JP3511596B2 - 遺伝子の検出方法及び検出用チップ - Google Patents
遺伝子の検出方法及び検出用チップInfo
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Description
及び検出用チップに関する。
学の基礎応用分野とともに重要なキーテクノロジーの1
つであり、フォトリソグラフィーやスタンプ法などで作
製したDNAチップにより、遺伝子多型の解析や遺伝子
発現のモニタリングが進められている。現在のところ、
チップ上での遺伝子検出法は、蛍光測定によるものが一
般的である。
て、二本鎖認識体、例えば、二重鎖DNA中の隣接する
塩基対の間に挿入[すなわち、インターカレーション
(intercalation)]することにより二重
鎖DNAと特異的に結合する挿入剤(intercal
ating agent)を用いる方法が公知である。
例えば、特開平5−285000号公報には、検出対象
遺伝子を一本鎖に変性させた状態で含む試料溶液中に、
担体を浸積させることにより、担体表面上に試料核酸を
吸着させた後、続いて、核酸プローブが貯留された反応
槽に、前記担体を浸積させ、プローブ溶液の温度を適当
に制御することによりハイブリダイゼーションを行な
い、更に、二本鎖認識体含有溶液を貯留された検出槽
に、前記担体を浸積させ、担体の表面に形成された二重
鎖核酸を認識して結合した二本鎖認識体に由来する電気
化学的信号を検出する、遺伝子検出方法が開示されてい
る。なお、前記公報には、検出対象遺伝子の含有量が微
量である場合には、遺伝子を増幅した後、前記検出を行
なうことができることも開示されている。
で実施するPCR法が、例えば、特開平8−19629
9号公報又は特開平9−224644号公報に開示され
ている。例えば、特開平8−196299号公報には、
20〜40mm(縦)×50〜100mm(横)程度の
矩形板状の反応容器を使用するPCR法が開示されてお
り、特開平9−224644号公報には、直径580μ
mの半球状のウエルを幅方向に12個、等間隔に設けた
幅80mmの長方形の反応容器を使用するPCR法が開
示されている。しかし、これらの公報には、増幅された
DNAをそのプレート上で検出する手段については全く
開示されていない。
000号公報に記載の遺伝子検出方法では、PCRに用
いるプライマー以外に、プローブを用意する必要があ
り、しかも、ハイブリダイゼーションの操作が必要であ
り、操作が煩雑である。また、前記特開平8−1962
99号公報又は特開平9−224644号公報に記載の
各PCR法では、PCRを実施したプレートとは別の場
所で、増幅したDNAの検出を行なう場合には、操作が
煩雑となる。従って、本発明の課題は、従来技術の前記
の欠点を解消し、操作が簡易であり、しかも、装置全体
の小型化が可能であり、汎用性を広げることができ、更
には、被検試料中の標的遺伝子の濃度が低い場合であっ
ても、標的遺伝子を検出可能な遺伝子検出方法及び検出
用チップを提供することにある。
る、(A)検出対象遺伝子を含む可能性のある 被検試料と、
前記検出対象遺伝子を鋳型として遺伝子を合成すること
のできるプライマーを含む遺伝子合成反応用液とを含む
混合液であって、二重鎖DNAに特異的に結合すること
ができ、しかも、電気化学的に活性な遺伝子結合性物質
と結合する遺伝子を、前記検出対象遺伝子を鋳型として
合成することのできる遺伝子合成反応を実施する前の混
合液(以下、遺伝子合成反応用混合液と称する)につい
て、前記遺伝子結合性物質の存在下での電気化学的応答
と、(B)検出対象遺伝子を含む可能性のある 被検試料と、
前記検出対象遺伝子を鋳型として遺伝子を合成すること
のできるプライマーを含む遺伝子合成反応用液とを含む
混合液に対して、前記遺伝子結合性物質と結合する遺伝
子を、前記検出対象遺伝子を鋳型として合成することの
できる遺伝子合成反応を実施して得られる生成液(以
下、遺伝子合成反応生成液と称する)について、前記遺
伝子結合性物質の存在下での電気化学的応答とを比較す
ることを特徴とする、前記被検試料中の遺伝子の検出方
法により解決することができる。また、本発明は、 (1)検出対象遺伝子を含む可能性のある被検試料と前
記検出対象遺伝子を鋳型として遺伝子を合成することの
できるプライマーを含む遺伝子合成反応用液とを含む混
合液に対して、二重鎖DNAに特異的に結合することが
でき、しかも、電気化学的に活性な遺伝子結合性物質と
結合する遺伝子を、前記検出対象遺伝子を鋳型として合
成することのできる遺伝子合成反応を実施可能な部位
(以下、遺伝子合成反応部位と称する); (2)前記遺伝子結合性物質の電気化学的応答の測定が
可能な電極を備えた電気化学的応答の測定部位(以下、
検査部位と称する);及び (3)前記の遺伝子合成反応を実施可能な部位内の液
を、前記の遺伝子合成反応を実施可能な部位(すなわ
ち、遺伝子合成反応部位)から、前記の電極を備えた電
気化学的応答の測定部位(すなわち、検査部位)へ、送
液可能な流路(以下、遺伝子合成反応生成液送液路と称
する)を含む遺伝子の検出用チップであって、基板層、
中間層、及びカバー層を積層した構造からなり、前記中
間層には、前記の遺伝子合成反応実施可能部位(すなわ
ち、遺伝子合成反応部位)及び測定部位(すなわち、検
査部位)にそれぞれ相当する貫通孔と、前記流路(すな
わち、遺伝子合成反応生成液送液路)に相当する溝とが
設けられており、前記基板層及びカバー層と一緒になっ
て、前記の遺伝子合成反応実施可能部位(遺伝子合成反
応部位)、測定部位(検査部位)、及び流路(遺伝子合
成反応生成液送液路)を形成していることを特徴とす
る、前記の遺伝子検出用チップに関する。
のできる検出対象遺伝子は、遺伝子合成反応用のプライ
マーを設計することができ、そのプライマーを用いて遺
伝子合成反応を実施可能な遺伝子である限り、特に限定
されるものではないが、例えば、天然に存在する遺伝子
(例えば、動物、植物、微生物、又はウイルスに由来す
る遺伝子)であることもできるし、あるいは、人工的に
製造した遺伝子(例えば、化学的に合成した遺伝子、あ
るいは、遺伝子工学的に製造した遺伝子)であることも
できる。なお、本明細書における「遺伝子」には、DN
A及びRNAの両方が含まれる。
できる被検試料は、検出対象遺伝子を含む可能性がある
限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的
試料[例えば、動物の体液(例えば、血液、血清、血
漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、又は喀痰)若しくは排泄
物(例えば、糞便)、臓器、組織、又は動植物それ自体
若しくはそれらの乾燥体]、あるいは、環境由来の試料
(例えば、河川水、湖沼水、若しくは海水、又は土壌)
を挙げることができる。
合する」とは、遺伝子の特異配列や構造を認識して結合
することを意味する。また、「電気化学的に活性であ
る」とは、電気化学測定において、酸化又は還元活性を
示すこと、すなわち、特定の電圧を加えた際に、遺伝子
結合性物質の量に比例したシグナルが得られることを意
味する。本発明の検出方法において用いる遺伝子結合性
物質は、遺伝子に特異的に結合することができ、しか
も、電気化学的に活性な遺伝子結合性物質である限り、
特に限定されるものではないが、例えば、二重鎖DNA
に特異的に結合することができ、しかも、電気化学的に
活性な挿入剤(intercalating agen
t)が好ましい。なお、「二重鎖DNAに特異的に結合
する」とは、一本鎖DNAに結合しないが、遺伝子に結
合することを意味する。本発明の検出方法において用い
ることのできる遺伝子結合性物質としては、例えば、ビ
スベンジイミド誘導体、フェロセン誘導体、キノン誘導
体、インドフェノール誘導体、アクリジン誘導体、フラ
ビン誘導体、ビオロゲン誘導体、ルテニウム錯体、オス
ミウム錯体、コバルト錯体、白金錯体、銅錯体、アクチ
ノマイシンD若しくはドーノマイシン又はそれらの誘導
体などを挙げることができる。
伝子を含む可能性のある被検試料と、(b)前記検出対
象遺伝子を鋳型として遺伝子を合成することのできるプ
ライマーを含む遺伝子合成反応用液とを、少なくとも含
有する遺伝子合成反応用混合液を用いて、遺伝子合成反
応を実施する。本発明の検出方法で実施する前記遺伝子
合成反応は、検出対象遺伝子を鋳型として、遺伝子結合
性物質と結合する遺伝子を合成することのできる反応で
ある限り、特に限定されるものではないが、例えば、遺
伝子増幅反応、複製反応、転写反応、又は逆転写反応を
挙げることができ、前記遺伝子増幅反応[例えば、ポリ
メラーゼ連鎖反応(PCR)]が好ましい。なお、前記
遺伝子合成反応は、前記遺伝子結合性物質の存在下で実
施することもできるし、あるいは、前記遺伝子結合性物
質の不在下で実施することもできる。
の反応それ自体は、遺伝子結合性物質の不在下で実施す
る場合には、通常の遺伝子合成反応と全く同様に実施す
ることができ、一方、遺伝子結合性物質の存在下で実施
する場合には、遺伝子結合性物質の存在下で実施するこ
と以外は、通常の遺伝子合成反応と同様に実施すること
ができる。例えば、本発明の検出方法において、遺伝子
合成反応としてPCRを行なう場合には、前記PCRの
反応それ自体は、遺伝子結合性物質の不在下で実施する
場合には、通常のPCRと全く同様に実施することがで
き、一方、遺伝子結合性物質の存在下で実施する場合に
は、遺伝子結合性物質の存在下で実施すること以外は、
通常のPCRと同様に実施することができる。
例えば、耐熱性DNAポリメラーゼ(例えば、Taqポ
リメラーゼ)を用いて、初期変性反応(例えば、97℃
で2〜3分間)を実施した後、(1)DNAの変性工程
(90〜94℃で30秒間)、(2)1本鎖DNAとプ
ライマーとのアニーリング工程(50〜55℃で30秒
間)、及び(3)耐熱性DNAポリメラーゼによるDN
A合成工程(70〜75℃で1〜2分間)からなる増幅
サイクルを繰り返す(例えば、15〜45回)ことによ
り、PCRを実施することができる。検出対象遺伝子が
RNAである場合には、例えば、逆転写PCR(RT−
PCR)法により実施することができる。すなわち、逆
転写酵素及びオリゴ(dT)プライマーを用いて、逆転
写反応を実施した後、前記DNAの場合と同様に、耐熱
性DNAポリメラーゼ(例えば、Taqポリメラーゼ)
を用いて、初期変性反応及びそれに続く増幅サイクルを
繰り返すことができる。
応で得られた遺伝子合成反応生成液と、遺伝子合成反応
を実施する前の遺伝子合成反応用混合液との各々につい
て、各液中に同量の遺伝子結合性物質が存在する状態
で、各液の電気化学的応答を測定し、比較する。例え
ば、遺伝子合成反応としてPCRを行なう場合には、ポ
リメラーゼ連鎖反応で得られたポリメラーゼ連鎖反応生
成液と、ポリメラーゼ連鎖反応を実施する前のポリメラ
ーゼ連鎖反応用混合液との各々について、各液中に同量
の遺伝子結合性物質(例えば、挿入剤)が存在する状態
で、各液の電気化学的応答を測定し、比較する。
検液(すなわち、遺伝子合成反応生成液又は遺伝子合成
反応用混合液)に電位を印加した時に発生する電流値を
測定することによって、電気化学的応答の測定を実施す
ることができる。具体的には、種々の電気化学測定方
法、例えば、リニアスイープボルタンメトリー(LS
V)、クーロアンペリメトリー(CA)、クーロクロノ
メトリー(CC)、又はサイクリックボルタメトリー
(CV)などを挙げることができる。なお、本発明の検
出方法では、遺伝子合成反応を実施する遺伝子合成反応
部位と、電気化学的応答を測定する検査部位とが、別々
であることもできるし、あるいは、遺伝子合成反応を実
施した遺伝子合成反応部位において、そのまま、電気化
学的応答を測定することもできる。また、前記検査部位
に、電気化学的応答の測定が可能な電極を予め設けてお
くこともできるし、あるいは、前記検査部位とは独立し
た電気化学的応答の測定が可能な電極を、測定の度に検
査部位内の検査対象液中に挿入し、測定することもでき
る。
生成液、又は遺伝子合成反応を実施する前の遺伝子合成
反応用混合液の各液中に、遺伝子結合性物質を存在させ
る方法は、電気化学的応答の測定の際に遺伝子結合性物
質が各液中に存在する限り、特に限定されるものではな
いが、例えば、遺伝子合成反応用混合液に予め遺伝子結
合性物質を添加しておくこともできるし、あるいは、遺
伝子合成反応終了後に、各液に遺伝子結合性物質を添加
することもできる。
いて、被検試料中における検出対象遺伝子の有無を判定
する。すなわち、本発明の検出方法で用いる遺伝子結合
性物質は、遺伝子と特異的に結合することができ、しか
も、電気化学的に活性である。従って、遺伝子結合性物
質を含むが、遺伝子を含まないか、あるいは、遺伝子の
量が少量である液における電気化学的応答と、遺伝子結
合性物質を含み、しかも、遺伝子を多量に含む液におけ
る電気化学的応答とを比較すると、遺伝子結合性物質が
遺伝子と結合するため、前者の電気化学的応答に比べ
て、後者の電気化学的応答が低下し、電気化学的に検出
可能な差異が生じる。遺伝子合成反応により遺伝子が合
成され、反応液中に遺伝子が多量に存在する場合には、
遺伝子合成反応を実施する前の遺伝子合成反応用混合液
における電気化学的応答に比べて、遺伝子合成反応によ
り得られた反応液における電気化学的応答が低下する。
この場合、被検試料中に検出対象遺伝子が存在すると判
定することができる。一方、遺伝子合成反応により遺伝
子が合成されず、反応液中に多量の遺伝子が存在しない
場合には、遺伝子合成反応を実施する前の遺伝子合成反
応用混合液における電気化学的応答と、遺伝子合成反応
により得られた反応液における電気化学的応答との間に
は、差異が生じない。この場合、被検試料中に検出対象
遺伝子が存在しないと判定することができる。
なう場合には、遺伝子結合性物質として、二重鎖DNA
中の隣接する塩基対の間に挿入[すなわち、インターカ
レーション(intercalation)]すること
により二重鎖DNAと特異的に結合することができる挿
入剤を使用することができる。PCRによりDNAが増
幅され、反応液中に二重鎖DNAが多量に存在する場合
には、PCRを実施する前のポリメラーゼ連鎖反応用混
合液における電気化学的応答に比べて、PCRにより得
られた反応液における電気化学的応答が低下する。この
場合、被検試料中に検出対象遺伝子が存在すると判定す
ることができる。一方、PCRによりDNAが増幅され
ず、反応液中に多量の二重鎖DNAが存在しない場合に
は、PCRを実施する前のポリメラーゼ連鎖反応用混合
液における電気化学的応答と、PCRにより得られた反
応液における電気化学的応答との間には、差異が生じな
い。この場合、被検試料中に検出対象遺伝子が存在しな
いと判定することができる。
しては、例えば、(a)検出対象遺伝子を含む可能性の
ある被検試料と、(b)前記検出対象遺伝子を鋳型とし
て遺伝子を合成することのできるプライマーを含む遺伝
子合成反応用液と、(c)遺伝子に特異的に結合するこ
とができ、しかも、電気化学的に活性な遺伝子結合性物
質とを含有する遺伝子合成反応用混合液を用いて、遺伝
子合成反応を実施する遺伝子合成反応工程;及び前記遺
伝子合成反応を実施する前の前記遺伝子合成反応用混合
液における電気化学的応答と、前記遺伝子合成反応工程
で得られた反応液における電気化学的応答とを比較する
工程を含む、遺伝子の検出方法を挙げることができる。
検出方法としては、例えば、(a)検出対象遺伝子を含
む可能性のある被検試料と、(b)前記検出対象遺伝子
を鋳型として遺伝子を合成することのできるプライマー
を含む遺伝子合成反応用液とを含有する遺伝子合成反応
用混合液を用いて、遺伝子合成反応を実施する遺伝子合
成反応工程;及び(c)遺伝子に特異的に結合すること
ができ、しかも、電気化学的に活性な遺伝子結合性物質
と、前記遺伝子合成反応を実施する前の前記遺伝子合成
反応用混合液とを接触させて得られる混合液における電
気化学的応答と、前記遺伝子合成反応用混合液に用いた
前記遺伝子結合性物質の量と同量の前記遺伝子結合性物
質と、前記遺伝子合成反応工程で得られた反応液とを接
触させて得られる混合液における電気化学的応答とを比
較する工程を含む、遺伝子の検出方法を挙げることがで
きる。
実施可能な部位(遺伝子合成反応部位); (2)電極を備えた電気化学的応答の測定部位(検査部
位);及び (3)前記遺伝子合成反応部位内の液を、前記遺伝子合
成反応部位から前記検査部位へ送液可能な流路(遺伝子
合成反応生成液送液路)を少なくとも含み、好ましく
は、遺伝子合成反応用混合液供給路、遺伝子結合性物質
供給路、及び/又は廃液路を更に含むことができる。
成反応部位、検査部位、及び遺伝子合成反応生成液送液
路を少なくとも含む限り、特に限定されるものではない
が、例えば、プレート状又はキャピラリー状などを挙げ
ることができ、プレート状であることが好ましい。前記
遺伝子合成反応部位又は前記検査部位における各部位の
形状も、特に限定されるものではないが、例えば、プレ
ート上の窪み、プレート上の特定の平面領域、あるい
は、基板中の部屋などを挙げることができる。
チップを説明する。図1は、本発明の検出用チップの一
態様の平面図であり、図2は、図1に示す本発明の検出
用チップのA−A線断面図である。なお、図1におい
て、上側から見て実際に見えない部分については、破線
で示す。図1に示す本発明の検出用チップ10は、基板
層11、中間層12、及びカバー層13を積層した構造
からなる。前記中間層12には、遺伝子合成反応部位1
及び検査部位2にそれぞれ相当する貫通孔と、遺伝子合
成反応用混合液供給路3、遺伝子合成反応生成液送液路
4、遺伝子結合性物質供給路5、及び廃液路6にそれぞ
れ相当する溝とが設けられており、前記基板層11及び
カバー層13と一緒になって、前記の遺伝子合成反応部
位1、検査部位2、遺伝子合成反応用混合液供給路3、
遺伝子合成反応生成液送液路4、遺伝子結合性物質供給
路5、及び廃液路6を形成している。
合成反応部位1、遺伝子合成反応生成液送液路4、検査
部位2、及び廃液路6は、その内部を液体がこの順に通
過可能なように、配置されており、更に、検査部位2に
遺伝子結合性物質を供給可能なように、遺伝子結合性物
質供給路5が配置されている。より具体的には、遺伝子
合成反応用混合液供給路3と遺伝子合成反応部位1とが
連絡しており、遺伝子合成反応部位1と検査部位2と
が、遺伝子合成反応生成液送液路4により連絡されてお
り、更に、検査部位2と廃液路6とが連絡している。遺
伝子合成反応用混合液供給路3から供給した遺伝子合成
反応用混合液は、遺伝子合成反応部位1に送液され、更
に、遺伝子合成反応生成液送液路4を通って、検査部位
2に送液され、最後に、廃液路6を通って、検出用チッ
プの外部へ排出される。基板層11には、電気化学的応
答測定用の電極として、作用電極7及び対極8が、検査
部位2に露出するように設けられている。
に示す態様のように、遺伝子合成反応用混合液供給路3
とは別に、遺伝子結合性物質供給路5を設けることもで
きるが、遺伝子結合性物質供給路を設けないでおくこと
もできる。なお、この場合には、予め遺伝子結合性物質
が添加されている遺伝子合成反応用混合液を使用し、前
記遺伝子合成反応用混合液を遺伝子合成反応用混合液供
給路から供給する。また、図1及び図2に示す本発明の
検出用チップでは、カバー層13を設けることにより、
検出用チップの全部位及び全流路が管状構造となってい
るが、本発明の検出用チップでは、カバー層を設けない
か、あるいは、一部にのみカバー層を設けることによ
り、検出用チップの全部位及び全経路、またはそれらの
一部を開放系とすることもできる。この場合、検出用チ
ップを使い捨て用として使用する場合には、更に、廃液
路を設けないでおくこともできる。更に、本発明の検出
用チップでは、図1及び図2に示すように、遺伝子合成
反応部位1つと検査部位1つとを含む検査単位を担持す
るだけでなく、前記の検査単位を2組以上形成すること
もできる。
プを用いて実施することができる。図1及び図2に示す
検出用チップを用いる場合には、以下の手順に限定され
るものではないが、例えば、以下の手順に従って、本発
明の検出方法を実施することができる。なお、始めに、
遺伝子合成反応終了後に、遺伝子合成反応生成液に遺伝
子結合性物質を添加する場合の手順について説明し、そ
の後、遺伝子合成反応用混合液中に予め遺伝子結合性物
質を添加しておく場合の手順について説明する。
衝液)で、検出用チップの全部位及び全流路を満たして
おく。予め調製しておいた遺伝子合成反応用混合液を、
遺伝子合成反応用混合液供給口3aから遺伝子合成反応
用混合液供給路3に注入し、続いて、前記と同じ緩衝液
を遺伝子合成反応用混合液供給口3aから遺伝子合成反
応用混合液供給路3に注入することにより、遺伝子合成
反応部位1まで前記遺伝子合成反応用混合液を送液す
る。この状態で遺伝子合成反応を実施した後、遺伝子合
成反応用混合液供給路3に緩衝液を注入することによ
り、遺伝子合成反応部位1内の反応液を、遺伝子合成反
応生成液送液路4経由で検査部位2へ送液する。この
際、遺伝子結合性物質を、遺伝子結合性物質供給口5a
から遺伝子結合性物質供給路5に注入し、続いて、前記
緩衝液を遺伝子結合性物質供給口5aから遺伝子結合性
物質供給路5に注入することにより、検査部位2まで遺
伝子結合性物質を送液する。検査部位2において電気化
学的応答を測定した後、遺伝子合成反応用混合液供給口
3aから遺伝子合成反応用混合液供給路3に前記緩衝液
を注入することにより、電気化学的応答の測定を終了し
た検査部位2内の反応液を、廃液路6経由で廃液口6a
からチップ外へ排出する。以上の一連の操作により、遺
伝子合成反応を実施した後の遺伝子合成反応生成液の電
気化学的応答の測定を行なうことができる。前記操作の
終了後、あるいは、実施前に、遺伝子合成反応部位1に
おいて遺伝子合成反応を実施しないこと以外は、前記操
作を繰り返すことにより、遺伝子合成反応を実施する前
の遺伝子合成反応用混合液の電気化学的応答の測定を行
なうことができる。得られた各測定値を比較することに
より、被検試料中における検出対象遺伝子の有無を判定
することができる。
伝子結合性物質を添加しておく場合には、遺伝子合成反
応終了後に、遺伝子結合性物質を遺伝子結合性物質供給
路5から検査部位2内へ送液しないこと以外は、前記操
作(すなわち、遺伝子合成反応終了後に遺伝子合成反応
生成液に遺伝子結合性物質を添加する場合の操作)と同
様にして、被検試料中における検出対象遺伝子の有無を
判定することができる。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
例は、図1及び図2に示す本発明の遺伝子検出用チップ
と同様のチップ(縦=約2.6cm;横=約5.3c
m;厚さ=約2mm)を用いて実施した。また、PCR
に用いるプローブとして、B型肝炎ウイルス(以下、H
BVと略称する)のC領域(3.2kbp)を増幅可能
なフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用
した。
及び検査部位並びに全流路を、リン酸水素二ナトリウム
及びリン酸二水素ナトリウム二水和物を含有するリン酸
緩衝液(pH7)で満たした。遺伝子合成反応用混合液
注入口からポリメラーゼ連鎖反応用混合液[50ng−
HBV、1ユニットTaqポリメラーゼ、15pmol
フォワードプライマー、15pmolリバースプライマ
ー、1mmol/L硫酸マグネシウム、0.2mmol
/L−dNTPs、5μL−10×buffer]10
0μLを注入し、続いて、前記リン酸緩衝液100μL
を注入することにより、PCR部位にポリメラーゼ連鎖
反応用混合液を送液した後、PCRを実施した。前記P
CRは、97℃(3分間)の初期変性反応を実施した
後、94℃(30秒間)と55℃(30秒間)と74℃
(90秒間)とからなるサイクル反応を30回繰り返す
ことにより実施した。
合液注入口からリン酸緩衝液100μLを注入すること
により、PCR部位内の反応液を検査部位に送液した。
その際、遺伝子結合性物質注入口から、式:
t社)100μmol/Lを含有する水溶液(以下、ヘ
キスト33258水溶液と称する)100μLを注入す
ることにより、前記検査部位にヘキスト33258水溶
液を送液した。検査部位内のヘキスト33258の最終
濃度は50μmol/Lであった。検査部位における電
気化学応答の測定は、リニアスイープボルタンメトリー
(LSV)及びクーロアンペリオメトリー(CA)の2
種類の方法で行なった。LSV測定においては、掃引速
度は5mV/secで200〜700mVまで掃引し、
電流値を測定した。また、CA測定においては、450
〜550mVにおいて電圧を固定し、10〜60秒間、
電流値を測定した。
以外は、前記操作を繰り返した。LSV測定の結果を図
3に示す。図3において、曲線aは、PCRを実施した
場合の結果であり、曲線bは、PCRを実施しなかった
場合(対照)の結果であり、曲線cは、バックグラウン
ド電流(バッファーのみの場合の電流値)の結果であ
る。また、CA測定の結果も、LSV測定の場合と同様
に、b、a、cの順の応答値を示した。
れば、1枚のマイクロプレート上で、遺伝子合成反応工
程と、その反応生成物に関する検査工程とが可能である
ため、装置全体の小型化が可能である。また、遺伝子の
種類に関わらず、検出が可能であり、汎用性を広げるこ
とができる。また、遺伝子合成反応としてPCRを行な
う場合には、検出対象である標的遺伝子をPCRにより
増幅させているため、被検試料中の標的遺伝子の濃度が
低い場合であっても、標的遺伝子を検出可能であり、し
かも、標的遺伝子の初期濃度に影響されない安定した応
答を得ることができる。また、一般的なDNAチップの
ように、基板上にプローブとなるDNAを固定化する必
要がないため、チップの作成と測定が簡便且つ迅速であ
る。更に、マイクロマシン技術により流路を集積化する
ことで、マルチチャンネル型チップを作製することがで
き、同時に複数の遺伝子の検出が可能である。
た平面図である。
面図である。
プボルタンメトリーによる測定結果を示すグラフであ
る。
位;2・・・検査部位;3・・・遺伝子合成反応用混合
液供給路;4・・・遺伝子合成反応生成液送液路;5・
・・遺伝子結合性物質供給路;6・・・廃液路;7・・
・作用電極;8・・・対極;11・・・基板層;12・
・・中間層;13・・・カバー層。
Claims (2)
- 【請求項1】 (A)検出対象遺伝子を含む可能性のあ
る被検試料と、前記検出対象遺伝子を鋳型として遺伝子
を合成することのできるプライマーを含む遺伝子合成反
応用液とを含む混合液であって、 二重鎖DNA に特異的に結合することができ、しかも、
電気化学的に活性な遺伝子結合性物質と結合する遺伝子
を、前記検出対象遺伝子を鋳型として合成することので
きる遺伝子合成反応を実施する前の混合液について、 前記 遺伝子結合性物質の存在下での電気化学的応答と、(B)検出対象遺伝子を含む可能性のある 被検試料と、
前記検出対象遺伝子を鋳型として遺伝子を合成すること
のできるプライマーを含む遺伝子合成反応用液とを含む
混合液に対して、前記遺伝子結合性物質と結合する遺伝子を、前記検出対
象遺伝子を鋳型として合成することのできる 遺伝子合成
反応を実施して得られる生成液について、 前記遺伝子結合性物質の存在下での電気化学的応答とを
比較することを特徴とする、前記被検試料中の遺伝子の
検出方法。 - 【請求項2】 (1)検出対象遺伝子を含む可能性のあ
る被検試料と前記検出対象遺伝子を鋳型として遺伝子を
合成することのできるプライマーを含む遺伝子合成反応
用液とを含む混合液に対して、二重鎖DNAに特異的に
結合することができ、しかも、電気化学的に活性な遺伝
子結合性物質と結合する遺伝子を、前記検出対象遺伝子
を鋳型として合成することのできる遺伝子合成反応を実
施可能な部位; (2)前記遺伝子結合性物質の電気化学的応答の測定が
可能な電極を備えた電気化学的応答の測定部位;及び (3)前記の遺伝子合成反応を実施可能な部位内の液
を、前記の遺伝子合成反応を実施可能な部位から、前記
の電極を備えた電気化学的応答の測定部位へ、送液可能
な流路を含む遺伝子の検出用チップであって、 基板層、中間層、及びカバー層を積層した構造からな
り、前記中間層には、前記の遺伝子合成反応実施可能部
位及び測定部位にそれぞれ相当する貫通孔と、前記流路
に相当する溝とが設けられており、前記基板層及びカバ
ー層と一緒になって、前記の遺伝子合成反応実施可能部
位、測定部位、及び流路を形成していることを特徴とす
る、前記の 遺伝子検出用チップ。
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Science,1998年,Vol.282,p.484−487 |
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