TWI628191B - 融合多胜肽、編碼此融合多胜肽之核酸分子、含此核酸分子之載體或細胞以及藉由此細胞產生衣康酸的方法 - Google Patents

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Abstract

所描述為一種融合多胜肽，其包含一烏頭酸酶(aconitase,Aco)與一順式烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)。也被描述的是表現此融合多胜肽之經基因修飾的細胞，與使用此細胞的方法。

Description

融合多胜肽、編碼此融合多胜肽之核酸分子、含 此核酸分子之載體或細胞以及藉由此細胞產生衣康酸的方法
本發明係關於用以在細胞中產生衣康酸之重組酵素系統。
在化學產業中高度需求之衣康酸(Itaconate)，為一前驅物化合物，通常用於各種產物之製造，如壓克力纖維(acrylic fibers)、橡膠、人工鑽石與透鏡(lens)。特定之絲狀真菌(filamentous fungi)(例如，黑穗病菌屬(Ustilago)、紫紋羽病菌屬(Helicobasidium)與麴菌屬(Aspergillus)將單醣類轉化成此化合物。目前，衣康酸之工業生產主要仰賴以天然衣康酸生產菌株-例如土麴菌(Aspergillus terreus)-進行發酵。土麴菌生長緩慢且於其孢子形成階段不產生衣康酸。亟需一種以高產量來產生衣康酸的方法。
所描述為一種包含一烏頭酸酶(aconitase,Aco)與一順式烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)的 融合多胜肽，以及編碼此多胜肽的一核酸分子。此多胜肽顯示出一烏頭酸酶活性與一順式烏頭酸脫羧酶活性。
也被敘述的是表現此融合多胜肽之一經基因修飾的細胞。此類細胞藉由將細胞培養於允許融合多胜肽表現與衣康酸產生的條件下，可被用來產生衣康酸。
於以下伴隨圖式與說明提及一或多個實施例的細節。實施例之其他特徵、目的與優點，從說明書與圖式，以及從申請專利範圍是明顯的。
第1A圖與第1B圖。於大腸桿菌(Escherichia coli)細胞中之衣康酸的生物合成。第1A圖：藉由烏頭酸酶(aconitase,Aco)與順式烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)所催化之反應為分別被以方框與橢圓框所標示。第1B圖：烏頭酸酶A(AcnA)、烏頭酸酶B(AcnB)(來自大腸桿菌(Escherichia coli))與順式烏頭酸脫羧酶(來自土麴菌(Aspergillus terreus))對於檸檬酸(citrate)與順式烏頭酸(cis-aconitate)的Km值被列於表中。
第2圖。cad-aco融合基因之基礎編排與用來選殖這些基因的PCR策略。位於連結子區域之內部XbaI切位(cutting site)被用來將兩種之PCR-1與PCR-2片段連接在一起。外面之KpnI與HindIII切位(以方框標出)被用來插入pSA40a在此載體上之對應位。以一單一連接反應(ligation reaction)將所有3個片段連接在一起。
第3A圖與第3B圖。在攜帶不同cad-aco融合體或cad與aco基因之菌株中，衣康酸(第3A圖)與順式烏頭酸(第3B圖)之產量的比較。這些菌株全部以相同之宿主，大腸桿菌SY403K為基礎。於各菌株中所攜帶之載體被列於括號中。
第4圖。在被提供過量之檸檬酸的不同菌株中，衣康酸與順式烏頭酸之產生的比較。這些菌株以相同之宿主，大腸桿菌SY403K為基礎。兩個質體被包含於細胞中，pPC6，用以過量提供檸檬酸，而用以測試功能之質體，則被列於括號中。
第5A圖與第5B圖。在被提供過量之檸檬酸的不同菌株中，衣康酸(第5A圖)與順式烏頭酸(第5B圖)之產生的比較。這些菌株以相同之宿主，大腸桿菌PCI400*為基礎，且攜帶兩個質體，pPC6與用以測試功能之質體(列於括號中)。
第6A圖與第6B圖。在被提供過量之檸檬酸且被表現個別之順式烏頭酸脫羧酶的不同菌株中，衣康酸(第6A圖)與順式烏頭酸(第6B圖)之產生的比較。這些菌株以相同之宿主，大腸桿菌PCI400*為基礎，且攜帶三個質體，pPC1、pPC6與用以測試功能之質體(列於括號中)。
第7A圖與第7B圖。在不同測試菌株中，衣康酸(第7A圖)與順式烏頭酸(第7B圖)之產生的比較。這些菌株以相同之宿主，大腸桿菌PCI400*為基礎。
第8圖。在被提供過量之檸檬酸的不同菌株中，衣康酸與順式烏頭酸之產生的比較。這些菌株以相同之宿主，大腸桿菌SY403K為基礎，且攜帶兩個質體，pPC6與用以測試功能 之質體(列於括號中)。
在下方細部敘述中，為了說明目的，提及為數眾多的特定細節以提供所揭露之實施例的徹底瞭解。然而，明顯的是，可實施一或多個實施例而不須這些細節。在其他例子中，為了簡化圖式，概要地顯示熟知的結構或裝置。
在真核或原核宿主中，衣康酸之生物合成需要兩個酵素，烏頭酸酶(aconitase,Aco)與順式烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)，以用於將檸檬酸(citrate)轉化為衣康酸的兩個依序反應。檸檬酸首先藉由烏頭酸酶被轉化為順式烏頭酸。所產生之順式烏頭酸藉由順式烏頭酸脫羧酶更進一步被轉化為衣康酸，隨著釋放一分子之CO2(第1圖)。如於此所使用，用語“衣康酸(itaconate)”與“衣康酸(itaconic acid)”可被替換地使用。
非預期地發現，表現包含一烏頭酸酶與一順式烏頭酸脫羧酶之融合多胜肽的細胞，產生高程度的衣康酸。
因此，於此所描述為一融合多胜肽，其包含一烏頭酸酶與一順式烏頭酸脫羧酶。
於此所使用之用語“順式烏頭酸脫羧酶(cis-aconitate decarboxylase)”或“CAD”意指任何自然發生之順式烏頭酸脫羧酶(例如，於Dwiarti et al.,J.Bioscience and Bioengineering,94(1)：29-33,2002與WO 2009/014437中所描述的土麴菌(Aspergillus terreus)順式烏頭酸脫羧酶)及其功能性等同物(functional equivalents)。例如，順式烏頭酸脫羧酶包 括於US Patent No.8,338,158中所描述之突變之土麴菌順式烏頭酸脫羧酶。於以下所提供的是一示範之土麴菌順式烏頭酸脫羧酶的核苷酸序列(序列辨識號：1)與一胺基酸序列(序列辨識號：2)：
於此所使用之用語“烏頭酸酶(aconitase)”或“Aco”意指任何自然發生之順式烏頭酸脫羧酶及其功能性等同物，包括，但不限於，自然發生之土麴菌與大腸桿菌(Escherichia coli)烏頭酸酶與其變體。於以下所提供的是大腸桿菌烏頭酸酶A(aconitase A)(由acnA基因所編碼)與烏頭酸酶B(aconitase B)(由acnB基因所編碼)的核苷酸序列與胺基酸序列：一大腸桿菌烏頭酸酶A的核酸序列(序列辨識號：3)與胺基酸序列(序列辨識號：4)
烏頭酸酶A
一大腸桿菌烏頭酸酶B的核酸序列(序列辨識號：5)與胺基酸序列(序列辨識號：6)
烏頭酸酶B
例如，順式烏頭酸脫羧酶可位於多胜肽之N端。在一實施例中，烏頭酸酶與順式烏頭酸脫羧酶藉由一連結子來連 接，而連結子具有，例如1-200個胺基酸。一連結子可為EFGPGPGPGPGPLEVLFQGPGRAKL(序列辨識號：7)。
於以下所顯示的是示範之融合多胜肽的胺基酸序列與編碼出此多胜肽的核酸序列：順式烏頭酸脫羧酶-連結子-烏頭酸酶A之核酸序列(序列辨識號：8)與胺基酸序列(序列辨識號：9)
順式烏頭酸脫羧酶-連結子-烏頭酸酶B之核酸序列(序列辨識號：10)與胺基酸序列(序列辨識號：11)。
順式烏頭酸脫羧酶-連結子-烏頭酸酶B E424Q之核酸序列(序列辨識號：12)與胺基酸序列(序列辨識號：13)。
順式烏頭酸脫羧酶-連結子-Yaco1之核酸序列(序列辨識號：14)與胺基酸序列(序列辨識號：15)。
藉由使用本技術領域中已知的方法，例如重組技術，可產生融合多胜肽與編碼融合多胜肽的核酸分子。
可將編碼一融合多胜肽的一序列可操作地連接至一適合之啟動子以產生一表現卡匣(expression cassette)。在一例子中，一表現卡匣包括一編碼序列(coding sequence)，其可操作地連接至一啟動子。在另一例子中，一表現卡匣包括多個編碼序列，其全部為與一啟動子可操作的連結。於那例子中，較佳為將一核醣體結合位(ribosome binding site)合併5’至各個之編碼序列。若需要，根據於宿主細胞中之最適密碼子使用(optimal codon usage)，使編碼序列遭受編碼最適化(codon optimization)。
如於此所使用，用語“啟動子”意指一核苷酸序列，其包含在一所要求之宿主細胞中起始一可操作連結之核酸序列的轉錄的要素。至少，一啟動子包含一RNA聚合酶結合位 (RNA polymerase binding site)。其可更包含一或多個，根據定義，為增強轉錄的增強子(enhancer)要素，或一或多個控制啟動子開/關之狀態的調控要素。一啟動子可為一可誘導(inducible)或持續型(constitutive)啟動子。
可將用以表現上述一融合多胜肽之表現卡匣引入一適合之宿主細胞以產生一經基因修飾的細胞。選擇陽性轉型株(positive transformants)，且藉由本技術領域中已知之方法，例如，免疫墨漬法(immune-blotting)或酵素活性分析，可確認融合多胜肽的表現。之後可將經修飾之細胞培養於用以衣康酸產生之一適合之培養基中。例如，培養基可包含葡萄糖、甘油、或檸檬酸為用以製造衣康酸的前驅物。參見，例如，US Patent No.8,192,965。在一足夠之培養期間後，可從培養基分離衣康酸。
適合之宿主細胞，包括，但不限於，黑麴菌(Aspergillus niger)、土麴菌、大腸桿菌、南極類酵母真菌(Pseudozyma antarctica)、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipotica)與啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)細胞。
上述經基因修飾之細胞可具有一突變內生性之icd基因(編碼出異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase))，以使其相較於其野生型相對物(wild-type counterpart)，表現一較低程度之異檸檬酸脫氫酶。異檸檬酸脫氫酶將異檸檬酸轉化成α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)。icd基因存在於各種種類之微生物中，包括土麴菌(GenBank Accession Nos.XM_001210553與XP_001210553)、克氏檸檬酸桿菌(Citrobacter koseri) (GenBank Accession Nos.NC_009792與YP_001453397)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)(GenBank Accession Nos.NC_010610與YP_001843755)、啤酒酵母菌(GenBank Accession Nos.NM_001182876與NP_014361)、解脂耶氏酵母菌(GenBank Accession Nos.XM_503571與XP_503571)及大腸桿菌(GenBank Accession Nos.NC_000913與NP_415654)。也參見US Patent No.8,143,036。產生具有一突變之內生性icd基因之一微生物的方法，為本技術領域所已知。例如，藉由同源重組(homologous recombination)，突變(例如，插入、刪除、點突變(site mutation))之icd基因可被引入。作為一例子，一大腸桿菌icd基因之編碼區域如下所示：一大腸桿菌異檸檬酸脫氫酶之核苷酸序列(序列辨識號：16)與胺基酸序列(序列辨識號：17)
或者，或除此之外，經基因修飾之細胞也可表現或過度表現一或多個之下列酵素：(a)一酵素，其將磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate)轉化成草醯乙酸(oxaloacetate)(例如，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶/羧化激酶(phosphoenolpyruvate carboxylase/carboxykinase)；包括三種同功異形體(isoform)EC 4.1.1.32、EC 4.1.1.38與EC 4.1.1.49)與功用相似之EC 4.1.1.31；(b)一酵素，其將草醯乙酸轉化成檸 檬酸(例如，檸檬酸合成酶(citrate synthase)、2-甲基檸檬酸合成酶(2-methylcitrate synthase)與檸檬酸裂解酶(citrate lyase)；以及(c)一酵素，其將檸檬酸或異檸檬酸轉化成順式烏頭酸(例如，烏頭酸酶與2-甲基檸檬酸脫水酶(2-methylcitrate dehydratase))。也參見US Patent No.8,143,036。
於此使用之用語“磷酸烯醇丙酮酸羧化酶/羧化激酶”、“檸檬酸合成酶”、“2-甲基檸檬酸合成酶”、“檸檬酸裂解酶”與“2-甲基檸檬酸脫水酶”意指具有上述酵素活性之所有酵素，包括自然發生之酵素與它們的功能性等同物兩者。下方所提供為大腸桿菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(由ppc基因所編碼)與檸檬酸合成酶(由gltA基因所編碼)的核苷酸序列與胺基酸序列。
一大腸桿菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之核酸序列(序列辨識號：18)與胺基酸序列(序列辨識號：19)
一大腸桿菌檸檬酸合成酶之核酸序列(序列辨識號：20)與胺基酸序列(序列辨識號：21)
下方表1列出磷酸烯醇丙酮酸羧化酶/羧化激酶、檸檬酸合成酶與烏頭酸酶，及示範之2-甲基檸檬酸合成酶、檸檬酸裂解酶與2-甲基檸檬酸脫水酶的額外例子：
藉由本技術領域已知方法，例如，重組技術(recombinant technology)，可構築上述經基因修飾之細胞。編碼任何之上述酵素的一序列可被可操作地連接至一適合之啟動子，以產生之後可被引入一宿主細胞中的一表現卡匣。
以下特定實施例被解釋為僅為說明性，且不以任何方式為揭露之其他部分的限制。不須更進一步之細節，相信該技術領域中具有通常知識者，根據於此之說明，可利用本說明書至其最大程度。於此所引用之所有出版物皆以其全文併入為參考文獻。
實施例
實施例1：以來自大腸桿菌之acnA或acnB之cad-aco融合基因的構築
採用Tsuchiya et al(Biochim.Biophysi.Acta,2008,1784：1847-1856)所報導的方法來設計順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶融合多胜肽，其每個包含一順式烏頭酸脫羧酶於N端與一烏頭酸酶於C端，以包含25個胺基酸富有PG之一短的胜肽(序列辨識號：7)來連接。C端之順式烏頭酸脫羧酶藉由併入一V490GI突變也被輕微地修飾。在烏頭酸酶的情況，三種類型之烏頭酸酶被測試：烏頭酸脫羧酶A(AcnA)、烏頭酸脫羧酶B(AcnB)與烏頭酸脫羧酶B(AcnB)E424Q突變。之後，總共構築了3種類型的順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶融合體：順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶A、順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶B以及順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶B E424Q(序列辨識號：9、11與13)。
為了構築融合基因，應用引子與PCR以獨立地擴增 兩條DNA片段(第2圖)：1)片段PCR-1，其包括cad編碼區與連結子，且其兩側被一位於cad基因正上游之KpnI切位與位於連結子區域之一XbaI切位所包圍；2)片段PCR-2，其僅包含連結子之部分與一完整之烏頭酸酶基因，且被位在連結子上之Xba切位與位於烏頭酸酶基因下游之一HindIII切位所包夾。由於有三個不同之烏頭酸酶基因要被測試，所以製備了三種不同種類之PCR-2片段。它們全部分享上述之相同結構且如於第2圖中所示。
如下列出所使用之引子於表2中。
將所製備之PCR-1與PCR-2片段進行膠體純化，且將其以KpnI與XbaI(對於PCR-1類型)，或以XbaI與HindIII(對於PCR-2類型)來進行處理，且經由三-片段-連結(three-fragments-ligation)方式將其與pSA40a載體連接於KpnI/HindIII切位。之後構築下方三個重組選殖體(recombinant clones)：pTYL101、pTYL102與pTYL103，其分別於各質體上攜帶PLlacO1：：cad-連結子-acnA(‘cad-acnA’)、PLlacO1：：cad-連結子-acnB(‘cad-acnB’)與PLlacO1：：cad-連結子-acnB(E424Q)(‘cad-acnBeq’)的融合基因。下方表3列出於此所述之表現質體。
實施例2：順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶融合蛋白顯示出順式烏頭酸脫羧酶與烏頭酸酶兩者活性
將質體pTYL101,pTYL102與pTYL103分別引入大腸桿菌SY403K(基因型：BW25113 acnA - acnB - icd - kan r )，且以0.5mM IPTG來誘導於這些質體上的cad-aco融合基因。於一in vitro分析中來分析從經IPTG誘導之培養物的那些所製備的細胞裂解物，以測試順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶蛋白質的活性。藉由將pP104A，其攜帶轉錄融合之PLlaco1：：cad：：acnA操縱子(operon)，以及pSA40a，為載體，分別引入大腸桿菌SY403K細胞來以相似之程序來製備正與負控制組裂解物。
下方表4列出於此揭露之細菌菌株。
將0.2mL測試樣本之細胞裂解物使用於1mL含有在MES-NaOH(50mM,pH 6.5)緩衝溶液中之順式烏頭酸(12.5mM)的反應混合物中，且培養於37℃，25分鐘。為了停止反應，添加3-4μL之濃縮(18M)H2SO4溶液。之後將樣本溶液以0.2μM濾器過濾並以HPLC分析以偵測衣康酸、檸檬酸(異檸檬酸) 的存在與剩餘之順式烏頭酸的量。
結果顯示於表5中。
*：對於pTYL101、pTYL102與pTYL103，使用兩個隨機挑選之選殖體以製備細胞裂解物並獨立地執行in vitro分析。於此列出之結果為來自兩個樣本之資料的平均值。
#：資料不只包括檸檬酸也包括異檸檬酸，由於此兩化合物之分析之HPLC訊號被混雜在一起。
相較於正與負控制組，被表現順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶融合蛋白(來自pTYL101、pTYL102或pTYL103)之細胞裂解物引起顯著之量的衣康酸的形成，此指出全部三種類 型之順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶融合蛋白具有順式烏頭酸脫羧酶活性。在順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶A(來自pTYL101)的情況，將檸檬酸/異檸檬酸的形成，及與順式烏頭酸的消耗，與正控制組(被表現來自pP104A的烏頭酸酶A)比較，其支持至少順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶A具有烏頭酸酶活性。已知烏頭酸酶B在細胞裂解液中是不穩定的，若沒有經過再活化(re-activation)處理，例如：補充Fe2+/S2-，將無法偵測到活性。此正好是在順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶B(來自pTYL102)與順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶B/E424Q(來自pTYL103)之樣本裂解物中沒有偵測到檸檬酸/異檸檬酸的理由。它們的烏頭酸酶活性藉由下方描述之in vivo培養分析(cultivation assays)被顯示。
實施例3：從表現cad-aco融合基因之細胞增加順式烏頭酸釋放
A.在大腸桿菌SY403K中，具有acnA- acnB- icd-突變的一突變株
為了比較在cad-aco融合體與它們之個別相對物(counterparts)之間的衣康酸產生效率，全部以大腸桿菌SY403K宿主細胞為基礎的菌株RT001、RT002、RT008與RT010，被測試它們產生衣康酸之能力。
以2-3mL之LB培養基(添加抗生素)來製備測試樣本之隔夜培養物，來自其之0.2-0.4mL細胞懸浮液被分別種入40mL之發酵培養基(0.5%酵母菌萃取物、0.05%蛋白腖(peptone)、3%甘油、1x M9鹽基，pH7.0)維持於一250mL-培 養瓶中。這些培養瓶首先被培養於30℃或37℃伴隨旋轉(200x rpm)，直到細胞OD600nm達到約0.2-0.4。之後添加IPTG至0.5mM之濃度且進一步將培養瓶培養於30℃約64小時。在培養期間，在選擇之時間從各樣本培養瓶移出1mL樣本以分析累積於培養基中之衣康酸與順式烏頭酸的量。
如第3圖所示，顯著之量的衣康酸累積於帶有轉譯融合之cad-aco融合基因的細胞中，而此支持這些基因的確編碼出有效之雙功能性融合蛋白，不只提供衣康酸合成所需之順式烏頭酸脫羧酶活性，且也提供形成順式烏頭酸所需的烏頭酸酶活性，而順式烏頭酸為順式烏頭酸脫羧酶之唯一基質。
在這些樣本中，須提醒的是，帶有acnA之細胞其與cad轉譯融合如在RT001中，或與cad轉錄融合如在RT008中，相較於帶有acnB的細胞(即，RT002與RT010)，累積較多之衣康酸。由於在宿主細胞中，染色體之acnA與acnB已被刪除，RT008與RT010的烏頭酸酶活性主要分別來自烏頭酸酶A與烏頭酸酶B，其各由它們所分別攜帶的質體所提供。
特別是，RT002之衣康酸產量甚至高於RT010，其支持順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶融合體在衣康酸產生上具有有益的影響，其可能起因於因順式烏頭酸脫羧酶緊密地連結烏頭酸酶B而有效捕獲順式烏頭酸。此外，當限制順式烏頭酸的補充時，此有益效果更是顯著，因為在RT002與RT010的情況，於其中，由於存在為一個別之酵素或功能性與順式烏頭酸脫羧酶融合的烏頭酸酶B對於檸檬酸的高Km值，烏頭酸酶B的活性可能是低的。
需提醒的是，不論它們的衣康酸產量，順式烏頭酸的釋放僅顯著增加於帶有cad-aco融合基因於質體上的RT001與RT002中，而不在個別地被表現烏頭酸酶A或烏頭酸酶B酵素的RT008或RT010中。
菌株RT021、RT022、RT023是藉由將cad-aco融合基因系統與攜帶PLlacO1：：ppc：：gltA操作子之質體pPC6，共轉形進入大腸桿菌SY403K細胞而產生。攜帶pP104A或pP154A之質體的控制組RT031與RT032，也以相似之方式來產生。在發酵期間之衣康酸的產生在這些菌株中伴隨它們的順式烏頭酸的釋放來被比較。
以2-3mL之LB培養基(添加抗生素)來製備測試樣本之隔夜培養物，來自其之0.2-0.4mL細胞懸浮液被分別種入30mL之發酵培養基(0.4%酵母菌萃取物、2%甘油、1x M9鹽基，pH7.0)維持於一250mL-培養瓶中。這些培養瓶首先被培養於30℃或37℃伴隨旋轉(200x rpm)，直到細胞OD600nm達到約0.2-0.4。之後添加IPTG至0.5mM之濃度且進一步將培養瓶培養於30℃約64小時。在培養期間，在選擇之時間從各樣本培養瓶移出1mL樣本以分析累積於培養基中之衣康酸與順式烏頭酸的量。
結果如第4圖中所示。顯然地，相較於在缺乏pPC6中所獲得之產量(參見第3圖)，在所有測試樣本中皆觀察到在衣康酸產量方面大於10倍的改善，特別是對於被表現個別之酵素或以順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶B融合體之形式的烏頭酸酶B的細胞而言。於這些細胞中過量提供檸檬酸，“全力提供” 了烏頭酸酶B酵素能量，導致順式烏頭酸的有效產生，其更進一步“活化”順式烏頭酸脫羧酶於相同細胞中，使得衣康酸產量增加且也釋放順式烏頭酸。再次，須提醒的是，在帶有cad-aco融合基因的細胞中，順式烏頭酸的釋放，顯著高於帶有轉錄融合之cad與aco基因的細胞。
B.在大腸桿菌PCI400*中，攜帶icd-突變的一突變株
在大腸桿菌SY403K細胞中，染色體之acnA與acnB基因已被刪除。為了測試這些位於染色體之aco基因對於來自cad-aco融合基因之衣康酸產生的影響，我們之後將cad-aco表現系統與pPC6質體共轉形進大腸桿菌PCI400*中，大腸桿菌PCI400*帶有icd-刪除與未確認之有利於在所使用之發酵培養基中的細胞生長的突變。這些菌株，RT014、RT015、RT017與RT018，在衣康酸之產生產量與所釋放之順式烏頭酸的相對量方面，被互相比較。
以2-3mL之LB培養基(添加抗生素)來製備測試樣本之隔夜培養物，來自其之0.2-0.4mL細胞懸浮液被分別種入40mL之發酵培養基(0.5%酵母菌萃取物、0.05%蛋白腖、3%甘油、1x M9鹽基，pH7.0)維持於一250mL-培養瓶中。這些培養瓶首先被培養於30℃或37℃伴隨旋轉(200x rpm)，直到細胞OD600nm達到約0.2-0.4。之後添加IPTG至0.5mM之濃度且進一步將培養瓶培養於30℃約64小時。在培養期間，在選擇之時間從各樣本培養瓶移出1mL樣本以分析累積於培養基中之衣康酸與順式烏頭酸的量。
如於第5圖中所示，在這些以PCI400*-為基礎之菌株中，所產生之衣康酸及所釋放之順式烏頭酸的相對量，與在以SY403K宿主為基礎之菌株中所觀察到的是相似的(參見第3圖與第4圖)，儘管相較於在以SY403K為基礎的菌株中，衣康酸之產量在以PCI400*為基礎之菌株中似乎較少。
上方測試證實了，表現cad-aco融合基因的細胞釋放較多之順式烏頭酸，相較於被表現相似但為個別之cad與aco基因，不論染色體上之aco基因存在與否，及伴隨可以過量提供檸檬酸於細胞中之ppc與gltA基因的共-過量表現與否。其也證實上述，在融合構築體上之順式烏頭酸脫羧酶與烏頭酸酶酵素的緊密連結，的確有益於融合酵素之順式烏頭酸脫羧酶部分捕獲從在附近之烏頭酸酶所釋放的順式烏頭酸，且當限制順式烏頭酸的提供時，其更為顯著(參見第1圖)。
實施例4：cad-aco與cad之共-過度表現促進衣康酸的有效產生
測試兩種方式來改善順式烏頭酸至衣康酸的轉化：首先，選擇一強的結構性啟動子，PCP25(Jensen and Hammer,1998,Biotechnol.Bioeng.5：191-195)以增加cad-acnA基因的表現程度，且為此目的構築了攜帶PCP25：：cad-AcnA基因的質體pTYL112。其次，將攜帶PLlacO1：：cad基因的質體pPC1，伴隨pPC6以及cad-acnA表現質體，pTYL101或pTYL112，而引入PCI400*細胞中。在這些菌株與控制組中，比較衣康酸的產生產量，於控制組中，攜帶cad-aco基因的質體被以pP104A，其攜帶轉錄融合之cad與acnA基因，或pSA40a，其為選殖載體， 來取代。
以2-3mL之LB培養基(添加抗生素)來製備測試樣本之隔夜培養物，來自其之0.2-0.4mL細胞懸浮液被分別種入40mL之發酵培養基(0.4%酵母菌萃取物、2%甘油、1x M9鹽基，pH7.0)維持於一250mL-培養瓶中。這些培養瓶首先伴隨旋轉(200x rpm)被培養於30℃，4-5小時。之後不管它們的OD600nm添加IPTG至各樣本且至0.5mM之濃度，OD600nm被記錄為在0.06至0.23之範圍。進一步將培養瓶培養於30℃。在培養期間，在選擇之時間從各樣本培養瓶移出1mL樣本以分析累積於培養基中之衣康酸與順式烏頭酸的量。
結果顯示於第6圖中。發現相較於在控制組，攜帶轉錄融合之cad與acnA基因或空白載體的RT127與RT114中，衣康酸之相對產量在攜帶cad-acnA融合基因的菌株，RT113與RT101中較高。於RT113中觀察到比在RT101中較高之衣康酸產量，可能是因為pTYL112上所帶有之PCP25：：cad-acnA基因的表現增加。
在RT101與RT127之菌株之間的比較中，於RT101中轉譯融合之cad-acnA基因與於RT127中轉錄融合之cad：：acnA基因被相同之IPTG-誘導PLlacO1啟動子所觸發。然而，RT101並不僅產生較多之衣康酸，且也釋放較高量的順式烏頭酸至培養基中。此結果支持雙功能性順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶酵素，相較於它們個別之相對物，至少在所測試的條件下，在衣康酸產生方面是更有效的。
在這些菌株中之pPC1質體的引入，儘管提供了獨 立之cad基因的額外來源，但可在細胞中實質上減少這三種質體之各個的複製數目(copy number)，由於在它們之中分享了相同的ColE1起始點(ColE1 origin)，且總質體數目在細胞中被控制。相較於僅攜帶pPC6與pP104A兩個相同質體的RT017細胞而言，在攜帶三個質體的RT127細胞中，前述控制作用可導致pP104A複製數目之減少與來自在此質體上之PLlacO1：：cad：：acnA基因的較少表現。為了補充減少之烏頭酸酶活性，質體pP154K，其帶有轉錄融合之PLlacO1：：cad：：acnB基因，被用來取代在RT109之菌株中的pPC1。之後，在RT109、RT101與RT113之中比較衣康酸產生產量。
以2-3mL之LB培養基(添加抗生素)來製備測試樣本之隔夜培養物，來自其之0.2-0.4mL細胞懸浮液被分別種入30mL之發酵培養基(0.4%酵母菌萃取物、2%甘油、1x M9鹽基，pH7.0)維持於一250mL-培養瓶中。這些培養瓶首先被培養於30℃或37℃伴隨旋轉(200x rpm)，直到細胞OD600nm達到約0.2-0.4。之後添加IPTG至0.5mM之濃度且進一步將培養瓶培養於30℃。在培養期間，在選擇之時間從各樣本培養瓶移出1mL樣本以分析累積於培養基中之衣康酸與順式烏頭酸的量。
如於第7圖中所示，RT109之衣康酸產生產量高於RT101，而不像前述在RT127中所觀察到的。這些結果指出，在RT109中，來自在pP154K質體上之PLlacO1：：cad：：acnB基因之增加的烏頭酸酶活性，的確促進了衣康酸產生。在震盪培養下，RT109的衣康酸產量達到約2.1g/L於45小時，及約2.8g/L於70 小時，而未調整pH值。
特別是，在RT113中觀察到的最高衣康酸產量，在未調整pH值下，於45小時達到約3.2g/L，於70小時達到約4.0g/L，且這些產量顯著地高於在RT109中所觀察到的衣康酸產量。在RT113細胞中，藉由來自pPC6質體之ppc：：gltA基因的過度表現來達成檸檬酸的充足提供；藉由於pTYL112質體上之PCP25：：cad-acnA融合基因的增強表現來達到高程度之烏頭酸酶與順式烏頭酸脫羧酶活性；此外，進一步增加之順式烏頭酸脫羧酶活性係從攜帶於pPC1質體上之個別的cad基因來補充。
實施例5：使用來自解脂耶氏酵母菌之烏頭酸酶的雙功效順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶融合酵素的構築
烏頭酸酶為被發現於不同物種之細胞中之三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle)的一關鍵組成，且為在結構與功能上為高度保守。在藉由大腸桿菌獨特之烏頭酸酶B或高度保守之烏頭酸酶A，來建構雙功能之順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶酵素的成功，強烈暗示了以來自真核來源之烏頭酸酶與順式烏頭酸脫羧酶之間進行功能性融合的可能性。
由於已如上方所提供與描述，可提供cad-aco融合基因以設置用於衣康酸產生之重組的大腸桿菌菌株，並伴隨經改善的效率。以真核之烏頭酸酶為基礎之有效的順式烏頭酸脫羧酶-烏頭酸酶融合體可具有改善在真核宿主中之衣康酸產量的潛力，前述真核宿主，例如，自然產生者，像是土麴菌，或是，以黑麴菌或解脂耶氏酵母菌為基礎的重組株。
對於以真核烏頭酸酶為基礎之CAD-Aco融合體的 構築，我們選擇來自解脂耶氏酵母菌之aco1基因(YALI0D09361p；Yli_Aco1)，藉由與描述於實施例1中相似的方式，來與cad基因融合在一起。為了以一不使用真核宿主之簡單方式來測試新構築之CAD-Yaco1融合體的功能性，將所產生之融合基因設計為被表現在，染色體上之acnA與acnB已被刪除的大腸桿菌SY403K中。因此，可藉由在SY403K宿主中表現融合基因，而從所產生之衣康酸及/或順式烏頭酸的存在，輕易地偵測質體編碼之烏頭酸酶與順式烏頭酸脫羧酶活性。
Yli_Aco1之DNA序列為由NCBI所維持之Genbank取得。此基因之胺基酸序列高度相似於來自土麴菌之烏頭酸酶，烏頭酸酶A(登錄號碼：AAC61778)的序列，具有81.4%的相似度及70.7%的相同度。於Yli_Aco1中發現兩個外顯子(exon)，其中之外顯子1是短的且僅包括30nt(編碼出前10個胺基酸)。
PCR引子被用來：1)擴增來自解脂耶氏酵母菌之染色體之Yli_Aco1基因的外顯子2；2)重建外顯子1編碼區；3)重建連結子區域；4)產生包含具有XbaI切位與HindIII切位於端點之連結子-Yaco1融合體的DNA片段。將引子列於下方表6中。
為了構築pTYL107，其為攜帶PLlacO1：：cad-Yaco1融合基因的表現質體，將PCR-擴增之連結子-Yaco1融合體以XbaI與HindIII酵素處理，且之後將其用來置換於pTYL101質體上。在獨特之XbaI與HindIII切位之間的acnA編碼區。
為了測試在大腸桿菌SY403K中之pTYL107的功能性表現，將於RT024中衣康酸發酵產量與帶有功能性cad-aco基因之菌株進行比較，而帶有功能性cad-aco基因之菌株包括RT021、RT022與RT023。對於控制組而言，使用帶有編碼出來自土麴菌之acnA基因的pP190A的菌株RT027，以及帶有空白載體pSA40a之RT030。
以2-3mL之LB培養基(添加抗生素)來製備測試樣本之隔夜培養物，來自其之0.2-0.4mL細胞懸浮液被分別種入30mL之發酵培養基(0.4%酵母菌萃取物、2%甘油、1x M9鹽基，pH7.0)維持於一250mL-培養瓶中。這些培養瓶首先被培養於30℃或37℃伴隨旋轉(200x rpm)，直到細胞OD600nm達 到約0.2-0.4。之後添加IPTG至0.5mM之濃度且進一步將培養瓶培養於30℃。在培養期間，在選擇之時間從各樣本培養瓶移出1mL樣本以分析累積於培養基中之衣康酸與順式烏頭酸的量。
結果如於第8圖中所示。與正控制組(RT021、RT022與RT023)相似，在RT024之培養基中偵測到顯著量之衣康酸與順式烏頭酸，儘管衣康酸之產量相當的少。這些結果強烈地支持表現於RT024中CAD-Yaco1是雙功能性的，能夠將細胞之檸檬酸轉化成順式烏頭酸，並將順式烏頭酸轉化成衣康酸。於RT024中所發現之相對低的衣康酸產量是可被合理地接受的，由於在異質性(heterogeneous)之大腸桿菌宿主中之Yli_Aco1的烏頭酸酶活性很可能是低的。此觀點由在菌株RT027中所觀察到的順式烏頭酸的低產量所支持，菌株RT027獨立地被表現來自異質性之土麴菌的烏頭酸酶A。
其他實施例
於此說明書中所揭露的所有特徵可被以任何組合形式來進行組合。於此說明書中所揭露的各個特徵，可以一適合相同、相等或相似目的之一替代特徵所取代。因此，除非特別以其他方式陳述，所揭露之各特徵僅為一般系列之相等或相似特徵的一個例子。
自上方說明，該技術領域中具有通常知識者可輕易地確認所述實施例之必要特徵，且不超出其精神與範圍的情況下而可做出實施例之各種改變與修飾，以使其適合各種用途與情況。因此，其他實施例也在申請專利範圍之中。對於該技 術領域中具有通常知識者而言，可對所揭露之實施例做出各種修飾與變化是明顯的。所意指為，說明書與實施例僅被視為示例，伴隨所揭露的實際範圍係由下方申請專利範圍及其等同務所指出。
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Claims (29)

  1. 一種融合多胜肽，包括一烏頭酸酶(aconitase,Aco)與一順式烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)，其中該多胜肽顯示出一烏頭酸酶活性與一順式烏頭酸脫羧酶活性。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之融合多胜肽，其中該順式烏頭酸脫羧酶為在該多胜肽之N端部分中。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之融合多胜肽，更包括一連結子介於該烏頭酸酶與該順式烏頭酸脫羧酶之間。
  4. 如申請專利範圍第1-3項之任一項所述之融合多胜肽，其中該烏頭酸酶為一大腸桿菌(Escherichia coli)烏頭酸酶A(AcnA)或烏頭酸酶B(AcnB)。
  5. 如申請專利範圍第1-3項之任一項所述之融合多胜肽，其中該烏頭酸酶為一真核之烏頭酸酶。
  6. 如申請專利範圍第4項所述之融合多胜肽，其中該烏頭酸酶B(AcnB)為烏頭酸酶B(AcnB)E424Q突變。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之融合多胜肽，其中該順式烏頭酸脫羧酶為順式烏頭酸脫羧酶V490GI突變。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之融合多胜肽，其中該融合多胜肽具有序列辨識號：9、11、13或15之胺基酸序列。
  9. 一種核酸分子，包括編碼出如申請專利範圍第1-8項之任一項所述之融合多胜肽的一核酸序列。
  10. 一種表現載體，包括編碼出如申請專利範圍第1項所述之融合多胜肽的一核酸序列與可操作地連接至該核酸序列的一啟動子。
  11. 一種經基因修飾的細胞，包括編碼出如申請專利範圍第1-8項之任一項所述之融合多胜肽的一核酸序列與可操作地連接至該核酸序列的一啟動子。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之經基因修飾的細胞，其中該細胞為一大腸桿菌細胞，而該啟動子為一大腸桿菌可誘導(inducible)或持續型(constitutive)啟動子，或其中該細胞為一真核細胞，而該啟動子為一真核之可誘導或持續型啟動子。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之經基因修飾的細胞，其中該順式烏頭酸脫羧酶為在該多胜肽之N端部分中。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之經基因修飾的細胞，其中該順式烏頭酸脫羧酶與該烏頭酸酶為藉由一連結子來連接。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之經基因修飾的細胞，其中該烏頭酸酶為一大腸桿菌烏頭酸酶A(AcnA)或烏頭酸酶B(AcnB)。
  16. 如申請專利範圍第14項所述之經基因修飾的細胞，其中該烏頭酸酶為一真核之烏頭酸酶。
  17. 如申請專利範圍第15項所述之經基因修飾的細胞，其中該烏頭酸酶B(AcnB)為烏頭酸酶B(AcnB)E424Q突變。
  18. 如申請專利範圍第15項所述之經基因修飾的細胞，其中該烏頭酸酶為一大腸桿菌烏頭酸酶A(AcnA)。
  19. 如申請專利範圍第16項所述之經基因修飾的細胞，其中該烏頭酸酶為一酵母菌烏頭酸酶。
  20. 如申請專利範圍第15-19項之任一項所述之經基因修飾的細胞，其中該順式烏頭酸脫羧酶為順式烏頭酸脫羧酶V490GI突變。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之經基因修飾的細胞，其中該細胞為icd功能缺乏型(icd -)。
  22. 如申請專利範圍第20項所述之經基因修飾的細胞，更包括一ppc基因與一gltA基因。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之經基因修飾的細胞，更包括另一AcnA基因與另一AcnB基因。
  24. 如申請專利範圍第23項所述之經基因修飾的細胞，更包括一土麴菌(Aspergillus terreus)順式烏頭酸脫羧酶基因。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之經基因修飾的細胞，其中該啟動子為PCP25啟動子。
  26. 如申請專利範圍第11項所述之經基因修飾的細胞，其中該細胞產生衣康酸(itaconate)。
  27. 一種產生衣康酸的方法，包括將如申請專利範圍第11項所述之經基因修飾的細胞培養於用以產生衣康酸之一培養基中，藉此該細胞產生衣康酸。
  28. 如申請專利範圍第27項所述之產生衣康酸的方法，更包括分離該衣康酸。
  29. 一種產生衣康酸的方法，包括：產生一經基因修飾之細胞，其表現如申請專利範圍第1-8項之任一項所述之融合多胜肽；以及將該細胞培養於允許該融合多胜肽表現與衣康酸產生的條件下，藉此該細胞表現該多胜肽並產生衣康酸。
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