CN104906595A - dcf1基因的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种dcf1基因的新用途。本发明主要是运用野生型（作为对照）和dcf1敲除两种小鼠，通过Western blotting检测到髓鞘碱性蛋白的下调；免疫组化和透射电镜观察髓鞘形态的变化；之后用行为学实验说明该dcf1敲除小鼠可以模拟多发性硬化的临床症状，进而对敲除小鼠进行rescue，发现dcf1可以引起髓鞘重塑，髓鞘再生。

Description

dcf1基因的新用途

技术领域

本发明涉及一种dcf1基因的新用途。

背景技术

中枢神经系统脱髓鞘疾病是指发生在脑或脊髓中，以髓鞘破坏、炎症细胞侵染为主要病理特征的疾病。临床上中枢神经系统脱髓鞘疾病以多发性硬化和视神经脊髓炎最为多见。多发性硬化（ Multiple sclerosis，MS）患者的髓鞘病变，引起大脑与身体其他区域的信息传导受阻或破坏，进而表现出 MS 的临床症状，包括肌无力，协调平衡能力受损，麻痹，刺痛，焦躁不安等感觉障碍，认知记忆障碍。MS 的发病机制并不清楚，可能是自身免疫疾病。脱髄鞘疾病没有有效的治疗方法，药物治疗仅可以减缓恶化，主要原因在于脱髓鞘以及髓鞘再生的机制仍不清楚。

树突状细胞因子（dendritic cell factor 1，dcf1），也称为跨膜蛋白59（transmembrane protein 59，dcf1），属于一种单次跨膜蛋白。Wang, L; et al研究发现，在神经干细胞中过量表达dcf1，可维持神经干细胞的未分化状态，而沉默dcf1则能促进神经干细胞的分化。Li, X; et al通过小分子microRNA-351下调dcf1的表达，神经干细胞系C17.2向胶质方向分化。综合以上结果，表明dcf1的表达对神经发育有举足轻重的作用。dcf1基因敲除小鼠的蛋白芯片结果表明，敲除dcf1后，髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）表达量下调。

发明内容

本发明的目的在于提供dcf1基因在制备治疗脱髓鞘疾病药物中的应用。

本发明运用野生型（作为对照）和dcf1敲除两种小鼠检测发现dcf1基因对于脱髓鞘的治疗作用。通过Western blotting检测到髓鞘碱性蛋白的下调；进而通过免疫组化和透射电镜观察髓鞘形态的变化；之后用行为学实验说明该dcf1敲除小鼠可以模拟多发性硬化的临床症状，最后对dcf1敲除小鼠进行rescue，发现dcf1可以引起髓鞘重塑，髓鞘再生。

附图说明

图1为dcf1 的敲除引起髓鞘碱性蛋白表达的下调。

图2为dcf1 的敲除引起胼胝体和海马的髓鞘发育异常。

图3为dcf1 的敲除引起中枢神经系统的髓鞘损伤。

图4为dcf1 的敲除导致髓鞘病理相关的行为损伤。

图5为dcf1 再表达使髓鞘重塑再生。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1：将预冷的PBS中取出目标区域，胼胝体和海马。然后在加有Western 及 IP 细胞裂解液的匀浆器中进行匀浆，直至无明显组织块，成透明匀浆状即可。在冰上继续裂解30min，然后将裂解液收集于1.5ml EP管中。4℃，8000rpm离心10分钟收集上清。继续将上清于4℃，15000rpm离心20min，再次收集上清即为组织蛋白提取液，加入相应量的Loading buffer，加热变性备用。之后进行Western blotting。电泳条件为浓缩胶80V，20分钟；分离胶120V，90分钟。转膜条件25V，60分钟。一抗稀释比例1:1000，二抗稀释比例1:10000。（图1A）大脑皮层，海马的 Western blotting（ MBP/GAPDH）示意图。取野生型和TMEM59敲除小鼠（ P90 ）的脑组织进行匀浆，取匀浆液进行Western blotting。（图1B）对于（图1A）的柱状图统计分析。TMEM59敲除小鼠中 MBP 表达量显著降低 (n=3，*P<0.05)。

实施例2：透射电子显微镜检测髓鞘形态

首先将实验小鼠进行灌流（固定液中含 4%多聚甲醛和 1%戊二醛）。然后将鼠脑取出，置于含 2.5%戊二醛的固定液中，将待观察区域（海马，胼胝体）切成 1mm² 大小，然后在上述 2.5%戊二醛固定液里进行固定。之后用四氧化锇进行后固定 2 小时。酒精逐级脱水。最后将组织块包埋于环氧树脂中。用超薄切片机切片， 500nm 厚度的切片载于载玻片上经甲苯胺蓝染色，可在Confocal 下观察；70nm 厚度的切片载于铜网上经乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，在透射电镜下观察。（图2A，B）胼胝体、海马区的髓鞘电镜超微结构示意图。可以看出在胼胝体和海马两个区域，髓鞘都有明显的变薄，而且松散。（图2C，D）对（图2A，B）的散点图统计分析，TMEM59敲除小鼠的 g-ratios 与野生型小鼠有显著差异，g-ratios 越大，说明TMEM59敲除小鼠海马区的髓鞘越薄(n=3)。

实施例3：免疫组织化学检测

首先将实验小鼠用4%PFA灌流固定，蔗糖脱水，包埋。然后进行冰冻切片（20um）。最后进行免疫组化。0.01M PBS 洗 3 次，每次5分钟；0.1%TritonX-100-PBS 通透30分钟；0.01M PBS 洗3次，每次5分钟；2 % BSA-PBS 室温封闭 1 小时；吸干 2% BSA-PBS 后，直接滴加 PBS 稀释的一抗（MBP，1：500）。37℃孵育2小时，或 4℃孵育过夜；吸干一抗， 0.01M PBS 洗3次，每次5分钟。避光条件下，加入 PBS 稀释的二抗（稀释比例 1：500）。37℃孵育2小时；吸干二抗，加入 PBS 稀释的 DAPI（1：1000），室温孵育 10 分钟；吸干 DAPI， 0.01M PBS 洗 3 次，每次 5 分钟；荧光封片剂封片，Confocal 观察。MBP信号在一定程度上可以指示髓鞘的发育情况。（图3A，B）免疫组织化学（MBP）示意图。所有观察区域均显示，TMEM59敲除小鼠的 MBP 信号（可反应髓鞘状态）明显减少（n=5）。

实施例4：抓力测试

本实验测定小鼠四肢的抓力。设置好仪器之后，右手轻轻抓起小鼠，使其四肢均在抓力板上，左手向前推住抓力板，然后右手向后滑至小鼠尾部，左手轻轻松开抓力板，抓力板随右手拉鼠尾的力量向前滑行，待动物用力抓住抓力板时及时加力后拉，当小鼠四肢松开抓力板时，仪器自动记录最大抓力。每只小鼠重复三次。（图4A）抓力随着小鼠年龄的增加而不断增加，但是，TMEM59敲除小鼠的抓力比同年龄的野生型小鼠有显著性下降。

实施例5：转棒试验

将每只待实验小鼠在恒速 5rpm 的转棒仪上训练 120 秒，每只训练 3 次。训练两天。第三天，转棒仪从 5rpm 加速到 40rpm，当小鼠落下转棒时，转棒仪自动记录时间。每只小鼠实验三次，每次实验间隔 15 分钟以上。（图4B）TMEM59敲除小鼠更容易从转棒上掉落下来。

实施例6：胚胎电转，免疫组化检测

取E14.5的孕鼠，用2%的戊巴比妥钠溶液按照 0.1 ml/30g进行腹腔注射，麻醉；待小鼠完全麻醉,将其腹部向上置于平板上；用酒精棉进行皮肤表面消毒；用无菌的纱布覆盖小鼠，在纱布中间剪开3cm左右大小，将开口对准腹中线一侧；用解剖剪刀在小鼠腹部，距离腹中线约0.5 cm处，与腹中线平行开2.5厘米左右的口子；将子宫从腹腔中拉出，置于纱布上；用指状镊控制鼠胚，显微注射针将外源基因（PAGGS-EGFP/PCAGGS-EGFP-TMEM59）注入一侧脑室中，注射2 ～3ul；记录Y型子宫的形状,注射的胚胎鼠及注射位置；镊状电极与胚胎脑的中缝平行；以电压30V，脉冲时间50 ms,频数5的条件给予电击；将子宫放回腹腔中，缝合。（图5A）胚胎电转和观察区域示意图。深色-神经元表达 EGFP/TMEM59 区域（Ipsi）；浅色-神经元不表达 EGFP/TMEM59（Contra）。待胎鼠成长到21天时，将其固定，按照效果实施例3中的方法进行免疫组化检测。（图5B）对于胚胎电转区域来说，在野生型和TMEM59敲除小鼠中表达PCAGGS-EGFP，也就是作为对照，结果表明TMEM59敲除小鼠中MBP表达减少，与未进行胚胎电转操作的小鼠结果一致；当在野生型和TMEM59敲除小鼠中表达PCAGGS-EGFP-TMEM59，野生型无明显变化，但是TMEM59敲除小鼠中MBP表达显著增加，表明再表达TMEM59可以使髓鞘再生，引起髓鞘重塑。

实施例7:髓鞘的恢复

待胚胎电转的胎鼠成长到21天时，将其取脑固定，按照效果实施例3中的方法进行免疫组化检测。（图5B）对于胚胎电转区域（Ipsi）来说，在野生型和dcf1敲除小鼠中表达PCAGGS-EGFP（作为对照），结果表明dcf1敲除小鼠中MBP表达减少，与未进行胚胎电转操作的小鼠结果一致，表明髓鞘受到损伤，而且手术操作并未对髓鞘发育产生不良影响；当在野生型和dcf1敲除小鼠中表达PCAGGS-EGFP-DCF1，野生型小鼠的MBP信号无明显变化，但是dcf1敲除小鼠中MBP表达显著增加，说明再表达dcf1可以使髓鞘再生，引起髓鞘重塑。以上结果表明dcf1可以在脱髓鞘中起到治疗作用。

Claims (1)

1.dcf1基因在制备治疗脱髓鞘疾病药物中的应用。