CN101003801A - 神经干细胞分化和抑制分化的调控方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了调控与神经干细胞分化发育有关的基因表达的技术。本发明也提供了该技术相应的表达载体、核酸序列。本发明提供了实施该技术的详细步骤。

Description

神经干细胞分化和抑制分化的调控方法

技术领域

本发明涉及神经干细胞分化和抑制分化的调控方法，特别是利用dendritic cellfactor(DCF1)基因来抑制神经干细胞的分化；而通过DCF1的沉默来诱导神经干细胞的分化。

背景技术

世界人口的老龄化导致神经退行性疾病，包括阿尔兹海默症，帕金森症的发病率上升，这成为一个日益严重的社会问题。同时各种神经系统的损伤例如脊髓损伤、缺血性中风等，也严重威胁人类健康。一直以来，这些中枢神经系统疾病的治疗，不管是药物治疗还是外科手术治疗，都只是一种症状性治疗，缺乏有效的治愈手段。近年来，神经干细胞研究的进展为神经系统疾病的治疗开辟了一条新的道路，提供了更加有效和可行的手段。

神经干细胞来源于神经系统或能产生神经组织的细胞，它具有自我更新及增殖能力和定向分化能力。将神经干细胞移植到受损部位，在经过一定的增殖期后，在体内环境中可分化成机体内的特定神经功能细胞，完成特定的神经功能。神经干细胞移植对治疗目前常规方法难以见效的神经疾患提供了广阔的思路和诱人的前景，移植后的康复技术可促进神经细胞的分化与参与神经功能重建。

神经干细胞移植存在诸多技术上的难题。其中移植后神经干细胞的存活以及分化并参与神经网络重建的能力成为人们关注的焦点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种神经干细胞分化和抑制分化的调控方法。通过对dendritic cell factor(DCF1)基因的调控，建立调控神经干细胞分化和抑制分化的方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种神经干细胞分化和抑制分化的调控方法，其特征在于该方法为：将DCF1基因转染神经干细胞，以抑制神经干细胞的分化；通过沉默载体psiRNA，使DCF1基因mRNA的表达显著下调，以诱导神经干细胞分化，以此来调控神经干细胞的分化和抑制分化。

所述的抑制神经干细胞的分化的具体步骤如下：

a)根据DCF1全长基因序列设计引物上游和下游引物，以神经干细胞mRNA文库为模板PCR扩增得到全长基因DCF1；

b)将上述的DCF1基因插入荧光质粒载体pEGFP-C1的多克隆位点，构建重组载体pEGFP-C1-DCF1；

c)以阳离子脂质体转染试剂梭华SofastTM介导DNA的转染，将pEGFP-C1-DCF1转染神经干细胞。

所述的诱导神经干细胞分化的具体步骤如下：在沉默载体psiRNA中插入21bp的发卡结构来转录可沉默目标片段的siRNA，以Lipofectamin2000介导RNAi质粒的转染，使DCF1基因mRNA的表达显著下调。

所设计的引物上游和下游引物分别为：

上游引物：5’-CTATGGTACCATGGCGGCGCCAAAGGGGAA-3’

下游引物：5’-ACTAGGTACCGATTTCTGAGTGAGCAAGGT-3’

所述的21bp的发卡结构为：

片段1：5′tcccaggaagaggagttatacgca ttc aag aga tgcgtataactcctcttcctt 3′

片段2：5′tcccaatcggaccaagctggaatg ttc aag aga cattccagcttggtccgattt 3′

所调控的神经干细胞是C17.2神经干细胞。

dendritic cell factor(DCF1)基因在神经干细胞分化过程中差异表达，本发明克隆了这一基因并构建了表达载体，同时构建了沉默该基因的载体。通过对该基因的调控，建立了调控神经干细胞分化和抑制分化的方法，可增加移植后细胞的存活增殖能力以及分化能力。

附图说明

图1为转染pEGFP-C1的神经干细胞的形态

图2为转染pEGFP-C1-DCF1的神经干细胞的形态

图3为转染pEGFP-C1和pEGFP-C1-DCF1的神经干细胞的轴突长度统计分析

图4为转染沉默载体后的神经干细胞中基因的下调

1.细胞转染psiRNA-DCF1后DCF1mRNA的表达。P-1，P-2表达明显下调，而阴性对照P-3和未转染的细胞CK表达量高。

2.转染psiRNA-DCF1的细胞中β-actin的mRNA表达量维持不变。

图5为抑制DCF1后神经干细胞的分化，转染后的细胞用G418筛选2周后用免疫荧光试剂检测其分化情况。

1-2：用psiRNA-1处理的细胞，NSE免疫染色结果呈阳性。

3-4：用psiRNA-2处理的细胞，NSE免疫染色结果呈阳性。

5：用psiRNA-3处理的细胞，NSE免疫染色结果呈阳性。

6-7：用psiRNA-1处理的细胞，GFAP免疫染色结果呈阳性。

8-9：用psiRNA-2处理的细胞，GFAP免疫染色结果呈阳性。

10：用psiRNA-3处理的细胞，GFAP免疫染色结果呈阴性。

具体实施方式

本实施例包括如下步骤：

1.重组荧光质粒载体pEGFP-C1-DCF1的构建

pEGFP-C1是一种哺乳动物表达载体，其报告基因编码的绿色荧光蛋白GFP受395nm的近紫外光或470～490nm的蓝光激发能发出510nm的绿色荧光。根据DCF1全长基因序列设计引物上游和下游引物，以神经干细胞mRNA文库为模板PCR扩增得到全长基因DCF1。将DCF1基因插入荧光质粒载体pEGFP-C1的多克隆位点，构建重组载体pEGFP-C1-DCF1。

上、下游引物序列如下，为了方便与载体连接，放入了Kpn1衔接位点

上游引物：5’-CTAT GGTACCATGGCGGCGCCAAAGGGGAA-3’

                  Kpn1

下游引物：5’-ACTA GGTACCGATTTCTGAGTGAGCAAGGT

                  Kpn1

以神经干细胞mRNA文库为模板得到972bp的片段，将其连入PMD18-T载体，测序以及BamH1酶切鉴定，证实该片段即为DCF1基因。

将PCR产物割胶回收后，连接pEGFP-C1载体，Kpn1酶切鉴定。酶切鉴定和基因测序表明成功构建重组载体pEGFP-C1-DCF1。

2，RNAi载体psiRNA-1，psiRNA-2的构建

本发明采用RNAi的方法来抑制DCF1基因的表达。RNAi是一种小的19-21bp的双链RNA分子(siRNA)在mRNA水平关闭相应序列基因的表达使其沉默的过程，是一种序列特异性的转录后沉默。虽然siRNA可以直接化学合成，但是为了得到稳定长时沉默效果，本发明采用构建RNAi载体的方式，通过带有启动子的载体在细胞内直接启动siRNA的转录合成。首先设计目标片段，合成引物。通过在沉默载体psiRNA中插入21bp的发卡结构来转录可沉默目标片段的siRNA。

基于DCF1基因序列，分别合成了如下3个含21bp发卡结构DNA片段。

片段1：5′tcccaggaagaggagttatacgca ttc aag aga tgcgtataactcctcttcctt 3′

片段2：5′tcccaatcggaccaagctggaatg ttc aag aga cattccagcttggtccgattt 3′

片段3：5′tcccagacctaggtactatgcgaa ttc aag aga ttcgcatagtacctaggtctt 3′

上述1，2片段位于DCF1基因的187，277位置。片段3为无关序列引物作为实验对照。

本发明采用带有H1启动子的载体psiRNA。分别插入的外源片段1，2，3取代原psiRNA载体中的Alpha-peptide和Nco1，Ase1酶切序列，用T4连接酶连接，16℃反应温度下连接16小时。蓝白斑筛选阳性克隆。阳性克隆进一步用Nco1酶切鉴定。测序结果表明所设计的3段发卡结构的片段已成功插入psiRNA载体，分别命名为psiRNA-1，psiRNA-2，psiRNA-3。

3.神经干细胞分化的抑制

以阳离子脂质体转染试剂梭华(SofastTM)介导DNA的转染。分别将pEGFP-C1-DCF1和pEGFP-C1转染C17.2神经干细胞48h后，将转染细胞放在激发波长为488nm的荧光显微镜下观测GFP表达，参见图1。转染pEGFP-C1-DCF1的神经干细胞形态，参见图2与图1明显不同，对照为多突起状，而实验组细胞突起消失或明显变短。数据分析表明转染pEGFP-C1-DCF1的神经干细胞突起长平均为3μm，比对照平均60μm短，参见图3。

神经干细胞分化过程中一个重要的事件是轴突与树突等突起的形成，而DCF1基因的导入对神经细胞突起的形成有减弱或抑制作用，所以对于保持神经干细胞的未分化状态起着重要的作用。

4.神经干细胞分化的诱导

以Lipofectamin2000介导RNAi质粒的转染。由于质粒上带有G418筛选标记，为了富集阳性细胞，用G418筛选2周。2周后一部分细胞用于RT-PCR检测DCF1基因的mRNA表达水平。一部分细胞用于免疫荧光染色检测其分化情况。

RT-PCR实验表明，在转染psiRNA-1，psiRNA-2的C17.2细胞中，DCF1基因mRNA的表达显著下调，参见图4。转染后的细胞用G418筛选2周后用免疫荧光试剂检测其分化情况。

NSE(neuron-specific enloase)为神经元特异性抗体；GFAP(glial fibrillary acidicprotein)为神经胶质细胞特异性抗体。将NSE与FITC绿色荧光二抗偶联，GFAP与TRITC红色荧光二抗偶联，对转染后的细胞进行荧光免疫实验检测细胞分化情况。实验结果显示，DCF1基因下调导致了神经干细胞分化成神经元和神经胶质细胞，参见图5。标准细胞记数方法统计分析表明，10％左右的神经干细胞分化为胶质细胞，1％左右的神经干细胞分化为神经元，其在体外分化的比例为1∶10左右，与两种神经细胞在体内分化的比例相似。

序列表

<110>上海大学

<120>神经干细胞分化和抑制的调控方法

<160>3

<170>

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

ctatggtacc atggcggcgc caaaggggaa                               30

<210>2

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<221>misc_RNA

<223>引物

<400>2

tcccaggaag aggagttata cgcattcaag agatgcgtat aactcctctt cctt    54

<210>3

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<221>misc_RNA

<223>引物

<400>3

tcccaatcgg accaagctgg aatgttcaag agacattcca gcttggtccg attt    54

Claims (6)

1.一种神经干细胞分化和抑制分化的调控方法，其特征在于该方法为：将DCF1基因转染神经干细胞，以抑制神经干细胞的分化；通过沉默载体psiRNA，使DCF1基因mRNA的表达显著下调，以诱导神经干细胞分化，以此来调控神经干细胞的分化和抑制分化。

2.根据权利要求1所述的神经干细胞分化和抑制分化的调控方法，其特征在于所述的抑制神经干细胞的分化的具体步骤如下：

a.根据DCF1全长基因序列设计引物上游和下游引物，以神经干细胞mRNA文库为模板PCR扩增得到全长基因DCF1；

b.将上述的DCF1基因插入荧光质粒载体pEGFP-C1的多克隆位点，构建重组载体pEGFP-C1-DCF1；

c.以阳离子脂质体转染试剂梭华SofastTM介导DNA的转染，将pEGFP-C1-DCF1转染神经干细胞。

3.根据权利要求1所述的神经干细胞分化和抑制分化的调控方法，其特征在于所述的诱导神经干细胞分化的具体步骤如下：在沉默载体psiRNA中插入21bp的发卡结构来转录可沉默目标片段的siRNA，以Lipofectamin2000介导RNAi质粒的转染，使DCF1基因mRNA的表达显著下调。

4.根据权利要求2所述的神经干细胞分化和抑制分化的调控方法，其特征在于所设计的引物上游和下游引物分别为：

上游引物：5’-CTATGGTACCATGGCGGCGCCAAAGGGGAA-3’

下游引物：5’-ACTAGGTACCGATTTCTGAGTGAGCAAGGT-3’。

5.根据权利要求3所述的神经干细胞分化和抑制分化的调控方法，其特征在于21bp的发卡结构为：

片段1：5′tcccaggaagaggagttatacgca ttc aag aga tgcgtataactcctcttcctt 3′

片段2：5′tcccaatcggaccaagctggaatg ttc aag aga cattccagcttggtccgattt 3′。

6.根据权利要求1所述的神经干细胞分化和抑制分化的调控方法，其特征在于调控的神经干细胞是C17.2神经干细胞。

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