CN104611286A - 用于制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌、制备方法及应用 - Google Patents

用于制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌、制备方法及应用 Download PDF

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CN104611286A CN201510067179.7A CN201510067179A CN104611286A CN 104611286 A CN104611286 A CN 104611286A CN 201510067179 A CN201510067179 A CN 201510067179A CN 104611286 A CN104611286 A CN 104611286A
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pediocin
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recombinant
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陈信全
鞠兴荣
袁建
何荣
和肖营
吴学友
刘凌平
施荣华
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Abstract

本发明提供用于制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌、制备方法及应用，涉及微生物生物技术领域。所述重组菌携带由乳酸片球菌素Pediocin、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因。制备乳酸片球菌素Pediocin的方法，诱导所述重组菌，破碎得到裂解液，离心取上清液，采用HisTrap HP柱和GSTrap 4B柱分离或者采用GSTrap 4B柱分离，收集洗脱峰，采用肠激酶酶解，除去酶解液中的纯化标签，得到乳酸片球菌素Pediocin。本发明重组菌构建方便，能够高效表达重组乳酸片球菌素Pediocin，通过亲和色谱进行高效分离，水解酶切位点后得到具有活性的乳酸片球菌素Pediocin。

Description

用于制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物生物技术领域，具体涉及用于制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌、制备方法及应用。
背景技术
细菌素是一类由核糖体产生的具有抑菌活性的蛋白质或多肽，在革兰氏阳性和革兰氏阴性菌中广泛存在，其对目标细菌的抑制具有低浓度和高效性的特点。在对化学防腐剂的安全隐患越来越重视的今天，食品级微生物来源的细菌素作为生物防腐剂的应用符合消费者对于安全、健康和天然的要求。
来源于乳酸片球菌、能够专一性抑制李斯特菌的细菌素Pediocin，在食品工业中有重要的潜在应用价值。采用乳酸片球菌发酵制备Pediocin，发酵液中目标产物浓度较低，发酵液成分复杂，因此分离有活性细菌素的过程耗时费力，成本高，且纯度难以保证。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌，该重组菌构建方便，在诱导条件下能够高效表达带有纯化标签的重组乳酸片球菌素Pediocin，菌体裂解液成分简单，有利于通过亲和色谱进行高效分离，水解酶切位点后得到具有活性的乳酸片球菌素Pediocin。
本发明的另一目的是提供所述重组菌的制备方法，该方法简单，效率高。
本发明的再一目的是提供制备乳酸片球菌素Pediocin的方法，诱导培养重组菌后，仅需要通过简单的亲和色谱就能够高效分离乳酸片球菌素Pediocin，水解后除去纯化标签，就能够获得大量、高纯度、有活性的细菌素。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
本发明提供用于制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌，所述重组菌携带由乳酸片球菌素Pediocin、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因。
在本发明中，所述纯化标签通过酶切位点连接在乳酸片球菌素Pediocin的一端或两端。
在本发明中，所述纯化标签是GST标签，或者所述纯化标签是由GST标签通过酰胺键与His标签相连而成；所述酶切位点是肠激酶酶切位点。
优选的技术方案中，所述纯化标签是GST标签通过酰胺键与His标签相连而成，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
另一优选的技术方案中，所述纯化标签是GST标签，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供所述重组菌的制备方法，将由乳酸片球菌素Pediocin、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因插入表达载体得到重组载体；将所述重组载体转化大肠杆菌，得到所述重组菌。
优选的技术方案中，所述重组载体是将由乳酸片球菌素Pediocin、酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因插入表达载体pGEX-6P-1后获得。
本发明还提供制备乳酸片球菌素Pediocin的方法，诱导所述重组菌表达由乳酸片球菌素Pediocin、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白，破碎所述重组菌得到裂解液，离心取上清液，采用HisTrap HP柱和GSTrap 4B柱分离或者采用GSTrap 4B柱分离，收集含有由乳酸片球菌素Pediocin、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的洗脱峰，采用肠激酶酶解，除去酶解液中的纯化标签，得到乳酸片球菌素Pediocin。
本发明巧妙构建了制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌，在诱导条件下能够高效表达带有纯化标签的重组乳酸片球菌素Pediocin，菌体裂解液成分简单，有利于通过亲和色谱进行高效分离，水解酶切位点后得到具有活性的乳酸片球菌素Pediocin。
本发明制备乳酸片球菌素Pediocin的方法，是通过诱导重组菌表达带有纯化标签的重组乳酸片球菌素Pediocin，然后采用亲和色谱分离，水解并除去纯化标签，就能够获得大量、高纯度、有活性的细菌素，该细菌素的结构和功能与天然乳酸片球菌素Pediocin完全一致。携带有GST标签和His标签的重组Pediocin的分离纯化效果显著好于仅含有GST标签蛋白的重组Pediocin，前者得到的乳酸片球菌素Pediocin纯度也显著高于后者。
附图说明
图1为携带有乳酸片球菌素Pediocin基因的重组表达载体构建过程，其中pedAB是Pediocin的基因（包括结构和免疫基因），Ptac为乳糖操纵子和色氨酸操纵子的杂合启动子；GST为GST标签编码基因的缩写，His是His标签编码基因的缩写。
图2为重组菌1的重组Pediocin粗提液采用HisTrap HP柱分离纯化的色谱图，其中A280表示流出液在280 nm波长下的吸收值。
图3  HisTrap HP柱或GSTrap 4B柱一步分离纯化重组Pediocin的SDS-PAGE电泳结果。泳道1为重组菌1的重组Pediocin粗提液，泳道2为重组菌1的重组Pediocin粗提液经HisTrap HP柱一步分离纯化得到的重组Pediocin，泳道3为重组菌2的重组Pediocin粗提液经GSTrap 4B柱一步分离纯化得到的重组Pediocin。图中箭头所示的条带为目标蛋白所在的位置，其余条带为杂蛋白。
图4 重组菌1的重组Pediocin经HisTrap HP柱和GSTrap 4B柱两步纯化后的SDS-PAGE电泳结果。泳道1为蛋白质Marker，泳道2为经过HisTrap HP柱和GSTrap 4B柱两步纯化后获得的重组Pediocin。
图5 重组Pediocin切除标签蛋白后的活性检测。
具体实施方式
以下结合说明书附图对本发明作进一步的描述。
下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；
下述实施例中使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下面以pGEX-6p-1载体为例，对本发明作进一步的详细说明。pGEX-6P-1载体（由本实验室保藏，可以通过商业途径购买）。pGEX-6P-1载体携带有GST标签的编码基因。
实施例1
1、乳酸片球菌素Pediocin基因克隆
    根据GenBank数据库中乳酸片球菌素Pediocin基因的序列(HQ876214.1)，设计引物20（SEQ ID NO:5）：5′-ATGGCCAATATCATTGGTGGTAAATACTACGGTAATGGGG-3′和引物8（SEQ ID NO:6）：5′-CCGCTCGAGT TACCACGTAT TGGTAGTATC TAGC-3′，从乳酸片球菌PAF（Somkuti GA, Steinberg DH.2010. Pediocin production in milk by Pediococcus acidilactici in co-culture with Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. J Ind Microbiol Biotechnol. 37(1):65-69.）中扩增Pediocin的基因片段，该片段由结构基因和免疫基因组成，序列如SEQ ID NO:1所示。
乳酸片球菌素Pediocin的编码基因也可以采用化学合成的方法制备。
    2、乳酸片球菌素Pediocin基因片段的序列验证
将扩增的Pediocin的基因片段回收，然后和pEASY-Blunt Simple Cloning Vector（购自北京全式金生物技术有限公司）连接，获得重组质粒pEASY/pedAB。连接过程中，插入片段与线性载体物质的量之比约为7:1，连接温度为25℃。将重组质粒pEASY/pedAB，转化到Trans1-T1感受态细胞（购自北京全式金生物技术有限公司）中，挑选阳性克隆，过夜培养后送上海生物工程有限公司测序，序列与预期相同。
    3、制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌构建
（1）构建重组菌1
重组菌1表达由GST标签、His标签、肠激酶酶切位点和乳酸片球菌素Pediocin相连形成的重组Pediocin，重组Pediocin的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。重组菌1的构建过程如下。
第一步，构建重组表达载体，具体过程见图1。
以pEASY/pedAB重组质粒为模板，设计上游引物Ped1和下游引物Ped2，扩增由His标签、肠激酶酶切位点和Pediocin的编码基因相连形成的融合基因。其中，上游引物Ped1带His标签和肠激酶酶切位点的编码基因，Ped1的序列（SEQ ID NO:7）为：5′-GCTGGATCCCACCATCATCATCATCATGACGACGACGACAAGAAATACTACGGTAATGGGGTTACTTGTG-3′；下游引物Ped2的序列（SEQ ID NO:8）为:5′-CCGCTCGAGTTACCACGTATTGGTAGTATCTAGCATGTTAA-3′。
使用BamH I 和XhoI分别双酶切pGEX-6p-1载体和融合基因PCR产物，胶回收线性载体和PCR产物，按照插入片段与线性载体物质的量之比约为3:1的比例在16℃进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌，挑选阳性重组子，双酶切鉴定序列正确的重组质粒命名为pGEX-6p-1/pedAB。
第二步，构建重组菌1。将重组表达载体pGEX-6p-1/pedAB转化大肠杆菌表达菌株 Rosetta(DE3)，得到重组菌1。
（2）构建重组菌2
重组菌2表达由GST标签、肠激酶酶切位点和Pediocin相连形成的重组Pediocin。重组Pediocin的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
重组菌2的构建过程如下：以pEASY/pedAB质粒为模板，设计上游引物Ped01和下游引物Ped2，扩增由肠激酶酶切位点和Pediocin的编码基因相连形成的融合基因。其中，上游引物Ped01带肠激酶酶切位点的编码基因，Ped01的序列（SEQ ID NO:9）为：5′-GCTGGATCCAAATACTACGGTAATGGGGTTACTTGTG-3′；下游引物Ped2的序列（SEQ ID NO:8）为:5′-CCGCTCGAGTTACCACGTATTGGTAGTATCTAGCATGTTAA-3′。融合基因PCR扩增片段和pGEX-6p-1载体经BamH I 和XhoI双酶切后，进行连接。鉴定正确后，重组载体命名为pGEX-6p-1/pedAB-GST，转化入大肠杆菌 Rosetta(DE3)，获得重组菌2。
（3）构建重组菌3
重组菌3表达由His标签、肠激酶酶切位点和Pediocin相连形成的重组Pediocin。重组Pediocin的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
重组菌3的构建过程如下：以pEASY/durAB质粒为模板，设计上游引物Ped001和下游引物Ped2，扩增由His标签、肠激酶酶切位点和Pediocin的编码基因相连形成的融合基因。其中，上游引物Ped001携带His标签和肠激酶酶切位点的编码基因，Ped001的序列（SEQ ID NO:10）为：5′- CTGGGTACCGACGACGACGACAAGAAATACTACG -3′；下游引物Ped2的序列同上。使用KpnI 和XhoI分别双酶切pET30a载体和纯化后的融合基因PCR产物，然后将酶切产物进行连接。鉴定正确后，重组载体命名为pET/pedAB-His，转化入大肠杆菌 Rosetta(DE3) 表达菌株，获得重组菌3。
4、重组Pediocin的分离纯化
（1）IPTG诱导重组Pediocin的表达及重组Pediocin粗提液的制备
分别诱导表达重组菌1、2和3，并提取重组Pediocin粗提液。具体方法如下：
a 挑取重组菌的的单菌落，接种于装有LB液体培养基（含终浓度为50 μg/mL的氨苄青霉素）的三角瓶中，37℃、200 r/min条件下振荡培养，直至OD600在0.6到0.8之间。
b 向三角瓶中加入终浓度为1 mM的IPTG进行诱导，继续培养5 h，然后在8 000 g条件下离心5 min收集菌体，用生理盐水清洗菌体3次。用发酵液初始体积1%的结合缓冲液（含有500 mM NaCl、20 mM Na3PO4和20 mM 咪唑的水溶液，pH 7.4）悬浮菌体，置于冰水混合物中超声破碎菌体细胞，直至菌体溶液澄清，得到菌体裂解液。将菌体裂解液在4℃条件下离心（15 000 g，30 min），取上清，用0.22 μm的滤膜过滤，得到重组Pediocin粗提液。
（2）HisTrap HP柱(购自GE公司）对重组Pediocin的纯化（使用蛋白纯化系统进行）
对重组菌1和3的重组Pediocin粗提液采用HisTrap HP柱进行分离，具体方法如下：
a 用去离子水充满管路，对各个接头进行湿接，以免引入气泡。
b 去掉柱子的上、下堵头，用3～5个柱体积的ddH2O替换柱子中的乙醇，然后用至少5个柱体积的结合缓冲液（含有500 mM NaCl、20 mM Na3PO4和20 mM 咪唑的水溶液，pH 7.4）平衡柱子。流速为1 mL/min。
c 上样。
d 用结合缓冲液洗到基线稳定。
e 用5～10个柱体积的洗脱缓冲液（含有500 mM NaCl、20 mM Na3PO4和500 mM 咪唑的水溶液，pH 7.4）洗脱结合到柱子上的蛋白。
使用紫外检测器，检测波长为280nm。重组菌1的重组Pediocin粗提液采用HisTrap HP柱分离的色谱图如图2所示，收集洗脱峰进行脱盐处理，并同时进行SDS-PAGE电泳，电泳结果见图3泳道2。重组菌3的重组Pediocin粗提液在色谱分离过程中，无洗脱峰出现。上述结果说明，只携带His标签的重组Pediocin不存在于上述粗提液中。进一步对重组菌3的裂解液沉淀进行SDS-PAGE电泳检测，也未发现有重组蛋白条带出现，表明只携带His标签的重组Pediocin未被表达。
（3）脱盐
重组菌1的重组Pediocin粗提液采用HisTrap HP柱分离所得的洗脱峰采用如下方法脱盐：
    a：用结合缓冲液（含有140 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4和1.8 mM KH2PO4的水溶液，pH7.4）平衡HiTrapTMDesalting 5ml柱（购自GE公司）。
    b：取1.5 mL样品上样，使用紫外和电导检测器监测流出液，保持流速在1~10 mL/min，收集洗脱峰。取洗脱峰采用GSTrap 4B柱进行纯化。
（4）GSTrap 4B柱(购自GE公司）对重组Pediocin的纯化
    将重组菌1的重组Pediocin粗提液采用HisTrap HP柱分离、脱盐后采用GSTrap 4B柱进行分离。将重组菌2的重组Pediocin粗提液采用GSTrap 4B柱进行分离。具体方法如下：
  a 用结合缓冲液（含有140 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4和1.8 mM KH2PO4的水溶液，pH7.4）充满管路，对各个接头进行湿接。
  b 去掉柱子上下堵头。
  c 用至少5个柱子体积的结合缓冲液平衡柱子。
  d 以1 mL/min的流速上样。
  e 用结合缓冲液洗到基线稳定。
  f 用5～10个柱体积的洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl缓冲液中含有10 mM还原型谷胱甘肽，pH8.0）洗脱结合到柱子上的蛋白，收集洗脱峰。重组菌1和重组菌2的重组Pediocin的分离色谱图与图2类似。
    （5）脱盐
重组菌1和2的重组Pediocin采用GSTrap 4B柱分离得到的洗脱峰分别采用如下方法进行脱盐：
   a用裂解缓冲液（含有25 mM Tris-HCl、2 mM CaCl2和50 mM NaCl的水溶液，pH 7.6）平衡HiTrapTMDesalting 5ml柱（购自GE公司）。
   b 上样品1.5 mL，使用紫外和电导检测器监测流出液，保持流速在1~10 mL/min，收集洗脱峰作为重组Pediocin。取洗脱峰进行SDS-PAGE电泳，其中重组菌2的重组Pediocin的电泳结果见图3泳道3；重组菌1的重组Pediocin的电泳结果见图4。
    5、重组Pediocin纯化标签的切除与乳酸片球菌素Pediocin的抑菌活性检测：
将本实施例标题4中步骤（5）脱盐后得到的重组菌1的重组Pediocin，采用肠激酶在25℃条件下酶切16 h，将酶切反应后的混合物通过His Trap HP柱和GST Trap 4B柱除去其中的His标签和GST标签，收集最后一个柱子中的流出液即得乳酸片球菌素Pediocin，经质谱鉴定，其纯度为95%，且氨基酸序列与天然乳酸片球菌素Pediocin完全一致，并且对指示菌（无害李斯特菌）具有抑制活性（图5）。重组菌1的重组Pediocin分离纯化效果及得到的乳酸片球菌素Pediocin的活性见表1。
将本实施例标题4中步骤（5）脱盐后得到的重组菌2的重组Pediocin，采用肠激酶在25℃条件下酶切16 h，将酶切反应后的混合物通过GST Trap 4B柱除去其中的GST标签，收集流出液即得乳酸片球菌素Pediocin，经质谱鉴定，其纯度为81%，且氨基酸序列与天然细菌素Pediocin完全一致，并且对指示菌（无害李斯特菌）具有抑制活性（图5）。重组菌2的重组Pediocin分离纯化效果及得到的乳酸片球菌素Pediocin的活性检测见表1。
乳酸片球菌素Pediocin的活性通过二倍稀释法进行检测确定，培养基中加入0.5%(v/v)的无害李斯特菌为指示菌。具体方法见参考文献（Lihui Du, George A. Somkuti, John A. Renye Jr. Guicheng Huo. 2012. Properties of Durancin GL, a new antilisterial bacteriocin produced by Enterococcus Durans 41D. Journal of food safety, 32:74-83.）。抑菌圈的出现表明切除标签蛋白后的乳酸片球菌素Pediocin同样具有抑制李斯特菌生长的活性。
表1 重组菌1和2的重组细菌素Pediocin的分离纯化及乳酸片球菌素Pediocin活性效果
注意：表中“相对得率”指以重组菌2纯化获得的乳酸片球菌素Pediocin总活力为参照的相对比值；“N”代表不能进行相应操作。“纯度”是通过BIO-RAD ChemiDoc XRS 凝胶成像系统软件直接分析SDS-PAGE电泳图片的条带相对亮度获得。“第一次”是指酶切处理前的亲和层析。
表1中的乳酸片球菌素Pediocin是经纯化、酶切后除去纯化标签所得，其氨基酸序列与天然乳酸片球菌素Pediocin一致。若将得到的乳酸片球菌素Pediocin活性换算到单位发酵液体积，则重组菌1和2单位体积发酵液获得的乳酸片球菌素Pediocin活性分别是119.5AU/mL和128AU/mL。由表1可以看出：携带有两种纯化标签的重组Pediocin经分离纯化后，纯度达到了92.1%，酶切后再次纯化得到的乳酸片球菌素Pediocin的纯度达到了95%；仅携带有单一GST标签的重组Pediocin经分离纯化后，纯度仅仅只有78.4%，酶切后再次纯化得到的乳酸片球菌素Pediocin的纯度达到了81%。携带有两种纯化标签的重组Pediocin并未影响该重组细菌素的外源表达效果。因此，采用本发明方法，诱导培养重组菌1后，不仅单位体积发酵液获得了大量的纯度非常高的细菌素Pediocin，且仅需采用简单的亲和层析就能够获得高纯度的乳酸片球菌素Pediocin。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  南京财经大学
 
<120>  用于制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌、制备方法及应用
 
<130>  20150206
 
<160>  10   
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  502
<212>  DNA
<213>  乳酸片球菌PAF
 
<400>  1
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gctaccactt gcataatcaa taatggagct atggcatggg ctactggtgg acatcaaggt    120
 
aatcataaat gctagcatta tgctgagctg gcatcaataa aggggtgatt ttatgaataa    180
 
gactaagtcg gaacatatta aacaacaagc tttggactta tttactaggc tacagttttt    240
 
actacagaag cacgatacta tcgaacctta ccagtacgtt ttagatattc tggagactgg    300
 
tatcagtaaa actaaacata accagcaaac gcctgaacga caagctcgtg tagtctacaa    360
 
caagattgcc agccaagcgt tagtagataa gttacatttt actgccgaag aaaacaaagt    420
 
tctagcagcc atcaatgaat tggcgcattc tcaaaaaggg tggggcgagt ttaacatgct    480
 
agatactacc aatacgtggt aa                                             502
 
 
<210>  2
<211>  286
<212>  PRT
<213>  artificial
 
<220>
<223>  重组Pediocin
 
<400>  2
 
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1               5                   10                  15     
 
 
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
            20                  25                  30         
 
 
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
        35                  40                  45             
 
 
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60                  
 
 
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65                  70                  75                  80 
 
 
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
                85                  90                  95     
 
 
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
            100                 105                 110        
 
 
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
        115                 120                 125            
 
 
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
    130                 135                 140                
 
 
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145                 150                 155                 160
 
 
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
                165                 170                 175    
 
 
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
            180                 185                 190        
 
 
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
        195                 200                 205            
 
 
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu
    210                 215                 220                
 
 
Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser His His His His His His Asp Asp Asp
225                 230                 235                 240
 
 
Asp Lys Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Thr Cys Gly Lys His Ser Cys
                245                 250                 255    
 
 
Ser Val Asp Trp Gly Lys Ala Thr Thr Cys Ile Ile Asn Asn Gly Ala
            260                 265                 270        
 
 
Met Ala Trp Ala Thr Gly Gly His Gln Gly Asn His Lys Cys
        275                 280                 285    
 
 
<210>  3
<211>  280
<212>  PRT
<213>  artificial
 
<220>
<223>  重组Pediocin
 
<400>  3
 
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1               5                   10                  15     
 
 
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
            20                  25                  30         
 
 
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
        35                  40                  45             
 
 
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60                 
 
 
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65                  70                  75                  80 
 
 
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
                85                  90                  95      
 
 
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
            100                 105                 110        
 
 
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
        115                 120                 125            
 
 
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
    130                 135                 140                
 
 
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145                 150                 155                 160
 
 
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
                165                 170                 175    
 
 
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
            180                 185                 190        
 
 
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
        195                 200                 205            
 
 
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu
    210                 215                 220                
 
 
Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Lys Tyr Tyr Gly
225                 230                 235                 240
 
 
Asn Gly Val Thr Cys Gly Lys His Ser Cys Ser Val Asp Trp Gly Lys
                245                 250                 255    
 
 
Ala Thr Thr Cys Ile Ile Asn Asn Gly Ala Met Ala Trp Ala Thr Gly
            260                 265                 270        
 
 
Gly His Gln Gly Asn His Lys Cys
        275                 280
 
 
<210>  4
<211>  87
<212>  PRT
<213>  artificial
 
<220>
<223>  重组Pediocin
 
<400>  4
 
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1               5                   10                  15     
 
 
Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp
            20                  25                  30         
 
 
Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Lys Tyr Tyr Gly Asn
        35                  40                  45              
 
 
Gly Val Thr Cys Gly Lys His Ser Cys Ser Val Asp Trp Gly Lys Ala
    50                  55                  60                 
 
 
Thr Thr Cys Ile Ile Asn Asn Gly Ala Met Ala Trp Ala Thr Gly Gly
65                  70                  75                  80 
 
 
His Gln Gly Asn His Lys Cys
                85         
 
 
<210>  5
<211>  40
<212>  DNA
<213>  artificial
 
<220>
<223>  引物20
 
<400>  5
atggccaata tcattggtgg taaatactac ggtaatgggg                           40
 
 
<210>  6
<211>  34
<212>  DNA
<213>  artificial
 
<220>
<223>  引物8
 
<400>  6
ccgctcgagt taccacgtat tggtagtatc tagc                                 34
 
 
<210>  7
<211>  70
<212>  DNA
<213>  artificial
 
<220>
<223>  Ped1
 
<400>  7
gctggatccc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca agaaatacta cggtaatggg     60
 
gttacttgtg                                                            70
 
 
<210>  8
<211>  41
<212>  DNA
<213>  artificial
 
<220>
<223>  Ped2
 
<400>  8
ccgctcgagt taccacgtat tggtagtatc tagcatgtta a                         41
 
 
<210>  9
<211>  37
<212>  DNA
<213>  artificial
 
<220>
<223>  Ped01
 
<400>  9
gctggatcca aatactacgg taatggggtt acttgtg                              37
 
 
<210>  10
<211>  34
<212>  DNA
<213>  artificial
 
<220>
<223>  Ped001
 
<400>  10
ctgggtaccg acgacgacga caagaaatac tacg                                 34
 
 

Claims (8)

1.用于制备乳酸片球菌素Pediocin的重组菌，其特征在于所述重组菌携带由乳酸片球菌素Pediocin、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因。
2.根据权利要求1所述重组菌，其特征在于所述纯化标签通过酶切位点连接在乳酸片球菌素Pediocin的一端或两端。
3.根据权利要求2所述重组菌，其特征在于所述纯化标签是GST标签，或者所述纯化标签是由GST标签通过酰胺键与His标签相连而成；所述酶切位点是肠激酶酶切位点。
4.根据权利要求3所述重组菌，其特征在于所述纯化标签是GST标签通过酰胺键与His标签相连而成，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求3所述重组菌，其特征在于所述纯化标签是GST标签，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
6.权利要求1-5之一所述重组菌的制备方法，其特征在于将由乳酸片球菌素Pediocin、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因插入表达载体得到重组载体；将所述重组载体转化大肠杆菌，得到所述重组菌。
7.根据权利要求6所述重组菌的制备方法，其特征在于所述重组载体是将由乳酸片球菌素Pediocin、酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因插入表达载体pGEX-6P-1后获得。
8.制备乳酸片球菌素Pediocin的方法，其特征在于诱导权利要求1-5之一所述重组菌表达由乳酸片球菌素Pediocin、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白，破碎所述重组菌得到裂解液，离心取上清液，采用HisTrap HP柱和GSTrap 4B柱分离或者采用GSTrap 4B柱分离，收集含有由乳酸片球菌素Pediocin、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的洗脱峰，采用肠激酶酶解，除去酶解液中的纯化标签，得到乳酸片球菌素Pediocin。
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