnB基因)如下所示：
E.coli的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶
E.coli的檸檬酸合成酶
E.coli的烏頭酸酶A
E.coli的烏頭酸酶B
下列表一顯示磷酸烯醇丙酮酸羧化酶/羧激酶、檸檬酸合成酶及烏頭酸酶的其他例子，以及2-甲基檸檬酸合成酶、檸檬酸裂解酶與2-甲基檸檬酸脫氫酶的例子。
上述之基因修飾微生物可以習知重組方法構築完成，可參照，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press。
特別是，基因修飾微生物可過度表現上述一或複數個酵素。可利用聚合酵素鏈鎖反應(PCR)由其天然來源(可來 自基因銀行)獲得編碼上述一或複數個酵素的DNA片段。此DNA片段接著連接至一適當的啟動子以形成一表現框架(expression cassette)。在一實施例中，一表現框架包括一連接啟動子的編碼序列。在另一實施例中，一表現框架包括複數個編碼序列，其皆連接至一啟動子。在此例子中，各編碼序列的5’端較佳具有一核醣體結合位。若有需要，此編碼序列為寄主微生物的最佳化編碼序列。
本發明中所述之“啟動子”係指一核酸序列，在寄主微生物中，此核酸序列的一部份可開啟連接核酸序列的轉錄。啟動子至少包括一RNA聚合酶結合位。啟動子可更包括一或複數個調控部份，其可控制啟動子的開啟/停止狀態。當以E.coli作為寄主微生物時，代表性的E.coli啟動子包括，但不限於，β-內醯胺酶及乳醣啟動子系統(Chang et al.,Nature 275：615-624,1978)，SP6、T3、T5及T7 RNAs聚合酶啟動子(Studier et al.,Meth.Enzymol.185：60-89，1990)，lambda啟動子(Elvin et al.,Gene 87：123-126,1990)，trp啟動子(Nichols and Yanofsky,Meth.In Enzymology 101：155-164,1983)以及Tac及Trc啟動子(Russell et al.,Gene 20：231-243,1982)。當以酵母菌作為寄主微生物時，代表性的酵母菌啟動子包括，但不限於，3-磷酸甘油酸激酶啟動子、甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子、半乳糖激酶(GAL1)啟動子、半乳糖表異構酶(galactoepimerase)啟動子、以及醇脫氫酶(ADH)啟動子。在其他微生物中，適合用於表現基因的啟動子亦為熟悉此技術領域人士所習知。
接著，將上述之表現框架轉染至一適合的微生物中， 以獲得上述之基因修飾微生物，篩選轉殖微生物，並證明一或複數個酵素過度表現的方法為熟悉此技術領域人士所習知，例如，免疫墨點或酵素活性分析。將此基因修飾微生物培養於一適當的培養基中以產生衣康酸。此培養基較佳具有葡萄醣或檸檬酸，其為產生衣康酸的前驅物。在充份的培養後，收集此培養基，並分離分泌於培養基中的衣康酸。
【實施例】
1.質體及基因修飾E.coli品系
本實施例中使用E.coli BW25113(rrnB T14△lacZ WJ16 hsdR514△araBAD AH33△rhaBAD LD78)及BL21(dcm ompT hsdS(rB-mB-)gal)，請參照Datsehko et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97：6640-6645,2000，以重組技術進行基因修飾。簡言之，將BW25113的內源性icd基因以FLP-FRT重組技術破壞，以獲得BW25113突變株(即PCI400)。相較於BW25113，BW25113突變株的異檸檬酸脫氫酶表現量較低。
將一些質體轉染至母品系及PCI400中，此質體如表二所述，其以重組技術構築完成。
將表二中所述之一或複數個質體轉染至BW25113、PCI400、或BL21以獲得各種修飾的E.coli品系，如表三所示。
2.以PCI 213表現衣康酸
PCI 213品系(BL21過度表現土麴菌(A.terreus)之CAD)於37℃下培養於LB(Luria-Bertani)培養基隔夜，再接種(1%)至一基礎培養基，其包括80g/L的葡萄糖、氯化鈉、及磷酸鹽緩衝液，並於30℃下培養一適當的期間，直到OD600達0.2-0.6。接著，添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，0.5mM)至培養基中以誘導CAD的表現。24小時後，收集此培養基。培養基中衣康酸的濃度為約100mg/l。
3.以PCI010表現衣康酸
PCI010品系(BW25133過度表現土麴菌(A.terreus)之CAD)於37℃下培養於基礎培養基隔夜，基礎培養基包括40g/L的葡萄糖、氯化鈉、及磷酸鹽緩衝液。將此隔夜培養基接種至一M9培養基中，其包括20或40g/L的葡萄糖、氯化鈉、及磷酸鹽緩衝液，另含有或不含有1mM的麩胺酸，於30℃下培養。當OD600達0.2-0.4時，加入0.5mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至培養基中以誘導土麴菌(A.terreus)之CAD的表現。培養24小時後，測定衣康酸的含量。此結果如表四所示。
4.以葡萄糖為基質，於各種修飾的E.coli品系表現衣康酸
將表五所述之修飾E.coli品系在37℃下，於旋轉震盪器(250rpm)中，培養於LB(Luria-Bertani)培養基隔夜， 再接種至一M9培養基中，其包括20g/L的葡萄糖、1g/L的酵母萃取物、氯化鈉、及磷酸鹽緩衝液，於37℃下培養。當OD600達0.2-0.4時，加入0.5mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至培養基中以誘導外源性基因表現。分別於不同的時間點收集培養基，並測定培養基中衣康酸的含量，如表五所示。
如表五所示，PCI 519(BW25133；△icd，gltA，ppc，cad及acnA)及PCI 516(△icd，gltA，ppc，cad及acnB)品系在培養72小時後，培養基中具有超過4g/L的衣康酸。PCI 519與PCI 516的葡萄糖-衣康酸轉換率分別為，每公克的葡萄糖可轉換0.52g衣康酸及0.68g衣康酸。
5.以檸檬酸為基質，於各種修飾的E.coli品系表現衣康酸
將PCI 513(BW25133；△icd，cad及acnB)、PCI 516及PCI 519於37℃下培養於LB培養基16小時。接著，將此E.coli品系接種至含0.5mM IPTG的新鮮LB培養基中培養16小時。將上述細胞以Triton X-100處理後，並重新懸浮於含50mg/ml檸檬酸的磷酸緩衝液中。於48或72小時後，檢測培養基的衣康酸含量。
PCI 513在培養48小時後可產生1.27g/L的衣康酸。此品系的葡萄糖-衣康酸轉換率為每公克的檸檬酸轉換0.24g衣康酸。
PCI 519及PCI 516在培養72小時後可分別產生6g/L及5g/L的衣康酸。PCI 519及PCI 516品系的葡萄糖-衣康酸轉換率分別為，每公克的檸檬酸轉換0.61g衣康酸及0.34g衣康酸。
6.以甘油為基質，於各種修飾的E.coli品系表現衣康酸
將PCI 519及PCI 543的E.coli品系在37℃下，於旋 轉震盪器(250rpm)中，培養於LB(Luria-Bertani)培養基隔夜，再接種至一TB培養基中，其包括20-50g/L的甘油、24g/L的酵母萃取物、12g/L胰蛋白腖(tryptone)、及磷酸鹽緩衝液，於37℃下培養。當OD600達0.2-0.4時，加入0.5mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至培養基中以誘導外源性基因表現。於24小時後收集培養基，並測定培養基中衣康酸的含量，如表六所示。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110> 財團法人工業技術研究院
<120> 提高衣康酸表現量之基因修飾微生物及以此微生物生產衣康酸的方法
<130> 0954-A23343-TW
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<150> US12/463,677
<151> 2009-05-11
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1473
<212> DNA
<213> Aspergillus terreus
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<223> 順式烏頭酸脫羧酶
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<223> 烏頭酸酶B
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Claims (27)

  1. 一種提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，包括：一第一外源性核酸序列，其編碼順式烏頭酸脫羧酶(CAD)，該第一外源性核酸序列連接至一啟動子，以及一突變之內源性icd基因，其編碼異檸檬酸脫氫酶，該突變之內源性icd基因的異檸檬酸脫氫酶表現量低於其野生型的表現量。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，更包括一第二外源性核酸序列，其編碼至少一種多胜肽選自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶及烏頭酸酶，且該第二外源性核酸序列連接至一啟動子。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，其中該烏頭酸酶為烏頭酸酶A或烏頭酸酶B。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，其中該第二外源性核酸序列編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，且該基因修飾的大腸桿菌更包括一第三外源性核酸序列，其編碼至少一種多胜肽選自檸檬酸合成酶及烏頭酸酶，該第三外源性核酸序列連接至一啟動子。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，其中該烏頭酸酶為烏頭酸酶A或烏頭酸酶B。
  6. 如申請專利範圍第2項所述之提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，其中該第二外源性核酸序列編碼檸檬酸合成酶，且該微生物更包括一第三外源性核酸序列，其編碼烏頭酸酶，該第三外源性核酸序列連接至一啟動子。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，其中該烏頭酸酶為烏頭酸酶A或烏頭酸酶B。
  8. 如申請專利範圍第4項所述之提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，其中該第三外源性核酸序列編碼檸檬酸合成酶，且該基因修飾的大腸桿菌更包括一第四外源性核酸序列，其編碼烏頭酸酶，該第四外源性核酸序列連接至一啟動子。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，其中該烏頭酸酶為烏頭酸酶A或烏頭酸酶B。
  10. 一種提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，包括：一突變之內源性icd基因，其編碼異檸檬酸脫氫酶，該突變之內源性icd基因的異檸檬酸脫氫酶表現量低於其野生型的表現量，一第一外源性核酸序列，其編碼順式烏頭酸脫羧酶，以及一第二外源性核酸序列，其編碼至少一種多胜肽選自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及檸檬酸合成酶，其中該第一及第二外源性核酸序列分別連接至一啟動 子。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，其中該第二外源性核酸序列編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，且該微生物更包括一第三外源性核酸序列，其編碼至少一種多胜肽選自檸檬酸合成酶及烏頭酸酶，且該第三外源性核酸序列連接至一啟動子。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，其中該第二外源性核酸序列編碼檸檬酸合成酶，且該微生物更包括一第三外源性核酸序列，其編碼烏頭酸酶，且該第三外源性核酸序列連接至一啟動子。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，其中該第三外源性核酸序列編碼檸檬酸合成酶，且該微生物更包括一第四外源性核酸序列，其編碼烏頭酸酶，該第四外源性核酸序列連接至一啟動子。
  14. 如申請專利範圍第10項所述之提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，其中該第二外源性核酸序列連接至一E.coli啟動子，且編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或檸檬酸合成酶。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，其中該第二外源性核酸序列編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，且該微生物更包括一第三外源性核酸序列，其編碼檸檬酸合成酶或烏頭酸酶，該烏頭酸酶為烏頭酸酶A或烏頭酸酶B，且該第三外源性核酸序列連 接至大腸桿菌啟動子。
  16. 如申請專利範圍第14項所述之提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，其中該第二外源性核酸序列編碼檸檬酸合成酶，且該微生物更包括一第三外源性核酸序列，其編碼烏頭酸酶，該烏頭酸酶為烏頭酸酶A或烏頭酸酶B，且該第三外源性核酸序列連接至大腸桿菌啟動子。
  17. 如申請專利範圍第15項所述之提高衣康酸表現量之基因修飾的大腸桿菌，其中該第二外源性核酸序列編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，該第三外源性核酸序列編碼檸檬酸合成酶，該微生物更包括一第四外源性核酸序列，其編碼烏頭酸酶，該烏頭酸酶為烏頭酸酶A或烏頭酸酶B，且該第四外源性核酸序列連接至大腸桿菌啟動子。
  18. 一種生產衣康酸的方法，包括：提供一基因修飾的大腸桿菌，其包括一編碼順式烏頭酸脫羧酶(CAD)之外源性核酸序列，該外源性核酸序列連接至一啟動子，以及一突變之內源性icd基因，其編碼異檸檬酸脫氫酶，其中該突變之內源性icd基因的異檸檬酸脫氫酶表現量低於其野生型的表現量；於培養基中培養該基因修飾微生物；以及由該培養基中分離衣康酸。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之生產衣康酸的方法，其中該培養基包括5-80g/L的葡萄糖。
  20. 如申請專利範圍第18項所述之生產衣康酸的方法，其中該基因修飾微生物被透化，且該培養基包括5-80g/L的檸檬酸。
  21. 如申請專利範圍第18項所述之生產衣康酸的方法，其中該培養基包括5-80g/L的甘油。
  22. 如申請專利範圍第18項所述之生產衣康酸的方法，其中該基因修飾微生物更包括一第二外源性核酸序列，其編碼至少一種多胜肽選自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶及烏頭酸酶，且該第二外源性核酸序列連接至一啟動子。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之生產衣康酸的方法，其中該第二外源性核酸序列編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，且該基因修飾微生物更包括一第三外源性核酸序列，其編碼至少一種多胜肽選自檸檬酸合成酶及烏頭酸酶，該第三外源性核酸序列連接至一啟動子。
  24. 一種生產衣康酸的方法，包括：提供一基因修飾的大腸桿菌，其包括一突變之內源性icd基因，其編碼異檸檬酸脫氫酶，該突變之內源性icd基因的異檸檬酸脫氫酶表現量低於其野生型的表現量，一第一外源性核酸序列，其編碼順式烏頭酸脫羧酶，以及一第二外源性核酸序列，其編碼至少一種多胜肽選自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及檸檬酸合成酶，其中該第一及第二外源性核酸序列分別連接至一啟動子；於培養基中培養該基因修飾微生物；以及由該培養基中分離衣康酸。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之生產衣康酸的方法，其中該培養基包括5-80g/L的葡萄糖。
  26. 如申請專利範圍第24項所述之生產衣康酸的方 法，其中該基因修飾微生物被透化，且該培養基包括5-80g/L的檸檬酸。
  27. 如申請專利範圍第24項所述之生產衣康酸的方法，其中該培養基包括5-80g/L的甘油。
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