CN102649946A - dcf1基因对大脑神经细胞发育的新用途 - Google Patents

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文铁桥
冯瑞丽
张智峰
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Abstract

本发明涉及一种dcf1基因对大脑神经细胞发育的新用途。本发明通过脑切片免疫荧光及体外培养原代神经干细胞的方法对神经元迁移和神经干细胞增殖能力做出判断，结果发现dcf1能促进影响神经元的迁移，dcf1缺失使神经干细胞增殖能力减弱。

Description

dcf1 基因对大脑神经细胞发育的新用途
技术领域
本发明涉及一种dcf1基因对大脑神经细胞发育的新用途。
背景技术
树突状细胞因子（dendritic cell factor 1，dcf1）又名跨膜蛋白59（transmembrane protein 59，TMEM59），是单次跨膜蛋白，在神经系统中具有重要功能，参与维持神经干细胞的干细胞状态及干细胞的分化。2008年Wang, L; et al针对dcf1的 RNAi研究证明：dcf1影响C17.2及原代神经干细胞的分化。在神经干细胞中，过量表达dcf1，可使神经干细胞维持未分化状态，而沉默dcf1的表达则能使神经干细胞进入分化状态。2012年 Li, X; et al通过小分子microRNA-351下调dcf1的表达，神经干细胞系C17.2向胶质方向分化。2010年JBC一篇文章报道了dcf1（TMEM59）够调节淀粉样前体蛋白（APP）的分泌，表明dcf1与神经性退行疾病Alzheimer's disease（AD）有关。
神经发育包括胚胎形成时期的神经发生，神经系统形成以及生命晚期神经系统的重塑三个部分。神经发育过程中有很多重要事件，主要有：神经祖细胞分化产生神经元；新生神经元迁移至行使功能位点；轴突与树突产生；引导生长锥至突触后膜效应器；突触形成；突触在整个生命过程中不断产生与消失即突触可塑性，它学习与记忆的关键。神经发育的缺陷会导致认知、运动以及智力损伤，严重时会产生神经性疾病如孤独症、Rett syndrome（瑞特综合症）、智力迟钝等。
发明内容
发明的目的之一在于通过dcf1基因敲除小鼠与野生型小鼠，提供一种dcf1基因在促进神经元迁移中的应用。
本发明的目的之二在于提供一种dcf1基因在增强神经干细胞增殖能力中的应用。
本发明通过在母鼠怀孕的不同时期注射胸腺嘧啶类似物BrdU标记神经细胞，BrdU可在DNA复制时掺入新合成的DNA，通过控制细胞暴露在BrdU中的时间，可以实现用BrdU标记不同的细胞，若BrdU标记时间不大于S期时间，则BrdU标记正在进行DNA复制的细胞即处于S期的细胞。若BrdU标记时间大于一个细胞周期，则BrdU标记新生神经细胞。我们采用对怀孕的杂合子母鼠（dcf1+/−）腹腔注射BrdU的方式，标记同窝的dcf1+/+和dcf1−/−小鼠新生的神经元，研究dcf1缺失对神经元迁移的影响。在E14.5、E15.5注射BrdU，分别在E16.5、E17.5、E18.5以及P7通过anti-BrdU免疫检测新生神经元的分布情况。在E15.5天注射BrdU，90分钟后取出胎鼠进行BrdU分析，此时BrdU+细胞为处于S期的神经祖细胞，S期神经祖细胞的多少可以反映神经祖细胞的增殖能力。进一步通过神经干细胞体外培养研究神经干细胞增殖能力。
本发明通过脑切片免疫荧光及体外培养原代神经干细胞的方法对神经元迁移和神经干细胞增殖能力做出判断，结果发现dcf1能促进影响神经元的迁移，dcf1缺失使神经干细胞增殖能力减弱。
附图说明
图 1 为小鼠基因型鉴定。通过特异引物鉴定小鼠基因型。dcf1+/-小鼠有三条带分别为：400bp、700bp和2000bp； dcf1+/+小鼠有两条带：400bp和2000bp；dcf1-/-小鼠只有一条700bp的条带。
图 2 为dcf1剔除小鼠（dcf1-/-）与野生型（dcf1+/+）小鼠脑部BrdU标记模式。图A-F,孕期14.5天（E14.5）注射BrdU，E17.5进行检测。比较发现dcf1-/-（图D，E，F）小鼠皮层BrdU阳性细胞比同窝的dcf1+/+（图A，B，C）小鼠明显减少，尤其在背侧皮质的深部（图 B, E）和皮质侧面（图 C, F）更为明显。图C，D，E，F分别为图A和B的局部高倍图片。图G-I， 孕期14.5天（E14.5）注射BrdU，P7进行检测。相比dcf1+/+（G），dcf1-/-（H）在皮质的Ⅰ层，Ⅱ/Ⅲ层和Ⅴ层BrdU阳性细胞显著减少。数据以平均数±标准误表示。*p<0.05，**p<0.01。 n = 3 。（20um，冰冻切片；标尺：200um.）。
图 3 为E14.5天注射BrdU，E16.5天观察小鼠脑部BrdU标记模式。dcf1-/-（图B）小鼠皮质区BrdU阳性细胞比同窝的dcf1+/+（图A）小鼠明显减少。 （20um，冰冻切片；标尺：200um.）。
图 4 为E15.5天注射BrdU，E18.5天观察小鼠脑部BrdU标记模式。dcf1-/-（图D，E，F）小鼠皮层BrdU阳性细胞与同窝的dcf1+/+（图A，B，C）小鼠相比无明显差异，图C，D，E，F分别为图A和B的局部高倍图片（C,E为皮层背面，D，F为皮层侧面）。（20um，冰冻切片；标尺：200um.）。
图 5 为dcf1剔除小鼠神经元形态异常。Anti-MAP-2在E18.5天时标记神经元，dcf1+/+皮质神经元呈紧密的放射状排列模式（图A，B，C）, dcf1-/-的皮质神经元排列紊乱，无明显放射状结构（图D，E，F）。其中A和D为细胞核；B和E为MAP-2；C和F为叠加（merge）的图片。(20um，冰冻切片； 标尺：200um.)。
图 6 为dcf1敲除影响神经祖细胞的增殖。E15.5天HE孕鼠腹腔注射BrdU，标记90分钟后取出胚胎进行分析。dcf1-/-（图B,D）小鼠VZ/SVZ区BrdU阳性细胞与同窝的dcf1+/+（图A,C）小鼠相比明显减少即dcf1-/- VZ/SVZ区处于S期的神经祖细胞数量少于同窝野生型小鼠。图C，D，分别为图A和B的局部高倍图片。（15um，冰冻切片；标尺：200um或50um）。
图 7 为dcf1缺失神经干细胞增殖能力减弱。E13.5/E14.5胚胎端脑神经干细胞原代培养，dcf1+/+小鼠（图A）与dcf1-/-小鼠（图B）神经球明视野图片，分别对dcf1-/-与dcf1+/+神经球直径进行统计分析（图C），图表用不同区段神经球数量占总数的百分比表示。dcf1-/-神经球直径在0-50um与50-100 um之间的百分比均明显高于野生型，在100-150um及150-200um范围内的神经球则明显少于dcf1+/+。数据以平均数±标准误表示，*p<0.05。（标尺：200um） 。
具体实施方式
实施例一：小鼠基因型鉴定
在小鼠4周龄时剪取0.3mm小鼠尾巴抽提基因组，通过PCR鉴定小鼠基因型（图1）。dcf1+/-小鼠有三条带分别为：400bp、700bp和2000bp； dcf1+/+小鼠有两条带：400bp和2000bp；dcf1-/-小鼠只有一条700bp的条带。
实施例二：dcf1缺失影响神经元迁移
用杂合子（dcf1+/-）与杂合子（dcf1+/-）交配，孕鼠以100 mg/ kg腹腔注射BrdU（10mg/ml），标记同窝的dcf1+/+和dcf1−/−小鼠新生的神经元，研究dcf1缺失对神经元迁移的影响。在E14.5、E15.5注射BrdU，分别在E16.5、E17.5、E18.5以及P7通过anti-BrdU免疫检测新生神经元的分布情况。在E16.5、E17.5及E18.5时，麻醉母鼠，解剖胎鼠取出脑袋，4%PFA固定4-6小时（P7小鼠灌流后取出鼠脑固定过），蔗糖梯度脱水后，冰冻切片20um，室温晾干切片后置于冰箱待用。anti-BrdU免疫过程：①将BrdU标记过的切片从冰箱取出后晾干，②0.01M PBS洗三次每次5min去除切片周围的OTC包埋剂。③2M HCL 37℃孵育30min后0.01M PBS洗三次,每次5min。④0.03% PBST室温30min。⑤0.01M PBS洗三次, 每次5min.⑥10%山羊血清室温30min。⑦Anti-BrdU单抗（1:100，biolegend）4℃过夜。⑧0.01M PBS洗五次每次5min。⑨二抗（goat-anti-mouse-FITC，1:400）室温2小时，之后0.01M PBS洗五次每次5min。⑩荧光封片剂封片，显微镜观察。结果显示： E14.5注射BrdU，E17.5进行检测时dcf1-/-小鼠背侧皮质的深部即皮质的Ⅴ/Ⅵ层即皮质侧面神经元显著减少， E14.5注射BrdU，P7进行检测。dcf1-/-在皮质的Ⅰ层，Ⅱ/Ⅲ层和Ⅴ层BrdU阳性细胞显著减少（图2）。E14.5天注射BrdU，E16.5天检测结果同E14.5-E17.5（图3），然而E15.5注射，E18.5检测室并没有差异（图4）。说明dcf1影响早期神经元迁移，使本该迁移至Ⅰ层，Ⅱ/Ⅲ层和Ⅴ层的神经元减少。
实施例三：dcf1剔除影响神经元形态
anti-MAP-2免疫标记神经元，观察神经元形态，①将玻片从冰箱中取出，挑选合适的切片，室温晾干。②0.01M PBS洗三次，每次5min。③0.2%PBST室温孵育30min。④0.01M PBS洗三次，每次5min。⑤5%BSA室温封闭1-2小时。⑥弃去封闭液。滴加anti-MAP-2（1:400，abcam），4℃过夜。⑦0.01M PBS洗三次，每次5min。⑧二抗（goat-anti-rabbit-FITC，1:400）室温2小时。⑨滴加DAPI工作液室温8min。⑩0.01M PBS洗五次每次5min，荧光封片剂封片，显微镜观察。发现dcf1-/-小鼠大脑皮层神经元排列紊乱，明显的放射结构消失（图5），说明dcf1-/-神经元在迁移过程中取向紊乱，致使形态异常。
实施例四：dcf1敲除影响神经祖细胞的增殖
在E15.5天注射BrdU，90分钟后取出胎鼠进行BrdU分析，此时BrdU+细胞为处于S期的神经祖细胞，S期神经祖细胞的多少可以反映神经祖细胞的增殖能力，从而决定了其产生神经元的多少。实验结果显示：dcf1敲除小鼠E15.5天时S期神经祖细胞减少，神经祖细胞增殖能力下降（图6）。
实施例五：dcf1缺失减弱体外神经干细胞增殖能力
为进一步研究dcf1对神经祖细胞增殖能力的影响，我们分别取出dcf1-/-小鼠与dcf1+/+小鼠E13.5或E14.5胚胎的端脑制成单细胞悬液进行神经干细胞体外培养。①孕鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3ml/kg进行麻醉。75%酒精消毒孕鼠腹部，“V”字形剪开腹部，取出胚胎，放在装有预冷D-Hank’s液的培养皿内。②在超净台取下胎鼠脑袋，放进装有冷D-Hank’s的培养皿内；左手用显微镊夹住两眼睛处固定脑袋，右手用另一显微镊划开脑颅、暴露整个鼠脑，并取出，置于另一装有冷D-Hank’s的培养皿；在体视显微镜下去除端脑表面的脑膜；然后将端脑置于装有1ml冷D-Hank’s的1.5ml EP管中。③取完所有端脑后，将其转移到15ml离心管中，用光头吸管轻轻吹打几下后，静置一分钟左右待大部分组织沉淀后弃去上清。加入4ml 冷D-Hank’s液，用1ml枪头轻柔吹打20次左右，静置后将上清转移至另一离心管中；沉淀中再加入4ml冷 D-Hank’s液吹打。重复2-3次后，端脑组织基本制备成细胞悬液。（注意：所有操作在冰上进行！）④收集细胞悬液，以1000r/min离心5分钟。⑤弃去上清液，沉淀用神经干细胞培液重新悬浮。用滴管轻轻混匀后，吸取少量悬液，加入等量台盼兰，计数板计数未着色圆形细胞，算出细胞悬液中具有活性的细胞的密度。⑥将细胞密度调整为5×104个/ ml，接种于60mm的培养皿中。于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。隔2-3天换一次细胞培液。⑦培养6-7天后，显微镜下观察，拍照，统计神经球的直径（图7）。发现dcf1缺失导致神经球体积减小，说明神经球内的细胞数量较少，神经干细胞增殖能力减弱。

Claims (2)

1.一种dcf1基因在促进神经元迁移中的应用。
2.一种dcf1基因在增强神经干细胞增殖能力中的应用。
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