KR20210006966A - 조작된 캐스케이드 구성성분 및 캐스케이드 복합체 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 다중-단백질 이펙터 복합체, 유형 I CRISPR-Cas (캐스케이드) 서브유닛 단백질 및 핵산 가이드를 포함하는 핵단백질 복합체, 유형 I CRISPR-Cas 서브유닛 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 시스템을 제공한다. 또한, 본 발명의 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 시스템을 제조하고 사용하는 방법이 개시된다.

Description

조작된 캐스케이드 구성성분 및 캐스케이드 복합체

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 3월 12일에 등록된 미국 특허 번호 10,227,576인, 2018년 8월 17일에 출원된 미국 특허 출원 번호 16/104,875의 연속인, 2019년 1월 30일에 출원되고 현재 허여된 미국 특허 출원 번호 16/262,773의 연속인, 2019년 5월 22일에 출원되고 현재 계류중인 미국 특허 출원 번호 16/420,061의 부분 연속이고; 2018년 6월 13일에 출원되고 현재 계류중인 미국 가출원 번호 62/684,735, 및 2019년 2월 19일에 출원되고 현재 계류중인 미국 가출원 번호 62/807,717을 우선권 주장하며, 이들 가출원의 내용은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.

연방 정부의 지원을 받는 연구 또는 개발에 관한 설명서

적용가능하지 않음.

서열 목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었고 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2019년 6월 12일에 창출된, 상기 ASCII 카피는 CBI032-30_ST25.txt로 명명되고 그 크기가 3.1 MB이다.

기술 분야

본 개시내용은 일반적으로, 다중-단백질 이펙터 복합체, 유형 I CRISPR-Cas (캐스케이드) 서브유닛 단백질 및 핵산 가이드를 포함하는 핵단백질 복합체, 유형 I CRISPR-Cas 서브유닛 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 시스템에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 본 발명의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 시스템을 제조하고 사용하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 및 CRISPR-연합된 단백질 (Cas)이 CRISPR-Cas 시스템을 구성한다. 이러한 CRISPR-Cas 시스템은 박테리아 및 고세균에서 외래 폴리뉴클레오티드에 대항한 적응 면역을 제공한다 (예를 들어, 문헌 [Barrangou, R., et al., Science 315:1709-1712 (2007); Makarova, K.S., et al., Nature Reviews Microbiology 9:467-477 (2011); Garneau, J.E., et al., Nature 468:67-71 (2010); Sapranauskas, R., et al., Nucleic Acids Res. 39:9275-9282 (2011); Koonin, E.V., et al., Curr. Opin. Microbiol. 37:67-78 (2017)] 참조). 그의 천연 숙주에서의 다양한 CRISPR-Cas 시스템은 DNA 표적화 (클래스 1 유형 I; 클래스 2 유형 II 및 유형 V), RNA 표적화 (클래스 2 유형 VI), 및 조인트 DNA 및 RNA 표적화 (클래스 1 유형 III)가 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Makarova, K.S., et al., Nat. Rev. Microbiol. 13:722-736 (2015); Shmakov, S., et al., Nat. Rev. Microbiol. 15:169-182 (2017); Abudayyeh, O.O., et al., Science 353:1-17 (2016)] 참조).

CRISPR-Cas 시스템의 분류는 여러 번 반복되어 왔다. 문헌 [Koonin, E.V., et al., (Curr. Opin. Microbiol. 37:67-78 (2017))]에서는 CRISPR-Cas 시스템의 개별 유형 및 하위유형에 특이적인 시그니처 cas 유전자를 고려하는 분류 시스템이 제안되었다. 분류는 또한 다수의 공유 Cas 단백질 사이의 서열 유사성, 가장 잘 보존된 Cas 단백질의 계통 발생, 유전자 조직 및 CRISPR 어레이의 구조를 고려하였다. 이러한 접근법은 CRISPR-Cas 시스템을 2개의 별개의 클래스로 나누는 분류 체계를 제공하였다: 다중단백질 이펙터 복합체 (유형 I (항바이러스 방어 ("캐스케이드") 이펙터 복합체를 위한 CRISPR-연합된 복합체), 유형 III (Cmr/Csm 이펙터 복합체), 및 유형 IV)를 포함하는 클래스 1; 및 단일 이펙터 단백질 (유형 II (Cas9), 유형 V (Cas12a; 이전에 Cpf1로서 지칭됨), 및 유형 VI (Cas13a; 이전에 C2c2로서 지칭됨))을 포함하는 클래스 2. 클래스 1 시스템에서, 유형 I은 가장 흔하고 다양하며, 유형 III은 박테리아보다 고세균에서 더 흔하며 유형 IV는 가장 흔하지 않다.

유형 I 시스템은 시그니처 Cas3 단백질을 포함한다. Cas3 단백질은 DNA 표적 서열 절단을 담당하는 헬리카제 및 DNase 도메인을 갖는다. 현재까지, 가변 수의 cas 유전자를 가지고 있는 유형 I 시스템의 7가지 하위유형 (즉, 유형 I-A, I-B, I-C, I-D, I-E, I-F (및 I-F에 대한 변이체 (예를 들어, I-Fv1, I-Fv2)), 및 I-U)이 확인되었다. 유형 I cas 유전자는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: cas7, cas5, cas8, cse2, csa5, cas3, cas2, cas4, cas1, 및 cas6. 유형 I 시스템을 갖는 유기체의 예는 하기와 같다: I-A, 아르카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus); I-B, 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri); I-C, 바실루스 할로두란스(Bacillus halodurans); I-U, 게오박터 술푸르레두센스(Geobacter sulfurreducens); I-D, 시아노테세(Cyanothece) 종 8802; I-E, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K12 (이. 콜라이(E. coli) K12); I-F, 예르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudo-tuberculosis); I-F 변이체, 슈와넬라 푸트레파시엔스(Shewanella putrefaciens) CN-32 (Koonin, E.V., et al., Curr. Opin. Microbiol. 37:67-78 (2017)). DNA의 Cas3 단백질 매개된 절단 및 점진적 분해의 특징이 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Plagens, A., et al., Nucleic Acids Res. 42:5125-5138 (2014); Maier, L., et al., RNA Biol. 10:865-874 (2013); Hochstrasser, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:6618-6623 (2014); Sinkunas, T., et al., EMBO J. 30:1335-1342 (2011); Westra, E., et al., Mol. Cell 46:595-605 (2012); Mulepati, S., et al., J. Biol. Chem. 288:22184-22192 (2013); Sinkunas, T., et al., EMBO J. 32:385-394 (2013); Mulepati, S., et al., J. Biol. Chem. 288:22184-22192 (2013); Redding, S., et al., Cell 163:854-865 (2015); Sinkunas, T., et al., EMBO J. 32:385-394 (2013); Westra, E., et al., Mol. Cell 46:595-605 (2012)] 참조).

유형 I 시스템은 전형적으로, CRISPR RNA (crRNA 또는 "가이드 RNA")와 조합하여 캐스케이드 복합체를 형성하는 단백질을 코딩한다. 이러한 복합체는 다수의 단백질 및 crRNA를 포함하며, 이들 둘 다가 이러한 CRISPR 로커스로부터 전사된다. 유형 I 시스템에서, 프리-crRNA의 1차 프로세싱은 Cas6에 의해 촉매된다. 이는 전형적으로, 8개 뉴클레오티드의 5' 핸들, 스페이서 영역 및 3' 핸들을 갖는 crRNA를 초래하며; 5' 핸들과 3' 핸들 둘 다는 반복부 서열로부터 유래된다. 일부 시스템에서, 3' 핸들은 스템 루프 구조를 형성하고; 다른 시스템에서, crRNA의 3' 단부의 2차 프로세싱은 리보뉴클레아제(들)에 의해 촉매된다 (예를 들어, 문헌 [van der Oost, J., et al., Nature Reviews Microbiology 12:479-492 (2014)] 참조).

유형 I CRISPR-Cas 시스템의 캐스케이드 이펙터 복합체는 RNA 인식 모티프 (RRM) 폴드 및 부가의 "대형" 및 "소형" 서브유닛 단백질을 함유하는 유사 반복부-연합된 신비한 단백질 (RAMP; 예를 들어, Cas7 및 Cas5 단백질)을 갖는 백본을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Koonin, E.V., et al., Curr. Opin. Microbiol. 37:67-78, (2017), 도 2] 참조). 이들 캐스케이드 이펙터 복합체는 전형적으로 Cas5 서브유닛 단백질 및 몇 가지 Cas7 서브유닛 단백질을 갖는다. 이러한 캐스케이드 이펙터 복합체는 또한 가이드 RNA를 포함한다. 캐스케이드 이펙터 복합체는 가이드 RNA의 길이를 따라 비대칭적 방식으로 배열된 다양한 서브유닛 단백질을 포함한다. Cas5 서브유닛 단백질과 대형 서브유닛 단백질 (Cas8 단백질)은 복합체의 한쪽 단부에 위치하여, 가이드 RNA의 5' 단부를 둘러싸고 있다. 소형 서브유닛 단백질의 몇 가지 카피는 Cas7 서브유닛 단백질의 다수의 카피에 결합되는 가이드 RNA 백본과 상호작용한다. 또 다른 RAMP 단백질인 Cas6 서브유닛 단백질은 주로 crRNA의 3' 핸들 (반복부 영역)과의 연합을 통해 캐스케이드 이펙터 복합체와 연합된다. Cas6 서브유닛 단백질은 통상적으로, 프리-crRNA 프로세싱에 관여하는 반복부-특이적 RNase로서 기능하지만; 유형 I-C 시스템에서는, Cas5가 반복부-특이적 RNase로서 기능하며, Cas6는 없다.

CRISPR-Cas 유형 I 캐스케이드 서브유닛 단백질의 1차 서열은 서열 동일성이 거의 없지만; 상동 RAMP 모듈의 존재와 다중단백질 이펙터 복합체의 전반적인 구조적 유사성은 이들 이펙터 복합체의 공통 기원을 지원한다 (예를 들어, 문헌 [Koonin, E.V., et al., Curr. Opin. Microbiol. 37:67-78 (2017)] 참조).

유형 I CRISPR-Cas 시스템의 적응 면역 메카니즘은 본질적으로 적응, 발현 및 간섭의 3가지 단계를 포함한다. 적응 단계에서는, 외래 DNA 또는 RNA가 숙주를 감염시키고, 다양한 cas 유전자에 의해 코딩된 단백질이 감염 DNA 또는 RNA의 영역과 결합한다. 이러한 영역은 프로토스페이서로 불린다. 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)는 프로토스페이서에 인접하는 짧은 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 2 내지 6개 염기 쌍 DNA 서열)이다. PAM 서열은 전형적으로, Cas1 서브유닛 단백질/Cas2 서브유닛 단백질 복합체에 의해 인식되며, 여기서 활성 PAM-센싱 부위가 Cas1 서브유닛 단백질과 연합된다 (예를 들어, 문헌 [Jackson, S. A., et al., Science 356:356(6333) (2017)] 참조).

발현 단계에서는, 다수의 스페이서-반복부 요소를 포함하는 CRISPR 어레이가 단일 전사체로서 전사된다. 개별 스페이서 반복부 요소는 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas6 단백질인 유형 I; 및 Cas5 단백질인 유형 I-C)에 의해 개별 crRNA로 프로세싱된다. Cas 서브유닛 단백질이 발현되고, crRNA와 연합되어 캐스케이드 이펙터 복합체를 형성한다.

캐스케이드 이펙터 복합체는 숙주를 감염시키는 외래 폴리뉴클레오티드를 스캔하여 스페이서에 상보적인 DNA를 확인한다. 유형 I 시스템에서, 간섭은 이펙터 복합체가 PAM에 인접한 스페이서에 상보적인 서열을 확인할 때 발생하고; Cas3 단백질은 외래 폴리뉴클레오티드를 절단하고 이를 점진적으로 소화하기 위해 DNA 결합된 캐스케이드 이펙터 복합체에 동원된다.

문헌 [Makarova, K.S., et al., (Cell 168:946 (2017))]은 유형 I CRISPR-Cas 시스템에 대한 유전자, 상동체, 캐스케이드 복합체 및 작용 메카니즘의 요약을 제공한다.

따라서, 유형 I CRISPR-Cas 시스템은 부분적으로 캐스케이드 복합체의 이종 발현의 어려움과 유형 I CRISPR-Cas 시스템이 DNA 표적을 절단하는 방식으로 인해 지금까지 진핵 게놈 조작 적용에 제한적으로 사용되어 왔다.

본 발명은 일반적으로, 단백질 구성성분, 변형되거나 또는 별개로 변화된 가이드 폴리뉴클레오티드, 및 그의 조합을 포함한, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 및 그의 구성성분을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태는 하기를 포함하는 조성물이다:

제1 Cse2 서브유닛 단백질, 제1 Cas5 서브유닛 단백질, 제1 Cas6 서브유닛 단백질, 및 제1 Cas7 서브유닛 단백질,

제1 Cas8 서브유닛 단백질 및 제1 FokI를 포함하며, 여기서 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단 또는 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단이 제1 링커 폴리펩티드에 의해 제1 FokI의 C-말단 또는 N-말단에 각각 공유적으로 연결되고, 여기서 제1 링커 폴리펩티드가 10개 아미노산 내지 40개 아미노산의 길이를 갖는 것인 제1 융합 단백질, 및

제1 핵산 표적 서열에 결합할 수 있는 제1 스페이서를 포함하는 제1 가이드 폴리뉴클레오티드

를 포함하는 제1 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체; 및

제2 Cse2 서브유닛 단백질, 제2 Cas5 서브유닛 단백질, 제2 Cas6 서브유닛 단백질, 및 제2 Cas7 서브유닛 단백질,

제2 Cas8 서브유닛 단백질 및 제2 FokI를 포함하며, 여기서 제2 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단 또는 제2 Cas8 단백질의 C-말단이 제2 링커 폴리펩티드에 의해 제2 FokI의 C-말단 또는 N-말단에 각각 공유적으로 연결되고, 여기서 제2 링커 폴리펩티드가 10개 아미노산 내지 40개 아미노산의 길이를 갖는 것인 제2 융합 단백질, 및

제2 핵산 표적 서열에 결합할 수 있는 제2 스페이서를 포함하며, 여기서 제2 핵산 표적 서열의 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)와 제1 핵산 표적 서열의 PAM이 20개 염기 쌍 내지 42개 염기 쌍의 인터스페이서 거리를 갖는 것인 제2 가이드 폴리뉴클레오티드

를 포함하는 제2 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체.

일부 실시양태에서, 제1 링커 폴리펩티드 및/또는 제2 링커 폴리펩티드의 길이는 15개 아미노산 내지 30개 아미노산, 또는 17개 아미노산 내지 20개 아미노산의 길이이다. 한 실시양태에서, 제1 링커 폴리펩티드와 제2 링커 폴리펩티드의 길이는 동일하다.

제2 핵산 표적 서열과 제1 핵산 표적 서열 사이의 인터스페이서 거리는 22개 염기 쌍 내지 40개 염기 쌍, 26개 염기 쌍 내지 36개 염기 쌍, 29개 염기 쌍 내지 35개 염기 쌍, 또는 30개 염기 쌍 내지 34개 염기 쌍을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

제1 FokI 및 제2 FokI는 연합하여 동종이량체를 형성할 수 있는 단량체성 서브유닛, 또는 연합하여 이종이량체를 형성할 수 있는 별개의 서브유닛일 수 있다.

일부 실시양태에서, 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단은 제1 링커 폴리펩티드에 의해 제1 FokI의 C-말단에 공유적으로 연결되고, 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단은 제1 링커 폴리펩티드에 의해 제1 FokI의 N-말단에 공유적으로 연결되며, 제2 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단은 제2 링커 폴리펩티드에 의해 제2 FokI의 C-말단에 공유적으로 연결되고, 제2 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단은 제2 링커 폴리펩티드에 의해 제2 FokI의 N-말단에 공유적으로 연결되며, 그의 조합이 있다. 제1 Cas8 서브유닛 단백질 및 제2 Cas8 서브유닛 단백질은 각각 상이한 서열을 갖는 Cas8 서브유닛 단백질을 포함할 수 있거나, 또는 제1 Cas8 서브유닛 단백질과 제2 Cas8 서브유닛 단백질 둘 다는 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

유사하게, 제1 Cse2 서브유닛 단백질 및 제2 Cse2 서브유닛 단백질은 각각 상이하거나 동일한 Cse2 서브유닛 단백질 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제1 Cas5 서브유닛 단백질 및 제2 Cas5 서브유닛 단백질은 각각 상이하거나 동일한 Cas5 서브유닛 단백질 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 제1 Cas6 서브유닛 단백질 및 제2 Cas6 서브유닛 단백질은 각각 상이하거나 동일한 Cas6 서브유닛 단백질 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제1 Cas7 서브유닛 단백질 및 제2 Cas7 서브유닛 단백질은 각각 상이하거나 동일한 Cas7 서브유닛 단백질 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그의 조합이 있다.

바람직한 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 RNA를 포함한다.

부가 실시양태에서, 본 발명은 야생형 유형 I CRISPR Cas3 단백질 ("wtCas3 단백질")에 비해 DNA를 따라 이동하는 것을 감소시킬 수 있는 조작된 유형 I CRISPR Cas3 돌연변이체 단백질 ("mCas3 단백질")을 포함한다.

본 발명은 또한 세포에서 게놈 편집을 수행하기 위한 상기 조성물의 용도 뿐만 아니라 상기 조성물의 제조 방법을 포함한다.

본 발명의 추가 실시양태는 본원에서의 개시내용을 고려하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.

본 도면은 비례적으로 제시되지 않으며 크기가 조정되지도 않는다. 인디케이터의 위치는 대략적인 것이다.
도 1a는 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 일반화된 예시를 제시한다. 도 1b는 유형 I CRISPR-Cas crRNA의 일반화된 예시를 제시한다.
도 2a, 도 2b, 및 도 2c는 이웃한 스페이서 서열에 결합된 융합 도메인을 갖는 2개의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 예시적 예를 제시한다.
도 3a 및 도 3b는 순환적으로 순열된 단백질의 예를 제시한다.
도 4a, 도 4b, 도 5a, 도 5b, 도 6a, 도 6b, 도 6c, 도 7a, 도 7b, 도 8, 도 9, 도 10a, 및 도 10b는 본 발명의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 다양한 예를 예시한다.
도 11a 및 도 11b는 기질 채널의 예를 예시한다.
도 12a, 도 12b, 및 도 12c는 dCas9:NATNA 복합체에 의해 캐스케이드 서브유닛 단백질과 융합된 기능적 단백질 도메인의 부위-지정 동원의 일반화된 예시를 제시한다.
도 13a, 도 13b, 도 14a, 도 14b, 및 도 14c는 본 발명의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 예를 예시한다.
도 15a, 도 15b, 도 15c, 도 16a, 도 16b, 도 16c, 도 17a, 도 17b, 도 17c, 도 18a, 도 18b, 도 18c, 도 18d, 도 19a, 도 19b, 도 20a, 및 도 20b는 본 발명의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 및 그의 사용 방법의 예를 제시한다.
도 21a, 도 21b, 도 21c, 도 21d, 도 22a, 도 22b, 도 22c, 및 도 22d는 활동적 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 Cas3 단백질을 사용하는 본 발명의 실시양태를 예시한다.
도 23a, 도 23b, 도 23c, 도 23d, 도 23e, 도 24, 도 25, 도 26, 및 도 27은 다양한 캐스케이드 구성성분 발현 시스템의 개략도를 제시한다.
도 28, 도 29, 도 30, 도 31a, 도 31b, 도 32, 도 33a, 도 33b, 및 도 34는 본 발명의 조작된 캐스케이드 시스템의 게놈 편집과 관련된 데이터를 제시한다.
도 35는 쌍형성된 가이드 RNA (gRNA)를 함유하는 최소 CRISPR 어레이의 예를 예시한다.
도 36a, 도 36b, 도 36c, 및 도 36d는 RNP를 통한 인간 세포에서의 게놈 편집 및 조작된 유형 I CRISPR-Cas 복합체의 플라스미드-기반 전달과 관련된 데이터를 제시한다.
도 37a, 도 37b, 도 37c, 도 37d, 도 37e, 도 37f, 및 도 37g는 복구 결과와 관련된 데이터를 제시한다.
도 38a, 도 38b, 및 도 38c는 gRNA와 표적 DNA 사이의 미스매치가, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 복합체에 의한 게놈 편집을 어떻게 억제하는지와 관련된 데이터를 제시한다.
도 39a, 도 39b, 도 39c, 및 도 39d는 3가지 캐스케이드 상동체 변이체에 대한 PAM 선택성의 확장된 스크리닝과 관련된 데이터를 제시한다.
도 40a, 도 40b, 도 40c, 도 40d, 도 40e, 및 도 40f는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 복합체의 편집 효율에 있어서의 예시적인 변화와 관련된 데이터를 제시한다.
도 41a, 도 41b, 및 도 41c는 3가지 캐스케이드 상동체 변이체에 대한 FokI-Cas8 링커 길이 및 인터스페이서 거리의 확장된 스크리닝과 관련된 데이터를 제시한다.
도 42a 및 도 42b는 올리고-주형화 PCR 증폭의 예를 예시한다.
도 43은 퍼센트 게놈 편집에 대한 데이터가 FokI-캐스케이드 상동체 변이체 및 인터스페이서 거리의 함수로서 제시된다는 것을 제시한다.
도 44는 EcoCas3 단백질의 기능적 도메인 및 서열 내에서 만들어진 돌연변이체의 상대적 위치의 선형 표현을 제시한다.
도 45a, 도 45b, 도 45c, 및 도 45d는 야생형 또는 돌연변이체 EcoCas3 단백질을 포함하는 Eco캐스케이드 RNP 복합체를 사용한 게놈 편집과 관련된 데이터를 제시한다.
도 46a, 도 46b, 도 46c, 도 47a, 및 도 47b는 dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체 로드블록 및 Eco캐스케이드 RNP 복합체에 의한 표적 절단에 대한 그의 효과와 관련된 데이터를 제시한다.
도 48은 Cas3[D452A]/-Eco캐스케이드 또는 mCas3[D452A]-Eco캐스케이드에 대한 예시적인 편집 데이터를 제시한다.
도 49는 Pse캐스케이드 RNP 복합체를 이용한 8개 TRAC 표적 부위에서의 게놈 편집을 위한 데이터를 제시한다.
참조로 포함됨
본 명세서에 인용된 모든 특허, 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 특허, 간행물 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다.

본원에 사용된 전문 용어는 단지 특별한 실시양태를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "폴리뉴클레오티드"에 대한 언급은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하고 "벡터"에 대한 언급은 하나 이상의 벡터를 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 다른 방법 및 물질이 본 발명에서 유용할 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기재된다.

본 명세서 및 실시예의 교시의 관점에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어, 하기 표준 텍스트에 의해 교시된 바와 같이, 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 게놈학 및 재조합 폴리뉴클레오티드의 통상적인 기술을 적용할 수 있다 (Cellular and Molecular Immunology, Ninth Edition, A. K. Abbas., et al., Elsevier (2017), ISBN 978-0323479783; Cancer Immunotherapy Principles and Practice, First Edition, L.H. Butterfield, et al., Demos Medical (2017), ISBN 978-1620700976; Janeway's Immunobiology, Ninth Edition, Kenneth Murphy, Garland Science (2016), ISBN 978-0815345053; Clinical Immunology and Serology: A Laboratory Perspective, Fourth Edition, C. Dorresteyn Stevens, et al., F.A. Davis Company (2016), ISBN 978-0803644663; Antibodies: A Laboratory Manual, Second edition, E.A. Greenfield, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2014), ISBN 978-1-936113-81-1; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Seventh Edition, R.I. Freshney, Wiley-Blackwell (2016), ISBN 978-1118873656; Transgenic Animal Technology, Third Edition: A Laboratory Handbook, C.A. Pinkert, Elsevier (2014), ISBN 978-0124104907; The Laboratory Mouse, Second Edition, H. Hedrich, Academic Press (2012), ISBN 978-0123820082; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition, R. Behringer, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2013), ISBN 978-1936113019; PCR 2: A Practical Approach, M.J. McPherson, et al., IRL Press (1995), ISBN 978-0199634248; Methods in Molecular Biology (Series), J.M. Walker, ISSN 1064-3745, Humana Press; RNA: A Laboratory Manual, D.C. Rio, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2010), ISBN 978-0879698911; Methods in Enzymology (Series), Academic Press; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition), M.R. Green, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012), ISBN 978-1605500560; Bioconjugate Techniques, Third Edition, G.T. Hermanson, Academic Press (2013), ISBN 978-0123822390; Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, W.V. Dashek, CRC Press (1997), ISBN 978-0849394805; Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology), V.M. Loyola-Vargas, et al., Humana Press (2012), ISBN 978-1617798177; Plant Transformation Technologies, C.N. Stewart, et al., Wiley-Blackwell (2011), ISBN 978-0813821955; Recombinant Proteins from Plants (Methods in Biotechnology), C. Cunningham, et al., Humana Press (2010), ISBN 978-1617370212; Plant Genomics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), W. Busch, Humana Press (2017), ISBN 978-1493970018; Plant Biotechnology: Methods in Tissue Culture and Gene Transfer, R. Keshavachandran, et al., Orient Blackswan (2008), ISBN 978-8173716164).

클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 및 관련된 CRISPR-연합된 단백질 (Cas 단백질)이 CRISPR-Cas 시스템을 구성한다 (예를 들어, 문헌 [Barrangou, R., et al., Science 315:1709-1712 (2007)] 참조).

본원에 사용된 바와 같은, "Cas 단백질", "CRISPR-Cas 단백질" 및 "CRISPR-Cas 서브유닛 단백질" 및 "Cas 서브유닛 단백질"은 달리 확인되지 않는 한, 모두 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 단백질을 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 측면에 사용하는 경우에, Cas 서브유닛 단백질은 하나 이상의 동족 폴리뉴클레오티드 (가장 전형적으로 crRNA)와 상호작용하여 유형 I 이펙터 복합체 (가장 전형적으로, RNP 복합체)를 형성할 수 있다.

유형 I-E CRISPR-Cas 시스템에서 캐스케이드를 코딩하는 유전자는 시간이 지남에 따라 다양한 협약으로 명명되었으며, 이는 최근 문헌과 오래된 문헌을 비교할 때 혼란스러운 지점이 될 수 있다. 전형적으로, 본 명세서는 문헌 [Koonin, E., et al. (Curr. Opin. Microbiol. 37: 67-78 (2017))]에 제시된 바와 같은 명명법을 사용하는데, 여기서 참조 이. 콜라이 K12 오페론의 유전자 순서가 cas3, cas8, cas11, cas7, cas5, cas6, cas1, 및 cas2이다. 간단하게 하기 위해, cas8e에서의 "e" 수식자는 유형 I 시스템 내에서의 상이한 하위유형 사이의 cas8 유전자를 구별하기 위해 종종 사용된다. 야생형 이. 콜라이 유형 I-E CRISPR-Cas의 화학량론은 Cas5₁-Cas6₁-Cas7₆-Cas8₁-Cas11₂-gRNA₁이다.

그러나, 상호 참조 목적으로: cas8은 이전에 cse1 및 casA로서 지칭되었고 "대형 서브유닛"으로서 공지되기도 하였으며; cas11은 이전에 cse2 및 casB로서 지칭되었고 "소형 서브유닛"으로서 공지되기도 하였으며; cas7은 이전에 cse4 및 casC로서 지칭되었고; cas5는 이전에 casD로서 지칭되었으며, 종종 수식자 cas5e가 제공되었고; cas6은 이전에 cse3 및 casE로서 지칭되었고 종종 수식자 cas6e를 제공하였다. Cas 서브유닛 단백질을 코딩하는 유전자가 표 1에 열거된다.

*문헌 [Makarova, K.S., et al., Nat. Rev. Microbiol. 13:722-736 (2015); Koonin, E.V., et al., Curr Opin Microbiol. 37:67-78 (2017)]에 의해 정의된 바와 같음.

PAM 서열은 전형적으로, Cas1 서브유닛 단백질/Cas2 서브유닛 단백질 복합체에 의해 인식되며, 여기서 활성 PAM-센싱 부위가 Cas1 서브유닛 단백질과 연합된다 (예를 들어, 문헌 [Jackson, S. A., et al., Science 356:356(6333) (2017)] 참조). Cas1 단백질 및 Cas2 단백질은 대부분의 공지된 CRISPR-Cas 시스템에 존재하며, 스페이서를 CRISPR 카세트 내로 삽입하는데 충분하다 (예를 들어, 문헌 [Yosef, I, et al., Nucleic Acids Res. 40:5569-5576 (2012)] 참조). 이들 두 단백질은 적응 프로세스를 위한 복합체를 형성한다. Cas1 단백질의 엔도뉴클레아제 활성은 스페이서 통합에 필요한 반면, Cas2 단백질은 비-효소적 기능을 수행하는 것으로 보인다 (예를 들어, 문헌 [Nunez, J., et al., Nat Struct Mol Biol. 21:528-534 (2014); Richter, C., et al., PLoS One. 2012;7:e49549] 참조). Cas1-Cas2 단백질 복합체는 시스템의 나머지 부분에서 준 자율적인 것으로 보이는 CRISPR-Cas 시스템의 고도로 보존된 정보 처리 모듈을 나타낸다 (예를 들어, 문헌 [Makarova, K., et al., Methods Mol. Biol. 1311:47-75 (2015)] 참조). 엔도뉴클레아제 Cas1 단백질은 CRISPR 시스템이 이전에 감염원과의 만남을 기억할 수 있도록 하는 고유한 능력을 보장하는 필수 Cas 단백질이다.

용어 "유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체", "유형 I CRISPR-Cas 핵단백질 (NP) 복합체", "캐스케이드 핵단백질 (NP) 복합체" 및 "유형 I 핵단백질 (NP) 복합체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 전형적으로 가이드 폴리뉴클레오티드와 복합체를 형성하는 캐스케이드 단백질을 지칭한다. "캐스케이드 복합체" 및 "유형 I 복합체"는 전형적으로, 캐스케이드 NP 복합체의 단백질 구성성분을 지칭할 때 사용된다. 용어 "캐스케이드 RNP 복합체", "유형 I CRISPR-Cas RNP 복합체" 및 "유형 I RNP 복합체"는 보다 일반적인 가이드 폴리뉴클레오티드 (즉, 캐스케이드 NP 복합체에서와 같음)에 비해 crRNA를 포함하는 캐스케이드 복합체를 지칭한다. 야생형 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 예가 도 1a에 예시된다. 도 1a는 문헌 [Makarova, K.S., et al., (Cell 168:946 (2017); Makarova, K., et al., Nature Reviews Microbiology 13:722-736 (2015))]을 각색한 것이다. 도 1a는 캐스케이드 복합체로서 연합된 6개의 Cas7 단백질, Cas5 단백질, Cas8 단백질, 2개의 Cse2 단백질, Cas6 단백질, 및 crRNA를 예시한다 (도 1a: Cas7, Cas5, Cas8, Cse2, 및 Cas6; Cas6 주위의 파선 박스는 crRNA 헤어핀과의 상호작용을 나타내고; cRNA는 헤어핀을 포함하는 흑색 선으로서 예시됨). 상기 복합체는 핵산 표적 서열에 결합할 수 있다. 복합체와 wtCas3 단백질 (도 1a, 파선 박스로 둘러싸인 Cas3)의 연합 후, 캐스케이드 복합체는 핵산 표적 서열을 절단할 수 있다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 일부 Cas 서브유닛 단백질의 총 수는 캐스케이드 복합체에서 달라질 수 있다.

"Cas3" 및 "Cas3 단백질"은 유형 I CRISPR-Cas3 단백질, 그의 변형, 및 변이체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 crRNA 가이드에 상보적인 외래 DNA에 결합하고, 표적 분해에 필요한 트랜스-작용 뉴클레아제-헬리카제인 Cas3을 동원한다. Cas3 단백질은 슈퍼패밀리 2로부터의 헬리카제에 특징적인 모티프를 가지며, DEAD/DEAH 박스 영역 및 보존된 C-말단 도메인을 함유한다. Cas3 단백질 및 그의 변이체는 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Westra, E.R., et al., Mol. Cell. 46: 595-605 (2012); Sinkunas, T., et al., EMBO J. 30:1335-1342 (2011); Beloglazova, N., et al., EMBO J. 30:4616-4627 (2011); Mulepati, S., et al., J. Biol. Chem. 286:31896-31903 (2011)] 참조). 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "mCas3 단백질"은 그의 상응하는 wtCas3 단백질에 비해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Cas3 단백질을 지칭한다. mCas3 단백질은 mCas3 단백질 (예를 들어, 실시예 23A, 실시예 23B, 및 실시예 23C), dblmCas3 단백질 (예를 들어, 실시예 26A, 실시예 26B, 및 실시예 26C), 및 dCas3* (임의의 뉴클레아제 활성 및/또는 헬리카제 활성을 갖지 않는 돌연변이된 Cas3 단백질)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "뉴클레아제"는 포스포디에스테르 결합, 예컨대 이중-가닥 (ds) 핵산 (예를 들어, dsDNA, 게놈 DNA (gDNA), dsRNA), 단일-가닥 (ss) 핵산 (예를 들어, ssDNA, RNA) 또는 혼성체 dsRNA/DNA에서 발견되는 바와 같은, 두 뉴클레오티드를 연결하는 결합을 절단할 수 있는 효소를 지칭한다. "엔도뉴클레아제"는 전형적으로, 그의 표적 분자에서의 ss-파손 (닉) 또는 ds-파손에 영향을 미칠 수 있다. DNA 엔도뉴클레아제의 한 가지 예는 FokI 효소이다. "FokI 엔도뉴클레아제" 및 "FokI"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, FokI 효소, FokI 상동체, FokI 효소의 효소적으로 활성인 도메인(들), 및 FokI 효소의 변이체를 지칭한다. DNA 절단을 위해서는 전형적으로 FokI 이량체화가 필요하다. FokI의 이량체는 연합하여 동종이량체를 형성하는 2개의 단량체성 서브유닛 또는 연합하여 이종이량체를 형성하는 2개의 별개의 단량체성 서브유닛을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bitinaite, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10570-10575 (1998); Ramalingam, S., et al., J. Mol. Biol. 405:630-641 (2011)] 참조). FokI 변이체의 한 가지 예는 문헌 [Guo, J., et al., J. Mol. Biol. 400:96-107 (2010)]에 기재된 샤키(Sharkey) 변이체이다. 부가의 DNA 및 RNA 뉴클레아제는 관련 기술분야에 공지되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "CRISPR RNA", "crRNA" 및 "가이드 RNA"는 복합체가 (핵산 표적 서열을 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드에 비해) 우선적으로 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열에 결합하도록 가이드하는 유형 I 이펙터 복합체를 형성하기 위해 Cas 서브유닛 단백질과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 RNA를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, "가이드" 및 "가이드 폴리뉴클레오티드"는 합성 백본, 자연적으로 발생하는 백본, 비-자연적으로 발생하는 백본, 기본적으로 상이한 백본 잔기, 화학적으로 이질적인 잔기 또는 연결, 변형된 백본, 혼합물 (예를 들어, 백본의 리보스 및 데옥시리보스 구성성분) 등, 및 그의 조합에 덧붙여, 리보뉴클레오티드 염기 (예를 들어, RNA) 및 리보스 당을 포함하는 유형 I 이펙터 복합체의 폴리뉴클레오티드 구성성분 뿐만 아니라 데옥시리보뉴클레오티드 염기, 뉴클레오티드 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 상이한 질소성 염기, 기본적으로 상이한 뉴클레오티드 염기, 화학적으로 이질적인 분자, 염기 (예를 들어, RNA 염기, DNA 염기, 및/또는 변형된 염기)의 혼합물 등, 뿐만 아니라 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 이질적인 구성성분 및 그의 조합을 지칭한다. 가이드 폴리뉴클레오티드의 일부 예가 본원에 기재되어 있다. crRNA 스페이서를 통해 핵산 표적 서열과 연합된 유형 I CRISPR-Cas crRNA의 예가 도 1b에 예시된다. 도 1b는 문헌 [Hochstrasser, M.L., et al., Mol. Cell 63:840-851 (2016)]을 각색한 것이다. 도 1b에서, PAM (도 1b, 104)이 핵산 표적 서열과 연합되고 이중-가닥 핵산의 5' 및 3' 가닥이 예시된다 (도 1b, 수직선은 수소 결합을 나타냄). 가이드 폴리뉴클레오티드 (도 1b, 106)는 전형적으로, 5' 핸들 영역 (도 1b, 101), 시드 영역을 포함하는 스페이서 영역 (도 1b, 103), 및 2개의 수소 결합된 반복부 영역을 포함하는 3' 헤어핀 (도 1b, 102)을 포함하며; 수평선은 수소 결합을 나타낸다. 다수의 유형 I 캐스케이드 상동체와 연합된 PAM 서열이 본원에 논의된다. PAM 서열은 인접한 프로토스페이서 서열 (도 1b, 105)이다. 도 1b는 핵산 표적 서열에 결합된 캐스케이드 복합체 스페이서를 예시한다 (도 1b, 수직선은 수소 결합을 나타냄). 도 1b는 또한 프로토스페이서 영역을 예시한다 (도 1b, 프로토스페이서). 스페이서는 약 6개 내지 약 56개 뉴클레오티드의 crRNA의 영역을 포함할 수 있으며, 여기서 스페이서는 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열에 상보적이다. 스페이서 길이는 유형 I-E CRISPR-Cas 시스템에서 캐스케이드 활성을 미세-조정하도록 변화될 수 있다. 캐스케이드 복합체는 crRNA 스페이서에 6개 뉴클레오티드가 부가된 여분의 Cas7 서브유닛과 스페이서에 12개 뉴클레오티드가 부가된 여분의 Cse2 서브유닛을 혼입할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Luo, M.L., et al., Nucleic Acids Res. 44(15):7385-7394 (2016)] 참조). 스페이서는 전형적으로, 약 32개 내지 약 36개 뉴클레오티드의 영역을 포함한다.

용어 "스페이서", "스페이서 서열" 및 "핵산 표적 결합 서열"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

"표적", "표적 서열", "핵산 표적 서열" 및 "표적-적중 서열"은 전부 또는 부분적으로, 캐스케이드 핵단백질 복합체 (예를 들어, 캐스케이드 RNP 복합체)의 가이드 (예를 들어, crRNA의 스페이서)의 핵산 표적 결합 서열에 상보적인 핵산 서열을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 전형적으로, 핵산 표적 결합 서열은 캐스케이드 핵단백질 복합체의 결합이 지정하는 핵산 표적 서열에 100% 상보적이 되도록 선택되지만; 핵산 표적 서열에의 결합을 약화시키기 위해서는, 더 낮은 퍼센트 상보성이 사용될 수 있다. 표적 결합 서열이 표적 서열에 100% 상보적인 경우에, "표적-이탈" 서열 결합은 캐스케이드 핵단백질 복합체가 핵산 표적 결합 서열 (스페이서)과의 100% 미만 상보성을 갖는 핵산 서열에 결합하는 것을 지칭한다. 이중-가닥 DNA 서열은 전형적으로, 하나의 가닥 위에 핵산 표적 서열을 포함한다 (도 1b, 가이드 RNA와 수소 결합된 절편). "표적 영역"은 핵산 표적 서열을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, "스템 요소" 또는 "스템 구조"는 이중-가닥 영역 ("스템 요소")을 형성하는 것으로 공지되어 있거나 이를 형성할 것으로 예측되는 핵산의 두 가닥을 지칭한다. "스템-루프 요소" 또는 "스템-루프 구조"는 한 가닥의 3'-말단 서열이 전형적으로 단일-가닥의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 ("스템-루프 요소 뉴클레오티드 서열")에 의해 제2 가닥의 5'-말단 서열에 공유적으로 결합되는 스템 구조를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 루프 요소는 약 3개 내지 약 20개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게 약 4개 내지 약 10개 뉴클레오티드 길이의 루프 요소 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 루프 요소 뉴클레오티드 서열은 이러한 루프 요소 뉴클레오티드 서열 내에 스템 요소를 창출하기 위해 수소 결합 형성을 통해 상호작용하지 않는 비-쌍형성된 핵산 염기의 단일-가닥 뉴클레오티드 서열이다. 용어 "헤어핀 요소"가 또한, 스템-루프 구조를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 이러한 구조는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 염기 쌍형성은 정확할 수 있지만; 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 스템 요소는 정확한 염기 쌍형성을 필요로 하지 않는다. 따라서, 스템 요소는 하나 이상의 염기 미스매치 또는 비-쌍형성된 염기를 포함할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드에서의 스템-루프 구조의 예가 도 1b에 예시되어 있다.

"링커 요소 뉴클레오티드 서열", "링커 뉴클레오티드 서열" 및 "링커 폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 제1 핵산 서열에 공유적으로 부착된 하나 이상의 뉴클레오티드의 단일-가닥 핵산 서열 또는 이중-가닥 핵산 서열을 지칭한다 (예를 들어, 5'-링커 뉴클레오티드 서열-제1 핵산 서열-3'). 일부 실시양태에서, 링커 뉴클레오티드 서열은 2개의 별도의 핵산 서열을 연결하여 단일 폴리뉴클레오티드를 형성한다 (예를 들어, 5'-제1 핵산 서열-링커 뉴클레오티드 서열-제2 핵산 서열-3'). 링커 뉴클레오티드 서열의 다른 예는 5'-제1 핵산 서열-링커 뉴클레오티드 서열-3' 및 5'-링커 뉴클레오티드 서열-제1 핵산 서열-링커 뉴클레오티드 서열-3'를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 링커 요소 뉴클레오티드 서열은 이러한 링커 요소 뉴클레오티드 서열 내에 2차 구조 (예를 들어, 스템-루프 구조)를 창출하기 위해 수소 결합 형성을 통해 서로 상호작용하지 않는 비-쌍형성된 핵산 염기의 단일-가닥 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 두 링커 요소 뉴클레오티드 서열은 이러한 두 링커 요소 뉴클레오티드 서열 사이의 수소 결합을 통해 서로 상호작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드는 "링커 폴리펩티드"를 코딩한다. 이러한 링커 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드의 3' 단부를 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드의 5' 단부에 연결하여, N-제1 폴리펩티드-링커 폴리펩티드-제2 폴리펩티드-C를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드를 형성시킨다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 3개 이상의 폴리펩티드 서열이 링커 폴리펩티드에 의해 나란히 연결될 수 있다 (예를 들어, N-제1 폴리펩티드-제1 링커 폴리펩티드-제2 폴리펩티드-제2 링커 폴리펩티드-제3 폴리펩티드-C). "링커 폴리펩티드", "링커 폴리펩티드 서열", "아미노산 링커 서열" 및 "링커 서열"이 또한, 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은, "뉴클레오티드 서열을 연결하는 것"은 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열을 공유적으로 연결하는 단일-가닥 핵산 서열 링커 서열을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "인터스페이서", "인터스페이서 영역" 및 "인터스페이서 거리"는 상호교환가능하며, 전형적으로 PAM-인 배향에서 제1 핵산 표적 서열 (예를 들어, 제1 DNA 표적 서열)의 PAM과 제2 핵산 표적 서열 (예를 들어, 제2 DNA 표적 서열)의 PAM 사이의 거리를 지칭하며, 여기서 제1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 제1 핵산 표적 서열에 결합할 수 있는 제1 스페이서를 포함하고, 제2 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 제2 핵산 표적 서열에 결합할 수 있는 제2 스페이서를 포함한다. 도 2a, 도 2b, 및 도 2c는 링커 폴리뉴클레오티드 (도 2a, "링커1" 및 "링커2")를 통해 각각의 캐스케이드 복합체와 연결된 융합 단백질 (도 2a, 원형 섹터로서 나타낸 "FP1" 및 "FP2"; 예를 들어, FP1 및 FP는 FokI일 수 있음)을 포함하는 2개의 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (도 2a: "crRNA1"을 포함하는 "캐스케이드1", 실선으로 윤곽을 나타낸 박스; 및 "crRNA2"를 포함하는 "캐스케이드2", 파선 박스)의 예시적인 예를 제시하며, 여기서 CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 이중-가닥 DNA (도 2a, "dsDNA", 쌍형성된 수평 파선으로서 나타냄) 상의 이웃한 핵산 표적 서열에 결합된다. 각각의 핵산 표적 서열과 연합된 PAM 서열이 표시된다 (도 2a, "PAM1," 열린 박스, 및 "PAM2," 열린 박스). 도 2a는 PAM-인 (PAM-인/PAM-인) 입체 배치에서 2개의 표적 부위 사이의 인터스페이서 (도 2a의 상단에 수평 이중 화살촉 모양의 선으로서 제시됨)를 예시한다. 도 2b는 PAM-인/PAM-아웃 입체 배치에서 2개의 표적 부위 사이의 인터스페이서 (도 2b의 상단에 수평 이중 화살촉 모양의 선으로서 제시됨)를 예시한다. 도 2c는 PAM-아웃 (PAM-아웃/PAM-아웃) 입체 배치에서 2개의 표적 부위 사이의 인터스페이서 (도 2c의 상단에 수평 이중 화살촉 모양의 선으로서 제시됨)를 예시한다. 도 2a, 도 2b, 및 도 2c는 또한 dsDNA의 두 가닥의 분리를 예시한다. 캐스케이드 복합체는 PAM에 인접한 dsDNA 표적 서열을 인식한다. PAM 서열은 Cse1에 의해 인식된다. crRNA와 상보적 표적 DNA 가닥 사이의 염기 쌍형성은 대체된 비-상보적 표적 DNA 가닥이 있는 R-루프를 생성한다 (예를 들어, 문헌 [Beloglazova, N., et al., Nucleic Acids Res. 43:530-543 (2015)] 참조).

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "동족"은 상호작용하는 생체 분자, 예컨대 세포 표면 수용체 (예를 들어, 케모카인 수용체)와 그의 리간드 (예를 들어, 종양 세포 상에 또는 종양 미세환경에서 발현된 케모카인); 부위-지정 폴리펩티드와 그의 가이드; 가이드 결합 서열에 상보적인 핵산 표적 서열에 부위-지정 결합할 수 있는 부위-지정 폴리펩티드/가이드 복합체 (즉, 핵단백질 복합체) 등을 지칭한다. 또한, 용어 "동족"은 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드 중 하나에 존재하는 스페이서에 상보적인 핵산 표적 서열에 부위-지정 결합할 수 있는 핵단백질 복합체를 형성할 수 있는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유형 I CRISPR-Cas RNA)와 Cas 서브유닛 단백질 군 (예를 들어, Cse2, Cas5, Cas6, Cas7, 및 Cas8)을 지칭한다.

용어 "야생형", "자연적으로 발생하는" 및 "비변형된"은 자연에 존재하는 전형적인 (또는 가장 통상적인) 형태, 외관, 표현형 또는 균주를 의미하기 위해 본원에 사용되며; 예를 들어, 자연의 공급원에서 발생하고 그로부터 단리될 수 있는 바와 같은, 전형적인 형태의 세포, 유기체, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 거대 분자 복합체, 유전자, RNA, DNA 또는 게놈이다. 야생형 형태, 외관, 표현형 또는 균주는 의도적인 변형, 변화, 돌연변이 및/또는 현저하게 상이한 구조적 변화 이전의 원래의 부모로서 제공된다. 따라서, 돌연변이체, 변이체, 조작된, 재조합 및 변형된 형태는 야생형 형태가 아니다.

용어 "조작된", "유전적으로 조작된", "유전적으로 변형된", "재조합", "변형된", "비-자연적으로 발생하는" 및 "비-천연"은 유기체 또는 세포의 게놈에 대한 의도적인 인간 또는 기계 조작을 나타낸다. 이러한 용어는 본원에 정의된 바와 같은 게놈 편집을 포함하는 게놈 변형 방법 뿐만 아니라 유전자 발현 또는 불활성화를 변경시키는 기술, 효소 공학, 유도 진화, 지식-기반 설계, 무작위 돌연변이 유발 방법, 유전자 셔플링, 코돈 최적화 등을 포괄한다. 유전 공학을 위한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

"공유 결합", "공유적으로 부착된", "공유적으로 결합된", "공유적으로 연결된", "공유적으로 연결된" 및 "분자 결합"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 원자 사이의 전자 쌍 공유를 수반하는 화학 결합을 지칭한다. 공유 결합의 예는 포스포디에스테르 결합, 포스포로티오에이트 결합, 디술피드 결합 및 펩티드 결합 (-CO-NH-)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

"비-공유 결합", "비-공유적으로 부착된", "비-공유적으로 결합된", "비-공유적으로 연결된", "비-공유 상호작용" 및 "비-공유적으로 연결된"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 한 쌍의 전자를 공유하는 것을 수반하지 않는 임의의 비교적 약한 화학 결합을 지칭한다. 다수의 비-공유 결합은 종종, 거대 분자의 입체 형태를 안정화시키고 분자 사이의 특이적 상호작용을 매개한다. 비-공유 결합의 예는 수소 결합, 이온 상호작용 (예를 들어, Na⁺Cl^-), 반 데르 발스 상호작용 및 소수성 결합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은, "수소 결합", "수소-염기 쌍형성" 및 "수소 결합된"은 상호교환가능하며, "왓슨-크릭-수소 결합된 염기 쌍" (W-C-수소 결합된 염기 쌍 또는 W-C 수소 결합); "후그스틴-수소 결합된 염기 쌍" (후그스틴 수소 결합); 및 "워블-수소 결합된 염기 쌍" (워블 수소 결합)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 표준 수소 결합 및 비-표준 수소 결합을 지칭한다. 역 W-C 수소 결합을 포함한 W-C 수소 결합은 퓨린-피리미딘 염기 쌍형성, 예를 들어, 아데닌:티민, 구아닌:시토신 및 우라실:아데닌을 지칭한다. 역 후그스틴 수소 결합을 포함한 후그스틴 수소 결합은 핵산에서 염기 쌍형성의 변이를 지칭하며, 여기서 각각의 가닥에 하나씩 2개의 핵염기가 주요 홈에서 수소 결합에 의해 결합된다. 이러한 비-W-C 수소 결합은 제3 가닥이 듀플렉스 주위를 감아 삼중-가닥 나선을 형성할 수 있게 한다. 역 워블 수소 결합을 포함한 워블 수소 결합은 왓슨-크릭 염기 쌍 규칙을 따르지 않는 RNA 분자 내의 두 뉴클레오티드 사이의 쌍형성을 지칭한다. 구아닌:우라실, 이노신 (히포크산틴):우라실, 이노신-아데닌 및 이노신-시토신의 4가지 주요 워블 염기 쌍이 있다. 표준 수소 결합 및 비-표준 수소 결합에 대한 규칙은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [The RNA World, Third Edition (Cold Spring Harbor Monograph Series), R.F. Gesteland, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2005), ISBN 978-0879697396; The RNA World, Second Edition (Cold Spring Harbor Monograph Series), R.F. Gesteland, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999), ISBN 978-0879695613; The RNA World (Cold Spring Harbor Monograph Series), R.F. Gesteland, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993), ISBN 978-0879694562 (예를 들어, Appendix 1: Structures of Base Pairs Involving at Least Two Hydrogen Bonds, I. Tinoco 참조); Principles of Nucleic Acid Structure, W. Saenger, Springer International Publishing AG (1988), ISBN 978-0-387-90761-1; Principles of Nucleic Acid Structure, First Edition, S. Neidle, Academic Press (2007), ISBN 978-01236950791] 참조).

"연결", "연결된" 및 "연결하는 것"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 2개의 거대 분자 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 단백질 등) 사이의 공유 결합 또는 비-공유 결합을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환가능하고, 뉴클레오티드의 중합체성 형태를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 하나의 5' 단부 및 하나의 3' 단부를 갖고 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있는 뉴클레오티드의 중합체성 형태를 지칭한다. "원형 폴리뉴클레오티드"는 그의 5' 단부와 3' 단부 사이에 공유 결합을 가지므로, 원형 폴리뉴클레오티드를 형성하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA), 리보뉴클레오티드 (RNA), 그의 유사체, 또는 그의 조합 (예를 들어, 가이드 폴리뉴클레오티드의 맥락에서 상기 기재된 바와 같음)일 수 있고, 임의의 길이의 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 기능을 수행할 수 있으며 다양한 2차 및 3차 구조를 가질 수 있다. 상기 용어는 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티에 있어서 변형되는 뉴클레오티드 및 자연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포괄한다. 특별한 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기 쌍형성 특이성을 갖는다 (예를 들어, T와 A 염기 쌍의 유사체). 폴리뉴클레오티드는 하나의 변형된 뉴클레오티드 또는 다수의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 예는 플루오린화 뉴클레오티드, 메틸화 뉴클레오티드, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 뉴클레오티드 구조는 중합체가 어셈블리되기 전 또는 후에 변형될 수 있다. 중합 후, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 표지화 구성성분 또는 표적 결합 구성성분과의 접합을 통해 부가적으로 변형될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 비-뉴클레오티드 구성성분을 혼입할 수 있다. 합성, 자연적으로 발생하는, 및/또는 비-자연적으로 발생하며 참조 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 또는 RNA)와 유사한 결합 특성을 갖는, 변형된 백본 잔기 또는 연결을 포함하는 핵산이 또한 포괄된다. 이러한 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA)™ (엑시콘, 인크. (Exiqon, Inc.; 미국 매사추세츠주 우번)) 뉴클레오시드, 글리콜 핵산, 브리지 핵산 및 모르폴리노 구조를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

펩티드-핵산 (PNA)은 폴리뉴클레오티드 포스페이트-당 백본이 가요성 슈도-펩티드 중합체로 대체되고, 핵염기가 이러한 중합체에 연결되는 핵산의 합성 상동체이다. PNA는 RNA 및 DNA의 상보적 서열과 높은 친화성 및 특이성으로 혼성화할 수 있는 능력을 가지고 있다.

포스포로티오에이트 핵산에서, 포스포로티오에이트 (PS) 결합은 폴리뉴클레오티드 포스페이트 백본에서 황 원자를 비-브리징 산소로 대체한다. 이러한 변형은 뉴클레아제 분해에 대해 저항성인 뉴클레오티드 간 연결을 만든다. 일부 실시양태에서, 포스포로티오에이트 결합은 엑소뉴클레아제 분해를 억제하기 위해 폴리뉴클레오티드 서열의 5'-말단 또는 3'-말단에서 마지막 3개 내지 5개 뉴클레오티드 사이에 도입된다. 전체 올리고뉴클레오티드 전반에 걸쳐 포스포로티오에이트 결합을 배치하는 것이, 엔도뉴클레아제에 의한 분해를 감소시키는데 또한 도움을 준다.

트레오스 핵산 (TNA)은 인공 유전적 중합체이다. TNA의 백본 구조는 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 반복 트레오스 당을 포함한다. TNA 중합체는 뉴클레아제 분해에 대해 저항성이다. TNA는 염기 쌍 수소 결합에 의해 듀플렉스 구조로 자기 어셈블리될 수 있다.

연결 반전은 "역전된 포스포르아미다이트"의 사용을 통해 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있다 (예를 들어, www.ucalgary.ca/dnalab/synthesis/-modifications/linkages 참조). 폴리뉴클레오티드의 말단에서의 3'-3' 연결은 2 개의 5'-OH 말단을 갖지만 3'-OH 말단이 결여된 올리고뉴클레오티드를 창출함으로써 엑소뉴클레아제 분해에 대해 폴리뉴클레오티드를 안정화시켜 준다. 전형적으로, 이러한 폴리뉴클레오티드는 5'-OH 위치 상에 포스포르아미다이트 기를 갖고 3'-OH 위치 상에 디메톡시트리틸 (DMT) 보호기를 갖는다. 정상적으로, DMT 보호기는 5'-OH 상에 있고, 포스포르아미다이트는 3'-OH 상에 있다.

폴리뉴클레오티드 서열은 달리 지시되지 않는 한 통상적인 5'에서 3' 배향으로 본원에 표시된다.

본원에 사용된 바와 같은, "서열 동일성"은 일반적으로, 다양한 가중치 파라미터를 갖는 알고리즘을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 제2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 비교하는 뉴클레오티드 염기 또는 아미노산의 퍼센트 동일성을 지칭한다. 두 폴리뉴클레오티드 또는 두 폴리펩티드 사이의 서열 동일성은 GENBANK (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 및 EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 월드와이드 웹 사이트를 통해 이용가능한 다양한 방법 및 컴퓨터 프로그램 (예를 들어, BLAST, CS-BLAST, PSI-BLAST, FASTA, HMMER, L-ALIGN 등)에 의한 서열 정렬을 사용하여 결정될 수 있다. 두 폴리뉴클레오티드 또는 두 폴리펩티드 서열 사이의 서열 동일성은 일반적으로, 다양한 방법 또는 컴퓨터 프로그램의 표준 디폴트 파라미터를 사용하여 계산된다. 본원에 사용된 바와 같은, 두 폴리뉴클레오티드 또는 두 폴리펩티드 사이의 높은 정도의 서열 동일성은 전형적으로, 약 90% 동일성 내지 100% 동일성, 예를 들어, 약 90% 이상의 동일성, 바람직하게 약 95% 이상의 동일성, 보다 바람직하게 약 98% 이상의 동일성이다. 본원에 사용된 바와 같은, 두 폴리뉴클레오티드 또는 두 폴리펩티드 사이의 중간 정도의 서열 동일성은 전형적으로, 약 80% 동일성 내지 약 85% 동일성, 예를 들어, 약 80% 이상의 동일성, 바람직하게 약 85% 동일성이다. 본원에 사용된 바와 같은, 두 폴리뉴클레오티드 또는 두 폴리펩티드 사이의 낮은 정도의 서열 동일성은 전형적으로, 약 50% 동일성 내지 75% 동일성, 예를 들어, 약 50% 동일성, 바람직하게 약 60% 동일성, 보다 바람직하게 약 75% 동일성이다. 예를 들어, 아미노산 치환을 포함하는 Cas 단백질 (예를 들어, 유형 I-E Cse2, Cas5, Cas6, Cas7, 및/또는 Cas8)은 그의 길이 전반에 걸쳐, 참조 Cas 단백질 (예를 들어, 각각 야생형 유형 I-E Cse2, Cas5, Cas6, Cas7, 및/또는 Cas8)과의 낮은 정도의 서열 동일성, 중간 정도의 서열 동일성, 또는 높은 정도의 서열 동일성을 가질 수 있다. 또 다른 예로서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 참조 Cas 단백질과 복합체를 형성하는 참조 야생형 가이드 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유형 I-E Cse2, Cas5, Cas6, Cas7, 및/또는 Cas8과 복합체를 형성하는 가이드 폴리뉴클레오티드)와 비교해서 그의 길이 전반에 걸쳐 낮은 정도의 서열 동일성, 중간 정도의 서열 동일성, 또는 높은 정도의 서열 동일성을 가질 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "혼성화", "혼성화하다" 또는 "혼성화하는 것"은 2개의 상보적 단일-가닥 DNA 또는 RNA 분자를 조합하여, 수소 염기 쌍형성을 통해 단일 이중-가닥 분자 (DNA/DNA, DNA/RNA, RNA/RNA)를 형성하도록 하는 프로세스이다. 혼성화 엄격성은 전형적으로, 혼성화 온도 및 혼성화 완충제의 염 농도에 의해 결정되며; 예를 들어, 고온 및 저염은 높은 엄격성 혼성화 조건을 제공한다. 상이한 혼성화 조건에 대한 염 농도 범위 및 온도 범위의 예는 하기와 같다: 높은 엄격성, 대략 0.01 M 내지 대략 0.05 M 염, 혼성화 온도 5℃ 내지 10℃ 미만 T_m; 중간 정도의 엄격성, 대략 0.16 M 내지 대략 0.33 M 염, 혼성화 온도 20℃ 내지 29℃ 미만 T_m; 및 낮은 엄격성, 대략 0.33 M 내지 대략 0.82 M 염, 혼성화 온도 40℃ 내지 48℃ 미만 T_m. 듀플렉스 핵산 서열의 T_m은 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 방법에 의해 계산된다 (예를 들어, 문헌 [Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York (1982); Casey, J., et al., Nucleic Acids Res. 4:1539-1552 (1977); Bodkin, D.K., et al., J. Virological Methods 10:45-52 (1985); Wallace, R.B., et al., Nucleic Acids Res. 9:879-894 (1981)] 참조). T_m을 추정하는 알고리즘 예측 도구가 또한 널리 이용가능하다. 혼성화를 위한 높은 엄격성 조건은 전형적으로, 표적 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 주로 표적 서열과 혼성화하고 비-표적 서열과 실질적으로 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 전형적으로, 혼성화 조건은 중간 정도의 엄격성, 바람직하게 높은 엄격성이다.

본원에 사용된 바와 같은, "상보성"은 핵산 서열이 또 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성할 수 있는 능력을 지칭한다 (예를 들어, 표준 왓슨-크릭 염기 쌍형성을 통함). 퍼센트 상보성은 제2 핵산 서열과 수소 결합을 형성할 수 있는 핵산 서열 내의 잔기의 백분율을 나타낸다. 두 핵산 서열이 100% 상보성을 갖는 경우에, 두 서열은 완벽하게 상보적인데, 즉 제1 폴리뉴클레오티드의 연속되는 잔기 모두가 제2 폴리뉴클레오티드 내의 동일한 수의 연속되는 잔기와 수소 결합된다.

본원에 사용된 바와 같은, "결합하는 것"은 거대 분자 사이의 (예를 들어, 단백질과 폴리뉴클레오티드 사이의, 폴리뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드 사이의, 단백질과 단백질 사이의 등) 비-공유 상호작용을 지칭한다. 이러한 비-공유 상호작용은 "연합하는 것" 또는 "상호작용하는 것" (예를 들어, 제1 거대 분자가 제2 거대 분자와 상호작용하는 경우에, 제1 거대 분자는 비-공유 방식으로 제2 거대 분자에 결합함)으로서 지칭되기도 한다. 결합 상호작용의 일부 부분은 서열-특이적일 수 있다 (용어 "서열-특이적 결합", "서열-특이적으로 결합하다", "부위-특이적 결합" 및 "부위 특이적으로 결합하다"는 본원에서 상호교환가능하게 사용됨). 본원에 사용된 바와 같은, 서열-특이적 결합은 전형적으로, 핵산 표적 결합 서열 (예를 들어, DNA 표적 결합 서열)을 수반하지 않는 제2 핵산 서열 (예를 들어, 제2 DNA 서열)에 비해 우선적으로 핵산 표적 서열 (예를 들어, DNA 표적 서열)을 포함하는 핵산 서열 (예를 들어, DNA 서열)에 결합하도록 하기 위해 유형 I CRISPR-Cas 서브유닛 단백질 (예를 들어, Cse2, Cas5, Cas6, Cas7, 및 Cas8)과의 복합체를 형성할 수 있는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 결합 상호작용의 모든 구성성분이 서열 특이적일 필요는 없는데, 예컨대 단백질이 DNA 백본 내의 포스페이트 잔기와 접촉할 필요는 없다. 결합 상호작용은 해리 상수 (Kd)에 의해 특징규명될 수 있다. "결합 친화도"는 결합 상호작용의 강도를 지칭한다. 증가된 결합 친화도는 더 낮은 Kd와 상관이 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 이펙터 복합체는 이러한 복합체가 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열에서의 폴리뉴클레오티드에 결합하거나 이를 절단하는 경우에, 상기 폴리뉴클레오티드를 "표적화한다"고 한다.

본원에 사용된 바와 같은, "이중-가닥 파손" (DSB)은 절단되는 DNA의 이중-가닥 세그먼트의 두 가닥을 지칭한다. 일부 경우에, 이러한 파손이 발생하면, 하나의 가닥은, 뉴클레오티드가 노출되고 다른 가닥 상의 뉴클레오티드에 수소 결합되지 않는 "점착성 단부"를 갖는다고 할 수 있다. 다른 경우에, 두 가닥이 서로 완전히 염기 쌍을 유지하고 있는 "평활 단부"가 발생할 수 있다.

"공여자 폴리뉴클레오티드", "공여자 올리고뉴클레오티드" 및 "공여자 주형"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA), 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 또는 RNA), 또는 그의 조합일 수 있다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 삽입 서열 (예를 들어, DNA 내의 DSB)을 플랭킹하는 상동성 아암(arm)을 포함할 수 있다. 각각의 측면 상의 상동성 아암은 그 길이가 다양할 수 있다 (예를 들어, 1-50개 염기, 50-100개 염기, 100-200개 염기, 200-300개 염기, 300-500개 염기, 500-1000개 염기). 상동성 아암은 그 길이가 대칭적 또는 비대칭적일 수 있다. 공여자 폴리뉴클레오티드의 설계 및 구축을 위한 파라미터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ran, F., et al., Nature Protocols 8:2281-2308 (2013); Smithies, O., et al., Nature 317:230-234 (1985); Thomas, K., et al., Cell 44:419-428 (1986); Wu, S., et al., Nature Protocols 3:1056-1076 (2008); Singer, B., et al., Cell 31:25-33 (1982); Shen, P., et al., Genetics 112:441-457 (1986); Watt, V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4768-4772 (1985); Sugawara, N., et al., J. Mol. Bio. 12:563-575 (1992); Rubnitz, J., et al., J. Mol. Bio. 4:2253-2258 (1984); Ayares, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5199-5203 (1986); Liskay, R., et al., Genetics 115:161-167 (1987)] 참조). 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 키메라 항원 수용체 (예를 들어, CAR)를 포함한다.

용어 "키메라 항원 수용체" 및 "CAR"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 전형적으로 적어도 2가지 구성성분, 즉 세포외 항원 인식 도메인 (표적 결합 도메인 또는 세포외 리간드 결합 도메인으로서 지칭되기도 함) 및 세포내 활성화 도메인 (예를 들어, 하나 이상의 세포내 시그널링 도메인 및 전형적으로 하나 이상의 공동-자극 시그널링 도메인을 포함함)을 포함하는, 실험실에서 창출된 폴리펩티드 분자를 지칭한다. CAR은 힌지 도메인 및 막횡단 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 전형적인 CAR 폴리펩티드의 구조는 하기와 같다: N 말단-세포외-[항원 인식 도메인-힌지 도메인]-막횡단-[막횡단 도메인]-세포내-[세포내 활성화 도메인]-C 말단; 또는 N 말단-세포내-[세포내 활성화 도메인]-막횡단-[막횡단 도메인]- 세포외-[항원 인식 도메인-힌지 도메인]-C 말단.

세포외 항원 인식 도메인의 예는 항원에 결합하기 위해 사용되는 모이어티를 포함하며, 이는 단일 쇄 이뮤노글로불린 가변 단편 (scFv), 항원 결합 단편 (Fab; 전형적으로, 항원에 결합하고 중쇄 및 경쇄 각각의 하나의 불변 및 하나의 가변 도메인으로 구성되는 항체의 영역), 나노바디, 낙타과 유래 또는 상어 유래 단일 쇄 항체, 조작된 단백질 결합 스캐폴드 (예를 들어, DARPin 및 센티린(Centyrin)), 또는 동족 수용체(들)에 결합하는 자연 리간드(들)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

힌지 도메인의 예는 가변 길이 (예를 들어, 하나 이상의 아미노산)의 폴리펩티드 힌지, CD8 알파의 힌지 영역, CD28의 힌지 영역, IgG4의 힌지 영역, 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

막횡단 도메인의 예는 막횡단 단백질, 예컨대, CD8 알파, CD28, DAP10, DAP12, NKG2D, 및 그의 조합으로부터 유래된 막횡단 영역을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

세포내 활성화 도메인의 예는 CD28, 4-1BB, CD3 제타, OX40, 2B4, DAP10, DAP12의 세포내 시그널링 도메인, 말단절단된 및 돌연변이된 시그널링 도메인 (예를 들어, CD3 제타의 3개의 ITAM 도메인 내의 돌연변이 및 말단절단), 또는 다른 세포내 시그널링 도메인, 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

세포외 리간드 결합 도메인이 동족 리간드에 결합할 때, CAR의 세포내 시그널링 도메인은 림프구를 활성화시킨다 (CAR-T 세포의 설명에 관해서는, 예를 들어, 문헌 [Brudno, J., et al., Nature Rev. Clin. Oncol. 15:31-46 (2018); Maude, S., et al., N. Engl. J. Med. 371:1507-1517 (2014); Sadelain, M., et al., Cancer Disc. 3:388-398 (2013)]; 미국 특허 번호 7,446,190; 미국 특허 번호 8,399,645을 참조) (CAR-NK 세포의 설명에 관해서는, 예를 들어, 문헌 [Rezvani, K., et al., Mol. Ther., 25:1769-1781 (2017); Siegler, E., et al., Cell Stem Cell. 23:160-161 (2018); Li, Y., et al., Cell Stem Cell. 23:181-192 (2018); Lin, C., et al., Biochim. Biophys. Acta. Rev. Cancer. 1869:200-215 (2018); Hu, Y., et al., Acta. Pharmacol. Sin. 39:167-176 (2018); Fang, F., et al., Semin. Immunol. 31:37-54 (2017); Glienke, W., et al., Front Pharmacol. 6:21 (2015)]을 참조).

표 2는 예시적인 세포성 표적 및 이러한 세포성 표적에 결합하는 scFv/결합 단백질을 제시한다. 이러한 scFv/결합 단백질 또는 그의 일부분이 CAR 구축물 내로 혼입될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "상동성-지정 복구" (HDR)는, 예를 들어, gDNA에서의 DSB를 복구하는 동안 세포에서 발생하는 DNA 복구를 지칭한다. HDR은 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하며, (예를 들어, DNA 표적 서열 내의) DSB가 발생한 서열을 복구하기 위해 공여자 또는 주형 폴리뉴클레오티드를 사용한다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, DSB를 플랭킹하는 서열과의 필수적 서열 상동성을 가지므로, 공여자 폴리뉴클레오티드가 복구에 적합한 주형으로서 제공될 수 있다. HDR은 유전 정보를, 예를 들어, 공여자 폴리뉴클레오티드에서 DNA 표적 서열로 전달시켜 준다. HDR은 공여자 폴리뉴클레오티드 서열이 DNA 표적 서열과 상이하고 공여자 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전부가 DNA 표적 서열 내로 혼입되는 경우에, DNA 표적 서열의 변경 (예를 들어, 삽입, 결실 또는 돌연변이)을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 공여자 폴리뉴클레오티드, 공여자 폴리뉴클레오티드의 일부분, 또는 공여자 폴리뉴클레오티드의 카피는 DNA 표적 서열의 부위에 통합된다. 예를 들어, 공여체 폴리뉴클레오티드는 DNA 표적 서열 내의 파손을 복구하는데 사용될 수 있으며, 여기서 복구는 DNA 내의 파손 부위 또는 파손에 근접한 부위에서 공여자 폴리뉴클레오티드로부터의 유전 정보의 전달을 초래한다. 따라서, 새로운 유전 정보가 DNA 표적 서열에 삽입되거나 또는 카피될 수 있다.

"게놈 영역"은 핵산 표적 서열 부위의 어느 한쪽에 존재하는 숙주 세포의 게놈 내의 염색체의 세그먼트이거나, 또는 또 다른 한편으론 또한, 핵산 표적 서열 부위의 일부분을 포함한다. 공여자 폴리뉴클레오티드의 상동성 아암은 상응하는 게놈 영역과의 상동 재조합을 수행하기에 충분한 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드의 상동성 아암은 핵산 표적 서열 부위를 바로 플랭킹하는 게놈 영역과의 상당한 서열 상동성을 공유하고; 상동성 아암은 핵산 표적 서열 부위로부터 멀리 떨어진 게놈 영역과의 충분한 상동성을 갖도록 설계될 수 있는 것으로 인식된다.

본원에 사용된 바와 같은, "비-상동 단부 결합" (NHEJ)은 공여자 폴리뉴클레오티드에 대한 요구없이 파손의 한 말단을 파손의 다른 말단에 직접 라이게이션함으로써 DNA 내의 DSB를 복구하는 것을 지칭한다. NHEJ는 복구 주형을 사용하지 않고서도 DNA를 복구하기 위해 세포에 이용가능한 DNA 복구 경로이다. 공여자 폴리뉴클레오티드의 부재 하에서의 NHEJ는 종종, 뉴클레오티드가 DSB의 부위에 무작위로 삽입되거나 결실되는 결과를 초래한다.

"미세상동성-매개 단부 결합" (MMEJ)은 gDNA 내의 DSB를 복구하기 위한 경로이다. MMEJ는 DSB를 플랭킹하는 결실, 및 연결하기 전에 파손 부위 내부의 미세상동 서열의 정렬을 수반한다. MMEJ는 유전적으로 정의되어 있으며, 예를 들어, CtIP, 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 1 (PARP1), DNA 폴리머라제 세타 (Pol θ), DNA 리가제 1 (Lig 1), 또는 DNA 리가제 3 (Lig 3)의 활성을 필요로 한다. 부가의 유전적 구성성분은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sfeir, A., et al., Trends in Biochemical Sciences 40:701-714 (2015)] 참조).

본원에 사용된 바와 같은, "DNA 복구"는 세포성 기구가 세포에 함유된 DNA 분자에 대한 손상을 복구하는 임의의 프로세스를 포괄한다. 복구된 손상은 단일-가닥-파손 또는 DSB를 포함할 수 있다. DSB를 복구하기 위해 HDR, NHEJ 및 MMEJ의 적어도 3가지 메카니즘이 있다. "DNA 복구"는 또한 인간 또는 기계 조작으로부터 비롯되는 DNA 복구를 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 여기서 표적 로커스는, 예를 들어, 뉴클레오티드를 삽입, 결실 또는 치환함으로써 변형되는데, 이들 모두는 게놈 편집의 형태를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같은, "재조합"은 두 폴리뉴클레오티드 사이의 유전 정보의 교환 프로세스를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "조절 서열", "조절 요소" 및 "제어 요소"는 상호교환가능하며, 발현될 폴리뉴클레오티드 표적의 상류 (5' 비-코딩 서열), 내부 또는 하류 (3' 비-번역 서열)인 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은, 예를 들어, 전사의 시기; 전사의 양 또는 수준; RNA 프로세싱 또는 안정성; 및/또는 관련된 구조적 뉴클레오티드 서열의 번역에 영향을 미친다. 조절 서열은 활성화제 결합 서열, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, 프로모터, 전사 시작 부위, 저해인자 결합 서열, 스템-루프 구조, 번역 개시 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 번역 리더 서열, 전사 종결 서열 (예를 들어, 폴리아데닐화 시그널 및 폴리-U 서열), 번역 종결 서열, 프라이머 결합 부위 등을 포함할 수 있다.

조절 요소는 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적, 유도성 및 저해성 발현을 지시하는 요소와, 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 요소 (예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터, 하나 이상의 pol II 프로모터, 하나 이상의 pol I 프로모터, 또는 그의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예는 U6 및 H1 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. pol II 프로모터의 예는 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (임의적으로 RSV 인핸서와 함께), 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (임의적으로 CMV 인핸서와 함께; 예를 들어, 문헌 [Boshart, M., et al., Cell 41:521-530 (1985)] 참조), SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터 뿐만 아니라 조작된 인공 프로모터 (예를 들어, MND 프로모터 및 CAG 프로모터)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 발현의 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있음을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인지할 것이다. 벡터는 숙주 세포 내로 도입됨으로써 RNA 전사체, 단백질, 또는 융합 단백질을 포함한 펩티드, 또는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 서열에 의해 코딩된 펩티드를 생산할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "유전자"는 엑손(들) 및 관련 조절 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 유전자는 인트론(들) 및/또는 비번역 영역(들) (UTR(들))을 추가로 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "작동가능하게 연결된"은 서로 기능적 관계로 배치된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 조절 서열 (예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)은 조절 서열이, 유전자 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절하거나 또는 이러한 폴리뉴클레오티드의 전사의 조정에 기여하는 경우에, 상기 유전자 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 "작동가능하게 연결"된다. 작동가능하게 연결된 조절 요소는 전형적으로, 코딩 서열과 연속된다. 그러나, 인핸서는 프로모터로부터 수 킬로염기 이하 또는 그 초과 만큼 분리되는 경우에, 기능할 수 있다. 부가적으로, 멀티시스트론성 구축물은 2A 자기 절단 펩티드, IRES 요소 등을 포함함으로써 단 하나의 프로모터를 사용하는 다중 코딩 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 조절 요소는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있지만, 폴리뉴클레오티드 서열과 연속되지 않을 수 있다. 유사하게, 번역 조절 요소는 폴리뉴클레오티드로부터의 단백질 발현의 조정에 기여한다.

본원에 사용된 바와 같은, "발현"은, 예를 들어, 메신저 RNA (mRNA) 또는 다른 RNA 전사체 (예를 들어, 비-코딩, 예컨대 구조적 또는 스캐폴딩 RNA)를 초래하는, DNA 주형으로부터의 폴리뉴클레오티드의 전사를 지칭한다. 상기 용어는 추가로, 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 프로세스를 지칭한다. 전사체 및 코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물(들)"로서 지칭될 수 있다. 발현은 폴리뉴클레오티드가 gDNA로부터 유래되는 경우에, 진핵 세포에서 mRNA를 스플라이싱하는 것을 포함할 수 있다.

"코딩 서열" 또는 선택된 폴리펩티드를 "코딩"하는 서열은 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓여질 때 시험관내 또는 생체내에서 폴리펩티드로 전사 (DNA의 경우) 및 번역 (mRNA의 경우)되는 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5' 말단에서의 출발 코돈과 3' 말단에서의 번역 중지 코돈에 의해 결정된다.

본원에 사용된 바와 같은, "인공 전사 활성화제 (ATA)" 또는 "인공 전사 인자 (ATF)"는 RNA 폴리머라제 II 홀로엔자임을, 이들이 연합되어 있는 유전자에 동원함으로써 관심 유전자의 이소성 발현을 유발할 수 있는 복합체를 의미한다. 이러한 활성화제는 적어도 2가지 구성성분을 포함한다: (1) 동족 뉴클레오티드 서열을 직접 인식하고 이들 서열에 결합할 수 있는, 촉매적으로 불활성인 폴리뉴클레오티드 결합 도메인, 또는 결합을 위해 이러한 서열로 가이드되는 폴리뉴클레오티드 결합 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 결합 도메인 및 가이드를 포함하는 핵단백질 복합체); 및 (2) 전사를 상향조절하기 위해 전사 기구를 구성하는 다양한 단백질과 상호작용하는 활성화 도메인 ("이펙터 도메인"이라고도 함).

"촉매적으로 불활성인 폴리뉴클레오티드 결합 도메인"은 결합 도메인에 의해 결합된 핵산 표적 부위에 결합하지만 이를 절단하지는 않는 분자를 의미한다. 이러한 도메인의 대표적인 예가 본원에 상세히 기재된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "조정하다"는 특정 기능의 수량, 정도 또는 양에 있어서의 변화를 지칭한다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 유형 I CRISPR 핵단백질 복합체는 프로모터 또는 전사 출발 부위 또는 조절인자 부위에서 또는 그 근처에서 핵산 표적 서열에 결합함으로써 프로모터 서열의 활성을 조정할 수 있다. 결합 후 발생하는 작용에 따라, 유형 I CRISPR 핵단백질 복합체는 프로모터 서열에 작동적으로 연결된 유전자의 전사를 유도, 증강, 저해 또는 억제할 수 있다. 따라서, 유전자 발현의 "조정"은 유전자 활성화와 유전자 저해 둘 다를 포함한다.

조정은 표적 유전자의 발현에 의해 직접 또는 간접적으로 영향을 받는 임의의 특징을 결정함으로써 검정될 수 있다. 이러한 특징은, 예를 들어, RNA 또는 단백질 수준, 단백질 활성, 산물 수준, 유전자의 발현, 또는 리포터 유전자의 활성 수준 상의 변화를 포함한다. 따라서, 용어 유전자의 "발현을 조정하는 것", "발현을 억제하는 것" 및 "발현을 활성화하는 것"은 유전자의 전사를 변화, 활성화 또는 억제할 수 있는 유형 I CRISPR 핵단백질 복합체의 능력을 지칭할 수 있다.

기능 (예를 들어, 효소적 기능)은 상향-조정될 수 있거나 (예를 들어, 기능을 증가, 강화, 증폭 또는 증강시킴) 또는 하향-조정될 수 있다 (예를 들어, 기능을 감소, 약화, 축소 또는 저하시킴). 한 실시양태에서, mCas3 단백질과 단일-가닥 DNA (ssDNA)의 결합 또는 mCas3 단백질에 의한 ATP 결합/가수분해는 상응하는 wtCas3 단백질에 비해 상향-조정되거나 또는 하향-조정될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "벡터" 및 "플라스미드"는 유전 물질을 세포 내로 도입하기 위한 폴리뉴클레오티드 비히클을 지칭한다. 벡터는 선형 또는 원형일 수 있다. 벡터는 적합한 숙주 세포에서 벡터의 복제를 수행할 수 있는 복제 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유할 수 있다. 적합한 숙주의 형질전환 시, 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제 및 기능하거나 또는 숙주 게놈에 통합될 수 있다. 벡터 설계는 무엇보다도 벡터에 대한 의도된 용도 및 숙주 세포에 의존하고, 특별한 용도 및 숙주 세포를 위한 본 발명의 벡터의 설계는 관련 기술분야의 기술 수준 내에 있다. 4가지 주요 유형의 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드 및 인공 염색체이다. 전형적으로, 벡터는 복제 기점, 다중 클로닝 부위 및/또는 선택가능한 마커를 포함한다. 발현 벡터는 전형적으로 발현 카세트를 포함한다. "재조합 바이러스"는, 예를 들어, 바이러스 게놈 또는 그의 일부분 내로의 이종 핵산 구축물의 부가 또는 삽입에 의해 유전적으로 변경시킨 바이러스를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은, "발현 카세트"는 재조합 방법을 사용하거나 또는 합성 수단에 의해 생성되고 숙주 세포에서 선택된 폴리뉴클레오티드의 발현을 용이하게 하기 위해 선택된 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물을 지칭한다. 예를 들어, 조절 서열은 숙주 세포에서 선택된 폴리뉴클레오티드의 전사, 또는 숙주 세포에서 선택된 폴리뉴클레오티드의 전사와 번역을 용이하게 할 수 있다. 발현 카세트는, 예를 들어, 숙주 세포의 게놈에 통합되거나 또는 벡터에 존재하여 발현 벡터를 형성할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "표적화 벡터"는 표적 유전자 또는 핵산 표적 서열 (예를 들어, DSB)의 요소를 플랭킹하는, gDNA에 상동인 맞춤형 DNA 아암을 전형적으로 포함하는 재조합 DNA 구축물이다. 표적화 벡터는 공여자 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 표적 유전자의 요소는 결실 및/또는 삽입을 포함한 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 결함이 있는 표적 유전자는 기능적 표적 유전자로 대체될 수 있거나, 또는 그 대안에서는, 기능적 유전자가 녹아웃될 수 있다. 임의적으로, 표적화 벡터의 공여자 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자 내로 도입되는 선택가능한 마커를 포함하는 선별 카세트를 포함한다. 표적 유전자에 인접하거나 또는 표적 유전자 내에 있는 표적화 영역 (핵산 표적 서열을 포함함)은 유전자 발현의 조절에 영향을 주기 위해 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "내지"는 주어진 범위 내의 말단 값을 포함한다 (예를 들어, 1개 내지 50개 뉴클레오티드 길이는 1개 뉴클레오티드 및 50개 뉴클레오티드를 포함하고; 5개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이는 5개 아미노산 및 50개 아미노산을 포함함).

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "아미노산" (aa)은 아미노산 유사체, 변형된 아미노산, 펩티드 모방제, 글리신, 및 D 또는 L 광학 이성질체를 포함한 자연 및 합성 (비자연) 아미노산을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "펩티드", "폴리펩티드", "단백질" 및 "서브유닛 단백질"은 상호교환가능하며 아미노산의 중합체를 지칭한다. 폴리펩티드는 임의의 길이일 수 있다. 이는 분지형 또는 선형일 수 있으며, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있으며, 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한, 예를 들어, 아세틸화, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, 페길화, 비오티닐화, 가교-결합, 및/또는 접합 (예를 들어, 표지화 구성성분 또는 리간드를 이용함)을 통해 변형시킨 아미노산 중합체를 지칭한다. 폴리펩티드 서열은 달리 지시되지 않는 한, 통상적인 N-말단에서 C-말단 배향으로 본원에 표시된다.

폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 분자 생물학 분야의 일상적인 기술을 사용하여 만들 수 있다 (예를 들어, 상기 열거된 표준 텍스트 참조). 더욱이, 본질적으로 임의의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 상업적 공급원으로부터 입수가능하다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "융합 단백질" 및 "키메라 단백질"은 단일 단백질에서 자연적으로 함께 발생하지 않는 둘 이상의 단백질, 단백질 도메인, 단백질 단편 또는 순환 순열된 폴리펩티드를 연결함으로써 창출된 단일 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드는 제1 단백질, 단백질 도메인, 또는 단백질 단편, 또는 순환 순열된 폴리펩티드를 제2 단백질, 단백질 도메인, 단백질 단편, 또는 순환 순열된 폴리펩티드에 연결하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 유형 I CRISPR-Cas 단백질 (예를 들어, Cas8, Cas3) 및 또 다른 단백질 (예를 들어, FokI; 예를 들어, 미국 특허 번호 9,885,026 참조)로부터의 기능적 도메인을 포함할 수 있다. 융합 단백질에 이러한 도메인을 포함시키는 변형은 조작된 유형 I CRISPR-Cas 단백질에 부가의 활성을 부여할 수 있다. 이러한 활성은 핵산 표적 서열과 연합된 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤)를 변형시키는, 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, DNA 복구 활성, DNA 손상 활성, 탈아미노화 활성, 디스무타제 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 리컴비나제 활성, 폴리머라제 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 포토리아제 활성, 글리코실라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 데아세틸라제 활성, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, SUMO화 활성, 탈SUMO화 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 및/또는 미리스토일화 활성 또는 탈미리스토일화 활성을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 융합 단백질은 에피토프 태그 (예를 들어, 히스티딘 태그, HA 태그, 플래그(FLAG)® (시그마 알드리치 (Sigma Aldrich; 미국 미주리주 세인트 루이스)) 태그, Myc 태그, 핵 국재화 시그널 (NLS) 태그, SunTag, 리포터 단백질 서열 (예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 베타-갈락토시다제, 루시페라제, 녹색 형광 단백질, 청록색 형광 단백질, 황색 형광 단백질) 및/또는 핵산 서열 결합 도메인 (예를 들어, DNA 결합 도메인 또는 RNA 결합 도메인)을 포함할 수 있다.

융합 단백질은 또한, 활성화제 도메인 (예를 들어, 열 충격 전사 인자, NFKB 활성화제) 또는 저해인자 도메인 (예를 들어, KRAB 도메인)을 포함할 수 있다. 문헌 [Lupo, A., et al., Current Genomics 14:268-278 (2013)]에 의해 기재된 바와 같이, KRAB 도메인은 강력한 전사 저해 모듈이며 대부분의 C2H2 징크 핑거 단백질의 아미노 말단 서열에 위치한다 (예를 들어, 문헌 [Margolin, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4509-4513 (1994); Witzgall, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4514-4518 (1994)] 참조). KRAB 도메인은 전형적으로, 단백질-단백질 상호작용을 통해 공동-저해인자 단백질 및/또는 전사 인자에 결합하여, KRAB 징크 핑거 단백질 (KRAB-ZFP)에 결합하는 유전자의 전사 저해를 유발한다 (예를 들어, 문헌 [Friedman, J.R., et al., Genes & Development 10:2067-2678 (1996)] 참조). 일부 실시양태에서, 링커 핵산 서열은 2개 이상의 단백질, 단백질 도메인 또는 단백질 단편을 연결하는데 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은, "캐스케이드a" (캐스케이드 활성화)는 CRISPR 방법 또는 시스템으로서, 여기서 이러한 방법 또는 시스템은 캐스케이드 RNP 복합체의 표적 핵산 서열의 로커스와 연합된 유전자의 발현을 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 캐스케이드 복합체의 하나 이상의 단백질은 이펙터 도메인 (예를 들어, VP16 또는 VP64)과 융합되고, 융합 및 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 캐스케이드 RNP 복합체가 내인성 전사 인자의 동원에 사용된다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 이펙터 도메인, 예컨대 전사 인자를 또한 동원하는 MS2 결합 RNA와 5' 또는 3' 융합될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "캐스케이드i" (캐스케이드 억제)는 CRISPR 방법 또는 시스템으로서, 여기서 CRISPR 방법 또는 시스템은 캐스케이드 RNP 복합체의 표적 핵산 서열의 로커스와 연합된 유전자의 발현을 하향조절한다 (즉, 캐스케이드 RNP 복합체는 유전자의 발현을 하향조절하는데 사용됨). 내인성 저해 인자의 동원을 위해, 캐스케이드 복합체의 하나 이상의 단백질은 전형적으로, 이펙터 도메인 (예를 들어, KRAB)과 융합된다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 내인성 전사 저해 이펙터 단백질을 또한 동원하는 뉴클레오티드 이펙터 도메인과 5' 또는 3' 융합될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "모이어티"는 분자의 일부분을 지칭한다. 모이어티는 작용기일 수 있거나 또는 다수의 작용기를 가진 분자의 일부분을 설명할 수 있다 (예를 들어, 통상의 구조적 측면을 공유함). 용어 "모이어티" 및 "작용기"는 전형적으로 본원에서 상호교환가능하게 사용되지만; "작용기"는 보다 구체적으로, 일부 통상의 화학적 행동을 포함하는 분자의 일부분을 지칭할 수 있다. "모이어티"는 종종 구조적 설명으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 5' 말단, 3' 말단, 또는 5' 말단과 3' 말단 (예를 들어, 제1 스템 요소에서 비-천연 5' 말단 및/또는 비-천연 3' 말단)은 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "입양 세포"는 암을 치료하고/거나 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 및 세포 요법의 다른 바람직하지 않은 부작용, 예컨대 시토카인 폭풍, 투여된 유전적으로 변형된 물질의 발암성 형질전환, 신경학적 장애 등이지만 이에 제한되지는 않는 부작용을 예방하기 위한 세포 요법 치료에 사용하기 위해 유전적으로 변형될 수 있는 세포를 지칭한다. 입양 세포는 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), 제대혈 줄기 세포, 림프구, 대식세포, 적혈구, 섬유모세포, 내피 세포, 상피 세포 및 췌장 전구 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은, "세포 요법"은 유전적으로 변형된 세포를 활용하는 질환 또는 장애의 치료를 지칭한다. 유전적 변형은 본원에 기재된 방법, 예컨대 바이러스 벡터, 뉴클레오펙션, 유전자 총 전달, 소노포레이션, 세포 압착, 리포펙션, 또는 다른 화학 물질, 세포 침투 펩티드 등의 사용을 포함하는 방법을 사용하여 도입될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "입양 세포 요법 (ACT)"은 환자를 치료하기 위해, 특이적 환자에게 되돌아온 그 환자로부터 유래되거나 (자가 세포 요법) 또는 제3자 공여자로부터 유래된 (동종이계 세포 요법) 유전적으로 변형된 입양 세포를 사용하는 요법을 지칭한다. ACT는 골수 이식, 줄기 세포 이식, T 세포 요법, CAR-T 세포 요법 및 자연 살해 (NK) 세포 요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은, "림프구"는 척추동물 면역 체계의 일부인 백혈구 (백혈구)를 지칭한다. 또한 용어 "림프구"에는 림프계 세포를 생성하는 조혈 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)가 포괄된다. 림프구는 세포-매개된 세포독성 적응 면역을 위한 T 세포, 예컨대 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포; 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포; 조절 T 세포, 예컨대 Treg 세포; 세포-매개된 세포독성 선천 면역에 있어서 기능하는 NK 세포; 체액성 항체 구동된 적응 면역을 위한 B 세포; NK/T 세포; 시토카인 유도된 살해 세포 (CIK 세포); 및 항원 제시 세포 (APC), 예컨대 수지상 세포를 포함한다. 림프구는 포유동물 세포, 예컨대 인간 (호모 사피엔스(Homo sapiens); 에이치. 사피엔스(H. sapiens)) 세포일 수 있다. 용어 "림프구"는 또한 T 또는 NK 세포 표면 상에 키메라 항원 수용체 (CAR)를 생산 (CAR-T 세포 및 CAR-NK 세포)하도록 변형된, 유전적으로 변형된 T 세포 및 NK 세포를 포괄한다. 이러한 CAR-T 세포는 특이적 가용성 항원을 인식하거나 또는 표적 세포 표면, 예컨대 종양 세포 표면 또는 종양 미세환경 내의 세포 상의 항원을 인식한다.

또한 본원에 사용된 바와 같은 용어 "림프구"는 주요 조직적합성 복합체 (MHC)에 의해 제시된 표적 세포의 단백질 또는 당(지질) 항원을 인식할 수 있는 하나 이상의 특이적인 자연적으로 발생하거나 또는 조작된 T-세포 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 T-세포 수용체 조작된 T 세포 (TCR)이다. 이들 항원의 작은 조각, 예컨대 펩티드 또는 지방산은 표적 세포 표면으로 이동하여 MHC의 일부로서 T-세포 수용체에 제시된다. 항원 부하된 MHC에 결합하는 T-세포 수용체는 림프구를 활성화시킨다.

림프구 활성화는 림프구가 세포 표면 상의 항원-특이적 수용체를 통해 촉발될 때 발생한다. 이것은 세포가 증식하고 전문화된 이펙터 림프구로 분화되도록 한다. 이러한 "활성화된" 림프구는 전형적으로, 림프구 표면 상의 수용체 세트에 의해 특징규명된다. 활성화된 T 세포에 대한 표면 마커는 CD3, CD4, CD8, PD1, IL2R 등을 포함한다. 활성화된 세포독성 림프구는 표적 세포의 표면 상에 동족 수용체를 결합한 후 표적 세포를 사멸시킬 수 있다.

종양 침윤 림프구 (TIL)는 또한 본원에 사용된 바와 같은 용어 "림프구"에 포함된다. TIL은 종양 내부와 주위의 환경 ("종양 미세환경")에 침투한 면역 세포이다. TIL은 전형적으로, 종양 세포 및 종양 미세환경으로부터 단리되며 종양 항원에 대항한 높은 반응성을 위해 시험관내에서 선택된다. TIL은 생체내에 존재하는 관용 영향력을 극복하는 조건 하에 시험관내에서 성장한 다음, 치료를 위해 대상체에게 도입된다.

T 세포는 전형적으로, 수많은 하위유형, 예컨대 "천연 T 세포" (Tn), "줄기 세포 기억 T 세포" (Tscm), "중심 기억 T 세포" (Tcm), "이펙터 기억 T 세포" (Tem), "이펙터 T 세포" (Teff) 및 "조절 T 세포" (Treg)로 존재한다. 각각의 T-세포 서브세트는 세포 표면 마커의 세트에 의해 특징규명된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "친화성 태그"는 전형적으로, 예를 들어, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 핵단백질 복합체의 형성을 촉진하기 위해 또 다른 거대 분자에 대한 하나의 거대 분자의 결합 친화성을 증가시키는 하나 이상의 모이어티를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 또 다른 Cas 서브유닛 단백질에 대한 하나의 Cas 서브유닛 단백질 (예를 들어, 제2 Cas7 단백질에 대한 제1 Cas7 단백질)의 결합 친화성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 동족 가이드 폴리뉴클레오티드에 대한 하나 이상의 Cas 서브유닛 단백질의 결합 친화성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태는 하나 이상의 친화성 태그를 Cas 서브유닛 단백질 서열의 N-말단, Cas 서브유닛 단백질 서열의 C-말단, Cas 서브유닛 단백질 서열의 N-말단과 C-말단 사이에 위치한 위치, 또는 그의 조합에 도입한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 Cas 서브유닛 단백질과 가이드 폴리뉴클레오티드의 결합 친화성을 증가시키는 친화성 태그를 포함한다. 광범위한 친화성 태그가 2014년 10월 23일에 공개된 미국 공개 특허 출원 번호 2014-0315985에 개시되어 있다. 리간드 및 리간드 결합 모이어티는 쌍형성된 친화성 태그이다.

본원에 사용된 바와 같은, "가교-결합"은 하나의 중합체 쇄 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)를 또 다른 쇄에 연결하는 결합이다. 이러한 결합은 공유 결합 또는 이온 결합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드를 가교 결합함으로써 또 다른 폴리뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드에 가교 결합될 수 있다. 부가 실시양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드에 가교 결합될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "가교-결합 모이어티"는 전형적으로, 2개의 거대 분자 사이에 가교 결합을 제공하기에 적합한 모이어티를 지칭한다. 가교-결합 모이어티는 친화성 태그의 또 다른 예이다.

본원에 사용된 바와 같은, "숙주 세포"는 일반적으로 생물학적 세포를 지칭한다. 세포는 유기체의 기본 구조적, 기능적 및/또는 생물학적 단위이다. 세포는 하나 이상의 세포를 가진 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 숙주 세포의 예는 원핵 세포, 진핵 세포, 박테리아 세포, 고세균 세포, 단일 세포 진핵 유기체의 세포, 진핵 유기체의 세포, 원생 동물 세포, 식물로부터의 세포, 조류 세포 (예를 들어, 보트리오코쿠스 브라우니이(Botryococcus braunii), 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii), 나노클로롭시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 사르가숨 파텐스 씨. 아가르드(Sargassum patens C. agardh) 등), 해초 (예를 들어, 다시마), 진균 세포 (예를 들어, 효모 세포, 또는 버섯으로부터의 세포), 동물 세포, 무척추동물 (예를 들어, 초파리, 자포 동물, 극피 동물, 선충류 등)로부터의 세포, 포유동물을 포함한 척추동물 (예를 들어, 돼지, 소, 염소, 양, 설치류, 래트, 마우스, 비-인간 영장류, 인간 등)로부터의 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 더욱이, 숙주 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포, 및 면역학적 세포, 예컨대 본원에 기재된 면역학적 세포 중 임의의 것일 수 있다. 숙주 세포는 인간 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 세포는 인체 외부에 있다. 일부 실시양태에서, 살아있는 유기체의 신체 (예를 들어, 인체) 세포는 생체외 (즉, 생체 외부에서) 조작된다. 생체외는 종종, 치료 또는 시술을 위해 생체 (예를 들어, 인체)로부터 기관, 세포 또는 조직을 채취한 다음, 이를 생체로 되돌리는 의료 시술을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, "줄기 세포"는 자기 재생 능력, 즉 미분화 상태를 유지하면서 세포 분열의 수많은 사이클을 통과할 수 있는 능력을 가진 세포를 지칭한다. 줄기 세포는 전능성, 만능, 다분화능, 과분화능, 또는 단분화능일 수 있다. 줄기 세포는 배아, 태아, 양수, 성체 또는 유도 만능 줄기 세포일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "유도 만능 줄기 세포"는 비-만능 세포, 전형적으로 체세포로부터 인공적으로 유래되는 만능 줄기 세포의 유형을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 체세포는 인간 체세포이다. 체세포의 예는 진피 섬유모세포, 골수 유래 중간엽 세포, 심장 근육 세포, 각질 세포, 간 세포, 위 세포, 신경 줄기 세포, 폐 세포, 신장 세포, 비장 세포 및 췌장 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 체세포의 부가의 예는 B 세포, 수지상 세포, 과립구, 선천성 림프계 세포, 거핵구, 단핵구/대식세포, 골수 유래 억제 세포, 자연 살해 (NK) 세포, T 세포, 흉선 세포 및 조혈 줄기 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 면역 체계의 세포를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, "조혈 줄기 세포"는 조혈 세포, 예컨대 림프구로 분화될 수 있는 능력을 가진 미분화 세포를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, "식물"은 전체 식물, 식물 기관, 식물 조직, 생식 질, 종자, 식물 세포 및 이들의 자손을 지칭한다. 식물 세포는 종자, 현탁 배양 물, 배아, 분열 조직, 캘러스 조직, 잎, 뿌리, 새싹, 배우자체, 포자체, 꽃가루 및 미세포자로부터의 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 식물 부분은 뿌리, 줄기, 새싹, 잎, 꽃가루, 종자, 종양 조직 및 다양한 형태의 세포 및 배양물 (예를 들어, 단일 세포, 원형질체, 배아 및 캘러스 조직)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 분화 및 미분화 조직을 포함한다. 식물 조직은 식물 또는 식물 기관, 조직 또는 세포 배양에 있을 수 있다. "식물 기관"은 식물의 형태학적으로 및 기능적으로 별개의 부분을 구성하는 식물 조직 또는 조직 군을 지칭한다.

용어 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 히말라야 원숭이, 침팬지, 및 다른 원숭이 및 유인원 종을 포함한 다른 영장류; 농장 동물, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 가축용 포유동물, 예컨대 개 및 고양이; 토끼, 마우스, 래트 및 기니 피그를 포함한 실험실 동물; 가축, 야생 및 사냥용 조류, 예컨대 닭, 칠면조 및 다른 순계류, 오리 및 거위를 포함한 조류 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 척색 동물 문의 임의의 구성원을 지칭한다. 상기 용어는 특별한 연령이나 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 상기 용어는 다 자란 개체, 어린 개체 및 신생 개체 뿐만 아니라 수컷과 암컷을 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 대상체로부터 유래된다 (예를 들어, 림프구, 줄기 세포, 전구 세포 또는 조직-특이적 세포). 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 (에이치. 사피엔스) 대상체이다.

조성물 또는 작용제, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 유전적으로 조작된 입양 세포의 "유효량" 또는 "치료상 유효량"이라는 용어는 원하는 반응을 제공하기 위한, 예컨대 동종이계 입양 세포 요법과 연관된 한 가지 이상의 유해한 부작용을 예방 또는 제거하기 위한 조성물 또는 작용제의 충분한 양을 지칭한다. 이러한 반응은 해당 특별한 질환에 좌우될 것이다. 예를 들어, 입양 세포 요법을 사용하여 암 치료를 받는 환자에서, 원하는 반응은 GvHD, 숙주 대 이식편 거부, 시토카인 방출 증후군 (CRS), 시토카인 폭풍의 효과의 치료 또는 예방, 및 투여된 유전적으로 변형된 세포의 발암성 형질전환의 감소를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 필요한 정확한 양은 대상체의 종, 연령 및 일반적인 상태, 치료되는 병태의 중증도, 및 사용되는 특별한 변형된 림프구, 투여 방식 등에 따라 대상체마다 다를 것이다. 임의의 개별 사례에서 적절한 "유효한" 양은 일상적인 실험을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.

특별한 질환, 예컨대 암성 병태 또는 GvHD를 "치료" 또는 "치료하는 것"은 (1) 질환을 예방하는 것, 예를 들어, 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환의 증상을 경험하거나 나타내지 않은 대상체에서 질환의 발생을 예방하거나 또는 질환이 더 적은 강도로 발생하도록 하는 것; (2) 질환을 억제하는 것, 예를 들어, 질환 상태의 발생 속도를 감소시키거나, 그의 발생을 저지하거나 또는 질환 상태를 반전시키는 것; 및/또는 (3) 질환의 증상 완화시키는 것, 예를 들어, 대상체가 경험하는 증상의 수를 감소시키는 것을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, "유전자 편집" 또는 "게놈 편집"은 세포 게놈 내의 특이적 부위에서의 유전적 변형, 예컨대 뉴클레오티드 서열 또는 심지어 단일 염기의 삽입, 결실 또는 대체를 초래하는 유전 공학의 한 유형을 의미한다. 상기 용어는 본원에 정의된 바와 같은, 이종 유전자 발현, 유전자 또는 프로모터 삽입 또는 결실, 핵산 돌연변이, 및 파괴적 유전적 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

"에피토프"는 특이적 B 세포 및 T 세포가 반응하는 분자 상의 부위를 의미한다. 에피토프는 이러한 에피토프에 고유한 공간적 입체 형태로 3개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일반적으로, 에피토프는 적어도 5개의 이러한 아미노산으로 이루어지며, 보다 통상적으로 적어도 8-10개의 이러한 아미노산으로 이루어진다. 아미노산의 공간적 입체 형태를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, x-선 결정학, 전자 현미경 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다. 더욱이, 주어진 단백질에서의 에피토프의 확인은 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여, 예컨대 소수성 연구의 사용에 의해 및 부위-지정 혈청학에 의해 쉽게 달성된다.

"미모토프"는 에피토프의 구조를 모방하는 거대 분자, 예컨대 펩티드이다. 이러한 특성 때문에, 이는 에피토프에 의해 유도된 것과 유사한 항체 반응을 일으킨다. 주어진 에피토프 항원에 대한 항체는 그 에피토프를 모방하는 미모토프를 인식할 것이다. 미모토프는 통상적으로, 바이오패닝을 통해 파지 디스플레이 라이브러리로부터 수득된다.

"항체"는 폴리펩티드에 존재하는 관심 에피토프, 예컨대 리간드 결합 도메인을 "인식"하는, 즉 이에 특이적으로 결합하는 분자를 의도한다. "특이적으로 결합한다"는 것은 항체가 "잠금 및 열쇠" 유형의 상호작용에서 에피토프와 상호작용하여 항원과 항체 사이에 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 모노클로날 제제로부터 수득된 항체 뿐만 아니라 하기를 포함한다: 혼성체 (키메라) 항체 분자; F(ab')2 및 F(ab) 단편; Fv 분자 (비-공유 이종이량체); 단일 쇄 Fv 분자 (scFv); 이량체성 및 삼량체성 항체 단편 구축물; 미니바디; 인간화 항체 분자; 단일 쇄 항체; 나노바디(Nanobody)® (아블링스 N.V. (Ablynx N.V.; 벨기에 즈위자르드)) 항체; 및 이러한 분자로부터 수득된 임의의 기능적 단편 (여기서 이러한 단편은 모 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 보유하고 있음). 항체는 상이한 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼, 낙타, 닭 등으로부터 공급될 수 있다. 이어서, 항체 및 항체 부분은 시험관내 기술에 의해, 예컨대 파지 디스플레이 및 효모 디스플레이에 의해 추가로 수득될 수 있다. 완전 인간화 항체는 조작된 인간화 B 세포 레퍼토리를 가진 인간 혈장, 인간 B 세포 클로닝, 마우스, 래트, 토끼, 닭 등으로부터 수득될 수 있다. 이어서, 항체는 친화성 성숙 및 다른 방법, 예컨대 아푸코실화 또는 IgG Fc 조작에 의해 추가로 변형될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "모노클로날 항체"는 동질적 항체 집단을 갖는 항체 조성물을 지칭한다. 이러한 용어는 항체의 종 또는 공급원과 관련하여 제한되지 않으며 그것이 만들어지는 방식에 의해서도 제한되지 않는다. 상기 용어는 전체 이뮤노글로불린 뿐만 아니라 모 모노클로날 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 나타내는 단편, 예컨대 Fab, F(ab')₂, Fv 및 다른 단편 뿐만 아니라 키메라 및 인간화 동질적 항체 집단을 포함한다.

"항체-의존성 세포성 세포독성"으로서 지칭되기도 하는 "항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)"은 막-표면 리간드 결합 도메인이 특이적 항체에 의해 결합되었을 때 면역 체계의 이펙터 세포가 표적 세포, 예컨대 입양 세포를 능동적으로 용해시키는 메카니즘을 지칭한다. 이펙터 세포는 전형적으로 자연 살해 (NK) 세포이다. 그러나, 대식 세포, 호중구, 및 호산구가 또한 ADCC를 매개할 수 있다. ADCC는 항체 또는 면역 체계 세포의 개입 없이 막을 손상시켜 표적을 또한 용해시키는 보체-의존성 세포독성 (CDC)과는 무관하다.

본원에 사용된 바와 같은, "형질전환"은 삽입에 사용된 방법에 관계없이 숙주 세포 내로의 외인성 폴리뉴클레오티드의 삽입을 지칭한다. 예를 들어, 형질전환은 직접 흡수, 형질감염, 감염 등에 의해 이루어질 수 있다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 비통합 벡터, 예를 들어, 에피솜으로서 유지될 수 있거나, 또는 또 다른 한편으론, 숙주 게놈에 통합될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "트랜스제닉 유기체"는 관련없는 유기체로부터의 DNA가 인공적으로 도입된 유전 물질을 함유하는 유기체를 지칭한다. 상기 용어는 트랜스제닉 유기체의 자손 (임의의 세대)을 포함하며, 단 이러한 자손이 유전적 변형을 가져야 한다. 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 유기체는 비-인간 트랜스제닉 유기체이다.

본원에 사용된 바와 같은, "단리된"은 인간 개입에 의해 그의 천연 환경과 별도로 존재하므로 자연의 산물이 아닌 분자 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)를 지칭할 수 있다. 폴리펩티드를 지칭할 때, 단리된 것은 표시된 분자가, 이러한 분자가 자연에서 발견되는 전체 유기체로부터 분리되고 별개라는 것 또는 동일한 유형의 다른 생물학적 거대 분자의 실질적인 부재 하에 존재한다는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드와 관련하여 용어 "단리된"은 자연에서 그와 정상적으로 연합되는 서열의 전체 또는 일부가 결여된 핵산 분자; 또는 자연에 존재하는 바와 같지만, 그와 연합하여 이종 서열을 갖는 서열; 또는 염색체로부터 해리된 분자이다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "정제된"은 바람직하게 동일한 분자의 적어도 75 중량%, 보다 바람직하게 적어도 85 중량%, 또한 보다 바람직하게 적어도 95 중량%, 및 가장 바람직하게 적어도 98 중량%가 존재하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은, "기질 채널"은 벌크 환경으로 먼저 확산되지 않고 하나의 효소 반응에서 또 다른 효소 반응으로 반응물을 직접 전달하는 것을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Wheeldon, I., et al., Nat. Chem. 8:299-309 (2016)] 참조). 이러한 효소 단계의 중간체는 벌크 용액과 평형을 이루지 못하여, 효소 프로세스에서 효율과 수율을 증가시킬 수 있다. 흔히, 자연적으로 발생하는 대사 과정에서의 효소는 제어된 응집체로의 공동-국재화 및 어셈블리의 수단을 진화시켜 왔다.

본원에 사용된 바와 같은, "기질 채널 요소"는 대사 경로의 구성성분을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 기질 채널 요소는 화학 반응을 촉매하는 효소이다.

본원에 사용된 바와 같은, "기질 채널 복합체"는 일부 수단을 통해 함께 공동-국재화되는 다수의 기질 채널 요소를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, "RNA 스캐폴드"는 펩티드가 결합을 위한 기질로서 사용할 수 있는 RNA 분자를 지칭한다.

본원에 제시된 데이터는 캐스케이드 구성성분과 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, 이량체화-의존성, 비-특이적 FokI 뉴클레아제 도메인; 예를 들어, 문헌 [Urnov, F.D., et al., Nature Reviews Genetics 11:636-646 (2010); Joung, J.K., et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14:49-55 (2013); Guilinger, J.P., et al., Nat. Biotechnol. 32:577-582 (2014); Tsai, S.Q., et al., Nat. Biotechnol. 32:569-576 (2014)] 참조) 사이의 융합이 인간 세포에서 유형 I 시스템을 사용하여 효율적인 프로그래밍가능한 RNA-가이드된 유전자 편집을 매개한다는 것을 명확하게 보여준다. 상기 데이터는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 시스템 (예를 들어, FokI-캐스케이드 구성성분 융합을 포함하는 것)이 무손상 리보핵단백질 (RNP) 복합체로서 직접적으로 형질감염되거나 또는 개별 플라스미드 코딩된 구성성분의 전달을 통해 세포에서 어셈블리될 수 있다는 것을 명확하게 보여준다. 본원에 제시된 바와 같이, 모든 CRISPR-연합된 (Cas) 유전자는 단일 폴리시스트론성 벡터 상으로 어셈블리되어, 단순화된 2 구성성분 Cas 단백질-가이드 RNA 발현 시스템을 산출하였다. 또한, 뉴클레아제 (예를 들어, FokI)/캐스케이드 구성성분 링커 서열의 길이/조성 설계 및 적절한 DNA 기하학의 제형 화 뿐만 아니라 선택적 캐스케이드 상동체 선택은 약 50% 이하의 편집 효율을 갖는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 복합체를 제공한다. DNA 표적화 동안 PAM 요구 사항 및 미스매치 감수성과 관련된 조작된 유형 I CRISPR-Cas 시스템 (예를 들어, FokI-캐스케이드 구성성분 융합 단백질을 포함하는 것)의 주요 특징이 결정되었다.

제1 측면에서, 본 발명은 캐스케이드 서브유닛 단백질 및 캐스케이드 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 캐스케이드 구성성분을 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 캐스케이드 유형 I-E 시스템으로부터 유래되는 캐스케이드 구성성분을 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 캐스케이드 단백질 및 캐스케이드 crRNA를 포함하는 예시적인 폴리뉴클레오티드 구축물이 실시예 1에 제시된다. 실시예 1, 표 15, 및 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 내지 서열식별번호: 20은 특이적으로 이. 콜라이 균주 K-12 MG1655로부터의 유형 I-E 캐스케이드의 5개의 서브유닛 단백질을 코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 DNA 서열 뿐만 아니라 이로써 생성되는 단백질 구성성분의 아미노산 서열을 제시한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 이. 콜라이 gDNA로부터 유래되었고, 이. 콜라이에서의 발현에 대해 특이적으로 코돈-최적화되고/거나 진핵 세포 (예를 들어, 인간 세포)에서의 발현에 대해 특이적으로 코돈-최적화되었다. 이러한 폴리뉴클레오티드가 전구체 crRNA로 전사되고 캐스케이드 RNA 엔도뉴클레아제에 의해 프로세싱될 때, 게놈 내의 상보적 DNA 서열을 표적화하는 가이드 RNA로서 기능하는 성숙한 crRNA가 생산된다. 최소 CRISPR 어레이는 crRNA의 가이드 부분을 나타내는 예시적인 스페이서 서열을 플랭킹하는 2개의 반복부 서열 (실시예 1에 제시된 CRISPR 어레이 서열에 밑줄이 그어져 있음)을 포함한다. 캐스케이드 엔도뉴클레아제에 의한 RNA 프로세싱은 가이드 서열을 플랭킹하는 5' 및 3' 단부 둘 다에 반복부 서열이 있는 crRNA를 생성한다. 본 명세서 및 실시예의 교시내용을 고려하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 선택된 표적 서열 (예를 들어, gDNA 내의)에 대한 캐스케이드 복합체의 결합을 표적화하는 적절한 스페이서 서열을 선택할 수 있다.

부가의 박테리아 또는 고세균 종으로부터의 캐스케이드 구성성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 본 명세서의 지침에 따르고, 한 예로서 이. 콜라이 균주 K-12 MG1655로부터의 캐스케이드 서브유닛 유전자의 상동체의 위치를 찾기 위해 생물 정보학 도구, 예컨대 BLAST 및 PSI-BLAST를 사용한 다음, 캐스케이드 유전자의 플랭킹 게놈 이웃을 검사하여 나머지 캐스케이드 서브유닛 단백질의 유전자의 위치를 찾고 확인함으로써 확인 및 설계될 수 있다 (예를 들어, 실시예 14A, 실시예 14B, 실시예 15A, 및 실시예 15B 참조). 캐스케이드 유전자는 보존된 오페론으로서 공동-발생하기 때문에, 이들은 전형적으로 동일한 유형 I 하위유형 내에서 일관된 순서로 배열되어, 추적 분석 및 실험을 위한 확인 및 선택을 용이하게 한다. 한 예로서, 부가의 유형 I-E 시스템은 Cas8 상동체의 위치를 찾고, 상동 캐스케이드 시험을 위한 유망한 박테리아 종을 확인한 다음, 이러한 상동 CRISPR-Cas 시스템으로부터의 캐스케이드의 다른 단백질 구성성분 및 Cas8을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 수득하거나 또는 설계함으로써 확인될 수 있다.

수많은 종으로부터의 캐스케이드의 서브유닛 단백질을 코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 DNA 서열 (표 3 및 표 4에 열거됨) (일부는 이. 콜라이 균주 K-12 MG1655로부터 유래된 것들과 상동인 캐스케이드 복합체를 가짐), 및 이로써 생성되는 단백질 구성성분의 아미노산 서열 뿐만 아니라 예시적인 최소 CRISPR 어레이가 서열식별번호: 22 내지 서열식별번호: 213으로서 제시된다 (표 3).

단백질에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 숙주 박테리움의 gDNA로부터 유래되었으며, 이. 콜라이에서의 발현을 위해 특이적으로 코돈-최적화되고/거나 진핵 세포 (예를 들어, 인간 세포)에서의 발현을 위해 특이적으로 코돈-최적화되었다. 상응하는 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 DNA 서열은 12가지 종으로부터 유래된 반복부 서열을 기반으로 하였으며, 가이드 RNA로서 기능하는 성숙한 crRNA를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 표 4에서, 최소 CRISPR 어레이는 crRNA의 가이드 부분을 나타내는 예시적인 "스페이서" 서열을 플랭킹하는 2개의 반복부 서열 (소문자, 밑줄)을 포함한다. 엔도뉴클레아제 캐스케이드 서브유닛에 의한 RNA 프로세싱은 가이드 서열을 플랭킹하는 5' 및 3' 단부 둘 다에 반복부 서열이 있는 crRNA를 생성한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 명세서의 지침에 따르고 각각의 하위유형을 대표하는 홀마크 시스템으로부터의 캐스케이드 유전자의 상동체의 위치를 찾기 위해 생물 정보학 도구, 예컨대 BLAST 및 PSI-BLAST를 사용함으로써 확인 및 설계될 수 있는, 유형 I-B, I-C, I-F, 및 I-F의 변이체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 유형 I 하위유형 내의, 부가의 박테리아 또는 고세균 종으로부터의 캐스케이드 구성성분을 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다 (예를 들어, 문헌 [Makarova, K.S., et al., Nat. Rev. Microbiol. 13:722-736 (2015); Koonin, E.V., et al., Curr. Opin. Microbiol. 37:67-78 (2017)] 참조). 바람직한 상동체를 확인한 후, 캐스케이드 유전자의 플랭킹 게놈 이웃을 검사하여, 본원에 개시된 바와 같이 나머지 캐스케이드 서브유닛 단백질의 유전자의 위치를 찾고 이를 확인할 수 있다. 한 예로서, 부가의 유형 I-F 시스템은 Cas8 상동체의 위치를 찾고 (부가의 유형 I-F 변이체 2 시스템은 Cas5 상동체의 위치를 찾음으로써 확인될 수 있음) 상동 캐스케이드 시험을 위한 유망한 박테리아 종을 확인한 다음, Cas8, Cas5, 및 이러한 상동 CRISPR-Cas 시스템으로부터의 캐스케이드의 다른 단백질 구성성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 수득하거나 설계함으로써 확인될 수 있다.

12개의 부가의 상동 캐스케이드 복합체로부터의 유형 I-B, I-C, I-F, 및 I-F 변이체 2로부터의 캐스케이드의 3개, 4개 또는 5개의 서브유닛 단백질을 코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 DNA 서열, 및 이로써 생성되는 단백질 구성성분의 아미노산 서열 뿐만 아니라 예시적인 최소 CRISPR 어레이가 서열식별번호: 214 내지 서열식별번호: 351로서 제시된다 (표 3). 서브유닛 단백질에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 숙주 박테리움의 gDNA로부터 유래되었으며, 이. 콜라이에서의 발현을 위해 특이적으로 코돈-최적화되고/거나 진핵 세포 (예를 들어, 인간 세포)에서의 발현을 위해 특이적으로 코돈-최적화되었다. 상응하는 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 DNA 서열은 12가지 종으로부터 유래된 반복부 서열을 기반으로 하였으며, 가이드 RNA로서 기능하는 성숙한 crRNA를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 표 5에서, 최소 CRISPR 어레이는 crRNA의 가이드 부분을 나타내는 예시적인 "스페이서" 서열을 플랭킹하는 2개의 반복부 서열 (소문자, 밑줄)을 포함한다. 엔도뉴클레아제 캐스케이드 서브유닛에 의한 RNA 프로세싱은 가이드 서열을 플랭킹하는 5' 및 3' 단부 둘 다에 반복부 서열이 있는 crRNA를 생성한다.

실시예 19A 내지 실시예 19I 및 실시예 22A 내지 실시예 22C는 각각의 캐스케이드 복합체에 대한 게놈 편집의 효율을 평가하기 위해, 각각 Cas 서브유닛 단백질-FokI 융합 단백질을 포함하는 다수의 캐스케이드 복합체 상동체의 설계 및 시험을 설명한다. 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 S-6-2로부터의 변이체를 사용하는 경우에 가장 높은 편집이 관찰되었지만, 다른 상동체 (즉, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 게오써모박터(Geothermobacter) 종 EPR-M, 메타노셀라 아르보리자에(Methanocella arvoryzae) MRE50, 및 에스. 써모필루스(S. thermophilus) (균주 ND07))는 이. 콜라이와 대략 등가의 편집을 나타내었다. 조작된 비브리오 콜레라(Vibrio cholera) 균주 L15 (유형 I-F) FokI-캐스케이드 복합체 및 비브리오 콜레라 균주 HE48 (유형 I-Fv2) FokI-캐스케이드 복합체를 사용한 경우에도 편집이 관찰되었다. 한 실시양태에서, 이들 상이한 상동체의 상이한 PAM 요건은 표적 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 세포 내의 gDNA)에서 표적 밀도를 증가시킬 수 있다. 따라서, 이러한 캐스케이드 복합체 상동체 컬렉션은 표적 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 세포 내의 gDNA)에서의 핵산 표적 서열의 선택에 더 큰 유연성을 제공한다.

제2 측면에서, 본 발명은 변형된 캐스케이드 서브유닛 단백질에 관한 것이다. 변형에 적합한 캐스케이드 서브유닛 단백질은 본원에 기재된 종의 캐스케이드 서브유닛 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

한 실시양태에서, 본 발명은 캐스케이드 서브유닛 단백질의 조작된 순환 순열에 관한 것이다. 이러한 캐스케이드 서브유닛 단백질의 순환 순열은 캐스케이드 서브유닛 단백질의 원래 선형 아미노산 서열의 상이한 연결성을 갖지만 전반적인 유사한 3차원 형태를 갖는 단백질 구조를 초래한다 (예를 들어, 문헌 [Bliven, S., et al., PLoS Comput. Biol. 8:e1002445 (2012)] 참조). 캐스케이드 서브유닛 단백질의 순환 순열은 많은 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, Cas7 서브유닛 단백질의 순환 순열은 Cas7 단백질 폴드 또는 캐스케이드 복합체 어셈블리를 방해하지 않고 융합 단백질 또는 링커 영역을 형성하기 위해 부가의 폴리펩티드 서열과의 연결을 위해 배치되도록 설계된 새로운 N-말단 및 새로운 C-말단을 창출할 수 있다. Cas7의 순환 순열 (순환적으로 순열된 Cas7, cpCas7)의 3가지 예가 도 3a 및 도 3b에 예시된다. 도 3a 및 도 3b에서, 단백질의 세 부분이 표시된다: 천연 단백질의 N-말단 부분 (도 3a, 수직 줄무늬, 예를 들어 Cas7 단백질), 천연 단백질의 중앙 부분 (도 3a, 회색 음영), 및 천연 단백질의 C-말단 부분 (도 3a, 음영 없음). 도 3a는 천연 단백질의 N-말단 부분을 천연 단백질의 C-말단 위치로 재배치하여 순환적으로 순열된 단백질 (도 3a, cpCas7)을 생산하며, 여기서 천연 단백질의 N-말단 부분은 이제 cpCas7의 N-말단 단부에 있고, 링커 폴리펩티드 (도 3a, 링커)에 의해 천연 단백질의 중앙 부분에 연결된다. 도 3b는 천연 단백질의 C-말단 부분 (도 3b, Cas7)의 천연 단백질의 N-말단 위치 (도 3b, cpCas7)로의 재배치를 예시하며, 여기서 천연 단백질의 C-말단 부분이 이제 cpCas7의 N-말단 단부에 있고, 링커 폴리펩티드 (도 3b, 링커)에 의해 천연 단백질의 중앙 부분에 연결된다.

실시예 10A, 실시예 10B, 및 실시예 10에 제시된 데이터는 순환적으로 순열된 Cas7 서브유닛 단백질 변이체를 포함하는 캐스케이드 복합체의 정제가, 야생형 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체와 본질적으로 동일한 조성 (분자량에 기반함)을 갖는 캐스케이드 복합체를 형성하기 위해 순환적으로 순열된 유형 I-E CRISPR-Cas 서브유닛 단백질이 성공적으로 사용될 수 있다는 것을 명확하게 보여준다는 것을 나타낸다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 융합 단백질 뿐만 아니라 이러한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 창출하기 위해 부가의 폴리펩티드 서열과 융합된 캐스케이드 서브유닛 단백질에 관한 것이다. 부가의 폴리펩티드 서열은 단백질, 단백질 도메인, 단백질 단편, 및 기능적 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 부가의 폴리펩티드 서열의 예는 전사 활성화제 또는 저해인자 도메인, 및 뉴클레오티드 데아미나제 (예를 들어, 문헌 [Komor, et al., Nature 553:420-424 (2016); Koblan, et al., Nat. Biotechnol. doi: 10.1038/nbt.4172 (May 29, 2018)]에 기재된 바와 같은 시티딘 데아미나제 또는 아데닌 데아미나제)로부터 유래된 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 융합 단백질에 대한 부가의 기능적 도메인이 본원에 제시된다.

부가의 폴리펩티드 서열은 캐스케이드 서브유닛 단백질 중 임의의 것과 융합될 수 있으며, 여기서 부가의 폴리펩티드 서열은 전형적으로 캐스케이드 서브유닛 단백질의 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 5' 또는 3' 단부에 첨부되는 부가의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 링커를 코딩하는 부가의 폴리뉴클레오티드 서열은 캐스케이드 서브유닛 단백질을 부가의 관심 폴리펩티드 서열에 연결시켜 준다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질 파트너에 대한 폴리뉴클레오티드 서열 및 링커 서열은 자연적으로 발생하는 gDNA 서열로부터 유래될 수 있거나 또는 이. 콜라이에서의 박테리아 발현 또는 포유동물 세포 (예를 들어, 인간 세포)에서의 진핵 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 친화성 태그 (예를 들어, His6, 스트렙-태그(Strep-tag)® II (IBA GMBH LLC; 독일 괴팅겐)), 핵 국재화 시그널 또는 서열 (NLS), 말토스 결합 단백질, 및 FokI를 포함하는 융합 단백질의 예가 실시예 1에 제시된다. 예시적인 아미노산 링커 서열이 또한 실시예 1에 개시된다.

실시예 11A은 캐스케이드 서브유닛 단백질-FokI 융합 뿐만 아니라 시티딘 데아미나제, 엔도뉴클레아제, 제한 효소, 뉴클레아제/헬리카제, 또는 그의 도메인과의 캐스케이드 서브유닛 단백질 융합을 설명한다. 실시예 11B는 다른 캐스케이드 서브유닛 단백질과의 캐스케이드 서브유닛 단백질 융합 뿐만 아니라 다른 캐스케이드 서브유닛 융합 단백질 및 효소 단백질 도메인과의 캐스케이드 서브유닛 단백질 융합 (실시예 11D)을 설명한다. 일부 실시양태에서, 유형 I CRISPR 서브유닛 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 사이의 위치에서 단백질 융합물을 생성하는데 사용될 수 있는 능력에 관하여 인 실리코 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유형 I CRISPR 서브유닛 단백질은 하나 이상의 폴리펩티드 링커를 사용하여 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 사이의 위치에서 하나 이상의 융합 도메인에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 캐스케이드 서브유닛 단백질은 단일 쇄 FokI와 융합될 수 있다 (예를 들어, Eco캐스케이드 RNP 복합체와의 단일 쇄 FokI 융합; 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 1926; 단백질 서열, 서열식별번호: 1927). 예시적인 폴리펩티드 링커가 실시예 1, 11, 18, 및 19에 제시된다.

도 4a 및 도 4b는 부가의 단백질 서열 (예를 들어, FokI)과 융합된 Cas8 서브유닛 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체를 예시한다 (도 4a, 도 4b, Cas7, Cas5, Cas8, Cse2, Cas6, Cas6 주위의 파선 박스는 crRNA 헤어핀과의 상호작용을 나타내고; cRNA는 이러한 헤어핀을 포함하는 흑색 선으로서 예시되며; Cas8, "C" C-말단, "N" N-말단이 표시됨). 도 4a는 링커 폴리펩티드 (도 4a, 흑색 곡선)를 사용하여 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단과 연결된 부가의 단백질 서열 (도 4a, FP)의 예를 제시한다. 도 4b는 링커 폴리펩티드 (도 4b, 흑색 곡선)를 사용하여 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단과 연결된 부가의 단백질 서열 (도 4b, FP)의 예를 제시한다. 실시예 11A는 FokI 뉴클레아제 도메인과 N-말단적으로 융합된 유형 I-E Cas8의 인 실리코 설계, 클로닝, 발현 및 정제를 설명한다.

도 5a 및 도 5b는 부가의 단백질 서열과 융합된 캐스케이드 서브유닛 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체의 부가의 예를 예시한다. 도 5a 및 도 5b에서, cRNA는 헤어핀을 포함하는 흑색 선으로서 예시되고 캐스케이드 복합체의 Cas 단백질의 상대적 위치가 제시되어 있다 (도 5a, 도 5b: Cas7, Cas5, Cas8, Cse2, Cas6; Cas6 주위의 파선 박스는 crRNA 헤어핀과의 상호작용을 나타냄). 도 5a는 각각 링커 폴리펩티드 (도 5a, 흑색 곡선)를 통해 6개의 Cas7 서브유닛 단백질 각각과 융합된 검출가능한 모이어티 (예를 들어, 녹색 형광 단백질; 도 5a, GFP)의 예를 제시한다. 이러한 캐스케이드 복합체는 캐스케이드 복합체와 연합된 다수의 검출가능한 모이어티의 존재의 결과로서 상당한 시그널 증폭을 제공함으로써 핵산 표적 서열에 대한 복합체의 결합의 검출에 유용할 수 있다. 도 5b는 링커 폴리펩티드 (도 5b, 흑색 곡선)를 사용하여 Cas6 서브유닛 단백질과 연결된 부가의 단백질 서열 (도 5b, FP)의 예를 제시한다.

이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 서브유닛 단백질을 함유하는 융합 단백질의 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 동일한 서브유닛 (예를 들어, Cse2_링커_Cse2), 순환적으로 순열된 서브유닛 (예를 들어, cpCas7_링커_cpCas7_링커_ cpCas7_링커_cpCas7_링커_cpCas7_링커_cpCas7), 뉴클레아제와 융합된 유형 I-E 캐스케이드 단백질 (예를 들어, FokI_링커_Cas8, Cas3_링커_Cas8, Cas6_링커_FokI, S1뉴클레아제_링커_Cse2_링커_Cse2), 시티딘 데아미나제와 융합된 유형 I-E 캐스케이드 단백질 (예를 들어, Cas8_링커_AID, Cse2_링커_Cse2_링커_APOBEC3G), 및 하나 이상의 다른 유형 I-E 캐스케이드 단백질과 융합된 유형 I-E 캐스케이드 단백질 (예를 들어, Cas6_링커_cpCas7_링커_cpCas7_링커_cpCas7_링커_cpCas7_링커_cpCas7_링커_cpCas7, cpCas7_링커_cpCas7_링커_cpCas7_링커_cpCas7_링커_cpCas7_링커_cpCas7_링커_Cas5, Cas6_링커_cpCas7_링커_cpCas7_링커_cpCas7_링커_cpCas7_링커_cpCas7_링커_cpCas7_링커_Cas5).

도 6a, 도 6b, 및 도 6c는 cpCas7을 함유하는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 예시를 제시한다. 도 6a, 도 6b, 및 도 6c에서, "cpCas7"은 순환적으로 순열된 Cas7 단백질 (도 6a, 도 6b, 도 6c: cpCas7, Cas5, Cas8, Cse2, 및 Cas6; Cas6 주위의 파선 박스는 crRNA 헤어핀과의 상호작용을 나타내고; cRNA는 헤어핀을 포함하는 흑색 선으로서 예시되며; cpCas7의 경우에, 음영은 도 3a에 예시된 순환적으로 순열된 단백질에 상응함)이고, 캐스케이드 복합체의 Cas 단백질의 상대적 위치가 제시된다. 도 6a는 6개의 개별 cpCas7 서브유닛 단백질 (도 6a, cpCas7)을 포함하는 캐스케이드 복합체를 제시한다. 도 6b는 6개의 융합된 cpCas7 서브유닛 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체를 제시하며, 여기서 cpCas7 서브유닛 단백질 (도 6b, cpCas7)의 C-말단은 링커 폴리펩티드 (도 6b, 링커 폴리펩티드는 cpCas7 서브유닛 단백질을 연결하는 진한 흑색 선으로서 예시됨)를 사용하여 인접한 cpCas7 서브유닛 단백질의 N-말단과 연결된다. 도 6c는 캐스케이드 복합체가 6개의 융합된 cpCas7 서브유닛 단백질 ("백본")을 포함하는 실시양태를 제시하며, 여기서 제1 cpCas7 서브유닛 단백질의 C-말단은 링커 폴리펩티드 (도 6c, 링커 폴리펩티드는 cpCas7 서브유닛 단백질을 연결하는 진한 흑색 선으로서 예시됨)를 사용하여 제2 cpCas7 서브유닛 단백질의 N-말단과 연결되고, 제2 cpCas7 서브유닛 단백질의 C-말단은 링커 폴리펩티드 (도 6c, cpCas7과 FP를 연결하는 직선 흑색 선)를 사용하여 상이한 단백질 서열 (도 6c, FP) (예를 들어, 시티딘 데아미나제)의 N-말단과 연결되며, 이러한 단백질 코딩 서열의 C-말단은 링커 폴리펩티드를 사용하여 제3 cpCas7의 N-말단과 연결된다. cpCas7 서브유닛 단백질의 이러한 융합된 백본의 한 가지 이점은 백본을 따라 특이적 위치에 부가의 단백질 서열이 도입되어, 가이드가 캐스케이드 복합체의 결합을 지정하는 핵산 표적 서열의 길이를 따라 상이한 위치에 부가의 단백질 서열이 접근할 수 있다는 것이다.

도 7a 및 도 7b는 융합 단백질을 포함하는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 추가 실시양태를 예시한다. 도 7a 및 도 7b에서, 캐스케이드 복합체의 Cas 단백질의 상대적 위치가 제시된다 (도 7a, 도 7b: Cas7, Cas5, Cas8, Cse2, 및 Cas6; Cas6 주위의 파선 박스는 crRNA 헤어핀과의 상호작용을 나타내고; cRNA는 헤어핀을 포함하는 흑색 선으로서 예시됨). 도 7a는 Cse2-Cse2 융합 단백질 (도 7a, 흑색 곡선에 의해 연결된 2개의 Cse2 단백질)을 포함하는 캐스케이드 복합체를 제시한다. 인 실리코 설계, 클로닝, 발현, 정제, 및 전기영동 이동성 시프트 검정이 Cse2-Cse2 융합 단백질을 포함하는 실시예 11B 및 실시예 11C 캐스케이드 복합체에서 기재된다. 도 7b는 링커 폴리펩티드 (도 7b, Cse2 단백질을 FP에 연결하는 흑색 곡선)를 통해 부가의 단백질 서열 (도 7b, FP)과 연결된 Cse2-Cse2 융합 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체를 제시한다. 실시예 11D는 시티딘 데아미나제와 융합된 Cse2-Cse2 단백질의 인 실리코 설계, 클로닝, 발현, 및 정제를 설명한다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵 국재화 시그널이 캐스케이드 단백질 서브유닛 (예를 들어, Cas8-FokI 융합 단백질, cpCas7 단백질, 또는 Cse2-Cse2 융합 단백질)의 조작된 N-말단 또는 C-말단에서 부가될 수 있다.

융합 폴리펩티드의 일부 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 2개 이상의 단백질 코딩 서열을 연결한다. 예시적인 링커 폴리펩티드의 길이는 본 실시예에 기재되어 있다. 전형적으로, 링커 길이는 약 10개 아미노산 내지 약 40개 아미노산, 약 15개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 및 약 17개 아미노산 내지 약 20개 아미노산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 링커 폴리펩티드의 아미노산 조성은 전형적으로, 극성, 소형 및/또는 하전된 아미노산 (예를 들어, Gly, Ala, Leu, Val, Gln, Ser, Thr, Pro, Glu, Asp, Lys, Arg, His, Asn, Cys, Tyr)을 포함한다. 부가 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 메티오닌을 함유하지 않도록 설계되고, 융합은 잠재적 번역 개시 부위를 피하도록 설계된다. 본 명세서의 지침에 따라, 링커 폴리펩티드는 융합 단백질 내에서 기능적 도메인 및 캐스케이드 단백질의 적절한 간격 및 위치를 제공하도록 설계된다 (예를 들어, 문헌 [Chichili, C., et al., Protein Science 22:153-167 (2013); Chen, X., et al., 65:1357-1369 (2013); George, R., et al., Protein Engineering, Design and Selection 15:871-879 (2002)] 참조). 본 발명의 실시에 유용한 링커 폴리펩티드의 부가의 예는 캐스케이드 시스템을 포함하는 유기체에서 캐스케이드 단백질의 코딩 서열을 서로 연결하는 것으로 확인된 링커 폴리펩티드이다 (예를 들어, 문헌 [Westra, E.R., et al., Mol, Cell. 46: 595-605 (2012)]에 기재된 바와 같이 스트렙토미세스 그리세우스(Streptomyces griseus)에서 Cas8을 Cas3에 연결하는 링커 폴리펩티드).

융합 단백질 코딩 DNA 서열은 선택된 유기체, 예컨대 박테리아, 고세균, 식물, 진균 또는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 코돈-최적화 프로그램은 예컨대 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies) 웹사이트 (www.idtdna.com/CodonOpt) 상에서, 또는 젠스크립트(Genscript)® (젠스크립트; 미국 뉴저지주 피스카타웨이) 서비스를 통해 널리 이용가능하다. 수용자 발현 벡터로의 클로닝을 용이하게 하기 위해, SLIC 클로닝에 적합한 벡터와 중복되는 부가의 서열 (예를 들어, 문헌 [Li, M., et al., Methods Mol. Biol. 852:51-59 (2012)] 참조)이 DNA 서열의 5' 및 3' 단부에 첨부될 수 있다.

다른 실시양태에서, 캐스케이드 서브유닛 단백질은 전사 활성화 및/또는 저해 도메인과 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 활성화제 도메인 (예를 들어, 열 충격 전사 인자, NFKB 활성화제, VP16, 및 VP64 (예를 들어, 문헌 [Eguchi, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113:E8257-E8266 (2016); Perez-Pinera, P. et al., Nature Methods 10:973-6 (2013); Gilbert, L.A., et al. Cell 159:647-61 (2014)] 참조)) 또는 저해인자 도메인 (예를 들어, KRAB 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 핵산 서열은 단백질, 단백질 도메인, 또는 단백질 단편에 대한 2개 이상의 코딩 서열을 연결하기 위해 사용된다.

전사 활성화제와 융합된 유형 I CRISPR-Cas 서브유닛 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체를 사용하여 유전자의 발현을 활성화할 수 있다. 표적 로커스는 전형적으로 세포의 전사 활성화 기구 (인자)에 대한 하나 이상의 결합 부위를 정착시킨 전사 시작 부위 (TSS)를 함유할 수 있다. 도 8은 링커 폴리펩티드 (도 8, cpCas7을 VP64에 연결하는 흑색 곡선)를 통해 전사 활성화제 VP64에 연결된 cpCas7 (도 3a와 비교)을 포함하는 6개의 융합 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체를 예시한다. 도 8에서, crRNA는 헤어핀을 포함하는 진한 흑색 선으로서 예시되고, 캐스케이드 복합체의 Cas 단백질의 상대적 위치가 제시된다 (도 8: cpCas7, Cas5, Cas8, Cse2, 및 Cas6; Cas6 주위의 파선 박스는 crRNA 헤어핀과의 상호작용을 나타냄). 이러한 캐스케이드 복합체의 조작은 복합체를 유전자의 전사 활성화를 위한 가요성 도구 (캐스케이드a)로 전환시키며, 여기서 선택된 유전자를 표적화하는 것은, 캐스케이드 복합체가 선택된 유전자의 하나 이상의 조절 요소 (예를 들어, TSS)에 결합하는 것을 지시하는 가이드 서열의 선택에 의해 달성된다. 실시예 12는 캐스케이드 복합체에 전사 활성화 활성을 부여하기 위해 VP64 활성화 도메인과 융합된 이. 콜라이 유형 I-E cp-Cas7 단백질의 설계를 설명한다. 전사 활성화제는 호메오도메인 단백질, 징크-핑거 단백질, 날개형 나선 (포크헤드) 단백질, 류신-지퍼 단백질, 나선-루프-나선 단백질, 이종이량체성 전사 인자, 활성화 도메인, 및 인핸서에 결합하는 전사 인자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 문헌 [Molecular Cell Biology, Harvey Lodish, et al., W H Freeman & Co; (2002) ISBN 978-0849394805] 참조).

또한, 전사 저해인자와 융합된 유형 I CRISPR-Cas 서브유닛 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체를 사용하여 유전자의 발현을 저해할 수 있다. 표적 로커스는 전사 조절 요소를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 캐스케이드 서브유닛 단백질은 링커 폴리펩티드를 통해 KRAB 도메인에 연결될 수 있다. 캐스케이드 서브유닛 단백질/KRAB 도메인 융합을 포함하는 캐스케이드 복합체는 이러한 복합체를 유전자의 전사 저해를 위한 가요성 도구 (캐스케이드i)로 전환시킬 수 있으며, 여기서 선택된 유전자를 표적화하는 것은, 선택된 유전자의 하나 이상의 조절 요소에 대한 캐스케이드 복합체의 결합을 지시하는 가이드 서열의 선택에 의해 달성된다. 전사 저해인자는 수동 전사 저해인자, bzip 전사 인자 패밀리, sp1-유사 전사 저해인자, 능동 전사 저해인자 (예를 들어, 히스톤 데아세틸라제의 동원, 히스톤 탈아세틸화, 및 이중-특이적 저해인자를 통한 전사 저해)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 문헌 [Thiel, G., et al., Eur. J. Biochem. 271:2855-2862 (2004); Nicola Reynolds, N., et al., Development 140:505-512 (2013); Gaston, K., et al., Cell Mol. Life Sci., 60:721-741 (2003)] 참조).

부가 실시양태에서, 캐스케이드 서브유닛 단백질은 친화성 태그와 융합될 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 유형 I CRISPR-Cas 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 폴리뉴클레오티드 내의 선택된 위치에서 뉴클레오티드의 변화 또는 선택된 폴리뉴클레오티드 요소의 삽입에 의해 변형될 수 있다 (예를 들어, RNA 모이어티에 대한 DNA 모이어티의 기본적으로 상이한 변화 뿐만 아니라 가이드 폴리뉴클레오티드에 대해 상기 기재된 다른 변화). 이러한 실시양태는 하나 이상의 뉴클레오티드 이펙터 도메인 (예를 들어, MS2 또는 MS2-P65-HSF1 결합 RNA 또는 전사 인자를 동원하는 앱타머)과 5', 3' 또는 내부적으로 융합된 유형 I CRISPR-Cas 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 도 9는 유형 I CRISPR 가이드 폴리뉴클레오티드를 예시하고, 캐스케이드 복합체의 Cas 단백질의 상대적 위치가 제시된다 (도 9: Cas7, Cas5, Cas8, Cse2, 및 Cas6; Cas6 주위의 파선 박스는 crRNA 헤어핀과의 상호작용을 나타내고; cRNA는 파선 박스 내에 헤어핀을 포함하는 흑색 선으로서 예시됨). 도 9에서, crRNA는 추가로, 가이드 폴리뉴클레오티드의 3' 헤어핀 내로 도입된 RNA 앱타머 헤어핀 (도 9, 화살표로 표시된 위치)을 포함한다.

유형 I CRISPR-Cas 가이드의 길이는 또한, 전형적으로 Cas7 서브유닛 단백질 및 Cse2 서브유닛 단백질 결합 영역을 연장시키거나 단축시킴으로써 변형될 수 있다. 도 10a는 3개의 Cas7 서브유닛, 1개의 Cse2 서브유닛 및 단축된 crRNA가 있는 캐스케이드 복합체를 예시한다 (도 10a: Cas7, Cas5, Cas8, Cse2, 및 Cas6; Cas6 주위의 파선 박스는 crRNA 헤어핀과의 상호작용을 나타내고; cRNA는 헤어핀을 포함하는 흑색 선으로서 예시됨). 도 10b는 9개의 Cas7 서브유닛, 3개의 Cse2 서브유닛, 및 연장된 crRNA가 있는 캐스케이드 복합체를 예시한다 (도 10b: Cas7, Cas5, Cas8, Cse2, 및 Cas6; Cas6 주위의 파선 박스는 crRNA 헤어핀과의 상호작용을 나타내고; cRNA는 헤어핀을 포함하는 흑색 선으로서 예시됨).

실시예 16은 유형 I CRISPR-Cas 가이드 crRNA의 변형의 생성 및 시험, 및 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 구축하는데 사용하기 위한 상기 변형된 가이드의 적합성을 설명한다.

제3 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 조작된 캐스케이드 구성성분을 코딩하는 핵산 서열 뿐만 아니라 하나 이상의 조작된 캐스케이드 구성성분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트, 벡터, 및 재조합 세포에 관한 것이다. 본 발명의 제3 측면의 일부 실시양태는 선택된 캐스케이드 시스템 구성성분 모두 (예를 들어, Cse2, Cas5, Cas6, Cas7, 및 Cas8 단백질, 및 하나 이상의 동족 가이드)를 코딩하는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하여, 여기서 상기 구성성분은 이펙터 복합체를 형성할 수 있다. 전형적으로, 2개 이상의 동족 가이드가 발현될 때, 이러한 가이드는 상이한 핵산 표적 서열에의 결합을 지시하기 위해 상이한 스페이서 서열을 갖는다. 이러한 실시양태는 발현 카세트, 벡터 및 재조합 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 조작된 캐스케이드 구성성분을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 카세트에 관한 것이다. 발현 카세트는 전형적으로, 전사의 조절, 전사 후 조절, 또는 번역의 조절 중 하나 이상에 관여한 조절 서열을 포함한다. 발현 카세트는 박테리아 세포, 효모 세포, 식물 세포 및 포유동물 세포 (인간 세포 포함)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 광범위한 유기체 내로 도입될 수 있다. 발현 카세트는 전형적으로, 이들이 도입되는 유기체(들)에 상응하는 기능적 조절 서열을 포함한다.

본 발명의 추가 실시양태는 하나 이상의 조작된 캐스케이드 구성성분을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한 벡터에 관한 것이다. 벡터는 또한 선택가능한 또는 스크리닝가능한 마커를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 더욱이, 핵 표적화 서열은 또한, 예를 들어, 캐스케이드 서브유닛 단백질에 부가될 수 있다. 벡터는 또한 단백질 태그 (예를 들어, 폴리-His 태그, 혈구 응집소 태그, 형광 단백질 태그 및 생물 발광 태그)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 단백질 태그에 대한 코딩 서열은, 예를 들어, 캐스케이드 서브유닛 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열과 융합될 수 있다.

발현 벡터의 구축을 위한 일반적인 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 숙주 세포에 대한 발현 벡터는 상업적으로 이용가능하다. 세포 형질전환 및 유전자 발현 및 이러한 폴리뉴클레오티드의 클로닝을 쉽게 허용하는 방법에 적절한 벡터, 예컨대 곤충 세포 형질전환 및 곤충 세포에서의 유전자 발현을 위한 곤충 세포 벡터, 박테리아 형질전환 및 박테리아 세포에서의 유전자 발현을 위한 박테리아 플라스미드, 세포 형질전환 및 효모 및 다른 진균에서의 유전자 발현을 위한 효모 플라스미드, 포유동물 세포 형질전환 및 포유동물 세포 또는 포유류에서의 유전자 발현을 위한 포유동물 벡터, 및 바이러스 벡터 (렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스 I 또는 II, 파보바이러스, 세망 내피증 바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 선택 및 그의 구축을 용이하게 하기 위해 설계된 몇 가지 상업적 소프트웨어 제품이 있다.

AAV-기반 벡터 (rAAV)는 본 발명의 방법의 실시에 유용한 바이러스 벡터의 한 예이다. AAV는 파르보비리다에(Parvoviridae) 과의 단일-가닥 DNA 구성원이며 자연적으로 복제가 결핍된 바이러스이다. AAV 벡터는 유전자 요법에 가장 자주 사용되는 바이러스 벡터 중 하나이다. 12개 인간 혈청형의 AAV (AAV 혈청형 1 [AAV-1] 내지 AAV-12) 및 비-인간으로부터의 100개 초과의 혈청형이 공지되어 있다. 한 실시양태에서, AAV-6이 벡터로서 사용된다.

렌티바이러스 벡터는 본 발명의 방법의 실시에 유용한 바이러스 벡터의 또 다른 예이다. 렌티바이러스는 레트로비리다에(Retroviridae) 과의 구성원이며 단일-가닥 RNA 바이러스로, 분열 세포와 비-분열 세포 둘 다를 감염시킬 수 있을 뿐만 아니라 게놈 내로의 통합을 통해 안정적인 발현을 제공할 수 있다. 렌티바이러스 벡터의 안전성을 증가시키기 위해, 바이러스 벡터를 생산하는데 필요한 구성성분은 다수의 플라스미드에 걸쳐 분할된다. 전달 벡터는 전형적으로 복제 부적격하며, 부가적으로 3'LTR에 결실을 함유할 수 있으며, 이는 통합 후 바이러스가 자기 불활성화되도록 한다. 패키징 및 외피 플라스미드는 전형적으로, 전달 벡터와 조합하여 사용된다. 예를 들어, 패키징 플라스미드는 Gag, Pol, Rev 및 Tat 유전자의 조합을 코딩할 수 있다. 전달 플라스미드는 바이러스 LTR 및 psi 패키징 시그널을 포함할 수 있다. 외피 플라스미드는 통상적으로 외피 단백질 (그의 감염력 범위가 넓기 때문에, 통상적으로 수포성 구내염 바이러스 당단백질, VSV-GP)을 포함한다.

예시적인 식물 형질전환 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 Ti 플라스미드로부터 유래된 것들을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Lee, L.Y., et al., Plant Physiology 146:325-332 (2008)] 참조). 또한, 유용하고 관련 기술분야에 공지된 것은 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 플라스미드이다. 예를 들어, 스냅진(SNAPGENE)™ (GSL 바이오텍(Biotech) LLC; 미국 일리노이주 시카고; snapgene.com/resources/plasmid_files/your_time_is_valuable/)은 벡터, 개별 벡터 서열 및 벡터 맵의 광범위한 목록 뿐만 아니라 많은 벡터에 대한 상업적 공급원을 제공한다.

박테리아 발현 시스템에서 재조합 캐스케이드를 발현하고 정제하기 위해, 캐스케이드 서브유닛 단백질을 코딩하는 벡터 뿐만 아니라 관심 가이드 서열을 포함하는 최소 CRISPR 어레이를 설계할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 이러한 발현 시스템을 포함한다. 한 실시양태에서, 캐스케이드 복합체는 3개의 별개의 플라스미드 벡터에서 발현되며, 이는 하기 구성성분을 집합적으로 코딩한다: Cas8 단백질; Cse2, Cas7, Cas5 및 Cas6 단백질; 및 CRISPR RNA. 일부 실시양태에서, Cas8을 코딩하는 발현 플라스미드는 자연 gDNA 유전자 서열을 포함하고, 다른 실시양태에서, 발현 플라스미드는 선택된 세포 유형에서의 발현을 위해 코돈-최적화되는 Cas8을 코딩할 수 있다. 유사하게, Cse2, Cas7, Cas5, 및 Cas6을 코딩하는 발현 플라스미드는 자연 gDNA 유전자 서열을 함유할 수 있거나 또는 선택된 세포 유형에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 유전자 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 오페론을 코딩하는 전체 캐스케이드 서브유닛 단백질은 단일 전사 프로모터의 하류에 배치될 수 있어서, 상이한 단백질은 모두 단일 폴리시스트론성 전사체로부터 번역된다. 부가 실시양태에서, 캐스케이드 서브유닛 단백질을 코딩하는 유전자는 전사 종결인자 및 프로모터를 개재하여 서로 분리될 수 있다.

crRNA를 코딩하는 발현 플라스미드는 적절한 전사 프로모터의 하류에 있는 단일 스페이서 서열을 플랭킹하는 불과 2개의 반복부를 함유할 수 있거나, 또는 동일한 정확한 가이드 서열 또는 다수의 별개의 가이드 서열의 다수의 스페이서 서열을 플랭킹하는 많은 반복부를 함유할 수 있다. CRISPR 및 캐스케이드 서브유닛, 특히 Cas6 서브유닛의 협조적 발현은 긴 전구체 crRNA를 성숙한 길이의 crRNA로 프로세싱하며, 각각은 crRNA의 5' 및 3' 단부 상의 단일 반복부의 단편을 포함하고, 중간에 단일 스페이서 서열이 있다.

이. 콜라이에서 완전한 캐스케이드 복합체를 발현시키기 위한 대체 전략은 2개의 플라스미드를 사용하며; 하나는 단일 발현 플라스미드에서 전체 Cas8-Cse2-Cas7-Cas5-Cas6 오페론을 코딩하는 플라스미드이고, 다른 하나는 CRISPR RNA를 코딩하는 플라스미드이다. 이러한 경우에, 정상적으로 Cas8 유전자의 3' 단부부와 중복되는 Cse2 유전자의 5' 단부가 Cas8 유전자의 3' 단부로부터 공간적으로 분리되어, 친화성 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 프로테아제 인식 서열을 첨부시킨다.

실시예 2는 캐스케이드 단백질에 대한 2가지 유형의 박테리아 발현 플라스미드 시스템을 설명한다: 첫 번째 유형은 Cas8 단백질을 코딩하는 제1 플라스미드와 CasBCDE 복합체의 4개의 서브유닛 단백질 (cse2-cas7-cas5-cas6 오페론)을 코딩하는 제2 플라스미드인 2개의 플라스미드를 포함하고 ; 두 번째 유형은 캐스케이드 복합체의 모든 5개의 서브유닛 단백질 (cas8-cse2-cas7-cas5-cas6 오페론)을 코딩하는 발현 플라스미드를 포함한다. 동족 CRISPR 어레이가 또한 기재된다.

캐스케이드 복합체의 정제를 용이하게 하기 위해, 친화성 태그를 Cse2 서브유닛, 예컨대 N-말단 스트렙-II 태그 또는 헥사히스티딘 (His6) 태그 상으로 첨부할 수 있다. 더욱이, 프로테아제, 예컨대 TEV 프로테아제 또는 HRV3C 프로테아제에 의해 인식되는 아미노산 서열은 친화성 태그와 Cse2 서브유닛의 천연 N-말단 사이에 삽입될 수 있으므로, 초기 정제 후 프로테아제를 이용하여 서열을 생화학적으로 절단하면, 최종 재조합 캐스케이드 복합체로부터 친화성 태그가 유리된다. 친화성 태그는 또한, 다른 서브유닛 상에 배치될 수 있거나, 또는 Cse2 서브유닛에 남겨지고 다른 서브유닛 상의 부가의 친화성 태그와 조합될 수 있다. 친화성 태그를 포함하는 예시적인 캐스케이드 서브유닛 단백질은 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3A, 실시예 3B, 및 실시예 3C에 제시되어 있다.

유형 I-E 캐스케이드 시스템의 경우에, 이. 콜라이의 균주는 CRISPR RNA 뿐만 아니라 cse2-cas7-cas5-cas6 유전자를 코딩하는 플라스미드로 형질전환될 수 있으며, 단백질 발현이 유도되고, Cas8 서브유닛이 결여되는 캐스케이드 복합체가 생산될 수 있다. 이러한 캐스케이드 복합체는 전형적으로, Cas8-마이너스 캐스케이드 복합체, 또는 또 다른 한편으론 CasBCDE 복합체로서 지칭된다 (예를 들어, 문헌 [Jore, M., et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 18:529-536 (2011)] 참조). 이러한 정제된 복합체는 별도로 정제된 Cas8과 생화학적으로 조합되어 완전한 캐스케이드를 재구성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sashital, D.G., et al., Mol. Cell 46:606-615 (2012)] 참조).

표 6은 상이한 태그 및 설계를 함유하는, 최소 CRISPR 어레이, cas8, cse2-cas7-cas5-cas6 구축물, 및 cas8-cse2-cas7-cas5-cas6 구축물을 코딩하는 박테리아 발현 플라스미드의 예시적인 서열을 제시한다. 캐스케이드 복합체 및 상동 유형 I 시스템으로부터의 캐스케이드 복합체를 코딩하는 플라스미드는 본 명세서의 지침에 따라 이. 콜라이 K-12 MG1655에서 발견된 유형 I-E에 대한 예시적인 발현 플라스미드 서열과 유사하게 설계될 수 있다. 표 6은 부가적으로, 유전자 편집 실험을 위한 뉴클레아제-캐스케이드 융합을 생산하기 위하여, Cas8-Cse2-Cas7-Cas5-Cas6 단백질을 발현하는 발현 플라스미드의 서열 뿐만 아니라 cas8 유전자 또는 cas6 유전자 중 하나와의 FokI 융합물을 함유한다.

표 7은 단일 박테리아 발현 플라스미드로부터의 crRNA와 함께 5개의 모든 서브유닛 단백질을 코딩하는 단일 폴리프로모터 박테리아 발현 플라스미드의 서열을 함유한다. 이러한 설계에서, 각각의 유전자는 전사 프로모터 및 종결인자로 상류 및 하류를 플랭킹하는 다른 유전자로부터 분리된다. 유전자 편집을 위한 캐스케이드-뉴클레아제 융합을 생성하기 위해, 뉴클레아제 단백질과의 융합 뿐만 아니라 친화성 태그 및/또는 프로테아제 인식 태그를 코딩하는 부가의 서열이 도입될 수 있다.

부가의 박테리아 발현 플라스미드는 본원에서의 설계 기준에 기반하여 다른 유형 I 하위유형 및 다른 박테리아 또는 고세균 유기체로부터의 상동 캐스케이드 복합체를 코딩하도록 설계될 수 있다. 이러한 발현 플라스미드는 캐스케이드 유전자에 대한 gDNA 서열로 설계될 수 있거나, 또는 이. 콜라이 또는 다른 박테리아 균주에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 유전자 서열로 설계될 수 있다.

포유동물 세포, 예컨대 인간 세포에서 캐스케이드 또는 캐스케이드와의 이펙터 융합물을 발현하기 위해, 진핵 전사 및 번역 기구에 의해 관련 단백질 및 RNA 구성성분의 발현을 가능하게 하도록 진핵 발현 플라스미드 벡터를 설계하였다. 한 실시양태에서, 캐스케이드는 진핵 프로모터 (예를 들어, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터)에 의해 구동되는 별도의 발현 벡터 상에 각각의 단백질 구성성분을 코딩하고 RNA 폴리머라제 III 프로모터 (예를 들어, 인간 U6 프로모터)에 의해 구동되는 별도의 발현 벡터 상에 crRNA를 코딩함으로써 포유동물 세포에서 생성될 수 있다. CRISPR RNA는 성숙한 crRNA의 가이드 부분으로 기능하는 하나 이상의 스페이서 서열을 플랭킹하는 적어도 2개의 반복부를 함유하는 최소 CRISPR 어레이로 코딩될 수 있다. CRISPR RNA를 생성하는 구축물은 상기 최소 어레이에서 가장 바깥 쪽 반복부를 플랭킹하는 부가의 서열로 설계될 수 있다. 전구체 CRISPR RNA의 프로세싱은 별도의 플라스미드로부터 발현될 수 있는 캐스케이드 복합체의 RNA 프로세싱 서브유닛 (Cas6 서브유닛 단백질)에 의해 가능해진다.

표 8은 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 복합체의 각각의 단백질에 대한 개별 진핵 발현 플라스미드의 서열을 함유한다. Cas8 서브유닛은 부가의 이펙터 뉴클레아제 도메인, 예컨대 FokI 뉴클레아제와 융합될 수 있다 (실시예 1, 실시예 3A, 실시예 3B, 및 실시예 3C). 표 8은 또한, 2개의 별도의 crRNA를 코딩하는, 캐스케이드의 crRNA 구성성분에 대한 발현 플라스미드의 서열을 함유하며, 이에 따라 3개의 반복부 서열이 2개의 스페이서를 플랭킹한다. 단백질 코딩 유전자 각각은 핵 국재화 시그널 (NLS), 친화성 태그, 및 이들 태그를 연결하는 링커 서열을 첨부하는 폴리뉴클레오티드 서열에 첨부될 수 있다. 캐스케이드 서브유닛 단백질 중 임의의 것에 대한 다른 융합은, 부가의 관심 폴리펩티드 서열에 캐스케이드 서브유닛 단백질을 연결하는 아미노산 링커를 코딩하는 부가의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한, 전형적으로 5' 또는 3' 코딩 서열에 첨부되는 부가의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 후보 융합 단백질의 예가 본원에 기재되어 있다.

더 적은 수의 발현 벡터 상에 캐스케이드 복합체의 구성성분을 발현하기 위해, 폴리시스트론성 발현 벡터가 구축될 수 있으며, 이에 의해 단일 프로모터 (예를 들어, CMV 프로모터)가 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 2A 서열에 의해 분리되는 다중 코딩 서열의 발현을 동시에 구동시킨다. 2A 바이러스 펩티드 서열은 리보솜 스키핑을 유도하여, 다중 단백질 코딩 유전자가 진핵 세포에서의 발현을 위해 단일 폴리시스트론성 구축물 내에서 연결될 수 있도록 한다. 따라서, 단일 프로모터에 의해 구동되는 단일 전사체 상에서 캐스케이드 복합체의 4개 또는 5개의 단백질 서브유닛을 코딩하는 폴리시스트론성 벡터를 설계할 수 있다. 표 9는 포유동물 세포에서 기능적 캐스케이드를 생산하기 위해 CRISPR RNA 발현 플라스미드와 조합될 수 있는 진핵 폴리시스트론성 발현 플라스미드의 서열을 함유한다.

일부 실시양태에서, CRISPR RNA는 단백질 코딩 유전자의 3' 비번역 영역 (UTR) 내에서 코딩되며, 그의 발현은 RNA 폴리머라제 II 프로모터 (예를 들어, CMV 프로모터)에 의해 구동되어 전사체를 생산한다. 이러한 실시양태에서, 최소 CRISPR 어레이는 단백질 코딩 유전자, 예컨대 Cas6, Cas7 또는 리포터 유전자 (예를 들어, 증강된 녹색 형광 단백질, eGFP)의 하류에 존재하도록 설계되고, 이전에 상류 전사체에 안정성을 부여하는 것으로 나타났던 MALAT1 트리플렉스 서열에 의해 단백질 코딩 서열로부터 분리된다. 최소 CRISPR 어레이는 캐스케이드의 RNA 프로세싱 서브유닛 (전형적으로 상이한 플라스미드를 사용하여 발현됨), 최소 CRISPR 어레이를 절단하는 엔도뉴클레아제에 의해 프로세싱되고, 파손이 상기 전사체 내로 도입되고, 트리플렉스 서열은 상류 단백질 코딩 유전자의 3' 단부를 조기 엑소뉴클레아제성 분해로부터 보호한다. 표 10은 3개의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이에 따라 CRISPR 어레이는 Cas6, Cas7 또는 eGFP의 하류에 클로닝되고, 전체 융합 서열의 발현은 CMV 프로모터에 의해 구동된다.

일부 실시양태에서, CRISPR RNA 어레이는 5개의 캐스케이드 서브유닛 단백질의 발현을 구동하는 폴리시스트론성 구축물과 동일한 벡터 상에서 코딩되고; 이들 두 요소의 조합은 캐스케이드 서브유닛 중 하나와 융합된 임의의 뉴클레아제 또는 이펙터 도메인과 함께, 캐스케이드 복합체의 모든 기능적 서브유닛 (단백질과 RNA 둘 다)을 생산하는 올-인-원 벡터를 생성한다. 표 11은 포유동물 세포에서 기능적 FokI-캐스케이드 RNP를 생산하기 위해 각각의 구성성분 모두를 코딩하는 이들 올-인-원 폴리뉴클레오티드 서열 중의 2가지 대표적인 서열을 함유한다.

실시예 3A, 실시예 3B, 및 실시예 3C는 각각 캐스케이드 서브유닛 단백질 및 최소 CRISPR 어레이를 발현하는 별도의 플라스미드를 사용하는 발현 시스템, 다수의 캐스케이드 서브유닛 단백질 코딩 서열이 단일 프로모터로부터 발현되는 발현 시스템, 및 포유동물 세포에서 사용하기 위한 최소 CRISPR 어레이 및 전체 cas8-cse2-cas7-cas5-cas6 오페론을 발현하도록 단일 플라스미드 캐스케이드 발현 시스템을 구축한 발현 시스템을 설명한다.

본 명세서의 지침에 따라 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 복합체가 제공된 실시예와 유사하게 다른 캐스케이드 복합체를 코딩하는 부가의 포유동물 발현 벡터를 설계할 수 있다.

제4 측면에서, 본 발명은 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 하나 이상의 구성성분을 코딩하는 플라스미드를 숙주 세포 내로 도입함으로써 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 생산하는 것에 관한 것이다. 형질전환된 숙주 세포 (또는 재조합 세포), 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 형질전환되었거나 또는 형질감염된 세포의 자손은 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 하나 이상의 구성성분을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 발현 벡터)를 숙주 세포 내로 도입하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며 전형적으로, 숙주 세포의 종류에 기반하여 선택된다. 이러한 방법은, 예를 들어, 바이러스 또는 박테리오파지 감염, 형질감염, 접합, 전기천공, 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌이민-매개 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 원형질체 융합, 리포펙션, 리포솜-매개 형질감염, 입자 총 기술, 미세발사체 충격, 직접 미세주입 및 나노입자-매개 전달을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 구성성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 박테리아 세포 (예를 들어, 이. 콜라이) 내로 도입된다.

실시예 4A 및 실시예 4B는 Cas8 단백질 코딩 서열의 도입 및 발현을 위한 방법 뿐만 아니라 이. 콜라이 발현 시스템을 사용하여 이러한 복합체의 박테리아 생산을 위한 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 구성성분에 대한 코딩 서열을 설명한다.

본원에 개시된 다양한 예시적인 숙주 세포는 조작된 캐스케이드 이펙터 복합체를 사용하여 재조합 세포를 생산하는데 사용될 수 있다. 이러한 숙주 세포는 식물 세포, 효모 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포, 조류 세포 및 포유동물 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

논의의 용이성을 위해, "형질감염"은 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하는 임의의 방법을 지칭하기 위해 하기에 사용된다.

일부 실시양태에서, 숙주 세포는 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 하나 이상의 구성성분을 코딩하는 핵산 서열로 일시적으로 또는 비-일시적으로 형질감염된다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체에서 자연적으로 발생하기 때문에 형질감염된다. 일부 실시양태에서, 형질감염되는 세포는 먼저, 대상체로부터 제거되는데, 예를 들어, 1차 세포 또는 전구 세포이다. 일부 실시양태에서, 1차 세포 또는 전구 세포는 배양되고/거나 생체외 형질감염 후 동일한 대상체 또는 상이한 대상체에 복귀된다.

조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 발현 및 정제는 노동 집약적이므로, 많은 수의 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이펙터 복합체 변이체 전체에 걸친 스크리닝을 용이하게 하기 위해, 더 높은 처리량의 플라스미드-기반 전달 시스템이 설계되었다. 5개의 Cas 유전자 각각은 인간 코돈-최적화되었고 N-말단 NLS 융합으로서 CMV 구동 발현 플라스미드로 클로닝되었으며, T 세포 수용체 알파 로커스 (UCSC 게놈 브라우저, hg38))의 TRAJ27 엑손을 표적화하는 쌍형성된 gRNA를 함유하는 최소 CRISPR 어레이를, 인간 U6 프로모터의 제6 플라스미드 하류에 클로닝하였다 (실시예 3A; 도 35). 도 35에서, 좌측에서 우측으로 요소의 순서는 하기와 같다: hu6 프로모터, 다이아몬드 단부가 있는 회색 직사각형; 반복부 1, 열린 다이아몬드, (백색); 스페이서 1, 회색 와플 직사각형; 반복부 2, 회색 다이아몬드; 스페이서 2, 회색 점각 직사각형; 및 반복부 3, 흑색 다이아몬드. 도 35에서, 각 괄호는 2개의 gRNA를 코딩하는 영역을 예시한다. 일부 실시양태에서, 2개의 가이드 RNA는 동일할 수 있고 (예를 들어, 동일한 핵산 표적 서열을 표적화함), 다른 실시양태에서 2개의 가이드 RNA는 상이할 수 있다 (예를 들어, 2개의 상이한 핵산 표적 서열을 표적화함).

대부분의 유형 I 시스템에서의 gRNA 프로세싱은 캐스케이드에 존재하는 Cas6 리보뉴클레아제에 의해 자연적으로 촉매되어 (예를 들어, 문헌 [Brouns, S. J., et al., Science 321:960-964 (2008); Hochstrasser, M., et al., Trends Biochem. Sci. 40:58-66 (2015)] 참조), 본원에 제시된 쌍형성된 gRNA 접근법으로 다수의 프로모터에 대한 필요성을 배제시킨다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는 가이드 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, gRNA)의 발현을 제공하기 위해 조절 요소에 작동가능하게 연결된 쌍형성된 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 6-플라스미드 공동-형질감염은 TRAJ27 로커스에서 최대 ~3% 편집을 산출하였고, 이. 콜라이 캐스케이드 이펙터 복합체가 DNA 결합에 절대적으로 필요하지 않은 Cas11을 제외하고는, 어느 하나의 구성성분의 제거가 게놈 편집을 폐지하였다 (예를 들어, 문헌 [Westra, E., et al., RNA Biol. 9:1134-1138 (2012)] 참조).

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 전형적으로 2개의 가이드 서열을 포함하는 최소 CRISPR 어레이는 DNA 주형으로서 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입된다. DNA 주형은 PCR 증폭에 의해 생산된다 (예를 들어, 도 42a; 실시예 20A). 이러한 최소 CRISPR 어레이는 캐스케이드 복합체 단백질 구성성분을 코딩하는 하나 이상의 플라스미드를 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 쌍형성된 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 최소 CRISPR 어레이 및 벡터는 둘 다 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입될 수 있다. 2개의 캐스케이드 RNP 복합체를 사용하는 방법 (예를 들어, 핵산 표적 서열에 결합하는 방법 또는 핵산 표적 서열을 커팅하는 방법; 예를 들어, 도 15a, 도 15b, 도 15c 참조)에서, 최소 CRISPR 어레이는 2개의 상이한 가이드를 코딩할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서 2개의 가이드 RNA는 상이할 수 있다 (예를 들어, 2개의 상이한 핵산 표적 서열을 표적화함). 단일 캐스케이드 RNP 복합체를 사용하는 방법에서 (예를 들어, mCas3 단백질과 연합된 하나의 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체, 또는 Cas3 융합 단백질이 복합체와 연합되는 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 사용하는 경우; 예를 들어, 도 16a, 17b, 17c, 도 21a, 도 21b, 도 21c, 도 21d 참조), 최소 CRISPR 어레이는 동일한 가이드 서열의 2개의 카피를 코딩할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 2개의 가이드 RNA는 동일할 수 있다 (예를 들어, 동일한 핵산 표적 서열을 표적화함).

또한 또 다른 실시양태에서, 성숙한 가이드 RNA에 대한 crRNA 전구체의 엔도뉴클레아제성 프로세싱을 위해 Cas6 단백질에 의해 인식되는 서열 및 구조를 추가로 포함하는 가이드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입될 수 있다. 다른 실시양태에서, 프로세싱을 필요로 하지 않는 성숙한 가이드 폴리뉴클레오티드가 캐스케이드 복합체의 어셈블리에 사용될 수 있다. 이러한 성숙한 가이드는 서열 변형 (예를 들어, RNase에 의한 것과 같은 뉴클레아제 소화로부터 가이드를 보호하는데 도움을 주기 위한 5' 및/또는 3' 단부에서의 포스포로티오에이트 연결)를 포함할 수 있다. 부가의 가이드 변형은 뉴클레오티드 서열에 대해 본원에 기재된 것들을 포함한다 (예를 들어, 뉴클레오티드 유사체 등).

실시예 9A, 실시예 9B, 실시예 9C, 및 실시예 9D는 인간 세포에서 게놈 편집을 용이하게 하기 위해 FokI 융합 단백질을 포함하는 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 복합체의 설계 및 전달을 예시한다. 실시예 9B는 캐스케이드 복합체 구성성분을 발현하는 플라스미드 벡터를 진핵 세포로 전달하는 것을 설명한다. 제5 측면에서, 본 발명은 세포로부터 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 정제 및 이러한 복합체의 용도에 관한 것이다. 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 숙주 세포에서 생산된다. 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (이러한 경우에, 캐스케이드 RNP 복합체)는 세포 용해물로부터 정제된다.

실시예 5A 및 실시예 5B는 실시예 4B에 기재된 바와 같이 박테리아에서의 과다발현에 의해 생산된 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 RNP 복합체의 정제를 설명한다. 이러한 방법은 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용한다. 실시예 5A 및 실시예 5B는 정제된 캐스케이드 RNP 산물의 품질을 평가하는데 사용될 수 있는 방법을 설명한다. Cas8, Cas7, Cas6, Cas5 및 Cse2 캐스케이드 RNP 복합체, Cas7, Cas6, Cas5 및 Cse2 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체, 및 FokI-Cas8 융합 단백질의 정제를 예시하는 실시예가 제시된다.

정제되고 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 또한 생화학적 검정 (예를 들어, 결합 및/또는 절단 검정)에서 직접적으로 사용될 수 있다. 실시예 6A, 실시예 6B, 및 실시예 6C는 시험관내 DNA 결합 또는 절단 검정에 사용하기 위한 dsDNA 표적 서열의 생산을 설명한다. 실시예 6은 합성 ssDNA 올리고뉴클레오티드의 어닐링, gDNA로부터 선택된 핵산 표적 서열의 PCR 증폭 뿐만 아니라 박테리아 플라스미드로의 핵산 표적 서열의 클로닝을 포함한, 표적 서열을 생산하는 3가지 방법을 설명한다. dsDNA 표적 서열이 캐스케이드 결합 또는 절단 검정에 사용되었다.

하나 이상의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 부위-특이적 결합 및/또는 이에 의한 커팅은 필요한 경우에, 전기영동 이동성 시프트 검정 (예를 들어, 문헌 [Garner, M., et al., Nucleic Acids Res. 9:3047-3060 (1981); Fried, M., et al., Nucleic Acids Res. 9:6505-6525 (1981); Fried, M., Electrophoresis 10:366-376 (1989); Fillebeen, C., et al., J. Vis. Exp. (94), e52230, doi:10.3791/52230 (2014)] 참조), 또는 실시예 7에 기재된 생화학적 절단 검정을 사용하여 확증될 수 있다.

실시예 7에 제시된 데이터는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체가 슈퍼코일드 원형 플라스미드 기질을 절단된 선형 형태로 전환시킴으로써 입증된 바와 같이, 거의 정량적 DNA 절단을 나타낼 수 있음을 명확하게 보여준다. 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (예를 들어, FokI-캐스케이드 구성성분 융합 단백질을 포함함)로 강력한 생화학적 활성을 입증한 후, 세포에서 게놈 편집을 수행하였다.

실시예 8A, 실시예 8B, 실시예 8C, 및 실시예 8D는 Cas 서브유닛 단백질-FokI 융합 단백질을 포함하는 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 복합체의 설계 및 인간 세포로의 전달을 예시한다. 실시예 8D에서의 데이터는 미리 어셈블리된 캐스케이드 RNP의 표적 세포로의 전달과 인간 세포에서의 유효한 게놈 편집을 명확하게 보여준다.

정제되고 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 구성성분을 세포 내로 도입하는 방법은 전기천공, 리포펙션, 입자 총 기술 및 미세발사체 충격을 포함한다.

도 36a, 도 36b, 도 36c, 및 도 36d는 조작된 캐스케이드-RNP 복합체, 및 조작된 유형 I CRISPR-Cas 복합체의 플라스미드-기반 전달을 사용하여 인간 세포에서 게놈 편집을 위한 비교 데이터를 제공한다. 도 36a-d에서, 도 36a, HEK293 세포를 정제된 RNP로 형질감염시킨 다음, 편집된 부위의 차세대 시퀀싱 (NGS) 분석을 수행하였다. 도 36a (RNP 형질감염)에 제시된 바와 같이, 2개의 인접한 로커스를 표적화하는 FokI-캐스케이드 RNP 복합체 (도 36a, 직선 위 도면의 좌측에 나타냄)를 HEK293 세포 (도 36a, 도면의 좌측에 별 모양, 회색)로 뉴클레오펙션하여 DNA 절단 및 게놈 편집을 유도하였다. 16개의 고유한 게놈 표적 부위 (실시예 6C, 표 31, 인간 이중 Hsa1-16 참조)에서의 편집 효율을 계산하였다 (n=1). TRAC는 T 세포 수용체의 불변 영역이다. T 세포 수용체가 생성될 때, 이는 스플라이스 연접부 (즉, "가변" 영역 및 "연결" 영역)을 포함한다. 본원에 기재된 TRAC 가이드 중 일부는 연결 영역 (예를 들어, TRAJ27)을 표적화한다. 각각의 표적에 대한 인터스페이서 거리는 그래프 아래에 제시된다 (도 36a, 좌측에서 우측으로, 25, 30, 35, 40, 45 염기 쌍 (bp)). 도 36a에서, 수직축은 퍼센트 편집 효율 (도 36a, 편집 효율 (%))이고, 수평축은 표적 1 내지 16을 나타내고, 수평축 아래는 염기 쌍 (bp) 단위의 인터스페이서 길이를 나타내는 각 괄호이다.

도 36b는 도 36a에서의 표적 7에 대한 대표적인 DNA 복구 결과를 제공한다. 도 36b에서, 쌍형성된 gRNA에 의해 표적화된 절반-부위의 상대적 위치는, 그와 연합된 PAM 부위와 함께 도면의 상단에 제시된다. 인터스페이서 거리는 맨 윗줄에 예시된다. 본 그래프에서, 예상 절단 부위 (도 36b, 수직 흑색 중간 선으로 표시된 위치 "0") 및 bp 거리 (-50 내지 50)가 상단에 표시된다. 각각의 수평 회색 선은 표적화된 로커스에서 관찰된 상이한 클래스의 서열 판독값을 나타낸다. 이들 선에 대한 인디케이터는 하기와 같다: 회색 영역=서열 매치; 수평 흑색 선=결실; 및 열린 박스=삽입. 원은 각각의 선별로 그래프의 우측에 위치한다: 흑색 원은 야생형 판독값이고; 열린 백색 원은 돌연변이체 판독값이다. 예상되는 야생형 판독값은 제1 회색 막대 ("Ref"; 즉, 참조 서열)로 예시된다. 야생형 판독값은 제2 회색 막대 (제2 회색 막대; 도 36b, 흑색 원)로 예시된다. 그 다음 11개 선은 돌연변이체 판독값을 예시한다 (도 36b, 열린 원). 염기 쌍의 수로 주어진 삽입 길이는 원의 우측 열에 제시된다. 판독값의 총 퍼센트는 우측 다음 열에 제시되고, 총 판독값은 우측 마지막 열에 제시된다.

도 36c (6-플라스미드 형질감염 시스템)에 제시된 바와 같이, HEK293 세포 (도 36c, 도면의 좌측에 별 모양, 회색)를 6개의 플라스미드로 형질감염시키고, Cas 단백질을 코딩하는 5개의 플라스미드 (도 36c, FokI-Cas8, Cas11, Cas7, Cas5, 및 Cas6으로서 표시된 플라스미드) 및 쌍형성된 gRNA를 코딩하는 하나의 플라스미드를 CMV 및 인간 U6 (hU6) 프로모터의 제어 하에 둔 다음 (도 36c, gRNA), 편집된 부위의 NGS 분석을 수행하였다. FokI-캐스케이드 RNP 복합체가 파선 아래에 예시된다. 도 36a로부터의 표적 7에서의 편집 효율을 계산하고 (n=2) (도 36a, 그래프의 흑색 막대), 단일 구성성분 (도 36c, 수평축 아래, -/+를 함유하는 회색 박스)이 결여된 플라스미드 혼합물이 대조군으로서 포함되었다 (도 36c, 그래프 내의 열린 막대).

도 36d (2-플라스미드 형질감염 시스템)에 제시된 바와 같이, HEK293 세포 (도 36d, 도면의 좌측에 별 모양, 회색)를 쌍형성된 gRNA 발현 플라스미드 (도 36d, gRNA 플라스미드) 및 T2A "리보솜 스키핑" 서열 펩티드에 의해 분리된 5개 모든 단백질을 코딩하는 폴리시스트론성 발현 플라스미드 (도 36d, CMV-Cas7-2A-Cas11-2A-Cas5-2A-Cas6-2A-FokI-Cas8)로 형질감염시킨 다음, 편집된 부위의 NGS 분석을 수행하였다. FokI-캐스케이드 RNP 복합체가 파선 아래에 예시된다. 도 36a에 제시된 16개 표적에서의 편집 효율을 2-플라스미드 시스템 형질감염 (도 36d, 열린 막대)과 도 37c로부터의 6-플라스미드 시스템 형질감염 (n=3) (도 36d, 흑색 막대) 둘 다에 대해 계산하였다. 도 36d에서, 수직축은 퍼센트 편집 효율 ("편집 효율 (%))이고, 수평축은 표적 1 내지 16을 나타내며, 수평축 아래에는 염기 쌍 (bp)의 인터스페이서 길이를 표시하는 각 괄호가 있다 (도 36d, 좌측에서 우측으로, 25, 30, 35, 40, 45 bp).

실험은 FokI 및 Cas6 상의 핵 국재화 시그널 서열을 함유하는 정제된 캐스케이드-RNP로 HEK293 세포를 뉴클레오펙션함으로써 수행되었다. gDNA로부터 수득된 PCR 앰플리콘의 차세대 시퀀싱에 의해 입증된 바와 같이, 최대 ~4% 편집 효율이 관찰되었으며, 시험된 16개의 표적 부위 중에서 편집은 전형적으로, 30 bp 인터스페이서 길이를 함유하는 부위에서 이루어졌다 (도 36a). 복구 결과의 스펙트럼을 면밀히 조사한 결과, 유형 I CRISPR-Cas 복합체의 설계와 일치하는 인터스페이서의 중간에 indel이 군집되어 있는 것으로 밝혀졌다 (도 36b). 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 복합체는 세포 내로 직접 도입된다. 6-플라스미드 전달 실험 (도 36c)을 위해, 하나를 제외하고 각각의 플라스미드 420 ng를 함유하는 플라스미드 혼합물을 어셈블리한 다음, 음성 대조군으로서 물 또는 누락된 플라스미드 700 ng를 뉴클레오펙션 후에 다시 부가하였다. 초기 FokI-Eco캐스케이드 폴리시스트론성 2-플라스미드 전달 실험 (도 36d)을 위해, 세포를 각각의 플라스미드 500 ng 또는 쌍형성된 gRNA 발현 플라스미드 500 ng 및 폴리시스트론성 플라스미드 2.5 μg (각각의 조건에 대해 총 3 μg)으로 전기천공하였다. 한 실시양태에서, 5개의 cas 유전자 모두는 T2A "리보솜 스키핑" 서열에 의해 직렬로 연결된 단일 폴리시스트론성 발현 벡터 (도 36d)로 구축되었다 (예를 들어, 문헌 [Kim, J., et al., PLoS ONE 6, e18556 (2011); Liu, Z., et al., Sci. Rep. 7:2193 (2017)] 참조). 놀랍게도, 폴리시스트론성 플라스미드 및 쌍형성된 gRNA 발현 플라스미드를 사용한 공동-형질감염은 6-플라스미드 방법 (실시예 9A)과 직접 RNP 전달 방법 (실시예 8A, 실시예 8B, 실시예 8C, 실시예 8D) 둘 다를 이용한 경우에 관찰된 것들과 유사한 편집 효율 및 DNA 복구 결과를 초래하였으며, 이는 생화학적으로 활성인 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체가 어셈블리되고 인간 세포의 핵에 트래피킹된다는 결론을 뒷받침한다. 집합적으로, 이들 실험은 광범위하게 사용되는 Cas9 및 sgRNA 플라스미드와 크기가 유사한 단 2개의 분자 구성성분으로 진핵 세포에서 정교한 11-서브유닛 RNA-가이드된 뉴클레아제를 재구성하기 위한 매우 단순화된 발현 시스템을 검증하였다.

조작된 유형 I CRISPR-Cas 복합체 (이. 콜라이 (Eco캐스케이드, 슈도모나스 종 S-6-2 (Pse캐스케이드), 및 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) (Sth캐스케이드))에 대한 데이터는, 대부분의 표적 부위가 절반-부위 둘 다, 필수 인터스페이서 거리 및 허용 PAM를 포함해야만 하기 때문에 고유할 것임을 암시하였다. 보다 상세한 특징규명을 위해 Eco캐스케이드, Pse캐스케이드, 및 Sth캐스케이드로부터의 조작된 캐스케이드 상동체가 선택되었다.

도 37a, 도 37b, 도 37c, 및 도 37d는 FokI 링커, 인터스페이서 길이, 및 캐스케이드 상동체와 관련된 바와 같은 편집 효율을 예시한다. 도 37a에서, FokI-Eco캐스케이드 편집 효율은 FokI-Cas8 링커 길이 (도 37a, 열린 원, 낮은 선 10 aa; 열린 원 위쪽 그래프 선, 20 aa; 흑색 원, 17 aa; 및 회색 원, 30 aa 링커 길이) 및 인터스페이서 거리의 함수로서 제시된다. 도 37a에서, 수직축은 편집 효율 (%)이고, 수평축은 인터스페이서 거리 (bp)이다. 각각의 데이터 점은 3-4개의 고유한 표적 부위의 평균을 나타낸다.

도 37b는 30-aa 링커와 함께 FokI-캐스케이드 뉴클레아제를 제공한다. FokI-Cas8 링커는 12개의 유형 I-E 캐스케이드 변이체에 대해 생성되었으며 4-7개의 표적 부위에서 게놈 편집을 관하여 시험되었다. 각각의 데이터 점은 단일 게놈 부위를 나타내고, 막대는 부위 전체의 평균 및 표준 편차 (s.d.)를 표시한다. 표적은 AAG (도 37b, 회색 막대) 또는 GAA (도 37b, 백색 막대) PAM 서열 및 30 bp 인터스페이서 거리를 함유하였으며, 여기서 수평축 상에 있는 종은 하기와 같다: Eco, 이. 콜라이; Pse, 슈도모나스 종 S-6-2; Sen, 살모넬라 엔테리카; Geo, 게오써모박터 종 EPR-M; Mar, 메타노셀라 아르보리자에; Ahe, 아틀란티박터 헤르만니이(Atlantibacter hermannii); Oce, 오세아니콜라(Oceanicola) 종 HL-35; Pae, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa); Sth, 스트렙토코쿠스 써모필루스; Str, 스트렙토미세스(Streptomyces) 종 S4; Kpn, 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae); Lba, 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium).

도 37c에서, FokI-Pse캐스케이드 데이터가 제시되며, 여기서 수직축은 퍼센트 편집 효율 (도 37c, 편집 효율 (%))이고, 수평축은 염기 쌍 (bp)의 인터스페이서 길이를 나타낸다. FokI-Cas8 링커 길이는 17개 아미노산이다. 각각의 데이터 점은 단일 게놈 부위를 나타내고, 막대는 7-8개 부위 전체의 평균 및 s.d.를 나타낸다.

도 37d는 PAM 서열의 함수로서의 FokI-Pse캐스케이드 편집 효율에 대한 데이터를 제공하며, 수직축은 퍼센트 편집 효율 (도 37d, 편집 효율 (%))이고, 수평축은 PAM 서열 (도 37d, 좌측에서 우측으로, CCG, CGC, AAG, AAA, ATG, AAC, AGG, ATA, GAG, 및 AAT)에 상응한다. 게놈 부위는 수평축 상에 제시된 바와 같이, 하나의 AAG PAM 및 제2 절반-부위에서의 가변 PAM을 함유하였다. 각각의 데이터 점은 단일 게놈 부위를 나타내고, 막대는 6-15개 부위 전체의 평균 및 s.d.를 나타낸다.

도 37e는 PAM 서열의 함수로서의 FokI-Eco캐스케이드 편집 효율 (도 37e, 수직축, 편집 효율 (%))에 대한 데이터를 제공한다. 표적 부위는 수평축 상에 제시된 바와 같이, 고정된 AAG PAM 및 제2 절반-부위에서의 가변 PAM을 함유하였다 (도 37e, 좌측에서 우측으로, CCG, CGC, AAG, AGG, ATG, GAG, AAA, AAC, ATA, 및 AAT). 각각의 점은 HEK293 세포 내의 단일 표적 부위를 나타내고, PAM당 6-15개의 부위가 시험되었다 (부위당 n=1). 막대 그래프는 평균 및 s.d.를 표시한다.

도 37f는 PAM 서열의 함수로서의 FokI-Sth캐스케이드 효율 (도 37f, 수직축, 편집 효율 (%))에 대한 데이터를 제공한다. 표적 부위는 수평축 상에 제시된 바와 같이, 고정된 GAA PAM 및 제2 절반-부위에서의 가변 PAM을 함유하였다 (도 37f, 좌측에서 우측으로, CC, AA, GA, TA, 및 CA). 각각의 점은 HEK293 세포 내의 단일 표적 부위를 나타내고, PAM당 18-33개의 부위가 시험되었다 (부위당 n=1). 막대 그래프는 평균 및 s.d.를 표시한다.

도 37g는 도 37c 및 도 37d로부터의 높은 편집 효율 (10-53%)을 나타내는 40개 게놈 부위에 대한 indel 클래스 빈도를 도시하는 히트 맵을 제공한다. 0-60의 퍼센트 편집 효율이 상단 패널의 막대 그래프에 제시된다. 1-8 bp의 삽입 길이는 중간 패널에 제시된 히트 맵에 제시되고, 1-50 bp의 결실 길이는 하단 패널의 히트 맵에 제시된다. 40개의 게놈 표적 부위 (도 37g, 표적)는 수평축에 표시된다 (1-40). 단일 bp 삽입은 뉴클레오티드 동일성에 의해 분리되고, 도면 하단의 회색 스케일 강도 등급은 삽입 빈도 백분율 (도 37g, Ins Freq (%), 스케일은 0 내지 20 이상임) 및 결실 빈도 백분율 (도 37g, Del Freq (%), 스케일은 0 내지 20 이상임)에 상응한다. 우측으로의 막대 그래프는 각각의 indel 클래스의 평균 빈도 (도 37g, 스케일은 0 내지 20임)를 표시한다. 우측으로의 파이 차트는, 절단 부위에 인접한 서열의 중복을 함유하는 것으로서 정의된 추정상의 주형 복구로부터 비롯되는 2-4 bp 삽입 분획을 보여준다 (도 37g, 파이 차트의 흑색 영역). "다른" 것은 파이 차트의 회색 영역으로 나타낸다.

가장 고도로 편집된 5개의 FokI-Pse캐스케이드 표적 부위에 대해 인간 게놈에서의 가장 밀접하게 관련된 부위 (~20-48% 편집)를 조사했으며, 이는 30-33 bp 인터스페이서 요구 사항에 의해서만 제한되었다. 5개 모든 표적 전체에 걸쳐, 절반-부위 둘 다의 전체에서 <22 미스매치인 부위가 확인되지 않았다. FokI-Eco캐스케이드 FokI-Cas8 링커 유형 및 인터스페이서 거리 실험 (도 37a)을 위해, 세포를 2.4 μg의 FokI-Eco캐스케이드 폴리시스트론성 플라스미드 및 ~0.5-3.5 μg의 쌍형성된 gRNA 발현 플라스미드로 뉴클레오펙션하였다.

FokI-캐스케이드 상동체 스크린 (도 37b)을 위해, 세포를 1.5 μg의 FokI-캐스케이드 폴리시스트론성 플라스미드 및 ~0.4-2.2 μg의 쌍형성된 gRNA 발현 플라스미드로 뉴클레오펙션하였다. 상동체 전체에 걸쳐, 4-7개 부위를 표적화하였고, FokI-Eco캐스케이드와 높은 편집 효율을 나타낸 부위를 선택하였다. 상동체 변이체 FokI-Cas8 링커 유형 및 인터스페이서 거리 편집 실험 (도 37c 및 도 41a 내지 도 41c)을 위해, 세포를 5 μg의 폴리시스트론성 플라스미드 및 ~100-400 ng의 올리고-주형화 쌍형성된 gRNA 발현 앰플리콘으로 뉴클레오펙션하였다. 이러한 실험을 위해, gRNA 농도는 웰 또는 상동체 변이체 전체에 걸쳐 정규화되지 않았다. 부가적으로, 도 41a 내지 도 41c의 경우에는, 세포를 FokI-Eco캐스케이드 또는 FokI-Sth캐스케이드 gRNA보다 평균 ~1.5배 더 많은 FokI-Pse캐스케이드 gRNA로 뉴클레오펙션하였다.

올리고-주형화 PCR 증폭이 본원에 기재된다 (예를 들어, 실시예 20A). 포유동물 세포에서 인간 U6 (hU6) 프로모터 (도 42a, 420)로부터 쌍형성된 gRNA 발현을 위한 앰플리콘을 생성하기 위한 올리고-주형화 PCR 전략이 도 42a 및 도 42b에 예시되어 있다. 간략하게, 역 내부 올리고뉴클레오티드 (도 42a, 424)는 두 gRNA 서열을 코딩하고 새로운 표적 부위에 대해 변형되는 반면 ("반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부" 서열을 코딩하는 고유한 프라이머로서 지칭되기도 함) (도 42a, 421: 반복부, 열린 직사각형; 스페이서 1, 회색 직사각형; 반복부, 열린 직사각형; 스페이서 2, 회색 직사각형; 반복부, 열린 직사각형), 나머지 프라이머는 불변체이다 (도 42a: 정방향 외부 프라이머, 422; 정방향 내부 프라이머, 423; 역방향 외부 프라이머, 425). HEK293 세포를 FokI Eco캐스케이드 RNP 복합체를 코딩하는 폴리시스트론성 플라스미드 및 쌍형성된 gRNA 발현 플라스미드 또는 쌍형성된 gRNA 발현 앰플리콘으로 공동-형질감염시킨 후 표적 7 (도 36b 참조)에서의 편집 효율이 도 42b에 제시되어 있다. 도 42b에서, 수직축은 편집 효율 (%)이고 수평축은 쌍형성된 gRNA 카세트 (ng)이다. 데이터 점은 하기와 같다: 각각 FokI-Eco캐스케이드 RNP 복합체 (ng), 쌍형성된 gRNA 플라스미드, 쌍형성된 gRNA 앰플리콘; 375, 열린 삼각형, 열린 원; 750, 흑색 삼각형, 흑색 원; 1,500, 회색 삼각형, 회색 원; 3,000, 백색 줄이 있는 흑색 삼각형, 백색 줄이 있는 흑색 원. 도 42b에서의 데이터는 쌍형성된 gRNA 발현 플라스미드에 비해 쌍형성된 gRNA 발현 앰플리콘 대한 편집 효율이 더 높지 않다면, 거의 동등한 수준이라는 것을 명확하게 보여준다.

PAM 스크린 (도 37d, 도 37e, 도 37f, 도 39a 내지 도 39d, 도 40c 및 도 40f)을 위해, 전형적으로, 세포를 3 μg의 FokI-캐스케이드 폴리시스트론성 플라스미드 및 150 ng (FokI-Pse캐스케이드 및 FokI-Eco캐스케이드) 또는 ~80-120 ng (FokI-Sth캐스케이드)의 올리고-주형화 쌍형성된 gRNA 발현 앰플리콘 (달리 표시되지 않는 한)으로 뉴클레오펙션하였다.

특이성 분석 (도 38a 내지 도 38c)을 위해, 세포를 3 μg의 폴리시스트론성 캐스케이드 및 150 ng의 올리고-주형화 쌍형성된 gRNA 발현 앰플리콘으로 뉴클레오펙션하고, 뉴클레오펙션 후 5일에 수거하였다. 도 38a의 상단에서, 수평선은 인터스페이서 거리를 나타내고, 가위는 예상 커트 부위를 나타내며, 게놈 표적의 절반-부위는 그의 상응하는 PAM 영역과 함께 표시된다 (도 38a, 대조적인 단부가 있는 직사각형 박스). 예시된 절반-부위와 표적의 관계는 파선으로 표시된다. 각각의 표적에 대해 32개의 염기 쌍이 예시되고 PAM 영역은 시드 서열에 인접하게 표시된다. 도 38a는 그리드에서 채워진 박스 (PAM 부위 제외)로 표시된 바와 같이, 게놈 표적 내의 하나 또는 둘 다의 절반-부위에 대한 미스매치를 함유하도록 설계된 쌍형성된 gRNA를 제공한다. 단순화를 위해 절반-부위 둘 다가 동일한 방향으로 표시된다는 것에 주목해야 한다. 도 38b는 완벽하게 매칭하는 gRNA에 대한 편집 효율의 백분율로서 플로팅된 미스매치된 쌍형성된 gRNA의 각각의 조합에 대해 게놈 표적 70에서의 상대적 편집 효율을 제공한다. 도 38b에서, 상부 라인은 표적 (도 38b, 표적 70)을 표시하고, 다음 라인은 가이드 (도 38b, gRNA1 및 gRNA2)를 나타내며, 다음 라인은 미스매치된 세트 (도 38b, mm 세트 1 및 mm 세트 2)를 확인하고, 다음 라인은 FokI-캐스케이드 RNP 복합체를 예시한다. 좌측 열은 가이드 1-mm 세트 1/가이드 2-mm 세트 2의 상대적 편집 효율에 대한 데이터를 제시하고, 우측 열은 가이드 1-mm 세트 2/가이드 2-mm 세트 1의 상대적 편집 효율에 대한 데이터를 제시하며, 두 열의 데이터는 상대적 편집 효율 퍼센트 (도 38b 상대적 편집 효율 (%), 스케일 0-100)를 제시하는데, 즉 좌측 열은 미스매치된 (mm) 세트 1 및 2를 갖는 gRNA₁ 및 gRNA₂에 대한 데이터를 나타내고, 우측 열은 동일한 표적에 대한 데이터를 나타내지만 gRNA₁과 gRNA₂ 사이에 미스매치된 (mm) 세트를 교환하였다 (n=1). 도 38c는 도 38b에 표시된 바와 같이, 표적 73에서의 편집 효율을 제공한다 (n=1).

노동 집약적인 클로닝 단계의 필요성을 제거시킨, 올리고-주형화 PCR 증폭 (본원에 기재된 바와 같음)에 의해 쌍형성된 gRNA 발현 카세트를 생성하는 확장가능한 방법을 개발한 후, FokI 링커 및 DNA 인터스페이서 길이를 96개의 게놈 표적 부위 패널 전체에 걸쳐 각각의 상동체 변이체에 대하여 재스크리닝하였다. 17-aa 링커를 사용하여, FokI-Pse캐스케이드는 대략 30-33 bp 인터스페이서 창 내에서 평균적으로 ~15-25%의 편집 효율을 일관되게 산출했으며, 일부 표적은 ~40-50% 이하의 indel을 나타냈다 (도 37c). 다른 상동체에서도 유사한 경향이 관찰되었다. PAM 요구 사항은 하나의 동족 PAM과 제2 돌연변이된 PAM이 정착된 게놈 부위를 표적화함으로써 조사되었다. PAM 인식은 시험관내에서 엄격한 5'-GG-3' 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) (에스. 피오게네스(S. pyogenes)) PAM 요구 사항보다 훨씬 더 난잡한 것으로 나타났다 (예를 들어, 문헌 [Szczelkun, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:9798-9803 (2014); Hayes, R., et al., Nature 530:499-503 (2016); Westra, E., et al., Mol. Cell. 46:595-605 (2012); Fineran, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:E1629-E1638 (2014); Leenay, R., et al., Mol. Cell. 62:137-147 (2016)] 참조). 놀랍게도 시험관내 데이터는 많은 수의 PAM이 활성에 대해 실제로 허용되었다는 것을 입증해 주었으며, 명확한 순위 선호도가 최근에 만들어졌다 (도 37d; 도 39a 내지 도 39d). 대조적으로, 돌연변이된 PAM이 CRISPR 어레이로부터의 "자기" 표적을 나타내면, 편집이 완전히 폐지되었다.

도 39a 내지 도 39d 각각에서, 수직축은 편집 효율 (편집 효율 (%))에 상응하고, 수평축은 표적과 연합된 PAM 서열에 상응한다. 도 39a는 PAM 서열의 함수로서 FokI-Pse캐스케이드 편집 효율을 제공한다. 게놈 부위는 수평축 상에 제시된 바와 같이, 하나의 고정된 ATG PAM과 제2 절반-부위에서의 가변 PAM을 함유하였다. 막대는 평균 및 s.d.를 나타낸다. (가변 PAM당 6-14개 부위, 표적 부위당 n=1). 도 37d는 하나의 PAM이 AAG에 고정되고 다른 PAM이 ATG를 포함한 PAM 세트에 걸쳐 가변적인 FokI-Pse캐스케이드에 대한 데이터를 설명한다는 것에 주목해야 한다. 따라서, 이러한 PAM의 서브세트는 AAG-ATG이다. 도 39a는 하나의 PAM이 ATG에 고정되고 다른 PAM이 AAG를 포함한 PAM 세트 전체에 걸쳐 가변적인 FokI-Pse캐스케이드에 대한 데이터를 설명한다 (도 39a, 수평축, 좌측에서 우측으로, AAG, AAC, AAA, ATG, GAG, ATA, AAT, 및 AGG). 따라서, 이들 PAM의 서브세트는 또한 AAG-ATG이고, 도 37d에서 동일한 AAG-ATG 부위이다.

도 39b는 PAM 서열 (도 39b, 수평축, 좌측에서 우측으로, CCG, CGC, AAG, AGG, ATG, GAG, AAA, AAC, ATA, 및 AAT)의 함수로서 FokI-Eco캐스케이드 편집을 제공한다. 고정된 PAM은 AAG이고, 막대는 평균 및 s.d.를 나타낸다 (가변 PAM당 6-15개 부위, 표적 부위당 n=1). 도 39c (도 39c, 수평축, 좌측에서 우측으로, AAG, ATG, AAC, AAA, AGG, GAG, AAT, 및 ATA)는 도 39b에 제시된 것과 유사한 결과를 제공하지만, 제1 PAM이 ATG로 고정되었다 (가변 PAM당 6-14개 부위, 표적 부위당 n=1). AAG-ATG 쌍 (평균 ~3)에 상응하는 도 39b에서의 ATG 열은 AAG-ATG 쌍 (평균 ~3)에 상응하는 도 39c에서의 AAG 열과 동일하다. 수직축은 상이한 스케일의 것임에 주목해야 한다. 도 39d는 PAM 서열의 함수로서 FokI-Sth캐스케이드 편집을 제공한다 (도 39d, 수평축, 좌측에서 우측, CC, AA, GA, TA 및 CA). 고정된 PAM은 GAA이고 막대는 평균 및 s.d.를 나타낸다 (가변 PAM당 18-33개 부위, 표적 부위당 n=1).

도 40a, 도 40b, 도 40c, 도 40d, 도 40e, 및 도 40f는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 복합체의 편집 효율에 있어서의 예시적인 변화와 관련된 데이터를 제시한다. 백분율 편집 효율 (수직축) 대 인터스페이서 거리 (bp) (수평축)에 대한 도 40a (FokI-Pse캐스케이드) 및 도 40d (FokI-Sth캐스케이드)에 제시된 데이터는 도 41a 및 도 41c에 제시된 데이터에 대하여 본질적으로 실시예 20C에 기재된 바와 같이 수득되었다. 도 40a 및 도 40d에서, 수평축은 23-34 bp 인터스페이서 거리를 나타내고, 그래프의 막대는 좌측에서 우측으로, 17 aa (연한 회색 막대), 20개 아미노산 (진한 회색 막대) 및 30 aa (백색 막대)의 FokI-Cas8 폴리펩티드 링커 길이이다. 도 40c 및 도 40f에 제시된 데이터는 본질적으로 도 39b에 대해 기재된 바와 같이 수득되었다. 도 40c 및 도 40f는 PAM 서열 (도 40c, 좌측에서 우측으로, CCG, CGC, AAG, AAA, ATG, AAC, AGG, ATA, GAG, 및 AAT; 도 40f, 좌측에서 우측으로, CC, AA, GA, TA, 및 CA)의 함수로서 FokI-Pse캐스케이드 및 FokI-Sth캐스케이드 편집 (도 40c, 도 40f, 수직축, 편집 효율 (%))을 제공한다. 도 40b는 FokI-Pse캐스케이드 RNP 복합체를 예시한다. FokI-Pse캐스케이드에 대한 고정된 PAM은 AAG (도 40b, AAG PAM)이고, 다른 PAM은 PAM의 세트 전체에 걸쳐 가변적이다 (도 40b, 가변 PAM). 도 40e는 FokI-Sth캐스케이드 RNP 복합체를 예시한다. FokI-Sth캐스케이드에 대한 고정된 PAM은 GAA (도 40b, GAA PAM)이고, 다른 PAM은 PAM의 세트 전체에 걸쳐 가변적이다 (도 40e, 가변 PAM). FokI-Pse캐스케이드는 링커 및 인터스페이서 선호도에 관하여 재스크리닝되었고, 그 데이터는 거의 50% 편집을 명화하게 보여주었다. PAM 선호도를 또한 조사하였다. 이러한 데이터로부터, PAM의 시험관내 순위 선호도를 결정하였다. 스트렙토코쿠스 써모필루스로부터의 변이체에 대하여 본질적으로 동일한 분석을 수행하였다. 편집은 에스. 써모필루스 시스템에서 더 낮았다. 그러나, 본원에 제시된 데이터는 생체내 인간 세포에서, 에스. 써모필루스 시스템에 대한 PAM 선호도가 매우 난잡하다는 것을 입증한다. 프로토스페이서 (즉, 표적 서열)의 단일 A 상류가 편집에 허용되었다는 사실은 일반적으로, (예를 들어, 동일한 유전자 내의 잠재적 클래스 2 유형 II CRISPR-Cas9 PAM-연합된 표적 부위의 수에 비해) 유전자 내의 잠재적 표적 서열의 증가된 수를 제공한다. 더욱이, 본원에 제시된 생체내 데이터는 문헌 [Sinkunas, T., et al., EMBO J. 32:385-394 (2013)]에 의해 입증된 시험관내 PAM 선호도와 상관이 있다.

수백 개의 편집된 게놈 부위 전체에 걸친 NGS 데이터의 축적은 FokI-Pse캐스케이드에 의해 도입된 DSB의 DNA 복구 결과의 특징규명할 수 있는 능력을 제공하였다. indel 빈도가 >10%인 40개의 고유한 부위에 초점을 맞추어, 결실 및 삽입의 빈도를, 예측된 절단 부위를 둘러싼 50 bp 창 내에서 총 돌연변이체 판독값의 함수로서 분석하였다. 2-4 bp의 삽입은 고도로 강화되었고, 조사된 대부분의 부위에 존재하였다 (도 37e). 상세한 검사는 이러한 삽입의 ~90%가 절단 부위에 인접한 서열의 완벽한 복제를 함유하였다는 것을 보여주었다. 임의의 특별한 이론에 의해 제한되는 것을 원하지는 않지만, 이러한 중복은 이량체성 FokI에 의해 도입된 엇갈린 커트의 주형 복구의 결과일 수 있다.

FokI-Pse캐스케이드의 특이성은 미스매치된 쌍형성된 gRNA의 광범위한 패널을 사용하여 2개의 고 효율 표적 부위를 편집함으로써 평가되었다 (도 38a). 캐스케이드에 대한 이전 연구에서는 ~8-nt PAM-근위 시드 서열 뿐만 아니라 32-nt 가이드 gRNA 내의 모든 6번째 위치에서의 미스매치 무차별성이 강조되었는데, 이는 이들 염기가 표적 결합 시 형성된 RNA-DNA 헤테로듀플렉스 구조로부터 뒤집히기 때문이다 (예를 들어, 문헌 [Jung, C., et al., Cell 170:35-47 (2017); Mulepati, S., et al., Science 345:1479-1484 (2014); Fineran, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:E1629-E1638 (2014); Semenova, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:10098-10103 (2011)] 참조). PAM-근위 시드 영역 내의 미스매치는 게놈 편집에 매우 해로운 반면, PAM으로부터 멀리 떨어진 미스매치는 잘 관용되어, 거의 야생형 편집 효율로 이어졌다 (도 38b; 도 38c). 그러나, 미스매치의 블록이 절반-부위 둘 다에 존재할 때, 편집은 시험된 쌍형성된 gRNA의 전체 패널에 걸쳐 현저하게 떨어졌다 (도 38b, 도 38c). FokI-Pse캐스케이드-매개된 게놈 편집의 PAM 데이터 및 인터스페이서 데이터 (도 38c; 도 37d)를 기반으로 하여, 본 발명의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 복합체의 한 가지 이점은 표적화가능한 부위가 인간 게놈에서 ~20 내지 ~30 bp마다 발생할 수 있는 반면, 잠재적인 표적-이탈 부위에서의 편집은 거의 불가능하다는 것이다.

따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 주어진 조작된 FokI-캐스케이드 시스템의 잠재적인 표적화가능한 부위, 또는 "표적 밀도"는 효율적인 인터스페이스 거리 및 PAM 선호도의 함수이며, 상동체 전반에 걸쳐 약간의 가변성을 가질 것이다. 일부 실시양태에서, FokI-Pse캐스케이드, FokI-Eco캐스케이드, 및 FokI-Sth캐스케이드에 대한 인간 게놈에서의 표적 밀도를 계산하기 위해 하기 기준을 사용할 수 있다 (데이터는 예측된 표적 밀도를 계산하기 위해 외삽되었음).

FokI-Pse캐스케이드, 표적 밀도는 하기 모티프를 사용하여 계산될 수 있다:

5'-[절반-부위₁-PAM₁]-[인터스페이서]-[PAM₂-절반-부위₂]-3'.

여기서 [절반-부위₁-PAM₁]은 절반-부위₁ gRNA₁ 표적 가닥 표적 서열 및 PAM의 역 보체를 나타내고, [절반-부위₂-PAM₂]는 절반-부위₂ gRNA₂ 비-표적 가닥 PAM 및 표적 서열을 나타낸다. FokI-Pse캐스케이드를 사용한 편집을 지원하는 인터스페이서 길이의 분포를 기반으로 한 (예를 들어, 도 37d 참조), 효율적인 인터스페이서 길이는 약 30-33 bp이다. PAM은 가장 높은 편집을 제공하는 세트 1 (AAG, AAA, ATG, AAC) 또는 활성을 보인 시험된 PAM 중 임의의 것 (AAG, AGG, ATG, GAG, AAA, AAC, AAT, ATA)이 함유된 경우에 세트 2에 속하는 것으로서 정의되었다 (예를 들어, 도 39a; 도 40b 참조). 이로부터, 세트 1 또는 세트 2에 속하는 2개의 PAM으로 선호되는 인터스페이서 길이 기준을 충족하는 잠재적 표적 부위는 각각 평균 33.4 bp 또는 9.2 bp마다 발생될 것이다.

FokI-Eco캐스케이드에 대한 표적 밀도는 인터스페이서 길이가 31-33으로서 정의된 것을 제외하고 유사하게 결정되었고, PAM은 가장 높은 편집을 제공하는 세트 1 (AAG, AGG, ATG, GAG, AAA) 또는 활성을 보인 시험된 PAM 중 임의의 것 (AAG, AGG, ATG, GAG, AAA, AAC, AAT, ATA)이 함유된 경우에 세트 2에 속하는 것으로서 정의되었다 (예를 들어, 도 39c; 도 39d 참조). 이로부터, 잠재적 표적 부위는 각각 평균 30.4 bp 또는 12.2 bp마다 발생하는 세트 1 PAM 또는 세트 2 PAM으로 계산되었다.

FokI-Sth캐스케이드에 대한 인간 게놈 표적 밀도는, 인터스페이서 길이가 29-31 bp로서 정의된 것을 제외하고는 유사하게 결정되었고, PAM은 NNA로서 결정되었다 (예를 들어, 도 39d 참조). 이로부터, 잠재적 표적 부위는 평균 4 bp마다 발생하도록 계산되었다.

따라서, 본원에 기재된 바와 같은, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 복합체는 게놈 편집에 이용가능한 다수의 PAM 인접한 표적 서열을 제공함으로써 다양한 잠재적 표적 부위를 제공하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는 (예를 들어, 클래스 2 CRISPR-Cas 유형 II 또는 유형 V 시스템의 PAM 서열과 연합된 이용가능한 표적 서열의 수에 비해) 유전자 내에 증가된 수의 이용가능한 표적 서열을 제공하기 위해 조작된 유형 I CRISPR-Cas 복합체와 연합된 PAM 서열을 사용하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법의 적용은 표적 서열에의 결합 및/또는 그의 절단, 표적 서열의 돌연변이, 표적 서열 또는 그의 조절 요소와 관련된 전사 조절 뿐만 아니라 본원에 기재된 조작된 유형 I CRISPR-Cas 복합체의 사용에 의해 매개되는 (예를 들어, 유전자의 산물에서의) 의도적 변형, 변화 및/또는 현저하게 상이한 구조적 변화를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 복합체의 용도에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 gDNA의 변형, 변화 및/또는 돌연변이를 생성하기 위해 게놈 내의 DNA 표적 로커스에 선택된 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 공여자 폴리뉴클레오티드의 일부분)을 부위 특이적으로 도입함으로써 비-인간 트랜스제닉 유기체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 트랜스제닉 유기체는 동물 또는 식물일 수 있다.

트랜스제닉 동물은 전형적으로, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 접합자 세포 내로 도입함으로써 생성된다. 트랜스제닉 마우스를 만드는 것과 관련하여 기재된 기본 기술 (예를 들어, 문헌 [Cho, A., et al., "Generation of Transgenic Mice," Current Protocols in Cell Biology, CHAPTER.Unit-19.11 (2009)] 참조)은 5가지 기본 단계를 포함한다: 첫째, 적합한 공여자 폴리뉴클레오티드를 포함한, 본원에 기재된 바와 같은 시스템의 제조; 둘째, 공여자 접합자를 수거하는 것; 셋째, 마우스 접합자로의 시스템의 미세주사; 넷째, 거짓 임신 수용자 마우스 내로의 미세주사된 접합자의 체내 이식; 다섯째, 창시 마우스에서 확립된 gDNA의 유전자형 분석 및 변형 분석을 수행하는 것. 창시 마우스는 유전적 변형을 임의의 자손에게 물려줄 것이다. 창시 마우스는 전형적으로 트랜스진에 대해 이형 접합성이다. 이들 마우스 사이의 교배는 그 시간에 트랜스진 25%에 대해 동형 접합성인 마우스를 생산할 것이다.

트랜스제닉 식물을 생성하는 방법이 또한 널리 공지되어 있으며, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 사용하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 아그로박테리움-매개된 형질전환을 사용하여 생성된 트랜스제닉 식물은 전형적으로, 하나의 염색체 내로 삽입된 하나의 트랜스진을 함유한다. 단일 트랜스진을 함유하는 독립적인 분리 개체 트랜스제닉 식물을 그 자체와 성적으로 교배 (즉, 자가 수정)함으로써 트랜스진에 대해 동형 접합성인 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있다. 전형적인 접합성 검정은 단일 뉴클레오티드 다형성 검정 및 동형 접합자와 이형 접합자를 구별하는 열 증폭 검정을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

제6 측면에서, 본 발명은 기질 채널을 창출하기 위해 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 사용하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 기질 채널 요소 및 Cas7 서브유닛 단백질을 포함하는 융합 단백질을 구축한다. 이어서, 이들 Cas7 융합 단백질은 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (예를 들어, Cse2, Cas5, Cas6, Cas7-기질 채널 요소 융합물, 및 Cas8을 포함함)로 어셈블리된다. 일부 실시양태에서, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 crRNA는 부가의 Cas7 서브유닛을 수용하도록 연장될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Luo, M., et al., Nucleic Acids Res. 44:7385-7394 (2016)] 참조). 상이한 기질 요소를 Cas7과 융합한 다음, 원하는 화학량론으로 혼합할 수 있다. 이러한 다양한 Cas7 서브유닛이 완전한 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체로 어셈블리될 때, 기질 요소의 공동-국 재화는 기질 채널링의 효율을 증강시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, RNA 스캐폴드는 다수의 Cas7-기질 채널 요소 융합이 다른 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 구성성분의 부재 하에 이에 결합할 수 있도록 구축된다.

기질 채널 요소는 Cas7의 N-말단 및/또는 Cas7의 C-말단과 융합될 수 있다. 또한, Cas7의 순환 순열이 기질 채널 요소와 융합될 수 있다.

도 11a 및 도 11b는 경로에서 3개의 연속적인 효소로 이루어진 기질 채널의 예시를 제시한다. 기질 채널은 여분의 채널 공간으로 방출되지 않고 대사 경로 쇄에서 연속적인 효소의 활성 부위로 중간 대사 산물을 직접 전달하는 것을 용이하게 한다. 도 11a는 조작된 기질 채널의 전형적인 배열을 예시한다. 효소 E1, E2 및 E3은 스캐폴드 단백질 (S1, S2, S3) 매트릭스와 공유적으로 또는 비-공유적으로 상호작용한다. 양방향 화살표는 효소와 스캐폴드 단백질 사이의 상호작용 (예를 들어, 친화성 상호작용)을 나타낸다. 이어서, 기질 (X)은 여분의 채널 공간으로 방출되지 않고 산물 (Y)로 프로세싱된다. 도 11b는 Cas7 서브유닛 단백질과의 융합 단백질 (즉, 공유 상호작용)로서 효소 E1, E2 및 E3을 운반하므로, 기질 채널을 창출하는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 포함하는 본 발명의 한 실시양태를 예시한다. cpCas7 단백질 및 cpCas7 단백질로 형성된 백본이 또한, 본 발명의 이러한 측면의 실시에 유용할 수 있다.

다른 실시양태에서, 기질 채널 요소가 Cas6과 융합될 수 있다. 캐스케이드 복합체의 Cas6 서브유닛은 특이적 RNA 헤어핀 구조를 인식한다. 함께 연결된 다수의 Cas6 RNA 헤어핀 구조로 구성되는 RNA 스캐폴드를 구축할 수 있다. 상이한 캐스케이드 복합체로부터의 Cas6 펩티드는 상이한 인식 서열을 갖는다. 따라서, RNA 스캐폴드는 다수의 직교 Cas6 RNA 헤어핀으로부터 구축될 수 있다. 상이한 기질 채널 요소를 직교 Cas6 펩티드와 융합시킴으로써, 기질 채널 복합체를 특이적 화학량론으로 어셈블리할 수 있다.

기질 채널 요소는 Cas6의 N-말단 및/또는 Cas6의 C-말단과 융합될 수 있다. 또한, Cas6의 순환 순열은 기질 채널 요소와 융합될 수 있다.

일부 실시양태에서, 관심 이종 대사 경로는 모델 유기체, 예컨대 이. 콜라이에서 발현될 수 있다. 유전자가 이종으로 발현되면, 유전자를 보다 효율적으로 발현하기 위해 유전자를 코돈-최적화할 수 있다.

한 실시양태에서, 관심 대사 경로는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 메발로네이트 경로이다. 이러한 경로의 기질 채널 요소는 아세토아세틸-CoA-티오아제 (AtoB), 히드록시-메틸글루타릴-CoA 신타제 (HMGS) 및 히드록시-메틸글루타릴-CoA 리덕타제 (HMGR)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 실시양태에서, 관심 대사 경로는 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae)로부터의 글리세롤 합성 경로이다. 이러한 경로의 기질 채널 요소는 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (GPD1) 및 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 (GPP2)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

또한 또 다른 실시양태에서, 관심 대사 경로는 클로스트리디움 스테르코라리움(Clostridium stercorarium)으로부터의 전분 가수분해 경로이다. 이러한 경로의 기질 채널 요소는 CelY 및 CelZ를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

부가 실시양태에서, 관심 대사 경로는 이. 콜라이로부터의 글루코스 포스포트랜스퍼라제 경로이다. 이러한 경로의 기질 채널 요소는 트레할로스-6-포스페이트 신테타제 (TPS) 및 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 (TPP)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

제7 측면에서, 본 발명은 클래스 2 유형 II Cas9 단백질 및 핵산 표적화 핵산 (NATNA)을 포함하는 복합체에 의해 캐스케이드 서브유닛 단백질과 융합된 기능적 도메인의 부위-지정 동원에 관한 것이다. 기능적 도메인이 본원에 개시되고, 이는 효소 기능을 갖거나, 전사 활성화할 수 있거나, 또는 전사 저해할 수 있는 단백질 도메인을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 실시예 13A 및 실시예 13B는 클래스 2 유형 II CRISPR sgRNA, crRNA, tracrRNA, 또는 crRNA 및 tracrRNA 서열을 클래스 1 유형 I CRISPR 반복부 스템 서열로 조작하여, 하나 이상의 캐스케이드 서브유닛 단백질을 유형 II CRISPR Cas 단백질/가이드 RNA 복합체 결합 부위로 동원할 수 있게 하는 방법을 설명한다.

도 12a, 도 12b, 및 도 12c는 dCas9:NATNA 복합체에 의해 캐스케이드 서브유닛 단백질과 융합된 기능적 단백질 도메인의 표적 부위로의 부위-지정 동원의 일반화된 예시를 제시한다. 스페이서 서열 (도 12a, 101)을 포함하는 클래스 2 유형 II CRISPR NATNA (도 12a, 102)는 링커 핵산 서열 (도 12a, 103)을 통하여 클래스 1 유형 I CRISPR 반복부 스템 서열 (도 12a, 104)에 공유적으로 연결된다. 유형 I CRISPR 반복부 스템 서열 (도 12a, 105)에 공유적으로 연결된 유형 II CRISRP NATNA는 유형 II dCas9 (도 12a, 106) 및 유형 I 캐스케이드 서브유닛 단백질 (예를 들어, Cas6; 도 12a, 107)에 결합할 수 있으며, 이는 링커 서열 (도 12a, 108)을 통하여 기능적 단백질 도메인 (예를 들어, 효소 도메인, 전사 활성화 또는 저해 도메인; 도 12a, 109)과 융합되어 RNP 복합체를 형성한다. 이러한 RNP 복합체 (도 12b, 110)는 유형 II CRISPR NATNA 스페이서 서열 (도 12a, 101)에 상보적인 표적 서열 (도 12b, 112)을 포함하는 이중-가닥 DNA (도 12b, 111)를 표적화할 수 있다. RNP 복합체에 의한 표적 인식은 스페이서 서열 (도 12a, 101)과 표적 서열 (도 12b, 112) 사이의 혼성화 (도 12b, 113)를 초래한다. 캐스케이드 서브유닛-기능적 도메인 융합 단백질을 DNA에 국재화하면, 인접한 유전자의 기능적 단백질 도메인 또는 전사 조절에 의해 상기 DNA의 변형이 허용된다 (도 12c, 114).

제8 측면에서, 본 발명은 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체, 조작된 가이드 폴리뉴클레오티드, 및 그의 조합을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 연합된 Cas3 융합 단백질을 포함한다. 야생형 유형 I CRISPR-Cas 시스템은 DNA 표적화를 위한 캐스케이드 이펙터 복합체와 전진하는 DNA 분해를 위한 Cas3 헬리카제-뉴클레아제의 협조적 작용을 필요로 한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 이러한 복합체를 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, 비-특이적 FokI 엔도뉴클레아제 도메인)과 융합시킴으로써 정밀한 DSB를 만들도록 조작되었다. 이러한 접근법은 개재 서열 (즉, 인터스페이서)에 의해 분리된 2개의 절반-부위 DNA 서열을 표적화하는 쌍형성된 가이드 폴리뉴클레오티드를 사용한다.

이러한 본 발명의 측면의 실시양태는 각각 스페이서 및 Cas 서브유닛과 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI; 예를 들어, 도 2a, 도 2b, 및 도 2c의 캐스케이드 복합체 참조)를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 2개의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 적어도 2개의 파라미터가 게놈 편집 효율을 조정하기 위해 달라진다. 이러한 파라미터는 하기를 포함한다:

Cas 서브유닛 단백질과 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI)를 포함하는 융합 단백질을 생산하기 위해 사용되는 링커 폴리펩티드의 길이; 및

스페이서에 결합될 수 있는 핵산 표적 서열 사이의 인터스페이서 거리의 길이.

아미노산 조성 및 서열 링커 폴리펩티드에 관한 지침이 본원에 제공된다.

이러한 본 발명의 측면의 한 실시양태는 하기를 포함하는 조성물이다:

제1 Cse2 서브유닛 단백질, 제1 Cas5 서브유닛 단백질, 제1 Cas6 서브유닛 단백질, 및 제1 Cas7 서브유닛 단백질,

제1 Cas8 서브유닛 단백질 및 제1 FokI를 포함하며, 여기서 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단 또는 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단이 제1 링커 폴리펩티드에 의해 제1 FokI의 C-말단 또는 N-말단에 각각 공유적으로 연결되고, 제1 링커 폴리펩티드가 약 10개 아미노산 내지 약 40개 아미노산의 길이를 갖는 것인 제1 융합 단백질, 및

제1 핵산 표적 서열에 결합할 수 있는 제1 스페이서를 포함하는 제1 가이드 폴리뉴클레오티드

를 포함하는 제1 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체; 및

제2 Cse2 서브유닛 단백질, 제2 Cas5 서브유닛 단백질, 제2 Cas6 서브유닛 단백질, 및 제2 Cas7 서브유닛 단백질,

제2 Cas8 서브유닛 단백질 및 제2 FokI를 포함하며, 여기서 제2 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단 또는 제2 Cas8 단백질의 C-말단이 제2 링커 폴리펩티드에 의해 제2 FokI의 C-말단 또는 N-말단에 각각 공유적으로 연결되고, 제2 링커 폴리펩티드가 약 10개 아미노산 내지 약 40개 아미노산의 길이를 갖는 것인 제2 융합 단백질, 및

제2 핵산 표적 서열에 결합할 수 있는 제2 스페이서를 포함하며, 여기서 제2 핵산 표적 서열의 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)와 제1 핵산 표적 서열의 PAM이 약 20개 염기 쌍 내지 약 42개 염기 쌍의 인터스페이서 거리를 갖는 것인 제2 가이드 폴리뉴클레오티드

를 포함하는 제2 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체.

이러한 제1 핵산 표적 서열에 결합된 제1 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 및 제2 핵산 표적 서열에 결합된 제2 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 예가 도 2a, 도 2b, 및 도 2c에 예시된다.

일부 실시양태에서, 제1 링커 폴리펩티드 및/또는 제2 링커 폴리펩티드의 길이는 약 15개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 또는 약 17개 아미노산 내지 약 20개 아미노산의 길이이다. 한 실시양태에서, 제1 링커 폴리펩티드와 제2 링커 폴리펩티드의 길이는 동일하다.

제1 Cas8 서브유닛 단백질 및 제2 Cas8 서브유닛 단백질은 각각 Cas8 서브유닛 단백질의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

유사하게, 제1 Cse2 서브유닛 단백질 및 제2 Cse2 서브유닛 단백질은 각각 Cse2 서브유닛 단백질의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제1 Cas5 서브유닛 단백질 및 제2 Cas5 서브유닛 단백질은 각각 Cas5 서브유닛 단백질의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 제1 Cas6 서브유닛 단백질 및 제2 Cas6 서브유닛 단백질은 각각 Cas6 서브유닛 단백질의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제1 Cas7 서브유닛 단백질 및 제2 Cas7 서브유닛 단백질은 각각 Cas7 서브유닛 단백질의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그의 조합이 있다.

전형적으로, 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단은 제1 링커 폴리펩티드에 의해 제1 FokI의 C-말단에 공유적으로 연결되고, 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단은 제1 링커 폴리펩티드에 의해 제1 FokI의 N-말단에 공유적으로 연결되며, 제2 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단은 제2 링커 폴리펩티드에 의해 제2 FokI의 C-말단에 공유적으로 연결되고, 제2 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단은 제2 링커 폴리펩티드에 의해 제2 FokI의 N-말단에 공유적으로 연결되며, 그의 조합이 있다.

이러한 본 발명의 측면의 실시양태는 제2 핵산 표적 서열과 제1 핵산 표적 서열 사이의 길이가 약 22개 염기 쌍 내지 약 40개 염기 쌍, 약 26개 염기 쌍 내지 약 36개 염기 쌍, 약 29개 염기 쌍 내지 약 35개 염기 쌍, 또는 약 30개 염기 쌍 내지 약 34개 염기 쌍의 인터스페이서 거리인 실시양태를 포함한다.

제1 FokI 및 제2 FokI는 연합하여 동종이량체를 형성할 수 있는 단량체성 서브유닛, 또는 연합하여 이종이량체를 형성할 수 있는 별개의 서브유닛일 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 RNA를 포함한다.

일부 실시양태에서, gDNA는 제2 핵산 표적 서열의 PAM 및 제1 핵산 표적 서열의 PAM을 포함한다.

일부 실시양태에서, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 살모넬라 엔테리카, 게오써모박터 종 (균주 EPR-M), 메타노셀라 아르보리자에 MRE50, 스트렙토코쿠스 써모필루스 (예를 들어, 스트렙토코쿠스 써모필루스 (균주 ND07)), 슈도모나스 종 S-6-2, 및 이. 콜라이로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기체의 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체에 기반한다. 바람직한 실시양태에서, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 스트렙토코쿠스 써모필루스 (예를 들어, 스트렙토코쿠스 써모필루스 (균주 ND07)), 슈도모나스 종 S-6-2, 및/또는 이. 콜라이의 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체에 기반한다. 슈도모나스 종 S-6-2는 이. 콜라이 상동체보다 ~10배 더 높은 편집 효율을 유도했으며, 시험된 다른 상동체의 대략 절반은 이. 콜라이와 동등한 활성을 나타냈으며, 이는 다양한 유형 I 시스템으로부터의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체가 인간 세포에서의 게놈 편집에 기능적으로 사용될 수 있다는 것을 명확하게 보여준다.

실시예 18A, 실시예 18B, 실시예 18C, 실시예 18D, 실시예 20A, 실시예 20B, 및 실시예 20C에 제시된 데이터는 Cas 서브유닛 단백질과 FokI를 포함하는 융합 단백질을 생산하기 위해 사용되는 링커 폴리펩티드의 길이를 다양하게 하고/거나 스페이서에 결합할 수 있는 핵산 표적 서열 사이의 인터스페이서 거리의 길이를 다양하게 하는 것이 세포에서의 게놈 편집 효율의 조정을 용이하게 한다는 것을 입증한다.

또한 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 캐스케이드 서브유닛 단백질 (예를 들어, Cas8 서브유닛 단백질) 및 제1 기능적 도메인 (예를 들어, FokI)을 포함하는 제1 융합 단백질, 및 dCas3* 단백질 및 제2 기능적 도메인 (예를 들어, FokI)을 포함하는 제2 융합 단백질을 포함하는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체에 관한 것이다 (도 13a: Cas7, Cas5, Cas8, Cse2, 및 Cas6; Cas6 주위의 파선 박스는 crRNA 헤어핀과의 상호작용을 나타내고; cRNA는 헤어핀을 포함하는 흑색 선으로서 예시됨). 제1 기능적 도메인 (예를 들어, FokI)을 포함하는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (도 13a, Cas8-링커1-FP1 융합물)는 DNA에 결합할 수 있고, 이어서 dCas3*-제2 기능적 도메인 (예를 들어, FokI) 융합 단백질을 동원할 수 있다 (도 13a, dCas3*-링커2-FP2). 제1 기능적 도메인 (도 13a, Cas8-링커1-FP1 융합물) 및 제2 기능적 도메인 (도 13a, dCas3*-링커2-FP2)이 이량체성 단백질의 서브유닛을 포함하는 경우에, dCas3*-제2 기능적 도메인 (예를 들어, FokI) 융합 단백질은 제1 기능적 도메인 (예를 들어, FokI)을 포함하는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체에 결합하여, 제1 기능적 도메인과 제2 기능적 도메인의 이량체화를 용이하게 한다 (도 13a). 도 14a는 링커 폴리펩티드 (도 14a, 링커 1)를 통해 Cas 서브유닛 단백질 (도 14a, 줄무의 박스)에 연결된 제1 기능적 도메인 (도 14a, FD1) 및 캐스케이드 복합체와 연합된 링커 폴리펩티드 (도 14a, 링커 2)를 통해 제2 기능적 도메인 (도 14a, FD2)에 연결된 dCas3*을 포함하는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (도 14a, 캐스케이드)의 dsDNA에 결합하는 것; 이에 따라, FD1 및 FD2를 근접하게 가져오는 것 및 FD1과 FD2의 상호작용을 용이하게 하는 것을 예시한다. 캐스케이드 복합체의 결합은 단일 PAM 서열 (도 14a, PAM, 열린 박스)을 수반한다. 도 14a에서, dsDNA는 쌍형성된 수평 파선으로서 예시된다. 기능적 도메인이 이량체성 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI)인 경우에, FD1과 FD2의 근접성은 기능적 이량체의 형성을 용이하게 한다.

이러한 본 발명의 실시양태의 한 가지 이점은 2개의 FokI-캐스케이드 복합체를 사용하는 것과 비교하여, 단일 캐스케이드 복합체 (단일 PAM 서열을 인식함)를 사용하여 이중-가닥 핵산 표적 서열을 절단할 수 있다는 것이다 (도 14a를 도 2a, 도 2b, 및 도 2c와 비교함). 2개의 FokI-캐스케이드 복합체를 사용하기 위해서는 2개의 PAM 서열이 적당한 배향으로 존재해야 하며 (도 2a, 도 2b, 및 도 2c), 이는 근접 핵산 표적 서열의 선택을 제한할 수 있다.

Cas 서브유닛 단백질과 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI)를 포함하는 융합 단백질을 생산하기 위해 사용되는 링커 폴리펩티드의 길이 및/또는 조성 뿐만 아니라 dCas3* 단백질과 엔도뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질을 생산하기 위해 사용되는 링커 폴리펩티드의 길이 및/또는 조성은 게놈 편집 효율을 조정하기 위해 달라질 수 있다. 실시예 21A, 실시예 21B, 실시예 21C, 및 실시예 21D는 게놈 편집 효율의 조정을 위한 다수의 Cas3-FokI 링커 조성 및 길이 및 FokI-Cas8 링커 조성 및 길이의 설계 및 시험을 설명한다.

이러한 본 발명의 측면의 또 다른 실시양태는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (도 13b: Cas7, Cas5, Cas8, Cse2, 및 Cas6; Cas6 주위의 파선 박스는 crRNA 헤어핀과의 상호작용을 나타내고; cRNA는 헤어핀을 포함하는 흑색 선으로서 예시됨) 및 링커 폴리펩티드 (도 13b, 링커)에 의해 연결된 dCas3* 단백질 (도 13b, dCas3*)과 기능적 도메인 (도 13b, FP) (예를 들어, 시티딘 데아미나제)을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 DNA에 결합할 수 있고, dCas3*-기능적 도메인 (예를 들어, 시티딘 데아미나제) 융합 단백질을 동원할 수 있다. 이러한 실시양태는 기능적 도메인에 의한 변형 또는 기능적 도메인과의 상호작용을 위하여 핵산 표적 서열의 부위-특이적 표적화를 용이하게 할 수 있다. 시티딘 데아미나제의 경우에, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 및 dCas3* 단백질과 시티딘 데아미나제를 포함하는 융합 단백질은 핵산 표적 서열에서의 부위-특이적 염기 편집에 사용될 수 있다. 도 14b는 링커 폴리펩티드 (도 14b, 링커)를 통해 기능적 도메인 (도 14b, FD)과 연결된 dCas3* 단백질 (도 14b, dCas3*)을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (도 14b, 캐스케이드)의 예를 예시하며, 여기서 복합체는 dsDNA에 결합된다 (도 14b, 쌍형성된 수평 파선). 도 14b에서, 기능적 도메인과 dsDNA의 접촉이 용이해진다. 캐스케이드 복합체의 결합은 단일 PAM 서열 (도 14b, PAM, 열린 박스)을 수반한다. 도 14c는 링커 폴리펩티드 (도 14c, 링커)를 통해 기능적 도메인 (도 14c, FD)과 연결된 dCas3* 단백질 (도 14c, dCas3*)을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (도 14c, 캐스케이드)의 또 다른 예를 예시하며, 여기서 복합체는 dsDNA에 결합된다 (도 14c, 쌍형성된 수평 파선). 캐스케이드 복합체의 결합은 단일 PAM 서열 (도 14c, PAM, 열린 박스)을 수반한다. 도 14c에서는, 기능적 도메인과 ssDNA의 접촉이 용이해진다.

유형 I CRISPR-Cas 서브유닛 단백질과의 융합 단백질을 구축하기 위해 사용될 수 있는 부가의 기능적 도메인 및 단백질이 본 명세서 및 실시예에 기재되어 있다. Cas3-링커 폴리펩티드-기능적 도메인 융합 단백질에 대한 링커 폴리펩티드 조성 및 길이는 기능적 도메인의 성능에 대한 효과를 평가하기 위한 실시예 21A 내지 실시예 21D 및 본 명세서의 지침에 따라 평가될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 및 mCas3 단백질을 사용할 수 있으며, 여기서 mCas3 단백질은 하향-조정된 헬리카제 활성을 포함하거나 (예를 들어, Cas3 전진성 돌연변이체 단백질인 mCas3 단백질은 야생형 유형 I CRISPR Cas3 단백질에 비해 DNA에 따른 이동이 감소되었음) 또는 mCas3 단백질에 헬리카제 활성이 결여된다 (예를 들어, mCas3 단백질은 더 이상 wtCas3 단백질과 같이 전진하는 뉴클레아제가 아니지만, mCas3 단백질은 닉킹 활성을 보유함). 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 DNA에 결합할 수 있고, 이어서 mCas3 단백질을 동원할 수 있다. 이러한 실시양태는 게놈 DNA의 부위-특이적 절단을 용이하게 할 수 있다.

표 48은 수많은 mCas3 단백질을 설명하며, 여기서 Cas3 단백질에 만들어진 돌연변이는 헬리카제 도메인의 ATP 결합/가수분해 영역 또는 헬리카제 도메인의 ssDNA 경로 보존된 영역에 영향을 미쳤다. 도 44는 EcoCas3 단백질의 기능적 도메인 및 Cas3 코딩 서열 내에서 만들어진 돌연변이체의 상대적 위치의 선형 표현을 제시한다. 도 44에서, HD 뉴클레아제 도메인 (아미노산 1-272), 헬리카제 도메인 (RecA1 영역, 아미노산 273-521; RecA2 영역, 아미노산 522-737), 링커 (아미노산 738-794), 및 C-말단 도메인 (CTD, 아미노산 795-888)이 표시된다. 문헌 [Huo, Y., et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 9:771-777 (2014)]은 써모비피다 푸스카(Thermobifida fusca) (등록 코드: Q47PJ0; 서열식별번호: 1869), 사카로모노스포라 비리디스(Saccharomonospora viridis) (C7MTA6; 서열식별번호: 1870), 써모모노스포라 쿠르바타(Thermomonospora curvata) (D1A6Q2; 서열식별번호: 1922), 스트렙토미세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) (Q825B5; 서열식별번호: 1925), 스트렙토미세스 보트로펜시스(Streptomyces bottropensis) (M3DI13; 서열식별번호: 1923), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus) 균주 HD8 (Q53VY2; 서열식별번호: 1924) 및 이. 콜라이 (P38036; 서열식별번호: 1844)로부터의 단백질의 Cas3 패밀리의 서열 정렬을 이용한 서열 보존 분석을 제공한다. 헬리카제 도메인 또는 ssDNA 루프 결합 도메인의 ATP 결합 부분에서 돌연변이를 갖는 24개의 상이한 EcoCas3 단백질 변이체를 스크리닝하였다 (실시예 23A 내지 실시예 23C). 여러 돌연변이체는 앰플리콘 창 내에서 훨씬 더 많은 및/또는 위치-시프트된 결실 클래스를 보여주었으며; 이는 이들 mCas3 단백질이 wtCas3에 비해 감소된 전진성을 가지고 있다는 것을 뒷받침하는 발견이다.

실시예 23A 내지 실시예 23C는 이러한 mCas3 단백질을 설명하며, 여기서 평균 mCas3 단백질 유도 결실은 상응하는 wtCas3 단백질로 생성된 평균 결실에 비해 더 짧다. 이러한 mCas3 단백질은 (예를 들어, 인간 세포에서의) 게놈 편집에 유용하다. 도 45a, 도 45b, 도 45c, 및 도 45d는 캐스케이드 RNP 복합체와 연합될 때, 인간 세포 내로 도입되고 발현된 경우에 캐스케이드 RNP 복합체와 연합되는 wtCas3 단백질에 비해 더 짧은 평균 결실 길이를 생성하는 mCas3 단백질을 나타내는 데이터를 제시한다. 본 명세서의 교시의 관점에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이. 콜라이 이외의 다른 종의 박테리아로부터 수득된 Cas3 단백질의 상응하는 영역에서 유사한 돌연변이를 만들 수 있다.

실시예 26A 내지 실시예 26C는 게놈 결실을 생성하는데 유용한 mCas3 단백질의 부가의 예를 제공하며, 여기서 평균 mCas3 단백질 유도 결실은 상응하는 wtCas3 단백질로 생성된 평균 결실에 비해 더 짧다. 본 실시예에 제시된 데이터는 슈도모나스 종 S-6-2로부터의 Cas3 (mPseCas3 단백질)의 ATPase/헬리카제 결핍성 변이체가 Pse캐스케이드 RNP 복합체와 함께 사용되어, 예상 절단 부위에서의 결실 (즉, 절단 부위 국한된 결실)을 생성할 수 있다는 것을 뒷받침한다.

wtPseCas3 단백질/Pse캐스케이드 활성을 추가로 특징규명하였다. 부가의 실험은 표적 강화 프로브를 사용하여 수행되었으며, 이는 대규모 게놈 결실을 검출 할 수 있게 한다. 구체적으로, HEK293 세포를 Pse캐스케이드 RNP 복합체, wtPseCas3 단백질, 및 본질적으로 실시예 26A 내지 실시예 26C에 기재된 바와 같이 TRAC 로커스로 향하는 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 DNA 주형으로 형질감염시켰다. 표적 강화 프로브를 사용하여 게놈 단편을 단리하고 서열 분석한 반면; 실시예 26C에서는, 앰플리콘 창을 사용하여 결실의 존재를 확인하였다. 표적 강화/시퀀싱 방법은 결실을 확인하기 위해 앰플리콘 창을 사용함으로써 제공되지 않은 더 큰 결실에 대한 편견없는 보기를 제공하였다. 전반적으로, 표적 강화 및 게놈 단편의 시퀀싱을 사용하여 평가된 결실은 wtPseCas3 단백질 개시 부위의 상류에서 시작하여 주로 단방향인 것으로 밝혀졌다. 결실은 1 bp 내지 거의 250 kb의 범위였다. 게놈 DNA를 커팅하고 주어진 길이의 결실을 제공하는 방법을 제공하는 것 외에도, 이러한 방법은 유전자의 조절/프로모터 영역을 조사하기 위해 규정된 위치에서 결실의 큰 무작위 서브세트를 생성하는데 유용할 수 있다.

mCas3 단백질은 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 표 48에 기재된 바와 같은 돌연변이의 조합)를 포함할 수 있다.

몇 가지 mCas3 단백질에 대한 결실 길이의 제어가 입증되었다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 mCas3 단백질은 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 캐스케이드 복합체와 연합하여, 약 1개 내지 약 600개 염기 쌍, 약 1개 내지 약 500개 염기 쌍, 약 1개 내지 약 400개 염기 쌍, 약 1개 내지 약 300개 염기 쌍, 바람직하게 약 1개 내지 약 250개 염기 쌍, 약 1개 내지 약 200개 염기 쌍, 또는 약 1개 내지 약 100개 염기 쌍의 평균 결실 길이를 제공할 수 있다.

일부 실시양태에서, wtCas3 단백질 또는 mCas3 단백질은 캐스케이드 복합체의 다양한 서브유닛과 융합되어 Cas3 평균 결실 길이를 추가로 제어할 수 있다. 캐스케이드 복합체에 대한 테더링은 캐스케이드 복합체가 결합된 로커스에 고정될 것이기 때문에, Cas3 단백질 또는 mCas3 단백질이 DNA를 따라 이동하는 것을 제한하거나 방지할 수 있다. wtCas3 단백질 또는 mCas3 단백질은 전형적으로 링커 폴리펩티드를 사용하여, 캐스케이드 복합체의 단백질 구성성분의 N- 또는 C-말단 도메인과 융합될 수 있다 (예를 들어, Eco캐스케이드 복합체의 경우에 EcoCas8, EcoCas6, 또는 EcoCas5와 융합될 수 있음). NLS 서열은 또한 융합 단백질의 N-말단에 첨부될 수 있다. 이. 콜라이 캐스케이드 단백질 구성성분에 대한 이러한 구축물의 예는 표 12에 제시되어 있다. 이들 EcoCas3 융합 단백질은 또한 N-말단에 첨부된 NLS 서열을 갖는다.

* 단백질 서열은 코딩된 폴리시스트론성 단백질 서열이다.

본 발명의 실시양태는 야생형 유형 I CRISPR Cas3 단백질 (wtCas3 단백질)에 비해 DNA를 따라 이동하는 것을 감소시킬 수 있는 조작된 유형 I CRISPR mCas3 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, mCas3 단백질은 상응하는 wtCas3 단백질과의 약 90% 이상, 바람직하게 약 95% 이상, 보다 바람직하게 약 98% 이상의 서열 동일성을 포함한다. mCas3 단백질에 대한 코딩 서열은 아미노 말단, 카르복시 말단, 또는 아미노 말단과 카르복시 말단 둘 다에 공유적으로 연결된 핵 국재화 시그널을 포함할 수 있다. mCas3 단백질은 헬리카제 활성을 하향-조정하는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있으며, 여기서 조작된 mCas3 단백질은 상응하는 wtCas3 단백질에 비해 뉴클레아제 활성 (또는 그의 적어도 일부분)을 보유한다. 전형적으로, DNA는 핵산 표적 서열을 포함하는 표적 영역을 포함하는 dsDNA이다. wtCas3 단백질이 상응하는 캐스케이드 핵단백질 복합체와 연합되고 ("캐스케이드 NP 복합체/wtCas3 단백질"; 예를 들어, 캐스케이드 RNP 복합체), 캐스케이드 NP 복합체가 핵산 표적 서열에 상보적인 스페이서를 포함하는 가이드를 포함하는 경우에, 핵산 표적 서열에 대한 캐스케이드 NP 복합체/wtCas3 단백질의 결합은 DNA의 표적 영역에서의 절단을 용이하게 하여, 전형적으로 표적 영역에서의 결실을 초래하고; mCas3 단백질이 캐스케이드 NP 복합체와 연합되고 ("캐스케이드 NP 복합체/mCas3 단백질"; 예를 들어, 캐스케이드 RNP 복합체/mCas3 단백질) 핵산 표적 서열에 결합하는 경우에, 이는 DNA의 표적 영역에서의 절단을 용이하게 하고 wtCas3 평균 결실 길이에 비해 더 짧은 평균 결실 길이를 초래한다.

일부 실시양태에서, mCas3 단백질에서의 하나 이상의 돌연변이는 wtCas3 단백질 대비 아미노산의 치환이다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 결실은 wtCas3 단백질 대비 mCas3 단백질 코딩 서열에서의 아미노산의 결실 또는 삽입을 포함한다. 하나 이상의 돌연변이는 헬리카제 도메인의 RecA1 영역 또는 RecA2 영역에서 일어날 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 wtCas3 단백질에 비해 ssDNA에 대한 mCas3 단백질의 결합을 하향-조정한다 (예를 들어, ssDNA 루프 결합에 영향을 미치는 돌연변이 및/또는 헬리카제 도메인의 ssDNA 경로 보존된 영역에서의 돌연변이). 부가 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 wtCas3 단백질에 비해 mCas3 단백질에 의한 ATP의 가수분해를 하향-조정하거나 또는 wtCas3 단백질에 비해 mCas3 단백질에 대한 ATP의 결합을 하향-조정한다. 추가 실시양태에서, mCas3 단백질은 wtCas3 단백질에 비해 ssDNA에 대한 mCas3 단백질의 결합을 하향-조정하거나, wtCas3 단백질에 비해 mCas3 단백질에 의한 ATP의 가수분해를 하향-조정하거나 또는 mCas3 단백질에 대한 ATP의 결합을 하향-조정하는 하나 이상의 돌연변이의 조합을 포함한다.

추가 실시양태는 캐스케이드 핵단백질 복합체 (예를 들어, 캐스케이드 RNP 복합체)의 Cas 단백질의 코딩 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 공유적으로 연결된 mCas3 단백질에 대한 코딩 서열을 포함한다. 이러한 Cas 단백질은 Cse2, Cas8 단백질, Cas7 단백질, Cas6, 및 Cas5 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

일부 실시양태에서, wtCas3 단백질은 이. 콜라이 유형 1 CRISPR Cas3 단백질이다. 다른 실시양태에서, wtCas3 단백질은 슈도모나스 종 S-6-2, 써모비피다 푸스카, 사카로모노스포라 비리디스, 써모모노스포라 쿠르바타, 스트렙토미세스 아베르미틸리스, 스트렙토미세스 보트로펜시스, 써무스 써모필루스, 비브리오 콜레라, 살모넬라 엔테리카, 게오써모박터 종 EPR-M, 메타노셀라 아르보리자에 MRE50, 및 스트렙토코쿠스 써모필루스 (균주 ND07)로 이루어진 군으로부터 선택된 wtCas3 단백질이다.

이. 콜라이 유형 1 CRISPR wtCas3 단백질의 경우에, 하나 이상의 돌연변이는 D452H, A602V, 또는 D452H 및 A602V를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

추가 실시양태에서, 세포를 DNA를 포함하며, 여기서 세포는 진핵 세포 (예를 들어, 인간 세포)일 수 있다.

부가 실시양태에서, 본 발명은 mCas3 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, mCas3 단백질 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트, mCas3 단백질 코딩 서열을 포함하는 플라스미드, 및 mCas3 단백질을 포함하는 캐스케이드 핵단백질 복합체를 포함한다.

제9 측면에서, 본 발명은 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 세포 또는 생화학적 반응 내로의 도입을 위해 하나 이상의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 제공하는 단계; 및 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입함으로써, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 폴리뉴클레오티드의 접촉을 용이하게 하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, dsDNA) 내의 핵산 표적 서열에 결합하는 방법을 포함한다. 상기 복합체와 폴리뉴클레오티드가 접촉하면, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체가 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열(들)에 결합하게 된다.

한 실시양태에서, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열에 상보적인 가이드를 포함한다. 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열에 결합한다.

추가 실시양태에서, 제1 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 폴리뉴클레오티드 내의 제1 핵산 표적 서열에 상보적인 가이드를 포함하고, 제2 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 폴리뉴클레오티드 내의 제2 핵산 표적 서열에 상보적인 가이드를 포함한다. 제1 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 제1 핵산 표적 서열에 결합하고, 제2 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 폴리뉴클레오티드 내의 제2 핵산 표적 서열에 결합한다.

또한 또 다른 실시양태에서, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열에 상보적인 가이드를 포함하고, 이러한 복합체와 연합될 수 있는 dCas3* 융합 단백질을 추가로 포함한다. 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열에 결합하고, 이펙터 복합체는 이러한 복합체와 연합된 dCas3* 융합 단백질을 포함한다.

이러한 핵산 표적 서열에 결합하는 방법은 시험관내에서 (예를 들어, 생화학적 반응에서 또는 배양된 세포에서; 일부 실시양태에서, 배양된 세포는 배양물 중에 유지되고 인간에게 도입되지 않은 인간 배양된 세포임); 생체내에서 (예를 들어, 살아있는 유기체의 세포에서, 단 일부 실시양태에서, 유기체는 비-인간 유기체임) 또는 생체외에서 (예를 들어, 대상체로부터 제거된 세포, 단 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체를 포함하고, 다른 실시양태에서 대상체는 비-인간 대상체임) 수행될 수 있다.

하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 핵산 서열과 폴리펩티드 사이의 상호작용을 평가하고/거나 정량화하기 위한 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다: 면역 침전 (ChIP) 검정, DNA 전기영동 이동성 시프트 검정 (EMSA), DNA 풀- 다운 검정, 및 마이크로 플레이트 포획 및 검출 검정. 상업적 키트, 물질 및 시약은 이러한 많은 방법을 실시하는데 이용할 수 있으며, 예를 들어, 하기 공급업자로부터 수득될 수 있다: 써모 사이언티픽 (Thermo Scientific; 미국 델라웨어주 윌밍턴), 시그노시스 (Signosis; 미국 캘리포니아주 산타 클라라), 바이오-래드 (Bio-Rad; 미국 캘리포니아주 헤라클레스), 및 프로메가 (Promega; 미국 위스콘신주 매디슨). 폴리펩티드와 핵산 서열 사이의 상호작용을 검출하는 통상의 접근법은 EMSA이다 (예를 들어, 문헌 [Hellman L.M., et al., Nature Protocols 2:1849-1861 (2007)] 참조).

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 세포 또는 생화학적 반응 내로의 도입을 위해 하나 이상의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 제공하는 단계; 및 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입함으로써, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 폴리뉴클레오티드의 접촉을 용이하게 하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열을 커팅하는 (예를 들어, dsDNA에서의 단일-가닥 커트 또는 dsDNA에서의 이중-가닥 커트) 방법을 포함한다.

한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 내의 제1 핵산 표적 서열에 상보적인 가이드 및 제1 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, FokI)을 포함하는 제1 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (도 15a, 캐스케이드1, 실선 아웃라인 박스, 링커 폴리펩티드, 흑색 곡선을 통해 부채꼴로서 나타낸 제1 뉴클레아제 도메인에 연결됨), 및 폴리뉴클레오티드 내의 제2 핵산 표적 서열에 상보적인 가이드 및 제2 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, FokI)을 포함하는 제2 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (도 15a, 캐스케이드 2, 파선 아웃라인 박스, 링커 폴리펩티드, 흑색 곡선을 통해 부채꼴로서 나타낸 제2 뉴클레아제 도메인에 연결됨)가 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입된다. 제1 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (도 15b, 캐스케이드1)는 dsDNA (도 15b, 쌍형성된, 수평 흑색 선으로 나타낸 dsDNA) 내의 제1 핵산 표적 서열에 결합하고, 제1 뉴클레아제 도메인은 dsDNA의 제1 가닥을 절단하며 (도 15c, 캐스케이드1), 제2 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (도 15b, 캐스케이드2)는 dsDNA 내의 제2 핵산 표적 서열에 결합하고, 제2 뉴클레아제 도메인은 dsDNA의 제2 가닥을 절단한다. 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 결합은 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체에 의한 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, dsDNA) 내의 핵산 표적 서열의 커팅을 초래한다.

부가 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 내의 제1 핵산 표적 서열에 상보적인 가이드를 포함하는 제1 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체, 폴리뉴클레오티드 내의 제2 핵산 표적 서열에 상보적인 가이드를 포함하는 제2 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체, 및 Cas3 닉카제 (예를 들어, 닉카제 활성만을 갖는 ATPase-결핍성 Cas3 변이체)가 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입된다. 제1 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 dsDNA 내의 제1 핵산 표적 서열에 결합하고, Cas3 닉카제 단백질은 제1 복합체와 연합되며, dsDNA의 제1 가닥을 절단하고, 제2 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 dsDNA 내의 제2 핵산 표적 서열에 결합하고, Cas3 닉카제 단백질은 제2 복합체와 연합되며, dsDNA의 제2 가닥을 절단한다. 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 연합된 Cas3 닉카제 단백질과의 결합은 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체에 의한 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, dsDNA) 내의 핵산 표적 서열의 커팅을 초래한다. 실시예 25A, 실시예 25B, 및 실시예 25C는 Cas3 ATPase 결핍성 돌연변이체 단백질을 포함하는 캐스케이드 RNP 복합체가 쌍형성된 닉킹을 통해 표적화된 게놈 결실을 유도할 수 있다는 것을 입증하는 데이터를 제시한다. 이러한 쌍형성된 닉킹은 숙주 세포 (예를 들어, 인간 세포)의 게놈에서의 표적화된 결실을 용이하게 할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열에 상보적인 가이드 및 제1 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, FokI)을 포함하는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (도 16a, 캐스케이드; 파선 아웃라인 박스, 링커 폴리펩티드, 흑색 곡선을 통해 부채꼴로서 나타낸 제1 뉴클레아제 도메인에 연결됨), 및 복합체와 연합될 수 있는 dCas3*-제2 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, FokI) 융합 단백질 (도 16a, dCas3; 실선 아웃라인 박스, 링커 폴리펩티드, 흑색 곡선을 통해 부채꼴로서 나타낸 제2 뉴클레아제 도메인에 연결됨)가 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입된다. 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (도 16b, 캐스케이드)는 dsDNA (도 16b, 쌍형성된, 수평, 흑색 선) 내의 핵산 표적 서열에 결합하고, dsDNA의 제1 가닥을 절단하며 (도 16c, 캐스케이드), dCas3* 융합 단백질은 캐스케이드 RNP 복합체와 연합되고 (도 16b, dCas3*), dsDNA의 제2 가닥을 절단한다 (도 16c, dCas3*).

추가 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열을 포함하는 표적 영역에 상보적인 가이드 및 복합체와 연합할 수 있는 Cas3 단백질 (예를 들어, Cas3 단백질 또는 mCas3 단백질)을 포함하는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체가 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입된다. 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 dsDNA 내의 핵산 표적 서열에 결합하고, Cas3 단백질 (예를 들어, Cas3 단백질 또는 mCas3 단백질)은 복합체와 연합되며, 표적 영역 내의 dsDNA의 적어도 하나의 가닥을 절단한다. 일부 실시양태에서, mCas3 단백질에 의한 dsDNA의 절단은 dsDNA의 표적 영역에서의 결실을 초래한다. 이러한 방법은 특이적 길이의 장거리 결실을 만드는데 사용될 수 있으며, 유전자 녹아웃 또는 녹인의 창출에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas3 단백질 (예를 들어, Cas3 단백질 또는 mCas3 단백질)은 캐스케이드 복합체 서브유닛 단백질 (예를 들어, Cas7 단백질, Cas8 단백질, Cas5 단백질, Cse2 단백질)와 융합될 수 있다. 실시예 23A 내지 실시예 23C는 mCas3 단백질의 실시양태를 설명한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 뉴클레아제 도메인이 캐스케이드 복합체 단백질 (예를 들어, 실시예 11A, 표 38 참조) 또는 dCas3* 단백질 (예를 들어, DNase와 융합된 dCas3* 단백질)과 융합되어 핵산 표적 서열을 결실시키는, 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 사용하는 것에 관한 것이다. 이러한 방법은 dsDNA의 표적 영역에서 커트 뿐만 아니라 결실을 만드는데 사용될 수 있으며 유전자 녹아웃의 창출에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 캐스케이드 복합체 서브유닛 단백질, 예컨대 Cas7 단백질, Cas8 단백질, Cas5 단백질, Cse2 단백질과 융합될 수 있다.

폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열을 커팅하는 방법은 공여자 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하여 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분을 세포의 gDNA 내로 혼입하는 것을 용이하게 하기 위한 것을 추가로 포함할 수 있다.

도 17a는 폴리뉴클레오티드 내의 제1 핵산 표적 서열 (도 17a, 캐스케이드1)에 상보적인 가이드 및 제1 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, FokI)을 포함하는 제1 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (도 17a, 캐스케이드1과 회색의 부채꼴을 연결하는 구부러진 선으로서 예시된 링커 폴리펩티드), 및 폴리뉴클레오티드 내의 제2 핵산 표적 서열 (도 17a, 캐스케이드 2)에 상보적인 가이드 및 제2 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, FokI)을 포함하는 제2 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (도 17a, 캐스케이드2와 회색의 부채꼴을 연결하는 구부러진 선으로서 예시된 링커 폴리펩티드)에 의해 절단되는 dsDNA (도 17a, 쌍형성된, 진한 수평선)의 두 가닥의 예를 예시한다. 도 17b는 이중-가닥 커트 부위 (도 18b, 공여자, 파선)에 인접한 DNA 서열에 상보적인 상동성 아암을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드 (도 17b, 캐스케이드2 위에 제시된 쌍형성된, 파선)를 예시한다. 도 17c는 이중-가닥 커트 부위의 영역 내에 공여자 폴리뉴클레오티드 (도 17c, dsDNA를 나타내는 쌍형성된, 진한, 수평선을 연결하는 쌍형성된, 파선)의 일부분을 혼입하는 것을 예시한다. 공여자 폴리뉴클레오티드를 혼입하는 것은 세포성 DNA 복구 메카니즘 (예를 들어, HDR)에 의해 매개된다 (도 17b 내지 도 17c, 아래쪽을 가리키는, 수직 화살표는 세포성 DNA 복구 메카니즘을 나타냄).

다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 내의 제1 핵산 표적 서열에 상보적인 가이드 및 제1 뉴클레아제 도메인을 포함하는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 제2 뉴클레아제 도메인을 포함하는 제2 구성성분과 쌍형성될 수 있으며, 여기서 제2 구성성분은 폴리뉴클레오티드 내의 제2 핵산 표적 서열에 결합할 수 있다. 이러한 제2 구성성분의 예는 제2 뉴클레아제 도메인을 포함하는 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 제2 뉴클레아제 도메인을 포함하는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 또는 제2 뉴클레아제 도메인을 포함하는 dCas9/NATNA 복합체를 포함한다.

한 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, gDNA)의 특정 영역은 표적 폴리뉴클레오티드 내의 제1 핵산 표적 서열에 상보적인 가이드를 포함하는 캐스케이드 복합체와, NATNA가 표적 폴리뉴클레오티드 내의 제2 핵산 표적 서열에 상보적인 스페이서 서열을 포함하는 dCas9/NATNA 복합체의 조합을 사용하여 결실될 수 있다. 제1 및 제2 핵산 표적 서열은 결실을 위해 표적화된 핵산 표적 서열을 플랭킹하도록 선택된다. 활동적 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 Cas3 단백질은 캐스케이드 복합체와 연합된 다음, 결실을 위해 표적화된 핵산 표적 서열을 포함하는 dsDNA의 단일 가닥을 점진적으로 결실시킨다. Cas3 단백질이 dCas9/NATNA 복합체와 충돌하는 경우 (즉, "로드블록"), Cas3 뉴클레아제 활성은 dCas9/NATNA 복합체에 의해 제2 핵산 표적 서열에서 중지될 수 있다. 도 21a 내지 도 21d는 핵산 표적 서열의 Cas3 결실의 예를 예시한다. 도 21a는 결실을 위해 표적화된 핵산 표적 서열을 플랭킹하는 핵산 표적 서열 1 (도 21a, NATS1) 및 핵산 표적 서열 2 (도 21a, NATS2)를 포함하는 dsDNA (도 21a, 쌍형성된, 수평, 흑색 선)를 제시한다. 도 21a는 NATS1에 상보적인 가이드를 포함하는 캐스케이드 복합체 (도 21a, 캐스케이드; 흑색 선 프레임드 직사각형), Cas3 단백질 (도 21a, Cas3; 회색 부채꼴), 및 NATS2에 상보적인 스페이서를 포함하는 dCas9/NATNA 복합체 (도 21a, dCas9; 파선 프레임드 직사각형)를 제시한다. 도 21b는 NATS1에 대한 캐스케이드 복합체의 결합, 캐스케이드 복합체와 Cas3 단백질의 연합, 및 NATS2에 대한 dCas9/NATNA 복합체의 결합을 제시한다. 도 21c는 결실을 위해 표적화된 핵산 표적 서열의 단일 가닥의 Cas3에 의한 점진적인 결실을 예시한다. 도 21d는 NATS2에 결합된 dCas9/NATNA 복합체의 위치에서 dsDNA로부터의 Cas3 단백질의 해리를 제시한다. 실시예 24A 내지 실시예 24D는 캐스케이드 핵단백질 복합체와 연합된 Cas3 단백질에 의해 매개된 결실의 길이를 제어하기 위해 단백질 로드블록을 사용하는 것을 뒷받침하는 데이터를 제시하므로; 세포 (예를 들어, 인간 세포)의 gDNA에서 규정된 길이를 갖는 결실의 형성을 용이하게 하기 위해 캐스케이드 핵단백질 복합체와 연합된 Cas3 단백질을 사용하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, gDNA)의 특정 영역은 표적 폴리뉴클레오티드 내의 제1 핵산 표적 서열에 상보적인 가이드를 포함하는 제1 캐스케이드 복합체와 표적 폴리뉴클레오티드 내의 제2 핵산 표적 서열에 상보적인 가이드를 포함하는 제2 캐스케이드 복합체의 조합을 사용하여 결실될 수 있다. 제1 및 제2 핵산 표적 서열은 결실을 위해 표적화된 핵산 표적 서열을 플랭킹하도록 선택된다. 활동적 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 Cas3 단백질은 각각의 캐스케이드 복합체와 연합된 다음, 결실을 위해 표적화된 핵산 표적 서열의 두 가닥을 점진적으로 결실시킨다. 각각의 Cas3 단백질이 캐스케이드 복합체 중 하나와 충돌하는 경우에, Cas3 뉴클레아제 활성은 캐스케이드 복합체에 의해 제1 및 제2 핵산 표적 서열에서 중지될 수 있다. 도 22a 내지 도 22d는 핵산 표적 서열의 두 가닥의 Cas3 결실의 예를 예시한다. 도 22a는 결실을 위해 표적화된 핵산 표적 서열을 플랭킹하는 핵산 표적 서열 1 (도 22a, NATS1) 및 핵산 표적 서열 2 (도 22a, NATS2)를 포함하는 dsDNA (도 22a; 쌍형성된, 수평, 흑색 선)를 제시한다. 도 22a는 NATS1에 상보적인 가이드를 포함하는 제1 캐스케이드 복합체 (도 22a, 캐스케이드1; 흑색 선 프레임드 직사각형), Cas3 단백질 (도 22a, Cas3; 회색 부채꼴), 및 NATS2에 상보적인 가이드를 포함하는 제2 캐스케이드 복합체 (도 22a, 캐스케이드2; 파선 프레임드 직사각형)를 제시한다. 도 22b는 NATS1 및 NATS2에 대한 캐스케이드 복합체의 결합 뿐만 아니라 캐스케이드 복합체와 Cas3 단백질의 연합을 제시한다. 도 22c는 결실을 위해 표적화된 핵산 표적 서열의 두 가닥의 Cas3에 의한 뉴클레아제 분해 및 DNA를 따라 이동하는 것으로부터 비롯되는 점진적인 결실을 예시한다. 도 22d는 NATS1 및 NATS2에 결합된 캐스케이드 복합체의 위치에서 dsDNA로부터의 Cas3 단백질의 해리를 제시한다.

추가 실시양태에서, 캐스케이드 복합체는 Cas3 단백질에 결합할 수 없도록 변형될 수 있고, 이러한 변형된 캐스케이드 복합체는 캐스케이드 RNP 복합체와 연합하여 촉매적으로 활성인 Cas3에 의한 DNA의 점진적인 분해를 중지시키기 위해 본질적으로 도 21a 내지 도 21d에 예시된 바와 동일한 방식으로 로드블록으로서 작용할 수 있다. 부가의 부위-특이적 결합 단백질 (예를 들어, 전사 활성화제 유사 이펙터 (TAL), 또는 징크 핑거 (ZnF) DNA 결합 단백질)이 유사한 방식으로 로드블록으로서 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 핵산 표적 서열은 dsDNA (예를 들어, 게놈 DNA)이다. 일부 실시양태에서, 핵산 표적 서열은 이중-가닥이고, 이러한 가닥 중 하나 또는 둘 다가 커팅된다. 이러한 핵산 표적 서열을 커팅하는 방법은 시험관내에서, 생체내에서 또는 생체외에서 수행될 수 있다.

상기 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서 본 발명은 하나 이상의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 숙주 세포 내로 도입하여, 공여자 폴리뉴클레오티드의 존재 하에 dsDNA 내의 핵산 표적 서열의 절단을 용이하게 하는 것에 관한 것이며, 여기서 하나 이상의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 숙주 세포 DNA의 핵산 표적 서열을 포함하는 표적 영역 내에 커트 부위를 생성함으로써 (또는 부위를 커팅하고 결실과 연합됨), 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분이 표적 영역 내로 삽입되는 것을 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, 커트 부위는 표적 영역에서의 이중-가닥 파손이다 (예를 들어, 각각 스페이서 및 Cas 단백질과 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI)를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 2개의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 또는 각각 Cas3 단백질 또는 mCas3 단백질과 연합되는 스페이서를 포함하는 2개의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 사용하는 경우). 일부 실시양태에서, 커트 부위는 표적 영역에서의 단일-가닥 파손이다 (예를 들어, mCas3 단백질과 연합된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 사용하는 경우). 다른 실시양태에서, 커트 부위는 표적 영역에서의 결실이다 (예를 들어, Cas3 또는 mCas3 단백질과 연합된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 사용하는 경우).

상동성-지정 복구 (HDR)를 입증하기 위해, FokI-Pse캐스케이드 RNP 복합체가 인간 게놈 내의 4개의 로커스 (WDR92, B2M, CCR5, 및 TRAC)를 표적화하도록 최소 CRISPR 어레이를 설계하였다. 최소 CRISPR 어레이는 3개의 올리고뉴클레오티드 (서열식별번호: 1513 내지 서열식별번호: 1515; 실시예 20A) 및 "반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부" 서열을 코딩하는 고유한 프라이머를 사용하여 PCR-기반 어셈블리로 생성되었으며, 여기서 제1 및 제2 스페이서는 FokI-Pse캐스케이드 RNP 복합체가 인접한 핵산 표적 서열을 지정하도록 하여 FokI 이량체화 및 게놈 절단 (즉, 커트 부위의 생성)을 가능하게 한다.

커트 부위를 포함하는 표적 영역에서의 각각의 HDR 삽입 부위 (이러한 경우에 커트 부위와 중복됨)에 대해, 세포를 하기로 형질감염시켰다: FokI의 N 말단과 연결된 NLS를 갖는 Cas8의 N-말단과 융합된 FokI를 포함하는 FokI-Pse캐스케이드 복합체 단백질 구성성분을 코딩하는 벡터 3 μg, 150 ng의 최소 CRISPR 어레이, 및 HDR을 위한 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (ssODN) 주형 공여자 폴리뉴클레오티드 0-60 pmol. ssODN은 상동성 아암을 포함하였고, 각각의 상동성 아암은 75개 뉴클레오티드였으며, 2개의 아암은 커트 부위 주위에 대칭적으로 위치되었다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 이러한 공여자 폴리뉴클레오티드의 세포성 분해를 감소 또는 방지하기 위해 상동성 아암의 3' 말단 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 결합을 추가로 포함하였다. 포스포티오에이트 결합의 5'에서 공여자 폴리뉴클레오티드는 2개의 중지 코돈을 삽입하고 복구된 염색체에서 인터스페이서 거리를 증가시킴으로써, FokI-Pse캐스케이드 RNP 복합체 재절단을 방해하기 위해 "TAATAAT"의 삽입 서열을 추가로 포함하였다.

HDR을 가능하게 하기 위해 ssODN이 혼합물에 포함되었다는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 20B에 기재된 바와 같이 HEK293 세포에서 형질감염을 수행하였다. 형질감염한지 며칠 후, gDNA를 세포로부터 정제하고, 엑소뉴클레아제로 처리하여 후속 PCR을 오염시킬 수 있는 임의의 잔여 ssODN을 제거한 다음, 이를 증폭을 위한 주형으로서 사용하여 공여자 삽입을 측정하였다. 심층 시퀀싱 분석은 본질적으로 실시예 20C에 기재된 바와 같이 수행되었다. 이러한 실험으로부터의 총 판독값 중에서 돌연변이체 판독값의 백분율이 표 13에 제시되어 있다 (제1 열은 ssODN의 pmol임):

돌연변이체 판독값의 백분율은 비-상동 단부 결합으로부터 비롯되는 indel 뿐만 아니라 "TAATAAT" HDR 서열의 삽입을 함유하는 돌연변이체 판독값을 나타낸다.

이러한 실험으로부터의 총 돌연변이체 판독값 중에서, "TAATAAT" 삽입 서열 만을 함유하는 HDR 판독값의 백분율이 표 14에 제시되어 있다 (제1 열은 ssODN의 pmol임):

데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 캐스케이드 RNP 복합체에 의한 dsDNA의 절단은 HDR을 가능하게 하고 인간 게놈 전체에 걸친 다수의 로커스에서 공여자 폴리뉴클레오티드의 혼입을 가능하게 한다.

또한 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입하기 위한 하나 이상의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (예를 들어, Cas 서브유닛 단백질-시티딘 데아미나제 융합 단백질을 포함함)를 제공하는 단계, 및 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체(들)를 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입함으로써, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체(들)와 폴리뉴클레오티드의 접촉을 용이하게 하여, 핵산 표적 서열(들)의 돌연변이 (예를 들어, C에서 T로 , G에서 A로, A에서 G로, 및 T에서 C로의 돌연변이)를 용이하게 하는 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열(들)에 대한 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체(들)의 결합을 초래하는 단계를 포함하는, 세포 또는 생화학적 반응에서 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) 내의 하나 이상의 핵산 표적 서열을 변형시키는 방법을 포함한다. 도 18a 내지 도 18d는 세포의 gDNA 내의 표적 뉴클레오티드를 돌연변이시키기 위해 Cas 서브유닛 단백질-링커 폴리펩티드-시티딘 데아미나제 융합 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체 (캐스케이드/CD 복합체)를 사용하는 것의 예를 예시한다 (도 18a, 쌍형성된, 진한 수평선, 시토신의 경우에 "C" 및 구아닌의 경우에 "G"를 수반함). 캐스케이드/CD 복합체 (도 18a; 회색의 부채꼴로서 나타낸 시티딘 데아미나제 "CD"와 캐스케이드를 연결하는 구부러진 선으로서 예시된 링커 폴리펩티드를 갖는 "캐스케이드")가 세포 내로 도입된다. 캐스케이드/CD 복합체는 표적 시토신 (도 18b, "C")에 인접한 DNA 표적 서열에 상보적인 가이드를 포함한다. 도 18b에서, 캐스케이드/CD 복합체는 DNA 표적 서열에 결합하고 시티딘 데아미나제는 시토신 (도 18b, "C")을 우라실 (도 18c, "U")로 전환시킨다. 이어서, 세포성 복구 메카니즘은 우라실을 티미딘으로 복구할 수 있고, 미스매치된 구아니딘을 아데닌으로 변화시킬 수 있다 (도 18c 내지 도 18d, 아래쪽을 가리키는, 수직 화살표는 세포성 DNA 복구 메카니즘을 나타냄).

또한 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 시험관내 또는 생체내 전사, 예를 들어, 조절 요소 서열을 포함하는 유전자의 전사를 조정하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입하기 위한 하나 이상의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (예를 들어, Cas 서브유닛 단백질-전사 인자 융합 단백질을 포함함)를 제공하는 단계, 및 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체(들)를 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입함으로써, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체(들)와 조절 요소 서열의 접촉을 용이하게 하여, 조절 요소 서열에 대한 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체(들)의 결합을 초래함으로써 조절 요소 서열을 포함하는 유전자의 시험관내 또는 생체내 전사를 조정하는 것을 용이하게 하는 단계를 포함한다.

도 19a 및 도 19b는 일반 유전자 ("유전자1")의 전사 활성화를 위한 예의 일반적 예시를 제시한다. 도 19a는 진핵 세포에서 내인성 유전자의 전사 조절의 개요를 제공한다. 도 19a에서, 2개의 진한 평행선은 이중-가닥 DNA를 나타내며, 유전자 1 (도 19a, 유전자 1)의 위치 뿐만 아니라 유전자 1과 연합된 전사 시작 부위 (도 19a, TSS)가 표시된다. 도 19a의 제1 패널에서, 유전자 1의 전사 활성화에 필요한 전사 인자 (도 19a, TF) 및 폴리머라제 II (도 19a, Pol II)는 아직 유전자1-TSS와 연합되지 않은 것으로 예시되어 있다. 제2 패널은 TF와 그의 동족 TSS의 연합을 예시한다. 이어서, TF는 전사 활성화 단백질 (도 19a, TP)을 동원하여 RNA 폴리머라제 II (도 19a, Pol II)를 동원한다. 전형적으로, 진핵 생물에서 TF 인자와 TP는 다수의 단백질과 가능한 다른 분자를 포함하는 복합체를 형성한다. 제3 패널은 이로써 생성되는, Pol II에 의한 유전자 1의 전사를 예시한다 (도 19a, 유전자 1의 단부에 구부러진 화살표는 전사의 방향을 표시함). 이러한 유형의 전사 활성화는 전형적으로, 유전자(들)의 발현에 특이적인 TF(들)에 의존적이다. 도 19b는 본 발명의 한 실시양태의 예시를 제시하며, 여기서 캐스케이드 복합체는 전사 활성화를 담당하는 세포 내의 하나 이상의 구성성분 (전사 활성화 인자; 도 19b, TA)을 끌어당기는 단백질 또는 인자를 포함하도록 조작된다 (도 19b, 캐스케이드a). 이러한 단백질 또는 인자의 한 예는 단백질 VP64이다. 캐스케이드a는 TSS (도 19b, TSS) 또는 그 근처에서 결합할 수 있는 가이드를 포함한다. 도 19b에서, 2개의 진한 평행선은 이중-가닥 DNA를 나타내며, 유전자 1 (도 19b, 유전자 1)의 위치 뿐만 아니라 유전자 1과 연합된 전사 시작 부위 (TSS)가 표시된다. 도 19b의 제1 패널에서, 캐스케이드a 및 폴리머라제 II (도 19b, Pol II)는 아직 유전자1-TSS와 연합되지 않은 것으로 예시되어 있다. 제2 패널은 캐스케이드a와 그의 표적인 TSS의 연합을 예시한다. 이어서, 캐스케이드a는 전사 활성화 단백질 (도 19b, TA)을 동원한 다음, RNA 폴리머라제 II (도 19b, Pol II)를 동원한다. 제3 패널은 이로써 생성되는, Pol II에 의한 유전자 1의 전사를 예시한다 (도 19b, 유전자 1의 단부에 구부러진 화살표는 전사의 방향을 표시함). 이러한 본 발명의 실시양태의 한 가지 이점은 유전자의 전사 활성화가 유전자의 TSS에 결합하는 내인성 전사 인자에 의존하지 않고, 오히려 유전자의 TSS가 적절한 캐스케이드 가이드의 선택에 의해 표적화될 수 있다는 것이다.

도 20a 및 도 20b는 유전자 1과 연합된 조절 서열 (도 20a, 프로모터)에 상보적인 가이드 및 Cas 서브유닛 단백질-KRAB 도메인 융합을 포함하는 캐스케이드 복합체 (도 20a, KRAB 도메인을 나타내는 원형 요소와 캐스케이드를 연결하는 구부러진 선으로서 예시된 링커 폴리펩티드를 갖는 캐스케이드i)를 사용하여 일반 유전자 (도 20a, 유전자 1)의 전사 저해에 대한 예의 일반적 예시를 제시한다. 조절 서열에 대한 캐스케이드i의 결합 (도 20b)은 유전자 1의 전사 저해를 초래한다 (도 20b, X에서 끝나는 진한 선은 전사 저해를 나타냄).

본원에 기재된 바와 같은, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는 키트 내로 혼입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 별도의 조성물로서 또는 임의적으로 구성성분의 화합성이 허용하는 경우에는 혼합물로서, 키트 요소를 유지하는 하나 이상의 용기와의 패키지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 또한 하기 부형제 중 하나 이상을 포함한다: 완충제, 완충 작용제, 염, 멸균 수성 용액, 보존제 및 그의 조합. 예시적인 키트는 하나 이상의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 및 하나 이상의 부형제, 또는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 하나 이상의 구성성분을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다.

더욱이, 키트는 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 조성물의 사용 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 하나 이상의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체, 또는 그의 구성성분을 만들거나 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 만들거나 제조하는 방법은 세포에서 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 생산하는 것 및 세포 용해물로부터 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 정제하는 것을 포함한다.

조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 조성물은 검출가능한 표지, 예컨대 검출가능한 시그널을 제공할 수 있는 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 검출가능한 표지의 예는 효소, 방사성 동위 원소, 특이적 결합 쌍의 구성원, 형광단 (FAM), 형광 단백질 (녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질, mCherry, tdTomato), 적합한 형광단 (증강된 GFP (eGFP), "스피나크")과 함께 DNA 또는 RNA 앱타머, 양자점, 항체 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다수의 다양한 적합한 검출가능한 표지는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.

일부 실시양태에서, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 (즉, 핵단백질 입자)는 뉴클레오펙션, 유전자 총 전달, 소노포레이션, 세포 압착, 리포펙션, 또는 다른 화학물질, 세포 침투 펩티드 등의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않는 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 다른 실시양태에서, 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 하나 이상의 구성성분에 대한 코딩 서열 및 연합된 단백질은 벡터 시스템, 상기 구성성분 중 하나 이상을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트 뿐만 아니라 상기 구성성분 중 하나 이상을 코딩하는 RNA 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 하나 이상의 RNA 분자 (예를 들어, mRNA)를 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태는 재조합 세포 (예를 들어, 변형된 림프구)를 생산하기 위한 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 용도에 관한 것이다. 상기 방법은 전형적으로, 숙주 세포에서의 핵산 표적 서열을 포함하는 표적 영역을 포함하는 dsDNA와 본 발명의 하나 이상의 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 접촉을 용이하게 하는 것을 포함한다. 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 핵산 표적 서열의 접촉은 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 핵산 표적 서열을 포함하는 표적 영역의 결합, 핵산 표적 서열을 포함하는 표적 영역의 절단, 및 표적 영역에서의 dsDNA의 변형을 초래하여, 재조합 세포를 생산한다. 일부 실시양태에서, dsDNA는 둘 이상의 핵산 표적 서열을 포함하며, 각각의 핵산 표적 서열에 상보적인 스페이서 서열을 포함하는 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체가 사용되어 각각의 핵산 표적 서열에 결합하고, 이를 커팅하며 변형시킨다. 일부 실시양태에서, 표적 영역의 변형은 삽입, 결실, 또는 삽입과 결실이다. 세포 내로 도입하기 위하여 하나 이상의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 제공하는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열을 커팅하는 방법 (예를 들어, dsDNA에서의 단일-가닥 커트 또는 dsDNA에서의 이중-가닥 커트)은 상기 기재되어 있다.

본 발명의 실시양태는 하나 이상의 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체를 사용하여 재조합 세포를 생산하는 것을 포함하며, 여기서 재조합 세포의 gDNA는 (예를 들어, B2M 유전자 및/또는 PDCD1 유전자의) 녹아웃 돌연변이, 녹인 (예를 들어, TRAC 로커스에서의 편집 및 공여자 폴리뉴클레오티드로부터의 CAR의 통합), 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, gDNA의 TRAC 유전자 내의 핵산 표적 서열에서의 절단에 이어 핵산 표적 서열에서 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분이 혼입된다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 CAR 구축물을 포함할 수 있으며, 여기서 CAR은 핵산 표적 서열에 삽입된다.

본 발명의 방법에 의해 만들어진 재조합 세포는 입양 세포 전달 (ACT)에 사용될 수 있다. ACT는 이식된 면역 세포를 사용하여 암을 치료하는 신속하게 부상하는 면역 요법 접근법이다. ACT는 세포를 환자에게 전달하는 것이다. 가장 통상적으로, 면역 세포는 면역 기능 개선을 목표로 면역 체계로부터 유래된다. 자가 암 면역 요법에서는, 환자로부터 면역 세포 또는 줄기 세포를 수거하여 생체외 배양을 통해 다량으로 확장한 다음, 이를 환자에게 되돌려 보낸다. 면역 세포 또는 줄기 세포는 배양에서 다양한 방식으로 변형될 수 있다 (예를 들어, CAR을 T 세포의 게놈에 혼입하기 위하여 게놈 편집을 사용함). 일부 실시양태에서, 변형을 위한 림프구는 대상체로부터 단리되고, 변형된 다음, 동일한 대상체 내로 재도입된다. 이러한 기술은 자가 림프구 요법으로서 공지되어 있다. 동종이계 암 면역 요법에서는, 단일 공여자로부터 유래되는 배양 확장된 면역 세포 또는 줄기 세포가 다수의 환자에게 치료를 제공한다. 이러한 면역 세포 또는 줄기 세포는 또한 배양에서 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 림프구는 단리되고, 변형되며, 상이한 대상체 내로 도입될 수 있다. 이러한 기술은 동종이계 림프구 요법으로서 공지되어 있다.

특정 실시양태에서, 이러한 면역 요법 방법은 T 세포, 자연 살해 세포 (NK 세포), B 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR-T 세포), T 세포 수용체 조작된 T 세포 (TCR), TCR CAR-T 세포, CAR TIL 세포, CAR-NK 세포, 조작된 NK 세포, 또는 림프구 세포를 생성하는 조혈 줄기 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 림프구를 활용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포는 줄기 세포, 수지상 세포 등이다. 이러한 세포의 게놈은 본 발명의 하나 이상의 조작된 클래스 I 유형 I 캐스케이드 이펙터 복합체를 사용함으로써 변형 (예를 들어, 림프구 세포 게놈에서 삽입 및/또는 결실의 생성)될 수 있다.

변형을 위한 림프구는 대상체, 예컨대 인간 대상체로부터, 예를 들어, 혈액으로부터 또는 TIL의 경우와 같은 고형 종양으로부터, 또는 림프 기관, 예컨대 흉선, 골수, 림프절 및 점막-연관 림프 조직으로부터 단리될 수 있다. 림프구를 단리하는 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 림프구는, 예를 들어, 혈액 층을 분리하는 친수성 폴리사카라이드인 피콜, 및 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 전혈로부터 분리되는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리될 수 있다. 일반적으로, 항응고제 또는 섬유소 제거된 혈액 표본은 피콜 용액 위에 층을 이루고 원심 분리하여 상이한 세포 층을 형성한다. 바닥 층은 적혈구 (적혈구)를 포함하며, 이는 피콜 배지에 의해 수집되거나 응집되어 바닥으로 완전히 가라 앉는다. 다음 층은 주로 과립구를 함유하며, 이는 또한 피콜-파크 용액을 통해 아래로 이동한다. 다음 층은 전형적으로, 단핵구 및 혈소판과 함께 혈장과 피콜 용액 사이의 계면에 있는 림프구를 포함한다. 림프구를 단리하기 위해, 이러한 층을 회수하고, 염 용액으로 세척하여 혈소판, 피콜 및 혈장을 제거한 다음, 다시 원심 분리한다. 또 다른 한편으론, 원심 분리 기술 (예를 들어, 셀세이버(CellSaver)® (해모네트릭스 (Haemonetrics; 미국 매사추세츠주 브레인트리)) 기계 또는 로보 자동화 세포 프로세싱 시스템 (프레세니우스 카비 유에스에이, 엘엘씨 (Fresenius Kabi USA, LLC; 미국 일리노이주 레이크 취리히)을 사용함)을 통해 공여자 혈액으로부터 세포를 단리될 수 있다.

림프구를 단리하는 다른 기술은 관심 세포를 항체 코팅된 플라스틱 표면에 결합하여 용액으로부터 세포 집단을 단리하는 바이오패닝을 포함한다. 이어서, 원치 않는 세포는 특이적 항체 및 보체로 처리하여 제거된다. 부가적으로, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 사용하여 림프구를 검출하고 계수할 수 있다. FACS 분석은 빛 산란 및 형광에 있어서의 차이에 기반하여 표지된 세포를 분리하는 유동 세포계수기를 사용한다.

TIL의 경우에, 림프구를 종양으로부터 단리하고, 예를 들어, 고용량 IL-2에서 성장시키고, 자가 종양 또는 HLA 매칭된 종양 세포주에 대항한 시토카인 방출 공동배양 검정을 사용하여 선택한다. 동종이계 비-MHC 매칭된 대조군과 비교해서 증가된 특이적 반응성의 증거가 있는 배양물이 신속한 확장을 위해 선택되고 암 치료를 위해 대상체 내로 도입된다 (예를 들어, 문헌 [Rosenberg, S., et al., Clin. Cancer Res. 17:4550-4557 (2011); Dudly, M., et al., Science 298:850-854 (2002); Dudly, M., et al., J. Clin. Oncol. 26:5233-5239 (2008); Dudley, M., et al., J. Immnother. 26:332-342 (2003)] 참조).

단리 시, 림프구는 특이성, 빈도 및 기능의 측면에서 특징규명될 수 있다. 자주 사용되는 검정은 T 세포 반응의 빈도를 측정하는 ELISPOT 검정을 포함한다.

일부 실시양태에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 공여자 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 기재된 바와 같은 다양한 방법에 의해 T 세포 또는 다른 림프계 세포를 단리할 수 있다. 이러한 세포는 또한 iPSC 세포로부터의 분화에 의해 단리될 수 있다.

단리 후, 림프구는 전문화된 이펙터 림프구로의 증식 및 분화를 촉진하기 위해 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 활성화될 수 있다. 활성화된 T 세포에 대한 표면 마커는, 예를 들어, CD3, CD4, CD8, PD1, IL2R 등을 포함한다. 활성화된 세포독성 림프구는 표적 세포의 표면 상에 동족 수용체를 결합한 후 표적 세포를 사멸시킬 수 있다. NK 세포에 대한 표면 마커는, 예를 들어, CD16, CD56 등을 포함한다.

단리 및 임의적으로 활성화 후, 원하는 특징을 제공하기 위해 림프구를 변형시킬 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 조작된 유형 I 캐스케이드 이펙터 복합체는 발현될 코딩 서열의 도입 및/또는 내인성 유전자 발현의 불활성화를 포함하나 이에 제한되지는 않는 게놈 변형을 도입하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 조작된 유형 I 캐스케이드 이펙터 복합체는 TRAC 유전자 (T 세포 수용체 α 상수를 코딩함), B2M 유전자 (β2 마이크로글로불린을 코딩함) 및/또는 PDCD1 유전자 (프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1을 코딩함; PD-1로서 공지되기도 함)를 편집하는데 사용될 수 있다.

T 세포 및 NK 세포는 본 발명의 방법에 의해 변형될 수 있는 림프구의 예이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 조작된 유형 I 캐스케이드 이펙터 복합체는 CAR을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드의 존재 하에 유전자의 표적 영역에 커트 부위를 도입하는데 사용될 수 있으며, 여기서 CAR은 림프구의 게놈의 표적 영역 내로 혼입된다. 부가 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 조작된 유형 I 캐스케이드 이펙터 복합체는 유전자의 발현을 방지하기 위해 녹아웃 돌연변이의 생성을 용이하게 하기 위해 유전자의 표적 영역에 커트 부위를 도입하는데 사용될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조작된 유형 I 캐스케이드 이펙터 복합체는 인간 iPSC 내로 게놈 변형을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 조작된 유형 I 캐스케이드 이펙터 복합체는 TRAC 유전자, B2M 유전자, 및/또는 PDCD1 유전자를 편집하는데 사용될 수 있다. 추가 실시양태에서, 조작된 유형 I 캐스케이드 이펙터 복합체는 공여자 폴리뉴클레오티드와 함께, 게놈 변형 및 코딩 서열, 예컨대 CAR 또는 시토카인 (예를 들어, IL2, IL15 등)을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 이어서, 변형된 iPSC 세포는 T 세포 및 NK 세포 또는 수지상 세포를 포함하는 성숙한 세포 유형으로 추가로 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 iPSC는 CAR-T 세포 및 CAR-NK 세포로 분화될 수 있다.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. CAR은 상동 재조합 ("녹인")을 통해 커트 부위를 포함하는 유전자 (예를 들어, TRAC 유전자)의 표적 영역으로의 삽입을 위해 표적화될 수 있다. 이러한 접근법의 이점은 표적화된 TRAC 유전자의 녹아웃을 제공할 수도 있다는 것이며; 즉, TRAC 유전자가 작동하지 않게 된다. CAR 구축물 내로 혼입될 수 있는 세포외 항원 인식 도메인의 예는 상기 기재되어 있다 (표 2 참조). 한 실시양태에서, 세포외 항원 인식 도메인은 CD19 결합 모이어티를 포함한다 (예를 들어, 항-CD19 scFv). 또 다른 실시양태에서, 세포외 항원 인식 도메인은 B-세포 성숙 항원 (BCMA) 결합 모이어티를 포함한다 (예를 들어, 항-BCMA scFv).

DNA의 표적 영역에서 커트 부위를 생성하는 것을 포함하는 본 발명의 방법의 실시양태에서, 상기 방법은 공여자 폴리뉴클레오티드를 변형된 세포 내로 도입함으로써, 변형된 세포의 커트 부위를 포함하는 표적 영역 내로의 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분의 삽입을 용이하게 하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 변형된 세포 내로 직접적으로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 벡터를 사용하여 도입된다. 벡터의 구축을 위한 일반적인 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 바이러스 벡터의 예는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스 I 또는 II, 파보바이러스, 세망 내피증 바이러스, 및 AAV 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 방법의 추가 실시양태는 B2M 유전자에 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 돌연변이는 B2M 유전자에서의 녹아웃 돌연변이이다.

본 발명의 방법의 추가 실시양태는 PDCD1 유전자에 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 돌연변이는 PDCD1 유전자에서의 녹아웃 돌연변이이다.

본 발명의 하나 이상의 조작된 유형 I 캐스케이드 이펙터 복합체에 의해 촉진되는 게놈 변형은 조작된 캐스케이드 복합체, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 플라스미드 또는 발현 카세트) 또는 이들의 혼합물을 숙주 세포 (예를 들어, 림프구) 내로 동시에 또는 일련으로 도입함으로써 수행될 수 있다.

변형된 림프구를 생산한 후, 림프구는 FACS, 미세유체-기반 스크리닝 플랫폼 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 방법, 예컨대 고 처리량 스크리닝 기술을 사용하여, 발현하는 세포 (예를 들어, 원하는 세포 표면 수용체를 발현함) 또는 발현하지 않는 세포 (예를 들어, 하나 이상의 조작된 유형 I 캐스케이드 이펙터 복합체를 사용하는 게놈 편집을 통해 그의 발현을 불활성화시킨 세포 표면 단백질)에 관하여 선택하기 위해 스크리닝될 수 있다. 이들 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Wojcik, M., et al., Int. J. Mol. Sci. 16:24918-24945 (2015)] 참조).

일단 생산되면, 변형된 림프구는 치료할 대상체에게 전달하기 위해 제약 조성물로 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 변형된 림프구 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 예시적인 부형제는 탄수화물, 무기 염, 항미생물제, 항산화제, 계면 활성제, 완충제, 산, 염기 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 주사용 조성물에 적합한 부형제는 물, 알콜, 폴리올, 글리세린, 식물성 오일, 인지질 및 계면 활성제를 포함한다. 탄수화물, 예컨대 당, 유도체화된 당, 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당, 및/또는 당 중합체가 부형제로서 존재할 수 있다. 구체적 탄수화물 부형제는, 예를 들어, 모노사카라이드, 예컨대 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 디사카라이드, 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 폴리사카라이드, 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대 만니톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 크실리톨, 소르비톨 (글루시톨), 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨 등을 포함한다. 부형제는 또한 무기 염 또는 완충제, 예컨대 시트르산, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 질산칼륨, 일염기성 인산나트륨, 이염기성 인산나트륨 및 그의 조합을 포함할 수 있다. 동결제 (예를 들어, 크리오스토르(CryoStor)® (바이오라이프 솔루션즈 인크 (BioLife Solutions Inc; 미국 워싱톤주 보셀)) CS2, CS5 또는 CS10 동결 배지)를 사용하여 저장 및 수송을 위해 세포를 동결시킬 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 또한 미생물 성장을 예방 또는 억제하기 위한 항미생물제를 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 항미생물제의 비-제한적인 예는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 벤질 알콜, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알콜, 페닐수은 니트레이트, 티메로살 및 그의 조합을 포함한다.

항산화제가 또한 제약 조성물에 존재할 수 있다. 산화를 방지하기 위해 항산화제가 사용되어, 제제의 림프구 또는 다른 구성성분의 악화를 방지한다. 본 발명에 사용하기 적합한 항산화제는, 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 차아인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 중아황산염 나트륨, 소듐 포름알데히드 술폭실레이트, 소듐 메타비술파이드 및 그의 조합을 포함한다.

계면 활성제가 부형제로서 존재할 수 있다. 예시적인 계면 활성제는 하기를 포함한다: 폴리소르베이트, 예컨대 TWEEN 20 및 TWEEN 80, 및 플루로닉, 예컨대 F68 및 F88 (BASF; 미국 뉴저지주 마운트 올리브); 소르비탄 에스테르; 지질, 예컨대 인지질, 예컨대 레시틴 및 다른 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 (바람직하게 리포솜 형태는 아니지만), 지방산 및 지방 에스테르; 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 및 아연 및 다른 이러한 적합한 양이온을 포함한다.

산 또는 염기가 제약 조성물에서 부형제로서 존재할 수 있다. 사용될 수 있는 산의 비-제한적인 예는 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 산을 포함한다. 적합한 염기의 예는 수산화나트륨, 아세트산나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 아세트산암모늄, 아세트산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨, 포름산나트륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 푸마르산칼륨 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

조성물 내의 림프구 (또는 다른 재조합 세포)의 양은 다수의 인자에 따라 달라질 수 있지만, 조성물이 단위 투여 형태 또는 용기 (예를 들어, 봉지)에 있을 때 최적의 치료상 유효 용량이 될 것이다. 치료상 유효 용량은 임상적으로 원하는 평가 항목을 산출하는 양을 결정하기 위해 증가하는 양의 조성물을 반복 투여함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.

조성물 중의 임의의 개별 부형제의 양은 부형제의 성질과 기능 및 조성물의 특별한 요구에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 임의의 개별 부형제의 최적 양은 일상적인 실험을 통해 결정되는데, 즉 다양한 양의 부형제 (낮은 양 내지 높은 양의 범위)를 함유하는 조성물을 제조하고, 안정성 및 다른 파라미터를 조사한 다음, 상당한 유해 효과 없이 최적의 성능이 달성되는 범위를 결정함으로써 결정된다. 그러나 일반적으로, 부형제(들)는 조성물에 약 1 중량% 내지 약 99 중량%, 바람직하게 약 5 중량% 내지 약 98 중량%, 보다 바람직하게 약 15 중량% 내지 약 95 중량%의 부형제의 양으로 존재할 것이며, 30 중량% 미만의 농도가 가장 바람직하다. 다른 부형제와 함께 이들 전술한 제약 부형제는 문헌 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy," current edition, Williams & Williams; the "Physician's Desk Reference," current edition, Medical Economics, Montvale, NJ; and Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, current edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C.]에 기재되어 있다.

제약 조성물은 의도된 전달 방식 및 사용 방식에 따라 주사기, 이식 장치 등에 수용될 수 있다. 바람직하게, 존재하는 조성물의 양은 미리 측정되거나 미리 패키징된 형태로 단일 용량에 적절하다.

본원의 제약 조성물은 임의적으로, 하나 이상의 부가 작용제, 예컨대 해당 암에 대한 대상체를 치료하거나 또는 치료로부터의 공지된 부작용을 치료하기 위해 사용되는 다른 의약을 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 시토카인을 혈류로 방출하여 위험할 정도로 고열과 갑작스런 혈압 강하를 유발할 수 있다. 이러한 병태는 시토카인 방출 증후군 (CRS)으로서 공지되기도 한다. 많은 환자에서, CRS는 스테로이드 및 면역 요법, 예컨대 IL-6 활성을 차단하는 토실리주맙 (악템라(Actemra)™, 제넨테크 (Genentech; 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코))을 포함한 표준 지원 요법으로 관리될 수 있다.

변형된 림프구 조성물을 사용한 치료의 적어도 하나의 치료상 유효 사이클이 대상체에게 투여될 것이다. "치료의 치료상 유효 사이클"은 투여될 때 해당 질환에 대한 개체의 치료에 대해 긍정적인 치료 반응을 가져 오는 치료의 사이클을 의도한다. "양성 치료 반응"은 본 발명에 따른 치료를 받고 있는 개체가 종양 감소 및/또는 림프구 요법에 대한 필요성 감소와 같은 개선을 포함하여, 질환의 한 가지 이상의 증상에 있어서의 개선을 나타내는 것으로 의도된다.

특정 실시양태에서, 림프구 또는 다른 의약을 포함하는 조성물의 다수의 치료상 유효 용량이 투여될 것이다. 본 발명의 조성물은 반드시는 아니지만 전형적으로, 주사, 예컨대 피하로, 피내로, 정맥내로, 동맥내로, 근육내로, 복강내로, 골수내, 종양내로, 결절내로를 통해, 주입에 의해 또는 국소적으로 투여된다. 제약 제제는 투여 직전에 액상 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 전술한 내용은 예시적인 것인데, 이는 부가의 투여 방식이 또한 고려되기 때문이다. 제약 조성물은 관련 기술분야에 공지된 임의의 의학적으로 허용되는 방법에 따라 동일하거나 상이한 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있다.

투여되는 실제 용량은 대상체의 연령, 체중 및 일반적인 상태 뿐만 아니라 치료되는 병태의 중증도, 의료 전문가의 판단, 및 투여되는 특별한 림프구에 따라 달라질 것이다. 치료상 유효량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있고, 각각의 특별한 경우의 특별한 요건에 따라 조정될 것이다.

일반적으로, 림프구의 치료상 유효량은 환자당 총 약 1 x 10⁵ 내지 약 1 x 10¹⁰개 림프구 또는 그 초과의 범위, 예컨대 1 x 10⁶ 내지 약 1 x 10¹⁰, 예를 들어, 1 x 10⁷ 내지 1 x 10⁹, 예컨대 5 x 10⁷ 내지 5 x 10⁸, 또는 이들 범위 내의 임의의 양일 것이다. 다른 투여량 범위는 체중 kg당 1x10⁴ 내지 1x10¹⁰개의 세포일 수 있다. 총 림프구 수는 단일 볼루스 용량으로 투여될 수 있거나, 또는 1일 이상의 간격으로 2회 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 림프구의 총 수는 단일 볼루스 용량으로 투여될 수 있거나, 또는 1일 이상의 간격으로 2회 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 투여되는 화합물의 양은 특이적 림프구 조성의 효능, 치료되는 질환 및 투여 경로에 의존할 것이다.

부가적으로, 용량은 림프구의 혼합물, 예컨대 CD8+ 세포와 CD4+ 세포의 혼합물을 포함할 수 있다. CD8+ 세포와 CD4+ 세포의 혼합물이 제공되는 경우에, CD8+ 세포 대 CD4+ 세포의 비는, 예를 들어, 1:1, 1:2 또는 2:1, 1:3 또는 3:1, 1:4 또는 4:1, 1:5 또는 5:1 등일 수 있다.

변형된 림프구는 다른 작용제 이전에, 동시에 또는 이후에 투여될 수 있다. 다른 작용제와 동시에 제공되는 경우에, 변형된 림프구는 동일하거나 상이한 조성물에 제공될 수 있다. 따라서, 림프구 및 다른 작용제는 동반 요법을 통해 개체에게 제시될 수 있다. "동반 요법"은 물질의 조합의 치료 효과가 요법을 받는 대상체에서 발생하도록 하는 대상체에 대한 의도된 투여이다. 예를 들어, 동반 요법은 변형된 림프구를 포함하는 제약 조성물의 용량, 및 특별한 투여 요법에 따라 조합하여 치료상 유효 용량을 포함하는 적어도 하나의 다른 작용제, 예컨대 또 다른 화학 요법제를 포함하는 제약 조성물의 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 유사하게, 변형된 림프구 및 치료제는 적어도 하나의 치료 용량으로 투여될 수 있다. 별도의 제약 조성물의 투여는 동시에 또는 상이한 시간에 (예를 들어, 동일한 날에 또는 상이한 날에 어느 한 순서로 순차적으로) 수행될 수 있으며, 단 이들 물질의 조합의 치료 효과가, 요법을 받는 대상체에서 야기되어야 한다.

본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 조작된 유형 I 캐스케이드 이펙터 복합체는 게놈 편집 도구를 제공한다. 게놈 편집을 위해 포유동물 세포에서 클래스 1 CRISPR-Cas 시스템의 기능적 재구성을 명확하게 보여주는 실험은, 이러한 간소화된 플라스미드 설계가 더 적은 단백질 구성성분과 고유한 PAM 요구 사항을 나타내는 시스템을 포함한 다른 클래스 1 CRISPR-Cas 시스템, 및 잠재적으로 심지어 유형 III CRISPR-Cas 시스템으로부터의 RNA 표적화 및 DNA 표적화 이펙터 복합체를 사용할 수 있다는 것을 보여준다 (예를 들어, 문헌 [Hille, F., et al., Cell 172:1239-1259 (2018); Tamulaitis, G., et al., Trends Microbiol. 25:49-61 (2017)] 참조). 캐스케이드 복합체의 다중 서브유닛 본성은 이펙터 융합물, 예컨대 합성 전사 인자, 후성유전자 변형제 및 염기 편집기의 다가 및/또는 입체적으로 정밀한 모집을 위한 잠재력을 제공한다. 또한, 유형 I 시스템으로부터의 완전한 DNA 간섭 경로의 이종 발현 (즉, Cas3 헬리카제-뉴클레아제의 게놈 표적 부위로의 캐스케이-매개 동원)을 이용하여 큰 DNA 결실을 생성하고, 상동성-지정 복구에 대한 긴 ssDNA 트랙을 노출시키고/거나 규정된 게놈 로커스에서 단백질-DNA 로드블록을 기계적으로 붕괴시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 조작된 클래스 1 CRISPR-Cas 시스템을 사용하여 큰 결실 영역을 생성할 수 있으며, 공여자 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 적절한 상동성 아암을 포함함)가 세포 내로 도입될 수 있어, 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분이 영역으로 삽입되는 것을 용이하게 할 수 있다.

본 발명의 실시양태는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

실시양태 1.

하기를 포함하는 조성물:

제1 Cse2 서브유닛 단백질, 제1 Cas5 서브유닛 단백질, 제1 Cas6 서브유닛 단백질, 및 제1 Cas7 서브유닛 단백질,

제1 Cas8 서브유닛 단백질 및 제1 FokI를 포함하며, 여기서 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단 또는 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단이 제1 링커 폴리펩티드에 의해 제1 FokI의 C-말단 또는 N-말단에 각각 공유적으로 연결되고, 여기서 제1 링커 폴리펩티드가 약 10개 아미노산 내지 약 40개 아미노산의 길이를 갖는 것인 제1 융합 단백질, 및

제1 핵산 표적 서열에 결합할 수 있는 제1 스페이서를 포함하는 제1 가이드 폴리뉴클레오티드

를 포함하는 제1 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체; 및

제2 Cse2 서브유닛 단백질, 제2 Cas5 서브유닛 단백질, 제2 Cas6 서브유닛 단백질, 및 제2 Cas7 서브유닛 단백질,

제2 Cas8 서브유닛 단백질 및 제2 FokI를 포함하며, 여기서 제2 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단 또는 제2 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단이 제2 링커 폴리펩티드에 의해 제2 FokI의 C-말단 또는 N-말단에 각각 공유적으로 연결되고, 여기서 제2 링커 폴리펩티드가 약 10개 아미노산 내지 약 40개 아미노산의 길이를 갖는 것인 제2 융합 단백질, 및

제2 핵산 표적 서열에 결합할 수 있는 제2 스페이서를 포함하며, 여기서 제2 핵산 표적 서열의 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)와 제1 핵산 표적 서열의 PAM이 약 20 bp 내지 약 42 bp의 인터스페이서 거리를 갖는 것인 제2 가이드 폴리뉴클레오티드

를 포함하는 제2 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체.

실시양태 2. 제1 링커 폴리펩티드가 약 15개 아미노산 내지 약 30개 아미노산의 길이를 갖는 것인, 실시양태 1의 조성물.

실시양태 3. 제1 링커 폴리펩티드가 약 17개 아미노산 내지 약 20개 아미노산의 길이를 갖는 것인, 실시양태 2의 조성물.

실시양태 4. 제2 링커 폴리펩티드가 약 15개 아미노산 내지 약 30개 아미노산의 길이를 갖는 것인, 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나의 조성물.

실시양태 5. 제2 링커 폴리펩티드가 약 17개 아미노산 내지 약 20개 아미노산의 길이를 갖는 것인, 실시양태 4의 조성물.

실시양태 6. 제1 링커 폴리펩티드와 제2 링커 폴리펩티드의 길이가 동일한 것인, 임의의 전술한 실시양태의 조성물.

실시양태 7. 제2 핵산 표적 서열 및 제1 핵산 표적 서열이 각각 약 22 bp 내지 약 40 bp의 인터스페이서 거리를 갖는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 조성물.

실시양태 8. 제2 핵산 표적 서열 및 제1 핵산 표적 서열이 각각 약 26 bp 내지 약 36 bp의 인터스페이서 거리를 갖는 것인, 실시양태 7의 조성물.

실시양태 9. 제2 핵산 표적 서열 및 제1 핵산 표적 서열이 각각 약 29 bp 내지 약 35 bp의 인터스페이서 거리를 갖는 것인, 실시양태 8의 조성물.

실시양태 10. 제2 핵산 표적 서열 및 제1 핵산 표적 서열이 각각 약 30 bp 내지 약 34 bp의 인터스페이서 거리를 갖는 것인, 실시양태 9의 조성물.

실시양태 11. 제1 FokI 및 제2 FokI가 연합하여 동종이량체를 형성할 수 있는 단량체성 서브유닛인, 임의의 전술한 실시양태의 조성물.

실시양태 12. 제1 FokI 및 제2 FokI가 연합하여 이종이량체를 형성할 수 있는 별개의 단량체성 서브유닛인, 실시양태 1 내지 10 중 어느 하나의 조성물.

실시양태 13. 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단이 제1 링커 폴리펩티드에 의해 제1 FokI의 C-말단에 공유적으로 연결되는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 조성물.

실시양태 14. 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단이 제1 링커 폴리펩티드에 의해 제1 FokI의 N-말단에 공유적으로 연결되는 것인, 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 조성물.

실시양태 15. 제2 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단이 제2 링커 폴리펩티드에 의해 제2 FokI의 C-말단에 공유적으로 연결되는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 조성물.

실시양태 16. 제2 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단이 제2 링커 폴리펩티드에 의해 제2 FokI의 N-말단에 공유적으로 연결되는 것인, 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나의 조성물.

실시양태 17. 제1 Cas8 서브유닛 단백질 및 제2 Cas8 서브유닛 단백질이 각각 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 조성물.

실시양태 18. 제1 Cse2 서브유닛 단백질 및 제2 Cse2 서브유닛 단백질이 각각 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 제1 Cas5 서브유닛 단백질 및 제2 Cas5 서브유닛 단백질이 각각 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 제1 Cas6 서브유닛 단백질 및 제2 Cas6 서브유닛 단백질이 각각 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 제1 Cas7 서브유닛 단백질 및 제2 Cas7 서브유닛 단백질이 각각 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 조성물.

실시양태 19. 제1 가이드 폴리뉴클레오티드가 RNA를 포함하는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 조성물.

실시양태 20. 제2 가이드 폴리뉴클레오티드가 RNA를 포함하는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 조성물.

실시양태 21. 게놈 DNA가 제2 핵산 표적 서열의 PAM 및 제1 핵산 표적 서열의 PAM을 포함하는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 조성물.

실시양태 22. 임의의 전술한 실시양태의 조성물을 포함하는 세포.

실시양태 23. 세포의 게놈 DNA가 제2 핵산 표적 서열의 PAM 및 제1 핵산 표적 서열의 PAM을 포함하는 것인, 실시양태 22의 세포.

실시양태 24. 세포가 원핵 세포인, 실시양태 22 또는 23의 세포.

실시양태 25. 세포가 진핵 세포인, 실시양태 22 또는 23의 세포.

실시양태 26. 실시양태 1 내지 21 중 어느 하나의 제1 Cse2 서브유닛 단백질, 제1 Cas5 서브유닛 단백질, 제1 Cas6 서브유닛 단백질, 제1 Cas7 서브유닛 단백질, 제1 융합 단백질 및 제1 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열.

실시양태 27. 실시양태 1 내지 21 중 어느 하나의 제2 Cse2 서브유닛 단백질, 제2 Cas5 서브유닛 단백질, 제2 Cas6 서브유닛 단백질, 제2 Cas7 서브유닛 단백질, 제2 융합 단백질 및 제2 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열.

실시양태 28. 실시양태 26, 실시양태 27, 또는 실시양태 26 및 실시양태 27의 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 카세트.

실시양태 29. 실시양태 28의 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 하나 이상의 벡터.

실시양태 30.

하기 단계를 포함하는, 제1 핵산 표적 서열 및 제2 핵산 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 결합하는 방법:

세포 또는 생화학적 반응 내로의 도입을 위해 실시양태 1 내지 21 중 어느 하나의 조성물을 제공하는 단계; 및

상기 조성물을 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입하며, 이로써 제1 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 제1 핵산 표적 서열의 접촉 및 제2 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 제2 핵산 표적 서열의 접촉을 용이하게 하여, 제1 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 제1 핵산 표적 서열의 결합 및 제2 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 폴리뉴클레오티드 내의 제2 핵산 표적 서열의 결합을 초래하는 단계.

실시양태 31. 게놈 DNA가 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 실시양태 30의 방법.

실시양태 32.

하기 단계를 포함하는, 제1 핵산 표적 서열 및 제2 핵산 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 커팅하는 방법:

세포 또는 생화학적 반응 내로의 도입을 위해 실시양태 1 내지 21 중 어느 하나의 조성물을 제공하는 단계; 및

상기 조성물을 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입하며, 이로써 제1 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 제1 핵산 표적 서열의 접촉 및 제2 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 제2 핵산 표적 서열의 접촉을 용이하게 하여, 제1 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체에 의한 제1 핵산 표적 서열의 커팅 및 제2 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체에 의한 제2 핵산 표적 서열의 커팅을 초래하는 단계.

실시양태 33. 게놈 DNA가 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 실시양태 32의 방법.

실시양태 34. 실시양태 1 내지 21 중 어느 하나의 조성물; 및 완충제를 포함하는 키트.

실시양태 35. 실시양태 26, 실시양태 27, 또는 실시양태 26 및 실시양태 27의 하나 이상의 핵산 서열; 및 완충제를 포함하는 키트.

실시양태 36. 하기를 포함하는 조성물:

하기를 포함하는 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체:

Cse2 서브유닛 단백질, Cas5 서브유닛 단백질, Cas6 서브유닛 단백질, 및 Cas7 서브유닛 단백질,

Cas8 서브유닛 단백질 및 제1 FokI를 포함하며, 여기서 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단 또는 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단이 제1 링커 폴리펩티드에 의해 제1 FokI의 C-말단 또는 N-말단에 각각 공유적으로 연결되는 것인 제1 융합 단백질, 및

핵산 표적 서열에 결합할 수 있는 스페이서를 포함하는 가이드 폴리뉴클레오티드; 및

dCas3* 단백질 및 제2 FokI를 포함하는 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas3 융합 단백질을 포함하며, 여기서 dCas3* 단백질의 N-말단 또는 dCas3* 단백질의 C-말단이 제2 링커 폴리펩티드에 의해 제2 FokI의 C-말단 또는 N-말단에 각각 공유적으로 연결되고, 제1 링커 폴리펩티드가 약 10개 아미노산 내지 약 40개 아미노산의 길이를 갖는 것인 제2 융합 단백질.

실시양태 37. 제1 링커 폴리펩티드가 약 5개 아미노산 내지 약 40개 아미노산의 길이를 갖는 것인, 실시양태 36의 조성물.

실시양태 38. 제2 링커 폴리펩티드가 약 5개 아미노산 내지 약 40개 아미노산의 길이를 갖는 것인, 실시양태 36의 조성물.

실시양태 39. 실시양태 36 내지 38 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 세포.

실시양태 40. 세포가 원핵 세포인, 실시양태 39의 세포.

실시양태 41. 세포가 진핵 세포인, 실시양태 39의 세포.

실시양태 42. 실시양태 36 내지 38 중 어느 하나의 Cse2 서브유닛 단백질, Cas5 서브유닛 단백질, Cas6 서브유닛 단백질, Cas7 서브유닛 단백질, 제1 융합 단백질 및 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열.

실시양태 43. 실시양태 36 내지 38 중 어느 하나의 제2 융합 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열.

실시양태 44. 실시양태 42, 실시양태 43, 또는 실시양태 42 및 실시양태 43의 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 카세트.

실시양태 45. 실시양태 44의 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 하나 이상의 벡터.

실시양태 46. 하기 단계를 포함하는, 핵산 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 결합하는 방법:

세포 또는 생화학적 반응 내로의 도입을 위해 실시양태 36 내지 38 중 어느 하나의 조성물을 제공하는 단계; 및

상기 조성물을 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입함으로써, 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 핵산 표적 서열의 접촉 및 제2 융합 단백질과 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 접촉을 용이하게 하여, 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 및 제2 융합 단백질과 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열의 결합을 초래하는 단계.

실시양태 47. 게놈 DNA가 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 실시양태 46의 방법.

실시양태 48. 하기 단계를 포함하는, 핵산 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 커팅하는 방법:

세포 또는 생화학적 반응 내로의 도입을 위해 실시양태 36 내지 38 중 어느 하나의 조성물을 제공하는 단계; 및

상기 조성물을 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입하며, 이로써 제1 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 제1 핵산 표적 서열의 접촉 및 제2 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 제2 핵산 표적 서열의 접촉을 용이하게 하고,

상기 조성물을 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입함으로써, 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 핵산 표적 서열의 접촉 및 제2 융합 단백질과 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 접촉을 용이하게 하여, 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체 및 제2 융합 단백질에 의한 핵산 표적 서열의 커팅을 초래하는 단계.

실시양태 49. 게놈 DNA가 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 실시양태 48의 방법.

실시양태 50. 실시양태 36 내지 38 중 어느 하나의 조성물; 및 완충제를 포함하는 키트.

실시양태 51. 실시양태 42, 실시양태 43, 또는 실시양태 42 및 실시양태 43의 하나 이상의 핵산 서열; 및 완충제를 포함하는 키트.

실시양태 52. 야생형 유형 I CRISPR Cas3 단백질 ("wtCas3 단백질")에 비해 DNA를 따라 이동하는 것을 감소시킬 수 있는 조작된 유형 I CRISPR Cas3 돌연변이체 단백질 ("mCas3 단백질")로서, mCas3 단백질은

상응하는 wtCas3 단백질과의 약 95% 이상의 서열 동일성을 포함하고,

아미노 말단, 카르복시 말단, 또는 아미노 말단과 카르복시 말단 둘 다에 공유적으로 연결된 핵 국재화 시그널을 포함하고,

헬리카제 활성을 하향-조정하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 여기서 조작된 유형 I CRISPR Cas3 돌연변이체 단백질이 뉴클레아제 활성을 보유하고;

여기서 DNA는 핵산 표적 서열을 포함하는 표적 영역을 포함하는 이중-가닥 DNA (dsDNA)이고;

여기서 wtCas3 단백질이 상응하는 캐스케이드 핵단백질 복합체와 연합되고 ("캐스케이드 NP 복합체/wtCas3 단백질"), 캐스케이드 NP 복합체가 핵산 표적 서열에 상보적인 스페이서를 포함하는 가이드를 포함하는 경우에, 핵산 표적 서열에 대한 캐스케이드 NP 복합체/wtCas3 단백질의 결합은 DNA의 표적 영역에서의 절단을 용이하게 하며, 이로써 결실 ("wtCas3-결실)을 초래하고;

여기서 mCas3 단백질이 캐스케이드 NP 복합체와 연합되고 ("캐스케이드 NP 복합체/mCas3 단백질") 핵산 표적 서열에 결합하는 경우에, 이는 DNA의 표적 영역에서의 절단을 용이하게 하며, 이로써 wtCas3-결실에 비해 더 짧은 결실을 초래하는 것인

mCas3 단백질.

실시양태 53. 하나 이상의 돌연변이가 아미노산의 치환인, 실시양태 53의 mCas3 단백질.

실시양태 54. 하나 이상의 돌연변이가 헬리카제 도메인의 RecA1 영역 또는 RecA2 영역 내에 있는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 mCas3 단백질.

실시양태 55. 하나 이상의 돌연변이가 wtCas3 단백질에 비해 단일-가닥 DNA (ssDNA)에 대한 mCas3 단백질의 결합을 하향-조정하는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 mCas3 단백질.

실시양태 56. 하나 이상의 돌연변이가 wtCas3 단백질에 비해 mCas3 단백질에 의한 아데노신 트리포스페이트 (ATP)의 가수분해를 하향-조정하거나 또는 mCas3 단백질에 대한 ATP의 결합을 하향-조정하는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 mCas3 단백질.

실시양태 57. mCas3 단백질에 대한 코딩 서열이 캐스케이드 NP 복합체의 Cas 단백질의 코딩 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 공유적으로 연결되는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 mCas3 단백질.

실시양태 58. 하나 이상의 돌연변이가 wtCas3 단백질에 비해 단일-가닥 DNA (ssDNA)에 대한 mCas3 단백질의 결합을 하향-조정하는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 mCas3 단백질.

실시양태 59. mCas3 단백질에 대한 코딩 서열이 캐스케이드 RNP 복합체의 Cas 단백질의 코딩 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 공유적으로 연결되는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 mCas3 단백질.

실시양태 60. Cas 단백질이 Cse2, Cas8 단백질, Cas7 단백질, Cas6 단백질, 및 Cas5 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 mCas3 단백질.

실시양태 61. wtCas3 단백질이 이. 콜라이 유형 1 CRISPR Cas3 단백질인, 임의의 전술한 실시양태의 mCas3 단백질.

실시양태 62. 하나 이상의 돌연변이가 D452H, A602V, 및 D452H 및 A602V로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 61의 mCas3 단백질.

실시양태 63. DNA가 세포 내에 있는 것인, 임의의 전술한 실시양태의 mCas3 단백질.

실시양태 64. 세포가 진핵 세포인, 실시양태 63의 mCas3 단백질.

실시양태 65. 진핵 세포가 포유동물 세포 (예를 들어, 인간 세포)인, 실시양태 64의 mCas3 단백질.

실시양태 66. 실시양태 52 내지 65 중 어느 하나의 mCas3 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드.

실시양태 67. 포유동물 세포에서의 발현을 위해 조절 서열에 작동가능하게 연결된 실시양태 52 내지 65 중 어느 하나의 mCas3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드.

실시양태 68. 포유동물 세포에서의 발현을 위해 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 실시양태 52 내지 65 중 어느 하나의 mCas3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 상응하는 유형 I CRISPR 캐스케이드의 단백질 구성성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 플라스미드.

실시양태 69. 포유동물 세포에서의 발현을 위해 조절 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 플라스미드를 추가로 포함하는, 실시양태 68의 하나 이상의 플라스미드.

실시양태 70. 실시양태 52 내지 65 중 어느 하나의 mCas3 단백질을 포함하는 유형 I CRISPR 캐스케이드 핵단백질 복합체.

실시양태 71. 핵단백질 복합체가 RNP인, 실시양태 70의 유형 I CRISPR 캐스케이드 핵단백질 복합체.

본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 기재되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 명세서 및 실시예로부터, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있으며, 그의 취지 및 범주를 벗어나지 않고서도 본 발명을 다양한 활용 및 조건에 적응시키기 위해 본 발명의 변화, 치환, 변이 및 변형을 만들 수 있다. 이러한 변화, 치환, 변이 및 변형은 또한 본 개시내용의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.

실험

본 발명의 측면은 하기 실시예에 예시된다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 농도, 퍼센트 변화 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 일부 실험적 오차 및 편차를 고려해야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 온도는 섭씨 온도이고 압력은 대기압 또는 그 근처이다. 이들 실시예는 단지 예시로서 제공되며 본 발명의 범주를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.

실시예 1

캐스케이드 구성성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인 실리코 설계

본 실시예는 유형 I-E CRISPR-Cas 시스템으로부터 유래된 유전자, 단백질 및 CRISPR 서열을 사용하여 캐스케이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 구성성분의 설계에 대한 설명을 제공한다.

표 15는 유형 I-E, 구체적으로 이. 콜라이 균주 K-12 MG1655로부터의 캐스케이드의 5개 단백질을 코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 DNA 서열 뿐만 아니라 이로써 생성되는 단백질 구성성분의 아미노산 서열을 제시한다. 게놈 서열은 NCBI 참조 서열 NZ_CP014225.1로부터 수득되었다. 표 15에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 이. 콜라이 gDNA로부터 증폭되었거나 또는 이. 콜라이에서의 발현 및 또한 인간 세포에서의 발현을 위해 특이적으로 코돈-최적화된 캐스케이드 단백질 구성성분을 코딩하는 제조업체 생산 폴리뉴클레오티드로부터 증폭되었다.

또한, 캐스케이드 단백질을 포함하는 몇 가지 융합 단백질이 설계되었다. 표 16은 캐스케이드 단백질 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 DNA 서열 뿐만 아니라 이로써 생성된 단백질 구성성분의 아미노산 서열을 제시한다. 대부분의 경우에, 표 16에 기재된 융합 단백질은 융합 구축물 내에서 2개의 폴리펩티드 서열을 연결하는 짧은 트리-아미노산 링커를 포함하며; 이러한 링커는 전형적으로 글리신-글리신-세린 (GGS) 또는 글리신-세린-글리신 (GSG)을 포함한다. 각각의 특별한 융합 단백질에 사용되는 정확한 트리-아미노산 링커 서열는 표 16에서 완전한 길이의 아미노산 서열에서 찾을 수 있다.

Cse2 단백질 상의 His6 (헥사히스티딘; 서열식별번호: 418) 및 스트렙-태그™ II (GE 헬스케어 바이오-사이언시스 (GE Healthcare Bio-Sciences; 미국 펜실베니아주 피츠버그)) (서열식별번호: 419) 펩티드 태그가 다른 캐스케이드 단백질과 공동-발현될 때, 이는 니켈-니트릴로아세트산 (Ni-NTA) 수지 또는 스트렙-탁틴(Strep-Tactin)™ (IBA GMBH LLC; 독일 괴팅겐) 수지를 통해 각각 복합체를 정제 할 수 있게 한다. HRV3C (인간 리노바이러스 3C) 프로테아제 인식 서열 (서열식별번호: 420)은 HRV3C 프로테아제에 의해 절단되며, 관심 단백질로부터 N-말단 융합물을 제거하는데 사용될 수 있다. Cas6, Cas7, 및/또는 Cas8 단백질 상의 NLS (핵 국재화 시그널; 서열식별번호: 421) 펩티드 태그는 진핵 시스템에서의 핵 트래피킹을 가능하게 한다. Cas6 또는 Cas7 단백질 상의 HA (혈구 응집소; 서열식별번호: 422) 펩티드 태그는 항-HA 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 이종 단백질 발현을 검출할 수 있게 한다. MBP (말토스 결합 단백질; 서열식별번호: 423) 펩티드 융합은 Cas8 단백질의 정제를 용이하게 하는 가용화 태그이다. TEV (담배 식각 바이러스) 프로테아제 인식 서열 (서열식별번호: 424)은 TEV 프로테아제에 의해 절단되고 관심 단백질로부터 N-말단 융합물을 제거하는데 사용될 수 있다. FokI 뉴클레아제 도메인은 문헌 [Guo, J., et al., J. Mol. Biol. 400:96-107 (2010)]에 기재된 샤키 변이체를 포함하고, 2개의 단량체성 FokI 서브유닛이 연합하여 동종이량체를 형성하며, 동종이량체화 시 이중-가닥 DNA 절단을 촉매한다. 링커 서열 (서열식별번호: 425)은 FokI 뉴클레아제 도메인을 Cas8 단백질과 융합시키는데 사용된다.

FokI 뉴클레아제 도메인을 Cas8 단백질에 연결하는 다양한 길이 및 아미노산 조성의 부가의 링커 서열이 설계되었다. 이들 아미노산 서열은 표 17에서 찾을 수 있다.

표 18은 전구체 crRNA로 전사되고 캐스케이드의 RNA 엔도뉴클레아제 단백질에 의해 프로세싱될 때, 생화학적 검정 및 세포 배양 유전자 편집 실험에서 상보 적 DNA 서열을 표적화하는 가이드 RNA로서 기능하는 성숙한 crRNA를 생성하는 4개의 최소 CRISPR 어레이의 폴리뉴클레오티드 DNA 서열을 함유한다.

최소 CRISPR 어레이는 crRNA의 가이드 부분을 나타내는 스페이서 서열을 플랭킹하는 2개의 반복부 서열 (밑줄, 소문자)을 포함한다. 캐스케이드 엔도뉴클레아제 단백질에 의한 RNA 프로세싱은 가이드 서열을 플랭킹하는 5' 단부와 3' 단부 둘 다에 반복부 서열이 있는 crRNA를 생성한다. CRISPR 어레이는 또한 엔도뉴클레아제 캐스케이드 단백질에 의한 RNA 프로세싱에 의해 2개의 별개의 crRNA의 가이드 부분을 나타내는 2개의 스페이서 서열을 플랭킹하는 3개의 반복부 서열 (밑줄)을 포함하도록 확장될 수 있다. 원하는 경우에 부가의 스페이서 서열을 포함하도록 상기 어레이를 추가로 확장할 수 있다.

실시예 2

캐스케이드 이펙터 복합체의 생산을 위한 박테리아 발현 벡터의 설계

본 실시예는 캐스케이드-연합된 단백질을 코딩하는 박테리아 발현 벡터 뿐만 아니라 실시예 1에 기재된 바와 같은 가이드 서열을 포함하는 최소 CRISPR 어레이의 설계를 설명한다. 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 플라스미드와 함께 사용하기 위한 캐스케이드 서브유닛 단백질 발현 시스템의 구축이 기재되어 있다.

단일 플라스미드 캐스케이드 단백질 발현 시스템은 CasBCDE 복합체 (Cse2, Cas7, Cas5, 및 Cas6 단백질을 함유하지만, Cas8 단백질은 함유하지 않음)로서 공지된 이. 콜라이에서의 캐스케이드의 복합체, 또는 이. 콜라이에서의 전체 기능적 캐스케이드 복합체의 단백질을 발현하도록 구축되었다. 단일 플라스미드 시스템은 단일 발현 플라스미드 상의 cse2-cas7-cas5-cas6 오페론 또는 전체 cas8-cse2-cas7-cas5-cas6 오페론을 포함한다. Cas8 단백질은 캐스케이드를 재구성하기 위해 CasBCDE 복합체와 함께 혼합되는 생화학 실험에 사용하기 위해, 자체 발현 플라스미드로부터 발현될 수 있다.

발현 벡터 구축을 위한 출발 플라스미드가 사용되었다 (문헌 [Brouns, S., et al., Science 321:960-964 (2008)] 참조). Cas 오페론을 포함하는 단일 플라스미드 캐스케이드 단백질 발현 시스템이 다음과 같이 어셈블리되었다. cas 유전자에 대한 코딩 서열은 cse2-cas7-cas5-cas6 (CasBCDE 복합체) 또는 cas8-cse2-cas7-cas5-cas6 (완전한 캐스케이드 복합체)의 순서로 배열되었고, 야생형 박테리아 유전자 배열에 상응하는 서열 (NCBI 참조 서열 NZ_CP014225.1 참조)에 의해 분리되었다.

친화성 태그 (His6 또는 스트렙-태그® II, IBA GMBH LLC, 독일 괴팅겐)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 첨부하기 위해, 상응하는 코딩 서열을 cas8 유전자의 3' 단부와 cse2 유전자의 5' 단부의 연접부에 삽입하였고; 이들 2개의 오픈 리딩 프레임은 야생형 gDNA 서열에서 중복된다.

N-말단 NLS 및/또는 NLS-HA 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 cas6 유전자의 5' 단부 상에 첨부하기 위해, cas6과 상류 cas5 유전자 사이에 부가의 간격을 도입하였는데, 이는 이들 오픈 리딩 프레임이 야생형 gDNA 서열에서 중복되어, cas6 유전자에 대한 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열이 cas5 유전자의 3' 부분 내에 있기 때문이다. 새로운 샤인-달가르노 서열이 새로운 NLS-Cas6 또는 NLS-HA-Cas6 오픈 리딩 프레임의 상류에 삽입되어 번역 효율을 개선시켰다.

C-말단 NLS 및/또는 HA-NLS 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 cas7 유전자의 3' 단부 상에 첨부하기 위해, cas7과 하류 cas5 유전자 사이에 부가의 간격을 도입하였는데, 이는 이들 오픈 리딩 프레임이 야생형 gDNA 서열에 아주 근접하여 있으므로, cas5 유전자에 대한 샤인-달가르노 서열이 cas7 유전자의 3' 부분 내에 있기 때문이다. 새로운 샤인-달가르노 서열이 새로운 Cas7-NLS 또는 Cas7-HA-NLS 오픈 리딩 프레임의 하류에 삽입되어 cas5 유전자에 대한 번역 효율을 개선시켰다.

N-말단 NLS-FokI-링커 융합물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 Cas8 단백질에 첨부하기 위해, 상응하는 코딩 서열을 cas8 유전자의 5' 단부에 삽입하였다.

cse2-cas7-cas5-cas6 및 cas8-cse2-cas7-cas5-cas6 오페론은 pCDF (밀리포어시그마 (MilliporeSigma; 미국 캘리포니아주 헤이워드)) 벡터 백본에 클로닝되었으며, 이는 aadA 유전자의 존재로 인해 스펙티노마이신 내성을 부여한다. 오페론의 전사는 T7 프로모터에 의해 구동되고 Lac 작동인자의 제어 하에 있으며; 벡터는 또한 LacI 저해인자를 코딩한다. T7 종결인자는 cse2-cas7-cas5-cas6 또는 cas8-cse2-cas7-cas5-cas6 오페론의 하류에 클로닝되었다. 벡터는 CDF 복제 기점을 함유한다.

Cas8 또는 FokI-Cas8 융합 단백질의 발현을 위해, cas8 유전자는 pET (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 패밀리 벡터 백본으로 클로닝되었으며, 이는 kanR 유전자의 존재로 인해 카나마이신 내성을 부여한다. 오페론의 전사는 T7 프로모터 (P_T7)에 의해 구동되며 Lac 작동인자 (lacO)의 제어 하에 있으며; 벡터는 또한 LacI 저해인자 (lacI 유전자)를 코딩한다. T7 종결인자는 cas8 유전자의 하류에 클로닝되었다. 벡터는 ColE1 복제 기점을 함유한다.

도 23a, 도 23b, 도 23c, 도 23d, 및 도 23e는 cas8, fokI-cas8, cse2-cas7-cas5-cas6 오페론, cas8-cse2-cas7-cas5-cas6 오페론, 및 fokI-cas8-cse2-cas7-cas5-cas6 오페론에 대한 과다발현 벡터의 개략도를 제시한다. 도 23a, 도 23b, 도 23c, 도 23d, 및 도 23e에서의 명칭은 (실시예 1에서 뿐만 아니라) 본 실시예에 기재되어 있고 다음과 같다: P_T7 (T7 프로모터), lacO (Lac 작동인자), His6 (헥사히스티딘), MBP (말토스 결합 단백질), 스트렙-태그® II (IBA GMBH LLC, 독일 괴팅겐) HRV3C (인간 리노바이러스 3C) 프로테아제 인식 서열, TEV (담배 식각 바이러스) 프로테아제 인식 서열, NLS (핵 국재화 시그널), kanR (카나마이신 내성 유전자), lacI (LacI 저해인자 유전자), colE1 ori (복제 기점), CDF ori (CloDF13 복제 기점), FokI 뉴클레아제 도메인 (샤키 변이체), 및 aadA (아미노글리코시드 내성 단백질을 코딩하는 유전자).

표 19는 Cas8 단백질, CasBCDE 복합체의 4개의 단백질 (cse2-cas7-cas5-cas6 오페론), 및 캐스케이드 복합체의 5개 모든 단백질 (cas8-cse2-cas7-cas5-cas6 오페론)을 코딩하는 박테리아 발현 플라스미드의 서열을 제공한다. Cas8 단백질 상에 N-말단 FokI 융합을 수반한 경우 및 수반하지 않은 경우의 폴리뉴클레오티드 서열이 제공된다.

crRNA를 함유하는 CasBCDE 복합체 및 캐스케이드 복합체를 정제하기 위해, cse2-cas7-cas5-cas6 오페론 또는 cas8-cse2-cas7-cas5-cas6 오페론을 코딩하는 단백질 발현 벡터를, 최소 CRISPR 어레이를 함유하는 벡터와 조합한다.

CRISPR 어레이는 pACYC-Duet1 벡터 백본에 클로닝되었으며, 이는 camR 유전자로 인해 클로람페니콜 내성을 부여한다. 어레이의 전사는 T7 프로모터에 의해 구동되며 Lac 작동인자 (lacO)의 제어 하에 있으며; 벡터는 또한 LacI 저해인자를 코딩한다. T7 종결인자는 CRISPR 어레이의 하류에 클로닝되었다. 벡터는 p15A 복제 기점을 함유한다.

도 24는 2개의 반복부 (도 24, "반복부") 및 1개의 스페이서 (도 24, "스페이서")를 갖는 CRISPR 어레이를 함유하는 발현 벡터의 개략도를 함유한다. 이러한 어레이는 본원에 기재된 바와 같이 확장될 수 있다. 도 24에서의 명칭은 (실시예 1에서 뿐만 아니라) 본 실시예에 기재되어 있고 다음과 같다: P_T7 (T7 프로모터), lacO (Lac 작동인자), lacI (LacI 저해인자 유전자), p15A ori (복제 기점) 및 camR (클로람페니콜 내성 유전자).

표 20은 최소 CRISPR 어레이의 예를 코딩하는 박테리아 발현 플라스미드의 서열을 제공한다.

실시예 3

포유동물 세포에서 캐스케이드 이펙터 복합체의 생산을 위한 진핵 발현 벡터의 설계

본 실시예는 캐스케이드-연합된 단백질을 코딩하는 진핵 발현 플라스미드 벡터 뿐만 아니라 실시예 1에 기재된 바와 같은 구성성분 서열을 포함하는 최소 CRISPR 어레이의 설계를 설명한다.

A. 각각의 캐스케이드 단백질을 발현하는 별도의 플라스미드 및 최소 CRISPR 어레이

캐스케이드 단백질은 인간 시토메갈로바이러스 (CMV) 즉발형 프로모터/인핸서에 의해 구동되는 별도의 발현 벡터 상에 단백질 구성성분 각각을 코딩하고 인간 U6 프로모터에 의해 구동되는 별도의 발현 벡터 상에 crRNA를 코딩함으로써 포유동물 세포에서 발현될 수 있다.

각각의 발현 플라스미드에 대한 출발 플라스미드는 pcDNA3.1의 유도체 (써모 사이언티픽; 미국 델라웨어주 윌밍턴)였다. 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 캐스케이드 단백질에 대한 코딩 서열 (실시예 1 참조)을 CMV 프로모터의 하류 및 소 성장 호르몬 (bGH) 폴리아데닐화 시그널의 상류에서 벡터 내로 삽입하였다. cse2 유전자는 N-말단 NLS 및 3x-FLAG 에피토프 태그를 코딩하는 5' 단부에서 폴리뉴클레오티드 서열과 융합시켰다. cas5 유전자는 N-말단 NLS를 코딩하는 5' 단부에서 폴리뉴클레오티드 서열과 융합시켰다. cas6 유전자는 N-말단 NLS 및 HA 에피토프 태그를 코딩하는 5' 단부에서 폴리뉴클레오티드 서열과 융합시켰다. cas7 유전자는 N-말단 NLS 및 Myc 에피토프 태그를 코딩하는 5' 단부에서 폴리뉴클레오티드 서열과 융합시켰다. cas8 유전자는 N-말단 NLS를 코딩하는 5' 단부에서 폴리뉴클레오티드 서열과 융합시켰고; 또 다른 실시양태에서, cas8 유전자는 N-말단 NLS, HA 에피토프 태그, 및 FokI 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 5' 단부에서 폴리뉴클레오티드 서열과 융합시켰다.

각각의 유전자 또는 유전자 융합은 pcDNA3.1 유도체 벡터 백본으로 클로닝되었으며, 이는 ampR 유전자의 존재로 인해 암피실린 내성을 부여한다. 벡터는 또한 SV40 초기 프로모터 (P_SV40) 및 기점 (SV40 ori)의 하류, 및 SV40 초기 폴리아데닐화 시그널 (SV40 pA)의 상류에 있는 neoR 유전자의 존재로 인해 네오마이신 내성을 코딩한다. 인간 CMV 즉발형 프로모터/인핸서 (P_CMV) 및 bGH (소 성장 호르몬) 폴리아데닐화 시그널 이외에, 벡터는 관심 유전자의 하류에 T7 프로모터를 함유하여, mRNA의 시험관내 전사를 허용한다. 벡터는 f1 복제 기점 뿐만 아니라 ColE1 복제 기점을 함유한다.

도 25는 FokI-Cas8 융합 단백질을 코딩하는 포유동물 발현 벡터의 개략도를 함유한다. 도 25에서의 명칭은 (실시예 1에서 뿐만 아니라) 본 실시예에 기재되어 있고 다음과 같다: 인간 CMV 즉발형 프로모터/인핸서 (P_CMV), NLS (핵 국재화 시그널), FokI (FokI 뉴클레아제 도메인 (샤키 변이체)), Cas8 단백질 코딩 서열, bGH pA (소 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그널), f1 ori (f1 파지 복제 기점), P_SV40 (SV40 초기 프로모터), SV40 ori (SV40 기점), neoR (네오마이신 내성 유전자), SV40 pA (SV40 초기 폴리아데닐화 시그널), colE1 ori (복제 기점), 및 ampR (암피실린 내성 유전자). 다른 캐스케이드 단백질을 코딩하는 벡터가 유사하게 설계되었다.

표 21은 Cse2, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, 및 FokI-Cas8 각각을 코딩하는 개별 포유동물 발현 벡터의 서열을 제공한다.

CRISPR RNA는 2개의 스페이서 서열을 플랭킹하는 3개의 반복부를 함유하는 최소 CRISPR 어레이로 코딩되었다. CRISPR RNA를 생성하는 구축물은 최소 어레이에서 가장 바깥 쪽 반복부를 플랭킹하는 부가의 서열로 설계될 수 있다. 전구체 CRISPR RNA의 프로세싱은 별도의 플라스미드 상에서 발현될 수 있는 캐스케이드 복합체 (Cas6 단백질)의 RNA 프로세싱 단백질에 의해 가능해진다.

인간 CMV 프로모터가 인간 U6 프로모터 (P_U6)로 대체되고 bGH 폴리아데닐화 시그널이 폴리-T 종결 시그널로 대체된 것을 제외하고는, CRISPR 어레이를 상기 기재된 바와 동일한 pcDNA3.1 유도체 벡터 백본에 클로닝하였다. 이러한 CRISPR 어레이의 예가 도 35에 예시되어 있다. 이러한 도면에서, hU6 프로모터 (도 35, 점각 영역으로서 표시됨)는 제1 반복부 서열 (투명 사각형)에 인접해 있고, 이는 제1 스페이서 서열 (도 35, 스페이서 1, 비스듬한 선)에 인접해 있으며, 이는 제2 반복부 서열 (도 35, 회색 사각형)에 인접해 있고, 이는 제2 스페이서 서열 (도 35, 스페이서 2)에 인접해 있으며, 이는 제3 반복부 서열 (도 35, 흑색 사각형)에 인접해 있다. 도 35에서, 쌍형성된 gRNA 가이드를 포함하는 영역이 제시되어 있다 (도 35, 쌍형성된 gRNA).

도 26은 TRAC 유전자를 표적화하는 대표적인 CRISPR 어레이를 코딩하는 진핵 발현 벡터의 개략도를 함유한다. 도 26에서의 명칭은 (실시예 1에서 뿐만 아니라) 본 실시예에 기재되어 있고 다음과 같다: P_U6 (인간 U6 프로모터), 반복부 (CRISPR RNA 반복부), TRAC 스페이서-1 (TRAC 유전자를 표적화하는 제1 스페이서), TRAC 스페이서-2 (TRAC 유전자를 표적화하는 제2 스페이서), 폴리T (폴리-T 종결 시그널), f1 ori (f1 파지 복제 기점), P_SV40 (SV40 초기 프로모터), SV40 ori (SV40 기점), neoR (네오마이신 내성 유전자), SV40 pA (SV40 초기 폴리아데닐화 시그널), colE1 ori (복제 기점), 및 ampR (암피실린 내성 유전자).

표 22는 TRAC 유전자를 표적화하는 CRISPR 어레이를 코딩하는 대표적인 포유동물 발현 벡터의 서열을 제공하며; TRAC 유전자에서의 매칭 DNA 서열을 표적화하는 스페이서 서열은 표 18에서 찾을 수 있다.

B. 다수의 캐스케이드 단백질 코딩 서열이 단일 프로모터로부터 발현되는 캐스케이드 단백질 발현 시스템

더 적은 발현 벡터로부터 캐스케이드 복합체의 구성성분을 발현하기 위해, 폴리시스트론성 발현 벡터를 구축하였다. 각각에서, 단일 CMV 프로모터는 2A 바이러스 펩티드 서열에 의해 분리되는 다수의 코딩 서열의 발현을 동시에 구동한다. 토세아 아시그나 바이러스 2A 펩티드 서열은 리보솜 스키핑을 유도하므로 (예를 들어, 문헌 [Liu, Z., et al., Sci. Rep. 7:2193 (2017)] 참조), 다수의 단백질 코딩 유전자가 단일 폴리시스트론성 구축물 내에서 연결될 수 있다.

폴리시스트론성 발현 플라스미드에 대한 출발 플라스미드는 CMV 프로모터 및 bGH 폴리아데닐화 시그널을 함유하는, 상기 기재된 pcDNA3.1의 동일한 유도체였다. 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 캐스케이드 단백질에 대한 코딩 서열 (실시예 1 참조)을 cas7-cse2-cas5-cas6-cas8의 순서로 연결하며, 토세아 아시그나 바이러스 2A (T2A) 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 각각의 쌍의 유전자 사이에 삽입되었다. 또한, NLS 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 각각의 캐스케이드 단백질 유전자의 5' 단부에 첨부하고, FokI 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 cas8 유전자의 5' 단부에 첨부하여, 30-아미노산 링커에 의해 연결하였다. 최종 구축물은 요소를 하기 순서로 갖는다: NLS-cas7-T2A-NLS-cse2-T2A-NLS-cas5-T2A-NLS-cas6-T2A-NLS-fokI-링커-cas8.

도 27은 모든 캐스케이드 단백질을 코딩하는 예시적인 폴리시스트론성 포유동물 발현 벡터의 개략도를 함유한다. 도 27에서의 명칭은 (실시예 1에서 뿐만 아니라) 본 실시예에 기재되어 있고 다음과 같다: 인간 CMV 즉발형 프로모터/인핸서 (P_CMV), NLS (핵 국재화 시그널), T2A (토세아 아시그나 바이러스 2A 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열), Cas7, Cse2, Cas5, 및 Cas6 단백질에 대한 코딩 서열, fokI (FokI 뉴클레아제 도메인 (샤키 변이체) 링커 서열), Cas8 단백질에 대한 코딩 서열, bGH pA (소 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그널), f1 ori (f1 파지 복제 기점), P_SV40 (SV40 초기 프로모터), SV40 ori (SV40 기점), neoR (네오마이신 내성 유전자), SV40 pA (SV40 초기 폴리아데닐화 시그널), colE1 ori (복제 기점), ampR (암피실린 내성 유전자), 및 MluI 제한 부위.

표 23은 모든 캐스케이드 단백질을 코딩하는 예시적인 폴리시스트론성 포유동물 발현 벡터의 서열을 제공한다. 이러한 벡터는 상기 기재된 CRISPR RNA를 코딩하는 포유동물 발현 벡터와 조합되어, 포유동물 세포에서 기능적 캐스케이드 복합체를 생산할 수 있다.

C. 단일 플라스미드 발현 시스템

인간 세포에서 완전한 캐스케이드 복합체를 발현하기 위해 단일 플라스미드 캐스케이드 발현 시스템이 구축되었다. 플라스미드는 단일 플라스미드 상에 전체 cas8-cse2-cas7-cas5-cas6 오페론 및 최소 CRISPR 어레이를 코딩한다. 이러한 플라스미드는 MluI 제한 부위에 상류 인간 U6 프로모터 및 하류 폴리-T 종결 시그널과 함께 최소 CRISPR 어레이를 삽입함으로써 폴리시스트론성 단백질 발현 벡터 (표 23 및 도 27에 기재됨)로부터 구축되었다.

표 24는 인간 세포에서 캐스케이드 복합체의 형성을 용이하게 하기 위해 crRNA와 함께 5개의 모든 캐스케이드 단백질의 발현을 위한 단일 플라스미드의 서열을 제공한다.

플라스미드는 또한 이. 콜라이 및 포유동물 세포에서 Cas3 단백질 (서열식별번호: 21; 단량체 Cas3 뉴클레아제/헬리카제 이. 콜라이 K-12 아균주 MG1655)의 발현을 위해 설계되었다. 표 25는 이들 플라스미드의 구축물 및 서열을 제공한다.

실시예 4

캐스케이드 구성성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 박테리아 생산 균주 내로의 도입

본 실시예는 Cas8 서브유닛 단백질 코딩 서열의 도입 및 발현 뿐만 아니라 이. 콜라이 발현 시스템을 사용하는 박테리아 세포에서의 조작된 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체의 구성성분에 대한 코딩 서열에 대해 설명한다.

A. Cas8 단백질의 발현

T7 프로모터로부터의 His6-MBP-TEV-Cas8의 IPTG 유도성 발현을 위한 오페론을 함유하는 플라스미드 (실시예 2, 서열식별번호: 438, 표 19, 도 23a)로부터 이. 콜라이 유형 I-E Cas8 단백질이 발현되었다. 발현 플라스미드는 카나마이신에 대한 내성을 부여하였다.

Cas8 단백질을 발현시키기 위해, 이. 콜라이 세포를 발현 플라스미드로 형질전환시켰다. 간단하게, 미세원심분리기 튜브에 있는 100 μL 분취액의 화학적으로 적격한 이. 콜라이 세포 (이. 콜라이 BL21 스타(Star)™ (써모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific; 미국 매사추세츠주 월섬)) 세포)를 얼음에서 10분 동안 해동하였다. 35 ng의 플라스미드 DNA를 상기 해동된 세포에 부가하고 세포를 8분 동안 얼음에서 DNA와 함께 인큐베이션하였다. 열 충격은 미세원심분리기 튜브를 42℃ 수조에 30초 동안 놓아둔 다음, 즉시 튜브를 2분 동안 얼음에 놓아 둠으로써 수행되었다. 900 μL의 2xYT 배지를 미세원심분리기 튜브에 부가하고, 미세원심분리기 튜브를 37℃ 하에 1시간 동안 튜브 회전자에 놓아 두었다. 마지막으로, 회수된 세포 100 μL를 LB 고체 카나마이신 (50 μg/mL) 상에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

항생제 선택 플레이트 상에서 성장한 집락으로부터 단일 집락을 골라 내고, 카나마이신 (50 μg/mL)이 보충된 10 mL의 2xYT 배지에 접종하였다. 배양물은 궤도 진탕기에서 200 RPM으로 진탕시키면서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 6 mL의 밤새 배양물을 카나마이신 (50 μg/mL)이 보충된 1 L의 2xYT 배지를 갖는 2 L의 칸막이가 있는 플라스크로 옮겼다. 1 L 배양액은 600 nm에서의 광학 밀도가 0.56이 될 때까지 궤도 진탕기에서 200 RPM으로 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다.

이어서, IPTG를 1 mM의 최종 농도로 부가하여 발현을 유도하였다. 유도된 배양물은 궤도 진탕기에서 200 RPM으로 진탕시키면서 16℃에서 밤새 성장시켰다. 세포는 4℃에서 15분 동안 4,000 RCF에서 원심 분리함으로써 수거하였다. 세포 펠릿을 50 mL의 용해 완충제당 1개의 컴플리트(Complete)™ (로슈 (Roche; 스위스 바젤)) 프로테아제 억제제 정제가 보충된 50 mM 트리스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 5% 글리세롤, 및 1 mM TCEP로 구성된 15 mL의 용해 완충제에 재현탁시켰다. 이와 같이 재현탁시킨 세포를 즉각적인 하류 프로세싱을 위해 50 mL 원뿔형 튜브로 옮겼다. Cas8 단백질을 정제하고, 이와 같이 정제된 단백질을 본질적으로 FokI-Cas8 융합 단백질에 대해 아래에 기재된 바와 같이 특징규명하였다 (실시예 5C).

B. 캐스케이드 RNP 복합체의 구성성분의 발현

5개의 이. 콜라이 캐스케이드 단백질 및 RNA 가이드의 전체 세트는 캐스케이드 RNP 복합체를 생산하기 위해 2-플라스미드 시스템을 사용하여 이. 콜라이 세포에서 공동-발현되었다. 하나의 플라스미드 (실시예 2, 서열식별번호: 441, 표 19, 도 23d)는 T7 프로모터로부터의 Cse2, Cas5, Cas6, Cas7, 및 Cas8 단백질의 IPTG 유도성 발현을 위한 오페론을 함유하였다. His6 친화성 태그는 Cse2의 N-말단에 대한 번역 융합으로서 포함되었다 (실시예 1, 서열식별번호: 392, 표 16). 제2 플라스미드는 J3 가이드의 IPTG 유도성 발현을 코딩한다 (실시예 2, 서열식별번호: 444, 표 20, 도 24). 캐스케이드 단백질 발현 플라스미드는 스펙티노마이신 내성을 부여하였고, 캐스케이드 RNA 가이드 발현 플라스미드는 클로람페니콜 내성을 부여하였다.

동일한 세포에서 캐스케이드 단백질과 RNA 구성성분을 공동-발현하기 위해, 이. 콜라이 세포를 2개의 플라스미드로 동시에 형질전환시켰다. 미세원심분리기 튜브에 있는 화학적으로 적격한 이. 콜라이 세포 (이. 콜라이, BL21 스타™ (DE3) (써모 피셔 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬))의 100 μL 분취액을 얼음에서 10분 동안 해동하였다. 35 ng의 각각의 플라스미드를 상기 해동된 세포에 부가하고 세포를 8분 동안 얼음에서 DNA와 함께 인큐베이션하였다. 열 충격은 미세원심분리기 튜브를 42℃ 수조에 30초 동안 놓아둔 다음, 즉시 미세원심분리기 튜브를 2분 동안 얼음에 놓아둠으로써 수행되었다. 900 μL의 2xYT 배지를 미세원심분리기 튜브에 부가하고, 미세원심분리기 튜브를 37℃ 하에 1시간 동안 튜브 회전자에 놓아 두었다. 마지막으로, 회수된 세포 100 μL를, 클로람페니콜 (34 μg/mL) 및 스펙티노마이신 (50 μg/mL)이 있는 LB 고체 배지 상에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

항생제 선택 플레이트 상에서 성장한 집락으로부터 단일 집락을 골라 내고, 클로람페니콜 (34 μg/mL) 및 스펙티노마이신 (100 μg/mL)이 보충된 10 mL의 2xYT 배지에 접종하였다. 배양물은 궤도 진탕기에서 200 RPM으로 진탕시키면서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 6 mL의 밤새 배양물을 클로람페니콜 (34 μg/mL) 및 스펙티노마이신 (100 μg/mL)이 보충된 1 L의 2xYT 배지를 갖는 2 L의 칸막이가 있는 플라스크로 옮겼다. 1 L 배양액은 600 nm에서의 광학 밀도가 0.56이 될 때까지 궤도 진탕기에서 200 RPM으로 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다.

IPTG를 1 mM의 최종 농도에 부가함으로써 두 플라스미드로부터의 발현을 유도하였다. 유도된 배양물은 궤도 진탕기에서 200 RPM으로 진탕시키면서 16℃에서 밤새 성장시켰다. 세포는 4℃에서 15분 동안 4,000 RCF에서 원심 분리함으로써 수거하였다. 세포 펠릿을 50 mL의 용해 완충제당 1개의 컴플리트™ (로슈; 스위스 바젤) 프로테아제 억제제 정제가 보충된 50 mM 트리스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 5% 글리세롤, 및 1 mM TCEP로 구성된 15 mL의 용해 완충제에 재현탁시켰다. 이와 같이 재현탁시킨 세포를 즉각적인 하류 프로세싱을 위해 50 mL 원뿔형 튜브로 옮겼다. 캐스케이드 RNP 복합체을 정제하고, 아래에 기재된 바와 같이 특징규명하였다.

실시예 5

캐스케이드 구성성분 및 캐스케이드 RNP 복합체의 정제

본 실시예는 실시예 4B에 기재된 바와 같이 박테리아에서의 과다발현에 의해 생산된 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 RNP 복합체를 정제하는 방법을 설명한다. 이러한 방법은 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용한다. 본 실시예는 또한, 정제된 캐스케이드 RNP 산물의 품질을 평가하는데 사용되는 방법을 설명한다. 또한, 본 실시예는 캐스케이드 구성성분의 정제 및 특징규명을 설명한다.

A. Cas8, Cas7, Cas6, Cas5, 및 Cse2 캐스케이드 RNP 복합체의 정제

이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 RNP 복합체가 실시예 4B에 기재된 바와 같이 생산되었다. 캐스케이드 복합체는 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 포획되었다. 간단하게, 실시예 4B에 기재된 바와 같이 생산된, 재현탁된 세포 펠릿을 얼음에서 해동하고, 50 mL의 용해 완충제당 1개의 컴플리트™ (로슈; 스위스 바젤) 프로테아제 억제제 정제가 보충된 50 mM 트리스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 5% 글리세롤, 및 1 mM TCEP로 구성된 부가의 15 mL의 용해 완충제에 의해 용적이 35 mL가 되게 하였다.

50 mL 원뿔형 튜브를 얼음 수조에 넣고 ½ 인치 팁이 있는 Q500 초음파 처리기 (콰니카 (Qsonica; 미국 코네티컷주 뉴타운))를 사용하여 2 라운드의 초음파 처리에 의해 세포를 용해시켰다. 각각의 라운드의 초음파 처리는 2.5분의 처리 사이클로 이루어졌으며, 50% 진폭에서 10초 초음파 처리한 다음 20초 휴식을 취하는 사이클을 반복하였다. 튜브를 초음파 처리의 라운드 사이에 1분 동안 얼음 수조에서 냉각시켰다. 용해물은 4℃에서 30분 동안 48,384 RCF으로 원심 분리함으로써 정화시켰다. 이어서, 이와 같이 정화된 상청액을, 50 mM 트리스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, 및 1 mM TCEP로 구성된 Ni-세척 완충제로 미리 평형화시킨 히스푸르(Hispur)™ Ni-NTA (써모 피셔 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬) 수지에 부가하였다. 1.5 mL 층 용적의 니켈 친화성 수지를 각각 1 L의 이. 콜라이 발현 배양에 사용하였다. 부드럽게 혼합하면서 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 수지를 4℃에서 2분 동안 500 RCF 하에 원심 분리함으로써 펠릿화하였다. 상청액을 흡인하고 수지를 5 층 용적의 Ni-세척 완충제로 5회 세척하였다. 각각의 세척 후, 수지를 4℃에서 2분 동안 500 RCF 하에 펠릿화하고, 상청액을 흡인하여 제거하였다. 마지막으로, 결합된 단백질 (캐스케이드 RNP 복합체를 포함함)은 50 mM 트리스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 300 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, 및 1 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)으로 구성된 Ni-용출 완충제의 5 층 용적을 부가함으로써 용출시켰다. 4℃에서 2분 동안 500 RCF 하에 원심 분리한 후, 니켈 친화성 용출액을 청정한 50 mL 원뿔형 튜브 내로 흡인시켰다.

니켈 친화성 용출액은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 추가로 정제되었다. 니켈 친화성 용출액을 울트라셀(Ultracel)®-50 (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 막이 있는 아미콘(Amicon)® (밀리포어시그마; 미국 매사추세츠주 빌러리카) 한외 여과 스핀 농축기를 사용하여 12℃에서 한외 여과함으로써 0.5 mL의 최종 용적이 되도록 농축시켰다. 농축된 샘플을 0.22 μM 울트라프리(Ultrafree)-MC GV (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 원심 필터를 사용하여 여과한 후, 50 mM 트리스 pH 7.5, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.1 mM EDTA, 및 1 mM TCEP으로 구성된 SEC 완충제로 평형화시킨 하이프렙(HiPrep)™ 16/60 세파크릴(Sephacryl)® S-300 (GE 헬스케어; 스웨덴 웁살라) 칼럼 상에서 0.5 mL/분의 유속으로 4℃에서 분리함으로써 추가로 정제하였다. 단백질을 SEC 완충제로 용출하고 1 ml 분획을 수집하였다. UV 280에 의해 판단된 바와 같이, 가장 초기의 용출 피크는 고 분자량 응집 물질인 것으로 가정되었으며 상응하는 분획은 폐기되었다. 후속 용출 분획은 쿠마시 염색된 SDS-PAGE로 분석하였다. 적절하게 형성된 각각의 복합체는 Cas8 1개 분자, Cas7 6개 분자, Cas6 및 Cas5 각각 1개 분자, Cse2 2개 분자를 함유하였다. SDS-PAGE 겔 상에서 시각화될 때, 캐스케이드 단백질의 대략적인 예상 화학량론을 갖는 용출 분획을 풀링하였다. 풀링된 분획은 280 nm에서의 흡광도보다 더 큰 260 nm에서의 흡광도에 의해 입증된 바와 같이, 상당한 핵산 구성성분을 함유하고 있음을 확증하기 위해 분광 광도법으로 분석되었다.

풀링된 샘플을 울트라셀®-50 (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 막이 있는 아미콘® (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 스핀 농축기로 100 uL가 되게 농축시킨 다음 저장 완충제로 50배 희석시킴으로써, 50 mM 트리스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.1 mM EDTA, 및 1 mM TCEP로 구성된 저장 완충제로 교환시켰다. 마지막으로, 동일한 한외 여과 장치를 이용하여 샘플을 10 mg/mL로 농축하고 -80℃ 하에 저장하였다.

최종 정제된 산물을 분광 광도법으로 분석하여 캐스케이드 RNP 복합체의 최종 농도를 결정하고 280 nM에서의 흡광도보다 더 큰 260 nm에서의 흡광도에 의해 입증된 바와 같이 핵산 구성성분의 존재를 확증하였다. 캐스케이드 RNP 복합체의 농도는 280 nm에서의 흡광도를, 경로 길이가 1 cm인 무손상 복합체의 0.1% 용액의 계산된 흡광도로 나눔으로써 결정되었다. 정제된 복합체의 0.1% 용액의 예상 흡광도는 2.03 cm^-1이며, 이는 복합체 내의 분자 각각에 대해 계산된 280 nm에서의 흡광 계수의 합 (916940 M^-1cm^-1)을, 복합체 내의 분자 각각의 분자량의 합 (450832 g/mole)으로 나눔으로써 계산되었다.

부가적으로, 최종 산물은 쿠마시 블루 염색으로 SDS-PAGE에 의해 분석되어 각각의 단백질 구성성분이 대략 정확한 화학량론으로 존재하였다는 것을 확증하고 오염 단백질의 존재를 평가하였다. SDS-PAGE 겔은 쿠마시 인스탄트블루(InstantBlue)™ (익스피던 (Expedeon; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)) 염색으로 염색되었다. 겔 doc™ EZ (바이오-래드; 미국 캘리포니아주 헤라클래스) 영상화기를 사용하여 겔을 영상화하고 이미지랩(ImageLab) (바이오-래드; 미국 캘리포니아주 헤라클래스) 소프트웨어를 사용하여 주석을 달았다.

B. Cas7, Cas6, Cas5 및 Cse2 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체의 정제

단백질 구성성분 Cas7, Cas6, Cas5, 및 Cse2로 구성된 캐스케이드 복합체를 정제하였다. L3 가이드 RNA (실시예 2, 서열식별번호: 445, 표 20)는 본질적으로 실시예 4B에 기재된 바와 같이 제1 플라스미드 (실시예 2, 도 24)로부터 발현되었다. 캐스케이드 단백질은 본질적으로 실시예 4B에 기재된 바와 같이 제2 플라스미드 (실시예 2, 서열식별번호: 440, 표 19, 도 23c)로부터 발현되었다.

복합체는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 포획되었다. 재현탁된 세포 펠릿을 얼음에서 해동하였다. 50 mL 원뿔형 튜브에서, 50 mL의 용해 완충제당 1개의 컴플리트™ (로슈; 스위스 바젤) 프로테아제 억제제 정제가 보충되고, 50 mM 트리스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 5% 글리세롤, 및 1 mM TCEP로 구성된 부가의 15 mL의 용해 완충제로 용적이 35 mL 이하가 되게 하였다. 50 mL 원뿔형 튜브를 얼음 수조에 넣고 ½ 인치 팁이 있는 Q500 초음파 처리기 (콰니카; 미국 코네티컷주 뉴타운)를 사용하여 6 라운드의 초음파 처리에 의해 세포를 용해시켰다. 각각의 라운드의 초음파 처리는 1분의 처리 사이클로 이루어졌으며, 90% 진폭에서 3초 초음파 처리한 다음 9초 휴식을 취하는 사이클을 반복하였다. 튜브를 초음파 처리의 라운드 사이에 1분 동안 얼음 수조에서 냉각시켰다. 용해물은 4℃에서 30분 동안 48,384 RCF으로 원심 분리함으로써 정화시켰다. 이와 같이 정화된 상청액을, 50 mM 트리스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% 글리세롤, 및 1 mM TCEP로 구성된 스트렙-세척 완충제로 미리 평형화시킨 스트렙-탁틴® 세파로스(Sepharose)® (IBA GMBH LLC; 독일 괴팅겐) 수지에 부가함으로써 친화성 정제하였다. 0.55 mL 층 용적의 친화성 수지를 각각 1 L의 이. 콜라이 발현 배양에 사용하였다. 부드럽게 혼합하면서 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 샘플을 30 mL 일회용 중력 흐름 칼럼 (바이오-래드; 미국 캘리포니아주 헤라클래스) 상으로 따라 부어, 결합되지 않은 물질이 칼럼을 통해 흐르도록 하였다. 수지를 5 층 용적의 스트렙-세척 완충제로 5회 세척하였다. 마지막으로, 결합된 단백질은 50 mM 트리스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 2.5 mM 데스티오비오틴, 5% 글리세롤, 1 mM EDTA, 및 1 mM TCEP로 구성된 5 층 용적의 스트렙-용출 완충제를 두 번 순차적으로 부가함으로써 용출시켰다.

친화성 용출액은 SEC에 의해 추가로 정제되었다. 친화성 용출액을 울트라셀®-50 (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 막이 있는 아미콘® (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 스핀 농축기를 사용하여 12℃에서 한외 여과함으로써 550 uL의 최종 용적으로 농축시켰다. 농축된 샘플을 0.22 μm 13 mm 울트라크루즈(UltraCruz)® (산타 크루즈 바이오테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology; 미국 텍사스주 댈러스)) PVDF 주사기 필터를 사용하여 여과한 후, 50 mM 트리스 pH 7.5, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.1 mM EDTA, 및 1 mM TCEP로 구성된 SEC 완충제로 평형화시킨 하이프렙™ 16/60 세파크릴® S-300 (GE 헬스케어; 스웨덴 웁살라) 칼럼 상에서 0.4 mL/분의 유속으로 4℃에서 분리함으로써 추가로 정제하였다. 단백질을 SEC 완충제로 용출시키고 0.75 ml 분획을 수집하였다. UV 280에 의해 판단되는 바와 같이, 가장 초기의 용출 피크는 고 분자량 응집 물질인 것으로 가정되었으며 상응하는 분획은 폐기되었다. 제2 피크에 상응하는 분획 (제1 UV 280 피크의 뒷면에 있는 숄더)을 풀링하였다.

풀링된 샘플을 울트라셀®-50 (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 막이 있는 아미콘® (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 스핀 농축기로 200 uL 이하가 되도록 농축한 다음 저장 완충제로 75배 희석함으로써 50 mM 트리스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.1 mM EDTA, 및 1 mM TCEP로 구성된 저장 완충제로 교환하였다. 샘플을 두 번째로 700 uL로 농축시키고 다시 저장 완충제로 20배 희석하였다. 마지막으로, 샘플을 동일한 한외 여과 장치에서 4.7 mg/mL로 농축하고 -80℃ 하에 저장하였다.

최종 정제된 산물을 분광 광도법으로 분석하여 캐스케이드 RNP 복합체의 최종 농도를 결정하고 280 nM에서의 흡광도보다 더 큰 260 nm에서의 흡광도에 의해 입증된 바와 같이 핵산 구성성분의 존재를 확증하였다. 캐스케이드 RNP 복합체의 농도는 280 nm에서의 흡광도를, 경로 길이가 1 cm인 무손상 복합체의 0.1% 용액의 계산된 흡광도로 나눔으로써 결정되었다. 정제된 복합체의 0.1% 용액의 예상 흡광도는 2.18 cm^-1이며, 이는 복합체 내의 각각의 분자에 대한 280 nm에서의 계산된 흡광 계수의 합 (762240 M^-1cm^-1)을, 복합체 내의 각각의 분자의 분자량의 합 (348952.07 g/mole)으로 나눔으로써 계산되었다.

부가적으로, 최종 산물은 쿠마시 블루 염색으로 SDS-PAGE에 의해 분석되어 각각의 캐스케이드 단백질이 대략 정확한 화학량론으로 존재하였다는 것을 확증하고 오염 단백질의 존재를 평가하였다. SDS-PAGE 겔은 쿠마시 인스탄트블루™ (익스피던; 미국 캘리포니아주 샌디에이고) 염색으로 염색되었다. 겔 doc™ EZ (바이오-래드; 미국 캘리포니아주 헤라클래스) 영상화기를 사용하여 겔을 영상화하고 이미지랩 (바이오-래드; 미국 캘리포니아주 헤라클래스) 소프트웨어를 사용하여 주석을 달았다. 적절하게 형성된 각각의 복합체는 Cas7 6개 분자, Cas6 및 Cas5 각각 1개 분자, 및 Cse2 2개 분자를 함유하였다.

C. FokI-Cas8 융합 단백질의 정제

고정화된 금속 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 (CIEX), 및 마지막으로 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 박테리아 과다발현 펠릿으로부터의 이. 콜라이 유형 I-E Cas8 단백질에 대한 FokI 뉴클레아제 융합을 포함하는 융합 단백질을 정제하기 위해 사용되는 방법이 본원에 기재된다.

링커 서열을 포함한 이. 콜라이 유형 I-E FokI-Cas8 융합 단백질이 실시예 1에 기재되어 있다 (서열식별번호: 413, 표 16). 발현 플라스미드는 실시예 2에 기재되어 있다 (서열식별번호: 439, 표 19, 도 23b). 융합 단백질을 포함하는 세포는 본질적으로 실시예 4A에 기재된 바와 같이 생산되었다. Cas8 융합 단백질은 N-말단 His6 태그, 말토스 결합 단백질 도메인, TEV 절단 부위, FokI 뉴클레아제 도메인, 및 30-아미노산 링커를 함유하였다. 단백질은 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 포획되었다. 재현탁된 세포 펠릿을 함유하는 50 mL 원뿔형 튜브를 얼음에서 해동시켰다. 이어서, 튜브를 얼음 수조에 넣고 ¼ 인치 팁이 있는 Q500 초음파 처리기 (콰니카; 미국 코네티컷주 뉴타운)를 사용하여 초음파 처리에 의해 세포를 용해시켰으며, 이는 40% 진폭에서 10초 초음파 처리한 다음 20초 휴식을 취하는 사이클을 반복하여 3분의 처리 사이클 동안 수행되었다. 용해물은 4℃에서 30분 동안 30,970 RCF으로 원심 분리함으로써 정화시켰다. 이어서, 이와 같이 정화된 상청액을, 50 mM 트리스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, 및 1 mM TCEP로 구성된 Ni-세척 완충제로 미리 평형화시킨 히스푸르™ Ni-NTA (써모 피셔 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬) 수지에 부가하였다. 2 mL 층 용적의 니켈 친화성 수지를 1 L의 이. 콜라이 발현 배양에 사용하였다. 부드럽게 혼합하면서 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 샘플을 30 mL 일회용 중력 흐름 칼럼 (바이오-래드; 미국 캘리포니아주 헤라클래스) 상으로 따라 부어, 결합되지 않은 물질이 칼럼을 통해 흐르도록 하였다. 수지를 5 층 용적의 Ni-세척 완충제로 5회 세척하였다. 마지막으로, 결합된 단백질은 50 mM 트리스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 300 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, 및 1 mM TCEP로 구성된 5 층 용적의 Ni-용출 완충제로 용출시켰다.

니켈 친화성 용출액은 친화성 태그를 제거하기 위해 TEV 프로테아제로 처리되었다. TEV 프로테아제는 1:25 (w/w)의 비로 용출액에 부가되었다. TEV를 포함한 샘플을 12 mL 슬라이드-A-라이저(Slide-A-Lyzer)™, 10K MWCO (써모 피셔 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬) 투석 카세트를 사용하여 Ni-세척 완충제에 대항하여 밤새 투석하였다.

TEV 프로테아제 및 절단된 His6-MBP 단편은 Ni 친화성 크로마토그래피에 의해 투석된 샘플로부터 제거되었다. 투석된 샘플을 Ni-세척 완충제로 평형화시킨 청정한 히스푸르™ Ni-NTA (써모 피셔 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬) 수지 칼럼 상으로 따라 부었다. 이어서, 수지를 1 칼럼 용적의 Ni-NTA 세척 완충제로 세척하였다. 통과액 및 세척액을 합하고, 농축시키며, 울트라셀®-10 (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 막이 있는 아미콘® (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 스핀 농축기를 사용하여 저장 완충제 (50 mM 트리스 pH 7.5, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤, 및 1 mM TCEP)로 교환하였다. 이어서, 이러한 샘플은 저장을 위해 -80℃ 하에 동결시켰다.

샘플을 해동시키고 양이온 교환 크로마토그래피 (CIEX)에 의해 추가로 정제 하였다. 샘플을 얼음에서 해동하고, 50 mM 트리스 pH 7.5, 5% 글리세롤, 및 1 mM TCEP로 구성된 찬 CIEX_A 완충제로 0.475 mL에서 4.75 mL로 10배 희석하여 50 mM NaCl의 최종 농도를 초래하였다. 10 mL 모세관 루프를 사용하여, CIEX_A 완충제 및 5% CIEX_B 완충제 (50 mM 트리스 pH 7.5, 1 M NaCl, 5% 글리세롤, 및 1 mM TCEP)를 포함하는 완충제로 평형화시킨, 1 mL 하이트랩™ SP HP (GE 헬스케어; 스웨덴 웁살라) 칼럼 상에 샘플을 부하하였다. 분리 내내 유속은 0.75 mL/분이었다. 루프는 15 mL의 5% CIEX_B 완충제로 칼럼 상에 비워졌다. 결합되지 않은 샘플을 부가 2 mL의 5% CIEX_B 완충제로 세척하였다. 결합된 단백질이 5% 내지 65% CIEX_B 완충제의 8 mL 선형 구배로 용출됨에 따라 500 μL 분획을 수집하였다. 2개의 주요 UV280 용출 피크가 있었다. 이들 2개의 피크 중 첫 번째에 상응하는 4개의 분획을 풀링하였다. 풀링된 총 용적은 2 mL였다.

풀링된 CIEX 분획을 SEC에 의해 추가로 정제하였다. 풀링된 CIEX 분획은, 울트라셀®-10 (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 막이 있는 아미콘® (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 스핀 농축기를 사용하여 12℃에서 한외 여과함으로써 0.3 mL의 최종 용적으로 농축시켰다. 농축된 샘플을, 0.22 μm 울트라프리-MC GV 원심 분리기 (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 스핀 필터를 사용하여 여과시키고, Cas8 SEC 완충제 (50 mM 트리스 pH 7.5, 200 mM NaCl, 5% 글리세롤, 및 1 mM TCEP)로 평형화시킨 10/300 슈퍼덱스(Superdex)™ 200 GL 인크리즈 (GE 헬스케어; 스웨덴 웁살라) 칼럼 상에 0.6 mL/분의 유속으로 4℃ 하에 분리함으로써 추가로 정제하였다. 단백질을 Cas8 SEC 완충제로 용출시키고 0.5 ml 분획을 수집하였다. UV 280에 의해 판단되는 바와 같이 가장 초기의 용출 피크는 고 분자량 응집 물질인 것으로 가정되었으며 상응하는 분획은 폐기되었다. 두 번째 주요 UV 280 피크는 약 14 mL 후에 용출되었다. 이러한 두 번째 피크에 상응하는 분획을 풀링하였다. 풀링된 샘플은 울트라셀®-3 (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 막이 있는 아미콘® (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 스핀 농축기로 40 μL로 농축시켰다. 농축된 샘플은 -80℃ 하에 저장하였다.

최종 정제된 산물을 분광 광도법으로 분석하여 융합 단백질의 최종 농도를 결정하고 260 nm에서의 흡광도보다 더 큰 280 nm에서의 흡광도에 의해 입증된 바와 같이 상당한 핵산 구성성분의 부재를 확증하였다. FokI-Cas8 융합물의 농도는 280 nm에서의 흡광도를, 무손상 복합체의 0.1% 용액의 계산된 흡광도로 나눔으로써 결정되었다. 정제된 복합체의 0.1% 용액의 예상 흡광도는 1.05 cm^-1이며, 이는 FokI-Cas8 융합에 대한 280 nm에서의 흡광 계수 (86290 M^-1cm^-1)를, 그의 분자량 (82171.32 g/mole)으로 나눔으로써 계산되었다. 부가적으로, 최종 산물은 인스탄트블루™ (익스피던; 미국 캘리포니아주 샌디에이고) 염색으로 염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 분석되었다. 겔 doc™ EZ (바이오-래드; 미국 캘리포니아주 헤라클래스) 영상화기를 사용하여 겔을 영상화하고 이미지랩 (바이오-래드; 미국 캘리포니아주 헤라클래스) 소프트웨어를 사용하여 주석을 달았다. 이러한 분석은 정제된 융합 단백질이 예상된 크기였고, 단지 낮은 수준의 오염 단백질이 존재하였다는 것을 명확하게 보여준다.

실시예 6

생화학적 절단 검정에 사용하기 위한 dsDNA 표적 서열의 생산

캐스케이드 또는 캐스케이드-융합 이펙터 복합체를 사용한 시험관내 DNA 결합 또는 절단 검정에 사용하기 위한 dsDNA 표적 서열은 여러 가지 상이한 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 본 실시예는 합성 ssDNA 올리고뉴클레오티드의 어닐링, gDNA로부터 선택된 핵산 표적 서열의 PCR 증폭, 및/또는 핵산 표적 서열을 박테리아 플라스미드로의 클로닝을 포함하여, 표적 서열을 생산하는 3가지 방법을 설명한다. dsDNA 표적 서열이 캐스케이드 결합 또는 절단 검정에 사용되었다.

A. 합성 ssDNA 올리고뉴클레오티드를 어닐링함으로써 dsDNA 표적 서열을 생산함

CRISPR RNA의 가이드 부분에 의해 인식되는 표적 서열, 이웃한 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM), 및 부가의 5' 및 3' 플랭킹 서열을 포함하는 관심 표적 영역을 코딩하는 DNA 올리고뉴클레오티드는 상업적 제조업체 (인티그레이티드 DNA 테크놀로지스; 미국 아이오와주 코럴빌)로부터 구입하였다. 구축물당 2개의 올리고뉴클레오티드가 정렬되었으며, 하나는 센스 가닥을 포함하고 다른 하나는 넌센스 가닥을 포함한다. 표 26은 박테리오파지 람다 gDNA로부터 유래되는, J3으로 표시된 표적 서열을 함유하도록 정렬된 올리고뉴클레오티드 서열을 열거한다. 표적 및 PAM 서열은 5' 단부와 3' 단부 둘 다에서 20 bp의 부가의 서열에 의해 플랭킹된다.

올리고뉴클레오티드는 1X 어닐링 완충제 (6 mM HEPES, pH 7.0, 및 60 mM KCl)에서 등몰 농도 (10 μM)로 두 올리고뉴클레오티드를 혼합하고, 95℃에서 2분 동안 가열한 다음, 서서히 냉각시킴으로써 어닐링하였다. 이어서, 어닐링된 올리고뉴클레오티드는 캐스케이드 및/또는 캐스케이드-이펙터 도메인 융합 RNP를 사용한 DNA 결합 및/또는 DNA 절단 검정에 직접 사용되었다.

CRISPR RNA의 가이드 부분에 의해 인식되는 표적 서열 뿐만 아니라 플랭킹 이웃한 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 및 부가의 5' 및 3' 플랭킹 서열을 둘 다 포함하는 관심 표적 영역을 코딩하는 5' Cy5 형광 표지된 DNA 올리고뉴클레오티드는 상업적 제조업체 (인티그레이티드 DNA 테크놀로지스; 미국 아이오와주 코럴빌)로부터 구입하였다. 구축물당 4개의 올리고뉴클레오티가 정렬되었으며, 하나는 5' 형광 표지된 센스 가닥을 포함하고, 하나는 5' 비표지된 센스 가닥을 포함하며, 하나는 5' 형광 표지된 넌센스 가닥을 포함하고, 하나는 5' 비표지된 넌센스 가닥을 포함한다. 표적 및 PAM 서열은 5' 단부와 3' 단부 둘 다에서 20 bp의 부가의 서열에 의해 플랭킹된다.

표 27은 박테리오파지 람다 gDNA로부터 유래된 J3으로 표시된 표적 서열, 및 인간 CCR5 로커스로부터 유래된 CCR5로 표시된 대조군 표적 서열을 함유하도록 정렬된 올리고뉴클레오티드 서열을 열거한다.

올리고뉴클레오티드는 1X 어닐링 완충제 (6 mM HEPES, pH 7.0, 60 mM KCl)에서 등몰 농도 (1 μM)로 표지 및 비표지된 또는 2개의 표지된 또는 2개의 비표지된 올리고뉴클레오티드를 혼합하고, 95℃에서 2분 동안 가열한 다음, 서서히 냉각시킴으로써 어닐링하였다. 이어서, 어닐링된 올리고뉴클레오티드는 캐스케이드 및/또는 캐스케이드-이펙터 도메인 융합 RNP를 사용한 DNA 결합 분석에 직접 사용되었다. Cy5 형광 표지된 DNA 올리고뉴클레오티드는 AZURE c600 (아즈레 바이오시스템즈 (Azure BioSystems; 미국 캘리포니아주 더블린)) 바이오 영상화기로 영상화되었다.

이러한 방법은 부가의 표지되거나 비표지된 표적 또는 이중 표적 서열을 생성하는데 적용될 수 있으며, 이로써 이중-표적은 인터스페이서 서열에 의해 분리된 개별 캐스케이드 분자에 의해 표적화된 2개의 프로토스페이서 서열을 함유하는 표적으로서 정의된다.

B. gDNA로부터 PCR 증폭에 의한 dsDNA 표적 서열의 생산

인간 gDNA로부터 유래된 이중 표적에 대한 dsDNA 표적 서열은 gDNA 주형 물질로부터 직접적으로 PCR 증폭을 사용하여 생산되었다. 구체적으로, PCR 반응은 K562 세포 및 Q5 핫 스타트(Hot Start) 고 충실도 2X 마스터 믹스 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs; 미국 매사추세츠주 입스위치))로부터 정제된 인간 gDNA 뿐만 아니라 표 28에 열거된 프라이머를 함유하였으며, 여기서 밑줄이 그어진 부분은 gDNA 내의 프라이머 결합 부위에 상응한다.

PCR은 제조업체의 지침 (뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치)에 따라 수행되었으며, 원하는 산물 DNA (288 bp 길이)를 뉴클레오스핀 겔 및 PCR 클린업 키트 (맥헤리-나겔 (Macherey-Nagel; 미국 펜실베니아주 베들레헴))를 사용하여 정제하였다. 이어서, 이러한 dsDNA는 캐스케이드 및/또는 캐스케이드-이펙터 도메인 융합 RNP를 사용한 DNA 결합 및/또는 DNA 절단 검정에 직접 사용되었다.

C. 표적 서열을 박테리아 플라스미드로 클로닝함으로써 dsDNA 표적 서열을 생산함

CRISPR RNA의 가이드 부분에 의해 인식되는, 프로토스페이서로서 공지되기도 한 표적 서열, 이웃한 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM), 및 부가의 5' 및 3' 플랭킹 서열을 포함하는 관심 표적 영역을 코딩하는 DNA 올리고뉴클레오티드는 상업적 제조업체 (인티그레이티드 DNA 테크놀로지스; 미국 아이오와주 코럴빌)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오티드는 어닐링될 때, 제한 효소 EcoRI 및 BlpI에 의한 또는 BamHI 및 EcoRI에 의한 각각의 인식 부위의 절단 시 말단이 점착성 단부를 재생하도록 설계되었다. 올리고뉴클레오티드는 J3으로 표시된, 박테리오파지 람다 게놈으로부터 유래된 단일 표적 서열을 함유하도록 설계되었다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 J3 및 L3으로 표시된, 박테리오파지 람다 게놈으로부터 유래된 2개의 직렬 표적 서열을 함유하도록 설계되었으며, 이는 15 bp 인터스페이서 서열에 의해 서로 분리되었다. 이들 올리고뉴클레오티드의 서열이 표 29에 열거되어 있다.

올리고뉴클레오티드는 5'-인산화된 단부를 함유하며, 이는 상업적 제조업체에 의해 도입되거나 또는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 사내에서 인산화되었다 (뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치). 이어서, 올리고뉴클레오티드는 어닐링 완충제 (6 mM HEPES, pH 7.0, 60 mM KCl)에서 등몰량을 함께 혼합하고, 95℃로 2분 동안 가열한 다음, 벤치 탑에서 서서히 냉각시킴으로써, 1 μM의 최종 농도에서 어닐링하였다.

별도로, pACYC-Duet1 (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 플라스미드는 BamHI 및 EcoRI 또는 EcoRI 및 BlpI의 상응하는 제한 효소 쌍으로 이중 소화시켰으며, 그의 점착성 단부는 혼성화된 올리고뉴클레오티드의 말단에 의해 형성된 점착성 단부와 매칭된다. 이중 소화된 벡터는 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 제거된 삽입물로부터 분리되었다.

혼성화된 올리고뉴클레오티드를 이중 소화된 벡터에 클로닝하기 위해, 혼성화된 올리고뉴클레오티드를 50 nM 스톡 농도로 희석한 다음, 혼성화된 올리고뉴클레오티드, 이중 소화된 벡터 및 퀵 리가제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치)를 사용하여 10 μL 라이게이션 반응물을 형성하였다. 이어서, 라이게이션 반응물을 사용하여 화학적으로 적격한 이. 콜라이 균주를 형질전환하고, 아가로스 플레이트 상에서 밤새 성장한 후, 개별 클론을 단리하고 액체 배양물에서 성장시켜, 플라스미드를 단리하기에 충분한 박테리아 배양물을 생성하였다. 이어서, 생어 시퀀싱을 사용하여 원하는 플라스미드 서열을 검증하였다. 표 30은 J3 표적 서열을 함유하는 플라스미드 (서열식별번호: 481) 및 15 bp 인터스페이서 서열에 의해 분리된 J3 및 L3 표적 서열을 함유하는 플라스미드 (서열식별번호: 482)에 대한 완전한 벡터 서열을 제공한다.

추가 클로닝 조작을 사용하여 부가의 이중 표적 플라스미드 구축물을 생성하였다. 서열식별번호: 482의 15 bp 인터스페이서 서열은 고유한 AvrII 및 XhoI 제한 부위를 함유한다. 따라서, 이들 제한 부위 내로 부가의 혼성화된 올리고뉴클레오티드를 도입하면, 정제된 캐스케이드 및 캐스케이드-뉴클레아제 융합 RNP를 사용한 생화학적 시험을 위해 인터스페이서가 더 긴 길이로 확장된다. crRNA-가이드된 FokI-캐스케이드 융합 복합체는 2개의 인접한 DNA 부위를 표적화하기 때문에, 인접한 DNA 결합된 복합체로부터의 FokI 도메인의 이량체화는 2개의 표적 부위를 분리하는 인터스페이서 내에서의 DNA 절단으로 이어진다. 가변 인터스페이서 길이는 FokI 뉴클레아제 도메인과 그의 융합된 캐스케이드 서브유닛 단백질 사이에 주어진 테더링 기하학적 구조를 이용하여 주어진 인터스페이서 길이를 평가하기 위해 설계되고 시험되었다. 30 bp의 확장된 인터스페이서 서열을 함유하는 표적 DNA 기질에 대한 완전한 벡터 서열은 서열식별번호: 483으로서 표 30에 제공된다.

또한, 하기 클로닝 전략은 하나의 큰 삽입물을 따라 일련으로 연결된 몇 가지 표적 서열을 함유하는 플라스미드 기질을 제공하였다. 유전자 블록은 17개의 연속적인 이중 표적을 함유하는 상업적 제조업체 (인티그레이티드 DNA 테크놀로지스; 미국 아이오와주 코럴빌)로부터 정렬되었다. 유전자 블록은 이웃한 이중 표적으로부터 각각의 이중 표적을 분리하는 4 bp를 함유하였고, 에이치. 사피엔스 gDNA로부터 유래된 16개의 이중 표적 뿐만 아니라 박테리오파지 람다 게놈으로부터 유래된 J3/L3 표적을 함유하는 하나의 대조군 이중 표적을 함유하였다. 16개의 연속적인 인간 이중 표적의 게놈 좌표가 표 31에 제시되어 있다. 유전자 블록은 단부에 SacI 및 SbfI 제한 부위를 플랭킹하면서 정렬되어, pACYC-Duet1 벡터 내의 SacI 및 SbfI 부위로 클로닝될 수 있도록 하였다. 유전자 블록을 pACYC-Duet1에 클로닝함으로써 생성된 다중-표적 플라스미드 기질의 전체 벡터 서열이 표 30에서 서열식별번호: 484로서 제시된다. 이러한 다중-표적 서열 플라스미드는 플라스미드 내에서 일련으로 연결된 표적 부위 중 하나를 표적화하는 crRNA를 정착시킨 다수의 상이한 FokI-캐스케이드 제제의 생화학적 시험을 허용하였다.

실시예 7

생화학적 절단 검정에서 정제된 캐스케이드 복합체의 사용

본 실시예는 생화학적 dsDNA 절단 검정에서 FokI-캐스케이드 융합 단백질 복합체의 사용을 예시한다. 단백질 시약은 dsDNA 절단에 있어서의 활성 측면에서 비교되었다.

이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 시스템으로부터 유래된 FokI-캐스케이드 RNP는 실시예 1, 2 및 5에 설명된 바와 같이 설계되고, 이. 콜라이에서 재조합적으로 발현되며, 사용을 위해 정제되었다. 이들 RNP는 박테리오파지 람다 gDNA로부터 유래된 J3 및 L3 표적 서열을 표적화하거나, 또는 인간 gDNA 내의 TRAC 유전자에서의 인트론을 표적화하는 CRISPR RNA를 함유하도록 설계되었다. 각각의 RNP 제제는 crRNA의 가이드 부분을 제외하고는 달리 동일한 2개의 FokI-캐스케이드 복합체를 포함하는 이질적 혼합물이다.

FokI-Cas8은 Cas8이 없는 캐스케이드 복합체로부터 별도로 정제되었으며, J3 및 L3 람다 표적 서열을 표적화하는 가이드 폴리뉴클레오티드로 프로그래밍되었으며, PAM-인 입체 배치에서 표적 부위를 정착시킨 J3/L3 플라스미드 기질을 이용한 생화학적 절단 검정에 사용되었다.

FokI-캐스케이드 복합체는 CasBCDE 복합체 (실시예 2에 기재된 바와 같이, 서열식별번호: 440 및 서열식별번호: 446을 사용하여 생산됨)를, 16-aa 링커를 포함하는 정제된 FokI-Cas8 (일반적 FokI-Cas8 발현 벡터 서열는 실시예 2에 기재되어 있고, 표 19에서의 서열식별번호: 439이며; 특별한 16-aa 링커는 실시예 1에 기재되어 있고, 표 17에서의 서열식별번호: 431임)과 함께 혼합함으로써 재구성되었다. 재구성은 CasBCDE 및 FokI-Cas8 둘 다 1 μM 최종 농도에서 1X 캐스케이드 절단 완충제 (20 mM 트리스-Cl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM TCEP, 5% 글리세롤)에서 수행되었다.

DNA 절단 검정을 수행하기 위해, 반응 혼합물은 하기와 같다. 30 bp 인터스페이서를 갖는 J3/L3 이중 표적 서열을 포함하는 플라스미드 기질 (표 30에서의 서열식별번호: 483)은 13.3 ng/μL의 최종 농도 하의 플라스미드 DNA를 사용하여, 1X 캐스케이드 절단 완충제 중의 15 μL 반응물에서 다양한 농도의 FokI-캐스케이드 복합체 (3-100 nM)와 함께 인큐베이션되었다. 반응물은 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 3 μL의 6X SDS 부하 염료를 부가하였다. 결합된 FokI-캐스케이드 복합체를 변성시키기 위해 부하 염료를 부가하였다. 반응 혼합물 구성성분은 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분해되었다. 겔은 SYBR™ 세이프 DNA 겔 염색 (써모 사이언티픽, 미국 델라웨어주 윌밍턴)으로 전기영동 후 염색되었다.

양성 대조군으로서, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질은 캐스케이드 J3 표적 서열의 20 bp 부분을 표적화하는 단일 가이드 RNA (sgRNA) (sgRNA-J3; 스페이서 서열은 서열식별번호: 501로서 제시됨)로 프로그래밍되었다. Cas9/sgRNA-J3 복합체는 1X CCE 완충제 (20 mM HEPES pH 7.4, 10 mM MgCl2, 150 mM KCl, 5% 글리세롤)에서 2배 몰 과량의 sgRNA와 함께 Cas9를 혼합함으로써 재구성되었다. 이러한 Cas9/sgRNA-J3 복합체에 의한 절단은 37℃에서 30분 동안 반응물을 인큐베이션함으로써 동일한 농도 범위 (3-100 nM) 전체에 걸쳐 평가되었다. 또한 본 실험에는 커팅되지 않은 플라스미드 DNA 뿐만 아니라 NheI 제한 효소 (뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치)로 선형화된 플라스미드 DNA를 함유하는 대조군 레인이 포함되었다. 표적 DNA 절단은 플라스미드에서의 이동성 시프트에 의해 입증되는데, 이는 커팅되지 않은 플라스미드 DNA가 슈퍼코일되고, 절단되고 선형화된 플라스미드 DNA보다 더 신속한 이동성을 갖기 때문이다. 닉킹된 열린 원형 플라스미드 DNA는 슈퍼코일된 플라스미드 DNA 및 선형화된 플라스미드 DNA 둘 다보다 더 느린 이동성을 갖는다.

이들 실험으로부터 수득된 데이터는 농도 범위에 걸쳐, FokI-캐스케이드 복합체가 Cas9-sgRNA와 유사한 표적 DNA 절단 활성을 나타낸다는 것을 명확하게 보여준다. 시험된 가장 높은 농도 (100 nM)에서, 플라스미드 표적은 FokI-캐스케이드 복합체 및 Cas9-sgRNA에 의해 정량적으로 선형화되었다.

FokI-캐스케이드 복합체 시약은 또한 표적 DNA 절단의 동역학에 관하여 시험되었다. 30 bp 인터스페이서를 갖는 J3/L3 이중 표적 서열을 함유하는 플라스미드 기질 (서열식별번호: 483)은 13.3 ng/μL의 최종 농도 하의 플라스미드 DNA를 이용하여 15 μL 반응물에서 200 nM FokI-캐스케이드 복합체 또는 200 nM Cas9-sgRNA와 함께 인큐베이션되었다. 반응물을 0, 7, 10, 15, 20, 25, 또는 30분에 켄칭하고, 반응 구성성분을 상기 기재된 바와 같이 아가로스 겔 전기영동에 의해 분해시켰다. FokI-캐스케이드 복합체는 Cas9/sgRNA-J3 복합체와 유사하지만 약간 더 느린 속도의 표적 DNA 절단 활성을 나타냈으며, 표적 플라스미드는 FokI-캐스케이드 복합체의 경우에 25분 시점까지 정량적으로 선형화되었고, Cas9/sgRNA-J3 복합체의 경우에는 20분 시점까지 정량적으로 선형화되었다.

FokI-캐스케이드 복합체 시약은 또한, J3/L3 이중 표적 플라스미드 기질의 특이적 DNA 절단과 비교하여 pACYC-Duet1 비-표적 플라스미드 기질에 대한 비-특이적 DNA 절단 및/또는 닉킹 활성에 관하여 시험되었다. 표 32는 이러한 대조군에 대해 사용된 pACYC-Duet1 비-표적 플라스미드 기질의 서열 (서열식별번호: 502)을 함유한다. 구체적으로, 반응 완충제에서 1가 염 농도의 함수로서 비-특이적 및 특이적 DNA 표적 절단의 의존성을 조사하였다. 1X 캐스케이드 절단 완충제 (20 mM 트리스-Cl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM TCEP, 및 5% 글리세롤)의 변이체를 제조하였으며, 여기서는 NaCl 농도를 200 mM에서 150 mM, 100 mM 또는 50 mM으로 떨어 뜨리고, 200 nM FokI-캐스케이드 복합체를 13.3 ng/μL의 J3/L3 표적 플라스미드 또는 13.3 ng/μL의 pACYC-Duet1 비-표적 플라스미드와 함께 인큐베이션함으로써 상기 기재된 바와 동일한 절단 반응을 수행하였다. NaCl 농도는 100 mM으로 유지되었지만, 5 mM MgCl2가 10 mM EDTA로 대체된 부가의 대조군 반응이 수행되었으며, 이는 DNA 절단을 위한 2가 금속 이온에 대한 FokI의 요구 사항 때문에 절단을 폐기할 것으로 예상되었다. 따라서, 비-표적 플라스미드 및 J3/L3 표적 플라스미드는 하기 반응 조건에 적용되었다: -FokI-캐스케이드 복합체; +FokI-캐스케이드 복합체, 100 mM NaCl 완충제 + 10 mM EDTA; +FokI-캐스케이드 복합체, 50 mM NaCl 완충제; +FokI-캐스케이드 복합체, 100 mM NaCl 완충제; +FokI-캐스케이드 복합체, 150 mM NaCl 완충제; +FokI-캐스케이드 복합체, 200 mM NaCl 완충제. 데이터는 FokI-캐스케이드 복합체가 낮은 염 농도 <200 mM NaCl에서 비-표적 및 J3/L3 표적 플라스미드 둘 다의 비-특이적 닉킹을 보여주었지만, 200 mM NaCl의 1가 염 농도에서는 비-표적 플라스미드가 무손상으로 유지되었지만, J3/L3 표적 플라스미드는 정량적으로 선형화되었다는 것을 명확하게 보여준다. 더욱이, EDTA를 함유하는 완충제는 예상대로 표적 절단의 완전한 폐기를 초래하였다.

FokI-캐스케이드 복합체가 예상되는 위치, 즉 J3과 L3 표적을 분리하는 인터스페이서 서열의 중간 내에서 표적 플라스미드를 절단한다는 것을 확증하기 위해, 표적 플라스미드를 먼저, FokI-캐스케이드 복합체와 함께 인큐베이션한 다음, 플라스미드 기질의 다른 곳에서 절단하는 AfeI 제한 효소 (뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치)와 함께 인큐베이션하는 실험을 수행하였다. 따라서, FokI-캐스케이드 1 복합체와 AfeI 둘 다에 의한 절단은 슈퍼코일된 원형 플라스미드를 아가로스 겔 상에서 별개의 종으로서 이동하는 2개의 선형 단편으로 전환시킨다. 구체적으로, 절단은 길이가 2427 bp 및 1357 bp인 단편을 생성할 것으로 예상되었다.

13.3 ng/μL J3/L3 표적 플라스미드를 200 nM FokI-캐스케이드 1 복합체와 함께 30분 동안 인큐베이션한 후, 1 μL의 AfeI (10 단위/μL; 뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치)를 반응물에 부가한 다음, 37℃에서 30분 더 인큐베이션하였다. 반응 산물을 상기 기재된 바와 같이 아가로스 겔 전기영동에 의해 분해시켰다. 부가적으로, 대조군 실험을 위해 표적 플라스미드를 단지 FokI-캐스케이드 1 복합체 또는 단지 AfeI와 함께 인큐베이션하였고, AfeI에 의해 절단될 수 있지만 FokI-캐스케이드 1 복합체에 의해서는 절단될 수 없는 비-표적 플라스미드 (이러한 플라스미드에 J3/L3 이중 표적이 결여되기 때문임)를 사용하여 동일한 반응을 수행하였다. 표 32는 이러한 대조군에 사용된 pACYC-Duet1 비-표적 플라스미드 기질의 서열 (서열식별번호: 502)을 함유한다. 따라서, 비-표적 플라스미드 및 J3/L3 표적 플라스미드는 하기 반응 조건에 적용되었다: -AfeI/-FokI-캐스케이드 복합체; -AfeI/+FokI-캐스케이드 복합체; +AfeI/+FokI-캐스케이드 복합체; 및 +AfeI/-FokI-캐스케이드 복합체. 데이터는 FokI-캐스케이드 복합체가 예상 위치에서 표적 플라스미드를 절단하였는데, 이는 FokI-캐스케이드 1 복합체와 AfeI의 공동-인큐베이션이 예상 길이의 2개의 선형 산물로 이어지기 때문이라는 것을 명확하게 보여준다.

FokI-캐스케이드 복합체에 의한 DNA 절단의 서열 특이성을 추가로 확증하기 위해, 하기를 함유하는 부가의 대조군 플라스미드 기질이 생성되었다: J3 표적을 플랭킹하는 PAM에서의 돌연변이, L3 표적을 플랭킹하는 PAM에서의 돌연변이, J3/L3 표적을 플랭킹하는 두 PAM에서의 돌연변이; J3 표적 내의 스페이서 서열에서의 돌연변이, L3 표적 내의 스페이서 서열에서의 돌연변이, J3/L3 표적 내의 두 스페이서 서열에서의 돌연변이; 및 J3 표적이지만, L3 표적은 아니고, L3 표적이지만, J3 표적은 아니며, J3 표적도 아니고 L3 표적도 아니다. 따라서, 플라스미드 기질은 하기와 같다: J3 PAM 돌연변이체, L3 PAM 돌연변이체, J3/L3 PAM 돌연변이체, J3 스페이서 돌연변이체, L3 스페이서 돌연변이체, J3/L3 스페이서 돌연변이체, 비-표적 플라스미드, J3-단독 표적, L3-단독 표적, 및 J3/L3 표적 플라스미드. 각각의 표적은 하기 반응 조건에 적용되었다: -NdeI/-FokI-캐스케이드 복합체; +NdeI/-FokI-캐스케이드 복합체; 및 -NdeI/+FokI-캐스케이드 1 복합체. 표 32는 상기 기재된 돌연변이된 모든 플라스미드 기질의 서열 (서열식별번호: 502 내지 서열식별번호: 510)을 함유한다.

DNA 절단 반응은 200 nM FokI-캐스케이드 복합체 및 13.3 ng/μL 플라스미드 기질을 사용하여, 상기 기재된 바와 같이 수행하였고; 각각의 플라스미드 기질을 선형화하기 위한 대조군 반응은 NdeI (뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치)으로 수행되었다. 아가로스 겔 전기영동은 상기 기재된 바와 같이 수행되었다. 데이터는 효율적인 이중-가닥 파손 도입 및 표적 플라스미드의 선형화가 J3/L3 표적 플라스미드에 대해서만 관찰되나, PAM 또는 시드 돌연변이를 정착시킨 대조군 플라스미드에 대해서는 그렇지 않거나, 또는 2개의 표적 부위 중 단지 하나에 대해서는 그렇다는 것을 입증한다.

다양한 FokI-캐스케이드 복합체에 대한 구성성분이 클로닝되고 과다발현되었다. 이들 구성성분에 의해 생산된 RNP는 상이한 FokI-캐스케이드 복합체에 대한 활성을 비교하기 위해 정제되고 생화학적 DNA 절단에 관하여 시험되었다. 구체적으로, DNA 절단 활동은 하기를 포함하는 재구성된 FokI-캐스케이드 복합체에 대해 비교되었다: 별도로 정제된 CasBCDE 복합체 (서열식별번호: 440 및 서열식별번호: 446을 사용하여 생산됨) 및 FokI-Cas8 (서열식별번호: 439를 사용하여 생산됨); J3/L3 가이드 crRNA를 정착시킨 FokI-캐스케이드 (서열식별번호: 442 및 서열식별번호: 446을 사용하여 생산됨); Cas7 서브유닛 (서열식별번호: 443 및 서열식별번호: 446을 사용하여 생산됨) 또는 Cas6 서브유닛 상에 부가의 핵 국재화 시그널을 정착시킨 FokI-캐스케이드; Cas7 서브유닛 또는 Cas6 서브유닛 상에 부가의 핵 국재화 시그널 및 HA 태그를 정착시킨 FokI-캐스케이드; 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)와 이온 교환 크로마토그래피 (IEX) 둘 다를 수반하는 보다 엄격한 정제를 진행한 FokI-캐스케이드; 및 추가 클린업 없이, 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의해서만 정제된 FokI-캐스케이드.

따라서, 비-표적 플라스미드 및 J3/L3 표적 플라스미드는 하기 반응 조건에 적용되었다: 음성 대조군; AfeI; CasBCDE+FokI-Cas8 복합체; FokI-캐스케이드 복합체; FokI-캐스케이드 (NLS-Cas6) 복합체; FokI-캐스케이드 (Cas7-NLS) 복합체; FokI-캐스케이드 (NLS-HA-Cas6) 복합체; FokI-캐스케이드 (Cas7-HA-NLS) 복합체; FokI-캐스케이드 복합체 (IEX, SEC 클린업); 및 FokI-캐스케이드 복합체 (클린업 없음). DNA 절단 반응은 비-표적 플라스미드 또는 컨센서스 J3/L3 표적 플라스미드를 사용하여, 상기 기재된 바와 같이 이들 RNP 시약으로 수행되었고, 반응 산물은 아가로스 겔 전기영동에 의해 분해되었다. 데이터는 한 가지 예외를 제외하고 모든 RNP 시약이 비-표적 플라스미드의 배경 절단 없이, 거의 동일하고 정량적인 플라스미드 DNA 절단을 나타낸다는 것을 명확하게 보여준다. 유일한 예외는 추가 클린업 없이 정제된 FokI-캐스케이드였으며, 이는 비-표적 플라스미드와 함께 인큐베이션된 레인에 대해 볼 수 있는 바와 같이, 더 많은 비-특이적 닉킹 활성을 나타 냈다.

마지막으로, FokI-캐스케이드 복합체의 NLS-태그부착된 Cas7 변이체를 출발점으로서 사용하여, 하나의 큰 삽입물을 따라 일련으로 연결된 에이치. 사피엔스 게놈 부위 Hsa01 내지 Hsa16에 대한 플라스미드 기질 (서열식별번호: 484)의 생화학적 DNA 절단에 관하여, 16개의 상이한 쌍형성된 가이드 crRNA를 시험하였다. 각각의 crRNA 쌍은 인터스페이서에 의해 분리된, 인간 gDNA 내의 2개의 인접한 표적 부위에 상응하는 2개의 고유한 스페이서 서열을 함유하며; 표적 서열은 서열식별번호: 485 내지 서열식별번호: 500에 기재되어 있다. 표 33은 Hsa01 내지 Hsa16 gDNA 서열을 표적화하는 각각의 쌍 내의 두 crRNA의 서열을 함유하고; crRNA의 스페이서에 밑줄이 그어져 있고 소문자로 되어 있으며, 가이드 영역의 5' 및 3'에 있는 서열은 CRISPR 어레이로부터의 반복부 서열에 상응한다.

16개의 FokI-캐스케이드 복합체를 정제한 후, 상기 기재된 바와 같이 절단 반응을 수행했으며, 여기서 FokI-캐스케이드 복합체는 에이치. 사피엔스 게놈 부위 Hsa01 내지 Hsa16를 함유하는 플라스미드 기질과 함께 인큐베이션되었으며, 반응 산물은 아가로스 겔 전기영동에 의해 분해되었다. 데이터는 16개의 RNP 시약 중에서, 14개/16개 (Hsa03-Hsa16)가, 슈퍼코일된 원형 플라스미드 기질을 절단된 선형 형태로 전환함으로써 입증된 바와 같이, 거의 정량적 DNA 절단을 나타냈다는 것을 명확하게 보여준다. 구축물 Hsa01 및 Hsa02 만이 부분적인 닉킹 활성을 나타 냈다. 더욱이, 데이터는 FokI-캐스케이드 복합체가 치료상 관련된 에이치. 사피엔스 유전자를 표적화하기 위해 설계된 16개의 쌍형성된 gRNA를 사용하여 효과적으로 프로그래밍되었다는 것을 입증해 주었다.

실시예 8

표적 세포 내로의 FokI-캐스케이드 RNP 복합체의 도입

본 실시예는 인간 세포에서 게놈 편집을 용이하게 하기 위해 FokI 융합 단백질을 포함하는 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 복합체의 설계 및 전달을 예시하고, 미리 어셈블리된 캐스케이드 RNP 복합체로서 표적 세포로의 전달을 설명한다.

A. 세포로의 형질전환을 위한 FokI를 포함하는 캐스케이드 RNP 복합체의 생산

최소 CRISPR 어레이는 인간 게놈에서 8개의 별개의 로커스를 표적화하도록 설계되었다. 각각의 최소 CRISPR 어레이는 2개의 스페이서 서열을 함유하며, 둘 다는 CRISPR 반복부 서열에 의해 플랭킹되었다. 2개의 스페이서 서열은 30 bp (즉, 30 bp 인터스페이서 영역)에 의해 분리된 게놈 내의 로커스를 표적화하였고, 각각의 스페이서는 표적 세포 게놈에서 AAG 또는 ATG 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열에 인접한 표적 서열에 결합하도록 설계되었다. 각각의 최소 CRISPR 어레이를 함유하는 플라스미드 벡터는 박테리아 발현을 위해 어닐링된 올리고뉴클레오티드 (인티그레이티드 DNA 테크놀로지스; 미국 아이오와주 코럴빌)를 pACYC-Duet1 (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 벡터 백본에 라이게이션함으로써 생산되었다.

최소 CRISPR 어레이에서 선택된 스페이서를 생산하기 위한 중첩 프라이머가 표 34에 제시되어 있고, 프라이머의 서열은 표 35에 기재되어 있다.

캐스케이드 RNP 복합체의 생산을 위한 박테리아 발현 벡터의 설계는 실시예 2에 상세히 기재되어 있다. 간단히 말해서, 각각의 cas 유전자는 단일 오페론으로부터 발현되었으며 cas 유전자에 대한 코딩 서열은 cas8-cse2-cas7-cas5-cas6의 순서로 배열되었다. FokI 모이어티는 30-aa 링커에 의해 Cas8에 부착되고, 핵 국재화 시그널 (NLS)은 FokI-Cas8 (FokI-캐스케이드 복합체)의 N-말단 및 Cas6의 N-말단에 부착되었다 (FokI-캐스케이드-NLS-Cas6 복합체로서 후술되기도 함; 서열식별번호: 577).

FokI-캐스케이드-NLS-Cas6 복합체는 본질적으로 실시예 5A에 기재된 바와 같이 이. 콜라이로부터 어셈블리된 복합체로서 정제되었다.

B. FokI를 포함하는 캐스케이드 RNP 복합체의 진핵 세포 내로의 형질감염

HEK293 세포 (ATCC; 미국 버지니아주 마나사스)는 37℃, 5% CO₂ 및 100% 습도에서 10% FBS 및 1x 항생제-항진균제 용액 (메디아테크, 인크. (Mediatech, Inc.; 미국 버지니아주 마나사스))이 보충된 DMEM 배지에서 현탁액으로 배양되었다. HEK293 세포는 뉴클레오펙터(Nucleofector)® 96-웰 셔틀 시스템 (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일)을 사용하여 형질감염되었다. 뉴클레오펙션 전에, 5 μl의 FokI-캐스케이드 RNP를 96-웰 플레이트의 개별 웰로 옮겼다. 각각의 웰은 RNP에 따라 ~225-500 pmol의 FokI-캐스케이드-NLS-Cas6 복합체를 함유하였다. HEK293 세포를 50 ml 원뿔형 원심 분리기 튜브로 옮기고 200 xG에서 3분 동안 원심 분리하였다. 배지를 흡인하고 세포 펠릿을 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS로 세척하였다. 세포를 한 번 더 원심 분리하고 1x10⁷개 세포/ml의 농도로 뉴클레오펙터 SF (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일) 완충제에 재현탁시켰다. 이러한 세포 현탁액 20 μl를 96-웰 플레이트 내의 FokI-캐스케이드-NLS-Cas6 복합체에 부가하고, 혼합한 다음, 전체 용적을 96-웰 뉴클레오큐벳(Nucleocuvette)™ (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일) 플레이트로 옮겼다. 이어서, 플레이트를 뉴클레오펙터™ 96-웰 셔틀™ 시스템 (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일)으로 부하하고, 세포를 96-CM-130 뉴클레오펙터™ 프로그램 (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일)을 사용하여 뉴클레오펙션하였다. 뉴클레오펙션 직후, 80 μl의 완전 DMEM 배지를 96-웰 뉴클레오큐벳™ (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일) 플레이트의 각각의 웰에 부가하였다. 이어서, 웰의 전체 내용물을 100 μl의 완전 DMEM 배지를 함유하는 96-웰 조직 배양 플레이트로 옮겼다. 세포를 37℃, 5% CO₂ 및 100% 습도에서 ~72시간 동안 배양하였다.

~72시간 후, HEK293 세포를 500 xG에서 5분 동안 원심 분리하고 배지를 제거하였다. 세포를 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS로 세척하였다. 이어서, 세포 펠릿을 50 μl의 퀵익스트랙트(QuickExtract) DNA 추출 용액 (에피센트레 (Epicentre; 미국 위스콘신주 매디슨))에 재현탁시켰다. 이어서, 수득된 gDNA 샘플을 37℃에서 10분, 65℃에서 6분, 및 95℃에서 3분 동안 인큐베이션하여 반응을 중지시켰다. 이어서, gDNA 샘플을 50 μl의 물로 희석하고 후속 심층 시퀀싱 분석을 위해 -20℃에 저장하였다.

C. 형질감염된 세포로부터의 gDNA의 심층 시퀀싱

단리된 gDNA를 사용하여, 1x 농도의 Q5 핫 스타트 고 충실도 2X 마스터 믹스 (뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치), 각각 0.5 μM의 프라이머, 10 μL의 최종 용적의 gDNA 3.75 μL를 사용하여 제1 PCR을 수행하였고, 98℃에서 1분 동안, 98℃에서 10초, 60℃에서 20초, 72℃에서 30초, 및 72℃에서 2분 동안 최종 연장의 35 사이클로 증폭시켰다. PCR 반응물을 물에서 1:100으로 희석시켰다. 표적-특이적 프라이머가 표 36에 제시되어 있다. 표적-특이적 프라이머는 일루미나(Illumina)-화합성 서열을 함유하므로, 증폭 산물은 MiSeq 서열 분석기 (일루미나; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)를 사용하여 분석할 수 있었다.

*DNA 프라이머 서열은 표 35에 제시된다

제2 "바코딩" PCR은 각각의 표적이 각각 고유한 8-bp 인덱스 (프라이머 서열 (서열식별번호: 575 및 서열식별번호: 576 참조)에서 "NNNNNNNN"으로 표시됨)를 함유하는 프라이머 (표 35에서의 G2 및 H2)로 증폭되도록 설정되었으며, 따라서 서열 분석 동안 각각의 앰플리콘의 탈다중화를 허용하였다.

1x 농도의 Q5 핫 스타트 고 충실도 2X 마스터 믹스 (뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치), 각각 0.5 μM의 프라이머, 10 μL의 최종 용적의, 1:100 희석된 제1 PCR 1μL를 사용하여 제2 PCR을 수행하였고, 98℃에서 1분 동안, 98℃에서 10초, 60℃에서 20초, 72℃에서 30초, 및 72℃에서 2분 동안 최종 연장의 12 사이클로 증폭시켰다. PCR 반응물은 시퀀싱을 위해 앰플리콘의 SPRI셀렉트(SPRIselect) 비드 (베크만 쿨터 (Beckman Coulter; 미국 캘리포니아주 파사데나))-기반 클린업을 위한 단일 마이크로퍼지 튜브 내로 풀링하였다.

풀링된 앰플리콘에, 0.9x 용적의 SPRI셀렉트 비드를 부가하고, 혼합하며, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 용액이 청정해질 때까지 마이크로퍼지 튜브를 자기 튜브 스탠드 (베크만 쿨터; 미국 캘리포니아주 파사데나)에 놓아 두었다. 상청액을 제거하고 폐기하며, 잔류 비드를 1 용적의 85% 에탄올로 세척하고, 실온 (RT)에서 30초 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 에탄올을 흡인하고, 비드를 실온에서 10분 동안 공기 건조시켰다. 이어서, 마이크로퍼지 튜브를 자기 스탠드로부터 제거하고 0.25x 용적의 물을 비드에 부가하고, 격렬하게 혼합하며 실온에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 마이크로퍼지 튜브를 미세원심분리기에서 회전시켜 튜브의 내용물을 수집한 다음, 자석으로 되돌려 보내고, 용액이 청정해질 때까지 인큐베이션하며, 정제된 앰플리콘을 함유하는 상청액을 깨끗한 마이크로퍼지 튜브에 분배하였다. 정제된 앰플리콘 라이브러리는 나노드롭(Nanodrop)™ 2000 (써모 사이언티픽; 미국 델라웨어주 윌밍턴) 시스템을 사용하여 정량화되었다.

앰플리콘 라이브러리는 260 nm에서의 광학 흡광도 (나노드롭™ 2000 (써모 사이언티픽; 미국 델라웨어주 윌밍턴) 시스템) 및 앰플리콘의 크기로부터 계산된 바와 같이 4 nM 농도로 정규화되었다. 라이브러리는 MiSeq 시약 키트 v2, 300 사이클 (일루미나; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)을 사용하여 MiSeq 서열 분석기 (일루미나; 미국 캘리포니아주 샌디에이고) 상에서 2개의 151 사이클 페어드-엔드 실행 플러스 2개의 8 사이클 인덱스 판독값을 사용하여 분석되었다.

D. 심층 시퀀싱 데이터 분석

시퀀싱 데이터에서 산물의 실체는 PCR의 제2 라운드에서 앰플리콘 상에 적응된 인덱스 바코드 서열을 기반으로 분석되었다. MiSeq (일루미나; 미국 캘리포니아주 샌디에이고) 데이터를 처리하기 위해 하기 작업을 실행하는 계산 스크립트가 사용되었다:

판독값은 보타이(Bowtie) (bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) 소프트웨어를 사용하여 인간 게놈 (빌드 GRCh38/38)에 정렬되었다.

정렬된 판독값은 야생형 로커스와 비교되었으며; 로커스의 어떤 부분에도 정렬되지 않은 판독값은 폐기되었다.

야생형 서열과 매칭되는 판독값이 집계되었다. indel을 포함한 판독값 (FokI-캐스케이드 RNP 예상 커트 부위로부터 10 bp 주변)은 indel 유형별로 분류되고 집계되었다.

총 indel 판독값을 야생형 판독값과 indel 판독값의 합계로 나누어 퍼센트 돌연변이된 판독값을 제공하였다.

도 28은 FokI-캐스케이드-NLS-Cas6 복합체 뉴클레오펙션 (n=1) (도 27, 수평축, Hsa3, Hsa4, Hsa5, Hsa6, Hsa7, Hsa8, Hsa9, 및 Hsa10)의 함수로서의 게놈 편집 (도 28, 수직축, "% 편집")을 제시한다. 도 28에서, 열린 막대는 음성 대조군이고, 흑색 막대는 FokI-캐스케이드-NLS-Cas6 복합체의 부가이다. FokI-캐스케이드-NLS-Cas6 복합체는 8개 모든 로커스에서 편집을 유도하였다. 편집 범위는 ~0.2-5% indel이며, indel은 인터스페이서 영역의 중간에서 예상 커트 부위를 중심으로 이루어졌다.

실시예 9

FokI-캐스케이드 RNP 복합체의 구성성분을 코딩하는 플라스미드를 표적 세포 내로 도입함

본 실시예는 인간 세포에서 게놈 편집을 용이하게 하기 위해 FokI 융합 단백질을 포함하는 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 복합체의 설계 및 전달을 예시한다. 본 실시예는 또한 캐스케이드 복합체 구성성분을 발현하는 플라스미드 벡터를 진핵 세포로 전달하는 것을 설명한다.

A. 표적 세포 내로 형질감염될 FokI-캐스케이드 RNP 구성성분을 코딩하는 벡터의 생산

최소 CRISPR 어레이는 인간 게놈에서 TRAC 로커스를 표적화하도록 설계되었다. 최소 CRISPR 어레이는 2개의 스페이서 서열을 함유하였고, 둘 다는 실시예 1 및 3에 기재된 바와 같이 CRISPR 반복부 서열에 의해 플랭킹되었다. 2개의 스페이서 서열은 30 bp에 의해 분리된 게놈 내의 로커스를 표적화하였고, 각각의 스페이서는 AAG PAM 서열에 인접한 게놈 서열에 상보적이었다. 최소 CRISPR 어레이를 함유하는 플라스미드 벡터는 2개의 스페이서 서열에 의해 플랭킹된 CRISPR 반복부를 코딩하는 어닐링된 올리고뉴클레오티드 (인티그레이티드 DNA 테크놀로지스; 미국 아이오와주 코럴빌)를 2개의 CRISPR 반복부 서열이 있는 포유동물 발현 벡터에 라이게이션함으로써 생산되었다. 이로써 생성된 플라스미드는 인간 U6 (hU6) 프로모터 (서열식별번호: 454)로부터의 2개의 가이드를 발현하는 "반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부"를 함유하였다.

FokI-캐스케이드 RNP 단백질 구성성분 코딩 유전자를, CMV 프로모터를 함유하는 플라스미드 벡터로 클로닝하여 포유동물 세포에서의 전달 및 발현을 가능하게 하였다. Cas 유전자를 별도의 플라스미드 (서열식별번호: 448 내지 서열식별번호: 451 및 서열식별번호: 453)로 클로닝하거나 또는 2A 바이러스 펩티드 "리보솜-스키핑" 서열을 통해 연결된 각각의 유전자를 갖는 폴리시스트론성 구축물로서 단일 플스미드 (서열식별번호: 455)에서 클로닝하였다. FokI-캐스케이드 RNP 복합체는 2가지 상이한 방법을 통해 진핵 세포로 전달되었다: cas 유전자 및 최소 CRISPR 어레이를 별도의 플라스미드 (6-플라스미드 전달 시스템, 서열식별번호: 448 내지 서열식별번호: 451, 서열식별번호: 453 및 서열식별번호: 454) 상에 공급하거나, 또는 폴리시스트론성 구축물로서 모든 cas 유전자를 코딩하는 하나의 플라스미드 및 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 제2 플라스미드 (2-플라스미드 전달 시스템, 서열식별번호: 454 및 서열식별번호: 455) 상에 공급하였다.

B. FokI-캐스케이드 RNP 복합체를 코딩하는 플라스미드(들)의 형질감염

6-플라스미드 전달 시스템 및 2-플라스미드 전달 시스템에 대한 형질감염 조건은 하기 변형을 수반하여 실시예 8B에 상세히 기재된 바와 같이 수행되었다. 뉴클레오펙션 전에, 5 μl의 플라스미드 벡터 용액을 96-웰 플레이트의 개별 웰로 옮겼다. 6-플라스미드 전달 시스템은 게놈 편집을 위해 각각의 구성성분의 필요성을 조사함으로써 초기에 시험되었다. 보다 구체적으로, 플라스미드 "칵테일"을 각각의 웰에 부가하여, 일정한 양 (420 ng)의 5개의 플라스미드와 가변 양의 제6 플라스미드 (0 ng, 70 ng, 700 ng, 또는 1,400 ng)가 존재하도록 하였다. 다음으로, 최소 CRISPR 어레이 플라스미드 대 cas-코딩 플라스미드(들)의 비를 변화시키면서 총 플라스미드 DNA의 고정된 양 (3.5μg)으로 뉴클레오펙션함으로써 6-플라스미드 전달 시스템과 2-플라스미드 전달 시스템을 비교하였다. 마지막으로, 후속 심층 시퀀싱 분석을 위해 뉴클레오펙션 후 ~72시간에 용해물을 수거하였다.

C. 형질감염된 세포로부터의 gDNA의 심층 시퀀싱 및 데이터 분석

심층 시퀀싱은 실시예 8C에 상세히 기재된 바와 같이 수행되었으나, 표 36으로부터의 표적-특이적 프라이머 Y 및 Z 만 사용하였다.

D. 심층 시퀀싱 데이터 분석

심층 시퀀싱 데이터 분석은 실시예 8D에 상세히 기재된 바와 같이 수행되었다. 도 29는 6-플라스미드 전달 전략 (n=1)에서 각각의 FokI-캐스케이드 구성성분 (도 29, 수평축, 가이드, FokI-Cas8, Cse2, Cas7, Cas5, Cas6, 및 참조 샘플)의 함수로서 TRAC 로커스에서의 게놈 편집 (도 29, 수직축, "% 편집")을 제시한다. 도 29에서, 열린 막대는 0 ng의 FokI-캐스케이드 구성성분을 나타내고, 점각 막대는 70 ng의 FokI-캐스케이드 구성성분을 나타내며, 사각형 패턴 막대는 700 ng의 FokI-캐스케이드 구성성분을 나타내고, 줄무늬 막대는 1,400 ng의 FokI-캐스케이드 구성성분을 나타낸다 (수평축 상의 막대 순서는 각각의 FokI-캐스케이드 구성성분에 대해 각각 좌측에서 우측임). 제시된 바와 같이, 주어진 구성성분이 결여된 경우에, 편집이 폐지되거나 크게 감소되었다 (Cse2의 경우). 이는 플라스미드 전달을 통한 편집을 위해서는 각각의 캐스케이드 구성성분이 필요하다는 것을 확증시켜 준다.

도 30은 게놈 편집을 6-플라스미드 전달 시스템 또는 2-플라스미드 전달 시스템과 비교한 데이터를 제시한다. 도 30은 6-플라스미드 (도 30, 열린 막대) 및 2-플라스미드 (도 30, 흑색 막대) 시스템의 각각의 구성성분의 다양한 농도 (도 30, 수평축 상의 막대 순서는 6-플라스미드 시스템 및 2-플라스미드 시스템에 대해 각각, 좌측에서 우측임)의 함수로서 표적 로커스에서의 게놈 편집 (도 30, 수직축, "% 편집")을 제시한다. 수평축을 따라 수치적 그룹핑은 구성성분의 양을 지칭한다: 상부 라인 = ng 단위의 총 플라스미드, 제2 라인 = ng 단위의 최소 CRISPR 어레이 플라스미드, 및 제3 라인 = ng 단위의 Cas-코딩 플라스미드 (예를 들어, 제1 수치적 그룹핑: 상부 라인 = 총 플라스미드, 3500 ng; 제2 라인 = 최소 CRISPR 어레이 플라스미드, 0 ng; 및 제3 라인 = Cas-코딩 플라스미드, 3500 ng).

두 방법 전체에 걸쳐, 가장 높은 비의 cas:최소 CRISPR 어레이 플라스미드를 이용하여 최고 수준의 편집이 달성되었다. 부가적으로, 폴리시스트론성 플라스미드는 잠재적으로 플라스미드 μg당 전사 증가로 인해, 더 높은 수준의 편집을 가능하게 하였다.

실시예 10

캐스케이드 서브유닛 단백질의 순환 순열

본 실시예는 구조-가이드된 모델링 접근법을 사용하여 순환적으로 순열된 (cp) 이. 콜라이 유형 I-E Cas7 단백질의 인 실리코 설계, 클로닝, 발현 및 정제를 예시한다.

A. 인 실리코 설계

이. 콜라이 캐스케이드 결정 구조 5H9E.pdb에 기반한 구조-가이드된 접근법을 사용하여, 이. 콜라이 유형 I-E Cas7 단백질 (서열식별번호: 18)을 순환적으로 순열시켰다 (www.rcsb.org/pdb/; Hayes, R.P, et al., Nature 530(7591):499-503 (2016)). 천연 Cas7 N-말단 및 C-말단은 서열 글리신-세린 (G-S)을 갖는 2-아미노산 펩티드 링커와 연결되었다. 이러한 원형화된 Cas7의 폴리펩티드 서열은 새로운 N-말단 (잔기 302)과 새로운 C-말단 (잔기 301)을 형성하기 위해 야생형 Cas7 폴리펩티드 서열에서 잔기 301과 302 사이의 펩티드 결합에 상응하는 위치에서 개방되어, Cas7 단백질의 순환 순열된 버전 (cp-Cas7 V1 단백질)이 생성되었다. 새로운 N-말단 및 새로운 C-말단은 Cas7 단백질 폴드 또는 캐스케이드 복합체 어셈블리를 방해하지 않고 융합 단백질 또는 링커 영역과의 연결을 위해 위치하도록 설계되었다. 메티오닌 잔기를 cp-Cas7 V1 단백질 (서열식별번호: 578)의 새로운 N-말단 (즉, 야생형 Cas7 단백질의 잔기 302에 상응하는 아미노산 잔기)에 부가하였다.

제2 cp-Cas7 단백질인 cp-Cas7 V2 단백질은 G-S 링커를 사용하여 유사하게 조작되었다. cp-Cas7 V2 단백질의 N-말단 및 C-말단은 야생형 Cas7 서열에서 각각 잔기 338 및 339에 상응한다. 새로운 N-말단 및 새로운 C-말단은 Cas7 단백질 폴드 또는 캐스케이드 복합체 어셈블리를 방해하지 않고 융합 단백질 또는 링커 영역과의 연결을 위해 위치하도록 설계되었다. 메티오닌 잔기를 cp-Cas7 V2 단백질 (서열식별번호: 579)의 N-말단 (즉, 야생형 Cas7 단백질의 잔기 339에 상응하는 아미노산 잔기)에 부가하였다.

B. cp-Cas7을 포함하는 캐스케이드 복합체의 클로닝, 발현 및 정제

cp-Cas7 V1 단백질 및 cp-Cas7 V2 단백질의 인 실리코 설계된 폴리펩티드 서열의 DNA 코딩 서열은 이. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈-최적화되었다.

이들 DNA 코딩 서열은 합성을 위해 상업적 제조업체 (젠스크립트; 미국 뉴저지주 피스카타웨이)에 제공되었다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 발현 벡터에서 야생형 Cas7 단백질을 대체하기 위해 DNA 서열을 캐스케이드-오페론 발현 벡터 (표 19; 서열식별번호: 441) 내로 개별적으로 도입하였다.

각각의 발현 벡터를 실시예 2에 기재된 바와 같이, 표 20에 제시된 J3 표적에 대한 가이드 RNA를 코딩하는 제2 벡터 (서열식별번호: 444)를 사용하여 이. 콜라이 BL21 스타™ (써모 피셔 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬) 세포 내로 형질감염시켰다. 세포를 실시예 4B에 기재된 바와 같이 배양하였다. Cas5, Cas6, cp-Cas7 V1, Cse2, 및 Cas8 단백질 뿐만 아니라 가이드 RNA/표적 J3을 함유하는 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 복합체; 및 Cas5, Cas6, cp-Cas7 V2, Cse2, 및 Cas8 단백질 뿐만 아니라 가이드 RNA/표적 J3을 함유하는 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 복합체를 실시예 5A에 기재된 바와 같이 정제하였다.

cp-Cas7 변이체를 포함하는 캐스케이드 복합체의 정제는 순환적으로 순열된 유형 I-E CRISPR-Cas 서브유닛 단백질이, 야생형 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체와 본질적으로 동일한 조성 (분자량 기준)을 갖는 캐스케이드 복합체를 형성하는데 성공적으로 사용될 수 있다는 것을 명확하게 보여준다.

C. 캐스케이드/cp-Cas7 및 J3 표적의 EMSA (전기영동 이동성 시프트 검정)

정제된 캐스케이드/cp-Cas7 복합체를 본 실시예에 기재된 바와 같이 정제하고 EMSA를 수행하여 각각의 표적 서열에 대한 특이적 결합을 입증하였다. 간단하게, 캐스케이드/cp-Cas7 및 캐스케이드/wt-Cas7을 정제하고 10 mg/mL로 농축시켰다. Cy5 이중-가닥 표적 DNA는 본질적으로 실시예 6A에 기재된 바와 같이 생산되었고, TE 완충제에서 1 μM로 희석되었다 (J3 표적 서열식별번호: 469 및 서열식별번호: 472 및 CCR5 표적 서열식별번호: 474 및 서열식별번호: 470). 캐스케이드 복합체 및 표지된 이중-가닥 표적 DNA를 37℃에서 30분 동안 상이한 단백질/표적 비로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 직후, 2 μl의 50% 글리세롤을 샘플에 부가하고, 5% 천연 PAA 겔에 부하하였다. 겔을 0.5x TBE 완충제에서 90분 동안 70V에서 4℃ 하에 실행하고, AZURE c600 바이오 영상화기 (아즈레 바이오시스템즈; 미국 캘리포니아주 더블린) 상에서 영상화하며, 밴드를 정량화하였다. 데이터가 표 37에 제시된다.

*LOD = 검출 한계 미만

실시예 11

캐스케이드 서브유닛 융합 단백질

A. FokI과의 캐스케이드 서브유닛 융합

본 실시예는 캐스케이드 복합체에 뉴클레아제 활성을 부여하기 위해 FokI 뉴클레아제 도메인과 융합된 이. 콜라이 유형 I-E Cas8 단백질의 인 실리코 설계, 클로닝, 발현 및 정제를 예시한다.

이. 콜라이 유형 I-E Cas8은 플라보박테리움 오케아노코이테스(Flavobacterium okeanokoites) FokI 뉴클레아제 도메인 (젠뱅크 번호 AAA24927.1)과 N-말단에 융합되었다. FokI 뉴클레아제 도메인은 문헌 [Guo, J., et al., J. Mol. Biol. 400:96-107 (2010)]에 기재된 샤키 변이체에 함유된 잔기를 포함하고, 동종이량체화 시 이중-가닥 DNA 절단을 촉매한다. FokI 뉴클레아제에 대한 아미노산 서열 (서열식별번호: 580)은 잔기 Q384 내지 F579를 함유하였고 (젠뱅크 번호 AAA24927.1), 하기 점 돌연변이를 갖는다: E486Q, L499I, 및 D469N. 간략하게, FokI 샤키 뉴클레아제 도메인 (서열식별번호: 581)은 링커 서열 (서열식별번호: 582)을 사용하여 Cas8과 N-말단 융합시켰다. 정제 목적으로, 헥사히스티딘 태그 (His6, 서열식별번호: 583)에 이어, MBP 태그 (서열식별번호: 584)에 이어, TEV 프로테아제 절단 서열 (서열식별번호: 585), 핵 국재화 시그널 (NLS, 서열식별번호: 586), 및 GGS 링커를 FokI의 잔기 384에 N-말단 첨부하였다. 최종 구축물은 단백질 서열에서 NH3-His6-MBP-TEV-NLS-GGS-FokI샤키-30aa-링커-Cas8-COOH를 포함하였다 (서열식별번호: 413).

인 실리코 설계된 DNA 서열은 합성을 위해 상업적 제조업체 (젠스크립트; 미국 뉴저지주 피스카타웨이)에 제공되었다. DNA 서열은 pET 발현 (밀리포어시그마; 미국 캘리포니아주 헤이워드) 패밀리 벡터 백본으로 클로닝되었으며, 이는 실시예 2에 기재된 바와 같이 kanR 유전자의 존재로 인해 카나마이신 내성을 부여하여, NH3-His6-MBP-TEV-NLS-GGS-FokI샤키-30aa-링커-Cas8-COOH를 운반하는 벡터를 생성한다 (서열식별번호: 439).

이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 H3-His6-MBP-TEV-NLS-GGS-FokI샤키-30aa-링커-Cas8-COOH (서열식별번호: 439)는 실시예 4B 및 실시예 5C에 기재된 바와 같이 발현 및 정제되었다. TEV 절단 다음의 단백질 서열은 NH3-NLS-GGS-FokI샤키-30aa-링커-Cas8-COOH를 포함한다 (서열식별번호: 587).

유사하게, 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 NLS-FokI-링커-Cas8_His6-HRV3C-Cse2_Cas7_Cas5_Cas6을 운반하는 벡터 (서열식별번호: 442)에서 Fok1-Cas8 융합 단백질을 구축하였다. 각각의 발현 벡터를 실시예 2에 기재된 바와 같이, J3 표적에 대한 가이드 RNA를 코딩하는 제2 벡터 (서열식별번호: 444)를 사용하여 이. 콜라이 BL21 스타™ (써모 피셔 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬) 세포로 형질감염시켰다. 이러한 구축물을 실시예 4B 및 실시예 5A에 기재된 바와 같이 발현 및 정제하였다. 상기 융합된 FokI-Cas8 변이체를 포함하는 캐스케이드 복합체의 정제는 뉴클레아제 융합된 유형 I-E CRISPR-Cas 서브유닛 단백질이, 야생형 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체와 본질적으로 동일한 조성 (분자량 기준)을 갖는 캐스케이드 복합체를 형성하는데 성공적으로 사용될 수 있다는 것을 명확하게 보여준다. FokI-Cas8 융합은 표적 핵산의 생화학적 절단 (실시예 7) 및 진핵 세포에서 게놈 서열의 세포 내 절단 (실시예 8D 및 실시예 9D)에 성공적으로 사용되었다.

표 38은 Cas 서브유닛 단백질-효소 융합의 추가 예를 열거한다. 표 38에서, APOBEC는 시티딘 데아미나제 경로의 구성원인 유전자에 상응하고 (인간 APOBEC I 젠뱅크 번호 AB009426, 인간 APOBEC 3F 젠뱅크 번호 CH471095, 인간 APOBEC 3G 젠뱅크 번호 CR456472, 래트 APOBEC UCSC 게놈 브라우저 ID RGD:2133 래트); AID는 활성화 유도된 시티딘 데아미나제에 상응하며 (젠뱅크 번호 AY536516); PmCDA1은 AID 오르소로그이고 (예를 들어, 문헌 [Nishida, et al., Science 16:353 (2016); Iwamatsu, et al., J. Biochem. 110:151-158 (1991)] 참조); PvuIIHIFIT46G는 PvuII 고 충실도 변이체 T46G이며 (예를 들어, 문헌 [Fonfara, et al., Nucleic Acids Res. 40:847-860 (2012)] 참조); PvuII단일쇄T46G는 pdbID 3KSK에 기재되고; I-TevI는 박테리오파지 T4로부터의 부위 특이적, 서열 내성 귀소 엔도뉴클레아제이며, N-말단 촉매 도메인 뿐만 아니라 C-말단 DNA-결합 도메인 (이들 도메인은 긴 가요성 링커에 의해 연결됨)을 포함하며 (예를 들어, 문헌 [Van Roey, et al., EMBO J. 20:3631-3637 (2001)] 참조); BcnI (예를 들어, 문헌 [Sokolowska, et al., J. Mol. Biol. 369:722-734 (2007)] 참조); 및 MvaI (예를 들어, 문헌 [Kaus-Drobek, et al., Nucleic Acids Res. 35:2035-2046 (2007)] 참조)가 제한 효소이다.

B. 또 다른 캐스케이드 서브유닛 단백질과의 캐스케이드 서브유닛 단백질 융합

캐스케이드 복합체의 2개의 Cse2 단백질을 이. 콜라이 캐스케이드 결정 구조 5H9E.pdb (www.rcsb.org/pdb/; 예를 들어, 문헌 [Hayes, R.P, et al., Nature 530(7591):499-503 (2016)] 참조)에 기반한 구조-가이드된 접근법을 사용하여 함께 융합시켰다. 간단하게, 하나의 Cse2의 C-말단과 제2 Cse2의 N-말단을, 10-aa 가요성 링커 (서열식별번호: 589)를 사용하여 함께 융합시켰다. Cse2-Cse2 (CasB_CasB) 융합 단백질의 완전한 서열이 서열식별번호: 588에 제시된다.

인 실리코 설계된 DNA 서열은 합성을 위해 상업적 제조업체 (젠스크립트; 미국 뉴저지주 피스카타웨이)에 제공되었다. DNA 서열은 실시예 2에서 설계된 발현 벡터 (서열식별번호: 441)에 클로닝되었다. Cse2 서열은 서열식별번호: 588로 교환되었다.

각각의 발현 벡터를 실시예 2에 기재된 바와 같이, J3 표적에 대한 가이드 RNA를 코딩하는 제2 벡터 (서열식별번호: 444)를 사용하여 이. 콜라이 BL21 스타™ (써모 피셔 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬) 세포로 형질감염시켰다. Cas5, Cas6, Cas7, Cse2-Cse2, 및 Cas8을 함유하는 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 복합체를 실시예 4B 및 5B에 기재된 바와 같이 발현 및 정제하였다. 융합된 Cse2-Cse2 변이체를 포함하는 캐스케이드 복합체의 정제는, 융합된 유형 I-E CRISPR-Cas 서브유닛 단백질이 야생형 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체와 본질적으로 동일한 조성 (분자량 기준)을 갖는 캐스케이드 복합체를 성공적으로 형성하였다는 것을 명확하게 보여준다.

C. 캐스케이드/Cse2-Cse2 및 J3 표적의 전기영동 이동성 시프트 검정 (EMSA)

정제된 캐스케이드/Cse2-Cse2 복합체를 본 실시예에 기재된 바와 같이 정제하고 EMSA에 적용하여 각각의 표적 서열에 대한 특이적 결합을 입증하였다. 간단하게, 캐스케이드/Cse2-Cse2 및 캐스케이드/WT-Cse2를 정제하고 10 mg/mL로 농축시켰다. Cy5 이중-가닥 표적 DNA를 실시예 6A에 기재된 바와 같이 생산하고 TE 완충제에서 1 M으로 희석하였다 (J3 표적 서열식별번호: 469 및 서열식별번호: 472 및 CCR5 표적 서열식별번호: 474 및 서열식별번호: 470). 캐스케이드 복합체 및 표지된 이중-가닥 표적 DNA를 37℃에서 30분 동안 상이한 단백질/표적 비로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 직후, 2 μl의 50% 글리세롤을 샘플에 부가하고, 5% 천연 PAA 겔에 부하하였다. 겔을 0.5x TBE 완충제에서 90분 동안 70V에서 4℃ 하에 실행하고, AZURE c600 바이오 영상화기 (아즈레 바이오시스템즈; 미국 캘리포니아주 더블린) 상에서 영상화하며, 밴드를 정량화하였다. 데이터가 표 39에 제시된다.

*LOD = 검출 한계 미만

D. 또 다른 캐스케이드 서브유닛 단백질 및 효소 단백질 도메인과의 캐스케이드 서브유닛 단백질 융합

시티딘 데아미나제 rAPOBEC1 (아포지단백질 B mRNA 편집 효소 촉매 서브유닛 1, 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus); NCBI 유전자 ID: 25383, uEnsembl:ENSRNOG00000015411)이 융합을 위해 선택되었다. Cse2-Cse2 단백질을 이. 콜라이 캐스케이드 결정 구조 5H9E.pdb (www.rcsb.org/pdb/; 예를 들어, 문헌 [Hayes, R.P, et al., Nature 530(7591):499-503 (2016)] 참조)에 기반한 구조 유도 접근법을 사용하여 rAPOBEC1과 융합시켰다. 간단하게, rAPOBEC1 (서열식별번호: 590)의 C-말단을, 9-aa 가요성 링커 (서열식별번호: 591)를 사용하여 Cse2-Cse2 이량체 (상기 기재됨)의 N-말단과 융합시켰다. rAPOBECI_Cse2-Cse2 융합 단백질의 완전한 서열이 서열식별번호: 592에 제시된다.

인 실리코 설계된 DNA 서열은 합성을 위해 상업적 제조업체 (젠스크립트; 미국 뉴저지주 피스카타웨이)에 제공되었다. DNA 서열은 Cse2 서열을 대체하여 발현 벡터 (서열식별번호: 441)로 클로닝되었다. 각각의 발현 벡터를 실시예 2에 기재된 바와 같이, J3 표적에 대한 가이드 RNA를 코딩하는 제2 벡터 (서열식별번호: 444)를 사용하여 이. 콜라이 BL21 스타™ (써모 피셔 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬) 세포로 형질감염시켰다. Cas5, Cas6, Cas7, rAPOBEC1_Cse2-Cse2, 및 Cas8을 함유하는 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 복합체를 실시예 4B 및 5B에 기재된 바와 같이 발현 및 정제하였다. 융합된 rAPOBEC1_Cse2-Cse2 변이체를 포함하는 캐스케이드 복합체의 정제는, 유형 I-E CRISPR-Cas 서브유닛 단백질과의 시티딘 데아미나제 융합물이 야생형 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체와 본질적으로 동일한 조성 (분자량 기준)을 갖는 캐스케이드 복합체를 형성하는데 성공적으로 사용되었다는 것을 명확하게 보여준다. 표 40은 Cse2-Cse2와의 효소 융합물의 예를 제시한다.

실시예 12

전사 활성화/저해 도메인과의 캐스케이드 서브유닛 단백질 융합

본 실시예는 캐스케이드 복합체에 전사 활성화 활성을 부여하기 위해 VP64 활성화 도메인과 융합된 이. 콜라이 유형 I-E cp-Cas7 단백질의 설계를 예시한다.

VP64는 글리신-세린 (GS) 링커와 연결된 VP16 (단순 포진 바이러스 단백질 16, DALDDFDLDML (서열식별번호: 614); 아미노산 437-447, 유니프로트:UL48)의 4개의 직렬 카피를 포함하는 전사 활성화제이다. 유전자의 프로모터 근처에서 결합할 수 있는 단백질 도메인과 융합될 때, VP64 (서열식별번호: 615)는 강력한 전사 활성화제로서 작용한다. 이. 콜라이 유형 I-E cp-Cas7 V2 (서열식별번호: 616)가 조작을 위해 선택될 수 있다.

활성화 도메인 VP64는 cpCas7 V2의 N-말단과 융합될 수 있다 (실시예 10A에 기재됨). 링커 (예를 들어, 5개 내지 50개의 아미노산 길이)는 cpCas7 V2와 VP64 도메인을 작동가능하게 연결하기 위해 선택될 수 있다.

인 실리코 설계된 DNA 서열은 합성을 위해 상업적 제조업체에 제공될 수 있다. VP64-cpCas7 V2 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열이 발현 벡터 (예를 들어, 서열식별번호: 455, 여기서 VP64-cpCas7 V2가 Cas7을 대체하는데 사용될 수 있음)로 클로닝될 수 있다. 각각의 발현 벡터를 실시예 2에 기재된 바와 같이, J3 표적에 대한 가이드 RNA를 코딩하는 제2 벡터 (서열식별번호: 444)를 사용하여 이. 콜라이 BL21 스타™ (써모 피셔 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬) 세포로 형질감염시킬 수 있다. Cas5, Cas6, VP64_cpCas7 V2, Cse2, 및 Cas8을 함유하는 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 복합체를 실시예 4 및 5에 기재된 바와 같이 발현 및 정제할 수 있다. 융합된 VP64_cpCas7 V2 변이체를 포함하는 캐스케이드 복합체의 정제는 야생형 단백질을 포함하는 캐스케이드 복합체와 본질적으로 동일한 조성 (분자량 기준)을 갖는 캐스케이드 복합체를 형성하는데 사용될 수 있다.

특별한 유전자의 프로모터 영역에 표적화된 가이드의 선택은 유전자의 전사 활성화를 용이하게 할 수 있는 융합된 VP64_cpCas7 V2를 포함하는 캐스케이드 복합체의 능력을 검증하기 위해 사용될 수 있다.

실시예 13

dCas9/가이드 복합체에 의해 캐스케이드 서브유닛과 융합된 기능적 도메인의 부위-지정 동원

본 실시예는 기능적 도메인과 융합된 하나 이상의 캐스케이드 서브유닛 단백질 (즉, Cas6, Cas5 등)을 유형 II CRISPR Cas 단백질/가이드 RNA 복합체 결합 부위로 동원하기 위하여 클래스 1 유형 I CRISPR 반복부 스템 서열 (예를 들어, 유형 I-F CRISPR 반복부 스템 서열)로 클래스 2 유형 II CRISPR sgRNA, crRNA, tracrRNA, 또는 crRNA 및 tracrRNA 서열을 조작하는 방법을 설명한다. 이러한 방법은 문헌 [Gilbert, L., et al., Cell 154(2):442-451 (2013) and Ferry, Q, et al., Nature Communication 8:14633 doi: 10.1038/ncomms14633 (2017)]을 각색한 것이다.

A. 유형 II 가이드 RNA를 조작하는 것

유형 II CRISPR sgRNA, crRNA, tracrRNA, 또는 crRNA 및 tracrRNA (집합적으로 "유형 II 가이드 RNA"로서 지칭됨)가 조작을 위해 선택될 수 있다.

유형 II 가이드 RNA 서열을, 유형 I CRISPR 반복부 스템 서열의 혼입 영역에 관하여 인 실리코 평가할 수 있다. 유형 I CRISPR 반복부 스템 서열을 유형 II 가이드 RNA의 내부에 있는 유형 II 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에 부착시킬 수 있거나, 또는 유형 II 가이드 RNA 내의 2차 구조 (예를 들어, 3' 헤어핀 요소)를 대체할 수 있다. 유형 I CRISPR 반복부 스템 서열의 혼입은 링커 요소 뉴클레오티드 서열을 동반할 수 있다. 유형 I CRISPR 반복부 스템 서열을 포함하도록 조작된 유형 II tracrRNA 3'의 예가 표 41에 제시된다.

*유형 I CRISPR 반복부 스템 서열에 밑줄이 그어져 있고 소문자이다. 상응하는 DNA 코딩 서열은 서열식별번호: 618로서 제시된다.

포유동물 유전자, 예컨대 C-X-C 케모카인 수용체 유형 4 (CXCR4)가 표적화를 위해 선택될 수 있다. 5' UTR과 엑손 1 사이의 연접부를, 유형 II CRISPR Cas 단백질 PAM 서열 (예를 들어, 5'-NGG)에 인접하여 발생하는 유형 II CRISPR Cas 단백질 표적 서열에 대해 인 실리코 스캔할 수 있다. 5' 방향으로 상류에서 발생하는 20-뉴클레오티드 표적 서열을 유형 II crRNA에 혼입할 수 있다. CXCR4를 표적화하는 유형 II crRNA의 예가 표 42에 제시된다.

*상응하는 DNA 코딩 서열이 서열식별번호: 620으로서 제시된다.

또 다른 한편으론, CXCR4 표적화 스페이서 (RNA) (서열식별번호: 619)의 3' 단부는 링커를 사용하여 3' 유형 I CRISPR 반복부 스템 서열 (RNA) (서열식별번호: 617)을 갖는 유형 II tracrRNA의 5' 단부에 공유적으로 연결될 수 있다. 적합한 링커 요소는 5'-GAAA-3'이다.

혼입된 유형 I CRISPR 반복부 스템 서열을 갖는 인 실리코 설계된 유형 II 가이드 RNA가 합성을 위해 상업적 제조업체에 제공할 수 있다.

유형 I 캐스케이드 서브유닛 단백질 (예를 들어, Cas6)은 전사 활성화 또는 저해 도메인 (예를 들어, KRAB)에 작동가능하게 연결될 수 있고, 실시예 12에 기재된 바와 같이 핵 국재화 시그널 (NLS)로 C-말단에 태그부착될 수 있다.

유형 II Cas 단백질 (예를 들어, Cas9)은 촉매적으로 불활성 (예를 들어, dCas9)되고 NLS 서열로 태그부착되도록 돌연변이될 수 있다.

Cas6-KRAB-NLS 단백질 및 dCas9-NLS 단백질은 이. 콜라이로부터 재조합적으로 발현 및 정제될 수 있다.

RNP 복합체는 유형 I CRISPR 반복부 스템 서열을 포함하도록 조작된 60 pmol dCas9 단백질:60 pmol Cas6-KRAB-NLS:120 pmol CXCR4 표적화 crRNA:120 pmol tracrRNA 3'의 농도에서 형성될 수 있다. dCas9 및 Cas6-KRAB-NLS로 어셈블리하기 전에, 유형 I CRISPR 반복부 스템 서열을 포함하도록 조작된 각각의 120 pmol CXCR4 표적화 crRNA 및 120 pmol tracrRNA 3' (본원에서 "조작된 유형 II 가이드 RNA"로서 지칭됨)을 2 μL의 최종 용적에서 원하는 총 농도 (120 pmol)로 희석하고, 95℃에서 2분 동안 인큐베이션하며, 열 순환기로부터 제거하고 실온으로 평형화되게 할 수 있다. dCas9 및 Cas6-KRAB-NLS 단백질을 결합 완충제 (20 mM HEPES, 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 및 5% 글리세롤, pH 7.4)에서 적절한 농도로 희석하여 3 μL의 최종 용적이 되도록 하고, 2 μL의 유형 II 가이드 RNA와 혼합한 다음, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션할 수 있다. 형질감염되지 않은 대조군 (예를 들어, 완충제 단독), 조작되지 않은 유형 II 가이드 RNA, 또는 저해 도메인에 연결되지 않은 Cas6을 사용하여 음성 대조군 RNP를 어셈블리할 수 있다.

B. dCas9:Cas6-KRAB-NLS:조작된 유형 II 가이드 RNA를 사용한 세포 형질감염

dCas9:Cas6-KRAB-NLS:조작된 유형 II 가이드 RNA 핵단백질 복합체는 뉴클레오펙터® 96-웰 셔틀 시스템 (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일) 및 하기 프로토콜을 사용하여 HEK293 세포 (ATCC; 미국 버지니아주 마나사스)로 형질감염시킬 수 있다: 복합체를 96-웰 플레이트의 개별 웰에 5 μL 최종 용적으로 분배할 수 있다. 세포 배양 배지를 HEK293 세포 배양 플레이트로부터 제거할 수 있고, 세포를 TrypLE™ (써모 사이언티픽; 미국 델라웨어주 윌밍턴)로 분리할 수 있다. 현탁된 HEK293 세포를 200 x g에서 3분 동안 원심 분리함으로써 펠릿화하고, TrypLE 시약을 흡인하며, 세포를 칼슘 및 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척할 수 있다. 세포를 200 x g에서 3분 동안 원심 분리함으로써 펠릿화하고, PBS를 흡인하며, 세포 펠릿을 10 mL의 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS에 재현탁시킬 수 있다.

카운티스(Countess)® II 자동화 세포 계수기 (라이프 테크놀로지스 (Life Technologies; 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드))를 사용하여 세포를 계수할 수 있다. 2.2 x 10⁷개의 세포를 1.5 ml 마이크로퍼지 튜브로 옮기고 펠릿화할 수 있다. PBS를 흡인하고 세포를 뉴클레오펙터™ SF (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일) 용액에 1 x 10⁷개 세포/m의 밀도로 재현탁할 수 있다. 이어서, 20 μL의 세포 현탁액을 5 μL의 RNP 복합체를 함유하는 각각의 개별 웰에 부가할 수 있으며, 각각의 웰로부터의 전체 용적을 96-웰 뉴클레오큐벳™ (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일) 플레이트의 웰로 옮길 수 있다. 플레이트를 뉴클레오펙터™ 96-웰 셔틀™ (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일) 상으로 부하하고, 96-CM-130 뉴클레오펙터™ (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일) 프로그램을 사용하여 세포를 뉴클레오펙션할 수 있다. 뉴클레오펙션 후, 10% 소 태아 혈청 (FBS; 써모 사이언티픽; 미국 델라웨어주 윌밍턴), 페니실린 및 스트렙토마이신 (라이프 테크놀로지스; 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)이 보충된 70 μL 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM; 써모 사이언티픽; 미국 델라웨어주 윌밍턴)를 각각의 웰에 부가할 수 있으며, 50 μL의 세포 현탁액을, 150 μL의 미리 가온된 DMEM 완전 배양 배지를 함유하는 96-웰 세포 배양 플레이트로 옮길 수 있다. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 옮기고 5% CO₂에서 37℃ 하에 48시간 동안 유지시킬 수 있다.

dCas9:Cas6-KRAB-NLS:조작된 유형 II 가이드 RNA 핵단백질 복합체의 뉴클레오펙션 후 72시간에, 세포를 CXCR4 발현의 저해에 관하여 평가할 수 있다. 배양 배지를 HEK293으로부터 흡인할 수 있으며, 세포를 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS로 1회 세척한 다음, TrypLE (라이프 테크놀로지스; 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)를 부가하여 트립신 처리한 후, 37℃에서 3-5분 동안 인큐베이션한다. 트립신 처리된 세포를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 형성한 다음, 세포를 200 x g에서 3분 동안 원심 분리함으로써 펠릿화할 수 있다. 원심 분리 후, 배양 배지를 흡인할 수 있고 세포를 10 mM EDTA/PBS 완충제에 재현탁하며 부드럽게 혼합하여 단일 세포 현탁액으로 만든다. 단일 세포 현탁액을, 실온에서 1시간 동안 10% FBS를 함유하는 PBS에서 항-인간 CXCR4 항체 (메디칼 앤 바이오로지칼 래보러토리즈 캄파니 (Medical & Biological Laboratories Co.; 일본 나고야))와 접합된 0.05% FITC를 사용하여 염색할 수 있다. 이소형 대조군 및 천연 RNP 대조군은 참조를 위해 유사하게 염색될 수 있다. 이어서, 염색된 세포를 LSR II 유동 세포계수기 (BD 래보러토리즈 (BD laboratories; 미국 캘리포니아주 산 호세))로 분류하고 FITC 양성 형광 세포 집단을 집계할 수 있다.

CXCR4 발현에 있어서의 감소는 비-형질감염된 대조군의 측정된 형광과 비교해서 dCas9:Cas6-KRAB-NLS:조작된 유형 II 가이드 RNA 뉴클레오펙션된 샘플의 검출된 형광에 있어서의 감소에 의해 측정된다. 유동 세포계수기로부터의 형광 상의 감소를 사용하여, 유형 I CRISPR 반복부 스템 서열을 갖는 조작된 유형 II 가이드 RNA를 뉴클레아제-결핍성 유형 II Cas9 단백질과 조합하여 사용하여 저해 도메인과 융합된 유형 I CRISPR 캐스케이드 서브유닛 단백질을 유전자 표적에 동원 및 국재화하고 상기 유전자 표적의 전사를 저해할 수 있다는 것을 입증할 수 있다.

실시예 14

유형 I cas 유전자의 확인 및 스크리닝

본 실시예는 상이한 종으로부터 유형 I cas 유전자를 확인하고 스크리닝하는 방법을 설명한다. 여기에 제시된 방법은 문헌 [Shmakov, S., et al., Mol. Cell 60:385-397 (2015)]을 각색한 것이다.

A. 유형 I CRISPR-Cas 유전자의 확인

기본 로컬 정렬 검색 도구 (BLAST, blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 사용하여, 다양한 종의 게놈의 검색을 시행하여 유형 I CRISPR-Cas 복합체의 다양한 유전자 구성성분을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 확인할 수 있다. cas1 인테그라제 유전자는 클래스 1 및 클래스 2 CRISPR-Cas 패밀리 둘 다의 구성성분이며, cas1 유전자를 함유하는 종의 확인 시, 이들 게놈에서의 하위 서열 검색기를 시행하여 유형 I-특이적 유전자를 포함하는 게놈을 단리할 수 있다. 게놈 검색은 CRISPR-Cas 인테그라제 유전자 cas1 상에 고정될 수 있으며, 사용될 수 있는 이. 콜라이 K-12 MG1655로부터의 유형 I-E 시스템으로부터의 예시적인 cas1 서열은 서열식별번호: 621이다. 특별한 유전자 (예를 들어, cas7 및 cas5)는 유형 I 시스템의 간섭 복합체의 핵심 구성성분이며 유형 I 시스템을 함유하는 종을 추가로 구별하기 위해 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 이. 콜라이 K-12 MG1655 cas7 및 cas5 유전자의 예시적인 서열은 각각 서열식별번호: 622 및 서열식별번호: 623이다. cas7 및 cas5 유전자를 보유하고 있는 것으로 확인된 게놈은 유형 I-특이적 뉴클레아제-헬리카제 cas3 유전자 또는 그의 상동체의 확인을 통해 추가로 분석될 수 있다. 사용될 수 있는 이. 콜라이 K-12 MG1655 cas3 서열의 예시적인 서열은 서열식별번호: 624이다.

CRISPR-Cas 인테그라제 유전자 cas1, 유형 I 간섭 복합체 유전자 cas7 및 cas5, 및 뉴클레아제-헬리카제 cas3 유전자, 또는 그의 일부 조합을 함유하는 게놈은 유형 I CRISPR-Cas 시스템(들)의 후보일 가능성이 높다. 유형 I CRISPR-Cas 유전자는 일반적으로, 단일 게놈 로커스 내의 하나에 근접하여, 전형적으로 20 킬로염기 (kb) 이내에서 발견된다. cas1, cas7, cas5, 또는 cas3 유전자 주변 영역은 유형 I 간섭 복합체를 구성하는 나머지 cas 유전자의 다른 오픈 리딩 프레임 (ORF)에 관하여 검색될 수 있다. 추정상의 ORF의 아미노산 서열은 상동성에 대하여 공지된 유형 I 유전자와 비교될 수 있거나, 또는 유형 I 단백질 구성성분의 특징적인 단백질 도메인의 존재는 맥스 플랜크 연구소 생물 정보학 툴키트(Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit) (www.toolkit.tuebingen.mpg.de/#/), 또는 등가물을 통해 이용가능한 상동성 검출 및 구조 예측 검색 도구를 사용하여 분석될 수 있다.

B. 확인된 유형 I 구성성분의 스크리닝

일단 유형 I 구성성분 (예를 들어, cas 유전자 및 상응하는 crRNA)의 추정상의 컬렉션이 확인되면, 유형 I 구성성분을 프로그래밍가능한 DNA 표적화를 수행할 수 있는 능력에 관하여 시험할 수 있다.

추정상의 cas 유전자 및 crRNA는 실시예 1, 2 및 3의 안내에 따라 발현 벡터로 코딩될 수 있다. 다양한 cas 유전자 및 crRNA를 코딩하는 벡터를 박테리아 균주 내로 도입하고, 유형 I 간섭 복합체를 실시예 4 및 5에 기재된 바와 같이 발현 및 정제할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 칼럼으로부터의 용출 분획은 SDS-PAGE 겔을 통해 분석하여, 완전한 유형 I 간섭 복합체를 포함하는 단백질 구성성분의 실체 (중량 기준)를 결정할 수 있다. 에티듐 브로마이드 겔을 또한 실행하여 간섭 복합체의 일부로서 crRNA의 존재를 검출할 수 있다.

정제된 캐스케이드 복합체는 실시예 6 및 7에 기재된 바와 같이 DNA 표적의 시험관내 생화학적 절단을 지원할 수 있는 능력에 관하여 시험될 수 있다.

단일 추정상의 cas 유전자가 발현되지 않는 대조군 발현 및 정제 샘플은, 프로그래밍가능한 DNA 표적을 할 수 있는 완전한 유형 I 간섭 복합체를 구성하는 필수 cas 유전자를 결정하는데 사용될 수 있다.

특정 적용의 경우에, 게놈 서열로부터 개별 cas 유전자 상동체 (예를 들어, cas7)를 확인하는 것이 충분하며, 부가의 cas 유전자를 확일할 필요가 없거나 스크리닝을 수행할 필요가 없다.

실시예 15

유형 I crRNA의 확인

본 실시예는 상이한 종에서 유형 I crRNA를 확인하는 방법을 설명한다. 여기에 제시된 방법은 문헌 [Chylinski, K., et al., RNA Biology 10:726-737 (2013)]을 각색한 것이다.

실시예 17A에 기재된 바와 같이 유형 I CRISPR-Cas 유전자를 확인하기 위해 다양한 종의 게놈 검색을 시행할 수 있다. 하나 이상의 유형 I 특이적 cas 유전자를 포함하는 게놈은 CRISPR 반복부-스페이서 어레이 내에 코딩된 CRISPR RNA (crRNA)를 함유할 가능성이 있는 후보 게놈이다. 확인된 유형 I cas 유전자 (예를 들어, cas7, cas5 또는 cas3 유전자)에 인접한 서열은 연합된 CRISPR 반복부-스페이서 어레이에 대해 프로빙될 수 있다. 인 실리코 예측 스크리닝하는 방법은 문헌 [Grissa, I.V., et al. Nucleic Acids Res. 35(Web Server issue):W52-W57 (2007)]에 따라 반복부 어레이부터 crRNA 서열을 추출하는데 사용될 수 있다. crRNA 서열은 CRISPR 반복부 어레이 내에 함유되며, 외래 스페이서 서열에 의해 간격을 둔 그의 특징적인 반복 서열에 의해 확인될 수 있다.

A. RNA-seq 라이브러리의 준비

인 실리코 확인된 개별 crRNA를 함유하는 추정상의 CRISPR 어레이는 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)을 사용하여 추가로 검증될 수 있다.

추정상의 유형 I cas 유전자 및 crRNA 구성성분을 포함하는 것으로서 확인된 종으로부터의 세포는 상업적 저장소 (예를 들어, ATCC; 미국 버지니아주 마나사스; 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션 게엠베하 (DSMZ); 독일 브라운슈바이크)로부터 조달될 수 있다.

세포를 중간-대수기로 성장시키고, 트리졸 시약 (시그마 알드리치 (SigmaAldrich; 미국 미주리주 세인트 루이스))을 사용하여 전체 RNA를 준비하고 이를 DNaseI (페르멘타스 (Fermentas; 리투아니아 빌니우스))로 처리할 수 있다.

10 μg의 전체 RNA를 리보-제로 rRNA 제거 키트 (일루미나; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)로 처리할 수 있고, 나머지 RNA는 RNA 클린 및 농축기 (자이모 리서치 (Zymo Research; 미국 캘리포니아주 어빈))를 사용하여 정제할 수 있다.

제조업체의 지침에 따라 TRUSEQ™ 소형 RNA 라이브러리 준비 키트 (일루미나; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)를 사용하여 라이브러리를 준비할 수 있다. 이로 인해 어댑터 서열을 갖는 cDNA가 생성될 것이다.

이로써 생성되는 cDNA 라이브러리는 MiSeq 서열 분석기 (일루미나; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)를 사용하여 시퀀싱할 수 있다.

B. 시퀀싱 데이터의 프로세싱

cDNA 라이브러리의 시퀀싱 판독값은, 예를 들어, 하기 방법을 사용하여 프로세싱될 수 있다.

어댑터 서열은 cutadapt 1.1 (pypi.python.org/pypi/cutadapt/1.1)을 사용하여 제거할 수 있으며, 판독 품질을 개선시키기 위해 판독값의 3' 말단으로부터 약 15개의 뉴클레오티드를 트리밍할 수 있다.

판독값은 보타이 2 (www.bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml)를 사용하여 각각의 종의 게놈 (즉, 그로부터 추정상의 crRNA가 확인되어야 함)에 정렬될 수 있다. 보타이 2에 의해 생성되는 서열 정렬/맵 (SAM) 파일은 후속 시퀀싱 분석 단계를 위해 SAM툴 (www.samtools.sourceforge.net/)을 사용하여 이진 정렬/맵 (BAM) 파일로 변환될 수 있다.

CRISPR 로커스 또는 로커스들에 대한 판독값 커버리지 매핑은 베드툴(BedTools) (bedtools.readthedocs.org/ en/latest/)를 사용하여 BAM 파일로부터 계산할 수 있다.

이전 단계에서 생성된 바와 같은 BED 파일을 통합 게놈학 뷰어(Integrative Genomics Viewer) (IGV; www.broadinstitute.org/igv/)에 부하하여 시퀀싱 판독값 누적을 시각화할 수 있다. 판독값 누적을 사용하여, 전사된 추정상의 crRNA 서열의 5' 및 3' 말단을 확인할 수 있다. RNA-seq 데이터를 사용하여, 추정상의 crRNA 요소가 생체내에서 활발하게 전사되는지 검증할 수 있다.

추정상의 crRNA는 실시예 17A의 안내에 따라 프로그래밍가능한 DNA 표적화를 수행할 수 있는 능력에 관하여 동족 유형 I cas 유전자로 시험할 수 있다.

실시예 16

캐스케이드 가이드 RNA 백본에서의 변화에 내성이 있는 부위에 대한 프로빙

본 실시예는 유형 I 가이드 crRNA에 대한 다양한 변화의 생성 및 시험, 및 캐스케이드 폴리뉴클레오티드 복합체를 구축하는데 사용하기 위한 적합성을 설명한다. 아래에 기재된 방법은 문헌 [Briner, A., et al., Mol. Cell 56:333-339 (2014)]을 각색한 것이다.

변화는 crRNA 백본에 도입될 수 있으며, 이로써 생성되는 조작된 crRNA는 동족 캐스케이드 복합체를 사용하여 시험되어, 조작되기 쉬운 유형 I 가이드 crRNA 백본 내의 영역 또는 위치를 용이하게 확인해줄 수 있다

유형 I CRISPR 시스템 (예를 들어, 이. 콜라이 캐스케이드)로부터의 crRNA가 조작을 위해 선택될 수 있다. crRNA 서열은 하기 영역 중 하나 이상으로부터 선택된 영역 내의 핵산 서열 내로 하나 이상의 염기 변화 (예를 들어, 치환, 변화, 돌연변이, 결실 및/또는 삽입)를 도입하기 위해 인 실리코 조작될 수 있다: 스페이서의 5'에 있는 핵산 서열 (5' 핸들), 스페이서 요소, 유형 I CRISPR 반복부 스템 서열, 또는 유형 I CRISPR 반복부 스템 서열의 3' (3' 핸들).

염기 변화는 또한, crRNA 영역 중 임의의 것의 수소 염기 쌍 상호작용에서 미스매치를 도입하거나, 또는 두 염기의 치환을 통해 대체 수소 염기 쌍 상호작용을 도입하는 염기 쌍 돌연변이를 도입하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 대체 수소 염기 쌍 상호작용은 원래 수소 염기 쌍 상호작용과 상이하다 (예를 들어, 원래 수소 염기 쌍 상호작용은 왓슨-크릭 염기 쌍형성이고, 두 염기의 치환은 역 후그스틴 염기 쌍형성을 형성함). 염기의 치환은 또한 crRNA 백본 내에서 수소 염기 쌍 상호작용을 도입하는데 사용될 수 있다.

crRNA의 영역은 독립적으로 조작되어, 2차 구조 요소를 crRNA 백본 내로 도입할 수 있다. 이러한 2차 구조 요소는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 스템-루프 요소, 스템 요소, 슈도-노트, 및 리보자임. 더욱이, crRNA 백본은 5' 단부, 3' 단부 또는 crRNA 내부의 결실을 통해 crRNA 백본의 일부분을 결실하도록 조작될 수 있다. 대체 백본 구조가 또한 도입될 수 있다.

인 실리코 설계된 crRNA 서열은 합성을 위해 상업적 제조업체에 제공될 수 있다.

조작된 crRNA는 개별 캐스케이드 서브유닛 단백질 (즉, Cas6, Cas5 등)에 의한 결합을 지원할 수 있거나, 또는 캐스케이드 단백질 복합체의 완전한 형성을 지원할 수 있거나, 또는 뉴클레아제 (예를 들어, Cas3)의 동원을 통한 이중-가닥 DNA 표적 서열의 변형 및 캐스케이드 복합체의 형성을 지원할 수 있는 능력에 관하여 평가할 수 있다. 개별 캐스케이드 서브유닛 단백질에 대한 crRNA 결합 및 캐스케이드 단백질 복합체 어셈블리는 문헌 [Jore, M., et al., Nature Structural & Molecular Biology 18:529-536 (2011)]과 유사한 방식으로 나노-ESI 질량 분석법으로 평가할 수 있다. crRNA의 생화학적 특징규명 및 뉴클레아제의 동원을 통한 이중-가닥 DNA 표적 서열의 캐스케이드 단백질 복합체 변형은 실시예 6 및 7에 기재된 것들과 유사한 방식으로 수행될 수 있다. 캐스케이드 복합체의 형성 및 뉴클레아제의 동원을 통한 이중-가닥 DNA 표적 서열의 변형을 지원할 수 있는 조작된 crRNA는 실시예 8A, 실시예 8B, 실시예 8C, 및 실시예 8D에 기재된 방법을 사용하여 세포에서의 활성에 관하여 검증될 수 있다.

실시예 17

DNA 표적 결합 서열을 포함하는 캐스케이드 복합체 가이드의 스크리닝

본 실시예는 인간 gDNA (gDNA)에 존재하는 DNA 표적 서열을 변형시키고 이들 부위에서의 절단 활성 수준을 측정하기 위해 본 발명의 유형 I CRISPR 단백질 및 유형 I 가이드 crRNA를 사용하는 것을 예시한다.

표적 부위 (DNA 표적 서열)는 먼저, gDNA로부터 선택될 수 있다. 유형 I 가이드 crRNA는 상기 선택한 서열을 표적화하도록 설계될 수 있다. 검정 (예를 들어, 실시예 7에 기재된 바와 같음)을 수행하여 DNA 표적 서열 절단 수준을 결정할 수 있다.

A. gDNA로부터 DNA 표적 서열을 선택하는 것

캐스케이드 단백질 복합체 (예를 들어, 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드)에 대한 PAM 서열 (예를 들어, ATG)은 선택된 게놈 영역 내에서 확인될 수 있다.

ATG PAM 서열에 3' 인접한 하나 이상의 캐스케이드 DNA 표적 서열 (예를 들어, 32개 뉴클레오티드 길이)이 확인될 수 있다.

핵산 표적 서열의 선택 기준은 하기를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 게놈 내의 다른 영역과의 상동성; 퍼센트 G-C 함량; 융점; 스페이서 내의 단일 중합체의 존재; 두 서열 사이의 거리; 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 기준.

캐스케이드 DNA 표적 서열과 혼성화되는 DNA 표적 결합 서열은 가이드 crRNA에 혼입될 수 있다. 가이드 crRNA 구축물의 핵산 서열은 전형적으로 상업적 제조업체에 제공되고 그에 의해 합성된다.

본원에 기재된 바와 같이, 가이드 crRNA는 동족 유형 I 캐스케이드 단백질 복합체와 함께 사용되어 crRNA/캐스케이드 단백질 복합체를 형성할 수 있다.

B. 절단 백분율 및 특이성의 결정

가이드 crRNA와 관련된 시험관내 절단 백분율 및 특이성 (즉, 표적-이탈 결합의 양)은, 예를 들어, 실시예 7에 기재된 절단 검정을 사용하여 결정될 수 있고 하기와 같이 비교될 수 있다:

(1) 가이드 crRNA에 대해 단일 DNA 표적 서열 만이 확인되거나 선택되는 경우에, 각각의 DNA 표적 서열에 대한 절단 백분율 및 특이성이 결정될 수 있다. 원하는 경우에, 절단 백분율 및/또는 특이성은 가이드 crRNA를 조작하는 것, 또는 이펙터 단백질/이펙터 단백질 결합 서열을 도입하여 가이드 crRNA 또는 캐스케이드 서브유닛 단백질을 조작하는 것, 또는 리간드/리간드 결합 모이어티를 도입하여 가이드 crRNA 또는 캐스케이드 서브유닛 단백질을 조작하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 방법을 사용하여 추가 실험에서 변경될 수 있다.

(2) 가이드 crRNA에 대해 다수의 DNA 표적 서열이 확인되거나 선택되는 경우에, 절단 검정으로부터 수득된 백분율 절단 데이터 및 부위 특이성 데이터를, 표적 결합 서열을 포함하는 상이한 DNA 사이에 비교하여 원하는 절단 백분율 및 특이성을 갖는 DNA 표적 서열을 확인할 수 있다. 절단 백분율 데이터 및 특이성 데이터는 다양한 적용에 대한 선택의 기본이 되는 기준을 제공한다. 예를 들어, 일부 상황에서는, 가이드 crRNA의 활성이 가장 중요한 요인이 될 수 있다. 다른 상황에서는, 절단 부위의 특이성이 절단 백분율보다 상대적으로 더 중요할 수 있다. 원하는 경우에, 절단 백분율 및/또는 특이성은 가이드 crRNA를 조작하는 것, 이펙터 단백질/이펙터 단백질 결합 서열을 도입하여 가이드 crRNA 또는 캐스케이드 서브유닛 단백질을 조작하는 것, 또는 리간드/리간드 결합 모이어티를 도입하여 가이드 crRNA 또는 캐스케이드 서브유닛 단백질을 조작하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 방법을 사용하여 추가 실험에서 변경될 수 있다.

또 다른 한편으론, 또는 시험관내 분석에 더하여, 가이드 crRNA의 세포 내 절단 백분율 및 특이성은, 예를 들어, 실시예 8C 및 실시예 8D에 기재된 방법을 사용하여 수득될 수 있고, 하기와 같이 비교될 수 있다:

(1) 가이드 crRNA에 대해 단일 DNA 표적 서열 만이 확인되거나 선택되는 경우에, 각각의 DNA 표적 서열에 대한 절단 백분율 및 특이성이 결정될 수 있다. 원하는 경우에, 절단 백분율 및/또는 특이성은 가이드 crRNA를 조작하는 것, 또는 이펙터 단백질/이펙터 단백질 결합 서열을 도입하여 가이드 crRNA 또는 캐스케이드 서브유닛 단백질을 조작하는 것, 또는 리간드/리간드 결합 모이어티를 도입하여 가이드 crRNA 또는 캐스케이드 서브유닛 단백질을 조작하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 방법을 사용하여 추가 실험에서 변경될 수 있다.

(2) 가이드 crRNA에 대해 다수의 DNA 표적 서열이 확인되거나 선택되는 경우에, 절단 검정으로부터 수득된 백분율 절단 데이터 및 부위 특이성 데이터를, 표적 결합 서열을 포함하는 상이한 DNA 사이에 비교하여 원하는 절단 백분율 및 특이성을 갖는 DNA 표적 서열을 확인할 수 있다. 절단 백분율 데이터 및 특이성 데이터는 다양한 적용에 대한 선택의 기본이 되는 기준을 제공한다. 예를 들어, 일부 상황에서는, 가이드 crRNA의 활성이 가장 중요한 요인이 될 수 있다. 다른 상황에서는, 절단 부위의 특이성이 절단 백분율보다 상대적으로 더 중요할 수 있다. 원하는 경우에, 절단 백분율 및/또는 특이성은 가이드 crRNA를 조작하는 것, 이펙터 단백질/이펙터 단백질 결합 서열을 도입하여 가이드 crRNA 또는 캐스케이드 서브유닛 단백질을 조작하는 것, 또는 리간드/리간드 결합 모이어티를 도입하여 가이드 crRNA 또는 캐스케이드 서브유닛 단백질을 조작하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 방법을 사용하여 추가 실험에서 변경될 수 있다.

실시예 18

효율적인 FokI-캐스케이드 복합체 게놈 편집을 위해 FokI-Cas8 링커 조성과 인터스페이서 거리를 다양하게 하는 것

본 실시예는 FokI-Cas8 및 다양한 길이의 링커 폴리펩티드를 포함하는 다수의 융합 단백질의 설계 및 시험 뿐만 아니라 효율적인 게놈 편집을 위하여 인터스페이서 거리를 다양하게 하는 것의 효과를 예시한다.

A. 표적 세포로 형질감염될 FokI 융합 단백질을 포함하는 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 복합체 구성성분을 코딩하는 벡터의 생산

최소 CRISPR 어레이는 ADAMTSL1 및 PCSK9의 두 가지 상이한 유전자에서 또는 그 근처에서 인간 게놈 내의 로커스 세트를 표적화하도록 설계되었다. 인터스페이서 거리는 14 내지 60 bp의 범위이고, 2 bp씩 증가하였다. 각각의 인터스페이서 거리에 대해 4개의 표적이 설계되었다. 표적은 AAG 또는 ATG PAM 서열에 의해 플랭킹되었다. "반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부" 서열을 함유하는 가이드에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 454를 사용하여 실시예 9A에 기재된 바와 같이 클로닝하였다. 서열식별번호: 625 내지 서열식별번호: 816은 최소 CRISPR 어레이를 생성하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드 서열의 전체 세트에 대한 서열을 제공한다.

FokI-캐스케이드 RNP 서브유닛 단백질 구성성분 코딩 유전자를, 포유동물 세포에서의 전달 및 발현을 가능하게 하는 CMV 프로모터; 2A 바이러스 펩티드 "리보솜-스키핑" 서열을 통해 연결된 cas 유전자; 30-aa 링커 (서열식별번호: 455)로 연결된 FokI 및 Cas8을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 벡터로 클로닝하였다. 다양한 길이 및 아미노산 조성의 부가의 링커 폴리펩티드 서열을 설계하고 이러한 벡터에서 FokI를 Cas8 단백질에 연결하는데 사용하였다. 부가의 링커 폴리펩티드 서열이 표 43에 열거된다.

B. FokI-캐스케이드 RNP 복합체 구성성분을 코딩하는 벡터의 형질감염

형질감염 조건은 하기 변형을 수반하여 본질적으로 실시예 8B에 기재된 바와 같이 수행되었다. 뉴클레오펙션 전에, 5 μl의 플라스미드 벡터 용액을 96-웰 플레이트의 개별 웰로 옮겼다. 각각의 웰은 FokI-캐스케이드 RNP 복합체 서브유닛 단백질 구성성분을 코딩하는 플라스미드 2.4 μg 및 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 플라스미드 ~1-2 μg을 함유하였다.

C. 형질감염된 세포로부터의 gDNA의 심층 시퀀싱

심층 시퀀싱은 하기 변형을 수반하여 본질적으로 실시예 8C에 기재된 바와 같이 수행되었다. 실시예 8C의 표 36으로부터의 프라이머 Y 및 Z 대신, 표적-특이적 프라이머는 서열식별번호: 825 내지 서열식별번호: 1016이었다.

D. 심층 시퀀싱 데이터 분석

심층 시퀀싱 데이터 분석은 본질적으로 실시예 8D에 기재된 바와 같이 수행되었다. 도 31a 및 도 31b는 데이터 분석의 결과를 제시한다. 도 31a 및 도 31b에서, 퍼센트 게놈 편집은 FokI-Cas8 링커 유형 (도 31a, 도 31b, 수직축 14-60 AA) 및 인터스페이서 거리 (n=1) (도 31a, 도 32b, 수평축, 인터스페이서 거리 5-50 bp)의 함수로서 제시된다. 도 31a에서, 우측에 있는 회색 스케일 수직 막대는 indel의 백분율이다. 도 32b에서, 셀 내의 값은 퍼센트 indel이다. 데이터의 초기 분석은 17개 및 20개 아미노산의 FokI-Cas8 링커 (각각 서열식별번호: 821 및 서열식별번호: 822) 및 ~26 bp 및 ~30-32 bp의 인터스페이서 거리의 경우에 게놈 편집이 가장 높았다는 것을 보여주었다. 데이터가 재처리되었고 1000개 미만의 서열 판독값을 갖는 샘플이 제거되었는데, 이는 낮은 적용 범위로 인해 부풀려진 편집 값을 함유할 수 있기 때문이다 (모든 관련 샘플이 >1000 판독값을 함유한 경우에만 부위가 유지되었음). 도 31a 및 도 31b에 제시된 이러한 데이터는, 17개 및 20개 아미노산의 FokI-Cas8 링커 (각각 서열식별번호: 821 및 서열식별번호: 822) 및 ~30-32 bp의 인터스페이서 거리의 경우에 게놈 편집이 가장 높았다는 것을 보여주었다. 따라서, Fok1-Cas8 융합 단백질을 포함하는 유형 I CRISPR-Cas 복합체를 사용한 효율적인 게놈 편집은 FokI-Cas8 융합 단백질의 링커 폴리펩티드 길이 및 인터스페이서 거리를 다양하게 함으로써 달성되었다. 링커 폴리펩티드의 아미노산 조성이 본원에서 논의된다.

실시예 19

게놈 편집을 위하여 캐스케이드 상동체를 확인하는 것

본 실시예는 게놈 편집의 효율을 평가하기 위한 다수의 상동체 캐스케이드 복합체의 설계 및 시험을 예시한다.

A. 상동체 캐스케이드 복합체로 시험하기 위한 부위의 확인

부가의 상동체 캐스케이드 복합체를 시험하기 위해 부위 패널을 확인하였다. 구체적으로, 최소 CRISPR 어레이는 30-bp 인터스페이서 거리를 갖는 인간 게놈에서의 로커스 세트를 표적화하도록 설계되었고, AAG 또는 ATG PAM 서열에 의해 플랭킹되었다. "반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부" 서열을 함유하는 가이드 폴리뉴클레오티드를 실시예 9A에 기재된 방법에 따라 서열식별번호: 454를 사용하여 클로닝하였다. 최소 CRISPR 어레이를 생성하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드 서열의 전체 세트가 서열식별번호: 1017 내지 서열식별번호: 1130으로서 제시된다 (Hsa33F, 서열식별번호: 1017, 및 Hsa33R, 서열식별번호: 1074, 한 쌍을 예시함). TRAC 로커스를 표적화하는 가이드를 포함하는 양성 대조군이 포함되었다 (서열식별번호: 454).

FokI-캐스케이드 RNP 서브유닛 단백질 구성성분 코딩 유전자를, 포유동물 세포에서의 전달 및 발현을 가능하게 하는 CMV 프로모터; 2A 바이러스 펩티드 "리보솜-스키핑" 서열을 통해 연결된 cas 유전자; 30-aa 링커 (서열식별번호: 455)로 연결된 FokI 및 Cas8을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 벡터로 클로닝하였다.

B. FokI-캐스케이드 RNP 복합체 구성성분을 코딩하는 벡터의 형질감염

형질감염 조건은 하기 변형을 수반하여 본질적으로 실시예 8B에 기재된 바와 같이 수행되었다. 뉴클레오펙션 전에, 5 μl의 플라스미드 벡터 용액을 96-웰 플레이트의 개별 웰로 옮겼다. 각각의 웰은 FokI-캐스케이드 RNP 서브유닛 단백질 구성성분을 코딩하는 플라스미드 3 μg 및 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 플라스미드 0.3 μg을 함유하였다.

C. 형질감염된 세포로부터의 gDNA의 심층 시퀀싱

심층 시퀀싱은 하기 변형을 수반하여 본질적으로 실시예 8C에 기재된 바와 같이 수행되었다. 실시예 8C의 표 36으로부터의 프라이머 Y 및 Z 대신, 본 실시예에 사용된 표적-특이적 프라이머는 서열식별번호: 1131 내지 서열식별번호: 1244였다.

D. 심층 시퀀싱 데이터 분석

심층 시퀀싱 데이터 분석은 본질적으로 실시예 8D에 기재된 바와 같이 수행되었다. 도 32는 데이터 분석의 결과를 제시한다. 도 32에서, 퍼센트 게놈 편집 (도 32, 수직축, % 편집)은 실시예 8A로부터의 표적 Hsa07 이외에도, 58개의 시험 부위에 대항하여 플로팅된다 (도 32, 수평축, "표적"; 이들 최소 CRISPR 어레이를 생성하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드 서열은 상기에 논의됨) (n=3). 도 32에 제시된 바와 같이, 편집 범위는 ~6% 내지 검출 한계 미만이었다. 이들 데이터로부터, AAG PAM을 수반하는 8개 부위의 패널 (Hsa07 뿐만 아니라 하기 표적 Hsa37, Hsa43, Hsa46, Hsa60, Hsa77, Hsa88, 및 Hsa126에 상응하는 표적 1, 3-5, 10, 13 및 16)을, 게놈 편집에 관하여 상동체 캐스케이드 복합체를 시험하기 위해 선택되었다.

E. 게놈 편집에 관하여 FokI 뉴클레아제를 사용하여 시험하기 위한 상동체 캐스케이드 복합체의 확인

상이한 유형 I 시스템으로부터의 Cas8 단백질 서열을 psi-BLASTp에 대한 질의로서 사용하여 상동체 선택을 위한 계통 발생 트리를 생성하였다. 구체적으로, 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum) (WP_008798978.1)로부터의 Cas8이 유형 I-B에 사용되었고, 바실루스 할로두란스 (WP_010896519.1)로부터의 Cas8이 유형 I-C에 사용되었으며, 이. 콜라이 (WP_001050401.1)로부터의 Cas8이 유형 I-E에 사용되었고, 슈도모나스 아에루기노사 (WP_003139224.1)로부터의 Cas8이 유형 I-F에 사용되었으며, 슈와넬라 푸트레파시엔스 (WP_011919226.1)로부터의 Cas5가 유형 I-Fv2에 사용되었다.

다음으로, psi-BLASTp는 각각의 유형 I 시스템에 대해 수천 개의 상동체가 확인될 때까지 여러 번 반복되었다. 이러한 정보로부터, 계통 발생 트리는 인터랙티브 트리 오브 라이프 온라인(interactive Tree of Life online) 소프트웨어 (iTOL, itol.embl.de/login.cgi에서 액세스가능)를 사용하여 구축되었다. 상기 트리는 가변적 분지 길이를 사용하여 클레이드를 자동 붕괴시킨 후 시각적으로 검사하였다.

이어서, 주요 클레이드 내에 속하는 유기체의 목록을 출력하고, 선택을 위해 수동으로 검사하였다. 이러한 단계에서는, 유형 I-E 내의 12개의 상동체 뿐만 아니라 유형 I-B, I-C, I-F 및 I-Fv2에 대한 2-3개의 대표적인 상동체에 대해 계통 발생 트리의 상이한 영역으로부터 샘플링된 상동체를 선택하는데에 우선 순위를 두었다. 상기 계통 발생 분석을 기반으로 하여 cas8 및 cas5 후보를 NCBI에 입력하고, 내인성 숙주 박테리움 내의 게놈 컨텍스트를 NCBI의 게놈 그래픽 브라우저에서 시각적으로 검사하였다. 캐스케이드 상동체는 단지, (1) 37℃에서 성장하는 유기체에서 발견된 경우; (2) 그들의 cas 유전자 오페론이 무손상이고, 예상되는 캐스케이드 서브유닛 단백질 코딩 유전자, cas3 유전자, 및 무손상 획득 유전자 (즉, cas1 및 cas2) 모두를 갖는 경우; (3) 그들의 cas 유전자 오페론이 하나 이상의 CRISPR 어레이에 의해 플랭킹된 경우; 및 (4) 그들의 CRISPR 어레이가 > 10개의 스페이서를 함유한 경우에만 선택되었다. 일부 상동체의 경우에, CRISPRfinder 프로그램 (crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/)을 사용하여 추정상의 PAM 서열을 확인하였다. 상기 기준에 기반하여, 표 44에 나타낸 22개의 상동체 캐스케이드 복합체를 선택하였다.

* 문헌 [Sinkunas, T., et al., EMBO J. 32:385-394 (2013)]에 의해 확인된 바와 같지만; 본원에 제시된 데이터는 스트렙토코쿠스 써모필루스 균주 ND07이 생체내에서 단일 A를 PAM 서열로서 활용할 수 있다는 것을 명확하게 보여준다.

F. 표적 세포로의 형질감염을 위해 22개의 별개의 종으로부터의 FokI-캐스케이드 RNP 구성성분을 코딩하는 벡터의 생산

각각의 상동체로부터의 각각의 cas 유전자에 대한 서열은 FokI 뉴클레아제와 Cas8을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 폴리시스트론성 구축물의 일부로서 합성되었다. 각각의 유형 I-E 캐스케이드 복합체 상동체에 대해, 적절한 PAM 서열을 가진 로커스를 표적화하는 ~7-8개의 가이드 세트가 생성되었다. 각각의 유형 I-B, I-C, I-F, 및 I-Fv2 캐스케이드 상동체에 대해, 적절한 PAM 서열을 가진 로커스를 표적화하는 ~2-7개의 가이드 세트가 생성되었다. 각각의 캐스케이드 복합체 상동체 시스템은 그의 동족 가이드를 프로세싱하기 위해 고유한 반복부 서열 (서열식별번호: 1267 내지 서열식별번호: 1288)을 필요로 하였다. "반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부" 서열을 함유하는 가이드에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 454에 대해 실시예 9A에 기재된 방법을 사용하여 클로닝되었다. 올리고뉴클레오티드는 5' 단부에서 인산화되고 오버행 서열이 첨부되어, 적절한 반복부 서열을 갖는 플라스미드 벡터로 클로닝할 수 있었다. 22개의 캐스케이드 복합체 상동체에 대한 최소 CRISPR 어레이를 생성하는데 사용된 올리고뉴클레오티드 서열의 전체 세트가 (서열식별번호: 1289 내지 서열식별번호: 1400)로서 제시된다.

FokI-캐스케이드 RNP 서브유닛 단백질 구성성분 코딩 유전자를, 포유동물 세포에서의 전달 및 발현을 가능하게 하는 CMV 프로모터; 2A 바이러스 펩티드 "리보솜-스키핑" 서열을 통해 연결된 cas 유전자; 30-aa 링커로 연결된 FokI 및 Cas8을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 벡터로 클로닝하였다.

G. FokI-캐스케이드 RNP 복합체를 코딩하는 플라스미드의 형질감염

형질감염 조건은 하기 변형을 수반하여 본질적으로 실시예 8B에 기재된 바와 같이 수행되었다. 뉴클레오펙션 전에, 5 μl의 플라스미드 벡터 용액을 96-웰 플레이트의 개별 웰로 옮겼다. 각각의 웰은 FokI-캐스케이드 RNP 서브유닛 단백질 구성성분을 코딩하는 플라스미드 1.5 μg 및 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 플라스미드 ~0.5-1.5 μg을 함유하였다. 실험을 삼중으로 수행하였고, 이는 양성 대조군으로서 8개 부위 (실시예 8A로부터의 Hsa07 및 실시예 19F 및 실시예 19G로부터의 Hsa37, Hsa43, Hsa46, Hsa60, Hsa77, Hsa88, Hsa126)를 표적화한 이. 콜라이로부터의 FokI-캐스케이드 RNP 복합체 (서열식별번호: 455)를 포함하였다. 이전에 기재된 바와 같이, 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 이. 콜라이 양성 대조군과 함께 사용되는 최소 CRISPR 어레이를 생성하였다: Hsa37 (서열식별번호: 1019; 서열식별번호: 1076), Hsa43 (서열식별번호: 1024; 서열식별번호: 1081), Hsa46 (서열식별번호: 1027; 서열식별번호: 1084), Hsa60 (서열식별번호: 1037; 서열식별번호: 1094), Hsa77 (서열식별번호: 1045; 서열식별번호: 1102), Hsa88 (서열식별번호: 1050; 서열식별번호: 1107), Hsa126 (서열식별번호: 1072; 서열식별번호: 1129).

H. 형질감염된 세포로부터의 gDNA의 심층 시퀀싱

심층 시퀀싱은 하기 변형을 수반하여 본질적으로 실시예 8C에 기재된 바와 같이 수행되었다. 실시예 8C의 표 36으로부터의 프라이머 Y 및 Z 대신, 본 실시예에 사용된 표적-특이적 프라이머는 서열식별번호: 1401 내지 서열식별번호: 1512였다. 유형 I-E RNP 복합체와 유형 I-B, I-C, I-F, 및 I-Fv2 RNP 복합체 둘 다에 대해, 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드를 포함하는 대조군 샘플이 비교를 위해 포함되었고, 실시예 8A로부터의 표적 Hsa07 및 본 실시예로부터의 Hsa37, Hsa43, Hsa46, Hsa60, Hsa77, Hsa88, Hsa126에 상응하는 표적-특이적 프라이머로 서열 분석하였다. 보다 구체적으로, 하기 표적-특이적 증폭 프라이머가 이들 표적에 사용되었다: Hsa37 (서열식별번호: 1133; 서열식별번호: 1190), Hsa43 (서열식별번호: 1138; 서열식별번호: 1195), Hsa46 (서열식별번호: 1141; 서열식별번호: 1198), Hsa60 (서열식별번호: 1151; 서열식별번호: 1208), Hsa77 (서열식별번호: 1159; 서열식별번호: 1216), Hsa88 (서열식별번호: 1164; 서열식별번호: 1221), Hsa126 (서열식별번호: 1186; 서열식별번호: 1243).

I. 심층 시퀀싱 데이터 분석

심층 시퀀싱 데이터 분석은 본질적으로 실시예 8D에 기재된 바와 같이 수행되었다. 도 33a 및 도 33b는 이러한 실험의 결과를 제시한다. 도 33a에서, 수직축은 퍼센트 편집 (도 33a, % 편집)이고 수평축 상의 숫자는 유형 I-E 상동체 시스템에 상응하는 서열식별번호이다. 많은 유형 I-E FokI-캐스케이드 상동체를 사용한 경우에 편집이 관찰되었다 (도 33a). 슈도모나스 종 S-6-2로부터의 변이체를 사용한 경우에 가장 높은 편집이 관찰되었지만, 다른 상동체 (즉, 살모넬라 엔테리카, 게오써모박터 종 EPR-M, 메타노셀라 아르보리자에 MRE50, 및 에스. 써모필루스 (균주 ND07))는 이. 콜라이와 대략 등가인 편집을 나타냈다. 도 33b에서, 수직축은 퍼센트 편집 (도 33b, % 편집)이고 수평축 상의 숫자는 유형 I-B, I-C, I-F, 및 I-Fv2 상동체 시스템에 상응하는 서열식별번호이다. 유형 I-B, I-C, I-F, 및 I-Fv2로부터 유래된 FokI-캐스케이드 RNP를 사용한 경우의 편집은 검출 한계 미만이었다 (도 33b).

본 실시예는 게놈 편집 능력을 제공하는 유형 I 시스템을 확인하기 위해 유형 I 상동체를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 부가의 유형 I 상동체 스크리닝은 실시예 22에 기재되어 있다.

실시예 20

효율적인 게놈 편집을 위해 슈도모나스 종 S-6-2에서 FokI-Cas8 링커 길이와 인터스페이서 거리를 다양하게 하는 것

본 실시예는 FokI-Cas8 및 다양한 길이의 링커 폴리펩티드를 포함하는 다수의 융합 단백질의 설계 및 시험 뿐만 아니라 슈도모나스 종 S-6-2 유형 I-E CRISPR-Cas 시스템을 사용한 효율적인 게놈 편집을 위해 인터스페이서 거리를 다양하게 하는 것의 효과를 예시한다.

A. 표적 세포로 형질감염될 FokI-캐스케이드 RNP 구성성분을 코딩하는 벡터의 생산

최소 CRISPR 어레이는 인간 게놈 내의 로커스 세트를 표적화하도록 설계되었다. 인터스페이서 거리는 23 내지 34 bp의 범위이고, 1 bp씩 증가하였다. 각각의 인터스페이서 거리에 대해 8개의 표적이 설계되었고, 표적은 AAG PAM 서열에 의해 플랭킹되었다. 최소 CRISPR 어레이는 FokI-캐스케이드 표적화를 가능하게 하는 "반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부" 서열을 코딩하는 고유한 프라이머 및 3개의 올리고뉴클레오티드 (서열식별번호: 1513 내지 서열식별번호: 1515)를 사용하여 PCR-기반 어셈블리 (올리고-주형화 PCR 증폭)로 생성되었다. 최소 CRISPR 어레이를 생성하기 위한 고유한 올리고뉴클레오티드 서열의 전체 세트는 서열식별번호: 1516 내지 서열식별번호: 1704였다. PCR-어셈블리된 가이드는 본질적으로 제조업체의 지침에 따라 SPRI셀렉트® (베크만 쿨터; 미국 캘리포니아주 파사데나) 비드를 사용하여 정제 및 농축되었다.

FokI-캐스케이드 RNP 서브유닛 단백질 구성성분 코딩 유전자를, 포유동물 세포에서의 전달 및 발현을 가능하게 하는 CMV 프로모터, 2A "리보솜-스키핑" 서열을 통해 연결된 cas 유전자, 및 30-aa 링커 (서열식별번호: 1748)로 Cas8에 부착된 FokI를 포함하는 벡터로 클로닝하였다. 다양한 길이의 부가의 링커 폴리펩티드 서열을 설계하고, 이를 Cas8 단백질에 FokI를 연결하는데 사용하여 융합 단백질을 형성하였다. 링커 폴리펩티드 서열이 표 45에 열거된다.

B. FokI-캐스케이드 RNP 복합체 구성성분을 코딩하는 벡터의 형질감염

형질감염 조건은 하기 변형을 수반하는 것을 제외하고는, 본질적으로 실시예 8B에 기재된 바와 같이 수행되었다. 뉴클레오펙션 전에, 5 μl의 플라스미드 벡터 용액을 96-웰 플레이트의 개별 웰로 옮겼다. 각각의 웰은 FokI-캐스케이드 RNP 단백질 구성성분을 코딩하는 플라스미드 5 μg 및 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 선형 PCR 산물 ~0.1-0.5 μg을 함유하였다.

C. 형질감염된 세포로부터의 gDNA의 심층 시퀀싱

심층 시퀀싱은 본질적으로 실시예 8C에 기재된 바와 같이 수행되었다. 실시예 8C의 표 36으로부터의 프라이머 Y 및 Z 대신, 표적-특이적 프라이머는 서열식별번호: 1705 내지 서열식별번호: 1803이었다.

심층 시퀀싱 데이터 분석은 본질적으로 실시예 8D에 기재된 바와 같이 수행되었다. 도 34는 95개 부위에서의 게놈 편집 (도 34, 수직축, "% 편집")을 제시한다 (n=1). 도 34에서, 수평축은 염기 쌍 단위의 인터스페이서 길이에 상응한다 (도 34, bp 인터스페이서). 링커 길이는 좌측에서 우측으로, 17AA (도 34, 열린 막대), 20AA (도 34, 크로스-해치 막대), 및 30AA (도 34, 스트립된 막대)의 3개의 막대 그래프로 표시된다. 편집 범위는 ~50% (도 34, 오차 막대, 평균 +/- 1 s.d.를 나타냄) 내지 검출 한계 미만이었으며, 인터스페이서 거리 및 링커 폴리펩티드 길이와 관련이 있었다. 링커 폴리펩티드의 아미노산 조성이 본원에 논의된다. ~30-33 bp의 인터스페이서 거리 및 17개 및 20개 아미노산의 링커 폴리펩티드 길이가 매우 효율적인 편집을 제공하였다.

본 발명을 지원하기 위해 수행된, 본 실시예에 제시된 바와 본질적으로 동일한 프로토콜을 따르는 부가의 실험으로부터의 데이터가 도 41a, 도 41b, 및 도 41c에 제시된다. 이들 도면에서, 수직축은 편집 효율 (%)이고 수평축은 bp 단위의 인터스페이서 거리 (23-34 bp)이다. 데이터는 3개의 캐스케이드 상동체 변이체인 FokI-Pse캐스케이드 (도 41a), FokI-Eco캐스케이드 (도 41b), 및 FokI-Sth캐스케이드 (도 41c)에 대한 FokI-Cas8 링커 길이 및 인터스페이서 거리의 스크리닝을 확장하였다. 퍼센트 편집 효율은 17 aa, 20 aa, 및 30 aa의 FokI-Cas8 링커 길이 (도 41a, 도 41b, 및 도 41c: 좌측에서 우측으로, 17 aa, 20 aa, 및 30 aa) 및 인터스페이서 거리의 함수로서 표시된다. 각각의 점은 단일 게놈 부위를 나타내며, 인터스페이서 거리당 7-8개 부위를 시험하였다. 평균은 막대 그래프로 표시된다. 이들 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, ~30-33 bp의 인터스페이서 거리와 17, 20 및 30개 아미노산의 링커 폴리펩티드 길이는 FokI-Pse캐스케이드에 대한 효율적인 편집을 제공하였고, ~31-33 bp의 인터스페이서 거리 및 17, 20, 및 30개 아미노산의 링커 폴리펩티드 길이는 FokI-Eco캐스케이드에 대해 효율적인 편집을 제공하였으며, ~29-31 bp의 인터스페이서 거리 및 17, 20, 및 30개 아미노산의 링커 폴리펩티드 길이는 FokI-Sth캐스케이드에 대해 효율적인 편집을 제공하였다.

실시예 21

FokI-캐스케이드 게놈 편집을 가능하게 하기 위해 Cas3-FokI 및 FokI-Cas8을 활용하는 것

본 실시예는 FokI의 이량체화를 유도하여 인간 게놈 내의 로커스에서 이중-가닥 파손을 생성하기 위해 Cas3-FokI 및 FokI-캐스케이드를 사용하는 것을 예시한다 (예를 들어, 도 16a, 도 16b, 및 도 16c 참조). 보다 구체적으로, 본 실시예는 게놈 편집 효율에 영향을 주기 위한 다수의 Cas3-FokI 링커 조성과 길이 및 FokI-Cas8 링커 조성과 길이의 설계 및 시험을 상세히 설명한다.

A. 표적 세포로 형질감염될 FokI-Cas3 및 FokI-캐스케이드 RNP 구성성분을 코딩하는 벡터의 생산

최소 CRISPR 어레이는 인간 게놈에서 AAG PAM에 의해 플랭킹된 3개의 별개의 부위를 표적화하도록 설계되었다. 가이드에 의해 지시된 이. 콜라이 FokI-캐스케이드 이량체를 사용하여 인터스페이서 편집을 지원하는 것으로 이전에 제시된 부위를 선택되었으므로, 이는 FokI-캐스케이드 결합에 허용되는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, Hsa37, Hsa43 및 Hsa46).

상기 실시예에 기재된 FokI-캐스케이드 시스템은 2개의 FokI 캐스케이드 복합체를 사용하였으며 (예를 들어, 도 15a, 도 15b, 및 도 15c 참조); 따라서, 제1 핵산 표적 부위를 명시하는 제1 가이드 서열 및 제2 핵산 표적 부위를 명시하는 제2 가이드 서열이 사용될 수 있다. Cas3-FokI-FokI-캐스케이드 시스템은 단일 PAM 만 필요하기 때문에, "반복부-스페이서-반복부"를 포함하는 가이드는 기능적 캐스케이드 복합체가 핵산 표적 부위에 결합하는 것을 용이하게 하기에 충분해야 한다. "반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부"를 함유하는 폴리뉴클레오티드가 또한 사용될 수 있지만, 전형적으로 이러한 실시양태에서, 2개의 스페이서 서열은 캐스케이드 복합체가 동일한 핵산 표적 서열에 결합하는 것을 지시하는데; 즉 2개의 스페이서는 동일한 서열을 가질 수 있다. 가이드는 서열식별번호: 454를 사용하여 본질적으로 실시예 9A에 기재된 바와 같이 클로닝된다. 하기 어닐링된 올리고뉴클레오티드가 최소 CRISPR 어레이의 생성에 사용된다: Hsa37 (서열식별번호: 1019; 서열식별번호: 1076), Hsa43 (서열식별번호: 1024; 서열식별번호: 1081), 및 Hsa46 (서열식별번호: 1027; 서열식별번호: 1084).

실시예 9A에 기재된 바와 같이, FokI-캐스케이드 RNP 단백질 구성성분 코딩 유전자를, 포유동물 세포에서의 전달 및 발현을 가능하게 하는 CMV 프로모터를 함유하는 플라스미드 벡터로 클로닝한다. cas 유전자는 2A "리보솜-스키핑" 서열을 통해 연결된다. 더욱이, FokI는 30-aa 링커 (서열식별번호: 455)를 사용하여 Cas8과 융합된다. 다양한 길이 및 조성의 부가의 링커 서열이 설계되고, 이를 사용하여 FokI를 Cas8 단백질에 연결한다. 이러한 서열의 예가 표 46에 열거되어 있다.

이. 콜라이로부터의 Cas3 단백질은 30-aa 링커를 사용하여 C-말단 상에서 FokI와 융합된다. 이러한 융합물은 N-말단 상의 NLS 서열 (서열식별번호: 1806)로 추가로 조작된다. 다양한 길이 및 조성의 부가의 링커 서열이 설계되고, 이를 사용하여 FokI를 Cas3 단백질에 연결한다 (표 46 및 서열식별번호: 1804 내지 서열식별번호: 1807).

Cas3 단백질의 헬리카제 또는 뉴클레아제 활성이 불활성화되는 부가의 Cas3-FokI 융합 구축물이 생성된다 (서열식별번호: 1808 내지 서열식별번호: 1815). 헬리카제 및 뉴클레아제 활성은 Cas3 단백질의 D452A 및 D75A 돌연변이를 각각 생성함으로써 손상된다 (예를 들어, 문헌 [Mulepati, S., et al., J. Biol. Chem. 288:22184-22192 (2013)] 참조).

B. FokI-캐스케이드 RNP 복합체를 코딩하는 플라스미드의 형질감염

형질감염 조건은 하기 변형을 수반하여 실시예 8B에 기재된 바와 같이 수행되었다. 뉴클레오펙션 전에, 5 μl의 플라스미드 벡터 용액을 96-웰 플레이트의 개별 웰로 옮겼다. 각각의 웰은 하기 3가지 구성성분을 포함한다: FokI-캐스케이드 RNP 단백질 구성성분의 세트를 코딩하는 플라스미드 3 μg, Cas3-FokI를 코딩하는 플라스미드 3 μg, 및 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 플라스미드 0.5 μg. 96-웰 플레이트는 상기 3가지 구성성분의 모든 조합을 제공하기 위해 매트릭스로서 설정된다.

C. 형질감염된 세포로부터의 gDNA의 심층 시퀀싱

심층 시퀀싱은 하기 변형을 수반하여 실시예 8C에 기재된 바와 같이 수행되었다. 실시예 8C의 표 36으로부터의 프라이머 Y 및 Z 대신, 본 실시예에 사용된 표적-특이적 프라이머는 하기와 같다: 서열식별번호: 1133 및 서열식별번호: 1190 (Hsa37 표적 부위), 서열식별번호: 1138 및 서열식별번호: 1195 (Hsa43 표적 부위), 및 서열식별번호: 1141 및 서열식별번호: 1198 (Hsa46 표적 부위).

D. 심층 시퀀싱 데이터 분석

FokI-캐스케이드 결합 부위 PAM 서열의 상류에서 ~1 bp 내지 ~25 bp의 indel이 집계되는 것을 제외하고는, 실시예 8D에 기재된 바와 같이 심층 시퀀싱 데이터 분석을 수행한다. 이러한 방식으로, 가장 효율적인 편집을 지원하는 FokI-Cas8 링커 서열, Cas3-FokI 링커 서열 및 Cas3 변이체의 조합을 결정할 수 있다.

실시예 22

조작된 상동체 FokI-캐스케이드 복합체를 스크리닝하는 것

본 실시예는 게놈 편집의 효율을 평가하기 위해 상이한 수의 서브유닛을 갖는 다수의 상동 캐스케이드 복합체의 설계 및 시험을 예시한다. 본 실시예는 실시예 19에 기재된 분석을 확장한 것이다.

A. FokI-캐스케이드 RNP 복합체에 대한 표적 세포로 형질감염될 DNA 주형 구성성분의 생산

최소 CRISPR 어레이는 2개의 FokI-캐스케이드 RNP 복합체가 인간 게놈 내의 gDNA의 반대 가닥에 있는 인접한 로커스를 표적화하도록 설계되었다. FokI-캐스케이드 구축물은 3개 또는 4개의 유전자를 함유하는 11개의 상동 종 각각으로부터 유래되었다: 에프. 뉴클레아툼(F. nucleatum) (Fnu, 유형 I-B), 씨. 페투스(C. fetus) (Cfe, 유형 I-B), 오. 스플란크니쿠스(O. splanchnicus) (Osp, 유형 I-B), 비. 할로두란스(B. halodurans) (Bhe, 유형 I-C), 디. 불가리스(D. vulgaris) (Dvu, 유형 I-C), 브이. 콜레라에(V. cholerae) 균주 L15 (Vch, 유형 I-F), 케이. 옥시토카(K. oxytoca) (Koh, 유형 I-F), 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) (Pae, 유형 I-F), 에스. 푸트레파시엔스(S. putrefaciens) (Spu, I-Fv2), 아시네토박터(Acinetobacter) (Aci, 유형 I-Fv2), 브이. 콜레라에 균주 HE48 (Vch_v2, 유형 I-Fv2).

제1 및 제2 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체가 설계되었으며, 여기서 제1 가이드 폴리뉴클레오티드는 제1 핵산 표적 서열에 결합할 수 있는 제1 스페이서를 포함하였고, 제2 가이드 폴리뉴클레오티드는 제2 핵산 표적에 결합할 수 있는 제2 스페이서를 포함하였으며, 제1 핵산 표적 서열의 PAM 및 제2 핵산 표적 서열의 PAM은 14개 염기 쌍 내지 60개 염기 쌍의 인터스페이서 거리를 가졌다. 2개의 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체는, PAM이 가이드 RNA 표적 서열 대비 안쪽을 향하도록 배향되었다 (즉, PAM-인 배향). PAM 서열은 유형 I-B의 경우에 TCA이고, 유형 I-C의 경우에 TTC이며, 유형 I-F, I-Fv2의 경우에 CC였다 (유형 I-F 및 유형 I-Fv2는 CRISPR 어레이에서 상이한 반복부 서열을 가지고 있다; 표 47 및 표 44 참조).

최소 CRISPR 어레이는 FokI-캐스케이드 RNP 복합체 표적화를 가능하게 하는 "반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부" 서열을 코딩하는 고유한 프라이머 및 3개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 본질적으로 본원에 기재된 바와 같이 (예를 들어, 실시예 20A; 또한 도 42a 및 도 42b) PCR-기반 올리고-주형화 어셈블리로 생성되었다. 유형 I-B 및 유형 1-C의 경우에, 비-범용 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용되었다. PCR-어셈블리된 최소 CRISPR 어레이는 본질적으로 실시예 20A에 기재된 바와 같이 SPRI셀렉트® 비드 (베크만 쿨터; 미국 캘리포니아주 파사데나)를 사용하여 정제 및 농축시켰다.

조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체에서, FokI 코딩 서열을 유형 I-B, I-C, I-F 복합체의 경우에는 Cas8의 N-말단과 융합시키고, 유형 I-Fv2 복합체의 경우에는 Cas5의 N-말단과 융합시켰다. FokI-캐스케이드 RNP 단백질 구성성분 코딩 유전자를, 포유동물 세포에서의 전달 및 발현을 가능하게 하는 CMV 프로모터, 2A "리보솜-스키핑" 서열을 통해 연결된 cas 유전자, 및 30-aa 링커로 Cas8에 부착된 (또는 유형 I-Fv2 상동체의 경우에는 30-aa 링커로 Cas5에 부착된) FokI 단량체를 포함하는 벡터 (표 44 및 표 47 참조)로 클로닝하였다.

B. 조작된 FokI-캐스케이드 RNP 복합체 구성성분을 코딩하는 벡터의 형질감염

형질감염 조건은 하기 변형을 수반하여 본질적으로 실시예 8B에 기재된 바와 같이 수행되었다. 뉴클레오펙션 전에, DNA 주형을 함유하는 용액 5 μl를 96-웰 플레이트의 개별 웰로 옮겼으며, 여기서 웰은 상동 FokI-캐스케이드 복합체의 구성성분을 코딩하는 각각의 플라스미드 약 1.5 μg 뿐만 아니라 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 선형 PCR 산물 0.4 μg을 함유하였다.

C. 형질감염된 세포로부터의 gDNA의 심층 시퀀싱

심층 시퀀싱은 본질적으로 실시예 8C에 기재된 바와 같이 수행되었다. 그러나, 실시예 8C의 표 36으로부터의 프라이머 Y 및 Z 대신, 상이한 표적-특이적 프라이머가 사용되었다. 도 43은 데이터 분석 결과를 제시한다. 도 43에서, 퍼센트 게놈 편집은 FokI-캐스케이드 상동체 변이체 (도 43, 수평축, 11개의 상동체 변이체는 상기 제시된 약어로써 확인되고, 수평축 상에 동일한 순서로 발생함) 및 인터스페이서 거리 (도 43, 수직축, 14-60 bp)의 함수로서 제시되며; 우측에 있는 회색 스케일 수직 막대는 indel의 백분율이다. 주어진 인터스페이서 거리에서의 각각의 측정은 4개의 표적 부위 (표적 부위당 n=1) 전체에 걸친 평균 편집을 나타낸다. 조작된 FokI-캐스케이드 오르소로그 복합체의 대부분을 사용한 편집은 시험된 표적 부위 전체에 걸쳐 검출 한계 미만인 반면, 조작된 비브리오 콜레라 균주 L15 (유형 I-F) FokI-캐스케이드 복합체를 사용한 편집 범위는 검출 한계 미만 내지 ~2% indel이었으며, 26 bp 내지 28 bp의 인터스페이서 거리의 경우에 가장 높은 편집이 관찰되었다. 편집은 또한, 42 bp 내지 46 bp의 인터스페이서 거리에서 검출 한계 미만 내지 ~1.5% 범위의 조작된 비브리오 콜레라 균주 HE48 (유형 I-Fv2) FokI-캐스케이드 복합체를 사용하여 관찰되었다.

본 실시예에서의 데이터는 본원에 기재된 방법이, 게놈 편집에 효과적인 상동 캐스케이드 복합체를 확인하기 위해 효과적으로 적용될 수 있다는 것을 예시한다.

실시예 23

mCas3 단백질을 사용하여 세포에서의 결실 길이를 제한하는 것

본 실시예는 게놈 편집 (예를 들어, 인간 세포)에서 사용하기 위해, 생성되는 Cas3 유도 결실이 wtCas3 단백질로 생성된 것들에 비해 더 짧도록 Cas3 단백질을 돌연변이시키는 방법을 예시한다.

A. 캐스케이드 및 Cas3 DNA 주형 구성성분의 생산

최소 CRISPR 어레이는 인간 게놈에서의 chr2 (HZGJ 유전자) 상의 AAG PAM을 사용하여 이. 콜라이 캐스케이드 (Eco캐스케이드) RNP 복합체가 게놈 로커스를 표적화하도록 설계되었다. 그 다음, 최소 CRISPR 어레이는 Eco캐스케이드 RNP 표적화를 가능하게 하는 "반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부" 서열을 코딩하는 고유한 프라이머 (서열식별번호: 1818) 및 3개의 올리고뉴클레오티드 (서열식별번호: 1513 내지 서열식별번호: 1515; 실시예 20A)를 사용하여 PCR-기반 어셈블리로 생성되었다. 이로써 생성된 앰플리콘은 최소 CRISPR 어레이의 발현을 구동하는 hu6 프로모터를 함유한다. 이러한 최소 CRISPR 어레이의 경우에, 두 스페이서 서열 모두에 동일한 서열이 사용되었다. PCR-어셈블리된 최소 CRISPR 어레이는 SPRI셀렉트® 비드 (베크만 쿨터; 미국 캘리포니아주 파사데나)를 사용하여 정제 및 농축되었다.

이. 콜라이 Cas3 (EcoCas3) 돌연변이체 변이체의 패널은 DNA 뉴클레아제 활성을 유지하면서 DNA에 대한 돌연변이체 단백질의 DNA 전위 전진성 (즉, DNA 길이에 따른 이동)을 감소시키기 위해 설계되었다.

단일-가닥 DNA 기질에 결합된 써모비피다 푸스카 Cas3의 결정 구조 (문헌 [Huo, Y., et al., Nat. Struct. Mol. Biol. (9):771-777 (2014)]), 기능성 단백질 도메인의 위치, 및 다른 Cas3 오르소로그와의 상동성를 참조하여, EcoCas3에서의 24개의 별개의 돌연변이 세트 (이. 콜라이 (P38036) Cas3 아미노산 서열: 유니프로트(UniProt)KB - P38036 (CAS3_ECOLI))를 만들어 헬리카제 도메인에서의 ATP 결합/가수분해 영역 (즉, G317A, S318A, G319A, K320N, T321N, Q297E, D452E, E453N, R662A, R665Q) 또는 헬리카제 도메인의 ssDNA 루프 결합/ssDNA 경로 보존된 영역 (즉, T346A, Q347N, G375A, K412G, T423A, D425H, Q426T, H601A, A602V, R603Q, R609S, T635A, Q636A, Q640H)을 조정하였다. 표 48는 EcoCas3 야생형 단백질 및 돌연변이체 단백질, 서열 (뉴클레오티드 서열)을 코딩하는 플라스미드, 및 상응하는 아미노산 서열을 열거한다.

* 야생형 EcoCas3 단백질 서열 대비

Eco캐스케이드 RNP 단백질 구성성분 코딩 유전자 뿐만 아니라 야생형 (wt) 및 돌연변이체 EcoCas3 유전자는 포유동물 세포에서의 전달 및 발현을 가능하게 하는 CMV 프로모터를 함유하는 벡터로 클로닝되었다. Eco캐스케이드 RNP cas 유전자는 2A "리보솜-스키핑" 서열을 통해 연결되었고, 모든 유전자는 N-말단 NLS 서열을 함유하여 코딩된 단백질을 핵으로 유도하였다 (Eco캐스케이드 폴리시스트론성 플라스미드 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 1871, 폴리시스트론성 아미노산 서열, 서열식별번호: 1872).

B. 조작된 Eco캐스케이드 RNP, 야생형 EcoCas3 단백질, 및 돌연변이체 EcoCas3 단백질을 코딩하는 벡터의 형질감염

형질감염 조건은 하기 변형을 수반하여, 본질적으로 실시예 8B에 기재된 바와 같이 수행되었다: 뉴클레오펙션 전에, DNA 주형을 함유하는 용액 6 μl를 96-웰 플레이트의 개별 웰로 옮겼으며, 여기서 웰은 Eco캐스케이드 복합체 단백질을 코딩하는 플라스미드 3 μg, 야생형 또는 돌연변이체 EcoCas3 단백질을 코딩하는 플라스미드 1 μg, 및 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 선형 PCR 산물 0.2 μg을 함유하였다. 형질감염 후 대략 4일에 gDNA를 수거하였다.

C. 형질감염된 세포로부터의 gDNA의 심층 시퀀싱

심층 시퀀싱은 본질적으로 실시예 8C에 기재된 바와 같이 수행되었다. 그러나, 실시예 8C의 표 36으로부터의 프라이머 Y 및 Z 대신, 표적-특이적 프라이머는 서열식별번호: 1873 내지 서열식별번호: 1874였으며; 또한, MiSeq 시약 키트 v3, 600 사이클 (일루미나; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)을 사용하였다. 심층 시퀀싱 데이터 분석은 하기 변형을 수반하여 본질적으로 실시예 8D에 기재된 바와 같이 수행되었다: (1) 앰플리콘 (앰플리콘 위치: chr2:68156987-68157510; 길이 = 524 뉴클레오티드) 창 내의 임의의 곳에 있는 적어도 하나의 판독값과 3개 초과의 뉴클레오티드 결실이 있는 고유한 판독값 클래스가 집계되었고 (본원에서 "고유한 결실 클래스"로서 지칭됨; 증폭 편향이 긴 결실을 수반한 산물에 대한 판독값 계수에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 판독값 계수에 의해 클래스에 가중치가 부여되지 않았음), (2) 삽입 또는 다수의 결실이 있는 판독값 클래스는 폐기되었으며, (3) 결실 시작 부위와 중지 부위가 샘플 사이에 비교 매핑되었다.

도 45a, 도 45b, 도 45c, 및 도 45d는 야생형 EcoCas3 단백질 (n=21)을 포함하거나, EcoCas3 단백질 (n=3), 또는 돌연변이체 EcoCas3 단백질 (n=3)이 결여되는 Eco캐스케이드 RNP 복합체를 사용한 HZGJ 로커스에서의 게놈 편집을 제시한다. 도 45a는 수직축 상에 고유한 결실 클래스의 수 (도 45a, 0 내지 600)를 제시하고, 수평축 상에 EcoCas3 단백질 변이체 (도 45a, 좌측에서 우측으로, 야생형 대조군 (WT), Cas3 단백질이 없는 대조군, 및 표 48에 주어진 순서대로 m1Cas3 단백질 내지 m24Cas3 단백질)를 제시한다. 여기에서, 524 bp 앰플리콘 창 내에 고유한 결실 클래스의 수를 증가시킨 Cas3 돌연변이체 변이체가, 감소된 전위 전진성 (즉, DNA 길이에 따른 이동)에 대한 후보였다. 도 45b는 수직축 상에 염기 쌍의 평균 결실 길이를 제시하고, 수평축 상에 EcoCas3 단백질 변이체를 제시한다 (도 45a에 대해서와 동일한 순서). 고유한 결실 클래스 측정과 마찬가지로, 524 bp 앰플리콘 창 내에서 더 작은 결실 길이를 초래한 Cas3 돌연변이체 변이체가, 감소된 전위 전진성에 대한 후보였다. 도 45c는 수직축 상에 Eco캐스케이드 PAM의 상류 (즉, Cas3 닉킹 부위 근처)의 6 bp 부위 및 수평축 상의 EcoCas3 단백질 변이체 (도 45a에 대해서와 동일한 순서) 대비 평균 결실 시작 위치 (bp)를 제시한다. 도 45d는 수직축 상에 Eco캐스케이드 PAM의 상류 (즉, Cas3 예상 닉킹 부위 근처)의 6 bp 부위 및 수평축 상의 EcoCas3 단백질 변이체 (도 45a에 대해서와 동일한 순서) 대비 평균 결실 중지 위치 (bp)를 제시한다. 여기에서, EcoCas3 예상 닉킹 부위에 더 가까운 결실 시작 및 중지 위치를 나타낸 Cas3 돌연변이체는 감소된 전위 전진성 (즉, DNA 길이에 따른 이동)에 대한 강력한 후보로 간주되었다. 취합해 보면, 앰플리콘 창 내에서 증가된 고유한 결실 클래스, 앰플리콘 창 내에서 더 짧은 결실 클래스, 및 앰플리콘 창 내의 위치-시프트된 결실 클래스의 일부 조합을 나타낸 Cas3 돌연변이체는, 감소된 전위 전진성에 대한 강력한 후보였다.

몇 가지 돌연변이체는 결실 길이 감소를 나타내는 변경된 복구 패턴을 제공하였다. 야생형 EcoCas3 단백질에 비해, 돌연변이체 EcoCas3 단백질 D452H와 A602V 둘 다는 (1) 앰플리콘 창 내에서의 고유한 결실 클래스 수가 크게 증가했으며, 이는 더 짧은 결실을 나타낼 수 있고, (2) 앰플리콘 창 내에서, 결실은 야생형 EcoCas3 단백질에 비해 EcoCas3 개시 부위에 더 가깝게 시프트했으며, 이는 또한 더 짧은 결실을 나타낼 수 있다. 돌연변이체 EcoCas3 단백질 A602V는 또한, 야생형 EcoCas3 단백질에 비해 앰플리콘 창 내에서 더 작은 결실을 나타냈다. 돌연변이 D452H와 A602V 둘 다는 ssDNA 루프 결합에 영향을 미칠 것으로 예측되었다. 본 실시예에서의 데이터는 인간 세포 내로 도입되고 발현될 때 캐스케이드 RNP 복합체와 연합하여, 돌연변이가 Cas3 단백질 내로 도입하여 wtCas3 단백질에 비해 결실 길이를 감소시킬 수 있고, 세포에서 gDNA 내에서의 결실 길이를 조정하기 위한 돌연변이를 포함하는 Cas3를 만들고 사용하는 방법에 관한 안내를 제공할 수 있다는 것을 명확하게 보여준다.

실시예 24

로드블록을 사용하여 Cas3 유도된 결실 길이를 제한하는 것

Cas3 단백질과 연합된 캐스케이드 RNP 복합체에 의해 촉진되는 결실 길이를 제한 및/또는 규정하는 몇 가지 방법이 본 출원에 기재되어 있다. 본 실시예는 단백질 로드블록을 사용하여 Cas3 결실을 제한할 수 있는 방법을 예시한다.

A. Cas3 단백질 및 Eco캐스케이드 RNP DNA 주형 구성성분의 생산

최소 CRISPR 어레이는 인간 게놈에서의 chr2 (HZGJ 유전자) 상의 AAG PAM을 사용하여 이. 콜라이 캐스케이드 (Eco캐스케이드) RNP가 게놈 로커스를 표적화하도록 설계되었다. 그 다음, 최소 CRISPR 어레이는 본질적으로 실시예 20A에 기재된 바와 같이, Eco캐스케이드 RNP 표적화를 가능하게 하는 "반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부" 서열을 코딩하는 프라이머 및 3개의 올리고뉴클레오티드 (서열식별번호: 1513 내지 서열식별번호: 1515)를 사용하여 PCR-기반 어셈블리로 생성되었다. 이러한 최소 CRISPR 어레이의 경우에, 두 스페이서 서열이 동일하였다. PCR 어셈블리된 가이드는 주로 제조업체의 지침에 따라 SPRI셀렉트® (베크만 쿨터; 미국 캘리포니아주 파사데나) 비드를 사용하여 정제 및 농축시켰다. 조작된 Eco캐스케이드 단백질 구성성분 코딩 유전자 뿐만 아니라 이. 콜라이 Cas3 (EcoCas3) 유전자는 포유동물 세포에서의 전달 및 발현을 가능하게 하는 CMV 프로모터를 함유하는 벡터로 클로닝되었다. Eco캐스케이드 RNP cas 유전자는 2A "리보솜-스키핑" 서열을 통해 연결되었고 (플라스미드 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 1871; 폴리시스트론성 단백질 서열, 서열식별번호: 1872), 모든 유전자는 N-말단 NLS 서열을 함유하여 코딩된 단백질을 핵으로 유도하였다.

B. dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체의 생산

dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체의 sgRNA 구성성분 [여기서 복합체는 캐스케이드 RNP 복합체와 연합된 Cas3 단백질의 전위 전진성 (즉, DNA를 따라 이동)을 중지하기 위한 로드블록으로서 사용되어야 함]은 시험관내 전사에 의해 생산되었다 (T7 신속 고 수율 RNA 합성 키트, 뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치). 5' 중첩 프라이머를 사용한 PCR을 사용하여, sgRNA 구성성분의 전사를 위한 dsDNA 주형을 어셈블리하였다. dsDNA 주형은 DNA 서열의 5' 단부에 T7 프로모터를 혼입하였다. sgRNA 주형을 생산하는데 사용되는 구성성분, 주형 및 프라이머는 표 49에 제시되어 있다.

sgRNA DNA 주형을 어셈블리하기 위한 PCR 반응은 하기를 포함하는 반응 혼합물을 사용하여 다음과 같이 수행되었다: 40 nM 농도의 하나의 "내부" DNA 프라이머 (서열식별번호: 1889 내지 서열식별번호: 1899), 500 nM 농도의 2개의 "외부" DNA 프라이머 (서열식별번호: 1887 및 서열식별번호: 1888; T7 프로모터 및 RNA 서열의 3' 말단을 함유함). PCR 반응은 본질적으로 제조업체의 지침에 따라 Q5 핫 스타트 고 충실도 2X 마스터 믹스 (뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치)를 사용하여 수행되었다. PCR 어셈블리 반응은 하기 열 순환 조건을 사용하여 수행되었다: 2분 동안 98℃, 98℃에서 10초, 58℃에서 20초, 72℃에서 20초, 및 72℃에서 1분 동안 최종 연장의 11 사이클.

대략 0.25 내지 0.5 μg의 각각의 sgRNA DNA 주형을 T7 고 수율 RNA 합성 키트 (뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치)를 사용하여 37℃에서 대략 16시간 동안 전사하였다. 전사 반응은 DNAse I 처리 (뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치)였다. C-말단과 융합된 VP64 이펙터 도메인을 갖고 NLS 태그가 VP64의 C-말단 상에 첨부된 dCas9 단백질 (D10A & H840A; 예를 들어, 문헌 [Sander, J.D., et al., Nat. Biotechnol. 32:347-355 (2014)] 참조) (N-NLS-VP64 코딩 서열-dCas9 코딩 서열-C)은 이. 콜라이 (BL21 (DE3))에서 박테리아 발현 벡터로부터 발현되었고, 본질적으로 문헌 [Jinek, M., et al., Science 337:816-821 (2012)]에 기재된 바와 같이 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 (IEC) 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 정제되었다.

C. EcoCas3 및 Eco캐스케이드 RNP 복합체 구성성분 뿐만 아니라 dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체의 구성성분을 코딩하는 벡터의 형질감염

HEK293 세포의 형질감염은 하기 변형을 수반하여 본질적으로 실시예 8B에 기재된 바와 같이 수행되었다:

Cas3/Eco캐스케이드 RNP 복합체 형성의 경우에는, EcoCas3 단백질 및 Eco캐스케이드 단백질을 코딩하는 DNA 주형을 함유하는 용액 4 μL를 96-웰 플레이트의 개별 웰로 옮겼으며, 여기서 상기 웰은 Eco캐스케이드 단백질을 코딩하는 플라스미드 3 μg, 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 선형 PCR 산물 0.2 μg, 및 EcoCas3을 코딩하는 플라스미드 0, 1 또는 3 μg을 함유하였고;

Cas3-Eco캐스케이드 RNP 복합체 형성의 경우에는, Cas3-Eco캐스케이드 단백질 구성성분을 코딩하는 플라스미드 3 μg (여기서 Cas3은 17-aa 링커를 사용하여 Cas8 단백질에 연결되었음) 및 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 선형 PCR 산물 0.2 μg을 함유하였다.

그 다음, dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체를 어셈블리하였다. 구체적으로, sgRNA를 95℃에서 2분 동안 인큐베이션한 다음, 약 5분 동안 실온으로 평형화되게 할 수 있다. dCas9-VP64 단백질을 반응 완충제 (20 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM KCL, 5 mM MgCl2, 5% 글리세롤) 중의 sgRNA와 1:3 비로 37℃에서 10분 동안 혼합하였다. 어셈블리된 dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체를, 세포로의 형질감염을 위해 다양한 용량으로 96-웰 플레이트의 웰로 옮겨져, 각각의 Cas3/Eco캐스케이드 또는 Cas3-Eco캐스케이드 혼합물이 0, 5, 20, 또는 50 pmol의 dCas9-VP64 로드블록을 수용한 매트릭스를 확립하였다. 뉴클레오펙션 후 4일에 세포로부터 gDNA를 수거하였다.

D. 형질감염된 세포로부터의 gDNA의 심층 시퀀싱

심층 시퀀싱 및 데이터 분석은 본질적으로 실시예 23C에 기재된 바와 같이 수행되었다. 도 46a, 도 46b, 및 도 46c는 dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체 로드블록의 부재 또는 존재 하에 Cas3/Eco캐스케이드 (1 μg 또는 3 μg의 Cas3 발현 플라스미드를 사용함, 각각 도 46a 및 도 46b) 또는 Cas3-Eco캐스케이드 (도 46c)에 대하여, 표시된 dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체가 결합하도록 표적화된 위치 (즉, 로드블록의 위치, 도 46a, 도 46b, 도 46c, 흑색 화살표)와 관련하여 HZGJ 로커스에서의 결실 시작 부위 (도 46a, 도 46b, 및 도 46c, 열린 화살표는 예상 Cas3 닉킹 부위를 표시함)의 빈도를 명확하게 보여주는 일련의 히트 맵을 제시한다. 총 11개의 로드블록 (F1 내지 F6 및 R1 내지 R5)이 HZGJ 로커스에서 평가되었다. 도 46a, 도 46b, 및 도 46c에서 "F"는 dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체의 정방향 배향을 지칭하며, 여기서 정방향 배향은 dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체의 핵산 표적 결합 부위와 연합된 PAM이, Eco캐스케이드 RNP 복합체의 핵산 표적 결합 부위의 PAM을 향해 마주하였다는 것을 의미하고; "R"은 dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체의 역방향 배향을 지칭하며, 여기서 역방향 배향은 dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체의 핵산 표적 결합 부위와 연합된 PAM이, Eco캐스케이드 RNP 복합체의 핵산 표적 결합 부위의 PAM과 마주하지 않았다는 것을 의미한다. 표적 부위 인디케이터 (F1 내지 F6 및 R1 내지 R5)의 우측에 있는 숫자 1, 2, 3 및 4는 각각 dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체의 0, 5, 20 또는 50 pmol에 상응한다. 각각의 히트 맵 위의 숫자 (-440 내지 +100)는 앰플리콘 창 내의 bp에 상응하며, 여기서 0 부위는 Eco캐스케이드 RNP PAM의 상류 6 bp로 지정되었다. 각각의 히트 맵의 좌측에 있는 회색 스케일 막대는 돌연변이체 클래스의 분율 (0.0-0.5)을 나타낸다. 결실 시작 부위는 로드블록 F4, F5 및 F6에 대한 dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체 로드블록 배치 부위 근처에서 고도로 강화된 것으로 나타났다.

도 47a 및 도 47b는 3 μg의 Cas3-Eco캐스케이드 및 0 pmol (도 47a) 또는 50 pmol (도 47b) dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체 로드블록으로 뉴클레오펙션된 샘플에 대한 앰플리콘 창 내의 모든 결실에 대한 데이터를 제시한다. 도 47a 및 도 47b에서, 열린 화살표는 EcoCas3 단백질 닉 부위의 상대적 위치를 나타낸다. 도 47b에서, 흑색 화살표는 로드블록 배치 (즉, dCas9-VP64/sgRNA RNP 복합체에 대한 표적 결합 부위)를 표시한다. 도 47a 및 도 47b에서, 수직축은 결실의 3' 단부를 나타내고, 단위는 앰플리콘 창 내의 bp이며, "0" 부위는 Eco캐스케이드 RNP PAM의 상류 6 bp로 지정된 부위이며; 수평축은 결실의 5' 단부를 나타내고, 단위는 앰플리콘 창 내의 bp이며, "0" 부위는 Eco캐스케이드 RNP PAM의 하류 6 bp로 지정되었다. 도 47a 및 도 47b에서, 수평 파선은 결실의 3' 단부의 평균 위치를 나타내고, 수직 파선은 결실의 5' 단부의 평균 위치를 나타낸다. 도 47a 및 도 47b 각각의 상단의 막대 그래프는 결실의 5' 단부의 분포에 상응하고, 곡선은 결실의 5' 단부의 커널 밀도 추정을 나타낸다. 유사하게, 도 47a 및 도 47b 각각의 우측에 있는 막대 그래프는 결실의 3' 단부의 분포에 상응하고, 곡선은 결실의 3' 단부의 커널 밀도 추정을 나타낸다. 결실 시작 부위는 도 47b에서의 흑색 화살표 근처에 고도로 강화되며, 이는 로드블록이 Cas3가 로드블록의 상류에 있는 gDNA를 결실시키는 것을 방지하였다는 것을 강력하게 시사한다.

본 실시예에서의 데이터는 캐스케이드 RNP 복합체와 연합된 Cas3 단백질에 의해 매개되는 결실의 길이를 제어하기 위해 단백질 로드블록을 사용하는 것을 지원하며; 따라서, 캐스케이드 RNP 복합체와 연합된 Cas3 단백질을 사용하여 세포의 gDNA에서 규정된 길이를 갖는 결실의 형성을 촉진시키는 방법을 제공한다.

실시예 25

캐스케이드 복합체에 연결된 ATPase 결핍성 돌연변이체를 사용하여, 쌍형성된 닉킹을 통해 표적화된 게놈 결실을 유도하는 것

본 실시예는 Cas3 ATPase 결핍성 돌연변이체 단백질 (mCas3 단백질)을 사용하여, 표적화된 결실을 유도하기 위해 게놈 DNA의 반대 가닥 상에 쌍형성된 닉킹을 촉진시킬 수 있는 방법을 예시한다.

A. mCas3 단백질/Eco캐스케이드 및 mCas3 단백질-Eco캐스케이드 RNP 복합체 DNA 주형 구성성분의 생산

최소 CRISPR 어레이는 2개의 이. 콜라이 캐스케이드 (Eco캐스케이드) (서열식별번호: 1871) RNP 복합체가 인간 게놈 내의 gDNA의 반대 가닥 상의 인접한 로커스를 표적화하도록 만들었다. 헬리카제 활성을 갖지 않으므로 닉킹 활성 만을 갖는 ATPase-결핍성 변이체인 이. 콜라이 D452A mCas3 단백질 (mCas3[D452A]) (예를 들어, 문헌 [Mulepati, S., et al., J. Biol. Chem. 288:22184-22192 (2013)] 참조)은 Eco캐스케이드 RNP 복합체 동원 후 쌍형성된-닉킹을 통해 표적화된 결실을 유도하도록 설계되었다. mCas3[D452A] 단백질은 Eco캐스케이드 (서열식별번호: 1900)로부터 별도로 단일 구성성분으로서 발현되거나, 또는 17개 아미노산 폴리펩티드 링커를 통해 Eco캐스케이드 RNP 복합체 (서열식별번호: 1901) 내의 Cas8 단백질에 연결된 융합 단백질로서 발현되었다. mCas3[D452A] 단백질이 단일 구성성분으로서 발현될 때, 코딩 서열은 발현 벡터 상에 존재하였으며, 여기서 그의 발현은 CMV 프로모터의 제어 하에 있었다. Cas3[D452A] 단백질/Eco캐스케이드는 Eco캐스케이드로부터의 별도의 구성성분으로서 발현된 mCas3[D452A] 단백질을 지칭한다. mCas3[D452A] 단백질-캐스케이드 RNP는 Eco캐스케이드 RNP 복합체 내의 Cas8 단백질에 연결된 융합 단백질로서의 mCas3[D452A]을 지칭한다. mCas3[D452A] 단백질-캐스케이드 RNP 단백질 구성성분 코딩 유전자는 포유동물 세포에서의 전달 및 발현을 가능하게 하는 CMV 프로모터, 2A "리보솜-스키핑" 서열을 통해 연결된 cas 유전자, 및 mCas3[D452A]-Cas8 융합 단백질을 만들기 위해 17-aa 링커 (서열식별번호: 1901)를 사용하여 Cas8에 부착된 Cas3의 ATPase-결핍성 돌연변이체 변이체 (D452A)를 포함하는 벡터로 클로닝되었다. mCas3[D452A] 단백질이 Cas8 단백질과의 융합 단백질로서 발현되었을 때, 이러한 융합 단백질은 Eco캐스케이드 RNP 복합체의 일부로서 어셈블리되었다 (mCas3[D452A] 단백질-Eco캐스케이드 RNP 복합체).

두 가이드 표적 서열 사이의 거리 (가이드 오프셋)은 1 bp 내지 120 bp였다. Eco캐스케이드 RNP 복합체는 PAM이 가이드 RNA 표적 서열 대비 안쪽 (PAM-인) 또는 바깥 쪽 (PAM-아웃)을 향하도록 배향되었다. 핵산 표적 서열과 연합된 PAM 서열은 AAT, ATA, AAC, AAA, GAG, ATG, AGG, 또는 AAG로부터 선택되었다.

최소 CRISPR 어레이는 캐스케이드 RNP가 인접한 로커스를 표적화할 수 있게 하는 "반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부" 서열을 코딩하는 고유한 프라이머 및 3개의 올리고뉴클레오티드 (서열식별번호: 1513 내지 서열식별번호: 1515)를 사용하여 PCR-기반 어셈블리로 생성되었다. 이로써 생성된 앰플리콘은 가이드에 대한 코딩 서열을 포함하는 최소 CRISPR 어레이의 발현을 구동하는 hu6 프로모터를 함유할 것이다 (예를 들어, 실시예 20A; 도 42a 참조). PCR-어셈블리된 최소 CRISPR 어레이는 본질적으로 제조업체의 지침에 따라 SPRI셀렉트® (베크만 쿨터; 미국 캘리포니아주 파사데나) 비드를 사용하여 정제 및 농축되었다.

B. FokI-캐스케이드 RNP 복합체 구성성분을 코딩하는 벡터의 형질감염

형질감염 조건은 하기 변형을 수반하여, 본질적으로 실시예 8B에 기재된 바와 같이 수행되었다. 뉴클레오펙션 전에, DNA 주형을 함유하는 용액 5 μl를 96-웰 플레이트의 개별 웰로 옮겼다. mCas3[D452A] 단백질/Eco캐스케이드 RNP 복합체 발현의 경우에, 웰은 mCas3[D452A] 단백질을 코딩하는 플라스미드 1.5 μg 및 Eco캐스케이드를 코딩하는 플라스미드 1.5 μg 뿐만 아니라 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 선형 PCR 산물 0.3 μg을 함유하였다. mCas3[D452A] 단백질-Eco캐스케이드 RNP 복합체 발현의 경우에, 웰은 mCas3[D452A]-Eco캐스케이드 단백질 (mCas3[D452A]-Cas8 융합 단백질 포함)을 코딩하는 플라스미드 3 μg 뿐만 아니라 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 선형 PCR 산물 0.3 μg을 함유하였다.

C. 형질감염된 세포로부터의 gDNA의 심층 시퀀싱

수많은 표적 부위를 포함하는 6개의 로커스를 gDNA의 반대 가닥 상의 쌍형성된 닉킹에 관하여 시험하였다 (HZGJ 로커스, 30개 표적 부위; NPHP3-ACAD11 로커스, 60개 표적 부위; JAK1 로커스 1, 49개 표적 부위; JAK1 로커스 2, 33개 표적 부위; NMNAT2 로커스, 38개 표적 부위; 및 ERBB2 로커스, 26개 표적 부위). gDNA의 반대 가닥 상의 쌍형성된 닉킹은 mCas3[D452A] 단백질/Eco캐스케이드 RNP 복합체와, 표적 부위에 대한 캐스케이드 복합체의 결합을 지시한 가이드를 포함하는 mCas3[D452A] 단백질-Eco캐스케이드 RNP 복합체 둘 다에 대해 시험되었다.

심층 시퀀싱은 본질적으로 실시예 8C에 기재된 바와 같이 수행되었고, 상이한 표적 특이적 프라이머가 상기 기재된 표적에 상응하여 사용된 것을 제외하고는 실시예 8D에 기재된 바와 같이 분석되었다.

표 50은 표시된 표적 부위를 표적화하는 mCas3[D452A] 단백질-Eco캐스케이드 RNP 복합체에 대한 30개의 HZGJ 표적 부위 전반에 걸친 예시적인 편집 데이터를 보여준다. 도 48은 mCas3[D452A]/Eco캐스케이드 또는 mCas3[D452A]-Eco캐스케이드를 사용한 경우의 30개의 HZGJ 표적 부위에서의 예시적인 게놈 편집 데이터를 제시한다. 도 48에서, 수직축은 % indel이고 수평축은 bp 단위의 인터스페이서 거리이다. 여기에서, 캐스케이드 복합체의 각각의 쌍에 대해, 하나의 RNP가 특별한 표적 부위에 고정되었고, 제2 RNP는 상이한 표적 부위에서 일정 범위의 거리에 걸쳐 상류 또는 하류로 향하였다. 도 48에서, 흑색 원과 이들을 연결하는 흑색 선은 mCas3-Eco캐스케이드를 사용한 편집에 상응하고, 회색 원과 이들을 연결하는 회색 선은 mCas3/Eco캐스케이드를 사용한 편집에 상응한다. mCas3/Eco캐스케이드를 사용한 편집은 대부분의 부위에 대해 검출 한계 미만인 반면, mCas3-Eco캐스케이드를 사용한 편집은 검출 한계 미만 내지 ~4% indel의 범위였다. mCas3-Eco캐스케이드는 일정 범위의 가이드 RNA 오프셋에 걸쳐 표적화된 결실을 가능하게 하였지만, PAM-아웃 입체 배치에서 가장 높았다.

본 실시예에 제시된 바와 본질적으로 동일한 프로토콜을 따르는 부가의 로커스로부터의 데이터는 캐스케이드 RNP 복합체가 PAM-아웃 입체 배치으로 배향되었을 때, mCas3[D452A]-Eco캐스케이드 샘플을 사용한 경우에 최상의 게놈 편집이 달성되었다는 것을 보여 주었다. 검출 한계를 초과하는 편집은 238개 표적 부위 중 26개에서 관찰되었고, 0.1% 초과의 편집은 mCas3[D452A]/Eco캐스케이드를 사용한 경우에 238개 표적 부위 중 1개에서 관찰된 반면 (즉, 대부분의 부위에 대하여 검출 한계 미만임), mCas3[D452A]-Eco캐스케이드를 사용한 경우에 검출 한계 초과의 편집은 242개 표적 부위 중 128개에서 관찰되었고, 0.1% 초과의 편집은 238개 표적 부위 중 1개에서 관찰되었다. mCas3[D452A]-Eco캐스케이드는 일정 범위의 가이드 오프셋에 걸쳐 표적화된 결실을 가능하게 하였으며, 캐스케이드 RNP 복합체가 PAM-아웃 입체 배치로 있을 때 가장 높았다.

본 실시예에서의 데이터는 mCas3 단백질을 포함하는 캐스케이드 RNP 복합체를 사용하여 gDNA의 반대 가닥 상에 쌍형성된 닉킹을 제공할 수 있으며, 따라서 숙주 세포 (예를 들어, 인간 세포)의 게놈에서 표적화된 결실을 촉진할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 26

게놈 결실을 생성하기 위한 Cas3 ATPase 결핍성 돌연변이체

Cas3 단백질과 연합된 캐스케이드 RNP 복합체에 의해 촉진되는 결실 길이를 제한 및/또는 규정하는 몇 가지 방법이 본 출원에 기재되어 있다. 본 실시예는 비-쌍형성된 ATPase 결핍성 돌연변이체 Cas3 단백질을 사용하여 표적화된 게놈 결실을 생성할 수 있으며; 따라서 단일 캐스케이드 RNP 복합체를 사용하여 단일 부위에서 닉킹을 제공하는 방법을 예시한다.

A. 표적 세포로의 형질감염을 위한 슈도모나스 종 S-6-2 Cas3 변이체 및 Pse캐스케이드 RNP 복합체 구성성분의 생산

최소 CRISPR 어레이는 슈도모나스 종 S-6-2 캐스케이드 (Pse캐스케이드) RNP 복합체가 인간 게놈 내의 TRAC 로커스에서 8개의 표적 (서열식별번호: 1902 내지 서열식별번호: 1909)을 표적화하도록 설계되었다. 이들 서열은 표 51에 제시되어 있다.

최소 CRISPR 어레이는 본질적으로 실시예 25A에 기재된 바와 같이, Pse캐스케이드 RNP 복합체 표적화를 가능하게 하는 "반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부" 서열을 코딩하는 고유한 프라이머 및 3개의 올리고뉴클레오티드 (서열식별번호: 1513 내지 서열식별번호: 1515)를 사용하여 PCR-기반 어셈블리로 생성되었다. 이러한 최소 CRISPR 어레이의 경우에, 두 스페이서 서열이 동일하였다. 최소 CRISPR 어레이를 생성하기 위한 올리고뉴클레오티드 서열의 전체 세트가 표 52에 제시된다.

PCR 어셈블리된 가이드는 주로 제조업체의 지침에 따라 SPRI셀렉트® (베크만 쿨터; 미국 캘리포니아주 파사데나) 비드를 사용하여 정제 및 농축시켰다.

ATPase/헬리카제 활성을 갖지 않으므로 닉킹 활성 만을 갖는 슈도모나스 종 S-6-2 Cas3 (PseCas3; 서열식별번호: 1918)의 D448A ATPase 돌연변이체 변이체 (mPseCas3으로 명명됨; 서열식별번호: 1919)는 표적화된 결실을 유도하도록 설계되었다. 평가 기준으로서, PseCas3의 D75A 뉴클레아제 데드 변이체 (서열식별번호: 1920)가 또한 생성되었으며 (dPseCas3*로 명명됨), 또한 PseCas3의 ATPase 뉴클레아제 이중 돌연변이체 변이체 (서열식별번호: 1921) (dblmPseCas3으로 명명됨)가 생성되었다. 각각의 표적에 대한 PAM 서열은 AAG였다.

Pse캐스케이드 RNP 복합체 단백질 구성성분 코딩 유전자 뿐만 아니라 돌연변이체 PseCas3 유전자는 포유동물 세포에서의 전달 및 발현을 가능하게 하는 CMV 프로모터를 함유하는 벡터로 클로닝되었다. Pse캐스케이드 RNP 복합체 cas 유전자는 2A "리보솜-스키핑" 서열을 통해 연결되었고, 모든 유전자는 N-말단 NLS 서열을 함유하여 코딩된 단백질을 핵으로 유도하였다. 그 서열이 표 53에 제시되어 있다.

B. FokI-캐스케이드 RNP 복합체 구성성분을 코딩하는 벡터의 형질감염

형질감염 조건은 하기 변형을 수반하여, 본질적으로 실시예 8B에 기재된 바와 같이 수행되었다. 뉴클레오펙션 전에, DNA 주형을 함유하는 용액 6 μl를 96-웰 플레이트의 개별 웰로 옮겼으며, 여기서 웰은 Pse캐스케이드 단백질 구성성분을 코딩하는 플라스미드 3 μg, 최소 CRISPR 어레이를 코딩하는 선형 PCR 산물 0.2 μg, 및 mPseCas3, dPseCas3*, 또는 dblmCas3을 코딩하는 플라스미드 1 μg을 함유하였다.

C. 형질감염된 세포로부터의 gDNA의 심층 시퀀싱

심층 시퀀싱은 본질적으로 실시예 8C에 기재된 바와 같이 수행되었다. 그러나, 실시예 8C의 표 36으로부터의 프라이머 Y 및 Z 대신, TRAC1 내지 TRAC8 표적 부위 각각에 대한 정방향 및 역방향 표적-특이적 프라이머 뿐만 아니라 MiSeq 시약 키트 v3, 600 사이클 (일루미나; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)을 사용하였다.

도 49는 mPseCas3, dPseCas3*, 또는 dblmCas3 각각과 연합된 Pse캐스케이드 RNP 복합체를 사용한 경우의 8개 TRAC 표적 부위에서의 게놈 편집을 제시한다 (n=2). 도 49에서, 수직축은 % 편집이고, 수평축은 TRAC 로커스에서의 표적 부위를 나타낸다. 수평축에 따른 막대의 순서는 mPseCas3 (흑색 막대), dPseCas3* (회색 막대), 및 dblmCas3 (줄무늬 막대)이다. 표적 부위에서의 편집은 dPseCas3* 또는 dblmPseCas3 Pse캐스케이드 RNP 복합체를 사용한 경우에 거의 관찰되지 않았지만, mPseCas3 Pse캐스케이드 RNP 복합체를 사용한 경우에 표적 부위에서의 결실에 의해 검출된 바와 같이 약 7% 이하의 게놈 편집에 도달하였다. 이들 데이터는 ATPase/헬리카제 활성을 갖지 않으므로, 닉킹 활성 만을 갖는 mPseCas3 단백질이 단일 표적 (즉, 쌍형성된-닉킹 입체 배치가 아님)에서 Pse캐스케이드 RNP 복합체와 함께 사용하여 예상 절단 부위에서 결실을 생성할 수 있다는 것을 보여준다.

관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않고서도 상기 실시양태의 다양한 변형 및 변이가 이루어질 수 있다. 이러한 변형 및 변이는 본 발명의 범주 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> CARIBOU BIOSCIENCES, INC <120> ENGINEERED CASCADE COMPONENTS AND CASCADE COMPLEXES <130> CBI032.30 <150> US 16/420,061 <151> 2019-05-22 <150> US 16/262,773 <151> 2019-01-30 <150> US 16/104,875 <151> 2018-08-17 <150> US 62/807,717 <151> 2019-02-19 <150> US 62/684,735 <151> 2018-06-13 <160> 1927 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1509 <212> DNA <213> Escherichia coli K-12 MG1655 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1509) <223> Cas8 <400> 1 atgaatttgc ttattgataa ctggatccct gtacgcccgc gaaacggggg gaaagtccaa 60 atcataaatc tgcaatcgct atactgcagt agagatcagt ggcgattaag tttgccccgt 120 gacgatatgg aactggccgc tttagcactg ctggtttgca ttgggcaaat tatcgccccg 180 gcaaaagatg acgttgaatt tcgacatcgc ataatgaatc cgctcactga agatgagttt 240 caacaactca tcgcgccgtg gatagatatg ttctacctta atcacgcaga acatcccttt 300 atgcagacca aaggtgtcaa agcaaatgat gtgactccaa tggaaaaact gttggctggg 360 gtaagcggcg cgacgaattg tgcatttgtc aatcaaccgg ggcagggtga agcattatgt 420 ggtggatgca ctgcgattgc gttattcaac caggcgaatc aggcaccagg ttttggtggt 480 ggttttaaaa gcggtttacg tggaggaaca cctgtaacaa cgttcgtacg tgggatcgat 540 cttcgttcaa cggtgttact caatgtcctc acattacctc gtcttcaaaa acaatttcct 600 aatgaatcac atacggaaaa ccaacctacc tggattaaac ctatcaagtc caatgagtct 660 atacctgctt cgtcaattgg gtttgtccgt ggtctattct ggcaaccagc gcatattgaa 720 ttatgcgatc ccattgggat tggtaaatgt tcttgctgtg gacaggaaag caatttgcgt 780 tataccggtt ttcttaagga aaaatttacc tttacagtta atgggctatg gccccatccg 840 cattcccctt gtctggtaac agtcaagaaa ggggaggttg aggaaaaatt tcttgctttc 900 accacctccg caccatcatg gacacaaatc agccgagttg tggtagataa gattattcaa 960 aatgaaaatg gaaatcgcgt ggcggcggtt gtgaatcaat tcagaaatat tgcgccgcaa 1020 agtcctcttg aattgattat ggggggatat cgtaataatc aagcatctat tcttgaacgg 1080 cgtcatgatg tgttgatgtt taatcagggg tggcaacaat acggcaatgt gataaacgaa 1140 atagtgactg ttggtttggg atataaaaca gccttacgca aggcgttata tacctttgca 1200 gaagggttta aaaataaaga cttcaaaggg gccggagtct ctgttcatga gactgcagaa 1260 aggcatttct atcgacagag tgaattatta attcccgatg 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Lys Gly Gly Met Asp Val Ser Gln 210 215 220 <210> 20 <211> 199 <212> PRT <213> Escherichia coli K-12 MG1655 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(199) <223> Cas6 <400> 20 Met Tyr Leu Ser Lys Val Ile Ile Ala Arg Ala Trp Ser Arg Asp Leu 1 5 10 15 Tyr Gln Leu His Gln Gly Leu Trp His Leu Phe Pro Asn Arg Pro Asp 20 25 30 Ala Ala Arg Asp Phe Leu Phe His Val Glu Lys Arg Asn Thr Pro Glu 35 40 45 Gly Cys His Val Leu Leu Gln Ser Ala Gln Met Pro Val Ser Thr Ala 50 55 60 Val Ala Thr Val Ile Lys Thr Lys Gln Val Glu Phe Gln Leu Gln Val 65 70 75 80 Gly Val Pro Leu Tyr Phe Arg Leu Arg Ala Asn Pro Ile Lys Thr Ile 85 90 95 Leu Asp Asn Gln Lys Arg Leu Asp Ser Lys Gly Asn Ile Lys Arg Cys 100 105 110 Arg Val Pro Leu Ile Lys Glu Ala Glu Gln Ile Ala Trp Leu Gln Arg 115 120 125 Lys Leu Gly Asn Ala Ala Arg Val Glu Asp Val His Pro Ile Ser Glu 130 135 140 Arg Pro Gln Tyr Phe Ser Gly Asp Gly Lys Ser Gly Lys Ile Gln Thr 145 150 155 160 Val Cys Phe Glu Gly Val Leu Thr Ile Asn Asp Ala Pro Ala Leu Ile 165 170 175 Asp 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HL-35 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(525) <223> Cse2 <400> 23 atgagcgatc gcaagcaggt catcggcaca tggtggcgga ccaggattgg tgcccgcaac 60 tccaccgcgg cgcgtgcgct ggcggccagg ctgaaccggg gcgagggggt ggacgtgctc 120 gcggagcggg cagtcttcga gcttggccgg gacttgggct tcctgaagca acccaaacgt 180 ctggtgctgc ttgtgcgggt gctggcggcg gtgcgtgagg atcggggggg agcgttgcca 240 ctaagactgg ggcaggggga tcctccaccc ctatcgccgt tgcgttttca gcgtcttttg 300 cgcgccgaag gcgaggagtt gaccacgctt ctgcgccgcg ccctccctat ggtcacacgg 360 acctgcgacg tgggcgcgct tggcgccgat ctgcttgact ggtctgactc cacccgcgcc 420 cgctgggcct tcgcctattt cggcgcgacc ccgcccgcca gaatcaacaa ctccagacca 480 acccctgaaa cgcccgccct atccgatcag gagaccgagg aatga 525 <210> 24 <211> 1083 <212> DNA <213> Oceanicola sp. HL-35 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1083) <223> Cas7 <400> 24 atgacgacct ttttgcaatt tcatgtgctg acgacctatc ccccgtcgaa ccctaaccgc 60 gacgatcagg gccgtccgaa gcaggccaat ctcggcggcg ctccccggct acggctatcg 120 tcgcaatcga tcaagcgggc aatgcgtgag agcccggcat ttcagcaggg tcttgatggc 180 catatcggca cgcgaacgaa gcgactgggc gaagaaatcc gcgaagagtt ggccaagcga 240 gagggcgtgt cgaccgatca ggcgctcgat gtggcttcaa aggtcgccgc gatcttctct 300 aagctggagg cgccgggcaa ggataaggtg caaaaaccac ttaccaccac tctggccttc 360 gtgtcgcccg acgaatgggc attggcccgc gatctggcga gccggatgtt ggcgggcgag 420 gagatgccga aggacaagga actgaagcgt ctggttctcc gccgtgccga cggggcagtg 480 gatatcgcca tgttcggccg gatgctggcg gatgaaccgg gctacaaccg cgaggccgcc 540 gtgcaggtga gccacgccat caccacccat cgcgccattg ccgaggacga ttggtattcc 600 gccgtcgacg atcttaacaa gcgcgaggat tcaggtgccg gacacttggg cgagcatggt 660 ttcggttcgg gcgtctatta cctctatgcc tgcgtcaacg tcgatcttct ggtagagaac 720 ctcgcgggcg atcgggcact cgccgcccgt ggtctcgaag cgttggcaaa ggcgctcgct 780 accgcaacac cacgcgggaa gcagaacagc catgcccacc acccccgcgc gatctatgtc 840 cgcgccgaac gcgggccgca acagccgcgc gacctgaccg gggccttctt ttctgctgtg 900 gacctgaagt cgaatgacat cgagcggaca tcaatcatcg cactggagag aaccgccgaa 960 cagattgatc gcgcctacgg tgccgcttgt gacgataccg cggtaatgga cgtgaaggag 1020 gggaatggca ctctggccga gatcgctgcc ttttctggcg cgtcggtatc tgccaatgcg 1080 tga 1083 <210> 25 <211> 765 <212> DNA <213> Oceanicola sp. HL-35 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(765) <223> Cas5 <400> 25 atggcactct ggccgagatc gctgcctttt ctggcgcgtc ggtatctgcc aatgcgtgag 60 catttggtct ttaccttggc cgcggctgtc gcctcgatgg gcgaactggc agggcacgag 120 cggcgtggca cctggtcttg gccgggacgg tcgtcagttc tgggcttgtg cgcagcagcc 180 cttggtatcc ggcgtgatgg cgatttcagt gcgcttgacg gactcgggct ggcagtggct 240 gtgttcgata caggcgaacc gctgcgggat tttcacacag ccgtcagtat cccgtcgtca 300 gtagcaaaga gaccgcagtc gcgtgcagat gcgttgcgga tcgacgctgg acgcagcaat 360 tccacgatca cattgcgcga ttaccgggtc ggagtgcttt atggtgtcgc gttgtggggc 420 gacggcctcc cgactgttgc agagaatctg gtcgaggctc tgcaacggcc gaccttcacg 480 ctctacttgg ggcgtaagtc ctgccccttg gcggccccgc ttgcgccacg tgtcctgacg 540 gcacccgacg ctgcggcggc gctgacagac ggaatgacgc taccaccgtg gcgtgctggt 600 gcccgtgcag gccagatcgc taccgaagag gaattgcccg cacctcgcac ggaaacccgc 660 cacgaccggc ccactgatcg caccgcatgg catttcgccc cgcgcgcggt gcgtctcgtt 720 ccctgtgata tcgcacctcg cactgctgga caggtggctg catga 765 <210> 26 <211> 708 <212> DNA <213> Oceanicola sp. HL-35 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(708) <223> Cas6 <400> 26 atgaccctct ggctatcccg agtccgcatc gctcgtggtg ctgatcttga tacgctgcgg 60 ccgctcttgg acccaagtgc gctgcatccg gcggcgatgg acccaaagat gttgggctct 120 caaacagacg cgcatcaccg cctgatctgg acgctgtttg ccgatagtcg tgaccggcgc 180 cgcgatttcc tgtggcgagc cgagggtgca gggaagttca ctttgctgtc gctgcgtcca 240 cctacggcgt cacgagtgtt tgaggcaccc gaggtgaagg ctttctctcc tgatcttttg 300 cccggtgacc ggctggcctt cgctttgcgc gccaacgcaa cccgagaccg ggccgggtca 360 gccaagggac ggcgagtcga tgtggtgatg cacgccttgc ataacgtgcc gcccgaggac 420 cgcgctgcgg cccggatgac tctggctcag gacgccgcct cggattggtt gacggggcag 480 ggcgcgcgcg cgggcttcgt gccggaagag gtgacagcag gtgattattc cgtggccgca 540 cttccaagcc acactggtag gcgaaagggg cagccgcagt atggtatcct cgatctgacc 600 ggcgtgctgc gcgtgaccga tccggcggct ttccttgcac ggctgggcca gggctttggt 660 agggcacgtg gttttggttg cgggcttatg ctgatccggc gggcctga 708 <210> 27 <211> 1455 <212> DNA <213> Oceanicola sp. HL-35 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1455) <223> Cas8 <400> 27 atgacagtga gcctgaatct gatcaccgat cgctggattc ccgtgctgga cacaaccgga 60 acacggcaca ccatcgcacc ttgggagatg gccgacagct cctttgtggc cccagattgg 120 cccagacctg acctgaacac cgcctgtctg gagctgctga tcggactggt gcgcctggcc 180 gatccccctg cacaccccga cgattgggag gacaggcagg cccctgacgc agataggctg 240 agggatagac tggcaccttt tgccccagcc ttcaatctgc tgggcgacgg cccacgcttc 300 atgcaggaga tgggaggact ggtgggcgat gtgcgggcaa cagacgtgct gtttatcgat 360 tccggcggcg acggaggcgc cctgaccgtg agagagggca ggtacccaaa cctggacctg 420 ccaacagcag caatggcact gtatgcaatg cagacccagg cacctagcgg cggaagagga 480 aatctgacat ccctgagggg aggaggacca atgaccgtgc tggtggaccc cggaggagga 540 atgtggcctc tgatctgggc aaacgtgccc gacggcaagc cagtggtgcc taatgtgctg 600 ccttggatga gaaggacagt gaccagcgag accggcgtga ggttctttcc acaccagggc 660 gatgccgccg aggtgttctt tggaatgcca cgccggctgt ggctggaggc acgcaacgac 720 tccgtgacag gcgtgatcca gcggccctct ggcaccaagt atgtgggctg gcgccaccca 780 ctgacaccct actataggca gaaggcaggc gataccccac tgcccgtgag gcctagggca 840 ggcgtgttcg gatacaggca ctggctggga atcgcagcag agcagggctc tgacctgagg 900 gagagaccag caaccgtgga ggcctgggag agccgcggac tgggcagaag ggccgatatc 960 atcgtggccg gctgggccat ggagaatatg aaggcaaggg actatatctg gtcccgggca 1020 cctctggtga cactgccaga ggagagagcc gcctttctga gggatatgat cgaggccgcc 1080 gacctgctgt ctgccgccct gaggggcgcc ctggccaccc tgctgggcga gggcgagggc 1140 agagaggccg ccagggaggc cttttacgtg agaacacagg ccgccttcga gggctgggtg 1200 agctgtctgg ataccatcgc cctggacgca gcagcaaggg gatggctggc cgatatgcgg 1260 aaggtggccc tggagatctt cgaggtgctg gccctgccag gactggcaga cagaaccatc 1320 ctggtgcagc aggagatcgt ggcagcacac aggggactga caggcagctt ctccggctac 1380 ggcaagctgg gcaccaaggc ctttggcgtg ctgaacctgc ctgtgccaac acggaagaag 1440 gaggccgcca cctaa 1455 <210> 28 <211> 525 <212> DNA <213> Oceanicola sp. HL-35 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(525) <223> Cse2 <400> 28 atgagcgaca ggaagcaggt catcggcaca tggtggagaa ccaggatcgg cgccagaaac 60 tccaccgcag caagggccct ggcagcacgg ctgaatagag gagagggagt ggatgtgctg 120 gcagagaggg ccgtgtttga gctgggaagg gacctgggct tcctgaagca gccaaagcgc 180 ctggtgctgc tggtgcgggt gctggcagcc gtgagggagg ataggggagg cgccctgcct 240 ctgaggctgg gccagggcga ccctccaccc ctgagcccac tgcggtttca gagactgctg 300 agggcagaag gagaggagct gacaaccctg ctgaggcgcg ccctgccaat ggtgacacgc 360 acctgcgacg tgggcgccct gggagcagac ctgctggatt ggtccgactc tacacgcgca 420 agatgggcct ttgcctattt cggcgccacc cctccagcca gaatcaacaa tagcaggcca 480 acacccgaga cccccgccct gtccgatcag gagacagagg agtaa 525 <210> 29 <211> 1083 <212> DNA <213> Oceanicola sp. HL-35 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1083) <223> Cas7 <400> 29 atgaccacat ttctgcagtt ccacgtgctg accacatatc ccccttctaa ccctaatagg 60 gacgatcagg gccggccaaa gcaggcaaac ctgggaggag caccaaggct gcggctgagc 120 tcccagtcta tcaagagggc aatgagggag agccctgcat tccagcaggg cctggatgga 180 cacatcggca cacggaccaa gagactgggc gaggagatca gggaggagct ggcaaagagg 240 gagggcgtga gcaccgatca ggccctggac gtggcatcta aggtggcagc catcttcagc 300 aagctggagg cccccggcaa ggacaaggtg cagaagcctc tgaccacaac cctggccttt 360 gtgagcccag atgagtgggc actggcaaga gacctggcat ccaggatgct ggcaggagag 420 gagatgccca aggataagga gctgaagcgc ctggtgctgc ggagagcaga tggagcagtg 480 gacatcgcaa tgttcggaag gatgctggca gacgagccag gatataacag ggaggcagca 540 gtgcaggtga gccacgcaat cacaacccac agagccatcg ccgaggacga ttggtactct 600 gccgtggacg atctgaataa gagggaggat agcggcgcag gacacctggg agagcacgga 660 tttggctccg gcgtgtacta tctgtacgcc tgcgtgaacg tggatctgct ggtggagaat 720 ctggcaggcg accgcgccct ggcagcaagg ggcctggagg ccctggcaaa ggccctggca 780 acagcaaccc caagaggcaa gcagaactct cacgcccacc accccagggc aatctatgtg 840 agggcagaga ggggaccaca gcagcctagg gacctgaccg gcgccttctt ttctgccgtg 900 gatctgaaga gcaatgacat cgagcggaca tccatcatcg ccctggagag aaccgccgag 960 cagatcgata gggcatacgg agcagcatgc gacgatacag ccgtgatgga cgtgaaggag 1020 ggaaacggca ccctggcaga gatcgcagcc ttcagcggcg catctgtgag cgccaatgca 1080 taa 1083 <210> 30 <211> 765 <212> DNA <213> Oceanicola sp. HL-35 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(765) <223> Cas5 <400> 30 atggcactgt ggcctcggtc tctgccattc ctggcccgga gatacctgcc aatgcgggag 60 cacctggtgt ttacactggc cgccgccgtg gcctccatgg gagagctggc aggacacgag 120 aggaggggca cctggtcttg gcccggcaga tctagcgtgc tgggcctgtg cgcagccgcc 180 ctgggcatcc ggcgggacgg cgatttctcc gccctggacg gactgggact ggcagtggcc 240 gtgtttgata caggagagcc actgagggac ttccacaccg ccgtgtccat cccatcctct 300 gtggccaaga ggccacagtc tcgggcagat gccctgcgca tcgacgcagg ccggagcaac 360 tccacaatca ccctgcgcga ttacagggtg ggcgtgctgt atggagtggc cctgtggggc 420 gacggactgc ctaccgtggc cgagaatctg gtggaggccc tgcagcgccc aacattcacc 480 ctgtacctgg gccggaagag ctgtccactg gcagcaccac tggcaccccg cgtgctgaca 540 gccccagatg cagcagccgc cctgacagac ggaatgaccc tgccaccatg gagagcagga 600 gcaagggcag gccagatcgc aaccgaggag gagctgcctg caccaagaac agagaccaga 660 cacgataggc caacagacag gaccgcctgg cactttgcac caagggccgt gcggctggtg 720 ccttgcgata tcgccccaag aacagcagga caggtggcag cataa 765 <210> 31 <211> 708 <212> DNA <213> Oceanicola sp. HL-35 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(708) <223> Cas6 <400> 31 atgacactgt ggctgagccg ggtgcggatc gcaagaggag cagacctgga taccctgagg 60 ccactgctgg accccagcgc cctgcaccca gcagcaatgg accccaagat gctgggctcc 120 cagacagacg cccaccacag actgatctgg accctgtttg ccgattccag agacaggcgc 180 cgggacttcc tgtggagggc agagggcgcc ggcaagttta cactgctgag cctgagaccc 240 cctaccgcct ccagggtgtt tgaggcccct gaggtgaagg ccttcagccc agatctgctg 300 ccaggcgaca ggctggcctt cgccctgcgg gccaacgcca cccgcgatcg ggccggctcc 360 gccaagggca gaagggtgga cgtggtcatg cacgccctgc acaatgtgcc acccgaggat 420 agggcagcag caaggatgac actggcacag gatgcagcaa gcgactggct gaccggacag 480 ggagccagag caggattcgt gcccgaggag gtgacagcag gcgactactc cgtggccgcc 540 ctgccttctc acaccggccg gagaaagggc cagccacagt atggcatcct ggatctgaca 600 ggcgtgctga gagtgaccga ccctgcagcc tttctggcaa ggctgggaca gggatttgga 660 agagcaaggg gattcggatg cggactgatg ctgatcagaa gggcataa 708 <210> 32 <211> 484 <212> PRT <213> Oceanicola sp. HL-35 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(484) <223> Cas8 <400> 32 Met Thr Val Ser Leu Asn Leu Ile Thr Asp Arg Trp Ile Pro Val Leu 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Thr Arg His Thr Ile Ala Pro Trp Glu Met Ala Asp 20 25 30 Ser Ser Phe Val Ala Pro Asp Trp Pro Arg Pro Asp Leu Asn Thr Ala 35 40 45 Cys Leu Glu Leu Leu Ile Gly Leu Val Arg Leu Ala Asp Pro Pro Ala 50 55 60 His Pro Asp Asp Trp Glu Asp Arg Gln Ala Pro Asp Ala Asp Arg Leu 65 70 75 80 Arg Asp Arg Leu Ala Pro Phe Ala Pro Ala Phe Asn Leu Leu Gly Asp 85 90 95 Gly Pro Arg Phe Met Gln Glu Met Gly Gly Leu Val Gly Asp Val Arg 100 105 110 Ala Thr Asp Val Leu Phe Ile Asp Ser Gly Gly Asp Gly Gly Ala Leu 115 120 125 Thr Val Arg Glu Gly Arg Tyr Pro Asn Leu Asp Leu Pro Thr Ala Ala 130 135 140 Met Ala Leu Tyr Ala Met Gln Thr Gln Ala Pro Ser Gly Gly Arg Gly 145 150 155 160 Asn Leu Thr Ser Leu Arg Gly Gly Gly Pro Met Thr Val Leu Val Asp 165 170 175 Pro Gly Gly Gly Met Trp Pro Leu Ile Trp Ala Asn Val Pro Asp Gly 180 185 190 Lys Pro Val Val Pro Asn Val Leu Pro Trp Met Arg Arg Thr Val Thr 195 200 205 Ser Glu Thr Gly Val Arg Phe Phe Pro His Gln Gly Asp Ala Ala Glu 210 215 220 Val Phe Phe Gly Met Pro Arg Arg Leu Trp Leu Glu Ala Arg Asn Asp 225 230 235 240 Ser Val Thr Gly Val Ile Gln Arg Pro Ser Gly Thr Lys Tyr Val Gly 245 250 255 Trp Arg His Pro Leu Thr Pro Tyr Tyr Arg Gln Lys Ala Gly Asp Thr 260 265 270 Pro Leu Pro Val Arg Pro Arg Ala Gly Val Phe Gly Tyr Arg His Trp 275 280 285 Leu Gly Ile Ala Ala Glu Gln Gly Ser Asp Leu Arg Glu Arg Pro Ala 290 295 300 Thr Val Glu Ala Trp Glu Ser Arg Gly Leu Gly Arg Arg Ala Asp Ile 305 310 315 320 Ile Val Ala Gly Trp Ala Met Glu Asn Met Lys Ala Arg Asp Tyr Ile 325 330 335 Trp Ser Arg Ala Pro Leu Val Thr Leu Pro Glu Glu Arg Ala Ala Phe 340 345 350 Leu Arg Asp Met Ile Glu Ala Ala Asp Leu Leu Ser Ala Ala Leu Arg 355 360 365 Gly Ala Leu Ala Thr Leu Leu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Glu Ala Ala 370 375 380 Arg Glu Ala Phe Tyr Val Arg Thr Gln Ala Ala Phe Glu Gly Trp Val 385 390 395 400 Ser Cys Leu Asp Thr Ile Ala Leu Asp Ala Ala Ala Arg Gly Trp Leu 405 410 415 Ala Asp Met Arg Lys Val Ala Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Ala Leu 420 425 430 Pro Gly Leu Ala Asp Arg Thr Ile Leu Val Gln Gln Glu Ile Val Ala 435 440 445 Ala His Arg Gly Leu Thr Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Gly Lys Leu Gly 450 455 460 Thr Lys Ala Phe Gly Val Leu Asn Leu Pro Val Pro Thr Arg Lys Lys 465 470 475 480 Glu Ala Ala Thr <210> 33 <211> 174 <212> PRT <213> Oceanicola sp. HL-35 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(174) <223> Cse2 <400> 33 Met Ser Asp Arg Lys Gln Val Ile Gly Thr Trp Trp Arg Thr Arg Ile 1 5 10 15 Gly Ala Arg Asn Ser Thr Ala Ala Arg Ala Leu Ala Ala Arg Leu Asn 20 25 30 Arg Gly Glu Gly Val Asp Val Leu Ala Glu Arg Ala Val Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Arg Asp Leu Gly Phe Leu Lys Gln Pro Lys Arg Leu Val Leu Leu 50 55 60 Val Arg Val Leu Ala Ala Val Arg Glu Asp Arg Gly Gly Ala Leu Pro 65 70 75 80 Leu Arg Leu Gly Gln Gly Asp Pro Pro Pro Leu Ser Pro Leu Arg Phe 85 90 95 Gln Arg Leu Leu Arg Ala Glu Gly Glu Glu Leu Thr Thr Leu Leu Arg 100 105 110 Arg Ala Leu Pro Met Val Thr Arg Thr Cys Asp Val Gly Ala Leu Gly 115 120 125 Ala Asp Leu Leu Asp Trp Ser Asp Ser Thr Arg Ala Arg Trp Ala Phe 130 135 140 Ala Tyr Phe Gly Ala Thr Pro Pro Ala Arg Ile Asn Asn Ser Arg Pro 145 150 155 160 Thr Pro Glu Thr Pro Ala Leu Ser Asp Gln Glu Thr Glu Glu 165 170 <210> 34 <211> 360 <212> PRT <213> Oceanicola sp. HL-35 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(360) <223> Cas7 <400> 34 Met Thr Thr Phe Leu Gln Phe His Val Leu Thr Thr Tyr Pro Pro Ser 1 5 10 15 Asn Pro Asn Arg Asp Asp Gln Gly Arg Pro Lys Gln Ala Asn Leu Gly 20 25 30 Gly Ala Pro Arg Leu Arg Leu Ser Ser Gln Ser Ile Lys Arg Ala Met 35 40 45 Arg Glu Ser Pro Ala Phe Gln Gln Gly Leu Asp Gly His Ile Gly Thr 50 55 60 Arg Thr Lys Arg Leu Gly Glu Glu Ile Arg Glu Glu Leu Ala Lys Arg 65 70 75 80 Glu Gly Val Ser Thr Asp Gln Ala Leu Asp Val Ala Ser Lys Val Ala 85 90 95 Ala Ile Phe Ser Lys Leu Glu Ala Pro Gly Lys Asp Lys Val Gln Lys 100 105 110 Pro Leu Thr Thr Thr Leu Ala Phe Val Ser Pro Asp Glu Trp Ala Leu 115 120 125 Ala Arg Asp Leu Ala Ser Arg Met Leu Ala Gly Glu Glu Met Pro Lys 130 135 140 Asp Lys Glu Leu Lys Arg Leu Val Leu Arg Arg Ala Asp Gly Ala Val 145 150 155 160 Asp Ile Ala Met Phe Gly Arg Met Leu Ala Asp Glu Pro Gly Tyr Asn 165 170 175 Arg Glu Ala Ala Val Gln Val Ser His Ala Ile Thr Thr His Arg Ala 180 185 190 Ile Ala Glu Asp Asp Trp Tyr Ser Ala Val Asp Asp Leu Asn Lys Arg 195 200 205 Glu Asp Ser Gly Ala Gly His Leu Gly Glu His Gly Phe Gly Ser Gly 210 215 220 Val Tyr Tyr Leu Tyr Ala Cys Val Asn Val Asp Leu Leu Val Glu Asn 225 230 235 240 Leu Ala Gly Asp Arg Ala Leu Ala Ala Arg Gly Leu Glu Ala Leu Ala 245 250 255 Lys Ala Leu Ala Thr Ala Thr Pro Arg Gly Lys Gln Asn Ser His Ala 260 265 270 His His Pro Arg Ala Ile Tyr Val Arg Ala Glu Arg Gly Pro Gln Gln 275 280 285 Pro Arg Asp Leu Thr Gly Ala Phe Phe Ser Ala Val Asp Leu Lys Ser 290 295 300 Asn Asp Ile Glu Arg Thr Ser Ile Ile Ala Leu Glu Arg Thr Ala Glu 305 310 315 320 Gln Ile Asp Arg Ala Tyr Gly Ala Ala Cys Asp Asp Thr Ala Val Met 325 330 335 Asp Val Lys Glu Gly Asn Gly Thr Leu Ala Glu Ile Ala Ala Phe Ser 340 345 350 Gly Ala Ser Val Ser Ala Asn Ala 355 360 <210> 35 <211> 254 <212> PRT <213> Oceanicola sp. HL-35 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(254) <223> Cas5 <400> 35 Met Ala Leu Trp Pro Arg Ser Leu Pro Phe Leu Ala Arg Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Pro Met Arg Glu His Leu Val Phe Thr Leu Ala Ala Ala Val Ala Ser 20 25 30 Met Gly Glu Leu Ala Gly His Glu Arg Arg Gly Thr Trp Ser Trp Pro 35 40 45 Gly Arg Ser Ser Val Leu Gly Leu Cys Ala Ala Ala Leu Gly Ile Arg 50 55 60 Arg Asp Gly Asp Phe Ser Ala Leu Asp Gly Leu Gly Leu Ala Val Ala 65 70 75 80 Val Phe Asp Thr Gly Glu Pro Leu Arg Asp Phe His Thr Ala Val Ser 85 90 95 Ile Pro Ser Ser Val Ala Lys Arg Pro Gln Ser Arg Ala Asp Ala Leu 100 105 110 Arg Ile Asp Ala Gly Arg Ser Asn Ser Thr Ile Thr Leu Arg Asp Tyr 115 120 125 Arg Val Gly Val Leu Tyr Gly Val Ala Leu Trp Gly Asp Gly Leu Pro 130 135 140 Thr Val Ala Glu Asn Leu Val Glu Ala Leu Gln Arg Pro Thr Phe Thr 145 150 155 160 Leu Tyr Leu Gly Arg Lys Ser Cys Pro Leu Ala Ala Pro Leu Ala Pro 165 170 175 Arg Val Leu Thr Ala Pro Asp Ala Ala Ala Ala Leu Thr Asp Gly Met 180 185 190 Thr Leu Pro Pro Trp Arg Ala Gly Ala Arg Ala Gly Gln Ile Ala Thr 195 200 205 Glu Glu Glu Leu Pro Ala Pro Arg Thr Glu Thr Arg His Asp Arg Pro 210 215 220 Thr Asp Arg Thr Ala Trp His Phe Ala Pro Arg Ala Val Arg Leu Val 225 230 235 240 Pro Cys Asp Ile Ala Pro Arg Thr Ala Gly Gln Val Ala Ala 245 250 <210> 36 <211> 235 <212> PRT <213> Oceanicola sp. HL-35 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(235) <223> Cas6 <400> 36 Met Thr Leu Trp Leu Ser Arg Val Arg Ile Ala Arg Gly Ala Asp Leu 1 5 10 15 Asp Thr Leu Arg Pro Leu Leu Asp Pro Ser Ala Leu His Pro Ala Ala 20 25 30 Met Asp Pro Lys Met Leu Gly Ser Gln Thr Asp Ala His His Arg Leu 35 40 45 Ile Trp Thr Leu Phe Ala Asp Ser Arg Asp Arg Arg Arg Asp Phe Leu 50 55 60 Trp Arg Ala Glu Gly Ala Gly Lys Phe Thr Leu Leu Ser Leu Arg Pro 65 70 75 80 Pro Thr Ala Ser Arg Val Phe Glu Ala Pro Glu Val Lys Ala Phe Ser 85 90 95 Pro Asp Leu Leu Pro Gly Asp Arg Leu Ala Phe Ala Leu Arg Ala Asn 100 105 110 Ala Thr Arg Asp Arg Ala Gly Ser Ala Lys Gly Arg Arg Val Asp Val 115 120 125 Val Met His Ala Leu His Asn Val Pro Pro Glu Asp Arg Ala Ala Ala 130 135 140 Arg Met Thr Leu Ala Gln Asp Ala Ala Ser Asp Trp Leu Thr Gly Gln 145 150 155 160 Gly Ala Arg Ala Gly Phe Val Pro Glu Glu Val Thr Ala Gly Asp Tyr 165 170 175 Ser Val Ala Ala Leu Pro Ser His Thr Gly Arg Arg Lys Gly Gln Pro 180 185 190 Gln Tyr Gly Ile Leu Asp Leu Thr Gly Val Leu Arg Val Thr Asp Pro 195 200 205 Ala Ala Phe Leu Ala Arg Leu Gly Gln Gly Phe Gly Arg Ala Arg Gly 210 215 220 Phe Gly Cys Gly Leu Met Leu Ile Arg Arg Ala 225 230 235 <210> 37 <211> 90 <212> DNA <213> Oceanicola sp. HL-35 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(90) <223> CRISPR <400> 37 ctgttccccg cacacgcggg gatgaaccgg gttcttcgat ctgcgcatcc atgatgccgc 60 cctgttcccc gcacacgcgg ggatgaaccg 90 <210> 38 <211> 1554 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1554) <223> Cas8 <400> 38 atggatttgt taagtgatac ctggctgcag tgccgccatc gtgatggcac gctgaagccg 60 atagctattg ggcagatagg gctagaagac tgtttagagc tggttgcgcc acgccccgac 120 ttccgtggtg cgctctatca gtttctgatc gggttgctgc aaaccgccta cgcgccagag 180 gatcttcagg agtggcgtga tcgctatgcc aacccaccta ccgctgatga cctggcagag 240 gttttcgctc cttaccgcga cgccttccag ctggaaaact cagggcctac ctttatgcag 300 gacctgacct tgcccgatga cgtcaatcag ctgccggtgc tggagctgtt gattgatgcc 360 ggctcatcga gcaatcagta tttcaacaag ccggcggttg agcacggcat gtgcgagggc 420 tgctttaccc aggcgttgct caccatgcag ttgaacgcgc cctctggcgg acgaggcatt 480 cggacctcgc tgcgtggtgg cggtccgttg acgaccttgc tggtgccagc cgaacagaac 540 gcgacgcttt ggcaaaagct ctggctcaac gtcttgcctc ttgatgcact cgatcacccg 600 ccgatcaaga tgctcagtga cgtattgccc tggctggcac caacccgcac cagcgatgac 660 aaacagggcc aggatacacc gccggagtcg gtgcacccct tgcaggcgta ctggagcatg 720 ccgcggcgca ttcgcctgga tgcagccacc ttggatcagg gggattgcgc ggtatgcggt 780 gcccagaatg taaagcgtat ccgtcattac cgtacccgcc atggcggcac caactacacc 840 gggacatgga ctcacccgct gacaccctac agcctggact cgaaaggaga aaagccgccg 900 ctctcgatca aggggcgtca ggccgggcga ggttaccgtg actggctggg tctggtactt 960 ggtaatgaag atcaccagcc ggatgccgcg caggttgttc ggcacttcac cgccaaactg 1020 ggcaagccgt ccgtgcgctt gtggtgcttc ggtttcgata tgtcgaacat gaaagcgttg 1080 tgctggtacg acagtctgtt gccggtacac ggcgtggcac ctgacgttca gcggaagttt 1140 acccgcagcg tcaagcaggt gctggattcg gccaatgaca tggcctccgt tctgcacaaa 1200 caggtcaaag cggcctggtt tcgccgtccg ggcgatgccg gtcaggagcc tgccgtgacg 1260 caaagttttt ggcagggctc tgagacggcc ttttatcagg tgctggagca gctcagcaag 1320 ctcgattttg acagcgcggc cgagttggca gcgatctaca gagcctggtt gcaggccacg 1380 cgtcgtctgg tgctaagtct gtttgaccac tgggtgctga gcggtccgct ggaagatatg 1440 gacatgcaac gcgtggtcaa ggcccgggct gatctggcca aagagctgaa tactggcaag 1500 gcacaaaagc cgctgtggac aatcgttaat caacatctca aggagcaggc atga 1554 <210> 39 <211> 642 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(642) <223> Cse2 <400> 39 atgaagccga gaaagcccag attgaacgag gcccagcagc gctgggtgcg cgactggtgg 60 cgcgccttgc agccccgcgc cgagggtgat gaacccatac ccggcgagct gtctgtcatg 120 gggaggggtg agcgggcaca actgcgccgc tgcaccgatg ccgatgagct gcttacccag 180 tcagccaccc tgctgctggc gcaccgtttg gttgcactca atggtgagcg aggccctttg 240 cctgataatt ccttgagcta cgagcgcatg gcctgggtgg ccggggtgct ggctaacgtc 300 aaggacgacc tgcgtgacgg caagagtctg gctacgcacc ttgggcaggc tgctgatgcc 360 gagcgcccgc cgatgagcga actgcgtttc agggctatgc agcgcggcac ggcgatgcag 420 gagctattcc tgcattggcg tcgggcgttg caactggccg ggggcaagac tgatgtggca 480 cacctggcag atgacctgct gagctggcag atagagcagg gccagtctgc tgctcaggcg 540 agcaacgggg tcaaatttca ctgggcctat gactactatc tgagcgcccg ggaccgggca 600 gccgccaaag aacctgaatt caacaaggag atatccaaat ga 642 <210> 40 <211> 1035 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1035) <223> Cas7 <400> 40 atgactcgtt ttgtgcaatt gcacctgctg acgtcctacc cgcccgccaa ccttaaccgc 60 gatgatctgg gcaacccgaa aaccgcacgc ctaggcggtg ttgaacgtct gcgtgtgtcc 120 tcgcaaagtc tcaaacgcgc ttggcgtacc tcggagctgt ttcagcaaca gttggccggg 180 actatcggca cgcgcaccaa gcgccttggt atcgaggttt tcgaggcact gctgggtgct 240 ggtgtcactg agaagcaggc gcgtgagtgg gctggacaaa tcgccaaggt ttacggggct 300 gcgaaaaagg ataatccact ggaaatcgag cagctggtcc atatcgcgcc tgaagagcgt 360 gcttcgctgg atcaactggt ggccaccctt gccgcggaaa aacgcggccc aacggatgag 420 gagttggacg ccctgctgca ccaccagaca gcggtggata tcgccatgtt tggtcgcatg 480 ctggcctcca aaacacagtt caacggagag gccgcagtgc aggtagccca tgccatcggc 540 gtgcacgcat cggctattga ggatgactac ttcaccgccg ttgacgatct caaccgcaat 600 gatcctggcg ctgcgcatat cggtgaatcc ggtttcgccg ctgcagtgtt ctaccagtac 660 atctgcatcg accgcgatct gctgaaacgg aatctggggg gcgatgaagt gctgactcaa 720 aaggcactcc gggctctgac tgaagcggcg ctcaaagtgg ggcccagcgg caagcaaaac 780 agcttcgcca gccgggcttt cgcccacttt gcgctggccg agaaaggcac tgatcagccg 840 cgctctctgt cactggcctt cgtcaaaccg gtggccggca cagactatgc cggtgatgcc 900 gttgcggcct tgcaacaggt gcgcgacaac atggacaagg tctatggagt ctgcgctgaa 960 agccgctgcc agttcaatgt gctgacgggt gaagggtcag tggccgacct gcttgatttt 1020 gtcgccgcgg agtga 1035 <210> 41 <211> 768 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(768) <223> Cas5 <400> 41 atgactgact atctactgct gcggctctat ggcccgctgg ccagctgggg cgagattgca 60 gtcggcgaat cgcgacactc ggcggtacaa ccgtcgcgtt ccgcgctgct tggtttgctg 120 ggtgcagcgc tgggtatcga gcggcacgat gatgccgctc agcaggcgct tgtggacggt 180 taccgctttg cgatcaagct ggaatgcata ggttcgccct tgcgtgacta tcacacggtt 240 caggtaggcg tgccgccgcg caagttccag tttcgctcac gtcgtcagga attggctgcc 300 gacaaagtcg atactattct gtcgacccgt gagtaccgct gtgacagcct cgcgttggtt 360 gctgtggaag ccttgcccgg tgcgccggtg gacttggcct ccctggccga agcgctgcgt 420 aagccgcgct tcgccttgta tctggggcgc aaatcctgcc cgcttgcttt gccgttgagt 480 ccaaaaattc ttgccgccag cagtgtgcgt gaggtgttcg acaatctgga attgccttcc 540 ttgctgggtt tgttggatcg ctatcagccc gagcaagcct ggccaagtcg acaggaccaa 600 caggcactac gtcccggtgt cgcgcgatac tattgggaag acgggatgac tgctggcatg 660 gcgccgagct ttgaggccca acgacatgat cagccactct cccgtcgccg ctggcagttt 720 gcaccgcgcc gcgaatgggt ggccttgaat gatggagggc agtcatga 768 <210> 42 <211> 663 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(663) <223> Cas6 <400> 42 atgagccatt atttctcgct tgttagactg atcggcagtc cgcgtcacga tgcctggctg 60 cgtgacttgt cgcgccatgg tgaagcctac agggatcatg cgttgatctg gcgcctgttc 120 ccgggcgatg gcgctgcacg tgactttgtt ttccgccgcc ttgaggacga aaaaagtttc 180 tatgtggttt cagcacgacc accacaggcc gatgcggggt tattccatat ccagagcaaa 240 gcctattcgc ctgagttggc cgagggtgat tgggtgcgat tcgacctgcg tgccaatccc 300 accgtcagcg tgcgccggga aaatggtcgc tcacagcgtc atgatgtgct gatgcacgcc 360 aagcagcttg ccagcacaga aaaatcggca ctacctgagc ggctggaagc agcaggcagg 420 gaatggctga aagacagggc ggaacgctgg ggactggatt tgcgtactga cagtcttatg 480 caaaacggtt atcgccagca gcggttgaag cgcaagggta aacacatcgc tttttccacg 540 ttggactatc agggcattgc ccaggtgacg gaccctgaac aattgcgccg ggcactgctc 600 gacggggttg gacacagcaa gggctttggc tgcgggctgt tgctggtaaa acgtgtggac 660 tga 663 <210> 43 <211> 1554 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1554) <223> Cas8 <400> 43 atggacctgc tgtctgatac atggctgcag tgcaggcaca gggacggcac cctgaagcct 60 atcgccatcg gccagatcgg cctggaggac tgtctggagc tggtggcacc tcggcccgac 120 ttccggggcg ccctgtacca gttcctgatc ggcctgctgc agacagccta tgccccagag 180 gacctgcagg agtggagaga tagatacgcc aaccctccaa ccgccgacga tctggccgag 240 gtgtttgccc cttataggga tgccttccag ctggagaact ccggcccaac attcatgcag 300 gacctgaccc tgccagacga tgtgaatcag ctgcccgtgc tggagctgct gatcgacgca 360 ggctcctcta gcaaccagta ctttaataag ccagcagtgg agcacggaat gtgcgagggc 420 tgtttcacac aggccctgct gaccatgcag ctgaatgcac catccggcgg aaggggcatc 480 agaacatctc tgaggggagg aggacctctg accacactgc tggtgccagc cgagcagaac 540 gccaccctgt ggcagaagct gtggctgaat gtgctgcccc tggacgccct ggatcaccca 600 cctatcaaga tgctgtctga tgtgctgcca tggctggcac caacccggac aagcgacgat 660 aagcagggcc aggacacacc acccgagtct gtgcacccac tgcaggccta ctggagcatg 720 cctaggcgga tcagactgga cgcagccacc ctggaccagg gcgattgcgc cgtgtgcgga 780 gcacagaacg tgaagcgcat ccggcactac agaacaaggc acggcggcac caattatacc 840 ggcacatgga cccaccccct gaccccttat tctctggata gcaagggcga gaagcctcca 900 ctgagcatca agggccggca ggcaggaagg ggatacaggg actggctggg actggtgctg 960 ggaaacgagg accaccagcc tgatgccgcc caggtggtga ggcacttcac agccaagctg 1020 ggcaagccat ccgtgcgcct gtggtgcttt ggcttcgaca tgagcaatat gaaggccctg 1080 tgctggtacg attccctgct gccagtgcac ggagtggccc ctgacgtgca gaggaagttt 1140 acccgcagcg tgaagcaggt gctggactct gccaacgata tggccagcgt gctgcacaag 1200 caggtgaagg ccgcctggtt cagaaggccc ggcgacgcag gacaggagcc tgcagtgaca 1260 cagtcttttt ggcagggcag cgagaccgcc ttctatcagg tgctggagca gctgtccaag 1320 ctggactttg attctgccgc agagctggca gcaatctaca gagcatggct gcaggcaacc 1380 cgccggctgg tgctgagcct gttcgatcac tgggtgctgt ccggccctct ggaggacatg 1440 gatatgcagc gggtggtgaa ggcaagagca gacctggcca aggagctgaa cacaggcaag 1500 gcccagaagc cactgtggac catcgtgaat cagcacctga aggagcaggc ctaa 1554 <210> 44 <211> 642 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(642) <223> Cse2 <400> 44 atgaagccaa ggaagcctcg gctgaatgag gcccagcaga gatgggtgag ggattggtgg 60 agggccctgc agccaagggc agagggcgac gagccaatcc ctggagagct gagcgtgatg 120 ggaaggggag agagggcaca gctgcggaga tgtaccgacg ccgatgagct gctgacacag 180 tccgccaccc tgctgctggc acacaggctg gtggccctga acggagagag aggaccactg 240 cccgataata gcctgtccta tgagaggatg gcatgggtgg caggcgtgct ggcaaacgtg 300 aaggacgatc tgagagatgg caagtccctg gccacccacc tgggacaggc agcagacgca 360 gagaggcctc caatgtctga gctgcgcttt cgggccatgc agagaggcac agccatgcag 420 gagctgttcc tgcactggag gcgcgccctg cagctggcag gaggcaagac cgacgtggca 480 cacctggcag acgatctgct gagctggcag atcgagcagg gacagtctgc cgcacaggcc 540 agcaatggcg tgaagtttca ctgggcctac gactactatc tgtctgccag agatagggcc 600 gccgccaagg agccagagtt caacaaggag atcagcaaat aa 642 <210> 45 <211> 1035 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1035) <223> Cas7 <400> 45 atgacacgct ttgtgcagct gcacctgctg acctcttatc cccctgccaa cctgaatagg 60 gacgatctgg gaaaccctaa gacagcaagg ctgggaggag tggagagact gagggtgagc 120 tcccagtctc tgaagcgcgc ctggcggaca agcgagctgt ttcagcagca gctggcagga 180 accatcggaa ccagaacaaa gaggctgggc atcgaggtgt tcgaggccct gctgggagca 240 ggagtgaccg agaagcaggc aagggagtgg gcaggacaga tcgcaaaggt gtacggagcc 300 gccaagaagg ataaccccct ggagatcgag cagctggtgc acatcgcccc tgaggagagg 360 gccagcctgg accagctggt ggccacactg gcagcagaga agagaggacc aaccgacgag 420 gagctggatg ccctgctgca ccaccagaca gccgtggaca tcgccatgtt tggcaggatg 480 ctggccagca agacccagtt caatggagag gcagcagtgc aggtggcaca cgcaatcgga 540 gtgcacgcct ccgccatcga ggacgattac ttcaccgccg tggacgatct gaaccgcaat 600 gatccaggag cagcacacat cggagagtcc ggctttgccg ccgccgtgtt ctaccagtat 660 atctgcatcg accgggatct gctgaagaga aacctgggcg gcgacgaggt gctgacacag 720 aaggccctgc gcgccctgac cgaggccgcc ctgaaggtcg gccccagcgg caagcagaat 780 tcctttgcct ctagggcctt tgcccacttc gccctggccg agaagggcac agatcagcca 840 cgctccctgt ctctggcctt cgtgaagcca gtggcaggaa ccgactacgc aggcgatgcc 900 gtggccgccc tgcagcaggt gagggacaac atggataagg tgtatggcgt gtgcgccgag 960 tcccgctgtc agtttaatgt gctgacagga gagggctctg tggcagacct gctggatttc 1020 gtggcagcag agtaa 1035 <210> 46 <211> 768 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(768) <223> Cas5 <400> 46 atgaccgact acctgctgct gaggctgtat ggaccactgg catcctgggg agagatcgca 60 gtgggagagt ctaggcacag cgccgtgcag ccttctcgca gcgccctgct gggactgctg 120 ggagccgccc tgggcatcga gagacacgac gatgcagcac agcaggccct ggtggatgga 180 taccggttcg ccatcaagct ggagtgtatc ggctctcccc tgagagacta tcacaccgtg 240 caagtgggag tgccaccaag gaagttccag tttagaagcc ggagacagga gctggcagca 300 gacaaggtgg atacaatcct gtccaccaga gagtataggt gcgattctct ggccctggtg 360 gcagtggagg ccctgccagg agcacccgtg gacctggcca gcctggcaga ggccctgcgc 420 aagccaaggt ttgccctgta cctgggaagg aagagctgtc cactggccct gcctctgtcc 480 ccaaagatcc tggccgcctc tagcgtgcgc gaggtgttcg ataacctgga gctgccttct 540 ctgctgggcc tgctggacag gtaccagcct gagcaggcct ggccaagcag acaggatcag 600 caggccctga ggccaggagt ggcaaggtac tattgggagg acggaatgac agcaggaatg 660 gcaccttctt ttgaggccca gaggcacgat cagccactga gcaggcgccg gtggcagttc 720 gcaccaagaa gggagtgggt ggccctgaac gatggaggac agtcctaa 768 <210> 47 <211> 663 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(663) <223> Cas6 <400> 47 atgtctcact acttcagcct ggtgaggctg atcggctccc ctaggcacga cgcctggctg 60 agggatctga gcagacacgg agaggcctac agggaccacg ccctgatctg gagactgttc 120 cctggcgacg gagcagcaag ggatttcgtg tttcgccggc tggaggatga gaagtccttt 180 tatgtggtgt ctgccaggcc acctcaggca gacgcaggac tgttccacat ccagtccaag 240 gcctactctc cagagctggc agagggcgac tgggtgaggt tcgatctgcg cgccaacccc 300 acagtgtctg tgagaaggga gaatggcaga agccagaggc acgatgtgct gatgcacgcc 360 aagcagctgg ccagcaccga gaagtccgcc ctgcccgagc ggctggaggc agcaggaaga 420 gagtggctga aggacagggc agagcggtgg ggcctggacc tgagaaccga ttccctgatg 480 cagaacggct acagacagca gaggctgaag cgcaagggca agcacatcgc cttttctaca 540 ctggactatc agggcatcgc ccaggtgacc gatcccgagc agctgcgccg ggccctgctg 600 gacggagtgg gacactccaa gggattcgga tgcggactgc tgctggtgaa gcgggtggat 660 taa 663 <210> 48 <211> 517 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(517) <223> Cas8 <400> 48 Met Asp Leu Leu Ser Asp Thr Trp Leu Gln Cys Arg His Arg Asp Gly 1 5 10 15 Thr Leu Lys Pro Ile Ala Ile Gly Gln Ile Gly Leu Glu Asp Cys Leu 20 25 30 Glu Leu Val Ala Pro Arg Pro Asp Phe Arg Gly Ala Leu Tyr Gln Phe 35 40 45 Leu Ile Gly Leu Leu Gln Thr Ala Tyr Ala Pro Glu Asp Leu Gln Glu 50 55 60 Trp Arg Asp Arg Tyr Ala Asn Pro Pro Thr Ala Asp Asp Leu Ala Glu 65 70 75 80 Val Phe Ala Pro Tyr Arg Asp Ala Phe Gln Leu Glu Asn Ser Gly Pro 85 90 95 Thr Phe Met Gln Asp Leu Thr Leu Pro Asp Asp Val Asn Gln Leu Pro 100 105 110 Val Leu Glu Leu Leu Ile Asp Ala Gly Ser Ser Ser Asn Gln Tyr Phe 115 120 125 Asn Lys Pro Ala Val Glu His Gly Met Cys Glu Gly Cys Phe Thr Gln 130 135 140 Ala Leu Leu Thr Met Gln Leu Asn Ala Pro Ser Gly Gly Arg Gly Ile 145 150 155 160 Arg Thr Ser Leu Arg Gly Gly Gly Pro Leu Thr Thr Leu Leu Val Pro 165 170 175 Ala Glu Gln Asn Ala Thr Leu Trp Gln Lys Leu Trp Leu Asn Val Leu 180 185 190 Pro Leu Asp Ala Leu Asp His Pro Pro Ile Lys Met Leu Ser Asp Val 195 200 205 Leu Pro Trp Leu Ala Pro Thr Arg Thr Ser Asp Asp Lys Gln Gly Gln 210 215 220 Asp Thr Pro Pro Glu Ser Val His Pro Leu Gln Ala Tyr Trp Ser Met 225 230 235 240 Pro Arg Arg Ile Arg Leu Asp Ala Ala Thr Leu Asp Gln Gly Asp Cys 245 250 255 Ala Val Cys Gly Ala Gln Asn Val Lys Arg Ile Arg His Tyr Arg Thr 260 265 270 Arg His Gly Gly Thr Asn Tyr Thr Gly Thr Trp Thr His Pro Leu Thr 275 280 285 Pro Tyr Ser Leu Asp Ser Lys Gly Glu Lys Pro Pro Leu Ser Ile Lys 290 295 300 Gly Arg Gln Ala Gly Arg Gly Tyr Arg Asp Trp Leu Gly Leu Val Leu 305 310 315 320 Gly Asn Glu Asp His Gln Pro Asp Ala Ala Gln Val Val Arg His Phe 325 330 335 Thr Ala Lys Leu Gly Lys Pro Ser Val Arg Leu Trp Cys Phe Gly Phe 340 345 350 Asp Met Ser Asn Met Lys Ala Leu Cys Trp Tyr Asp Ser Leu Leu Pro 355 360 365 Val His Gly Val Ala Pro Asp Val Gln Arg Lys Phe Thr Arg Ser Val 370 375 380 Lys Gln Val Leu Asp Ser Ala Asn Asp Met Ala Ser Val Leu His Lys 385 390 395 400 Gln Val Lys Ala Ala Trp Phe Arg Arg Pro Gly Asp Ala Gly Gln Glu 405 410 415 Pro Ala Val Thr Gln Ser Phe Trp Gln Gly Ser Glu Thr Ala Phe Tyr 420 425 430 Gln Val Leu Glu Gln Leu Ser Lys Leu Asp Phe Asp Ser Ala Ala Glu 435 440 445 Leu Ala Ala Ile Tyr Arg Ala Trp Leu Gln Ala Thr Arg Arg Leu Val 450 455 460 Leu Ser Leu Phe Asp His Trp Val Leu Ser Gly Pro Leu Glu Asp Met 465 470 475 480 Asp Met Gln Arg Val Val Lys Ala Arg Ala Asp Leu Ala Lys Glu Leu 485 490 495 Asn Thr Gly Lys Ala Gln Lys Pro Leu Trp Thr Ile Val Asn Gln His 500 505 510 Leu Lys Glu Gln Ala 515 <210> 49 <211> 213 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(213) <223> Cse2 <400> 49 Met Lys Pro Arg Lys Pro Arg Leu Asn Glu Ala Gln Gln Arg Trp Val 1 5 10 15 Arg Asp Trp Trp Arg Ala Leu Gln Pro Arg Ala Glu Gly Asp Glu Pro 20 25 30 Ile Pro Gly Glu Leu Ser Val Met Gly Arg Gly Glu Arg Ala Gln Leu 35 40 45 Arg Arg Cys Thr Asp Ala Asp Glu Leu Leu Thr Gln Ser Ala Thr Leu 50 55 60 Leu Leu Ala His Arg Leu Val Ala Leu Asn Gly Glu Arg Gly Pro Leu 65 70 75 80 Pro Asp Asn Ser Leu Ser Tyr Glu Arg Met Ala Trp Val Ala Gly Val 85 90 95 Leu Ala Asn Val Lys Asp Asp Leu Arg Asp Gly Lys Ser Leu Ala Thr 100 105 110 His Leu Gly Gln Ala Ala Asp Ala Glu Arg Pro Pro Met Ser Glu Leu 115 120 125 Arg Phe Arg Ala Met Gln Arg Gly Thr Ala Met Gln Glu Leu Phe Leu 130 135 140 His Trp Arg Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gly Gly Lys Thr Asp Val Ala 145 150 155 160 His Leu Ala Asp Asp Leu Leu Ser Trp Gln Ile Glu Gln Gly Gln Ser 165 170 175 Ala Ala Gln Ala Ser Asn Gly Val Lys Phe His Trp Ala Tyr Asp Tyr 180 185 190 Tyr Leu Ser Ala Arg Asp Arg Ala Ala Ala Lys Glu Pro Glu Phe Asn 195 200 205 Lys Glu Ile Ser Lys 210 <210> 50 <211> 344 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(344) <223> Cas7 <400> 50 Met Thr Arg Phe Val Gln Leu His Leu Leu Thr Ser Tyr Pro Pro Ala 1 5 10 15 Asn Leu Asn Arg Asp Asp Leu Gly Asn Pro Lys Thr Ala Arg Leu Gly 20 25 30 Gly Val Glu Arg Leu Arg Val Ser Ser Gln Ser Leu Lys Arg Ala Trp 35 40 45 Arg Thr Ser Glu Leu Phe Gln Gln Gln Leu Ala Gly Thr Ile Gly Thr 50 55 60 Arg Thr Lys Arg Leu Gly Ile Glu Val Phe Glu Ala Leu Leu Gly Ala 65 70 75 80 Gly Val Thr Glu Lys Gln Ala Arg Glu Trp Ala Gly Gln Ile Ala Lys 85 90 95 Val Tyr Gly Ala Ala Lys Lys Asp Asn Pro Leu Glu Ile Glu Gln Leu 100 105 110 Val His Ile Ala Pro Glu Glu Arg Ala Ser Leu Asp Gln Leu Val Ala 115 120 125 Thr Leu Ala Ala Glu Lys Arg Gly Pro Thr Asp Glu Glu Leu Asp Ala 130 135 140 Leu Leu His His Gln Thr Ala Val Asp Ile Ala Met Phe Gly Arg Met 145 150 155 160 Leu Ala Ser Lys Thr Gln Phe Asn Gly Glu Ala Ala Val Gln Val Ala 165 170 175 His Ala Ile Gly Val His Ala Ser Ala Ile Glu Asp Asp Tyr Phe Thr 180 185 190 Ala Val Asp Asp Leu Asn Arg Asn Asp Pro Gly Ala Ala His Ile Gly 195 200 205 Glu Ser Gly Phe Ala Ala Ala Val Phe Tyr Gln Tyr Ile Cys Ile Asp 210 215 220 Arg Asp Leu Leu Lys Arg Asn Leu Gly Gly Asp Glu Val Leu Thr Gln 225 230 235 240 Lys Ala Leu Arg Ala Leu Thr Glu Ala Ala Leu Lys Val Gly Pro Ser 245 250 255 Gly Lys Gln Asn Ser Phe Ala Ser Arg Ala Phe Ala His Phe Ala Leu 260 265 270 Ala Glu Lys Gly Thr Asp Gln Pro Arg Ser Leu Ser Leu Ala Phe Val 275 280 285 Lys Pro Val Ala Gly Thr Asp Tyr Ala Gly Asp Ala Val Ala Ala Leu 290 295 300 Gln Gln Val Arg Asp Asn Met Asp Lys Val Tyr Gly Val Cys Ala Glu 305 310 315 320 Ser Arg Cys Gln Phe Asn Val Leu Thr Gly Glu Gly Ser Val Ala Asp 325 330 335 Leu Leu Asp Phe Val Ala Ala Glu 340 <210> 51 <211> 255 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(255) <223> Cas5 <400> 51 Met Thr Asp Tyr Leu Leu Leu Arg Leu Tyr Gly Pro Leu Ala Ser Trp 1 5 10 15 Gly Glu Ile Ala Val Gly Glu Ser Arg His Ser Ala Val Gln Pro Ser 20 25 30 Arg Ser Ala Leu Leu Gly Leu Leu Gly Ala Ala Leu Gly Ile Glu Arg 35 40 45 His Asp Asp Ala Ala Gln Gln Ala Leu Val Asp Gly Tyr Arg Phe Ala 50 55 60 Ile Lys Leu Glu Cys Ile Gly Ser Pro Leu Arg Asp Tyr His Thr Val 65 70 75 80 Gln Val Gly Val Pro Pro Arg Lys Phe Gln Phe Arg Ser Arg Arg Gln 85 90 95 Glu Leu Ala Ala Asp Lys Val Asp Thr Ile Leu Ser Thr Arg Glu Tyr 100 105 110 Arg Cys Asp Ser Leu Ala Leu Val Ala Val Glu Ala Leu Pro Gly Ala 115 120 125 Pro Val Asp Leu Ala Ser Leu Ala Glu Ala Leu Arg Lys Pro Arg Phe 130 135 140 Ala Leu Tyr Leu Gly Arg Lys Ser Cys Pro Leu Ala Leu Pro Leu Ser 145 150 155 160 Pro Lys Ile Leu Ala Ala Ser Ser Val Arg Glu Val Phe Asp Asn Leu 165 170 175 Glu Leu Pro Ser Leu Leu Gly Leu Leu Asp Arg Tyr Gln Pro Glu Gln 180 185 190 Ala Trp Pro Ser Arg Gln Asp Gln Gln Ala Leu Arg Pro Gly Val Ala 195 200 205 Arg Tyr Tyr Trp Glu Asp Gly Met Thr Ala Gly Met Ala Pro Ser Phe 210 215 220 Glu Ala Gln Arg His Asp Gln Pro Leu Ser Arg Arg Arg Trp Gln Phe 225 230 235 240 Ala Pro Arg Arg Glu Trp Val Ala Leu Asn Asp Gly Gly Gln Ser 245 250 255 <210> 52 <211> 220 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(220) <223> Cas6 <400> 52 Met Ser His Tyr Phe Ser Leu Val Arg Leu Ile Gly Ser Pro Arg His 1 5 10 15 Asp Ala Trp Leu Arg Asp Leu Ser Arg His Gly Glu Ala Tyr Arg Asp 20 25 30 His Ala Leu Ile Trp Arg Leu Phe Pro Gly Asp Gly Ala Ala Arg Asp 35 40 45 Phe Val Phe Arg Arg Leu Glu Asp Glu Lys Ser Phe Tyr Val Val Ser 50 55 60 Ala Arg Pro Pro Gln Ala Asp Ala Gly Leu Phe His Ile Gln Ser Lys 65 70 75 80 Ala Tyr Ser Pro Glu Leu Ala Glu Gly Asp Trp Val Arg Phe Asp Leu 85 90 95 Arg Ala Asn Pro Thr Val Ser Val Arg Arg Glu Asn Gly Arg Ser Gln 100 105 110 Arg His Asp Val Leu Met His Ala Lys Gln Leu Ala Ser Thr Glu Lys 115 120 125 Ser Ala Leu Pro Glu Arg Leu Glu Ala Ala Gly Arg Glu Trp Leu Lys 130 135 140 Asp Arg Ala Glu Arg Trp Gly Leu Asp Leu Arg Thr Asp Ser Leu Met 145 150 155 160 Gln Asn Gly Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Lys Arg Lys Gly Lys His Ile 165 170 175 Ala Phe Ser Thr Leu Asp Tyr Gln Gly Ile Ala Gln Val Thr Asp Pro 180 185 190 Glu Gln Leu Arg Arg Ala Leu Leu Asp Gly Val Gly His Ser Lys Gly 195 200 205 Phe Gly Cys Gly Leu Leu Leu Val Lys Arg Val Asp 210 215 220 <210> 53 <211> 90 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. S-6-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(90) <223> CRISPR <400> 53 gtgttccccg cacctgcggg gatgaaccgg gccggggcgt ttgcgctgtc aggggcgtcc 60 cgtgttcccc gcacctgcgg ggatgaaccg 90 <210> 54 <211> 1536 <212> DNA <213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Muenster strain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1536) <223> Cas8 <400> 54 atggatttaa ccaaagagaa atggcttccc gtcatattct caaacggcga aaaaacgaga 60 atatcattac gcgatcttct ggataaccgc attcaggatc ttgcataccc ccggcccgat 120 tttcaggggg ctgcatggca aatgctgatt ggtattttac aatgtaccgt cgcgccggaa 180 gataaagaag aatgggcaga tatctggcat gaaagtatcg aattcgaaca atgggagaag 240 gcgttaaata cgatttctct ggctctacag ttcggcgagc aaaaaccttc cttcctgcaa 300 agttttgatc ctctcgatag tgaatatggt tctattgccg ggctgctggt ggatgcgccg 360 ggcggtaatg cgctcaagct caataaagat cattttgtaa aacgtggcaa cgtagaacaa 420 atatgtcctc actgcgcggc gatagcgcta tttgcgattc aaaccaattc acctgccggc 480 ggggcgggtt accgggtagg gatgcgcggc ggtggtccgc tgactacgct ggtggtaccg 540 caggaagaag ataaatatcc actatggaaa aaactttggc ttaacgtttt gccgcaggaa 600 gagccgccga atgttacaca gcatccactc atttttccct ggcttgcgcc gacgaaaacc 660 agcgaaaaag cggggaatgt ggtcacaccg gataatgcgc accccttgca agcctactgg 720 ggaatgccgc ggcgcataga actggatttc acccacactg tggcaggtat ctgcgatttg 780 tgcggggagc atcacgaatc actgctactg caaatgcgta gtaaaaatta tggcgttcag 840 tacgacagtt ggttacatcc tttctcccca tatcggcagg cattgaaaga tccatccgca 900 ccctggctgg cgtttaaagg gcagccgggc gggttaagtt ataaagactg gttggggctg 960 atgctcaatc gtgaggataa gttcaacaaa atgcagcctg caaaggtcgt tcgtgccgct 1020 ggtcagcgga acaaaatgag cctgtggtgc tttgcctggg atatggataa ggccaaggtc 1080 cgctgctggt atcagcaccg tattccgctc attagcgttt cgcacgaaga gcaatttctc 1140 gctgtgctta acattgtgct ggtgctggct agtgagtcgc tgtcgctgtt acggaacgcg 1200 ttaaagagcg ccaaattcga ttgtccgaaa gaagccaaaa tggattttag tatggtggat 1260 atcgccttct ggcaggaaac cgaacccgct tttcggacgt tgcaagaggc gctggctgtc 1320 gatccgcttc ggcaggatac acagactcgt cacgcagtaa gtcagtggga ggcggaatta 1380 gcacactatc tatttcacgt ttttgatcgt gatgccctga ccaaccccga ctgcccggac 1440 gatatcctgc agcgccagct gacggcccga caggatttag ccagcagcta tcgtaaacat 1500 aaagcgcgca aggatgtgtt ggcgctggtc gaataa 1536 <210> 55 <211> 603 <212> DNA <213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Muenster strain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(603) <223> Cse2 <400> 55 atgctgaata gcaatacagc agtgttatgc agaattctcc accccgatgc gcagaaggcg 60 ctacttgact ggtttgctac gctgtctgag cgttacgagc gcaaggatgg taaacgagtc 120 aacggtcgcg cctggcgggc tgagttgaaa agaatggcgc cgccatatgg cgtaatgata 180 tgtgaagggc atgacgctct ccgccaggcg ctgcttaaac atatgcgact gcaacctctt 240 gatgagatgg ctctggcgct gtttgtcagc gtcgctgtgc atattaagag ccataaggcg 300 aatattagtt tcgctgcaca attaggggaa aagcttaaag gttctacgcc gtgcgtttct 360 gttctgcgtt ttgaacgttt gcaaaaagcg tccgacccgg aaacattttg ccagttgttg 420 attcaggcag tgaagattcg cggtacggag ggggtgaatg ttctttcact tgccgatggc 480 attttcctgt ggatggaaga gtggcaacga cgcgaaaacc atcagccgga attccgtaac 540 ccctttgaac gaaatcgcat ccgttgggcg aacgaatatc tttccacgtc gcgtggcaaa 600 taa 603 <210> 56 <211> 1065 <212> DNA <213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Muenster strain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1065) <223> Cas7 <400> 56 ttgataatga caacttttat tcaactgcat ttattgactg cttatgcgcc cgctaacctg 60 aatcgtgatg agtctggcag accgaagacc gcgtttatgg gaggagttga gcgtttacgc 120 gtatcgtcgc aaagtctgaa gcgtgcctgg cgggtgtcgg aaacttttga agcggcaatg 180 gatggtttta tgggtaagcg tactcgtcga attggcgtgg attatgttta tcgtccgatg 240 aaagatgccg gaattgaaga aaaaattgct aagagttcgt ctgagttaat cgctaagcaa 300 tttggcaagc ttaaaagtga taaagatgcg aaaccggaaa aaaatctcga aattgagcag 360 atcgttcacg tcagtaacca tgaaattagt ttgattaagc aactggttga tacgctaatt 420 gccgacaaac gcgaacctaa cgatgaagaa gtggagttgt tgcgcaaaga gcagcgtagc 480 gtagatatgg cgctgtttgg ccgtatgctg gcgtcatcgc ctgagttcaa cgtcgaggct 540 gcttgtcagg tatcccatgc gttgggcgta agtgccgtga ccgttgagtc tgattttttc 600 accgccgttg acgatctgaa taataaagag gaagacgcag gttccgggca tatgggcgag 660 cagggttttg cctcggcgct tttctatacc tatgtctgta tcagccgcga tctgctggtg 720 gaaaacctgg gtggtaacga agaactggcg aagcgtacta tcgcggcact cactgaaaca 780 gcgttaaccg tctcgccaac cggtaaacaa aacagcttcg cttctcgtgc ctatgccacc 840 tatgcgttgg ccgaagtcgg gcaaaaacaa ccgcgttctc tggcggcggc atttttccag 900 ccggtacgcg ataccgatca aattccggcg gcaataaccc gtttaaaaca gcagcgcgcc 960 agcttcgata acgtatacgg aaactgtgca gacgattatc gcgagttgaa cgttcaggaa 1020 ggtacgggat ctctggcgga attactggcc tttgttagcc agtaa 1065 <210> 57 <211> 726 <212> DNA <213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Muenster strain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(726) <223> Cas5 <400> 57 atgaaggaat atctggtttt tcagctctat gcgccgctgg cgtcgtgggg ggaagaagcg 60 tctggcgaga ttcgccactc agctacggtt cccacgcgct ctgcgctatt gggtctgctt 120 gccgcagcgt taggaattcg tcgcgacgaa gaagcgcggc tgaataactt taaccggcac 180 tatcatctgg cggtgcacgc gttggcttca caagatcgct ggttgcggga ttatcacacg 240 gttagcgcgc cgcgagaaaa caaaaagaat cgttattaca cgcgccggga tgaactgact 300 ctcgcgccgg atgaagtggg gacgcttatc tcgcagcgag aatatcgctg cgacggctac 360 tggcatgtgg caataagcgc cacgcctgat gcaccacatt cgcttagcga attgcgagag 420 gcgctgctga caccgcattt tccgctctat ctggggagaa aatcctgccc gctggcgtta 480 ccgttagcgg cgcgtttaat gaccggcacc ttaaaagagg tattcaccca tgctgtggag 540 gagatttccg cagcggaatt aagtggattt accctgcgtg agggtatttg ttattgggat 600 gatcctgatg aggagagtct ggtctggcaa caaaagcagc atagcaataa ccagccagtt 660 agccgccaac gctggcagtt tggcggctac acccgcttca atgggccgtt gcaggagaga 720 acataa 726 <210> 58 <211> 705 <212> DNA <213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Muenster strain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(705) <223> Cas6 <400> 58 atgtatcttt ctcgtattca actccggttt aataatttgc gaccggagat gttggcaaag 60 tggaattcag ccaggcctta tgccagccac cagtggttat ggcagctctt tccggaacag 120 gaattgcgtc agtttctgtt tcgcgaagag gcgcatggcg gcttttttat gctctcggca 180 ataccgccgt tatcgcagca ctccctgttt cttattgaaa ccaaaccatt taatccgcaa 240 ctgacaaatg gtcttgagct tgattttcaa ctacgagcta acccggtgat aacccgtaac 300 ggtaagcgca gtgacgtgat gatgaacgcg aaacatcagg cgaaggcgaa tggtgtggag 360 aaagaacggt ggtgggagct tcaacagcag gccgcgcagg cgtggctgga acaacaaggg 420 cagcagcatg gtttccggtt gattgcaccg gaacctgatg atttcgctat gtgggctggt 480 gacgagtaca gtgaattgca ggcacattgt ggatgcgtgc aagcgtatca gcagcatcgt 540 tttgtccgta aagaccagca aaaaccgatc actttcagta gcgttgattt tagcggtgcg 600 ctctgtatca ccgatgcagc actgtttaaa caggctttat tttccggatt aggtaaaagt 660 aaagcgctgg gctgcggaat gctgatggta aaaaggaaac gctga 705 <210> 59 <211> 1536 <212> DNA <213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Muenster strain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1536) <223> Cas8 <400> 59 atggacctga ccaaagagaa gtggctgcct gtgatctttt ctaacggcga gaagacaaga 60 atcagcctga gggacctgct ggataatcgc atccaggacc tggcctatcc tcggccagat 120 ttccagggag cagcatggca gatgctgatc ggcatcctgc agtgtaccgt ggccccagag 180 gacaaggagg agtgggccga tatctggcac gagtctatcg agtttgagca gtgggagaag 240 gccctgaaca caatcagcct ggccctgcag ttcggcgagc agaagccctc ttttctgcag 300 agcttcgacc ctctggattc cgagtacggc tctatcgcag gactgctggt ggacgcacca 360 ggaggcaacg ccctgaagct gaataaggat cactttgtga agagaggcaa cgtggagcag 420 atctgcccac actgtgcagc aatcgccctg ttcgccatcc agaccaatag ccctgcagga 480 ggagcaggct atagggtggg aatgagggga ggaggaccac tgaccacact ggtggtgcct 540 caggaggagg acaagtaccc actgtggaag aagctgtggc tgaacgtgct gccacaggag 600 gagcccccta atgtgaccca gcacccactg atctttccct ggctggcccc taccaagaca 660 tccgagaagg ccggcaacgt ggtgacacct gataatgccc acccactgca ggcctactgg 720 ggaatgccaa ggaggatcga gctggacttc acccacacag tggcaggaat ctgcgacctg 780 tgcggagagc accacgagtc cctgctgctg cagatgcgct ctaagaacta cggcgtgcag 840 tatgactctt ggctgcaccc ctttagccct tataggcagg ccctgaagga cccctccgcc 900 ccatggctgg ccttcaaggg acagccagga ggactgtctt acaaggactg gctgggcctg 960 atgctgaaca gggaggataa gtttaataag atgcagccag caaaggtggt gcgcgcagca 1020 ggccagcgga ataagatgag cctgtggtgc ttcgcctggg acatggataa ggccaaggtg 1080 cgctgttggt accagcacag aatccccctg atctccgtgt ctcacgagga gcagttcctg 1140 gccgtgctga acatcgtgct ggtgctggcc agcgagtccc tgtctctgct gcggaatgcc 1200 ctgaagagcg ccaagtttga ctgccctaag gaggccaaga tggacttttc catggtggat 1260 atcgccttct ggcaggagac cgagcctgcc ttcagaacac tgcaggaggc cctggcagtg 1320 gacccactga gacaggatac ccagacaagg cacgccgtga gccagtggga ggcagagctg 1380 gcccactatc tgtttcacgt gttcgaccgc gatgccctga ccaaccctga ttgtccagac 1440 gatatcctgc agagacagct gacagcaagg caggacctgg caagctccta caggaagcac 1500 aaggcccgga aggatgtgct ggccctggtg gagtaa 1536 <210> 60 <211> 603 <212> DNA <213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Muenster strain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(603) <223> Cse2 <400> 60 atgctgaaca gcaataccgc cgtgctgtgc agaatcctgc accctgacgc ccagaaggcc 60 ctgctggatt ggttcgccac actgagcgag cggtacgagc ggaaggacgg caagcgcgtg 120 aacggaagag catggagggc agagctgaag aggatggcac caccctacgg cgtgatgatc 180 tgtgagggac acgacgccct gagacaggcc ctgctgaagc acatgaggct gcagcctctg 240 gatgagatgg cactggccct gttcgtgagc gtggcagtgc acatcaagtc tcacaaggcc 300 aacatcagct tcgccgcaca gctgggagag aagctgaagg gctccacccc atgcgtgtct 360 gtgctgcgct ttgagcggct gcagaaggcc agcgaccccg agaccttctg tcagctgctg 420 atccaggccg tgaagatcag gggcacagag ggcgtgaatg tgctgtccct ggccgatggc 480 atcttcctgt ggatggagga gtggcagagg cgcgagaacc accagccaga gtttcgcaac 540 cccttcgaga ggaatcgcat ccggtgggcc aatgagtacc tgtctaccag ccgcggcaag 600 taa 603 <210> 61 <211> 1065 <212> DNA <213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Muenster strain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1065) <223> Cas7 <400> 61 atgatcatga ccaccttcat ccagctgcac ctgctgaccg catacgcacc tgccaacctg 60 aatagagacg agagcggcag gccaaagaca gccttcatgg gaggagtgga gcggctgaga 120 gtgagctccc agagcctgaa gagagcctgg agggtgtccg agacctttga ggccgccatg 180 gatggcttca tgggcaagag aacacggaga atcggcgtgg actacgtgta taggcctatg 240 aaggatgccg gcatcgagga gaagatcgcc aagtctagct ccgagctgat cgccaagcag 300 ttcggcaagc tgaagagcga caaggatgcc aagccagaga agaacctgga gatcgagcag 360 atcgtgcacg tgagcaatca cgagatctcc ctgatcaagc agctggtgga caccctgatc 420 gccgataaga gggagccaaa cgacgaggag gtggagctgc tgcgcaagga gcagcggtcc 480 gtggatatgg ccctgtttgg ccgcatgctg gcctctagcc ccgagttcaa tgtggaggca 540 gcatgccagg tgtctcacgc cctgggcgtg agcgccgtga ccgtggagtc cgacttcttt 600 acagccgtgg acgatctgaa caataaggag gaggatgcag gctccggcca catgggagag 660 cagggatttg cctctgccct gttctacacc tacgtgtgca tcagccgcga cctgctggtg 720 gagaacctgg gaggcaatga ggagctggcc aagcggacaa tcgccgccct gaccgagaca 780 gccctgaccg tgagccctac aggcaagcag aacagctttg cctcccgcgc atacgcaacc 840 tatgccctgg cagaagtggg acagaagcag ccacgctccc tggcagcagc cttctttcag 900 cccgtgcggg acaccgatca gatccctgcc gccatcacac gcctgaagca gcagcgggcc 960 tcttttgaca acgtgtacgg caattgcgcc gacgattata gggagctgaa cgtgcaggag 1020 ggaaccggct ccctggcaga gctgctggcc ttcgtgtctc agtaa 1065 <210> 62 <211> 726 <212> DNA <213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Muenster strain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(726) <223> Cas5 <400> 62 atgaaggagt acctggtgtt tcagctgtat gcacctctgg caagctgggg agaggaggcc 60 tccggcgaga tcagacactc tgccaccgtg ccaacaaggt ccgccctgct gggactgctg 120 gcagccgccc tgggcatccg gcgggatgag gaggccagac tgaacaattt caataggcac 180 taccacctgg cagtgcacgc cctggcatcc caggacagat ggctgaggga ttatcacacc 240 gtgtctgccc cccgcgagaa caagaagaat cggtactata ccaggaggga cgagctgaca 300 ctggcccctg atgaagtggg cacactgatc tctcagcgcg agtaccggtg cgacggctat 360 tggcacgtgg caatcagcgc cacccccgat gcacctcact ccctgtctga gctgcgggag 420 gccctgctga caccacactt ccccctgtac ctgggcagaa agagctgtcc actggccctg 480 cctctggcag caaggctgat gaccggcaca ctgaaggagg tgtttaccca cgcagtggag 540 gagatcagcg ccgcagagct gtccggcttc acactgagag agggcatctg ctattgggac 600 gatcctgacg aggagtccct ggtgtggcag cagaagcagc acagcaacaa tcagccagtg 660 tccagacaga ggtggcagtt tggcggctac accaggttca acggaccact gcaggagagg 720 acataa 726 <210> 63 <211> 705 <212> DNA <213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Muenster strain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(705) <223> Cas6 <400> 63 atgtatctga gcagaatcca gctgaggttt aacaatctga gacccgagat gctggccaag 60 tggaactccg ccaggcctta cgcctctcac cagtggctgt ggcagctgtt ccctgagcag 120 gagctgagac agttcctgtt tagggaggag gcccacggcg gcttctttat gctgagcgcc 180 atcccacccc tgtcccagca ctctctgttt ctgatcgaga ccaagccttt caacccacag 240 ctgacaaatg gcctggagct ggactttcag ctgagagcca accccgtgat cacccgcaat 300 ggcaagcggt ccgatgtgat gatgaacgcc aagcaccagg ccaaggccaa tggcgtggag 360 aaggagcggt ggtgggagct gcagcagcag gcagcacagg cctggctgga gcagcagggc 420 cagcagcacg gctttagact gatcgcccca gagcccgacg atttcgccat gtgggcaggc 480 gacgagtaca gcgagctgca ggcacactgc ggatgcgtgc aggcctatca gcagcacaga 540 ttcgtgagga aggatcagca gaagccaatc accttttcct ctgtggactt ctccggcgcc 600 ctgtgcatca cagatgccgc cctgtttaag caggccctgt tctccggcct gggcaagtct 660 aaggccctgg gctgcggcat gctgatggtg aagaggaaga gataa 705 <210> 64 <211> 511 <212> PRT <213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Muenster strain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(511) <223> Cas8 <400> 64 Met Asp Leu Thr Lys Glu Lys Trp Leu Pro Val Ile Phe Ser Asn Gly 1 5 10 15 Glu Lys Thr Arg Ile Ser Leu Arg Asp Leu Leu Asp Asn Arg Ile Gln 20 25 30 Asp Leu Ala Tyr Pro Arg Pro Asp Phe Gln Gly Ala Ala Trp Gln Met 35 40 45 Leu Ile Gly Ile Leu Gln Cys Thr Val Ala Pro Glu Asp Lys Glu Glu 50 55 60 Trp Ala Asp Ile Trp His Glu Ser Ile Glu Phe Glu Gln Trp Glu Lys 65 70 75 80 Ala Leu Asn Thr Ile Ser Leu Ala Leu Gln Phe Gly Glu Gln Lys Pro 85 90 95 Ser Phe Leu Gln Ser Phe Asp Pro Leu Asp Ser Glu Tyr Gly Ser Ile 100 105 110 Ala Gly Leu Leu Val Asp Ala Pro Gly Gly Asn Ala Leu Lys Leu Asn 115 120 125 Lys Asp His Phe Val Lys Arg Gly Asn Val Glu Gln Ile Cys Pro His 130 135 140 Cys Ala Ala Ile Ala Leu Phe Ala Ile Gln Thr Asn Ser Pro Ala Gly 145 150 155 160 Gly Ala Gly Tyr Arg Val Gly Met Arg Gly Gly Gly Pro Leu Thr Thr 165 170 175 Leu Val Val Pro Gln Glu Glu Asp Lys Tyr Pro Leu Trp Lys Lys Leu 180 185 190 Trp Leu Asn Val Leu Pro Gln Glu Glu Pro Pro Asn Val Thr Gln His 195 200 205 Pro Leu Ile Phe Pro Trp Leu Ala Pro Thr Lys Thr Ser Glu Lys Ala 210 215 220 Gly Asn Val Val Thr Pro Asp Asn Ala His Pro Leu Gln Ala Tyr Trp 225 230 235 240 Gly Met Pro Arg Arg Ile Glu Leu Asp Phe Thr His Thr Val Ala Gly 245 250 255 Ile Cys Asp Leu Cys Gly Glu His His Glu Ser Leu Leu Leu Gln Met 260 265 270 Arg Ser Lys Asn Tyr Gly Val Gln Tyr Asp Ser Trp Leu His Pro Phe 275 280 285 Ser Pro Tyr Arg Gln Ala Leu Lys Asp Pro Ser Ala Pro Trp Leu Ala 290 295 300 Phe Lys Gly Gln Pro Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Asp Trp Leu Gly Leu 305 310 315 320 Met Leu Asn Arg Glu Asp Lys Phe Asn Lys Met Gln Pro Ala Lys Val 325 330 335 Val Arg Ala Ala Gly Gln Arg Asn Lys Met Ser Leu Trp Cys Phe Ala 340 345 350 Trp Asp Met Asp Lys Ala Lys Val Arg Cys Trp Tyr Gln His Arg Ile 355 360 365 Pro Leu Ile Ser Val Ser His Glu Glu Gln Phe Leu Ala Val Leu Asn 370 375 380 Ile Val Leu Val Leu Ala Ser Glu Ser Leu Ser Leu Leu Arg Asn Ala 385 390 395 400 Leu Lys Ser Ala Lys Phe Asp Cys Pro Lys Glu Ala Lys Met Asp Phe 405 410 415 Ser Met Val Asp Ile Ala Phe Trp Gln Glu Thr Glu Pro Ala Phe Arg 420 425 430 Thr Leu Gln Glu Ala Leu Ala Val Asp Pro Leu Arg Gln Asp Thr Gln 435 440 445 Thr Arg His Ala Val Ser Gln Trp Glu Ala Glu Leu Ala His Tyr Leu 450 455 460 Phe His Val Phe Asp Arg Asp Ala Leu Thr Asn Pro Asp Cys Pro Asp 465 470 475 480 Asp Ile Leu Gln Arg Gln Leu Thr Ala Arg Gln Asp Leu Ala Ser Ser 485 490 495 Tyr Arg Lys His Lys Ala Arg Lys Asp Val Leu Ala Leu Val Glu 500 505 510 <210> 65 <211> 200 <212> PRT <213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Muenster strain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(200) <223> Cse2 <400> 65 Met Leu Asn Ser Asn Thr Ala Val Leu Cys Arg Ile Leu His Pro Asp 1 5 10 15 Ala Gln Lys Ala Leu Leu Asp Trp Phe Ala Thr Leu Ser Glu Arg Tyr 20 25 30 Glu Arg Lys Asp Gly Lys Arg Val Asn Gly Arg Ala Trp Arg Ala Glu 35 40 45 Leu Lys Arg Met Ala Pro Pro Tyr Gly Val Met Ile Cys Glu Gly His 50 55 60 Asp Ala Leu Arg Gln Ala Leu Leu Lys His Met Arg Leu Gln Pro Leu 65 70 75 80 Asp Glu Met Ala Leu Ala Leu Phe Val Ser Val Ala Val His Ile Lys 85 90 95 Ser His Lys Ala Asn Ile Ser Phe Ala Ala Gln Leu Gly Glu Lys Leu 100 105 110 Lys Gly Ser Thr Pro Cys Val Ser Val Leu Arg Phe Glu Arg Leu Gln 115 120 125 Lys Ala Ser Asp Pro Glu Thr Phe Cys Gln Leu Leu Ile Gln Ala Val 130 135 140 Lys Ile Arg Gly Thr Glu Gly Val Asn Val Leu Ser Leu Ala Asp Gly 145 150 155 160 Ile Phe Leu Trp Met Glu Glu Trp Gln Arg Arg Glu Asn His Gln Pro 165 170 175 Glu Phe Arg Asn Pro Phe Glu Arg Asn Arg Ile Arg Trp Ala Asn Glu 180 185 190 Tyr Leu Ser Thr Ser Arg Gly Lys 195 200 <210> 66 <211> 354 <212> PRT <213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Muenster strain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(354) <223> Cas7 <400> 66 Met Ile Met Thr Thr Phe Ile Gln Leu His Leu Leu Thr Ala Tyr Ala 1 5 10 15 Pro Ala Asn Leu Asn Arg Asp Glu Ser Gly Arg Pro Lys Thr Ala Phe 20 25 30 Met Gly Gly Val Glu Arg Leu Arg Val Ser Ser Gln Ser Leu Lys Arg 35 40 45 Ala Trp Arg Val Ser Glu Thr Phe Glu Ala Ala Met Asp Gly Phe Met 50 55 60 Gly Lys Arg Thr Arg Arg Ile Gly Val Asp Tyr Val Tyr Arg Pro Met 65 70 75 80 Lys Asp Ala Gly Ile Glu Glu Lys Ile Ala Lys Ser Ser Ser Glu Leu 85 90 95 Ile Ala Lys Gln Phe Gly Lys Leu Lys Ser Asp Lys Asp Ala Lys Pro 100 105 110 Glu Lys Asn Leu Glu Ile Glu Gln Ile Val His Val Ser Asn His Glu 115 120 125 Ile Ser Leu Ile Lys Gln Leu Val Asp Thr Leu Ile Ala Asp Lys Arg 130 135 140 Glu Pro Asn Asp Glu Glu Val Glu Leu Leu Arg Lys Glu Gln Arg Ser 145 150 155 160 Val Asp Met Ala Leu Phe Gly Arg Met Leu Ala Ser Ser Pro Glu Phe 165 170 175 Asn Val Glu Ala Ala Cys Gln Val Ser His Ala Leu Gly Val Ser Ala 180 185 190 Val Thr Val Glu Ser Asp Phe Phe Thr Ala Val Asp Asp Leu Asn Asn 195 200 205 Lys Glu Glu Asp Ala Gly Ser Gly His Met Gly Glu Gln Gly Phe Ala 210 215 220 Ser Ala Leu Phe Tyr Thr Tyr Val Cys Ile Ser Arg Asp Leu Leu Val 225 230 235 240 Glu Asn Leu Gly Gly Asn Glu Glu Leu Ala Lys Arg Thr Ile Ala Ala 245 250 255 Leu Thr Glu Thr Ala Leu Thr Val Ser Pro Thr Gly Lys Gln Asn Ser 260 265 270 Phe Ala Ser Arg Ala Tyr Ala Thr Tyr Ala Leu Ala Glu Val Gly Gln 275 280 285 Lys Gln Pro Arg Ser Leu Ala Ala Ala Phe Phe Gln Pro Val Arg Asp 290 295 300 Thr Asp Gln Ile Pro Ala Ala Ile Thr Arg Leu Lys 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ctataggccc ggggcaatgt tgcgggtgcg gacagcagag caaccagcgt 780 tataacggtt ttctcaaggc taaattcaac tttacggttg aaggattatg gcctcatcca 840 cattccccgc gcgttctggt tgagaaaaaa ggcgttattg aacaaaagtt tctcgccttt 900 accaccgcag cgccttcatg gacgcaaata ggtcgcctac tggtggacaa agaaacccgg 960 caaggtgaag ggcgtcgggt ggcgacggtg gttgaacaat tcagggaggt gtacccgcgc 1020 ttcaggctgg cattgatcgt cggtggatat cgtaataatc aggcttctat tctggagcgt 1080 cgccacgatg tgctggtttt caatgatgga tggcaaaacg gtagcgatgt gatcaatgac 1140 attgttgaaa tggggctggg atacaaaact gctttgcgaa aagggttgta caccttcgtt 1200 gagggggcaa aaaatcacga tgttaaaggg gcgggtgtag cggtacacga agtggctgaa 1260 cgacattatt accgccgcag cgaactgctt attcccgcga tcctggcaag cattgattat 1320 tctcagccaa atgatgtcat tgcacgtctg agaaaagagc ttcatcaact ttgcgaagcg 1380 ctcttcaacc aggttactgc cccatatgcc catcatccca aattgatccg ctcattagca 1440 gtggcgcgcg cttcgcttca taaacatctc aatgaactta aaccacaagg agagttagcg 1500 tatgtcgacg gagattga 1518 <210> 71 <211> 492 <212> DNA <213> Atlantibacter hermannii NBRC 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gcactatcca tcttgaagag ctgcgtgacg tattacgtca aaaattatcc 240 ccgcgattcg aattgccgat aatcgataaa acgctgtctt tgttatcagg aaaaaccatt 300 gatgatgctg aaaaaattaa cggcgacgca gtaacgcctt gggtattggg cgaagtcgaa 360 tggttttgcg aacaggtaat gaaagcggaa gctgagcaac tggatgataa aaaactgctc 420 aaaatgctta aagatgatat tgccgcgatg cgcaccaatc ttcagcaggg ggttgatgtt 480 gcactgagcg gacgcatggc gaccagcggc ctgatgagcg aactcgggaa agttgatggt 540 gcaatgtcca ttgctcatgc catcaccaca catactgttg attccgatat tgactggttt 600 acagcagtag acgatctcca ggacttaggt tcggcgcacc ttggaaccca ggaattttct 660 tccggcgtgt tttatcgcta cgccagtctg aatattgccc agcttcagga gaaccttggc 720 ggtgtatctc gcgagcaggt ccttgaaatc gcagcgcatc ttgcgcatat gctggcgact 780 gaagtaccgg gcgcgaagca acataccttc gcggcattca acccggcgga catggtcatg 840 atcaattttt ctgatttccc cctttcgtta gccaatgctt ttgaaagccc gattaaagcc 900 aaagatggct atttgttacc ttctatcaac gcctttaatg agtactggca gcgtatagct 960 aaagggtatg gattaacagg accggcggca cagtttatgt tggccgaagc aagtatggcg 1020 ggcggaaatg tggtgtctgt 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EPR-M <220> <221> misc_feature <222> (1)..(480) <223> Cse2 <400> 92 atggccaagg agacagattt catggacctg taccaggcct ggcagagact gccaaacgga 60 ccaaaggcag agctgaagag gtgcggcgat ctgggcgacc tgctggagac cagcgccttt 120 tacagactgc tggcaggaag gggagaggca gagtggcaga agaaggccta tcagcggatg 180 atcttctgcc tgccctgtat caatcacaca gagcagaaga tccctctggg agccgccctg 240 gcacggagca gaaagggcag ccggagcgcc gtgagcgagt ctaggatgat ccaggtggtg 300 cgctccgagg caccaaacga tatggtgcag ctgaggcgca tcctgaagca cgcagagcca 360 accgtgaact ggcctctgat ggccaagcag ctgtggtact gggacctgaa tgagaggagc 420 aagcggagcc tgctggagga tttctttctg aaccacaccg acacaagcaa ggagggataa 480 <210> 93 <211> 1095 <212> DNA <213> Geothermobacter sp. EPR-M <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1095) <223> Cas7 <400> 93 atgcagaact ttatcaatta ccacgtgctg atctctcaca gcccatcctg cctgaaccgc 60 gacgatatga atatgcagaa gagcgccatc ttcggaggcg tgcggagagt gcggatcagc 120 tcccagagcc tgaagcgggc catgagaaag tccgactact atgcccagca cctgggcgag 180 gcctctatca gaaccaagca cctgagcggc ctgagggata ggctgcacga gcgcctggca 240 ggccggttca gccccgaagt gatcgacaag acaatcaagc tgctgatcga caaggatgtg 300 agcgtggatg gaatcgtgga gggcgacgca gtggcaccat gggcagtgga ggagtttgca 360 tggttctgtg agagagtgat gaacgcacag gcagagggcc tggaggataa ggccctgacc 420 aagcagctga aggagtccat cgccgccatg agacagacac tggtgggcgg cctggatatc 480 gccctgtctg gcaggatggc caccagcggc ctgctgtccg agctgggcaa ggtggacggc 540 gccctggcag tggcacacgc cctgaccaca cacaccgtgg acgccgatat cgactggttt 600 acagccgtgg acgatctgca ggagctgggc tctggccacc tggacaccca ggagttttct 660 agcggcgtgt tctacagata tgccagcctg aacatcggac agctgcagga gaatctggga 720 ggagcaccaa gggagcaggc cctggagatc gcaacccacg tgctgcagat gctggccaca 780 gtggtgccct ccgccaagca gcagtctttc gccgcccaca atctggccga tctggccctg 840 gtgtcctttg ccgacatccc cgtgagcctg gcaaacgcct tcgagaagcc agtgcagcag 900 aagaatggct ctggctttcg ggagccaagc atcgccgccc tgcacgacta ctggcagaag 960 gtgcacatcg gctatggcct ggaggagaga tgcggccagt tcgtgctgaa caaggtggag 1020 acccctgcag gaatcgcagc aaaggagtcc ctggaggatc tgaagtcttg ggtgcgcaac 1080 aatggagagg gataa 1095 <210> 94 <211> 678 <212> DNA <213> Geothermobacter sp. EPR-M <220> <221> misc_feature <222> (1)..(678) <223> Cas5 <400> 94 atgggcgact atctgatcct gaagctgcag ggacctatgc aggcctgggg agagcacagc 60 tttgagggaa cccgcccatc cggcaatttc cccacacggt ctgccctgct gggactgctg 120 ggagcatgtc tgggcatccg gcggaacgag tacgagaggc tgcagcagct ggccgatagc 180 gtgcagtttg ccgtgagaaa ggacgccagg cagacccaga cagagtgggg cgagccaaag 240 aagctgccca tggtgaagat gaccgattac cacacagtga aggacgccag acagtcttat 300 atcggcctga agagccacga gaccatccag acatggaggg agtacctgct ggacgccgag 360 tattctgtgg ccatctggga gaatgaggat gcagccgtga gcctggacga gctggagacc 420 gccgtgagga agcccgtgtt caccccatac ctgggcaggc gcagctgccc actggcacag 480 cctctgttcg gcaagcgcct gaccgcagag tccccaaacc aggccctgca ggcagtggag 540 ccttccggcg gcgtgatcta ttctgagcag ccctctgatc gcagcatgag gctgagggac 600 ctgcctatgg caggacagcc aaggcagttc gcatctcgga ccgtgtacat ccacggaggc 660 gatcacgtgt ccgagtaa 678 <210> 95 <211> 609 <212> DNA <213> Geothermobacter sp. EPR-M <220> <221> misc_feature <222> (1)..(609) <223> Cas6 <400> 95 atgtacctga gcaaagtgat ggtgaccgga gcagcatgta ggaacccata tgagatccac 60 cggtccctgt ggcagctgtt ccccgaggac cccgacgcac ggagagatta tctgttccgg 120 gtggagagag caggcaggca gcaggcagag atcctgctgc agagccagcg gaagccaagc 180 gactccgagc tgcgcaaggt gcggctgctg gcaaccagag gataccagcc aaggctgcag 240 cagggacagc ggctgagatt tgccctgctg gccaaccctg tgaagacaat caatgatgag 300 aggggccgcc tgaacgcaaa gggacaggtg aagaagtgca gggtgccact gatcagggag 360 gaggagtgga gaagctggct ggagcacaag ctgatcggat gtgcagagct ggagaccctg 420 gtggcagaga acaggctgcc catcaacttc agaaagccaa aggagaagag ggtgggcaag 480 atccagcccg tgagcttcca gggcatcctg agagtgtcct ctccagaggc catgatgcag 540 gccatctcta ccggcatcgg accagcaaag gccttcggct gcggactgct gagcatcgca 600 ccagcataa 609 <210> 96 <211> 503 <212> PRT <213> Geothermobacter sp. EPR-M <220> <221> misc_feature <222> (1)..(503) <223> Cas8 <400> 96 Met Asn Leu Leu Thr Asp Pro Trp Ile Pro Ala Arg Pro Gln Gly Arg 1 5 10 15 Ala Thr Ala Gln Lys Leu Thr Leu Arg Gln Leu Leu Cys Glu Asp Glu 20 25 30 Arg Trp Glu Leu Arg Leu Pro Arg Asp Asp Met Glu Met Ala Thr Leu 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Cys Leu Thr Gln Ala Leu Ala Thr Pro Ala Asp Leu 50 55 60 Pro Glu Leu Lys Arg Arg Ile Met Lys Pro Leu Gly Gln Gln Glu Phe 65 70 75 80 Asn Ala Ala Tyr Thr Pro Phe Ala Asp Trp Phe Arg Leu Asp His Pro 85 90 95 Gln Tyr Pro Phe Met Gln Val Arg Gly Val Lys Ala Lys Glu Pro Thr 100 105 110 Pro Met Asp Lys Leu Leu Ala Gly Leu Thr Gly Ala Thr Asn Ser Cys 115 120 125 Phe Val Asn Gln Ser Gly Leu Gly Glu Gly Leu Cys Pro Ala Cys Ala 130 135 140 Ala Ile Ala Leu Phe Asn Gln Ala Met Asn Val Pro Gly Phe Gly Gly 145 150 155 160 Gly Phe Lys Ala Ser Leu Arg Gly Ser Ala Pro Val Thr Thr Leu Val 165 170 175 Gln Gly Glu His Leu Arg Gln Thr Ile Trp Leu Asn Val Leu Ser Thr 180 185 190 Glu Ser Val Glu Ala Leu Leu Pro Trp His Arg Gln Thr Glu Asp Gln 195 200 205 Lys Pro Thr Trp Ile Ala Pro Ile Lys Ser Glu Thr Phe Ser Ser Arg 210 215 220 Ser Ile Gly Phe Leu Arg Gly Leu Phe Trp Gln Pro Ala His Ile Glu 225 230 235 240 Leu Leu Pro Ala Glu Ser Val Gly Asp Cys Ser Cys Cys Gly Gln Gly 245 250 255 Asp Thr Glu Val Tyr Arg Gly Phe Asn Lys Ala Lys Phe Asn Tyr Thr 260 265 270 Val Thr Gly Ile Trp Pro His Pro His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Val 275 280 285 Lys Lys Gly Glu Gln Glu Glu Lys Phe Val Ser Phe Thr Thr Glu Ala 290 295 300 Pro Ser Trp Thr Gln Leu Gly Arg Phe Val Ala Arg Arg Ala Phe Val 305 310 315 320 Asp Ala Lys Thr Pro Gly Gln Glu Pro Ala Ala Val Ile Arg Gln Ala 325 330 335 Gln Lys Leu Gly Val Arg Leu Thr Leu Cys Ile Gly Gly Tyr Arg Asn 340 345 350 Asn Gln Ala Ser Ile Leu Glu Arg Arg His Glu Leu Leu Pro Leu Gly 355 360 365 Glu Gly Trp Asn Ser Lys Pro Gln Ile Val Gln Asp Val Val Asp Thr 370 375 380 Ala Ile Gly Tyr Arg Asp Ala Leu Asn Lys Ser Leu Tyr Ser Phe Phe 385 390 395 400 Lys Gly Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Leu Pro Ile His Glu Phe Gly 405 410 415 Lys Ala Gln Phe Tyr Arg Arg Thr Glu Glu Ala Ile Leu Asp Ser Leu 420 425 430 Ala Arg Leu Asp Phe Ser Asn Pro Arg Pro Val Leu Leu Ala Leu Gln 435 440 445 Lys Lys Leu Asp Thr Glu Val Arg Gly Leu Phe Glu Glu Ala Val Arg 450 455 460 Pro Tyr Leu Asn Asp Pro Asn Leu Ile His Thr Met Ala Val Ser Arg 465 470 475 480 Arg Thr Leu Tyr Lys Asn Leu Asn Val Leu Lys Pro Gln Gln Glu Gly 485 490 495 Gly Val Asp Gly Lys Arg Asn 500 <210> 97 <211> 159 <212> PRT <213> Geothermobacter sp. EPR-M <220> <221> misc_feature <222> (1)..(159) <223> Cse2 <400> 97 Met Ala Lys Glu Thr Asp Phe Met Asp Leu Tyr Gln Ala Trp Gln Arg 1 5 10 15 Leu Pro Asn Gly Pro Lys Ala Glu Leu Lys Arg Cys Gly Asp Leu Gly 20 25 30 Asp Leu Leu Glu Thr Ser Ala Phe Tyr Arg Leu Leu Ala Gly Arg Gly 35 40 45 Glu Ala Glu Trp Gln Lys Lys Ala Tyr Gln Arg Met Ile Phe Cys Leu 50 55 60 Pro Cys Ile Asn His Thr Glu Gln Lys Ile Pro Leu Gly Ala Ala Leu 65 70 75 80 Ala Arg Ser Arg Lys Gly Ser Arg Ser Ala Val Ser Glu Ser Arg Met 85 90 95 Ile Gln Val Val Arg Ser Glu Ala Pro Asn Asp Met Val Gln Leu Arg 100 105 110 Arg Ile Leu Lys His Ala Glu Pro Thr Val Asn Trp Pro Leu Met Ala 115 120 125 Lys Gln Leu Trp Tyr Trp Asp Leu Asn Glu Arg Ser Lys Arg Ser Leu 130 135 140 Leu Glu Asp Phe Phe Leu Asn His Thr Asp Thr Ser Lys Glu Gly 145 150 155 <210> 98 <211> 364 <212> PRT <213> Geothermobacter sp. EPR-M <220> <221> misc_feature <222> (1)..(364) <223> Cas7 <400> 98 Met Gln Asn Phe Ile Asn Tyr His Val Leu Ile Ser His Ser Pro Ser 1 5 10 15 Cys Leu Asn Arg Asp Asp Met Asn Met Gln Lys Ser Ala Ile Phe Gly 20 25 30 Gly Val Arg Arg Val Arg Ile Ser Ser Gln Ser Leu Lys Arg Ala Met 35 40 45 Arg Lys Ser Asp Tyr Tyr Ala Gln His Leu Gly Glu Ala Ser Ile Arg 50 55 60 Thr Lys His Leu Ser Gly Leu Arg Asp Arg Leu His Glu Arg Leu Ala 65 70 75 80 Gly Arg Phe Ser Pro Glu Val Ile Asp Lys Thr Ile Lys Leu Leu Ile 85 90 95 Asp Lys Asp Val Ser Val Asp Gly Ile Val Glu Gly Asp Ala Val Ala 100 105 110 Pro Trp Ala Val Glu Glu Phe Ala Trp Phe Cys Glu Arg Val Met Asn 115 120 125 Ala Gln Ala Glu Gly Leu Glu Asp Lys Ala Leu Thr Lys Gln Leu Lys 130 135 140 Glu Ser Ile Ala Ala Met Arg Gln Thr Leu Val Gly Gly Leu Asp Ile 145 150 155 160 Ala Leu Ser Gly Arg Met Ala Thr Ser Gly Leu Leu Ser Glu Leu Gly 165 170 175 Lys Val Asp Gly Ala Leu Ala Val Ala His Ala Leu Thr Thr His Thr 180 185 190 Val Asp Ala Asp Ile Asp Trp Phe Thr Ala Val Asp Asp Leu Gln Glu 195 200 205 Leu Gly Ser Gly His Leu Asp Thr Gln Glu Phe Ser Ser Gly Val Phe 210 215 220 Tyr Arg Tyr Ala Ser Leu Asn Ile Gly Gln Leu Gln Glu Asn Leu Gly 225 230 235 240 Gly Ala Pro Arg Glu Gln Ala Leu Glu Ile Ala Thr His Val Leu Gln 245 250 255 Met Leu Ala Thr Val Val Pro Ser Ala Lys Gln Gln Ser Phe Ala Ala 260 265 270 His Asn Leu Ala Asp Leu Ala Leu Val Ser Phe Ala Asp Ile Pro Val 275 280 285 Ser Leu Ala Asn Ala Phe Glu Lys Pro Val Gln Gln Lys Asn Gly Ser 290 295 300 Gly Phe Arg Glu Pro Ser Ile Ala Ala Leu His Asp Tyr Trp Gln Lys 305 310 315 320 Val His Ile Gly Tyr Gly Leu Glu Glu Arg Cys Gly Gln Phe Val Leu 325 330 335 Asn Lys Val Glu Thr Pro Ala Gly Ile Ala Ala Lys Glu Ser Leu Glu 340 345 350 Asp Leu Lys Ser Trp Val Arg Asn Asn Gly Glu Gly 355 360 <210> 99 <211> 225 <212> PRT <213> Geothermobacter sp. EPR-M <220> <221> misc_feature <222> (1)..(225) <223> Cas5 <400> 99 Met Gly Asp Tyr Leu Ile Leu Lys Leu Gln Gly Pro Met Gln Ala Trp 1 5 10 15 Gly Glu His Ser Phe Glu Gly Thr Arg Pro Ser Gly Asn Phe Pro Thr 20 25 30 Arg Ser Ala Leu Leu Gly Leu Leu Gly Ala Cys Leu Gly Ile Arg Arg 35 40 45 Asn Glu Tyr Glu Arg Leu Gln Gln Leu Ala Asp Ser Val Gln Phe Ala 50 55 60 Val Arg Lys Asp Ala Arg Gln Thr Gln Thr Glu Trp Gly Glu Pro Lys 65 70 75 80 Lys Leu Pro Met Val Lys Met Thr Asp Tyr His Thr Val Lys Asp Ala 85 90 95 Arg Gln Ser Tyr Ile Gly Leu Lys Ser His Glu Thr Ile Gln Thr Trp 100 105 110 Arg Glu Tyr Leu Leu Asp Ala Glu Tyr Ser Val Ala Ile Trp Glu Asn 115 120 125 Glu Asp Ala Ala Val Ser Leu Asp Glu Leu Glu Thr Ala Val Arg Lys 130 135 140 Pro Val Phe Thr Pro Tyr Leu Gly Arg Arg Ser Cys Pro Leu Ala Gln 145 150 155 160 Pro Leu Phe Gly Lys Arg Leu Thr Ala Glu Ser Pro Asn Gln Ala Leu 165 170 175 Gln Ala Val Glu Pro Ser Gly Gly Val Ile Tyr Ser Glu Gln Pro Ser 180 185 190 Asp Arg Ser Met Arg Leu Arg Asp Leu Pro Met Ala Gly Gln Pro Arg 195 200 205 Gln Phe Ala Ser Arg Thr Val Tyr Ile His Gly Gly Asp His Val Ser 210 215 220 Glu 225 <210> 100 <211> 202 <212> PRT <213> Geothermobacter sp. EPR-M <220> <221> misc_feature <222> (1)..(202) <223> Cas6 <400> 100 Met Tyr Leu Ser Lys Val Met Val Thr Gly Ala Ala Cys Arg Asn Pro 1 5 10 15 Tyr Glu Ile His Arg Ser Leu Trp Gln Leu Phe Pro Glu Asp Pro Asp 20 25 30 Ala Arg Arg Asp Tyr Leu Phe Arg Val Glu Arg Ala Gly Arg Gln Gln 35 40 45 Ala Glu Ile Leu Leu Gln Ser Gln Arg Lys Pro Ser Asp Ser Glu Leu 50 55 60 Arg Lys Val Arg Leu Leu Ala Thr Arg Gly Tyr Gln Pro Arg Leu Gln 65 70 75 80 Gln Gly Gln Arg Leu Arg Phe Ala Leu Leu Ala Asn Pro Val Lys Thr 85 90 95 Ile Asn Asp Glu Arg Gly Arg Leu Asn Ala Lys Gly Gln Val Lys Lys 100 105 110 Cys Arg Val Pro Leu Ile Arg Glu Glu Glu Trp Arg Ser Trp Leu Glu 115 120 125 His Lys Leu Ile Gly Cys Ala Glu Leu Glu Thr Leu Val Ala Glu Asn 130 135 140 Arg Leu Pro Ile Asn Phe Arg Lys Pro Lys Glu Lys Arg Val Gly Lys 145 150 155 160 Ile Gln Pro Val Ser Phe Gln Gly Ile Leu Arg Val Ser Ser Pro Glu 165 170 175 Ala Met Met Gln Ala Ile Ser Thr Gly Ile Gly Pro Ala Lys Ala Phe 180 185 190 Gly Cys Gly Leu Leu Ser Ile Ala Pro Ala 195 200 <210> 101 <211> 90 <212> DNA <213> Geothermobacter sp. EPR-M <220> <221> misc_feature <222> (1)..(90) <223> CRISPR <400> 101 ctgttccccg cacccgcggg gatgaaccgg tcatctattt ttaatggacg atatttttca 60 actgttcccc gcacccgcgg ggatgaaccg 90 <210> 102 <211> 1509 <212> DNA <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1509) <223> Cas8 <400> 102 atgaatctgc ttgaagaccc ttggattccc gtgcgtgccg atggcggtac gggcgctttc 60 caactgctga cctatcggca gctactttgc gaacccggca actggcaggt gagcttgccg 120 cgtgacgatc tggagctggc ctgtgtgcaa ttgctggtgt gcatgactca ggtgatgttc 180 ttgccggaaa acgacgctgt ttggcggaag cggttgactg aagctttgac gcgtgaagag 240 ttcaccgccg gcacagaacc gtgcctggat tggttcgatc tcgaccaccc gacccagcct 300 ttcatgcaat cacgaggagt gagggccgcc gaggacacgc ccattcagaa gctgctgatt 360 ggcctgccgg aaggaaacaa ccacgctttc ttcaacgagg cgggcgaagt gcgccaccta 420 tcggtaacag tggcagcaat tgccctgttc aatcaggcta ctaattgccc cagtttcggc 480 ggcggcttca agggcagcct acgtggaggc gcgccaatca ccacactggt gaatggcgag 540 aatttgcgcg aaaccgtctg gtgtaatgta ctcacacgct cccgtttggc tgcgcgccag 600 atcgccatgc ccggattgga tcgggaccgt ccaacctggg tcgagcctat ccaggaaaaa 660 gccaccattc cctggaacac catcggtttg gcgcgaggct tgttttggca gccggcgcgg 720 gtggaactgg tgaggtccat ggccgctgca ccttgcgatg tgatgggcgg cgcgcccaca 780 ttgggatacg tgggatttcg caaggagaaa ttcaacttta ccgtggaggg agtgtggccc 840 caccctcatg gcgcaataac catgaccttg aaaaaaggcg cgcttgaaca aaagttcgcc 900 agcttcacga ccaccgcgcc ggcatggacc cagctctccg aattcgtcgt gcccaaaggc 960 gtcaatgatc ccggagccaa agagggctcc attcccgcag gaccggttac acaagccagc 1020 gagctaggcg aaagcggttt acacctgctc gttggcggct atcgcaccaa tcaagcttcc 1080 gtgttggaac ggcgccacga aatgatgagc ctggcccgag gctggcggga tgacaaaagc 1140 cgcctgccca aattggtcga aatgggcaaa gaggcaaaaa aagccttgcg cggcaagctc 1200 tatttcgccg ttcagggcaa taaagacaaa gggcttaaag gtattggcgc ggccatccac 1260 gaaaccgccg agaaactgtt ttacgcccga accgaaagtc tgatccacga aaccttttcc 1320 aatgaactca cgttcaagca gtgggccacc gcccgcaagg cttttgtcca ggaattggcc 1380 ggccattgcc gcgcaatttt tgaggagctg actgcacctt atgcgatgaa accggagttg 1440 attccggtta tcgcctgggc gcggcgcagc ctgaatttcg atcttaccaa gctgatggag 1500 gatgcatga 1509 <210> 103 <211> 456 <212> DNA <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(456) <223> Cse2 <400> 103 atgactgccg aattgccgga ttttgtcgcg ctgaaaatgc actacgacga cgagagcttt 60 ccgaccggcg cacgtgccga gctgcgccgt gctgccgaac cggatgatgt ggcgttgacc 120 ccggcgctct accgcttatt ccccggcgag cggccgagcg accgccactt acgtgtcgcc 180 tatctcctgc cctatgccaa acacgcggct aaagccaagt cgttgggtgc gcaactggcg 240 gaagccaagg tggcggaagc acgggttctg caagtggccc gcgctcatga accgctcgat 300 gtggtccagt tacgtcgcct cttgatgcag gttgaagccg cagtggactg gtcggcgttc 360 ggcccgatgg tgtggttttg gaacgaacga gccaaacgtc agctcatcga ggatttctat 420 atcgcccgtt tttcccccgt cacaggagct aaataa 456 <210> 104 <211> 1137 <212> DNA <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1137) <223> Cas7 <400> 104 atgaccaaga agaacttcat caacttccat gtactcattt cccacagccc ctcctgtctc 60 aaccgggacg atatgaacat gcagaaaacc gccgtatttg gtggcgtcaa ccgggtgcgg 120 atttccagcc aatctctgaa gcgggcgata cgcaagagcg attactacca agccaatttg 180 ggcgcaccat cggtgcgcac ccgcgatttg aacaaactca aagcgcgttt caccgaactg 240 ctcaaagacc gctttgacgc cgaattgatt aaccgcgcgc tggagtggat ttccggcaag 300 gaaggtatcg ccgaaggcgt aacggccgac gccgttgcgc cctggtcggt ggatgaagta 360 acgcacttct gcgaaatcat tagcgccgac gaccagcaag atatcaagaa actggaaaag 420 cagattgaaa aagaggcgcg tcctttccgg gcggctatga gcaacaccgt ggacatcgcc 480 ttgtccggtc gtatggcgac cagtggattg atgagcaacc tgcccgtgga tggcgcgctc 540 gccgtcgctc acgccattac cacccatgcc gtcgagccgc aggacgtgga ctggttcacc 600 gccgtcgacg atttgaccca ggacgcgggc gatacgggag cgggacatct ggatacccag 660 cagttttcct ccggcgtgtt ctaccgttac gccagtctca acctgagaca actgcaagtg 720 aacctgggat tgatcgacca catcaaggcg gaggaaaccg ccgagtcccg ccaacgtgcg 780 ctggacatcg cccatcatgt attccattta ctggcgacgg tggtgccttc ggccaagcaa 840 cagtctttcg ccgctcacaa cttggcggac ttcgccatcg tcagcttcgc cgaccagccg 900 atttcgttag ccaatgcatt cgaagaaccg gtcagacgcg attacaaact ggcgggattc 960 ctcaaaccat ccattcagtg tttggccaat tactggggac gcatgaatcg cgcctacggt 1020 ctggacgaac aggcgcgcgc tttcgcggtc gatgcgagct tcgagatggg cggcaagcct 1080 cccctggact ccctgaaagc ggtggaagac tggatcgccg aggatggtca ggaataa 1137 <210> 105 <211> 681 <212> DNA <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(681) <223> Cas5 <400> 105 atgccgcgtt atttgattct cctcctggac ggtcccatgc aagcgtgggg cacgcacacg 60 ttcgaagatt ttcgcccttg caatgcgttt ccgactcgca gcggtttgct cggactgcta 120 ggtgcctgcc tggggttgga ccggcgcgat accgaagcat tggagcaatt ggcgatgagc 180 gtcgagttcg ccgtacgcgc cgacagagag gtgttgcggc cggaagcgga agtacccaag 240 gcaaaagccg ctgtaaagct tcccgacttc cacacggtgg aggatgctcg caaggtagac 300 ggttccgcca acaagaaccc ggtggtttct cggcgcgaat acctgttcga tgccgctttc 360 accgtggcga tcggcgcaaa gcccgacggg ccggttacgc tggatgcaat tgccgaagct 420 ttgcggcgcc cgtgttttac gcctgtgctg ggacggcgtt cctgtcccat cgcccggcct 480 ttgctcgatg gcgaggccgt ggaggcgagc gatgcgaagg cggcactggc aaccatcgca 540 cctgtaggtg gcatgatcta taccgaaggc gaattgatct ccgcacaacc cttgcgggtc 600 cgcgacgtac ccatacaggg ccggcaccgg caattcagca ctcgactggt gtatctccat 660 aagggggaaa catgttcctg a 681 <210> 106 <211> 627 <212> DNA <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(627) <223> Cas6 <400> 106 atgttcctga gccgtgtcga gattccttgg gatgcagtcc gcaaccctta cgaaattcat 60 cgccagcttt ggcggctgtt tcccggagag gacaaagaac cccggaagaa tgccgaggaa 120 ggacgccaag ggttcctgtt cagggtggaa aacaatcagc ctggccgccc gctgcgtttg 180 ttgattcagt ctcggcgagc gccagagcct acggctggat tgacgattgt aggtacgcgc 240 gaattccaac cccagccagc tcacgggcag cgcttggcat ttctactcac ctcaaatccg 300 gtcaaaacca ttatcgatgc acagcgagaa accaagtcgg gcaaaagctc cgaaaagtgc 360 cgtgtgccgt tgattcacga atccgaacag cgcgaatggt taaagcgcaa actcatcggt 420 gcgggagaat ttgaaggtgt caatgtggtg cctcacgccc cggtgttctt tcggaaaggc 480 aatcggggcg gcaagatagt catggtgact ttcgaaggcg tattgcgtgt aaacgagcca 540 ggaacgttga tcgcctattt ggaaaacggc atcggccccg ccaaagcctt cggttgcggt 600 ttgctgttag tacggcgctt gggataa 627 <210> 107 <211> 1509 <212> DNA <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1509) <223> Cas8 <400> 107 atgaatctgc tggaggaccc ttggattccc gtgcgggcag atggaggaac cggagcattc 60 cagctgctga catacaggca gctgctgtgc gagccaggaa actggcaggt gagcctgcca 120 agggacgatc tggagctggc ctgcgtgcag ctgctggtgt gcatgaccca ggtcatgttt 180 ctgcctgaga atgacgccgt gtggaggaag cgcctgaccg aggccctgac aagagaggag 240 ttcacagccg gcaccgagcc atgtctggac tggtttgacc tggatcaccc cacccagcct 300 ttcatgcagt ctaggggcgt gcgcgcagca gaggatacac caatccagaa gctgctgatc 360 ggcctgcctg agggcaacaa tcacgccttc tttaatgagg caggagaggt gcggcacctg 420 agcgtgaccg tggccgccat cgccctgttc aaccaggcca caaattgccc ttcctttggc 480 ggaggcttca agggctctct gaggggagga gcaccaatca ccacactggt caacggcgag 540 aatctgcggg agaccgtgtg gtgtaacgtg ctgacacggt ccagactggc agcaaggcag 600 atcgcaatgc caggcctgga cagggatagg cctacctggg tggagccaat ccaggagaag 660 gccaccatcc cctggaatac aatcggactg gcaaggggac tgttttggca gcctgcccgg 720 gtggagctgg tgagaagcat ggcagcagca ccttgcgacg tgatgggagg agcaccaacc 780 ctgggatatg tgggcttcag aaaggagaag tttaacttca cagtggaggg cgtgtggcca 840 cacccacacg gagccatcac aatgaccctg aagaagggcg ccctggagca gaagtttgcc 900 agcttcacca caaccgcacc tgcatggacc cagctgtccg agttcgtggt gccaaaggga 960 gtgaacgatc caggagcaaa ggagggctcc atcccagcag gaccagtgac ccaggcctcc 1020 gagctgggag agtctggcct gcacctgctg gtgggaggat acaggacaaa tcaggccagc 1080 gtgctggagc ggagacacga gatgatgtcc ctggcccggg gctggagaga cgataagagc 1140 cggctgccaa agctggtgga gatgggcaag gaggccaaga aggccctgag gggcaagctg 1200 tattttgccg tgcagggcaa caaggacaag ggcctgaagg gaatcggagc agcaatccac 1260 gagaccgccg agaagctgtt ctacgccaga acagagtctc tgatccacga gaccttcagc 1320 aatgagctga ccttcaagca gtgggccaca gccagaaagg cctttgtgca ggagctggca 1380 ggacactgta gggcaatctt cgaggagctg accgccccct acgccatgaa gcctgagctg 1440 atcccagtga tcgcatgggc aaggcgcagc ctgaacttcg acctgacaaa gctgatggag 1500 gatgcctaa 1509 <210> 108 <211> 456 <212> DNA <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(456) <223> Cse2 <400> 108 atgacagcag agctgccaga ttttgtggcc ctgaagatgc actatgacga tgagtccttc 60 cccaccggag caagggcaga gctgaggcgc gcagccgagc ctgacgatgt ggccctgaca 120 ccagccctgt acaggctgtt tcctggagag aggccatctg acaggcacct gcgcgtggca 180 tacctgctgc cctatgccaa gcacgccgcc aaggccaaga gcctgggagc acagctggca 240 gaggcaaagg tggccgaggc ccgggtgctg caggtggcca gagcacacga gcccctggac 300 gtggtgcagc tgcggagact gctgatgcag gtggaggcag cagtggattg gtccgccttt 360 ggccctatgg tgtggttctg gaacgagcgg gccaagagac agctgatcga ggacttttat 420 atcgcccgct tctctccagt gaccggagca aagtaa 456 <210> 109 <211> 1137 <212> DNA <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1137) <223> Cas7 <400> 109 atgaccaaga agaactttat caatttccac gtgctgatca gccactcccc ttcttgcctg 60 aacagagacg atatgaatat gcagaagaca gccgtgttcg gcggcgtgaa tcgggtgaga 120 atcagctccc agtccctgaa gcgggccatc agaaagtctg actactatca ggccaacctg 180 ggagcaccaa gcgtgaggac ccgcgatctg aataagctga aggcccggtt tacagagctg 240 ctgaaggaca gattcgatgc cgagctgatc aacagggccc tggagtggat ctccggcaag 300 gagggcatcg cagagggagt gaccgcagac gcagtggccc catggtctgt ggatgaggtg 360 acacactttt gtgagatcat cagcgccgac gatcagcagg acatcaagaa gctggagaag 420 cagatcgaga aggaggcaag gcccttccgc gcagcaatga gcaacaccgt ggacatcgcc 480 ctgtccggca ggatggccac atctggcctg atgagcaatc tgccagtgga tggcgccctg 540 gcagtggcac acgcaatcac cacacacgcc gtggagcctc aggacgtgga ttggttcacc 600 gccgtggacg atctgacaca ggacgcaggc gataccggag caggacacct ggatacccag 660 cagttttcta gcggcgtgtt ctacagatat gcctccctga acctgcgcca gctgcaagtg 720 aatctgggcc tgatcgacca catcaaggca gaggagaccg cagagtctcg gcagagagcc 780 ctggatatcg cccaccacgt gtttcacctg ctggccacag tggtgccttc cgccaagcag 840 cagtctttcg ccgcccacaa cctggccgac tttgccatcg tgagcttcgc cgatcagcca 900 atctccctgg ccaatgcctt tgaggagccc gtgcggagag actacaagct ggccggcttc 960 ctgaagccat ccatccagtg cctggccaac tactggggcc ggatgaatag agcatatggc 1020 ctggacgagc aggcaagggc ctttgccgtg gatgccagct tcgagatggg cggcaagccc 1080 cctctggatt ccctgaaggc cgtggaggac tggatcgccg aggatggaca ggagtaa 1137 <210> 110 <211> 681 <212> DNA <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(681) <223> Cas5 <400> 110 atgcctcggt acctgatcct gctgctggac ggaccaatgc aggcctgggg aacacacacc 60 tttgaggatt tcagaccctg caacgccttc cctaccagga gcggcctgct gggactgctg 120 ggagcctgtc tgggcctgga caggcgcgat acagaggccc tggagcagct ggccatgtcc 180 gtggagtttg ccgtgagggc agacagggag gtgctgaggc cagaggcaga ggtgccaaag 240 gcaaaggcag cagtgaagct gccagatttc cacaccgtgg aggacgcccg caaggtggat 300 ggctctgcca acaagaatcc cgtggtgagc cggagagagt atctgtttga cgcagccttc 360 accgtggcaa tcggagcaaa gcctgacgga ccagtgacac tggatgcaat cgcagaggcc 420 ctgaggcgcc cctgctttac ccctgtgctg ggccggagat cttgtccaat cgccagacca 480 ctgctggacg gagaggcagt ggaggccagc gatgccaagg ccgccctggc aaccatcgca 540 ccagtgggcg gcatgatcta tacagaggga gagctgatct ccgcccagcc actgagggtg 600 cgcgacgtgc ctatccaggg ccggcacaga cagttctcta cccgcctggt gtacctgcac 660 aagggcgaga catgcagcta a 681 <210> 111 <211> 627 <212> DNA <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(627) <223> Cas6 <400> 111 atgtttctgt cccgcgtgga gatcccatgg gacgccgtgc ggaaccccta cgagatccac 60 aggcagctgt ggaggctgtt cccaggagag gataaggagc ctcgcaagaa tgccgaggag 120 ggcaggcagg gcttcctgtt tcgcgtggag aacaatcagc ccggccggcc tctgagactg 180 ctgatccaga gcaggagggc ccctgagcca acagcaggac tgaccatcgt gggcacaaga 240 gagtttcagc cacagcctgc acacggacag aggctggcct tcctgctgac atctaaccct 300 gtgaagacca tcatcgacgc ccagcgcgag accaagagcg gcaagtcctc tgagaagtgc 360 cgggtgccac tgatccacga gtccgagcag agggagtggc tgaagaggaa gctgatcgga 420 gcaggagagt tcgagggagt gaacgtggtg ccacacgcac ccgtgttctt tcggaagggc 480 aatagaggcg gcaagatcgt gatggtgacc tttgagggcg tgctgagggt gaacgagcca 540 ggcacactga tcgcctatct ggagaatggc atcggaccag caaaggcctt cggctgcgga 600 ctgctgctgg tgcggagact gggataa 627 <210> 112 <211> 502 <212> PRT <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(502) <223> Cas8 <400> 112 Met Asn Leu Leu Glu Asp Pro Trp Ile Pro Val Arg Ala Asp Gly Gly 1 5 10 15 Thr Gly Ala Phe Gln Leu Leu Thr Tyr Arg Gln Leu Leu Cys Glu Pro 20 25 30 Gly Asn Trp Gln Val Ser Leu Pro Arg Asp Asp Leu Glu Leu Ala Cys 35 40 45 Val Gln Leu Leu Val Cys Met Thr Gln Val Met Phe Leu Pro Glu Asn 50 55 60 Asp Ala Val Trp Arg Lys Arg Leu Thr Glu Ala Leu Thr Arg Glu Glu 65 70 75 80 Phe Thr Ala Gly Thr Glu Pro Cys Leu Asp Trp Phe Asp Leu Asp His 85 90 95 Pro Thr Gln Pro Phe Met Gln Ser Arg Gly Val Arg Ala Ala Glu Asp 100 105 110 Thr Pro Ile Gln Lys Leu Leu Ile Gly Leu Pro Glu Gly Asn Asn His 115 120 125 Ala Phe Phe Asn Glu Ala Gly Glu Val Arg His Leu Ser Val Thr Val 130 135 140 Ala Ala Ile Ala Leu Phe Asn Gln Ala Thr Asn Cys Pro Ser Phe Gly 145 150 155 160 Gly Gly Phe Lys Gly Ser Leu Arg Gly Gly Ala Pro Ile Thr Thr Leu 165 170 175 Val Asn Gly Glu Asn Leu Arg Glu Thr Val Trp Cys Asn Val Leu Thr 180 185 190 Arg Ser Arg Leu Ala Ala Arg Gln Ile Ala Met Pro Gly Leu Asp Arg 195 200 205 Asp Arg Pro Thr Trp Val Glu Pro Ile Gln Glu Lys Ala Thr Ile Pro 210 215 220 Trp Asn Thr Ile Gly Leu Ala Arg Gly Leu Phe Trp Gln Pro Ala Arg 225 230 235 240 Val Glu Leu Val Arg Ser Met Ala Ala Ala Pro Cys Asp Val Met Gly 245 250 255 Gly Ala Pro Thr Leu Gly Tyr Val Gly Phe Arg Lys Glu Lys Phe Asn 260 265 270 Phe Thr Val Glu Gly Val Trp Pro His Pro His Gly Ala Ile Thr Met 275 280 285 Thr Leu Lys Lys Gly Ala Leu Glu Gln Lys Phe Ala Ser Phe Thr Thr 290 295 300 Thr Ala Pro Ala Trp Thr Gln Leu Ser Glu Phe Val Val Pro Lys Gly 305 310 315 320 Val Asn Asp Pro Gly Ala Lys Glu Gly Ser Ile Pro Ala Gly Pro Val 325 330 335 Thr Gln Ala Ser Glu Leu Gly Glu Ser Gly Leu His Leu Leu Val Gly 340 345 350 Gly Tyr Arg Thr Asn Gln Ala Ser Val Leu Glu Arg Arg His Glu Met 355 360 365 Met Ser Leu Ala Arg Gly Trp Arg Asp Asp Lys Ser Arg Leu Pro Lys 370 375 380 Leu Val Glu Met Gly Lys Glu Ala Lys Lys Ala Leu Arg Gly Lys Leu 385 390 395 400 Tyr Phe Ala Val Gln Gly Asn Lys Asp Lys Gly Leu Lys Gly Ile Gly 405 410 415 Ala Ala Ile His Glu Thr Ala Glu Lys Leu Phe Tyr Ala Arg Thr Glu 420 425 430 Ser Leu Ile His Glu Thr Phe Ser Asn Glu Leu Thr Phe Lys Gln Trp 435 440 445 Ala Thr Ala Arg Lys Ala Phe Val Gln Glu Leu Ala Gly His Cys Arg 450 455 460 Ala Ile Phe Glu Glu Leu Thr Ala Pro Tyr Ala Met Lys Pro Glu Leu 465 470 475 480 Ile Pro Val Ile Ala Trp Ala Arg Arg Ser Leu Asn Phe Asp Leu Thr 485 490 495 Lys Leu Met Glu Asp Ala 500 <210> 113 <211> 151 <212> PRT <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(151) <223> Cse2 <400> 113 Met Thr Ala Glu Leu Pro Asp Phe Val Ala Leu Lys Met His Tyr Asp 1 5 10 15 Asp Glu Ser Phe Pro Thr Gly Ala Arg Ala Glu Leu Arg Arg Ala Ala 20 25 30 Glu Pro Asp Asp Val Ala Leu Thr Pro Ala Leu Tyr Arg Leu Phe Pro 35 40 45 Gly Glu Arg Pro Ser Asp Arg His Leu Arg Val Ala Tyr Leu Leu Pro 50 55 60 Tyr Ala Lys His Ala Ala Lys Ala Lys Ser Leu Gly Ala Gln Leu Ala 65 70 75 80 Glu Ala Lys Val Ala Glu Ala Arg Val Leu Gln Val Ala Arg Ala His 85 90 95 Glu Pro Leu Asp Val Val Gln Leu Arg Arg Leu Leu Met Gln Val Glu 100 105 110 Ala Ala Val Asp Trp Ser Ala Phe Gly Pro Met Val Trp Phe Trp Asn 115 120 125 Glu Arg Ala Lys Arg Gln Leu Ile Glu Asp Phe Tyr Ile Ala Arg Phe 130 135 140 Ser Pro Val Thr Gly Ala Lys 145 150 <210> 114 <211> 378 <212> PRT <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(378) <223> Cas7 <400> 114 Met Thr Lys Lys Asn Phe Ile Asn Phe His Val Leu Ile Ser His Ser 1 5 10 15 Pro Ser Cys Leu Asn Arg Asp Asp Met Asn Met Gln Lys Thr Ala Val 20 25 30 Phe Gly Gly Val Asn Arg Val Arg Ile Ser Ser Gln Ser Leu Lys Arg 35 40 45 Ala Ile Arg Lys Ser Asp Tyr Tyr Gln Ala Asn Leu Gly Ala Pro Ser 50 55 60 Val Arg Thr Arg Asp Leu Asn Lys Leu Lys Ala Arg Phe Thr Glu Leu 65 70 75 80 Leu Lys Asp Arg Phe Asp Ala Glu Leu Ile Asn Arg Ala Leu Glu Trp 85 90 95 Ile Ser Gly Lys Glu Gly Ile Ala Glu Gly Val Thr Ala Asp Ala Val 100 105 110 Ala Pro Trp Ser Val Asp Glu Val Thr His Phe Cys Glu Ile Ile Ser 115 120 125 Ala Asp Asp Gln Gln Asp Ile Lys Lys Leu Glu Lys Gln Ile Glu Lys 130 135 140 Glu Ala Arg Pro Phe Arg Ala Ala Met Ser Asn Thr Val Asp Ile Ala 145 150 155 160 Leu Ser Gly Arg Met Ala Thr Ser Gly Leu Met Ser Asn Leu Pro Val 165 170 175 Asp Gly Ala Leu Ala Val Ala His Ala Ile Thr Thr His Ala Val Glu 180 185 190 Pro Gln Asp Val Asp Trp Phe Thr Ala Val Asp Asp Leu Thr Gln Asp 195 200 205 Ala Gly Asp Thr Gly Ala Gly His Leu Asp Thr Gln Gln Phe Ser Ser 210 215 220 Gly Val Phe Tyr Arg Tyr Ala Ser Leu Asn Leu Arg Gln Leu Gln Val 225 230 235 240 Asn Leu Gly Leu Ile Asp His Ile Lys Ala Glu Glu Thr Ala Glu Ser 245 250 255 Arg Gln Arg Ala Leu Asp Ile Ala His His Val Phe His Leu Leu Ala 260 265 270 Thr Val Val Pro Ser Ala Lys Gln Gln Ser Phe Ala Ala His Asn Leu 275 280 285 Ala Asp Phe Ala Ile Val Ser Phe Ala Asp Gln Pro Ile Ser Leu Ala 290 295 300 Asn Ala Phe Glu Glu Pro Val Arg Arg Asp Tyr Lys Leu Ala Gly Phe 305 310 315 320 Leu Lys Pro Ser Ile Gln Cys Leu Ala Asn Tyr Trp Gly Arg Met Asn 325 330 335 Arg Ala Tyr Gly Leu Asp Glu Gln Ala Arg Ala Phe Ala Val Asp Ala 340 345 350 Ser Phe Glu Met Gly Gly Lys Pro Pro Leu Asp Ser Leu Lys Ala Val 355 360 365 Glu Asp Trp Ile Ala Glu Asp Gly Gln Glu 370 375 <210> 115 <211> 226 <212> PRT <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(226) <223> Cas5 <400> 115 Met Pro Arg Tyr Leu Ile Leu Leu Leu Asp Gly Pro Met Gln Ala Trp 1 5 10 15 Gly Thr His Thr Phe Glu Asp Phe Arg Pro Cys Asn Ala Phe Pro Thr 20 25 30 Arg Ser Gly Leu Leu Gly Leu Leu Gly Ala Cys Leu Gly Leu Asp Arg 35 40 45 Arg Asp Thr Glu Ala Leu Glu Gln Leu Ala Met Ser Val Glu Phe Ala 50 55 60 Val Arg Ala Asp Arg Glu Val Leu Arg Pro Glu Ala Glu Val Pro Lys 65 70 75 80 Ala Lys Ala Ala Val Lys Leu Pro Asp Phe His Thr Val Glu Asp Ala 85 90 95 Arg Lys Val Asp Gly Ser Ala Asn Lys Asn Pro Val Val Ser Arg Arg 100 105 110 Glu Tyr Leu Phe Asp Ala Ala Phe Thr Val Ala Ile Gly Ala Lys Pro 115 120 125 Asp Gly Pro Val Thr Leu Asp Ala Ile Ala Glu Ala Leu Arg Arg Pro 130 135 140 Cys Phe Thr Pro Val Leu Gly Arg Arg Ser Cys Pro Ile Ala Arg Pro 145 150 155 160 Leu Leu Asp Gly Glu Ala Val Glu Ala Ser Asp Ala Lys Ala Ala Leu 165 170 175 Ala Thr Ile Ala Pro Val Gly Gly Met Ile Tyr Thr Glu Gly Glu Leu 180 185 190 Ile Ser Ala Gln Pro Leu Arg Val Arg Asp Val Pro Ile Gln Gly Arg 195 200 205 His Arg Gln Phe Ser Thr Arg Leu Val Tyr Leu His Lys Gly Glu Thr 210 215 220 Cys Ser 225 <210> 116 <211> 208 <212> PRT <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(208) <223> Cas6 <400> 116 Met Phe Leu Ser Arg Val Glu Ile Pro Trp Asp Ala Val Arg Asn Pro 1 5 10 15 Tyr Glu Ile His Arg Gln Leu Trp Arg Leu Phe Pro Gly Glu Asp Lys 20 25 30 Glu Pro Arg Lys Asn Ala Glu Glu Gly Arg Gln Gly Phe Leu Phe Arg 35 40 45 Val Glu Asn Asn Gln Pro Gly Arg Pro Leu Arg Leu Leu Ile Gln Ser 50 55 60 Arg Arg Ala Pro Glu Pro Thr Ala Gly Leu Thr Ile Val Gly Thr Arg 65 70 75 80 Glu Phe Gln Pro Gln Pro Ala His Gly Gln Arg Leu Ala Phe Leu Leu 85 90 95 Thr Ser Asn Pro Val Lys Thr Ile Ile Asp Ala Gln Arg Glu Thr Lys 100 105 110 Ser Gly Lys Ser Ser Glu Lys Cys Arg Val Pro Leu Ile His Glu Ser 115 120 125 Glu Gln Arg Glu Trp Leu Lys Arg Lys Leu Ile Gly Ala Gly Glu Phe 130 135 140 Glu Gly Val Asn Val Val Pro His Ala Pro Val Phe Phe Arg Lys Gly 145 150 155 160 Asn Arg Gly Gly Lys Ile Val Met Val Thr Phe Glu Gly Val Leu Arg 165 170 175 Val Asn Glu Pro Gly Thr Leu Ile Ala Tyr Leu Glu Asn Gly Ile Gly 180 185 190 Pro Ala Lys Ala Phe Gly Cys Gly Leu Leu Leu Val Arg Arg Leu Gly 195 200 205 <210> 117 <211> 90 <212> DNA <213> Methylocaldum sp. 14B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(90) <223> CRISPR <400> 117 ctgttcccca cgtacgtggg gatgaaccga cggcgtaatg gtaattgtta gccgacaagt 60 tctgttcccc acgtacgtgg ggatgaaccg 90 <210> 118 <211> 1632 <212> DNA <213> Methanocella arvoryzae MRE50 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1632) <223> Cas8 <400> 118 ttgaaaaatc gagtgaaaag aggtgaacat ttggtctcat ataacttgtt aacagaaccg 60 tggatcacat ccatcgacct gtccggaaac ccggtgcagg agggaatact ggcgactttg 120 aaaaacgcac ataagatcga cagtattttt gatccggctc ctccggtaga attcggaata 180 taccgcctgc tgatcgcttt tataacagat gtcttccagc ctcagggact ggaggatctg 240 gccgatctcc tcgaccgtaa gcggttagac cccacagcgc tggacgaata tgccgccagg 300 tggagagacc ggtttgatct gttcgacgaa aaatacccgt tcttacagca ggcaataacg 360 ggggtaataa agaaacctcc cgagccgatc tccaggttga tgcagcatct gccggcaggc 420 actaacgtct cccattttca ccatggacgc tgggatgaga actccttctc tttcgagcag 480 tgcgccaaag ggctggtgac tatagccccg ttcatgacag ccggcggcgc tggcctgtcc 540 ccaagcatta acggcagccc accttggtac gttcttgtaa aaggcaacaa cctgttcgag 600 actctcctct acaacgtctg ccagatacca atgactgtca aacctatcgg agattcacct 660 gtagcctgga ggaacgacaa acgaatcgat cccggcgatg aacctaaaac cttttccatc 720 gtcgaaggtc tgacctggag gcccaggatc attcagctta tcccgggaaa cggcaagggc 780 acatgcacgt atactggaga aaaagacgtt gacacggtca gccacatgca ttattacccg 840 ggacaaaaat cgcccgagcc aggcctgtgg gtcgatcctc aggtagcata taaaaagact 900 aaggatgcca tcaggccgct caggccggac gagaacaagg cgctgtggcg agacattggg 960 ccgttgatgc tcctgcaaca cggggactac tcgggcaaag acggaaaagt aagcttcgat 1020 cggccggcgg tagttactca gtacaaacag atggtcagca atggtatgat caaacgcagc 1080 gagcctttaa gactggaagt ttatggtatc cgcacagatg gaaaaatgaa gatttacgaa 1140 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S4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(882) <223> Cas5 <400> 206 atgaccacag cacctacacc agagccagca ggaaataccc acccagcaca cggctccgat 60 gagcctaccg tgctgctgct gaggctggca ggaccactgc agtcttgggg cgtgagatcc 120 tcttttaaca ggagggacac aggagcagag ccaaccaagt ccggcgtgat cggactgctg 180 gcagcagcag caggacaccc tagagagcag ccactgggag agctggcaga tctgaccctg 240 ggcatcaggg tggaccagcc aggcacactg ctgagggact accacaccgt gagcgattat 300 aggggcagac ctctgccaca ggcaggcgtg tctgccaagg gcatccagaa gcccaccagc 360 cctgccaagc acacacacgt gaccacaagg ttttacctgc aggatgccgt gttcgtggcc 420 gccctggagg gacctccagg actgctgacc acactggaca gggccgtgcg gaatccagca 480 ttcccactgg ccctgggccg gagaagctgt ccacctaccc agccactgtc cctgggactg 540 cggaccacag atatggagac agccctgaga tctgagcctt ggcaggccag cgcccacacc 600 agagagcagt atgcaaggcg cctgggaagg gagaggggac tgcaccagcc tctgcaccca 660 ggaaccatcg acagggcagc aacaatcgag gaccccaggg gcgacgatag gctgcaggac 720 gcacccgtga gctttgatcc tcaccagagg gccttcacct ccagacaggt gaggcacacc 780 tggctggcca tccccacagg ctttgaccac atcgacgatg accagcctca cggacaggca 840 gatgaccccg atcacgaccc tttcgccctg ctgggatggt aa 882 <210> 207 <211> 813 <212> DNA <213> Streptomyces sp. S4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(813) <223> Cas6 <400> 207 atgacatacc tgtcccggat cagaatcaac ccactgcgga aggacagccg gaagctgctg 60 agcaatccaa gggcagtgca cggagccgtg atgggaggcc tgccaaacca caagcccgat 120 gacagggtgc tgtggcgcat ggaccccgac aatcctcaca ggccacacct gtttgtgctg 180 agccccacac gccctgactg gacccacatc atccaggatt gtggctggcc agatgcagac 240 ggcgatcacg cagccgtgag agactatacc ccactgctga gccagctggc agtgggaaga 300 gagttcgcct ttaggctgac agcctccccc gtgcagaaca ccgccacacc aaccaaggca 360 accccagcac aggcagcaag gctgaccaca cacgccgaga atggcaagcg gatcagaggc 420 ttcagaatgg gacacagaac cgcagcagca cagctggatt ggtttctgac acgcaccgac 480 cggtggggct tcgatatccc tgcaacaaga tctgacccag cagcaccagg catccacgca 540 ccaacacctc caaccgcacc aaggcctaca agcccaccta gaccagatcc caacccacca 600 tacgaggtgc gcatcaccgc aaggcacaga cactcctttc agaagaatgg ccacggcgcc 660 cacgtggtgt ttcggtctgc caccttcgag ggcaggctgc gcatcacaga caccgatcgg 720 ttcaccacat ctctgctgac aggcctgggc cctagcagag cctatggatg cggactgctg 780 acactggcac ctctgccagg acagcagacc taa 813 <210> 208 <211> 580 <212> PRT <213> Streptomyces sp. S4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(580) <223> Cas8 <400> 208 Met Pro Gly Lys Gly Gly Ala Ser Val Asn Leu Leu Ser Asp Gly Trp 1 5 10 15 Leu Ser Ala Val Ser Ala Gly Gly Gly Ser Gly Phe Gly Gly Gly Pro 20 25 30 Gly Ala Gly Pro Ala Glu Phe Gly Val Arg Glu Leu Leu Leu Asn Ala 35 40 45 Glu Lys Phe Ala Asp Ile Val Val Asp Leu Pro Thr Gln Arg Pro Ala 50 55 60 Val Phe Arg Gln Val Leu Leu Pro Leu Val Val Asp Ala Leu Gly Cys 65 70 75 80 Pro Lys Asp Ala Glu Ala Trp Met Asp Met Phe Arg Ala Gly Ala Phe 85 90 95 Ser Pro Glu Gln Arg Gln Val Leu Ala Asp Tyr Leu Asp Lys His Gln 100 105 110 His Leu Phe Gly Leu Leu Asp Pro Val Glu Pro Phe Gly Gln Val Ala 115 120 125 Asp Leu Arg Thr Ala Lys Gly Glu Thr Lys Gly Ser Ala Leu Leu Val 130 135 140 Ala Thr Ala Ala Thr Gly Asn Asn Val Pro Leu Phe Ser Ser Arg Thr 145 150 155 160 Glu Gly Asp Val Leu Glu Leu Thr Pro Ala Glu Ala Ala Arg Trp Leu 165 170 175 Leu His Thr His Cys Trp Asp Thr Ala Ala Ile Lys Thr Gly Ala Val 180 185 190 Gly Asp Pro Met Val Lys Ser Gly Lys Thr Thr Gly Asn Pro Thr Gly 195 200 205 Pro Leu Gly Gln Leu Gly Val Thr Met Pro Val Gly Ser Thr Leu Phe 210 215 220 Glu Thr Leu Leu Leu Asn Ile Pro Tyr Gly Gln Ala Gly Leu Ser Asp 225 230 235 240 Asp Val Pro Gln Trp Arg Arg Arg Ser Thr Gln Gly Asp Val Lys Asp 245 250 255 Thr Leu Ser Cys Ala Thr Pro Val Trp Gln Ser Arg Pro Ala Arg Gly 260 265 270 Leu Leu Glu Ala Trp Thr Trp Gln Ala Arg Arg Ile Arg Leu Ile Ser 275 280 285 Gln Asp Thr Asp Arg Gly Pro Arg Ile Thr Arg Val Leu Val Ala Ala 290 295 300 Gly Asp Arg Leu Glu Val Ser Pro Asp Thr Glu Pro His Thr Ala Trp 305 310 315 320 Val Val Asp Ser Pro Ala Gly Arg Arg Gly Lys Ser Pro Ala Arg Ser 325 330 335 Gly Val Lys Ser Ala Arg Pro Arg Arg His Thr Ala Gly Arg Ala Gly 340 345 350 Trp Arg Gly Leu Asp Ala Leu Leu Ala Val Asn Ala Val Asp Gln Asp 355 360 365 Gln Gln Ala Thr Ala Thr Arg Ser Gly Ala Val Ser Ser Gln Leu Val 370 375 380 Arg Gln Leu Ser Ala Ile Ser Arg Arg Leu Pro Ser Arg Tyr Pro Leu 385 390 395 400 Arg Val Glu Leu Thr Gly Ile Ala Tyr Gly Asn Gln Ser Ala Val Ile 405 410 415 Glu Asp Met Tyr Phe Asp Glu Ile Pro Leu Pro Val Ala Ala Leu Asp 420 425 430 Pro Glu Gly Ile Val Tyr Gly Ala Leu Leu Glu Val Val Asp Gln Ala 435 440 445 Glu Asp Leu Ala Lys Ala Val Asn His Leu Ser Gly Asp Leu Arg Arg 450 455 460 Ala Ala Gly Ser Glu Pro Ile Pro Trp Asp Lys Gly Gln Arg Pro Gly 465 470 475 480 Asp Thr Leu Leu His Ala Leu Asp Pro Ile Val Arg Arg Leu Leu Ala 485 490 495 Gly Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Asp Arg Cys Glu Gln Gly Leu 500 505 510 Glu Ala Trp Glu His Lys Ala Gly Gln Ala Thr Leu Arg Val Ala Glu 515 520 525 Gly Leu Phe Asn Ser Ala Pro Ala Ala Leu Phe Thr Gly Arg Arg Val 530 535 540 Lys Lys Asp Gly Lys Glu Gln Val Tyr Arg Leu Ser Thr Ala Glu Ala 545 550 555 560 Ser Phe Arg Arg Arg Leu Ala Val Ile Leu His Arg Arg Ala Ala Ala 565 570 575 Arg Thr Ala Gly 580 <210> 209 <211> 204 <212> PRT <213> Streptomyces sp. S4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(204) <223> Cse2 <400> 209 Met Ser Thr Ser Pro Leu Ser Ala Pro Val Pro Gly Gln Arg Val Ser 1 5 10 15 Ser Leu Pro Arg Pro Tyr Trp Ser Gly Arg Ala Asp Glu Gln Gly Gln 20 25 30 Trp Arg Thr Arg Ala Gly Glu Ser Leu Arg Pro Pro Gly Glu Asp Leu 35 40 45 Ser Ala Leu Arg Ala Gly Leu Gly Lys Lys Ala Phe Thr Glu Pro Arg 50 55 60 Leu Trp Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Thr Asp Gly Arg Val Thr Leu Glu 65 70 75 80 Leu Glu Ala Glu His Ala Ala Leu Ala Leu Tyr Gly Leu His Gln Gln 85 90 95 Ser Gln Glu Gln Pro Met His Arg Gln Gly Val Arg Thr Gly Arg Ala 100 105 110 Leu Arg Ala Leu His Gln Arg Tyr Ser Glu Glu Ala Thr Asp Arg Arg 115 120 125 Val Ala Gln Ala Val Gly Ala Thr Ser Ala Ala Ala Phe Ala Tyr Arg 130 135 140 Leu Arg Ala Leu Val Thr Gln Leu Arg Ser Ile Gly Gln Pro Leu Asp 145 150 155 160 Tyr Asp Gln Leu Met Gln Asp Leu Leu Arg Trp His Phe Pro Asp Gly 165 170 175 Arg Ser Arg Val Arg Arg Gly Trp Gly Leu Gly Tyr His Gly Arg Asp 180 185 190 Arg Gln Pro Asp Glu Ala Pro Pro Pro Glu Gly Ser 195 200 <210> 210 <211> 388 <212> PRT <213> Streptomyces sp. S4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(388) <223> Cas7 <400> 210 Met Ser Gln Pro Ala Ala Arg Pro Pro Arg Thr Tyr Val Asp Phe His 1 5 10 15 Ile Leu Gln Thr Val Pro Pro Ala Asn Leu Asn Arg Asp Asp Gln Gly 20 25 30 Asn Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Gly Gly Val Arg Arg Ser Arg Val Ser 35 40 45 Ser Gln Ala Trp Lys Arg Ala Thr Arg Thr His Phe Ala Glu Arg Val 50 55 60 Pro Glu Gln Asp Leu Ala Thr Arg Thr Arg Arg Ile Ile Gly Ala Leu 65 70 75 80 Ala Asp Asp Ile Gln Lys Arg Ala Gly Leu Asp Arg Pro Ala Ala Leu 85 90 95 Arg Leu Ala Asp Ala Leu Leu Ala Pro Leu Glu Leu Ser Gly Gly Lys 100 105 110 Lys Lys Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Leu Phe Tyr Gly Arg Arg Gln Leu 115 120 125 Asp Ala Val Ala Ala Leu Val Ala Asp Gln Ala Thr Glu Leu Ser Ala 130 135 140 Leu Ser Asp Ala Asp Leu Ala Ser Arg Val Lys Glu Leu Pro Val Arg 145 150 155 160 Glu Gln Phe Ser Thr Gly His Pro Ile Asp Val Ala Leu Phe Gly Arg 165 170 175 Met Val Ala Asp Ile Pro Ala Leu Lys Val Asp Ala Ala Ala Gln Val 180 185 190 Ala His Ala Leu Ser Thr His Ala Val Glu Leu Glu Phe Asp Tyr Phe 195 200 205 Thr Ala Val Asp Asp Glu Gln Thr Asp Glu Glu Thr Gly Ala Gly Met 210 215 220 Ile Gly Thr Ile Gly Phe Asn Ser Ala Thr Leu Tyr Arg Tyr Ala Ser 225 230 235 240 Val Gly Leu His Gln Leu Leu Asp Asn Leu Thr Asp Glu Glu Ala Ala 245 250 255 Leu Thr Ala Ile Ser Glu Phe Ala Thr Ser Phe Ala Arg Ser Met Pro 260 265 270 Thr Gly Tyr Gln Asn Ser Phe Ala His Arg Thr Leu Pro Ser Leu Val 275 280 285 Ala Val Val Val Arg Glu Asp Gln Pro Val Asn Leu Val Ser Ala Phe 290 295 300 Glu Gln Pro Val Ala Thr Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Ser Ala Ala 305 310 315 320 Arg Leu Ala Glu Glu His Thr Arg Ala Thr Val Thr Trp Gly Asp Ala 325 330 335 Pro Ala Phe Ala Ala Ala Thr His Val Phe Thr Asp His Gln Lys Thr 340 345 350 Thr Ala Ala Leu Asn Ser Ala Phe Gly Pro Ser Ile Pro Phe Ser Ala 355 360 365 Leu Leu Glu Gly Leu His Thr His Leu Ala Gly Ala Leu Lys Pro Lys 370 375 380 Gln Ala Ala Gln 385 <210> 211 <211> 293 <212> PRT <213> Streptomyces sp. S4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(293) <223> Cas5 <400> 211 Met Thr Thr Ala Pro Thr Pro Glu Pro Ala Gly Asn Thr His Pro Ala 1 5 10 15 His Gly Ser Asp Glu Pro Thr Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Gly Pro 20 25 30 Leu Gln Ser Trp Gly Val Arg Ser Ser Phe Asn Arg Arg Asp Thr Gly 35 40 45 Ala Glu Pro Thr Lys Ser Gly Val Ile Gly Leu Leu Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Gly His Pro Arg Glu Gln Pro Leu Gly Glu Leu Ala Asp Leu Thr Leu 65 70 75 80 Gly Ile Arg Val Asp Gln Pro Gly Thr Leu Leu Arg Asp Tyr His Thr 85 90 95 Val Ser Asp Tyr Arg Gly Arg Pro Leu Pro Gln Ala Gly Val Ser Ala 100 105 110 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Thr Ser Pro Ala Lys His Thr His Val Thr 115 120 125 Thr Arg Phe Tyr Leu Gln Asp Ala Val Phe Val Ala Ala Leu Glu Gly 130 135 140 Pro Pro Gly Leu Leu Thr Thr Leu Asp Arg Ala Val Arg Asn Pro Ala 145 150 155 160 Phe Pro Leu Ala Leu Gly Arg Arg Ser Cys Pro Pro Thr Gln Pro Leu 165 170 175 Ser Leu Gly Leu Arg Thr Thr Asp Met Glu Thr Ala Leu Arg Ser Glu 180 185 190 Pro Trp Gln Ala Ser Ala His Thr Arg Glu Gln Tyr Ala Arg Arg Leu 195 200 205 Gly Arg Glu Arg Gly Leu His Gln Pro Leu His Pro Gly Thr Ile Asp 210 215 220 Arg Ala Ala Thr Ile Glu Asp Pro Arg Gly Asp Asp Arg Leu Gln Asp 225 230 235 240 Ala Pro Val Ser Phe Asp Pro His Gln Arg Ala Phe Thr Ser Arg Gln 245 250 255 Val Arg His Thr Trp Leu Ala Ile Pro Thr Gly Phe Asp His Ile Asp 260 265 270 Asp Asp Gln Pro His Gly Gln Ala Asp Asp Pro Asp His Asp Pro Phe 275 280 285 Ala Leu Leu Gly Trp 290 <210> 212 <211> 270 <212> PRT <213> Streptomyces sp. S4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(270) <223> Cas6 <400> 212 Met Thr Tyr Leu Ser Arg Ile Arg Ile Asn Pro Leu Arg Lys Asp Ser 1 5 10 15 Arg Lys Leu Leu Ser Asn Pro Arg Ala Val His Gly Ala Val Met Gly 20 25 30 Gly Leu Pro Asn His Lys Pro Asp Asp Arg Val Leu Trp Arg Met Asp 35 40 45 Pro Asp Asn Pro His Arg Pro His Leu Phe Val Leu Ser Pro Thr Arg 50 55 60 Pro Asp Trp Thr His Ile Ile Gln Asp Cys Gly Trp Pro Asp Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asp His Ala Ala Val Arg Asp Tyr Thr Pro Leu Leu Ser Gln Leu 85 90 95 Ala Val Gly Arg Glu Phe Ala Phe Arg Leu Thr Ala Ser Pro Val Gln 100 105 110 Asn Thr Ala Thr Pro Thr Lys Ala Thr Pro Ala Gln Ala Ala Arg Leu 115 120 125 Thr Thr His Ala Glu Asn Gly Lys Arg Ile Arg Gly Phe Arg Met Gly 130 135 140 His Arg Thr Ala Ala Ala Gln Leu Asp Trp Phe Leu Thr Arg Thr Asp 145 150 155 160 Arg Trp Gly Phe Asp Ile Pro Ala Thr Arg Ser Asp Pro Ala Ala Pro 165 170 175 Gly Ile His Ala Pro Thr Pro Pro Thr Ala Pro Arg Pro Thr Ser Pro 180 185 190 Pro Arg Pro Asp Pro Asn Pro Pro Tyr Glu Val Arg Ile Thr Ala Arg 195 200 205 His Arg His Ser Phe Gln Lys Asn Gly His Gly Ala His Val Val Phe 210 215 220 Arg Ser Ala Thr Phe Glu Gly Arg Leu Arg Ile Thr Asp Thr Asp Arg 225 230 235 240 Phe Thr Thr Ser Leu Leu Thr Gly Leu Gly Pro Ser Arg Ala Tyr Gly 245 250 255 Cys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Pro Leu Pro Gly Gln Gln Thr 260 265 270 <210> 213 <211> 90 <212> DNA <213> Streptomyces sp. S4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(90) <223> CRISPR <400> 213 gtcggccccg cacccgcggg gatgctccaa tggccgagga cgacggcgat ctggccacgg 60 acgtcggccc cgcacccgcg gggatgctcc 90 <210> 214 <211> 744 <212> DNA <213> Fusobacterium nucleatum subsp. animalis 3_1_33 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(744) <223> Cas6 <400> 214 atggaagttt acgaaatgaa attaaaagta aaacttaaaa aagatatttt tttaaaagat 60 gtttccacat atatcacaag atttatggat atgaatctat cagctaatcc aacaatgtac 120 aattatcata cttctaaaat ctacaaagga tatacatttg acggactatt cccgatagaa 180 gaagataaaa tatataaaaa agataaaact tattctttta gagtaagaac aataaatcaa 240 aaaatagcta actatttttt agatactctt atgttctttg aaaataaaga tattcaaggt 300 ttgacattaa atataagggt gatagagaaa aaattaattg aaaagttata tacaataact 360 cctattttaa tgaaaacaga tgagggatat tggagatatt ctatgacttt tgaagaattt 420 gaaaaaagat taaaaataaa ctgtttaaag aagtatttat actttacaga gaataatgat 480 gatataacta ttgatactga acttttaaaa aaattaggag aagataaatc tgatgatata 540 gatttattta ctaatattaa gtttattaat agaatgcctg tcccaattat ttataaggga 600 agaaaattag ttggagataa ggttgaacta caagttgcca ataatgagaa agcacaagat 660 attgcatata tgcttttagg aacagggctt ttagaaaatt gtgcaagggg ttgcggcttc 720 ttgaatttca aaaattatga gtag 744 <210> 215 <211> 1728 <212> DNA <213> Fusobacterium nucleatum subsp. animalis 3_1_33 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1728) <223> Cas8 <400> 215 ttgattgatg aagcattaga agtatttaaa aaaatttatg ataaggaggg ggaaaaactt 60 gttgtaaaca aacatattcc aaaagatgga acatatattt tagtaaatat aaaatcagga 120 aaaataatag aaaaattaaa tattttctat gataaaaaaa gtaaaaaaat agatggtgaa 180 cttaatcaat actatggcta ttttagagct tttgattatt attctaattt agtagatatg 240 aataaaccaa tggatccaaa aaagacaata cattcaaatc agatttattc attttttata 300 aaaaaagata gcataagaga aaataaatta actaaatcaa ttattgaagg atataaaaaa 360 aatcttttaa acccagaaga aaaatacaat agtaaggaag ggaaagagct atataaaaat 420 atagcagaaa agcttcctaa aattgaaaaa gatattgtag aggatatttt tttatggata 480 gaagataatg taaatgaaaa tttattagaa aatgacaata aaaaagatta cttaaaaata 540 ttttttgtag aagaggattt agataaaagt ttagaactat ttaaaaatga acataaaaga 600 tatattattc ctaatatttt taattctaat gattataata aaaaaattgg agagactatt 660 tatggattgt ctaataataa tatgggatta aatgcaaaaa aagcattttt ggaaaataag 720 acaagaagag tatcaacccc atatttagtt aatactgatg aaatactttt acaatatgct 780 ttctataatt atttattacc agaagtaaaa caaggaaatt attttattta tttttcagaa 840 aatgaaatta ttcctaggac atataaagaa ggctgtccta atggagcaaa atatttatta 900 aatgctagtt attcaaaaga tgttgatata aaaaatttta atgtaatctc aaaaaatagt 960 agcgaagaaa taaatattaa ttttaaagaa attttacatc aaaagaaaaa agatacagat 1020 gagattgaat atggaaatct taatagagaa aagatgatga ataatataaa taaaattctt 1080 ttctataatt ctttattagg aaatttttta ctcagtgatg gagatttgga tataaaggat 1140 attgagataa aaaaactgtt aatgaaatat agaaatgctt tttataagtg gttttattta 1200 aatgatgaag cagaagtcaa aaaaaatatt agaaaaatat atctggatgc tgtaatggtg 1260 gcaataggaa atggatattt ctttaaagca agtcaacaac ttgattttgg cttttgtttg 1320 gaaaagtatt tttatggaaa aagtgagtta atggaggaaa ttatgaatgt aaaagaagta 1380 tttttaaatc atactttatc agaagaagat tgggagtttt taaatgatga agagtatttt 1440 ttcgcagttg ggcaaatatt agcgtacata aattatatga gaaatagtaa agctaaaagt 1500 ttgaatttta taaaacaact aacttttgtt aaaaatattg atgttctaaa agaaaagata 1560 aagaaaatag taatttcata ttcacatatt tttgaaacta aaaataaaaa aattaataga 1620 acagtatcaa atattagttt gtaccaacca aaagaaataa gaatagatat attattagca 1680 ggatttacag cagatataat tttctttaaa aagagggagg aaaaataa 1728 <210> 216 <211> 948 <212> DNA <213> Fusobacterium nucleatum subsp. animalis 3_1_33 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(948) <223> Cas7 <400> 216 atgaaaatgg aaaaaagagt ttatggaatt ttaggaatat catctattat gtctaattgg 60 aatgcagatt tcagtggaga gcctaagtca atttctaatg gaagaatatt tgggagtgat 120 aaggcattta agtatcctat gaaaaaaatg tgggaaaatc aaggagaaaa agttctttat 180 ataaaatctt taaaagttga taaaggagct ttaattccta agactttaaa ggaaagatat 240 gagcaattat ttccagaaaa aaaacttgat aaaaatacag aaacaataga agttattaag 300 aacttattta aagccataga tgtaaaaaat tttggagcaa catttgcaga agaaggaaat 360 aatatttcta tcacaggggc agttcaaata ggacaaggtt ttaatttcta tgatgaaagt 420 aacacagaag ttcaagatat tctatctcca tttagagatc caaaaggaaa aattaataaa 480 gaaacaaaag aaaatgaaga tgcaaagaac tctactttgg gaactaaaat agttagtgat 540 gaggcacact atttttatcc ttttaatata aatcctttgg catataaaga atttatagaa 600 ttagaaataa ctgatggata tacagaagaa gattatttga agtttaaaga agcagcttta 660 tcatcagcaa ctttttttgc aacaaattca aaagttggct gtgataatga atttggacta 720 ttcattgaaa cagaagaaga tttttattta ccaattttaa ctcaatatat aaaatttgaa 780 aagggagaag aaaaaaataa aataactctt aatttaagta ctatattaaa aggagtagaa 840 aatcatatca aaaatataga aatatactat aatccagtaa ctactgaaat tgtaactgat 900 atttctaact ataagttgat aaatatttta actaagaaag aggtataa 948 <210> 217 <211> 771 <212> DNA <213> Fusobacterium nucleatum subsp. animalis 3_1_33 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(771) <223> Cas5 <400> 217 atggaagcac tgaaatttac tttaagtggt aatagtgcct tttttaaaga taatgtaatc 60 aacactgttt atttaacata tggaaatata catagagtag ctttattagg aatgtttgga 120 gcaattttag gctatggtgg atatagtaaa caaaatgata tgttgaagaa aaaaaataaa 180 aagatgcctg attatccaga attttatgag aaactaaaag atattaaaat atcaatagtt 240 tccaacggaa aaaatggtta ttttaataaa aagttacaaa catttaataa tagtgttggt 300 tatgcgtcaa aagaagaagg tggaaattta atagtaaaac aattctggtt agaaaatcct 360 tcttgggata tttatatatt gttagattgt gatgaagcaa agaaaatagc agactatata 420 cagaatagga aagctattta tcttccatat cttggaagca atgaccattt agcaaatata 480 atggatgtag agataataga tattgaagaa aagatgagtt cagaagatga aactattgaa 540 attctttcta tggtaaaaga tagtgatata tcagaaaaaa agaaaaatgt atttagtata 600 gataaaaatt caataagaga tgatatatat aaatattctg aatatttacc agttacctta 660 tcaaaagaat taaatcaata tgaaaaagaa aaaatgacaa ttactaatat gtctgttata 720 ttaaaaaaat cttattataa agtggaagat aaaaacattg ttttctatta a 771 <210> 218 <211> 744 <212> DNA <213> Fusobacterium nucleatum subsp. animalis 3_1_33 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(744) <223> Cas6 <400> 218 atggaggtgt acgagatgaa gctgaaggtg aagctgaaga aggatatctt tctgaaggac 60 gtgagcacct atatcacaag attcatggat atgaacctgt ccgccaatcc aaccatgtac 120 aactatcaca catctaagat ctacaagggc tatacctttg acggcctgtt ccccatcgag 180 gaggataaga tctacaagaa ggacaagacc tatagctttc gggtgagaac aatcaaccag 240 aagatcgcca attacttcct ggataccctg atgttctttg agaataagga catccagggc 300 ctgacactga acatcagagt gatcgagaag aagctgatcg agaagctgta caccatcaca 360 cctatcctga tgaagaccga tgagggctac tggcggtatt ctatgacatt tgaggagttc 420 gagaagagac tgaagatcaa ctgcctgaag aagtacctgt atttcaccga gaacaatgac 480 gatatcacca tcgacacaga gctgctgaag aagctgggcg aggataagag cgacgatatc 540 gacctgttta caaacatcaa gttcatcaat aggatgcccg tgcctatcat ctacaagggc 600 cgcaagctgg tgggcgataa ggtggagctg caggtggcca acaatgagaa ggcccaggac 660 atcgcctata tgctgctggg aaccggactg ctggagaatt gcgcacgggg ctgtggcttt 720 ctgaacttca agaattacga gtaa 744 <210> 219 <211> 1728 <212> DNA <213> Fusobacterium nucleatum subsp. animalis 3_1_33 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1728) <223> Cas8 <400> 219 atgatcgatg aggccctgga ggtgtttaag aagatctacg acaaggaggg cgagaagctg 60 gtggtgaata agcacatccc caaggacggc acatatatcc tggtgaatat caagtctggc 120 aagatcatcg agaagctgaa catcttctac gataagaaga gcaagaagat cgacggcgag 180 ctgaaccagt actatggcta ttttcgcgcc ttcgattact atagcaacct ggtggatatg 240 aataagccta tggacccaaa gaagaccatc cacagcaatc agatctattc cttctttatc 300 aagaaggact ctatccggga gaacaagctg acaaagagca tcatcgaggg ctacaagaag 360 aacctgctga atcctgagga gaagtacaat tccaaggagg gcaaggagct gtataagaac 420 atcgccgaga agctgccaaa gatcgagaag gatatcgtgg aggacatctt cctgtggatc 480 gaggacaatg tgaacgagaa tctgctggag aacgataata agaaggacta tctgaagatc 540 ttctttgtgg aggaggacct ggataagagc ctggagctgt ttaagaacga gcacaagagg 600 tacatcatcc ctaacatctt caactccaac gattacaata agaagatcgg cgagaccatc 660 tatggcctgt ctaacaataa catgggcctg aacgccaaga aggcctttct ggagaataag 720 accaggcgcg tgagcacacc ctacctggtg aatacagacg agatcctgct gcagtatgcc 780 ttctacaact atctgctgcc tgaggtgaag cagggcaact actttatcta tttctccgag 840 aatgagatca tcccaagaac ctacaaggag ggctgcccca acggcgccaa gtacctgctg 900 aatgcctctt atagcaagga cgtggatatc aagaacttta atgtgatctc caagaatagc 960 tccgaggaga tcaacatcaa tttcaaggag atcctgcacc agaagaagaa ggacacagat 1020 gagatcgagt acggcaacct gaatagggag aagatgatga acaacatcaa caagatcctg 1080 ttttataact ccctgctggg caatttcctg ctgtctgacg gcgatctgga catcaaggat 1140 atcgagatca agaagctgct gatgaagtac cgcaatgcct tttacaagtg gttctatctg 1200 aacgatgagg ccgaggtgaa gaagaatatc agaaagatct acctggacgc cgtgatggtg 1260 gccatcggca acggctattt ctttaaggcc agccagcagc tggactttgg cttctgtctg 1320 gagaagtact tctatggcaa gtccgagctg atggaggaga tcatgaacgt gaaagaggtg 1380 tttctgaatc acaccctgag cgaggaggat tgggagttcc tgaacgacga ggagtacttc 1440 tttgccgtgg gccagatcct ggcctacatc aactatatgc gcaattccaa ggccaagagc 1500 ctgaacttca tcaagcagct gacattcgtg aagaacatcg acgtgctgaa ggagaagatc 1560 aagaagatcg tgatctccta ttctcacatc tttgagacca agaacaagaa gatcaatagg 1620 acagtgtcta acatcagcct gtaccagcca aaggagatcc gcatcgatat cctgctggcc 1680 ggcttcaccg ccgacatcat cttctttaag aagcgggagg agaagtaa 1728 <210> 220 <211> 942 <212> DNA <213> Fusobacterium nucleatum subsp. animalis 3_1_33 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(942) <223> Cas7 <400> 220 atggagaaga gagtgtacgg catcctgggc atcagctcca tcatgtccaa ttggaacgcc 60 gatttctctg gcgagcctaa gtctatcagc aatggcagaa tctttggctc cgacaaggcc 120 ttcaagtacc caatgaagaa gatgtgggag aaccagggcg agaaggtgct gtatatcaag 180 tctctgaagg tggataaggg cgccctgatc cccaagaccc tgaaggagag gtacgagcag 240 ctgtttcctg agaagaagct ggataagaac accgagacaa tcgaagtgat caagaatctg 300 ttcaaggcca tcgacgtgaa gaactttggc gccaccttcg ccgaggaggg caacaatatc 360 agcatcacag gcgccgtgca gatcggccag ggcttcaact tttacgacga gagcaatacc 420 gaggtgcagg atatcctgtc ccccttcaga gaccctaagg gcaagatcaa caaggagaca 480 aaggagaacg aggatgccaa gaatagcacc ctgggcacaa agatcgtgtc cgacgaggcc 540 cactactttt atccattcaa tatcaacccc ctggcctaca aggagtttat cgagctggag 600 atcaccgatg gctacacaga ggaggactat ctgaagttca aggaggccgc cctgtctagc 660 gccaccttct ttgccacaaa ctccaaagtg ggctgcgata atgagtttgg cctgttcatc 720 gagaccgagg aggactttta cctgccaatc ctgacacagt atatcaagtt cgagaagggc 780 gaggagaaga acaagatcac cctgaatctg tctacaatcc tgaagggcgt ggagaaccac 840 atcaagaata tcgagatcta ctataatccc gtgaccacag agatcgtgac cgatatcagc 900 aactacaagc tgatcaatat cctgacaaag aaggaagtgt aa 942 <210> 221 <211> 771 <212> DNA <213> Fusobacterium nucleatum subsp. animalis 3_1_33 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(771) <223> Cas5 <400> 221 atggaggccc tgaagtttac actgagcggc aattccgcct tctttaagga caacgtgatc 60 aataccgtgt acctgacata tggcaacatc cacagggtgg ccctgctggg catgtttggc 120 gccatcctgg gctacggcgg ctattctaag cagaacgaca tgctgaagaa gaagaacaag 180 aagatgccag attaccccga gttctatgag aagctgaagg acatcaagat ctctatcgtg 240 agcaacggca agaatggcta ctttaataag aagctgcaga ccttcaacaa tagcgtgggc 300 tatgcctcca aggaggaggg cggcaatctg atcgtgaagc agttctggct ggagaacccc 360 tcctgggata tctacatcct gctggactgc gatgaggcca agaagatcgc cgactatatc 420 cagaaccgca aggccatcta cctgccttat ctgggctcca acgatcacct ggccaatatc 480 atggatgtgg agatcatcga catcgaggag aagatgtcct ctgaggacga gaccatcgag 540 atcctgtcta tggtgaagga ctccgatatc tctgagaaga agaagaacgt gttcagcatc 600 gacaaaaata gcatccggga cgatatctac aagtattctg agtacctgcc tgtgacactg 660 agcaaggagc tgaatcagta tgagaaggag aagatgacca tcacaaacat gagcgtgatc 720 ctgaagaagt cctactataa ggtggaggat aagaatatcg tgttctacta a 771 <210> 222 <211> 247 <212> PRT <213> Fusobacterium nucleatum subsp. animalis 3_1_33 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(247) <223> Cas6 <400> 222 Met Glu Val Tyr Glu Met Lys Leu Lys Val Lys Leu Lys Lys Asp Ile 1 5 10 15 Phe Leu Lys Asp Val Ser Thr Tyr Ile Thr Arg Phe Met Asp Met Asn 20 25 30 Leu Ser Ala Asn Pro Thr Met Tyr Asn Tyr His Thr Ser Lys Ile Tyr 35 40 45 Lys Gly Tyr Thr Phe Asp Gly Leu Phe Pro Ile Glu Glu Asp Lys Ile 50 55 60 Tyr Lys Lys Asp Lys Thr Tyr Ser Phe Arg Val Arg Thr Ile Asn Gln 65 70 75 80 Lys Ile Ala Asn Tyr Phe Leu Asp Thr Leu Met Phe Phe Glu Asn Lys 85 90 95 Asp Ile Gln Gly Leu Thr Leu Asn Ile Arg Val Ile Glu Lys Lys Leu 100 105 110 Ile Glu Lys Leu Tyr Thr Ile Thr Pro Ile Leu Met Lys Thr Asp Glu 115 120 125 Gly Tyr Trp Arg Tyr Ser Met Thr Phe Glu Glu Phe Glu Lys Arg Leu 130 135 140 Lys Ile Asn Cys Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Phe Thr Glu Asn Asn Asp 145 150 155 160 Asp Ile Thr Ile Asp Thr Glu Leu Leu Lys Lys Leu Gly Glu Asp Lys 165 170 175 Ser Asp Asp Ile Asp Leu Phe Thr Asn Ile Lys Phe Ile Asn Arg Met 180 185 190 Pro Val Pro Ile Ile Tyr Lys Gly Arg Lys Leu Val Gly Asp Lys Val 195 200 205 Glu Leu Gln Val Ala Asn Asn Glu Lys Ala Gln Asp Ile Ala Tyr Met 210 215 220 Leu Leu Gly Thr Gly Leu Leu Glu Asn Cys Ala Arg Gly Cys Gly Phe 225 230 235 240 Leu Asn Phe Lys Asn Tyr Glu 245 <210> 223 <211> 575 <212> PRT <213> Fusobacterium nucleatum subsp. animalis 3_1_33 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(575) <223> Cas8 <400> 223 Met Ile Asp Glu Ala Leu Glu Val Phe Lys Lys Ile Tyr Asp Lys Glu 1 5 10 15 Gly Glu Lys Leu Val Val Asn Lys His Ile Pro Lys Asp Gly Thr Tyr 20 25 30 Ile Leu Val Asn Ile Lys Ser Gly Lys Ile Ile Glu Lys Leu Asn Ile 35 40 45 Phe Tyr Asp Lys Lys Ser Lys Lys Ile Asp Gly Glu Leu Asn Gln Tyr 50 55 60 Tyr Gly Tyr Phe Arg Ala Phe Asp Tyr Tyr Ser Asn Leu Val Asp Met 65 70 75 80 Asn Lys Pro Met Asp Pro Lys Lys Thr Ile His Ser Asn Gln Ile Tyr 85 90 95 Ser Phe Phe Ile Lys Lys Asp Ser Ile Arg Glu Asn Lys Leu Thr Lys 100 105 110 Ser Ile Ile Glu Gly Tyr Lys Lys Asn Leu Leu Asn Pro Glu Glu Lys 115 120 125 Tyr Asn Ser Lys Glu Gly Lys Glu Leu Tyr Lys Asn Ile Ala Glu Lys 130 135 140 Leu Pro Lys Ile Glu Lys Asp Ile Val Glu Asp Ile Phe Leu Trp Ile 145 150 155 160 Glu Asp Asn Val Asn Glu Asn Leu Leu Glu Asn Asp Asn Lys Lys Asp 165 170 175 Tyr Leu Lys Ile Phe Phe Val Glu Glu Asp Leu Asp Lys Ser Leu Glu 180 185 190 Leu Phe Lys Asn Glu His Lys Arg Tyr Ile Ile Pro Asn Ile Phe Asn 195 200 205 Ser Asn Asp Tyr Asn Lys Lys Ile Gly Glu Thr Ile Tyr Gly Leu Ser 210 215 220 Asn Asn Asn Met Gly Leu Asn Ala Lys Lys Ala Phe Leu Glu Asn Lys 225 230 235 240 Thr Arg Arg Val Ser Thr Pro Tyr Leu Val Asn Thr Asp Glu Ile Leu 245 250 255 Leu Gln Tyr Ala Phe Tyr Asn Tyr Leu Leu Pro Glu Val Lys Gln Gly 260 265 270 Asn Tyr Phe Ile Tyr Phe Ser Glu Asn Glu Ile Ile Pro Arg Thr Tyr 275 280 285 Lys Glu Gly Cys Pro Asn Gly Ala Lys Tyr Leu Leu Asn Ala Ser Tyr 290 295 300 Ser Lys Asp Val Asp Ile Lys Asn Phe Asn Val Ile Ser Lys Asn Ser 305 310 315 320 Ser Glu Glu Ile Asn Ile Asn Phe Lys Glu Ile Leu His Gln Lys Lys 325 330 335 Lys Asp Thr Asp Glu Ile Glu Tyr Gly Asn Leu Asn Arg Glu Lys Met 340 345 350 Met Asn Asn Ile Asn Lys Ile Leu Phe Tyr Asn Ser Leu Leu Gly Asn 355 360 365 Phe Leu Leu Ser Asp Gly Asp Leu Asp Ile Lys Asp Ile Glu Ile Lys 370 375 380 Lys Leu Leu Met Lys Tyr Arg Asn Ala Phe Tyr Lys Trp Phe Tyr Leu 385 390 395 400 Asn Asp Glu Ala Glu Val Lys Lys Asn Ile Arg Lys Ile Tyr Leu Asp 405 410 415 Ala Val Met Val Ala Ile Gly Asn Gly Tyr Phe Phe Lys Ala Ser Gln 420 425 430 Gln Leu Asp Phe Gly Phe Cys Leu Glu Lys Tyr Phe Tyr Gly Lys Ser 435 440 445 Glu Leu Met Glu Glu Ile Met Asn Val Lys Glu Val Phe Leu Asn His 450 455 460 Thr Leu Ser Glu Glu Asp Trp Glu Phe Leu Asn Asp Glu Glu Tyr Phe 465 470 475 480 Phe Ala Val Gly Gln Ile Leu Ala Tyr Ile Asn Tyr Met Arg Asn Ser 485 490 495 Lys Ala Lys Ser Leu Asn Phe Ile Lys Gln Leu Thr Phe Val Lys Asn 500 505 510 Ile Asp Val Leu Lys Glu Lys Ile Lys Lys Ile Val Ile Ser Tyr Ser 515 520 525 His Ile Phe Glu Thr Lys Asn Lys Lys Ile Asn Arg Thr Val Ser Asn 530 535 540 Ile Ser Leu Tyr Gln Pro Lys Glu Ile Arg Ile Asp Ile Leu Leu Ala 545 550 555 560 Gly Phe Thr Ala Asp Ile Ile Phe Phe Lys Lys Arg Glu Glu Lys 565 570 575 <210> 224 <211> 313 <212> PRT <213> Fusobacterium nucleatum subsp. animalis 3_1_33 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(313) <223> Cas7 <400> 224 Met Glu Lys Arg Val Tyr Gly Ile Leu Gly Ile Ser Ser Ile Met Ser 1 5 10 15 Asn Trp Asn Ala Asp Phe Ser Gly Glu Pro Lys Ser Ile Ser Asn Gly 20 25 30 Arg Ile Phe Gly Ser Asp Lys Ala Phe Lys Tyr Pro Met Lys Lys Met 35 40 45 Trp Glu Asn Gln Gly Glu Lys Val Leu Tyr Ile Lys Ser Leu Lys Val 50 55 60 Asp Lys Gly Ala Leu Ile Pro Lys Thr Leu Lys Glu Arg Tyr Glu Gln 65 70 75 80 Leu Phe Pro Glu Lys Lys Leu Asp Lys Asn Thr Glu Thr Ile Glu Val 85 90 95 Ile Lys Asn Leu Phe Lys Ala Ile Asp Val Lys Asn Phe Gly Ala Thr 100 105 110 Phe Ala Glu Glu Gly Asn Asn Ile Ser Ile Thr Gly Ala Val Gln Ile 115 120 125 Gly Gln Gly Phe Asn Phe Tyr Asp Glu Ser Asn Thr Glu Val Gln Asp 130 135 140 Ile Leu Ser Pro Phe Arg Asp Pro Lys Gly Lys Ile Asn Lys Glu Thr 145 150 155 160 Lys Glu Asn Glu Asp Ala Lys Asn Ser Thr Leu Gly Thr Lys Ile Val 165 170 175 Ser Asp Glu Ala His Tyr Phe Tyr Pro Phe Asn Ile Asn Pro Leu Ala 180 185 190 Tyr Lys Glu Phe Ile Glu Leu Glu Ile Thr Asp Gly Tyr Thr Glu Glu 195 200 205 Asp Tyr Leu Lys Phe Lys Glu Ala Ala Leu Ser Ser Ala Thr Phe Phe 210 215 220 Ala Thr Asn Ser Lys Val Gly Cys Asp Asn Glu Phe Gly Leu Phe Ile 225 230 235 240 Glu Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Leu Pro Ile Leu Thr Gln Tyr Ile Lys 245 250 255 Phe Glu Lys Gly Glu Glu Lys Asn Lys Ile Thr Leu Asn Leu Ser Thr 260 265 270 Ile Leu Lys Gly Val Glu Asn His Ile Lys Asn Ile Glu Ile Tyr Tyr 275 280 285 Asn Pro Val Thr Thr Glu Ile Val Thr Asp Ile Ser Asn Tyr Lys Leu 290 295 300 Ile Asn Ile Leu Thr Lys Lys Glu Val 305 310 <210> 225 <211> 256 <212> PRT <213> Fusobacterium nucleatum subsp. animalis 3_1_33 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(256) <223> Cas5 <400> 225 Met Glu Ala Leu Lys Phe Thr Leu Ser Gly Asn Ser Ala Phe Phe Lys 1 5 10 15 Asp Asn Val Ile Asn Thr Val Tyr Leu Thr Tyr Gly Asn Ile His Arg 20 25 30 Val Ala Leu Leu Gly Met Phe Gly Ala Ile Leu Gly Tyr Gly Gly Tyr 35 40 45 Ser Lys Gln Asn Asp Met Leu Lys Lys Lys Asn Lys Lys Met Pro Asp 50 55 60 Tyr Pro Glu Phe Tyr Glu Lys Leu Lys Asp Ile Lys Ile Ser Ile Val 65 70 75 80 Ser Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Phe Asn Lys Lys Leu Gln Thr Phe Asn 85 90 95 Asn Ser Val Gly Tyr Ala Ser Lys Glu Glu Gly Gly Asn Leu Ile Val 100 105 110 Lys Gln Phe Trp Leu Glu Asn Pro Ser Trp Asp Ile Tyr Ile Leu Leu 115 120 125 Asp Cys Asp Glu Ala Lys Lys Ile Ala Asp Tyr Ile Gln Asn Arg Lys 130 135 140 Ala Ile Tyr Leu Pro Tyr Leu Gly Ser Asn Asp His Leu Ala Asn Ile 145 150 155 160 Met Asp Val Glu Ile Ile Asp Ile Glu Glu Lys Met Ser Ser Glu Asp 165 170 175 Glu Thr Ile Glu Ile Leu Ser Met Val Lys Asp Ser Asp Ile Ser Glu 180 185 190 Lys Lys Lys Asn Val Phe Ser Ile Asp Lys Asn Ser Ile Arg Asp Asp 195 200 205 Ile Tyr Lys Tyr Ser Glu Tyr Leu Pro Val Thr Leu Ser Lys Glu Leu 210 215 220 Asn Gln Tyr Glu Lys Glu Lys Met Thr Ile Thr Asn Met Ser Val Ile 225 230 235 240 Leu Lys Lys Ser Tyr Tyr Lys Val Glu Asp Lys Asn Ile Val Phe Tyr 245 250 255 <210> 226 <211> 96 <212> DNA <213> Fusobacterium nucleatum subsp. animalis 3_1_33 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(96) <223> CRISPR <400> 226 atgaactgta aacttgaaaa gttttgaaat gttgacaaat attcagataa tttttcaaaa 60 tcttttatga actgtaaact tgaaaagttt tgaaat 96 <210> 227 <211> 723 <212> DNA <213> Campylobacter fetus subsp. testudinum Sp3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(723) <223> Cas6 <400> 227 atggatgtga aaatatatca gctgaaagta tttttaaagt taaatcaaaa tgtagatttt 60 ataaatagcc ctgagttttt aagcacaaat ttacataaag ctatgttggg ggatgaagct 120 ctacgatcta ttcatatgca aagatattta aagccttata gcatcggttt tttatacagt 180 atgaaaggca aaaaagatac ttttgtgagt ggtgaagata tgtattttta cgtaagaagt 240 attgatgaga gttttatatc taagttaaga atttgtttag aaaattctaa aaatcttggg 300 tttaatgtat atttatctaa atttgaaaat ttggatataa agcaagtcga tcgtttatat 360 actatgagtc cggcaactat cgtgcttaaa gaaggcgata aaactatacc ttggagacgt 420 gaaaatagcg atataacagt gcttaaagaa gctttgattt caaatttaaa aaacaaatac 480 gaatattttt tagacaaaaa aattgagata aaagatgata tcatcgaact tatagagata 540 aaaacaaata gagcgtttgc atttagatat aaaaacggta aaatttatgc ttatagatat 600 caaattcact tttcccaaaa cagattggct caagagtttg caaatatcgc catgatactt 660 ggtgttggag ttaaaaatac attgggattt ggcttttgta tgaggagtaa taatgctgtt 720 tga 723 <210> 228 <211> 1692 <212> DNA <213> Campylobacter fetus subsp. testudinum Sp3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1692) <223> Cas8 <400> 228 atgctgtttg aattgcttga tgagtttaaa aaacagcttg aaaaaaataa gcacatagtc 60 acacaaaatc acattttaaa agacggagtt tatgcgagaa tttccgatga aaaatgtgag 120 attttttacg taaaaactat cacagaaaaa ataggtaaaa ctgcgcagaa aagaacgatt 180 ttatacaaac aaaacggaga tatcgcgtta aatgatgata tgcagtggtt tgagcaagct 240 gattatttaa gtttcttatg ggatatgaat aaagctgttt tgcctaataa aaaatttcac 300 agcattaact ttttgtctct attttttaag cttgaagagt ctgagtatgt taaggaaaat 360 ttggaagagt attttgatat ttttagagat tatagtgcat ttaataaagc aaaagataag 420 gaaattttat cattttatat ggattatata aaagatgaaa atagacaaaa cttgatcaca 480 aattcagtag ttttatctaa aaaatatttt aatgatataa atgattttgc tgtacaaaat 540 aactttaaaa agtgttatat taagtttttt attgacaaag attttgagat ttatgaaaaa 600 gagtcgcaaa tttatattga tttgaaaatt tacaattcaa atgaacacaa tataaaatat 660 aataatgaaa ttttcggtct ttcaaatttc aatatgggta tgaattcaaa aaaacctttt 720 ttagagcata aaaatagatt atttaaaata ccttacgcca taagtcaaaa agacgctctt 780 gctagtaaaa tgctttttga ttggcttggt tcgcaaaata aaagaattat tcgtgatttt 840 aactcaatct ttatatctaa attcaataaa caatcaaaag ccgtggtaag tgacttcgag 900 tatgttcctg tagataaaaa taagtttaaa tttgataaat ttaaacttaa aaattttatg 960 aatattgaaa atggtgaaaa agagatactt agttttgatg attttaagca agttattgat 1020 gagcagcttt atcataaatg tctttttggt aatttgtata atgatgagat aagagttagt 1080 aaaagaatca gcgaagatat gcaaaattta ctttatcaaa ctagatgttc tatggtggag 1140 tattttgata aatttaataa caatgaattt tactatgtta tacaaaaata ttctaatgat 1200 tttattaaaa ttgctatgca agatagtgaa tttggtagat taaacggtaa aaaatctata 1260 aatttgctac ttagtataaa agaaattaaa ggagaaaaag tggatataga cgggataaaa 1320 aatagagtta tatcagcact tactgatgat aatgtaacta aattaagcgg aaatgaatac 1380 tactttttag taggtaattt agcaatgtat ctagttagta aaagcaagac ttggaaaaag 1440 acgtttgcac taactgaccc atacactaaa gctagaaata caaaaaagct aaaaatggct 1500 ctgtttattg attttgatag atacaactat gatatttttt tagaaaatgg aatattaaaa 1560 aaagcatttt cattggctca aaattgtgaa gatatagtta tgtcaaataa cgaccaacag 1620 atggttttaa tcggtatgat gacaaaaaat ataattaaga aaccaggaga aaaagatgaa 1680 attagcgaat ag 1692 <210> 229 <211> 942 <212> DNA <213> Campylobacter fetus subsp. testudinum Sp3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(942) <223> Cas7 <400> 229 atgaaattag cgaatagaat ttatggaata atcggtataa aatcaactat ggccaactgg 60 aatgcagatt ttagcggcag accaaaaagc acaggaaacg gagatatctt tgctagtgat 120 aaagctttaa aatatcctat gaaaaagatg tgggaaagct atggaaaaaa tattcttttt 180 gtaaaatctc taaaacaagg caagagtaag gatggcaatg acaagctcgt gccaaatact 240 ctaggagaaa gatatggttt gctttttggc gatatcaaaa aagcaaaatc cacaaaagag 300 gttttgagta acctttttaa ctgcattgat gttaaaaatt tcggtgctac attccctgaa 360 gatggttata acttatcaat aactggtgca gttcagatag gacaaggatt taataaattt 420 ggagatataa atatagaagt tcaaaatatc ttatctccat ttgccgattc aagagctaaa 480 gagaaaaacg aaaatggaga agatgcgagc caaagcactc tgggtacaaa aatagttaca 540 gatgaggctc attattttta cggattttgc ataaatccgt tagcttataa tgattataaa 600 gagattttgg gtgatgattt tggttacaat gaagatgatt acgctgagtt caaaaaggct 660 gctagatttt gcgctacgta ttttaattcc aactcaaaat tcggctgcga aaatgagttt 720 gctatgttca ttgaaacagc cgtagatgca tatctgcctg atcttagttc atatatggat 780 tttatttgca aagataaaaa tagattggta aatttagaaa aaatagaaaa aatgatagaa 840 agttcagatg taaaaaaagt agaaatttat tacaatcctt tatctttgga cgtagaaact 900 aaatttgata aattcgatat ttacagtgga aataaaatat ga 942 <210> 230 <211> 762 <212> DNA <213> Campylobacter fetus subsp. testudinum Sp3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(762) <223> Cas5 <400> 230 atgaaagcca taagttttaa gcttagcgga aagtttgcac atttcaaaaa accagatgta 60 aatgaatatg tgtattttac ttataataat atcccaaaac caactctatt agggcttttg 120 ggggccatta tagggcttaa aggatacgcg caaaaaactt ataataataa aaaagataaa 180 aaatcacttt taaacaatga aaacagaagt aacgagccgg aattttatga gcgtttaaaa 240 catcttaaaa tttgtattat tcctcttgtt aaatatggta aattttctaa aaaaattcaa 300 gttttcaata attcagtagg atacgcaagc accgaagaag gtggaaattt aatagttaga 360 gagcaatggc ttgaaaatcc ttcttggcag atacttatag aagatgacgg aagtgcggag 420 tttgagacta tttcacaata tctatttgat aaaaaagcta agtttatacc atatcttggt 480 aaaaatgacc attttgcaga tataagcgaa gtggagaaaa tagatcttgc agagtctaaa 540 aaagataaaa ttgtgataaa atcgctgttt ttggataatt tagcaaagca ggttgatgac 600 cctgatgatg agatatcata tctttttaat gaattttatc ctattggttt taatgaactt 660 atgttttata agcttgaaaa aactactttt acaaatcaaa tttgtcaagc aatggacggg 720 aaatggtatg agtttaaaga cggaactata tgcttctttt aa 762 <210> 231 <211> 723 <212> DNA <213> Campylobacter fetus subsp. testudinum Sp3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(723) <223> Cas6 <400> 231 atggatgtga agatctacca gctgaaggtg ttcctgaagc tgaatcagaa cgtggacttc 60 atcaacagcc cagagtttct gtccaccaat ctgcacaagg ccatgctggg cgatgaggcc 120 ctgaggtcca tccacatgca gcggtacctg aagccctact ctatcggctt tctgtacagc 180 atgaagggca agaaggacac atttgtgagc ggcgaggata tgtacttcta tgtgcggtcc 240 atcgacgagt ctttcatcag caagctgaga atctgcctgg agaattctaa gaacctgggc 300 tttaacgtgt atctgagcaa gttcgagaat ctggacatca agcaggtgga taggctgtac 360 accatgagcc ctgccacaat cgtgctgaag gagggcgata agaccatccc atggcggaga 420 gagaactccg acatcacagt gctgaaggag gccctgatct ctaatctgaa gaacaagtac 480 gagtatttcc tggacaagaa gatcgagatc aaggacgata tcatcgagct gatcgagatc 540 aagaccaatc gggccttcgc ctttagatat aagaacggca agatctacgc ctataggtac 600 cagatccact ttagccagaa ccgcctggcc caggagttcg ccaatatcgc catgatcctg 660 ggcgtgggcg tgaagaatac cctgggcttc ggcttttgca tgaggtccaa caatgcagtg 720 taa 723 <210> 232 <211> 1692 <212> DNA <213> Campylobacter fetus subsp. testudinum Sp3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1692) <223> Cas8 <400> 232 atgctgttcg agctgctgga tgagtttaag aagcagctgg agaagaacaa gcacatcgtg 60 acacagaatc acatcctgaa ggatggcgtg tatgcccgca tctccgacga gaagtgtgag 120 atcttctacg tgaagaccat cacagagaag atcggcaaga ccgcccagaa gcggacaatc 180 ctgtataagc agaacggcga catcgccctg aatgacgata tgcagtggtt tgagcaggcc 240 gactacctga gcttcctgtg ggatatgaac aaggccgtgc tgcccaataa gaagttccac 300 agcatcaact ttctgtccct gttctttaag ctggaggagt ccgagtacgt gaaggagaat 360 ctggaggagt attttgacat cttcagagat tactccgcct ttaacaaggc caaggataag 420 gagatcctgt ctttctatat ggactacatc aaggatgaga ataggcagaa cctgatcacc 480 aattctgtgg tgctgagcaa gaagtacttc aatgacatca acgattttgc cgtgcagaac 540 aatttcaaga agtgctacat caagttcttt atcgacaagg atttcgagat ctacgagaag 600 gagagccaga tctatatcga cctgaagatc tacaattcca acgagcacaa catcaagtat 660 aacaatgaga tcttcggcct gtctaacttc aacatgggca tgaatagcaa gaagccattt 720 ctggagcaca agaaccgcct gttcaagatc ccctacgcca tctcccagaa ggatgccctg 780 gcctctaaga tgctgtttga ctggctgggc agccagaaca agcggatcat cagagacttt 840 aattccatct tcatctctaa gtttaacaag cagtctaagg ccgtggtgag cgacttcgag 900 tacgtgcccg tggataagaa caagtttaag ttcgacaagt tcaagctgaa gaacttcatg 960 aacatcgaga atggcgagaa ggagatcctg agctttgacg atttcaagca ggtcatcgat 1020 gagcagctgt atcacaagtg cctgtttggc aacctgtaca atgatgagat cagggtgagc 1080 aagcgcatct ccgaggacat gcagaatctg ctgtatcaga cccggtgttc catggtggag 1140 tactttgaca agttcaacaa taacgagttc tactatgtga tccagaagta ctctaacgac 1200 ttcatcaaga tcgccatgca ggacagcgag ttcggccgcc tgaacggcaa gaagagcatc 1260 aatctgctgc tgtccatcaa ggagatcaag ggcgagaagg tggacatcga tggcatcaag 1320 aatagagtga tctccgccct gaccgacgat aacgtgacaa agctgtctgg caatgagtac 1380 tattttctgg tgggcaacct ggccatgtac ctggtgagca agtccaagac ctggaagaag 1440 acattcgccc tgaccgatcc atatacaaag gcccggaaca ccaagaagct gaagatggcc 1500 ctgtttatcg acttcgatag atataactac gacatctttc tggagaatgg catcctgaag 1560 aaggccttca gcctggccca gaattgtgag gatatcgtga tgtccaataa cgaccagcag 1620 atggtgctga tcggcatgat gacaaagaac atcatcaaga agcccggcga gaaggacgag 1680 atcagcgagt aa 1692 <210> 233 <211> 942 <212> DNA <213> Campylobacter fetus subsp. testudinum Sp3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(942) <223> Cas7 <400> 233 atgaagctgg ccaaccgcat ctacggcatc atcggcatca agagcaccat ggccaattgg 60 aacgccgact tttctggccg ccccaagagc acaggcaatg gcgacatctt cgccagcgat 120 aaggccctga agtatcctat gaagaagatg tgggagtcct acggcaagaa catcctgttc 180 gtgaagtccc tgaagcaggg caagtctaag gacggcaacg ataagctggt gccaaatacc 240 ctgggcgagc ggtatggcct gctgtttggc gatatcaaga aggccaagag cacaaaggag 300 gtgctgtcca atctgttcaa ctgcatcgat gtgaagaatt ttggcgccac cttcccagag 360 gacggctaca acctgagcat cacaggcgcc gtgcagatcg gccagggctt taacaagttc 420 ggcgacatca acatcgaggt gcagaatatc ctgtccccct tcgccgatag ccgggccaag 480 gagaagaatg agaacggaga ggacgcctcc cagtctaccc tgggcacaaa gatcgtgacc 540 gatgaggccc actactttta tggcttctgt atcaaccccc tggcctataa tgactacaag 600 gagatcctgg gcgacgattt tggctataat gaggacgatt acgccgagtt caagaaggcc 660 gccagattct gcgccaccta ctttaatagc aactccaagt ttggctgtga gaacgagttt 720 gccatgttca tcgagacagc cgtggacgcc tatctgcctg atctgagctc ctacatggac 780 ttcatctgca aggataagaa caggctggtg aatctggaga agatcgagaa gatgatcgag 840 tctagcgatg tgaagaaggt ggagatctac tataatcctc tgtccctgga cgtggagacc 900 aagtttgaca agttcgatat ctattctggc aacaagatct aa 942 <210> 234 <211> 762 <212> DNA <213> Campylobacter fetus subsp. testudinum Sp3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(762) <223> Cas5 <400> 234 atgaaggcca tcagctttaa gctgtccggc aagtttgccc acttcaagaa gccagacgtg 60 aacgagtacg tgtacttcac ctacaacaat atccccaagc ctacactgct gggactgctg 120 ggagcaatca tcggcctgaa gggctatgcc cagaagacct acaacaataa gaaggacaag 180 aagagcctgc tgaacaatga gaatcggtcc aacgagcctg agttctatga gagactgaag 240 cacctgaaga tctgcatcat cccactggtg aagtacggca agttttctaa gaagatccag 300 gtgttcaaca attctgtggg atatgccagc accgaggagg gaggaaatct gatcgtgagg 360 gagcagtggc tggagaaccc cagctggcag atcctgatcg aggacgatgg ctctgccgag 420 tttgagacaa tcagccagta tctgttcgat aagaaggcca agtttatccc ttacctgggc 480 aagaatgacc acttcgccga tatctccgag gtggagaaga tcgacctggc cgagtccaag 540 aaggataaga tcgtgatcaa gtctctgttc ctggacaacc tggccaagca ggtggacgat 600 cccgacgatg agatctctta tctgtttaac gagttctacc ctatcggctt caatgagctg 660 atgttttaca agctggagaa gaccaccttc accaatcaga tctgtcaggc catggatggc 720 aagtggtatg agttcaagga cggcaccatc tgcttctttt aa 762 <210> 235 <211> 240 <212> PRT <213> Campylobacter fetus subsp. testudinum Sp3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(240) <223> Cas6 <400> 235 Met Asp Val Lys Ile Tyr Gln Leu Lys Val Phe Leu Lys Leu Asn Gln 1 5 10 15 Asn Val Asp Phe Ile Asn Ser Pro Glu Phe Leu Ser Thr Asn Leu His 20 25 30 Lys Ala Met Leu Gly Asp Glu Ala Leu Arg Ser Ile His Met Gln Arg 35 40 45 Tyr Leu Lys Pro Tyr Ser Ile Gly Phe Leu Tyr Ser Met Lys Gly Lys 50 55 60 Lys Asp Thr Phe Val Ser Gly Glu Asp Met Tyr Phe Tyr Val Arg Ser 65 70 75 80 Ile Asp Glu Ser Phe Ile Ser Lys Leu Arg Ile Cys Leu Glu Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Leu Gly Phe Asn Val Tyr Leu Ser Lys Phe Glu Asn Leu Asp 100 105 110 Ile Lys Gln Val Asp Arg Leu Tyr Thr Met Ser Pro Ala Thr Ile Val 115 120 125 Leu Lys Glu Gly Asp Lys Thr Ile Pro Trp Arg Arg Glu Asn Ser Asp 130 135 140 Ile Thr Val Leu Lys Glu Ala Leu Ile Ser Asn Leu Lys Asn Lys Tyr 145 150 155 160 Glu Tyr Phe Leu Asp Lys Lys Ile Glu Ile Lys Asp Asp Ile Ile Glu 165 170 175 Leu Ile Glu Ile Lys Thr Asn Arg Ala Phe Ala Phe Arg Tyr Lys Asn 180 185 190 Gly Lys Ile Tyr Ala Tyr Arg Tyr Gln Ile His Phe Ser Gln Asn Arg 195 200 205 Leu Ala Gln Glu Phe Ala Asn Ile Ala Met Ile Leu Gly Val Gly Val 210 215 220 Lys Asn Thr Leu Gly Phe Gly Phe Cys Met Arg Ser Asn Asn Ala Val 225 230 235 240 <210> 236 <211> 563 <212> PRT <213> Campylobacter fetus subsp. testudinum Sp3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(563) <223> Cas8 <400> 236 Met Leu Phe Glu Leu Leu Asp Glu Phe Lys Lys Gln Leu Glu Lys Asn 1 5 10 15 Lys His Ile Val Thr Gln Asn His Ile Leu Lys Asp Gly Val Tyr Ala 20 25 30 Arg Ile Ser Asp Glu Lys Cys Glu Ile Phe Tyr Val Lys Thr Ile Thr 35 40 45 Glu Lys Ile Gly Lys Thr Ala Gln Lys Arg Thr Ile Leu Tyr Lys Gln 50 55 60 Asn Gly Asp Ile Ala Leu Asn Asp Asp Met Gln Trp Phe Glu Gln Ala 65 70 75 80 Asp Tyr Leu Ser Phe Leu Trp Asp Met Asn Lys Ala Val Leu Pro Asn 85 90 95 Lys Lys Phe His Ser Ile Asn Phe Leu Ser Leu Phe Phe Lys Leu Glu 100 105 110 Glu Ser Glu Tyr Val Lys Glu Asn Leu Glu Glu Tyr Phe Asp Ile Phe 115 120 125 Arg Asp Tyr Ser Ala Phe Asn Lys Ala Lys Asp Lys Glu Ile Leu Ser 130 135 140 Phe Tyr Met Asp Tyr Ile Lys Asp Glu Asn Arg Gln Asn Leu Ile Thr 145 150 155 160 Asn Ser Val Val Leu Ser Lys Lys Tyr Phe Asn Asp Ile Asn Asp Phe 165 170 175 Ala Val Gln Asn Asn Phe Lys Lys Cys Tyr Ile Lys Phe Phe Ile Asp 180 185 190 Lys Asp Phe Glu Ile Tyr Glu Lys Glu Ser Gln Ile Tyr Ile Asp Leu 195 200 205 Lys Ile Tyr Asn Ser Asn Glu His Asn Ile Lys Tyr Asn Asn Glu Ile 210 215 220 Phe Gly Leu Ser Asn Phe Asn Met Gly Met Asn Ser Lys Lys Pro Phe 225 230 235 240 Leu Glu His Lys Asn Arg Leu Phe Lys Ile Pro Tyr Ala Ile Ser Gln 245 250 255 Lys Asp Ala Leu Ala Ser Lys Met Leu Phe Asp Trp Leu Gly Ser Gln 260 265 270 Asn Lys Arg Ile Ile Arg Asp Phe Asn Ser Ile Phe Ile Ser Lys Phe 275 280 285 Asn Lys Gln Ser Lys Ala Val Val Ser Asp Phe Glu Tyr Val Pro Val 290 295 300 Asp Lys Asn Lys Phe Lys Phe Asp Lys Phe Lys Leu Lys Asn Phe Met 305 310 315 320 Asn Ile Glu Asn Gly Glu Lys Glu Ile Leu Ser Phe Asp Asp Phe Lys 325 330 335 Gln Val Ile Asp Glu Gln Leu Tyr His Lys Cys Leu Phe Gly Asn Leu 340 345 350 Tyr Asn Asp Glu Ile Arg Val Ser Lys Arg Ile Ser Glu Asp Met Gln 355 360 365 Asn Leu Leu Tyr Gln Thr Arg Cys Ser Met Val Glu Tyr Phe Asp Lys 370 375 380 Phe Asn Asn Asn Glu Phe Tyr Tyr Val Ile Gln Lys Tyr Ser Asn Asp 385 390 395 400 Phe Ile Lys Ile Ala Met Gln Asp Ser Glu Phe Gly Arg Leu Asn Gly 405 410 415 Lys Lys Ser Ile Asn Leu Leu Leu Ser Ile Lys Glu Ile Lys Gly Glu 420 425 430 Lys Val Asp Ile Asp Gly Ile Lys Asn Arg Val Ile Ser Ala Leu Thr 435 440 445 Asp Asp Asn Val Thr Lys Leu Ser Gly Asn Glu Tyr Tyr Phe Leu Val 450 455 460 Gly Asn Leu Ala Met Tyr Leu Val Ser Lys Ser Lys Thr Trp Lys Lys 465 470 475 480 Thr Phe Ala Leu Thr Asp Pro Tyr Thr Lys Ala Arg Asn Thr Lys Lys 485 490 495 Leu Lys Met Ala Leu Phe Ile Asp Phe Asp Arg Tyr Asn Tyr Asp Ile 500 505 510 Phe Leu Glu Asn Gly Ile Leu Lys Lys Ala Phe Ser Leu Ala Gln Asn 515 520 525 Cys Glu Asp Ile Val Met Ser Asn Asn Asp Gln Gln Met Val Leu Ile 530 535 540 Gly Met Met Thr Lys Asn Ile Ile Lys Lys Pro Gly Glu Lys Asp Glu 545 550 555 560 Ile Ser Glu <210> 237 <211> 313 <212> PRT <213> Campylobacter fetus subsp. testudinum Sp3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(313) <223> Cas7 <400> 237 Met Lys Leu Ala Asn Arg Ile Tyr Gly Ile Ile Gly Ile Lys Ser Thr 1 5 10 15 Met Ala Asn Trp Asn Ala Asp Phe Ser Gly Arg Pro Lys Ser Thr Gly 20 25 30 Asn Gly Asp Ile Phe Ala Ser Asp Lys Ala Leu Lys Tyr Pro Met Lys 35 40 45 Lys Met Trp Glu Ser Tyr Gly Lys Asn Ile Leu Phe Val Lys Ser Leu 50 55 60 Lys Gln Gly Lys Ser Lys Asp Gly Asn Asp Lys Leu Val Pro Asn Thr 65 70 75 80 Leu Gly Glu Arg Tyr Gly Leu Leu Phe Gly Asp Ile Lys Lys Ala Lys 85 90 95 Ser Thr Lys Glu Val Leu Ser Asn Leu Phe Asn Cys Ile Asp Val Lys 100 105 110 Asn Phe Gly Ala Thr Phe Pro Glu Asp Gly Tyr Asn Leu Ser Ile Thr 115 120 125 Gly Ala Val Gln Ile Gly Gln Gly Phe Asn Lys Phe Gly Asp Ile Asn 130 135 140 Ile Glu Val Gln Asn Ile Leu Ser Pro Phe Ala Asp Ser Arg Ala Lys 145 150 155 160 Glu Lys Asn Glu Asn Gly Glu Asp Ala Ser Gln Ser Thr Leu Gly Thr 165 170 175 Lys Ile Val Thr Asp Glu Ala His Tyr Phe Tyr Gly Phe Cys Ile Asn 180 185 190 Pro Leu Ala Tyr Asn Asp Tyr Lys Glu Ile Leu Gly Asp Asp Phe Gly 195 200 205 Tyr Asn Glu Asp Asp Tyr Ala Glu Phe Lys Lys Ala Ala Arg Phe Cys 210 215 220 Ala Thr Tyr Phe Asn Ser Asn Ser Lys Phe Gly Cys Glu Asn Glu Phe 225 230 235 240 Ala Met Phe Ile Glu Thr Ala Val Asp Ala Tyr Leu Pro Asp Leu Ser 245 250 255 Ser Tyr Met Asp Phe Ile Cys Lys Asp Lys Asn Arg Leu Val Asn Leu 260 265 270 Glu Lys Ile Glu Lys Met Ile Glu Ser Ser Asp Val Lys Lys Val Glu 275 280 285 Ile Tyr Tyr Asn Pro Leu Ser Leu Asp Val Glu Thr Lys Phe Asp Lys 290 295 300 Phe Asp Ile Tyr Ser Gly Asn Lys Ile 305 310 <210> 238 <211> 253 <212> PRT <213> Campylobacter fetus subsp. testudinum Sp3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(253) <223> Cas5 <400> 238 Met Lys Ala Ile Ser Phe Lys Leu Ser Gly Lys Phe Ala His Phe Lys 1 5 10 15 Lys Pro Asp Val Asn Glu Tyr Val Tyr Phe Thr Tyr Asn Asn Ile Pro 20 25 30 Lys Pro Thr Leu Leu Gly Leu Leu Gly Ala Ile Ile Gly Leu Lys Gly 35 40 45 Tyr Ala Gln Lys Thr Tyr Asn Asn Lys Lys Asp Lys Lys Ser Leu Leu 50 55 60 Asn Asn Glu Asn Arg Ser Asn Glu Pro Glu Phe Tyr Glu Arg Leu Lys 65 70 75 80 His Leu Lys Ile Cys Ile Ile Pro Leu Val Lys Tyr Gly Lys Phe Ser 85 90 95 Lys Lys Ile Gln Val Phe Asn Asn Ser Val Gly Tyr Ala Ser Thr Glu 100 105 110 Glu Gly Gly Asn Leu Ile Val Arg Glu Gln Trp Leu Glu Asn Pro Ser 115 120 125 Trp Gln Ile Leu Ile Glu Asp Asp Gly Ser Ala Glu Phe Glu Thr Ile 130 135 140 Ser Gln Tyr Leu Phe Asp Lys Lys Ala Lys Phe Ile Pro Tyr Leu Gly 145 150 155 160 Lys Asn Asp His Phe Ala Asp Ile Ser Glu Val Glu Lys Ile Asp Leu 165 170 175 Ala Glu Ser Lys Lys Asp Lys Ile Val Ile Lys Ser Leu Phe Leu Asp 180 185 190 Asn Leu Ala Lys Gln Val Asp Asp Pro Asp Asp Glu Ile Ser Tyr Leu 195 200 205 Phe Asn Glu Phe Tyr Pro Ile Gly Phe Asn Glu Leu Met Phe Tyr Lys 210 215 220 Leu Glu Lys Thr Thr Phe Thr Asn Gln Ile Cys Gln Ala Met Asp Gly 225 230 235 240 Lys Trp Tyr Glu Phe Lys Asp Gly Thr Ile Cys Phe Phe 245 250 <210> 239 <211> 95 <212> DNA <213> Campylobacter fetus subsp. testudinum Sp3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(95) <223> CRISPR <400> 239 gtttgctaat gacaatattt gtgttaaaac aagcgtagca ccaaaagaag cgtatgaaag 60 cataggtttg ctaatgacaa tatttgtgtt aaaac 95 <210> 240 <211> 771 <212> DNA <213> Odoribacter splanchnicus DSM 20712 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(771) <223> Cas6 <400> 240 atgcgtttga aattggtact taaaattgtg gaaggaaccg ttttaccttg taattatatg 60 tatgaattgt caagttgttt gtacaaggta ttgaatgaag gtaatccggt ttttactgcc 120 tggctacatg ataaaggata ttgtaaggaa aagaaagcat ttaaattatt taccttttcg 180 aatttctatt ttccgtgttt cagaatcgag ggggatcgga tttttgtttt ggcggatacg 240 gcccagttga ttgtgtcgtt ctatccgata gaagcaattg atgcttttgt aatgggtctg 300 tttaagaaca ggcaattgga ggttggtgac cggaaatcga gggtccgctt tgaagtcttt 360 aacttagagc ggcaggctga gccggaattc acttcccgga tgttttttaa aactctatcg 420 cctatgttta ttgaagagca attaccggaa acccggaaag cgatacatct ttcaccgggg 480 aatccgaagt ttgcagaatt gttgcatttg aatctgctgg ataaatacag ggtgttttat 540 ggacaggaac ccgatccgtc ctggcctctg acccgcttgc atttgttgtc tgagcccaag 600 cctaaaacaa ttgtgctgaa ggtaggtact ccggaggaaa ccagaatgaa aggatatact 660 ttccgctttg agctggaagg acagccggaa ttattgcgtc tgggttacga aggtggtttc 720 ggacgattga acagccaggg attcggttgt gtggaagtgt tgaaacagtg a 771 <210> 241 <211> 1845 <212> DNA <213> Odoribacter splanchnicus DSM 20712 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1845) <223> Cas8 <400> 241 atgcttcagg aaattaataa ctttatgaat agtttgcctg ctgagttaaa gcaggcgggg 60 ctgaagccta aagaaggact gcatgttttg ctgaaaatcc aggaaaagga gggaactcat 120 tttatggacg aacagtctgt ctgccgggtt tgtctgaccc ggaaagcgac agaattcgat 180 tatccttttt tacagcattg tgctgagctg gctcaggtgg gatggtgtgt gaataccaat 240 aaatgtttcg atcttccggc taaggggctg cattcctgtt ctccttattg cattgccttg 300 aaacgggaat ctctggaagg aggaggaaaa tatgcgaaag ataagactaa aatctacgac 360 cgtatcgata cttattttgc taatgcttta tcctacgtcg aagaggatag cgagaaagaa 420 agaataaggg tttttcagca ttttatcaac tccaaagaga aactgaatgc tttatttgcc 480 tgttttcagt cagaggttga tgaagtcaag gataaggagt acattattct ttatttggag 540 gaggagatgg aaaaatatcg ccgggttcat gaaaaatatt tgtcggacaa attattcaat 600 accaatgaat acaatatttc ggtagaaaat caactctatg ggaccagcga tttcctgaat 660 ggatttccaa ctaaaaagcc ttttttatcc catcagtcgg ctgttttcga tattgccggg 720 cggattaccg gagagatggc tggaaatctc catgattttc aggaaatcat gcgccggaat 780 gttttacccc gtcctttgcc gttgtttgtt taccgggaag agttgcagac cgaaatgctt 840 gcggttttct cccggtattt ggcggatggc aagaggatcg gttatcagga gatcatacgg 900 gagctttata aaaatcatca ggacgatatc ggtgattatt atttattgta ttactatggc 960 gatacggttt gtgatttcga ttttgtttcc cgtttccgct atcgtttgca gagtggggat 1020 aaagaaggtt ggatggtaaa agatcatttt cagatcggtt ttacggagaa aataagccat 1080 gtatttgagt tggaggaaaa agtgttacgc gaaatattta ataactcgtt gattacacga 1140 acgaaagccg gagatacaca acgtaaatat ttcgatgaat tagaaccgaa atactgtaaa 1200 tcggaaaata actatttatt ggtattgaag tatcggcaag ctttttatga ttatatctat 1260 aaatccagat tacaggctgt tacccgtcct atgttcgatc atattttatt gaccggtatt 1320 ttggaggata tccgtttgga tgaattaaaa ggaaaccagc atacccaacg ctgggggatt 1380 ttgtctaaaa tgaacatttg gttcagtttg gctgaacgtt ttgatttaca atttaaaaat 1440 acagatacta tggcaagtaa attggaagaa cagagagtgt ttatggttgc cttatcgcaa 1500 ggtgaggcta tattggaaaa cgacgaacaa tatgcttttg cagccggaca ggtgatttac 1560 tatttattac ataagagtaa gacggcagac aaaagttata aacggctgga gccttttttg 1620 cagcaggtgc acgcctctga attgaataaa gcgattgccc ggcttttcga tacctataag 1680 catgagaatt tttcaggcaa tttccgtcat ccgtttgcat cggttatggc ctatcagacc 1740 caagcgaata tgcgggacta cctgcccatg atgctggccg ggattttttc ggataatctg 1800 ctttttagcg ttaataaatc agaagaaaca aatgaagaaa actaa 1845 <210> 242 <211> 939 <212> DNA <213> Odoribacter splanchnicus DSM 20712 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(939) <223> Cas7 <400> 242 atgagtaata catttaaaaa cagagtgttt ggttgtgtgg taatcaaatc tgtcaattcc 60 aattataatg cggacttttc acatcagccc cgtactttgc ccgatgggtc ggtatatgca 120 acagataaag cattgaaata taccgttcgg aattatatag ataaaaatta tccggaagac 180 aaggtatttt attttaaaag cctgaatgga gatatgcagc cccgggattt agaccagaat 240 tatgcccgtt tcttcggcga ttatccgaaa gcggataaga aagaggcggt caaggcgcgt 300 aaagtgattc tgggaaattt gttgagctgt ctggatgtac ggttatttgg cggaactttt 360 gccagtaaaa cggccaattt gtctattcat ggtgttgtac aaccgacgca tggggtgaac 420 cgatatgtgg aagggattat ctattcagag cagattgctt cgcctttccg gaactccaat 480 gataatagta cggattcgat gcaaacgact ttaggaaccc aatttaaatt acaggaaggc 540 cattacgtac atcatttttc agtcaatccc ggtaatttag acgaactgac tgaatttgtc 600 gataatggaa gattaacggg ggaggatatt 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aggttcaaag 240 gttgcaccgt accctcttca cgataagctt agctatgttg ctggtgattt tgtcaaatac 300 ggaggaaaga tcaaaaatca agacgatgct ccttttgaca cctatataaa aaatttaggt 360 gagtgggcca attccccgta tgcgacggag aaggtgaagt gcatttatac gtatttgaaa 420 aaagggcgat tgattgaaga cttggtcgac gcaggtgtcc ttaagctcga tgaaaaccaa 480 caattgatcg aaaaatggga aaagcgatat gaagagctac tgggggaaaa gcccgctatt 540 ttttcaagtg gtgctaccga tcaagcgagt gcttttgtga gattcaatgt ttttcaccct 600 gagtcgatcg acgatgtttg gaaagacaaa gagatgtttg attcatttat ttctttttat 660 aatgacaaat taggcgaaga ggatatttgt ttcgtcacag ggaacaggct tcctagcaca 720 gaacgccatg caaataagat ccgtcatgcg gcggataagg caaaattaat atcagctaat 780 gataactctg gttttacctt ccgtgggcga tttaaaacaa gtcgagaagc cgtgggcatt 840 agctatgagg tttctcaaaa ggcccataat gctttgaaat ggctcattca tcgccaaagt 900 aaaagcattg atgatcgtgt gtttcttgtt tggagtaatg ataacagtct tgtgcctaac 960 ccagatgagg atgcggtaga catcatgaag catgccaacc gtgagttaga aagagatcca 1020 gatacagggc aaatttttgc aggtgaagtt aagaaagcga tcggcggcta tcggagtgac 1080 ttgaactatc aaccagaggt tcatattctc gttcttgatt cagcaacgac tgggagaatg 1140 gccgttcttt attatcgaag tctcaataaa gaactctatt tgaatcgttt agaggcgtgg 1200 catgattcgt gtgcatggga gcaccggtat cgaagggacg aaaaggagtt tatttcgttt 1260 tatggggcac ctgcaacgaa ggatattgca tttgccgctt atggaccgag agcgagtgaa 1320 aaggtcataa aagacttaat ggaacgaatg cttccttgta ttgtcgatgg gcgtcgggtc 1380 ccaaaggata ttgttagaag tgccttccaa cgggcttcaa atccggtctc gatggagcgc 1440 tgggaatggg aaaaaacatt aagtatcaca tgtgccctta ttagaaaaat gcacattgaa 1500 caaaaggagg aatggggcgt gccacttgat aaaagctcaa cggaccgcag ctacttgttt 1560 ggacgcttgc tggctgttgc tgatgtgttg gagcgagggg ctctcggtaa ggacgaaaca 1620 agagctacca atgctattcg ttatatgaac tcatattcaa aaaatccagg acgtacgtgg 1680 aaaacgattc aggaaagctt gcagccgtac caagccaaac tcggaactaa agcgacttat 1740 ttatcaaagc tagtcgacga gatcggcgat caatttgagc caggggactt taacaacaac 1800 cctctgacgg aacaatattt gcttgggttt tatagtcaac gtcgtgagct ttataagaaa 1860 aaagaggagg agaccaacca atga 1884 <210> 255 <211> 852 <212> DNA <213> Bacillus halodurans C-125 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(852) <223> Cas7 <400> 255 atgactatac ttgaccacaa aattgatttt gctgttattc tatctgttac taaagccaat 60 ccgaatggag atccccttaa cggaaaccgc ccacgtcaaa attacgatgg gcatggggag 120 atttctgatg ttgcgatcaa gcgtaaaatt cgcaatcgtt tgctagatat ggaagaacct 180 atttttgttc aatctgatga ccgtaaagca gattctttta aaagtttgcg agatcgtgca 240 gattcgaatc ctgagttagc caaaatgctg aaagcaaaaa atgcgtctgt tgatgaattt 300 gcaaaaattg cttgtcaaga gtggatggat gtgcgtagtt ttggacaagt atttgcgttt 360 aaaggctcca atttatccgt tggtgttcgc ggtcctgtgt cgattcacac agcaacgagc 420 attgatccta ttgatattgt tagcacccag attacaaaaa gtgttaactc ggtcacgggt 480 gataaacgta gctcagacac catgggaatg aagcaccgtg tcgactttgg tgtttatgtg 540 ttcaaaggga gcattaacac gcagcttgca gagaaaacag gctttacgaa tgaagatgcg 600 gaaaaaatca agcgggcact catcaccctg tttgaaaatg acagctcttc cgcccgccct 660 gatgggagca tggaggtcca taaagtgtac tggtgggagc attcttcaaa gcttggacaa 720 tattcttctg ccaaagtgca tcgttcatta aaaattgaat caaagacgga tacacctaag 780 agttttgatg 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catcgtcttc gacaacgtgc ggcgcaacga ggtcagttcg 240 aagataccca agcccaatcc ggcaacggcc atgcgcgaca ggaagccgct ctactttctg 300 gtcgatgacg gcagcaaccg ccagcaacgg gcggcgaccc tgctgcgcaa cgtcgactat 360 gtcatcgaag cccacttcga actgacagac aaggccggag cggaagacaa cgcgggcaag 420 catctggaca tcttcaggcg tcgtgcgcgc gccgggcagt cgttccagca gccatgcctc 480 ggctgccgcg agtttccggc gtcgttcgaa ctgctggagg gggatgtgcc gctctcgtgc 540 tacgcgggcg agaagcgcga ccttggctac atgctgctcg acatcgactt cgaacgcgac 600 atgacgccgc tgttcttcaa ggccgtcatg gaagacggag tgataacgcc cccgtcgcgc 660 acgtcaccgg aggtgagggc atga 684 <210> 264 <211> 1839 <212> DNA <213> Desulfovibrio vulgaris <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1839) <223> Cas8, Desulfovibrio vulgaris RCH1 plasmid pDEVAL01 <400> 264 atgatcctgc aggcattgca tggctattac cagcgcatga gcgcagaccc cgatgcgggg 60 atgccgccct acgggaccag catggagaac atctcgttcg cgctggtgct ggatgcgaaa 120 gggacgctac ggggcatcga ggacttgcgg gaacaggaag gcaagaagct gcggccccgc 180 aagatgctgg ttcctatcgc ggaaaagaag gggaacggca tcaaaccgaa cttcctgtgg 240 gagaacacca gttatattct gggggtggac gccaagggca agcaggaacg tacagacaag 300 tgccacgccg cgttcattgc ccacatcaag gcctactgtg acactgcaga ccaagacctt 360 gccgccgttc tgcagttcct tgaacacggc gaaaaagacc tctccgcttt tccggtttcg 420 gaagaggtca tcggctccaa tatcgtcttt cgcatcgagg gcgaaccggg cttcgtccat 480 gagcgtccgg ctgcgcggca ggcttgggcc aactgcctga accggcggga gcaagggcta 540 tgtggtcaat gcctcatcac cggggagcgc cagaagccga ttgcccaact ccatccgtcg 600 atcaaaggcg ggcgagacgg cgttcgcggt gcacaggctg ttgcctcgat agtgtccttt 660 aacaacaccg cctttgaatc ttacgggaaa gaacagtcga tcaatgcacc cgtcagtcaa 720 gaagcggcat tctcttatgt cacagccctg aattacctgc tcaacccgtc aaatcgacag 780 aaggtcacca tcgctgacgc caccgtggtc ttctgggccg aacgcagcag cccggcagag 840 gacatctttg caggcatgtt cgacccgcct tccaccacgg cgaaaccgga gtcctcgaac 900 gggacgccgc cggaagacag tgaagaaggc agccagcctg acacagccag agacgacccc 960 catgccgctg ccagaatgca cgacctgctt gtggccatcc gttccggcaa gcgcgccacg 1020 gacatcatgc ccgacatgga cgagtccgtg cgcttccatg tgcttggcct gtcgcccaac 1080 gccgcccgcc tgtccgtccg cttctgggag gtcgataccg tcggtcacat gctggacaag 1140 gtggggcggc actaccgtga actcgagatc attccgcaat tcaacaacga gcaggagttc 1200 ccgtctcttt caaccctgct gcggcagact gccgtcttga acaagaccga gaacatctcg 1260 cctgtacttg caggcgggct attcagggcc atgctcaccg gcgggcccta tccgcaaagc 1320 ctgttgcccg ccgtgcttgg acgcatccgc gccgagcacg ccagaccaga agataaaagc 1380 cgctataggc ttgaagttgt gacgtattat cgagccgcct tgatcaaggc gtatctcata 1440 agaaacagaa agctggaggt gcccgtgtct ctcgaccccg caagaacaga ccgcccgtac 1500 ctgctcggac gactcttcgc cgttctggaa aaagcgcagg aagatgccgt gcccggtgcg 1560 aacgccacca tcaaggaccg ctatctggcc tccgcatcgg ccaatccggg gcaggtattc 1620 cacatgctgc tcaagaatgc gtccaaccac acggccaaac tccgcaagga ccctgaaaga 1680 aaggggtcgg ccatccacta cgaaatcatg atgcaagaga ttatcgacaa catcagcgat 1740 tttccggtga ccatgtcgtc cgacgaacaa ggcctgttca tgatcggcta ctaccaccag 1800 cgcaaggccc ttttcaccaa gaagaacaag gagaactag 1839 <210> 265 <211> 873 <212> DNA <213> Desulfovibrio vulgaris <220> <221> misc_feature <222> (1)..(873) <223> Cas7, Desulfovibrio vulgaris RCH1 plasmid pDEVAL01 <400> 265 atgaccgcca ttgccaacag atacgagttc gtgctgcttt tcgatgtgga gaacggcaac 60 cccaacggcg accccgacgc gggcaacatg ccgcgcatcg accccgagac cgggcatggt 120 ctggtcaccg acgtgtgcct gaagcgcaag atacgcaacc atgtggccct gacaaaagaa 180 ggtgccgagc ggttcaatat ctatattcag gaaaaggcca ttctcaacga aacccacgaa 240 cgcgcctaca cggcctgcga cctgaaaccc gaacccaaga aactgcccaa gaaggtcgaa 300 gacgccaaga gggtcaccga ctggatgtgc acgaacttct acgacatccg cacgttcggc 360 gccgtcatga ccacagaggt caactgcggg caggtgcgcg gccccgtgca gatggccttt 420 gccagaagtg tggaacccgt cgtgccgcaa gaggtgagca tcacccgcat ggcagtcacc 480 acgaaggcag aggccgaaaa gcagcaggga gacaaccgca ccatgggtcg caagcacatc 540 gtgccctacg gcctgtatgt ggcgcacggc ttcatctccg caccgctggc agagaagaca 600 ggcttctccg atgaagacct gacgctgttc tgggacgccc tcgtcaacat gttcgagcac 660 gaccgttcgg cggcacgcgg cctcatgagc agccgcaaac tcatcgtctt caagcaccag 720 aacaggctcg gcaacgcccc cgcccacaag ttgttcgacc tcgtgaaggt cagccgtgca 780 gagggttcgt ccggccccgc ccggtcgttt gccgactatg cggtgacagt ggggcaggcc 840 cccgaaggcg tagaggtcaa agagatgctg tag 873 <210> 266 <211> 684 <212> DNA <213> Desulfovibrio vulgaris <220> <221> misc_feature <222> (1)..(684) <223> Cas5, Desulfovibrio vulgaris RCH1 plasmid pDEVAL01 <400> 266 atgacccacg gagcagtgaa gacatacggc atcagactga gggtgtgggg cgactatgcc 60 tgttttaccc ggcctgagat gaaggtggag agagtgagct acgatgtgat gccaccatcc 120 gccgcaaggg gcatcctgga ggcaatccac tggaagccag ccatcagatg gatcgtggac 180 agaatccacg tgctgcgccc catcgtgttc gataatgtgc ggagaaacga ggtgtcctct 240 aagatcccta agccaaaccc agcaacagca atgagggata ggaagcccct gtattttctg 300 gtggacgatg gctccaacag gcagcagagg gcagccaccc tgctgcggaa tgtggactac 360 gtgatcgagg cccacttcga gctgacagac aaggccggcg ccgaggataa tgccggcaag 420 cacctggata tcttcaggcg ccgggcaagg gcaggacaga gctttcagca gccttgcctg 480 ggctgtcgcg agtttccagc ctccttcgag ctgctggagg gcgacgtgcc actgtcttgc 540 tacgcaggcg agaagcggga tctgggctat atgctgctgg acatcgattt cgagagagac 600 atgaccccac tgttctttaa ggccgtgatg gaggatggcg tgatcacccc tccatctagg 660 acaagccccg aggtgcgcgc ataa 684 <210> 267 <211> 1839 <212> DNA <213> Desulfovibrio vulgaris <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1839) <223> Cas8, Desulfovibrio vulgaris RCH1 plasmid pDEVAL01 <400> 267 atgatcctgc aggccctgca cggatactat cagagaatgt ccgccgaccc tgatgcagga 60 atgccaccct acggcaccag catggagaat atctccttcg ccctggtgct ggacgccaag 120 ggcacactga ggggcatcga ggatctgcgc gagcaggagg gcaagaagct gagaccaagg 180 aagatgctgg tgcccatcgc cgagaagaag ggcaatggca tcaagccaaa ctttctgtgg 240 gagaatacca gctatatcct gggcgtggac gccaagggca agcaggagag gaccgataag 300 tgccacgccg ccttcatcgc ccacatcaag gcctactgtg acaccgcaga ccaggatctg 360 gcagccgtgc tgcagttcct ggagcacggc gagaaggatc tgtctgcctt tcccgtgagc 420 gaggaagtga tcggctccaa catcgtgttc agaatcgagg gcgagcccgg ctttgtgcac 480 gagagacctg cagcaaggca ggcctgggcc aattgtctga acaggaggga gcagggactg 540 tgcggacagt gtctgatcac cggcgagagg cagaagccta tcgcccagct gcacccaagc 600 atcaagggag gaagggacgg cgtgcgggga gcacaggccg tggccagcat cgtgtccttt 660 aacaataccg ccttcgagtc ttacggcaag gagcagagca tcaacgcacc cgtgtcccag 720 gaggcagcct tttcttacgt gacagccctg aattatctgc tgaatccttc caacaggcag 780 aaggtgacca tcgccgatgc cacagtggtg ttctgggcag agcgcagctc cccagcagag 840 gacatctttg ccggcatgtt cgatcctcca tctaccacag ccaagcccga gtctagcaac 900 ggaacccccc ctgaggactc tgaggagggc agccagccag atacagcaag ggacgatcca 960 cacgcagcag caaggatgca cgacctgctg gtggccatca gatctggcaa gagggccacc 1020 gatatcatgc ccgacatgga tgagagcgtg agatttcacg tgctgggcct gtctcctaat 1080 gcagcaaggc tgagcgtgcg gttctgggag gtggacacag tgggccacat gctggataaa 1140 gtgggcagac actataggga gctggagatc atccctcagt ttaacaatga gcaggagttc 1200 ccatccctgt ctaccctgct gagacagaca gccgtgctga ataagaccga gaacatctct 1260 ccagtgctgg ccggaggact gttcagggca atgctgacag gaggacctta cccacagagc 1320 ctgctgccag ccgtgctggg acgcatccgg gcagagcacg cacggcctga ggacaagtcc 1380 agatacaggc tggaggtggt gacctactat agagccgccc tgatcaaggc ctatctgatc 1440 cgcaaccgga agctggaggt gcccgtgtcc ctggaccctg caaggaccga taggccatat 1500 ctgctgggcc gcctgtttgc cgtgctggag aaggcacagg aggacgcagt gcctggagcc 1560 aacgccacaa tcaaggatcg gtacctggcc agcgcctccg ccaatccagg acaggtgttc 1620 cacatgctgc tgaagaatgc ctccaaccac accgccaagc tgcggaagga ccctgagaga 1680 aagggctctg ccatccacta cgagatcatg atgcaggaga tcatcgacaa tatcagcgat 1740 ttcccagtga ccatgtcctc tgatgagcag ggcctgttta tgatcggcta ctatcaccag 1800 aggaaggccc tgttcacaaa gaagaataag gagaactaa 1839 <210> 268 <211> 873 <212> DNA <213> Desulfovibrio vulgaris <220> <221> misc_feature <222> (1)..(873) <223> Cas7, Desulfovibrio vulgaris RCH1 plasmid pDEVAL01 <400> 268 atgaccgcaa tcgcaaaccg ctatgagttt gtgctgctgt tcgacgtgga gaacggcaat 60 ccaaacggcg accccgatgc cggcaatatg cctaggatcg acccagagac cggacacgga 120 ctggtgacag acgtgtgcct gaagagaaag atcaggaacc acgtggccct gacaaaggag 180 ggcgccgaga ggttcaacat ctacatccag gagaaggcca tcctgaatga gacccacgag 240 cgcgcctata cagcctgtga cctgaagcca gagcccaaga agctgccaaa gaaggtggag 300 gacgccaagc gggtgaccga ttggatgtgc acaaactttt acgatatcag 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aagtcgagcg catcagttat cctgtgatga cgccgagcgc agcgcggggg 120 gtattggaag cgatcttttg gaagcccgaa tttcgctacg aggttcgaca aatcgggatt 180 ttaagtttag gggggcaaca agcgattttg cgcaacgaac tcacaagcaa gcaaaataaa 240 aacccgatcg tgattgaaag cgccagggct caacgaacga gcttgatttt aaagaacgtg 300 gcgtattgga tagttgccga tatcatttta acaaatcgag cggttgatcc agcggccaaa 360 taccgggatc agtttaaccg acgagttgaa cgaggtcagt gtcatcatac gccatattta 420 ggaacaaggg agtttgccgc ctacttttca tctatagatg aagatgatgt tgtgaagccg 480 gtcgatatgg acattggcac aatgctgttg gattttgctt ttattgaaga cggttcgaga 540 aaagaaatgg agtttctccg ttatgaagaa acggggacgc gaacggcggt tggattcgcg 600 aagccactct tttttgaggc aaaggtagaa aacggttggc tgcatgttcc aaaagaaaca 660 tatcagcagc tgtatgcatt ggagggacaa aatgctttac gagttgattg a 711 <210> 274 <211> 1776 <212> DNA <213> Geobacillus thermocatenulatus strain KCTC 3921 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1776) <223> Cas8 <400> 274 atgcattgga gggacaaaat gctttacgag ttgattgagt tggcggctaa gttgcagagg 60 gaaaaaaaac taccaccgat ctcctataaa cctaaatcaa tcaattggat tattgattta 120 ggtggggatc aaccatattt gaaagggccg tttagaaggg gagaataccg tttggtggaa 180 gcgccgtttc ggttgaggca agggaaagtt acggaagaaa acgtaaagcc ttatttgttg 240 gctgatgatg gccgctatgt acttggcatc cctgaaagtc cagaaaaggc ggatgaagcg 300 gagttaatgc ataaagggta tgttcgatta attgaggaag cttatgagaa aacaaagttg 360 aaagaattaa aaaaagtgct ggattttttg tacagtccga tgaagaatgc gttccgtgag 420 caaattggtg ccaaggatat cgtgacgttt caagatgatg aggagtcatt gatttttgaa 480 aagagtgaaa ttcaaacatt ttgggctgaa tacttggcga gtgatttgct gtccgacgat 540 gaatgtgact gttctgtttg cgggaagcga tcggcttatg tacggtattt gcccaaccct 600 gtccagttat ttggacaatc gtgccaactg acgtcgttta ataacccgtc gtttgaatca 660 atgggcaaaa ctcaaacgaa taatgtacct gtctgcttcg ggtgtgctac tttggttgtc 720 gatacattga attatctcat tagggaagat caacatcata ctcccctgta tataagcgac 780 cgaaatattt tgcaatccca aatggccata tattgggttg atgaccaaat tgaggggagg 840 ggatgtatcc aacttgatga aaaattgttt gcatcgccaa tcgaacaatg gctttttgat 900 gaagatacaa atcaacggac tcctccccct gagttgaagc 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tatcaaagaa 600 ggagagggcg aggttattgc cgctgaacta cagaattata ttcagtcact taaccccagc 660 ttaaatccac aagccatttt tcattcaaac tacgtcagaa gaggcactat attcgaagag 720 ggagaatgcg gcattttact taatgatgat gcagtaaaag ccttggttgc tgaaacatta 780 gaacgcttag ctaatttgtc tattcgccaa gctaaaggtt atatgtacgt ggatgacatc 840 acggtggatt acaacgacag ccataaaatg atgcgtatca agcgtgatga gtcagaaatc 900 atcaatgagc agcatgcgcc atttgcacag tatttttatg caaaatag 948 <210> 323 <211> 1011 <212> DNA <213> Shewanella putrefaciens CN-32 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1011) <223> Cas5 <400> 323 atgaaaataa tcatagaata tgactcttgc tggcgtaatg cctttttagg tggttcaaat 60 aatgaacctg taccgaaaaa aggccgcgaa tttttaggct caatgacgag cttaaaaaaa 120 gaaggcaatt ttaaggtgtg tgaaaatacc ttagataccg taatgggagt actaaatcgt 180 ttaattggcg accaacgaaa gctttatcag gcgcgcagta aaatgtacga atccgcttat 240 tacttcgaag cactggaaga taaagtcagc tttatagata agccgcagtt gaccaatgaa 300 atatcattta ttcgtaatat gaatggcagt acggatcaga atgcatttac tggaatgatc 360 aaagtgtctg atcctgtttt tacctctgaa tattcacagc aattttgggg cgtgttggct 420 ctcgatttca cgcagctctg tgattttatt attaagcaat cacaagttgt aggatctatt 480 gagttaaacc cgttaagtat tatcaatcgc ttggagagcc ttaatcagga aaaagcacta 540 gaaaatagtg atgatttagc ccaagtatta aaggtactaa atgaatactt tcctgatatt 600 gaatatttaa ataataaagg tttgatcaca cctatcagca tttattgctc ggcgctttac 660 cttcagcttg cccgcttaga aactagcttt aatatgacca cagctaaaac gaaagcaggg 720 gggattagtg gaatttccaa acgaggtttc actaaaaaag acttcatgga ccgatataca 780 acgggaccca aaaaaacaat ctggggtaat ccttttatca aaaaagaaaa gataaaaggg 840 caaggtgaag tgacctccat gatgaccaaa gcaagtggtc aattggaaat tagtatcgat 900 gtggatcgag acaaagccca agaaatcaaa attttgattg aaaatgctgg ggtatcaagc 960 ttttaccttg gaaaaaaagg gctggcctat gtatcaaaca ttaagcttta g 1011 <210> 324 <211> 552 <212> DNA <213> Shewanella putrefaciens CN-32 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(552) <223> Cas6 <400> 324 atgaactcat atattgatat acggctgaag cctgatgccg aaatgcggga ggctgagctc 60 agtagtaaag tatttactaa atttcacaaa gcgttagtga cgctcaatag ccataaaatt 120 ggcattagct ttccgcaaat gaaattaagc ttagggcagt tatttcgcat tcatggtgat 180 gcgagtttat tgcatgattt acaaggcctg gattggttag gccctttggc aggatattgt 240 caggttactg ctgtttctgc cgtgcctgat cacgtgcaat atcgtattgt ttccgttaaa 300 cgcagtaatt taagtaaagc aaaattgaag cgtttaattg ccagaggcag catagataaa 360 gacggagaga aacggtacaa ggtaaaaatg ctcggccaag gatttgataa tccatatctt 420 gatctgttta gtagttccac agggcaggta tatcgtaaat tctttgagtt tagcgacatt 480 caagctcacc cccttgatgg tgagtttgat agttatggtc ttagcaaaac cgctacagta 540 ccttggtttt aa 552 <210> 325 <211> 948 <212> DNA <213> Shewanella putrefaciens CN-32 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(948) <223> Cas7 <400> 325 atgcagaagg tgaccggcat caagtccgtg gacttcaaga tcaaggccct gggccacggc 60 gtggtgaact ggaatggccc caccacactg acaggcgacg atggcaagac cgtggacaat 120 cacacactgc ctaagctgag aggctacacc aacctgacag gcaaggtgaa ggatgagacc 180 ggctacaagt ataagaagca ggccaccgac atcaatttca aggagacacc tctgtacatc 240 agccagaact gcatccggca ccacctgttt agagagcagg ccttcgatct gcactatgcc 300 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tatgtcacgg atattagacc ttaa 1014 <210> 334 <211> 603 <212> DNA <213> Acinetobacter sp. 869535 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(603) <223> Cas6 <400> 334 atgaactatt acattgaagt aacattaatg gaaaatgatc aattttctcc ttatgaatta 60 tggtcacaac tttatcctca attgcatctt gcattggttg aagccaaaaa tgctgacaat 120 aaagtgaata ttggattttc gttccctcaa taccgctttc atcaagataa aggtgttgga 180 tttataggta caaaattacg tttatttgct gagtctgaag ctgatttgaa gaaactggac 240 attcgacgtt ggcttgagcg tttagaagat tatgtacatg tcacttctat tcgtgaagta 300 cctaatgata ttaagaacta tgccatttat aagcgtaagc aagtgaaaac caatgcacaa 360 cgtttggcgc gtcaccgtgt aaaacgtggg gatattggct ttgatgaggc attagccaga 420 tacagcaatg tagttacgac aaccaacatg ccttatattg aaatgaaaag cctgagcact 480 tcagatcagc aaagtgaaaa acgttttaaa ttgtttatcg aaaagcaatc tgctgaaaaa 540 tctgaaactc aggtttttag cacttatgga ttaagttcgg tgtcatctgt accagaattt 600 taa 603 <210> 335 <211> 990 <212> DNA <213> Acinetobacter sp. 869535 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(990) <223> Cas7 <400> 335 atggccaagg tgacaggcgt gaagtccgtg gacttcaaga tcaccgccta cggctatggc 60 gtggtgaact ggaatggccc aacaagcctg accggcaatg acggcaagac agtggataac 120 cacaccctgc ccaagctgag aggcttctcc aatctgtctg gcagggtgaa ggaggagaca 180 ggctacaagt ataggaagga ggcctctgac atcgacttca acgagacccc tctgtacatc 240 agccagaact gcatcaggca ccacctgttt cgcgaccagt ccttcgatct gcactatgcc 300 aaggacaaga acctgatcga tgtgctggcc tctatcaccg gactgatcag gggatacgtg 360 gtgccaagct cccagtgtaa gcggacaagc cccctgctga tcaccgactt catcgatcag 420 ctgggcaacg gcaattttga gcagctgagc aatgcctcta gctccgagga gatcacacag 480 gacgatggct ccaagaccta caagcgcggc gagaacagca tcttttccaa gaccacattc 540 ggcgacaccg agtacatcgc ctatggctcc atctctatcg agcagctgca gtttatctcc 600 ctggacaaga agttcgatag agcctctatg atcatcaagg agggcgaggg cgagaagatc 660 gccgagaggg tgcaggagtt catcaagagc ctggacccca gcaaggagcc taaggccatc 720 ttccacaaga attacgtgcg gaagggcaca atctttaacg agggcgaagt gggcatcctg 780 ctggacaata cagccatcga tatcctggtg aaggagaccc tgagcatgct ggaggagctg 840 gtcatcaagc aggccaaggg ctacatgtgc 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Polypromoter(EcoCO), CRISPR(J3/L3)_Cse2_Cas7_Cas5_Cas8_Cas6 <400> 365 ggcaccatgc atcgatcccg cgaaatgcgg ccgcttaatt aaggcatcaa ataaaacgaa 60 aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg agtccttcca 120 gtctgggcga aagcgcggtc gatcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt 180 ttgcgtttct atcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggcccct ctagagctag 240 cgagttcccc gcgccagcgg ggataaaccg ccagtgataa gtggaatgcc atgtgggctg 300 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gagtggcaga tatagcctgg tggttcaggc 360 ggcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cggagctcgc tgagcatagc ataacccctt 420 ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat atcaagtccc 480 gaagtagctg tcagactgct ggcgaccgcc gcaactagtg gcgtcatgcg tgccgtatgg 540 tctttcgcct gtagacgccc tacaagccgt actaaagtgg aaagacccgc aaaaggtatc 600 gcgattaagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat 660 ctgttgtttg tcggtgagtc cttccagtct gggcgaaagc gcggtcgatc aaattaagca 720 gaaggccatc ctgacggatg gcctttttgc gtttctatcg atcccgcgaa attaatacga 780 ctcactatag gcccctctag 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1500 gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560 gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620 agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680 aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740 agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800 cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860 accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920 aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980 ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040 cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100 gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160 tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220 agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280 tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340 caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400 ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460 gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520 gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580 gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640 aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700 ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760 acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820 ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880 tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940 tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000 cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060 gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120 ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180 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atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg 840 tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg 900 tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa ctccggatga 960 gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc 1020 tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga 1080 gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg 1140 gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac 1200 tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg 1260 tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt atcaacaggg 1320 acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta ttcggcgcaa 1380 agtgcgtcgg gtgatgctgc caacttactg atttagtgta tgatggtgtt tttgaggtgc 1440 tccagtggct tctgtttcta tcagctgtcc ctcctgttca gctactgacg gggtggtgcg 1500 taacggcaaa agcaccgccg gacatcagcg ctagcggagt gtatactggc ttactatgtt 1560 ggcactgatg agggtgtcag tgaagtgctt catgtggcag gagaaaaaag gctgcaccgg 1620 tgcgtcagca gaatatgtga tacaggatat 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cctggaagat gccaggaaga tacttaacag ggaagtgaga gggccgcggc 1800 aaagccgttt ttccataggc tccgcccccc tgacaagcat cacgaaatct gacgctcaaa 1860 tcagtggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc tggcggctcc 1920 ctcgtgcgct ctcctgttcc tgcctttcgg tttaccggtg tcattccgct gttatggccg 1980 cgtttgtctc attccacgcc tgacactcag ttccgggtag gcagttcgct ccaagctgga 2040 ctgtatgcac gaaccccccg ttcagtccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 2100 tgagtccaac ccggaaagac atgcaaaagc accactggca gcagccactg gtaattgatt 2160 tagaggagtt agtcttgaag tcatgcgccg gttaaggcta aactgaaagg acaagttttg 2220 gtgactgcgc tcctccaagc cagttacctc ggttcaaaga gttggtagct cagagaacct 2280 tcgaaaaacc gccctgcaag gcggtttttt cgttttcaga gcaagagatt acgcgcagac 2340 caaaacgatc tcaagaagat catcttatta atcagataaa atatttctag atttcagtgc 2400 aatttatctc ttcaaatgta gcacctgaag tcagccccat acgatataag ttgtaattct 2460 catgttagtc atgccccgcg cccaccggaa ggagctgact gggttgaagg ctctcaaggg 2520 catcggtcga gatcccggtg cctaatgagt gagctaactt acattaattg cgttgcgctc 2580 actgcccgct 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EPR-M <400> 1249 atgggcccca agaagaagag aaaggtaggc tccggcatgc agaactttat caattaccac 60 gtgctgatct ctcacagccc atcctgcctg aaccgcgacg atatgaatat gcagaagagc 120 gccatcttcg gaggcgtgcg gagagtgcgg atcagctccc agagcctgaa gcgggccatg 180 agaaagtccg actactatgc ccagcacctg ggcgaggcct ctatcagaac caagcacctg 240 agcggcctga gggataggct gcacgagcgc ctggcaggcc ggttcagccc cgaagtgatc 300 gacaagacaa tcaagctgct gatcgacaag gatgtgagcg tggatggaat cgtggagggc 360 gacgcagtgg caccatgggc agtggaggag tttgcatggt tctgtgagag agtgatgaac 420 gcacaggcag agggcctgga ggataaggcc ctgaccaagc agctgaagga gtccatcgcc 480 gccatgagac agacactggt gggcggcctg gatatcgccc tgtctggcag gatggccacc 540 agcggcctgc tgtccgagct gggcaaggtg gacggcgccc tggcagtggc acacgccctg 600 accacacaca ccgtggacgc cgatatcgac tggtttacag ccgtggacga tctgcaggag 660 ctgggctctg gccacctgga cacccaggag ttttctagcg gcgtgttcta cagatatgcc 720 agcctgaaca tcggacagct gcaggagaat ctgggaggag caccaaggga gcaggccctg 780 gagatcgcaa cccacgtgct gcagatgctg gccacagtgg tgccctccgc caagcagcag 840 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S4 <400> 1256 atgggcccca agaagaagag aaaggtaggc agcggcatgt cccagccagc agcaaggcca 60 cctagaacat acgtggactt tcacatcctg cagaccgtgc cacccgccaa cctgaatcgg 120 gacgatcagg gcaacccaaa ggaggcctac tatggcggcg tgcggagatc cagagtgagc 180 tcccaggcct ggaagagggc aacccgcaca cacttcgcag agcgggtgcc cgagcaggat 240 ctggcaacca gaacaaggag gatcatcggc gccctggcag acgatatcca gaagagggcc 300 ggcctggata ggcctgccgc cctgaggctg gcagacgccc tgctggcccc actggagctg 360 tccggcggca agaagaagga cgagtctgcc tacctgctgt tttatggccg gagacagctg 420 gatgcagtgg ccgccctggt ggcagaccag gcaaccgagc tgtctgccct gagcgatgca 480 gacctggcat cccgggtgaa ggagctgccc gtgagagagc agttttctac aggccaccct 540 atcgacgtgg ccctgttcgg caggatggtg gccgacatcc ctgccctgaa ggtggatgca 600 gcagcacagg tggcacacgc cctgagcaca cacgccgtgg agctggagtt tgattacttc 660 accgccgtgg acgatgagca gacagacgag gagaccggag caggaatgat cggaaccatc 720 ggcttcaaca gcgccacact gtaccgctat gcctccgtgg gactgcacca gctgctggac 780 aatctgaccg atgaggaggc cgccctgaca gccatctccg agtttgccac ctccttcgcc 840 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tacatcagcc agaactgcat caggcaccac 300 ctgtttcgcg accagtcctt cgatctgcac tatgccaagg acaagaacct gatcgatgtg 360 ctggcctcta tcaccggact gatcagggga tacgtggtgc caagctccca gtgtaagcgg 420 acaagccccc tgctgatcac cgacttcatc gatcagctgg gcaacggcaa ttttgagcag 480 ctgagcaatg cctctagctc cgaggagatc acacaggacg atggctccaa gacctacaag 540 cgcggcgaga acagcatctt ttccaagacc acattcggcg acaccgagta catcgcctat 600 ggctccatct ctatcgagca gctgcagttt atctccctgg acaagaagtt cgatagagcc 660 tctatgatca tcaaggaggg cgagggcgag aagatcgccg agagggtgca ggagttcatc 720 aagagcctgg accccagcaa ggagcctaag gccatcttcc acaagaatta cgtgcggaag 780 ggcacaatct ttaacgaggg cgaagtgggc atcctgctgg acaatacagc catcgatatc 840 ctggtgaagg agaccctgag catgctggag gagctggtca tcaagcaggc caagggctac 900 atgtgcgccg acaccgtgga ggtggactat aacgattccc acaagatgat gaggatcaag 960 cgcaatccag accaggccaa ccccgagctg cagcaggatt acgccgtgta tttcgaggca 1020 cagggcagcg gcgagggaag aggctccctg ctgacatgtg gcgacgtgga ggagaaccct 1080 ggacctccta aaaagaaacg aaaggtaggc agcggcatga attactatat cgaggtgacc 1140 ctgatggaga acgatcagtt ttctccttac gagctgtgga gccagctgta tccacagctg 1200 cacctggccc tggtggaggc aaagaacgcc gacaataagg tgaacatcgg cttctccttt 1260 ccccagtacc gctttcacca ggataagggc gtgggcttca tcggcaccaa gctgcggctg 1320 tttgccgagt ccgaggccga cctgaagaag ctggatatcc ggcggtggct ggagagactg 1380 gaggactatg tgcacgtgac atctatcagg gaggtgccca atgatatcaa gaactacgcc 1440 atctataaga ggaagcaggt gaagaccaac gcacagcgcc tggccaggca cagagtgaag 1500 cggggcgaca tcggcttcga tgaggccctg gcccgctaca gcaatgtggt gaccacaacc 1560 aacatgcctt atatcgagat gaagagcctg tccacatctg accagcagtc tgagaagcgg 1620 tttaagctgt tcatcgagaa gcagtccgcc gagaagtctg agacacaggt gttcagcacc 1680 tacggcctgt ctagcgtgtc ctctgtgcct gagtttggct ccggcgaggg aaggggctct 1740 ctgctgacct gcggcgatgt ggaggagaac cctggacctc caaagaagaa aagaaaagtc 1800 ggcggctctc agctggtgaa gagcgagctg gaggagaaga agagcgagct gagacacaag 1860 ctgaagtacg tgcctcacga gtatatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cccaacccag 1920 gacagaatcc tggagatgaa agtgatggag ttctttatga 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tctgtgctgg ccttcgagaa gaagctggtg cctagcgatg gctacctgtt tggctgccag 120 tgggagacca aggagcaggc caccccactg acactgcagg agaagagcgt gagaggcaca 180 atctccaaca ggctgaaggc cgccgtgcag aacgaccctg ccaagctgaa tgccgaggtg 240 gagaaggcca atctgcagcg ggtggatgcc tgtgcactgg gacaggacca cgataccctg 300 aagctgcact tcacactgaa ggtgctggga ggcctggccc agccatctgc ctgcaacaat 360 gccctgttta agcagtctta cagcaccgcc gtgagccagt acatcacaaa gtatggctgt 420 ttcgagctgg ccaagagata tgccaccaac ctggccaatg ccaggtttct gtggcggaac 480 agagtgggcg ccgaggagat cgaggtgcag gtgaaggccc tgaacaaggg cgccgagcag 540 acctggacct tcaacgccaa gcagttctct accaggcact ttgaccacaa cgatagccag 600 ctgaattccc tggccgacag gatcgcacag gccctggcca gcgagacaga ccacctgatg 660 ctgcagatcg attgctacgc caaagtgggc aaggcccagg aggtgtatcc ctccgaggag 720 ctggtgctgg ataagggcaa cagcaagacc aagaagtcca agatcctgta cgccgtgaac 780 gagcacgccg ccatgcactc tcagaagatc ggcaatgccc tgcgcagcat cgacacatgg 840 taccctgatt atgcctctga ggagcagagc gccggagcaa tcgcaatcga gccctacggc 900 gccgtgacca atctgggcaa ggccttcaga acccctaagg acaagcagga cttctacacc 960 ttctttgaca agtgggcaag gggagagagc ctgcctaggg aggaggatga gcactacgtg 1020 atggccgtgc tggtgcgggg aggcgtgttc ggagagtccg acaagggctc tggcgaggga 1080 agaggcagcc tgctgacctg tggcgatgtg gaggagaacc ctggacctcc taaaaagaaa 1140 cgaaaggtag gctccggcat gaattactat caggagatca cactgctgcc cgacgcagat 1200 atcgccctgg gcttcctgtg gcagaacgtg tttcagcagg tgcacatcgc cctggtggag 1260 cacaaggtgg cctctaatca gagcctggtg gccgtgggct tccctgacta cagacaggcc 1320 aagtttccac tgggcgccaa gctgaggctg ttcgccaagg agcaggtgac cctggagaag 1380 ctggacatcc acagatggct gacaaggctg gaggattacg tgcacatcaa gggcgtgaag 1440 ccagtgccct ctgacgtgac ctatgtgagc tttgtgagaa agcaggtgaa gtcccccgag 1500 cggatcgaga gagatatgca gcagaaggcc gagctgtggg ccgccaagtc tggcaagcct 1560 ctggtggagt gcctggtgga cctgcagcag tccaagccca ccgccctgtg ctctctgcct 1620 ttcatctacc tgcacagcca gcagacaaag cagaggtctc cagagaagaa cagcaagttt 1680 cccctgttca tcgagatgca gcagcagtcc acatctcagg acggcggctt cgattgctat 1740 ggcctgagct ccaaggccaa tggccagagc atgctggcca ccgtgccaca ctttggctcc 1800 ggcgagggaa ggggctctct gctgacatgt ggcgacgtgg aagaaaaccc tggacctcca 1860 aagaagaaaa gaaaagtcgg ctccggcatg aatgtgctga tcctgcctca cctgaagatc 1920 cacaacgcca atgccctgtc tagccccttt accgtgggct tccctgccat gacagcatgg 1980 ctgggattcg tgcacgccct ggagagaaag ctgtcccagg ccggcctgtc tgatctgatg 2040 ctgcacagca ccgcagtggt gtcccacagg tgcgacgtgc agacacacaa gggcgagggc 2100 gatttcgtgc acagcatcat cggcaccgcc aaccccctgg acaaggatgg cagccgctcc 2160 gcctttatcg aggaggcccg gtgtcacctg gacgtgagcc tggtcatcga gtggtccggc 2220 aatgaggagc aggtgcagca gcctgagttt accgagcagc tgcaggccgt gatcgccaca 2280 atgaaggtgg caggaggcga tgtgctggcc gtgggcaagc cttccgtgaa gtctgtgatc 2340 accgaggacg atacaggcag ggtgctgagg cagctgatgc caggatacgt gctgatcgag 2400 cggagagacc tgatgatcga tgccatgcag cagggcgacg atgcaatcga cgccctgctg 2460 ggctatctga ccgtgcacca ccactgcgag cagctggagg atcagtctgt ggtgtggcac 2520 agccagcgga agacctccgg ctggatcgtg cccatcgcca caggcttcca gggcatctcc 2580 cctctgggcg aggccaagaa ccagagagac cctagcgtgc cacacaggtt cgcagagtcc 2640 gtggtgaccc tgggagagtt tgtgatggtg cacaagatca agcacctgga cgatatcctg 2700 tggcagtacc acccagacct ggagaacgat ctgtatctgt gccagaaggt gaacgccatc 2760 aatgagcacc agggctctgg cgaaggcagg ggcagcctgc tgacatgcgg cgatgtggaa 2820 gagaaccctg gacctcccaa gaaaaagagg aaagtgggcg gctctcagct ggtgaagagc 2880 gagctggagg agaagaagag cgagctgcgg cacaagctga agtacgtgcc tcacgagtat 2940 atcgagctga tcgagatcgc cagaaaccca acccaggaca gaatcctgga gatgaaagtg 3000 atggagttct ttatgaaggt gtacggctat agaggcgagc acctgggcgg ctctaggaag 3060 ccagatggcg ccatctacac cgtgggcagc cccatcgact atggcgtgat cgtggataca 3120 aaggcctact ccggcggcta taatctgcca atcggacagg cagacgagat gcagcggtac 3180 gtggaggaga accagacccg gaataagcac atcaacccca atgagtggtg gaaggtgtac 3240 ccttcctctg tgacagagtt caagtttctg ttcgtgagcg gccacttcaa gggcaactat 3300 aaggcccagc tgaccagact gaatcacatc acaaactgta atggagccgt gctgtccgtg 3360 gaggagctgc tgatcggcgg cgagatgatc aaggccggca ccctgacact ggaggaggtg 3420 aggcgcaagt tcaacaatgg cgagatcaac ttttctgcta gcgagacacc tggcacctcc 3480 gagtctgcca ccccagagtc cggcggctct ggctctagcg gcggctctgg ctcctccgga 3540 ggaatgatcg acccagtgat cgccgccttc tttgccgaga ggaaggaggc ctggctgaag 3600 aagaatatca gcgccgcaat gtccgatgca gaggtgctgg agaagcagca ggagtgcgag 3660 cagaacttcc tgctggacaa ttggctgccc gatgcagcaa agagggcagg acagatctct 3720 gtggccagcc acccatgtac attttcccac ccctctgccc gcaagaacaa gaatggctac 3780 gtgtcctcta tcatcgccaa gaacaagcca cgcatcgacg gcttcctgcg gtctggcaac 3840 gtgagcgtgg agccagacgc cctgggaaat gcagccgccc tggacgtgta caagtttctg 3900 tccctggaga tgtctgatca gcgcagcctg ctggtgcaca tcgagcagga gagcgagctg 3960 gccaggcagc tgctggacat cccttcctgc gagtatcagg ccctgagaga tggcttcctg 4020 aagatggtgg actccgatca ggcctctgtg agctcctcta agatcaagca ggtgtacttt 4080 ccaatcgccg acggcgagta tcacctgctg tccctgctga cccactctgg ccacctgttc 4140 gagctgagga agcgcctgga cgccctgagg tttggcgatg ccgtgaagga ggcccgggag 4200 tgtaagaaga ccaaccactt ccacccagcc ggctaccagg agatcttcgg cctgaccaca 4260 atcggctttg gcggcacaaa gccccagaac atcagcgtgc tgaacaatca gaatgcaggc 4320 aaggcacacc tgctggcctc catcccccct gagctgaccc ctcgggacat cagactgcca 4380 aagacagatt tctttaagga gtccttcaac gcctggcagg ccaaggaggt gctggagtct 4440 ctgcacagac tgtttcagac cgactgcaac aatatcaatc tgagggacgg ccgcgattac 4500 agaatccagc agtatgtgga cctggtcatc gagaagatgt ggcaggtgag gctgttcctg 4560 gaggcctaca gcggcgagct gagctccgcc ctgcctctgg agcagaagat ctggctgtat 4620 ccagagtttg cagagcagag gcagcaggag gacgagtggc tggataagat catccgccac 4680 atcgcccggg gcctgatcaa ccactacagc cggtccaaag tgatcaccaa tcctgtgaca 4740 ctggccgacc aggagctgct ggccatcgag gaggtggtgg cctccaacaa ggagaatctg 4800 agatga 4806 <210> 1267 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Oceanicola sp. HL-35 <400> 1267 ctgttccccg cacacgcggg gatgaaccg 29 <210> 1268 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Pseudomonas sp. S-6-2 <400> 1268 gtgttccccg cacctgcggg gatgaaccg 29 <210> 1269 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Salmonella enterica subsp. enterica serovar Muenster strain <400> 1269 gtgttccccg cgccagcggg gataaaccg 29 <210> 1270 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Atlantibacter hermannii NBRC 105704 <400> 1270 gtgttccccg cgccagcggg gataaaccg 29 <210> 1271 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Geothermobacter sp. EPR-M <400> 1271 ctgttccccg cacccgcggg gatgaaccg 29 <210> 1272 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Methylocaldum sp. 14B <400> 1272 ctgttcccca cgtacgtggg gatgaaccg 29 <210> 1273 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Methanocella arvoryzae MRE50 <400> 1273 aaagtcccca caggcgtggg ggtgaaccg 29 <210> 1274 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Pseudomonas aeruginosa DHS01 <400> 1274 gtgttcccca catgcgtggg gatgaaccg 29 <210> 1275 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Lachnospiraceae bacterium KH1T2 <400> 1275 gtattcccca cgcacgtggg ggtaaatc 28 <210> 1276 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Klebsiella pneumoniae strain VRCO0172 <400> 1276 gtattcccca cacgcgtggg ggtgtttc 28 <210> 1277 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Streptococcus thermophilus strain ND07 <400> 1277 gtttttcccg cacacgcggg ggtgatcc 28 <210> 1278 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Streptomyces sp. S4 <400> 1278 gtcggccccg cacccgcggg gatgctcc 28 <210> 1279 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Campylobacter fetus subsp. testudinum Sp3 <400> 1279 gtttgctaat gacaatattt gtgttaaaac 30 <210> 1280 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Odoribacter splanchnicus DSM 20712 <400> 1280 cttttaattg aactaaggta gaattgaaac 30 <210> 1281 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Bacillus halodurans C-125 <400> 1281 gtcgcactct tcatgggtgc gtggattgaa at 32 <210> 1282 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Desulfovibrio vulgaris RCH1 plasmid pDEVAL01 <400> 1282 gtcgcccccc acgcgggggc gtggattgaa ac 32 <210> 1283 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Geobacillus thermocatenulatus strain KCTC 3921 <400> 1283 gttgcacccg gctattaagc cgggtgagga ttgaaac 37 <210> 1284 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Vibrio cholerae strain L15 L15_contig8 <400> 1284 gttcactgcc gtacaggcag cttagaaa 28 <210> 1285 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14 <400> 1285 gttcactgcc gtgtaggcag ctaagaaa 28 <210> 1286 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Shewanella putrefaciens CN-32 <400> 1286 gttcaccgcc gcacaggcgg cttagaaa 28 <210> 1287 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Acinetobacter sp. 869535 <400> 1287 gttcactgcc atataggcag cttagaaa 28 <210> 1288 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CRISPR repeats for Vibrio cholerae HE48 vcoHE48.contig.11 <400> 1288 gttcactgcc gcacaggcag cttagaaa 28 <210> 1289 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_F_1 <400> 1289 cgggcaggca gagctggagg cctttcaggc ccctgttccc cgcacacgcg gggatgaacc 60 gggcctgagg tgctgcctgg gcatgtgtaa agg 93 <210> 1290 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_F_2 <400> 1290 tctgtggctg tcgacatgct aagtgagggc ctctgttccc cgcacacgcg gggatgaacc 60 gtagtctcaa gtttgttcaa agctggactc ctc 93 <210> 1291 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_F_3 <400> 1291 atgagtctag gttacattca gtgcaaaaaa ccctgttccc cgcacacgcg gggatgaacc 60 ggtaagtttt taaaatatat atctaccatg tat 93 <210> 1292 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_F_4 <400> 1292 atgattggaa ttatcttcta gctcttgtcg aactgttccc cgcacacgcg gggatgaacc 60 ggtatcaaga ctgtgacttt taattgtagt tta 93 <210> 1293 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_F_5 <400> 1293 acaagttttg ggtctcagcg caggcctcag ttctgttccc cgcacacgcg gggatgaacc 60 gaggtctgtc cagatgctaa gaccaggtac ttc 93 <210> 1294 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_F_6 <400> 1294 gatttcctaa aggaatttaa caacaagacc atctgttccc cgcacacgcg gggatgaacc 60 ggttcctctg tctgatggac ttattcaatg ttt 93 <210> 1295 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_F_7 <400> 1295 tcttagaccc cagccacagg gatatttccc tgctgttccc cgcacacgcg gggatgaacc 60 gttccttcgt catccttgta atccatcagg gtc 93 <210> 1296 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_F_8 <400> 1296 atgctgctct tcatctctct tatttaccac tgctgttccc cgcacacgcg gggatgaacc 60 gcaggcaata tctggaactt ctccagtggc ttc 93 <210> 1297 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_R_1 <400> 1297 cctttacaca tgcccaggca gcacctcagg cccggttcat ccccgcgtgt gcggggaaca 60 ggggcctgaa aggcctccag ctctgcctgc ccg 93 <210> 1298 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_R_2 <400> 1298 gaggagtcca gctttgaaca aacttgagac tacggttcat ccccgcgtgt gcggggaaca 60 gaggccctca cttagcatgt cgacagccac aga 93 <210> 1299 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_R_3 <400> 1299 atacatggta gatatatatt ttaaaaactt accggttcat ccccgcgtgt gcggggaaca 60 gggttttttg cactgaatgt aacctagact cat 93 <210> 1300 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_R_4 <400> 1300 taaactacaa ttaaaagtca cagtcttgat accggttcat ccccgcgtgt gcggggaaca 60 gttcgacaag agctagaaga taattccaat cat 93 <210> 1301 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_R_5 <400> 1301 gaagtacctg gtcttagcat ctggacagac ctcggttcat ccccgcgtgt gcggggaaca 60 gaactgaggc ctgcgctgag acccaaaact tgt 93 <210> 1302 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_R_6 <400> 1302 aaacattgaa taagtccatc agacagagga accggttcat ccccgcgtgt gcggggaaca 60 gatggtcttg ttgttaaatt cctttaggaa atc 93 <210> 1303 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_R_7 <400> 1303 gaccctgatg gattacaagg atgacgaagg aacggttcat ccccgcgtgt gcggggaaca 60 gcagggaaat atccctgtgg ctggggtcta aga 93 <210> 1304 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set1_R_8 <400> 1304 gaagccactg gagaagttcc agatattgcc tgcggttcat ccccgcgtgt gcggggaaca 60 gcagtggtaa ataagagaga tgaagagcag cat 93 <210> 1305 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set2_F_1 <400> 1305 aatcagacca ctcacagcat aggagcagct ctggtattcc ccacacgcgt gggggtgttt 60 cactctgtgc atactctggg gctgggagtt acca 94 <210> 1306 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set2_F_2 <400> 1306 atttctagcc ttacttccac cttatttctt cccgtattcc ccacacgcgt gggggtgttt 60 caaatagctc ttcagttgtt tctggttaat tgag 94 <210> 1307 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set2_F_3 <400> 1307 ttctattatg ggatctgtaa cactttattg gatgtattcc ccacacgcgt gggggtgttt 60 ctcattattt ctgcctagag atggatcagg aaat 94 <210> 1308 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set2_F_4 <400> 1308 aaaataacaa gtttcatgga agaataccca accgtattcc ccacacgcgt gggggtgttt 60 cctttaatga ttgggaatct ggagttaagg gaaa 94 <210> 1309 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set2_F_5 <400> 1309 tcaccacata gtatgtccct ttaaagcatt gacgtattcc ccacacgcgt gggggtgttt 60 cacaaacttt ctgaacaata caattttaat gcat 94 <210> 1310 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set2_F_6 <400> 1310 tgacggtgga aacgttctct actacgaagt gatgtattcc ccacacgcgt gggggtgttt 60 catcagtaac atggaagtct caaatatttc agca 94 <210> 1311 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set2_F_7 <400> 1311 cccttgccct tcttgtggcc cagtggtttt caagtattcc ccacacgcgt gggggtgttt 60 cacgggagag gggaggggag gagttcagag gaag 94 <210> 1312 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set2_F_8 <400> 1312 tcacttgagg tcaggagttc aagaccaccc tgggtattcc ccacacgcgt gggggtgttt 60 cgatactggg ccagatcatt gtttctcaaa ttgc 94 <210> 1313 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set2_R_1 <400> 1313 aggcctctag gaagacaggt ggaggttagg gatttctaag ctgcctgtgc ggcagtgaac 60 aacctaatta taaggaggtt gttttggcca tg 92 <210> 1314 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set2_R_2 <400> 1314 cgctctggag ccgcagtgcg cactgcgctg cgtttctaag ctgcctgtgc ggcagtgaac 60 ttattcagga ctgactcccc ctgccagtcc ca 92 <210> 1315 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set2_R_3 <400> 1315 tatgctcata gcaagatgcc 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set3_R_1 <400> 1324 taactatatt gtaccaatag attagttttt ttgtttgttt taacacaaat attgtcatta 60 gcaaacagag agtttctata taccttttac agattcccca ga 102 <210> 1325 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set3_R_2 <400> 1325 agttcctgtc ctaaagagaa aacaggattt tcttatgttt taacacaaat attgtcatta 60 gcaaacaagg cactggaatg tatcggtgta actttaaaac ac 102 <210> 1326 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set3_R_3 <400> 1326 tcctatgggg gataagactg attccctagg tatcaggttt taacacaaat attgtcatta 60 gcaaacaaaa cttgtaaact gaagatccat tattctatta tt 102 <210> 1327 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: homolog screen target set4_F_1 <400> 1327 gtgttttaaa gttacaccga tacattccag tgccttcttt taattgaact aaggtagaat 60 tgaaacataa gaaaatcctg ttttctcttt aggacaggaa ct 102 <210> 1328 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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tattgtcggt tcatccccgc aggtgcgggg aacactccac 120 cgtgcagctc atcacgcagc tcatgcccgg ttcatccccg caggtgcggg gaacacggtg 180 tttcgtcctt tccacaagat 200 <210> 1591 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Hsa420_Pseud <400> 1591 cccagctggt tctttccgaa aaaaacggtt catccccgca ggtgcgggga acacggggac 60 agctctggaa aggggacgct cactcccggt tcatccccgc aggtgcgggg aacacgctgg 120 agggtggcag tgggaccgct ccggcggcgg ttcatccccg caggtgcggg gaacacggtg 180 tttcgtcctt tccacaagat 200 <210> 1592 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Hsa421_Pseud <400> 1592 cccagctggt tctttccgaa aaaaacggtt catccccgca ggtgcgggga acacggggac 60 agctctggaa aggggacgct cactcccggt tcatccccgc aggtgcgggg aacacgctgg 120 agggtggcag tgggaccgct ccggcggcgg ttcatccccg caggtgcggg gaacacggtg 180 tttcgtcctt tccacaagat 200 <210> 1593 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Hsa422_Pseud <400> 1593 cccagctggt tctttccgaa aaaaacggtt catccccgca ggtgcgggga acacaaatgg 60 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taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 11280 actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 11340 ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 11400 aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 11460 ttttcattat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 11520 atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 11580 tgacgtc 11587 <210> 1927 <211> 2067 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: single-chain FokI fusion to EcoCascade <400> 1927 Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ser Gly Met Ser Asn Phe Ile 1 5 10 15 Asn Ile His Val Leu Ile Ser His Ser Pro Ser Cys Leu Asn Arg Asp 20 25 30 Asp Met Asn Met Gln Lys Asp Ala Ile Phe Gly Gly Lys Arg Arg Val 35 40 45 Arg Ile Ser Ser Gln Ser Leu Lys Arg Ala Met Arg Lys Ser Gly Tyr 50 55 60 Tyr Ala Gln Asn Ile Gly Glu Ser Ser Leu Arg Thr Ile His Leu Ala 65 70 75 80 Gln Leu Arg Asp Val Leu Arg Gln Lys Leu Gly Glu Arg Phe Asp Gln 85 90 95 Lys 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Lys Ala Val Lys Ala Lys Asp Gly Phe Leu Gln Pro Ser Ile 305 310 315 320 Gln Ala Phe Asn Gln Tyr Trp Asp Arg Val Ala Asn Gly Tyr Gly Leu 325 330 335 Asn Gly Ala Ala Ala Gln Phe Ser Leu Ser Asp Val Asp Pro Ile Thr 340 345 350 Ala Gln Val Lys Gln Met Pro Thr Leu Glu Gln Leu Lys Ser Trp Val 355 360 365 Arg Asn Asn Gly Glu Ala Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu 370 375 380 Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Pro Lys Lys Lys Arg 385 390 395 400 Lys Val Gly Ser Gly Met Ala Asp Glu Ile Asp Ala Met Ala Leu Tyr 405 410 415 Arg Ala Trp Gln Gln Leu Asp Asn Gly Ser Cys Ala Gln Ile Arg Arg 420 425 430 Val Ser Glu Pro Asp Glu Leu Arg Asp Ile Pro Ala Phe Tyr Arg Leu 435 440 445 Val Gln Pro Phe Gly Trp Glu Asn Pro Arg His Gln Gln Ala Leu Leu 450 455 460 Arg Met Val Phe Cys Leu Ser Ala Gly Lys Asn Val Ile Arg His Gln 465 470 475 480 Asp Lys Lys Ser Glu Gln Thr Thr Gly Ile Ser Leu Gly Arg Ala Leu 485 490 495 Ala Asn Ser Gly Arg Ile Asn Glu Arg Arg Ile Phe Gln Leu Ile Arg 500 505 510 Ala Asp Arg Thr Ala Asp Met Val Gln Leu Arg Arg Leu Leu Thr His 515 520 525 Ala Glu Pro Val Leu Asp Trp Pro Leu Met Ala Arg Met Leu Thr Trp 530 535 540 Trp Gly Lys Arg Glu Arg Gln Gln Leu Leu Glu Asp Phe Val Leu Thr 545 550 555 560 Thr Asn Lys Asn Ala Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr 565 570 575 Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys 580 585 590 Val Gly Ser Gly Met Arg Ser Tyr Leu Ile Leu Arg Leu Ala Gly Pro 595 600 605 Met Gln Ala Trp Gly Gln Pro Thr Phe Glu Gly Thr Arg Pro Thr Gly 610 615 620 Arg Phe Pro Thr Arg Ser Gly Leu Leu Gly Leu Leu Gly Ala Cys Leu 625 630 635 640 Gly Ile Gln Arg Asp Asp Thr Ser Ser Leu Gln Ala Leu Ser Glu Ser 645 650 655 Val Gln Phe Ala Val Arg Cys Asp Glu Leu Ile Leu Asp Asp Arg Arg 660 665 670 Val Ser Val Thr Gly Leu Arg Asp Tyr His Thr Val Leu Gly Ala Arg 675 680 685 Glu Asp Tyr Arg Gly Leu Lys Ser His Glu Thr Ile Gln Thr Trp Arg 690 695 700 Glu Tyr Leu Cys Asp Ala Ser Phe Thr Val Ala Leu Trp Leu Thr Pro 705 710 715 720 His Ala Thr Met Val Ile Ser Glu Leu Glu Lys Ala Val Leu Lys Pro 725 730 735 Arg Tyr Thr Pro Tyr Leu Gly Arg Arg Ser Cys Pro Leu Thr His Pro 740 745 750 Leu Phe Leu Gly Thr Cys Gln Ala Ser Asp Pro Gln Lys Ala Leu Leu 755 760 765 Asn Tyr Glu Pro Val Gly Gly Asp Ile Tyr Ser Glu Glu Ser Val Thr 770 775 780 Gly His His Leu Lys Phe Thr Ala Arg Asp Glu Pro Met Ile Thr Leu 785 790 795 800 Pro Arg Gln Phe Ala Ser Arg Glu Trp Tyr Val Ile Lys Gly Gly Met 805 810 815 Asp Val Ser Gln Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys 820 825 830 Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 835 840 845 Gly Ser Gly Met Tyr Leu Ser Lys Val Ile Ile Ala Arg Ala Trp Ser 850 855 860 Arg Asp Leu Tyr Gln Leu His Gln Gly Leu Trp His Leu Phe Pro Asn 865 870 875 880 Arg Pro Asp Ala Ala Arg Asp Phe Leu Phe His Val Glu Lys Arg Asn 885 890 895 Thr Pro Glu Gly Cys His Val Leu Leu Gln Ser Ala Gln Met Pro Val 900 905 910 Ser Thr Ala Val Ala Thr Val Ile Lys Thr Lys Gln Val Glu Phe Gln 915 920 925 Leu Gln Val Gly Val Pro Leu Tyr Phe Arg Leu Arg Ala Asn Pro Ile 930 935 940 Lys Thr Ile Leu Asp Asn Gln Lys Arg Leu Asp Ser Lys Gly Asn Ile 945 950 955 960 Lys Arg Cys Arg Val Pro Leu Ile Lys Glu Ala Glu Gln Ile Ala Trp 965 970 975 Leu Gln Arg Lys Leu Gly Asn Ala Ala Arg Val Glu Asp Val His Pro 980 985 990 Ile Ser Glu Arg Pro Gln Tyr Phe Ser Gly Asp Gly Lys Ser Gly Lys 995 1000 1005 Ile Gln Thr Val Cys Phe Glu Gly Val Leu Thr Ile Asn Asp Ala 1010 1015 1020 Pro Ala Leu Ile Asp Leu Val Gln Gln Gly Ile Gly Pro Ala Lys 1025 1030 1035 Ser Met Gly Cys Gly Leu Leu Ser Leu Ala Pro Leu Gly Ser Gly 1040 1045 1050 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn 1055 1060 1065 Pro Gly Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Ser Gln Leu 1070 1075 1080 Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys 1085 1090 1095 Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala 1100 1105 1110 Arg Asn Pro Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu 1115 1120 1125 Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Glu His Leu Gly Gly 1130 1135 1140 Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile 1145 1150 1155 Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr 1160 1165 1170 Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu 1175 1180 1185 Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp 1190 1195 1200 Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val 1205 1210 1215 Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu 1220 1225 1230 Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu 1235 1240 1245 Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu 1250 1255 1260 Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Gly 1265 1270 1275 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1280 1285 1290 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1295 1300 1305 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1310 1315 1320 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1325 1330 1335 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 1340 1345 1350 Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His 1355 1360 1365 Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile 1370 1375 1380 Ala Arg Asn Pro Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met 1385 1390 1395 Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Glu His Leu Gly 1400 1405 1410 Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro 1415 1420 1425 Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly 1430 1435 1440 Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val 1445 1450 1455 Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp 1460 1465 1470 Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe 1475 1480 1485 Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg 1490 1495 1500 Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu 1505 1510 1515 Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr 1520 1525 1530 Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe 1535 1540 1545 Ala Asp Pro Thr Asn Arg Ala Lys Gly Leu Glu Ala Val Ser Val 1550 1555 1560 Ala Ser Met Asn Leu Leu Ile Asp Asn Trp Ile Pro Val Arg Pro 1565 1570 1575 Arg Asn Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Leu Gln Ser Leu Tyr 1580 1585 1590 Cys Ser Arg Asp Gln Trp Arg Leu Ser Leu Pro Arg Asp Asp Met 1595 1600 1605 Glu Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu Val Cys Ile Gly Gln Ile Ile 1610 1615 1620 Ala Pro Ala Lys Asp Asp Val Glu Phe Arg His Arg Ile Met Asn 1625 1630 1635 Pro Leu Thr Glu Asp Glu Phe Gln Gln Leu Ile Ala Pro Trp Ile 1640 1645 1650 Asp Met Phe Tyr Leu Asn His Ala Glu His Pro Phe Met Gln Thr 1655 1660 1665 Lys Gly Val Lys Ala Asn Asp Val Thr Pro Met Glu Lys Leu Leu 1670 1675 1680 Ala Gly Val Ser Gly Ala Thr Asn Cys Ala Phe Val Asn Gln Pro 1685 1690 1695 Gly Gln Gly Glu Ala Leu Cys Gly Gly Cys Thr Ala Ile Ala Leu 1700 1705 1710 Phe Asn Gln Ala Asn Gln Ala Pro Gly Phe Gly Gly Gly Phe Lys 1715 1720 1725 Ser Gly Leu Arg Gly Gly Thr Pro Val Thr Thr Phe Val Arg Gly 1730 1735 1740 Ile Asp Leu Arg Ser Thr Val Leu Leu Asn Val Leu Thr Leu Pro 1745 1750 1755 Arg Leu Gln Lys Gln Phe Pro Asn Glu Ser His Thr Glu Asn Gln 1760 1765 1770 Pro Thr Trp Ile Lys Pro Ile Lys Ser Asn Glu Ser Ile Pro Ala 1775 1780 1785 Ser Ser Ile Gly Phe Val Arg Gly Leu Phe Trp Gln Pro Ala His 1790 1795 1800 Ile Glu Leu Cys Asp Pro Ile Gly Ile Gly Lys Cys Ser Cys Cys 1805 1810 1815 Gly Gln Glu Ser Asn Leu Arg Tyr Thr Gly Phe Leu Lys Glu Lys 1820 1825 1830 Phe Thr Phe Thr Val Asn Gly Leu Trp Pro His Pro His Ser Pro 1835 1840 1845 Cys Leu Val Thr Val Lys Lys Gly Glu Val Glu Glu Lys Phe Leu 1850 1855 1860 Ala Phe Thr Thr Ser Ala Pro Ser Trp Thr Gln Ile Ser Arg Val 1865 1870 1875 Val Val Asp Lys Ile Ile Gln Asn Glu Asn Gly Asn Arg Val Ala 1880 1885 1890 Ala Val Val Asn Gln Phe Arg Asn Ile Ala Pro Gln Ser Pro Leu 1895 1900 1905 Glu Leu Ile Met Gly Gly Tyr Arg Asn Asn Gln Ala Ser Ile Leu 1910 1915 1920 Glu Arg Arg His Asp Val Leu Met Phe Asn Gln Gly Trp Gln Gln 1925 1930 1935 Tyr Gly Asn Val Ile Asn Glu Ile Val Thr Val Gly Leu Gly Tyr 1940 1945 1950 Lys Thr Ala Leu Arg Lys Ala Leu Tyr Thr Phe Ala Glu Gly Phe 1955 1960 1965 Lys Asn Lys Asp Phe Lys Gly Ala Gly Val Ser Val His Glu Thr 1970 1975 1980 Ala Glu Arg His Phe Tyr Arg Gln Ser Glu Leu Leu Ile Pro Asp 1985 1990 1995 Val Leu Ala Asn Val Asn Phe Ser Gln Ala Asp Glu Val Ile Ala 2000 2005 2010 Asp Leu Arg Asp Lys Leu His Gln Leu Cys Glu Met Leu Phe Asn 2015 2020 2025 Gln Ser Val Ala Pro Tyr Ala His His Pro Lys Leu Ile Ser Thr 2030 2035 2040 Leu Ala Leu Ala Arg Ala Thr Leu Tyr Lys His Leu Arg Glu Leu 2045 2050 2055 Lys Pro Gln Gly Gly Pro Ser Asn Gly 2060 2065

Claims (27)

1. 하기를 포함하는 조성물로서:
   제1 Cse2 서브유닛 단백질, 제1 Cas5 서브유닛 단백질, 제1 Cas6 서브유닛 단백질, 및 제1 Cas7 서브유닛 단백질,
   제1 Cas8 서브유닛 단백질 및 제1 FokI를 포함하며, 여기서 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단 또는 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단이 제1 링커 폴리펩티드에 의해 제1 FokI의 C-말단 또는 N-말단에 각각 공유적으로 연결되고, 여기서 제1 링커 폴리펩티드가 10개 아미노산 내지 40개 아미노산의 길이를 갖는 것인 제1 융합 단백질, 및
   제1 핵산 표적 서열에 결합할 수 있는 제1 스페이서를 포함하는 제1 가이드 폴리뉴클레오티드
   를 포함하는 제1 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체; 및
   제2 Cse2 서브유닛 단백질, 제2 Cas5 서브유닛 단백질, 제2 Cas6 서브유닛 단백질, 및 제2 Cas7 서브유닛 단백질,
   제2 Cas8 서브유닛 단백질 및 제2 FokI를 포함하며, 여기서 제2 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단 또는 제2 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단이 제2 링커 폴리펩티드에 의해 제2 FokI의 C-말단 또는 N-말단에 각각 공유적으로 연결되고, 여기서 제2 링커 폴리펩티드가 10개 아미노산 내지 40개 아미노산의 길이를 갖는 것인 제2 융합 단백질, 및
   제2 핵산 표적 서열에 결합할 수 있는 제2 스페이서를 포함하는 제2 가이드 폴리뉴클레오티드
   를 포함하는 제2 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체;
   여기서 제2 핵산 표적 서열의 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)와 제1 핵산 표적 서열의 PAM이 20개 염기 쌍 내지 42개 염기 쌍의 인터스페이서 거리를 갖는 것인
   조성물.
2. 제1항에 있어서, 제1 링커 폴리펩티드가 15개 아미노산 내지 30개 아미노산, 또는 17개 아미노산 내지 20개 아미노산의 길이를 갖는 것인 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 링커 폴리펩티드가 15개 아미노산 내지 30개 아미노산, 또는 17개 아미노산 내지 20개 아미노산의 길이를 갖는 것인 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 링커 폴리펩티드의 길이와 제2 링커 폴리펩티드의 길이가 동일한 길이인 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 핵산 표적 서열 및 제1 핵산 표적 서열이 각각 22개 염기 쌍 내지 40개 염기 쌍의 인터스페이서 거리를 갖거나, 각각 26개 염기 쌍 내지 36개 염기 쌍의 인터스페이서 거리를 갖거나, 각각 29개 염기 쌍 내지 34개 염기 쌍의 인터스페이서 거리를 갖거나, 또는 각각 30개 염기 쌍 내지 32 염기 쌍의 인터스페이서 거리를 갖는 것인 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 FokI 및 제2 FokI가 연합하여 동종이량체를 형성할 수 있는 단량체성 서브유닛인 조성물.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 FokI 및 제2 FokI가 연합하여 이종이량체를 형성할 수 있는 별개의 단량체성 서브유닛인 조성물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단이 제1 링커 폴리펩티드에 의해 제1 FokI의 C-말단에 공유적으로 연결되고/거나, 제1 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단이 제1 링커 폴리펩티드에 의해 제1 FokI의 N-말단에 공유적으로 연결되는 것인 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 Cas8 서브유닛 단백질의 N-말단이 제2 링커 폴리펩티드에 의해 제2 FokI의 C-말단에 공유적으로 연결되고/거나, 제2 Cas8 서브유닛 단백질의 C-말단이 제2 링커 폴리펩티드에 의해 제2 FokI의 N-말단에 공유적으로 연결되는 것인 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Cas8 서브유닛 단백질 및 제2 Cas8 서브유닛 단백질이 각각 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Cse2 서브유닛 단백질 및 제2 Cse2 서브유닛 단백질이 각각 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 제1 Cas5 서브유닛 단백질 및 제2 Cas5 서브유닛 단백질이 각각 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 제1 Cas6 서브유닛 단백질 및 제2 Cas6 서브유닛 단백질이 각각 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 제1 Cas7 서브유닛 단백질 및 제2 Cas7 서브유닛 단백질이 각각 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 가이드 폴리뉴클레오티드가 RNA를 포함하고/거나, 제2 가이드 폴리뉴클레오티드가 RNA를 포함하는 것인 조성물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 DNA가 제2 핵산 표적 서열의 PAM 및 제1 핵산 표적 서열의 PAM을 포함하는 것인 조성물.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체가 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 게오써모박터(Geothermobacter) 종 (균주 EPR-M), 메타노셀라 아르보리자에(Methanocella arvoryzae) MRE50, 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 슈도모나스(Pseudomonas) 종 S-6-2, 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기체의 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체에 기반한 것인 조성물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체가 살모넬라 엔테리카, 게오써모박터 종 (균주 EPR-M), 메타노셀라 아르보리자에 MRE50, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 슈도모나스 종 S-6-2, 및 에스케리키아 콜라이로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기체의 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체에 기반한 것인 조성물.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 숙주 세포.
17. 제16항에 있어서, 세포가 진핵 세포인 숙주 세포.
18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 제1 Cse2 서브유닛 단백질, 제1 Cas5 서브유닛 단백질, 제1 Cas6 서브유닛 단백질, 제1 Cas7 서브유닛 단백질, 제1 융합 단백질 및 제1 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열; 및/또는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 제2 Cse2 서브유닛 단백질, 제2 Cas5 서브유닛 단백질, 제2 Cas6 서브유닛 단백질, 제2 Cas7 서브유닛 단백질, 제2 융합 단백질 및 제2 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열.
19. 하기 단계를 포함하는, 숙주 세포 또는 생화학적 반응에서 제1 핵산 표적 서열 및 제2 핵산 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 커팅하는 방법으로서:
    제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 조성물을 숙주 세포 또는 생화학적 반응 내로 도입하며, 이로써 제1 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 제1 핵산 표적 서열의 접촉 및 제2 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체와 제2 핵산 표적 서열의 접촉을 용이하게 하여, 제1 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체에 의한 제1 핵산 표적 서열의 커팅 및 제2 조작된 클래스 1 유형 I CRISPR-Cas 이펙터 복합체에 의한 제2 핵산 표적 서열의 커팅을 초래하는 단계;
    임의적으로 여기서 방법은 숙주 세포 내에서 이루어지고, 숙주 세포는 인체 외부의 인간 세포인
    방법.
20. 제19항에 있어서, 숙주 세포가 공여자 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분이 dsDNA에 통합되는 것인 방법.
21. 야생형 유형 I CRISPR Cas3 단백질 ("wtCas3 단백질")에 비해 DNA를 따라 이동하는 것을 감소시킬 수 있는 조작된 유형 I CRISPR Cas3 돌연변이체 단백질 ("mCas3 단백질")로서, mCas3 단백질은
    상응하는 wtCas3 단백질과의 95% 이상의 서열 동일성을 포함하고,
    아미노 말단, 카르복시 말단, 또는 아미노 말단과 카르복시 말단 둘 다에 공유적으로 연결된 핵 국재화 시그널을 포함하고,
    헬리카제 활성을 하향-조정하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 여기서 조작된 유형 I CRISPR Cas3 돌연변이체 단백질이 뉴클레아제 활성을 보유하고;
    여기서 DNA는 핵산 표적 서열을 포함하는 표적 영역을 포함하는 이중-가닥 DNA (dsDNA)이고;
    여기서 wtCas3 단백질이 상응하는 캐스케이드 핵단백질 복합체와 연합되고 ("캐스케이드 NP 복합체/wtCas3 단백질"), 캐스케이드 NP 복합체가 핵산 표적 서열에 상보적인 스페이서를 포함하는 가이드를 포함하는 경우에, 핵산 표적 서열에 대한 캐스케이드 NP 복합체/wtCas3 단백질의 결합은 DNA의 표적 영역에서의 절단을 용이하게 하며, 이로써 결실 ("wtCas3-결실)을 초래하고;
    여기서 mCas3 단백질이 캐스케이드 NP 복합체와 연합되고 ("캐스케이드 NP 복합체/mCas3 단백질") 핵산 표적 서열에 결합하는 경우에, 이는 DNA의 표적 영역에서의 절단을 용이하게 하며, 이로써 wtCas3-결실에 비해 더 짧은 결실을 초래하는 것인
    mCas3 단백질.
22. 제21항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이가 wtCas3 단백질에 비해 단일-가닥 DNA (ssDNA)에 대한 mCas3 단백질의 결합을 하향-조정하는 것인 mCas3 단백질.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이가 wtCas3 단백질에 비해 mCas3 단백질에 의한 아데노신 트리포스페이트 (ATP)의 가수분해를 하향-조정하거나 또는 mCas3 단백질에 대한 ATP의 결합을 하향-조정하는 것인 mCas3 단백질.
24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, mCas3 단백질에 대한 코딩 서열이 캐스케이드 NP 복합체의 Cas 단백질의 코딩 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 공유적으로 연결되는 것인 mCas3 단백질.
25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, DNA가 세포 내에 있는 것인 mCas3 단백질.
26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 진핵 세포인 mCas3 단백질.
27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항의 mCas3 단백질을 포함하는 유형 I CRISPR 캐스케이드 핵단백질 복합체.

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