JPWO2006033348A1 - 標識酵素 - Google Patents

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Abstract

本発明は、標識酵素および標識酵素を利用した標的物質の検出および／または定量方法に関する。本発明によって、基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素が提供される。また、本発明の標識酵素が触媒するゲル化反応による膜の膜厚および／または屈折率の変化を始めとする物理量の変化を測定することにより、標的物質を共存物質の影響を受けにくく、迅速かつ高感度に検出および／または定量することが可能になる。

Description

本発明は、標識酵素および標識酵素を利用した標的物質の検出および／または定量方法に関する。
現在、抗体・抗原間の親和性を利用して標的物質を検出および／または定量する方法として、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ：エライザ）法に代表される酵素免疫測定法（ＥＩＡ：エンザイムイムノアッセイ）が幅広い分野で利用されており、各種診断や種々の生物学的検査になくてはならない技法の１つとなっている。また、酵素免疫測定法を応用したバイオセンサーであるイムノセンサーも開発され、広く利用されている。
ＥＬＩＳＡ法の測定原理は、標的物質である抗原または抗体を、標識酵素を連結した抗体または抗原と反応させ、その標識酵素の酵素活性から標的物質を検出および／または定量するものである。すなわち、ＥＬＩＳＡ法においては、抗体または抗原による分子認識により得られた信号を、酵素を利用して増幅することによって、標的物質の高感度な検出を達成している。
ここで、ＥＬＩＳＡ法において標識酵素として用いられる酵素の大部分は、ペルオキシダーゼ（Ｆ． Ｐａｔｏｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｇｍｕｉｒ， １５， ３７０３， １９９９）、アルカリフォスファターゼ（Ｅ． Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７５， ５６６５， ２００３）、グルコースオキシダーゼ（Ｋ． Ｋｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ７５（５）， １１１６， ２００３）、およびガラクトシダーゼであり、ＥＬＩＳＡ法を応用したイムノセンサーの場合も上記標識酵素が一般に使用されている（池袋一典、早出広司「酵素電極反応を用いたＤＮＡハイブリダイゼーションの高感度検出」電気化学及び工業物理化学、７２号８巻、ｐ．５９４−５９７、２００４）。これらの方法においては、上記標識酵素が触媒する反応によって生じる反応生成物を、吸光、蛍光、発光によって検出する方法が一般的であり、また、イムノセンサーの場合、標識酵素による酵素反応を電気化学的に検出する方法が主流となっている。その他の酵素反応の検出法としては、標識酵素であるアルカリフォスファターゼ等の反応により不溶性生成物を生成させ、その沈殿物を水晶振動子等のピエゾ素子を利用して検出する方法が知られている（Ｆ． Ｐａｔｏｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９（３）， ２５３， ２００１）。
従来の酵素反応を利用した標的物質の検出および／または定量方法には、不純物や共存物質の影響を受けやすく、安定した測定結果を得にくいという問題が存在した。また、標識酵素を利用して不溶性生成物を生成させる場合は、水晶振動子を用いて検出するしかなく、水中での水晶振動子の発振が不安定であることから、高感度での測定が難しいという問題があった。
以上のような状況に鑑み、本発明の課題は、酵素反応を利用した標的物質の測定方法において、共存物質の影響を受けにくく、標的物質を簡便かつ高感度に検出および／または定量する方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、酵素によるゲル化反応によって生じるゲルによる膜の膜厚および／または屈折率の変化を始めとする物理量の変化を測定することにより、共存物質の影響を受けにくく、標的物質を高感度に検出および／または定量する方法を開発することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の事項に関する。
（１）基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素。
（２）前記標識酵素がプロテアーゼまたはペプチダーゼである、（１）に記載の標識酵素。
（３）前記標識酵素が血液凝固反応に関与する酵素である、（１）または（２）に記載の標識酵素。
（４）前記標識酵素がトロンビンである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の標識酵素。
（５）前記基質がタンパク質である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の標識酵素。
（６）前記基質がフィブリノーゲンである、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の標識酵素。
（７）（ａ）標的物質と；該標的物質を特異的に認識し得る分子認識素子を基材に固定させた固定化分子認識素子と；基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素で標識した、該標的物質を特異的に認識し得る標識化分子認識素子；とを反応させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で生じた固定化分子認識素子−標的物質−標識化分子認識素子の複合体に、該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質を添加して、該基材上にゲルを生成させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）で生じたゲルを含む該基材上の膜の膜厚および／または屈折率の変化を測定する工程、
を含む、標的物質の検出および／または定量方法。
（８）（ａ）標的物質と、基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素で標識した標的物質とを、該標的物質を特異的に認識し得る分子認識素子を基材に固定させた固定化分子認識素子と反応させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で生じた固定化分子認識素子−標的物質の複合体、および固定化分子認識素子−標識化標的物質に、該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質を添加して、該基材上にゲルを生成させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）で生じたゲルを含む該基材上の膜の膜厚および／または屈折率の変化を測定する工程
を含む、標的物質の検出および／または定量方法。
（９）干渉増幅反射法または表面プラズモン共鳴法を利用して膜の膜厚および／または屈折率の変化を測定する、（７）または（８）に記載の標的物質の検出および／または定量方法。
（１０）基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素と；該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質と；を含む標的物質の測定キット。
（１１）基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素と；標的物質を特異的に認識し得る分子認識素子と該標識酵素とを連結させるための試薬と；を含む標的物質の測定キット。
（１２）（ａ）基材に固定化された、標的物質を特異的に認識し得る第１の分子認識素子と；基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素により標識された、標的物質を特異的に認識し得る第２の分子認識素子と；該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質と；標的物質と；を反応させる反応部、ならびに
（ｂ）前記反応により生じたゲルに起因する、該基材上の膜の膜厚および／または屈折率の変化を測定する測定部とを備えた、標的物質を検出および／または定量するためのバイオセンサー。
（１３）（ａ）標的物質と；基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素により標識された標的物質と；基材に固定化された、該標的物質を特異的に認識し得る固定化分子認識素子と；該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質と；を反応させる反応部、ならびに
（ｂ）前記反応により生じたゲルに起因する、該基材上の膜の膜厚および／または屈折率の変化を測定する測定部とを備えた、標的物質を検出および／または定量するためのバイオセンサー。
標識酵素および基質
本発明において使用できる標識酵素は、基質に作用してゲルを生じさせ、膜の膜厚および／または屈折率の変化を生じさせることのできる酵素であれば、特に限定されない。ゲル化反応に必要な酵素はごく少量であるので、本発明によれば、高感度な測定系を構築することが可能である。本発明の標識酵素は、抗原や抗体を始めとする分子認識素子に連結され、分子認識素子を標識する。本発明において使用することのできる標識酵素としては、例えば、プロテアーゼ、ペプチターゼ等を挙げることができるが、これに限定されない。この場合、本発明において使用することのできる基質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド等を挙げることができる。
また、本発明に使用する標識酵素として、血液凝固反応に関与する酵素が好適である。より好ましくは、本発明に使用する標識酵素はトロンビンであり、基質はフィブリノーゲンである。というのは、トロンビンによるフィブリノーゲンのゲル化は、共存物質の影響を受けにくく、安定した測定が可能であるためである。この場合、血液凝固反応に関与する酵素であるトロンビンによって、基質であるフィブリノーゲンが加水分解されてゲル化し、不溶性のフィブリンが生成される。これによって、膜の膜厚および／または屈折率に変化が生じる。
その他には、本発明において、エンドトキシン（内毒素）によるゲル化反応を利用することも好適である。より具体的には、カブトガニの血液凝固反応の１つである、エンドトキシンまたはグリカン類（例えば、β−Ｄ−グリカン等）とカブトガニ血球抽出物（ＬＡＬ、ライセート）とによるゲル化反応を利用することができる。特に、エンドトキシンまたはグリカン類とカブトガニ血球抽出物とによるゲル化反応は、リムルス試験として医薬品等の品質管理等の分野で利用されており、取り扱いが容易なため本発明において好適なゲル化反応である。
カブトガニ血球成分によるゲル化をより詳しく説明すると、以下のような反応が進行している。すなわち、カブトガニのライセート中にはエンドトキシンに反応し活性化されるＣ因子系とβ−Ｄ−グリカン（植物多糖で、真菌細胞壁の構成成分の１つ）と反応し活性化されるＧ因子系が確認されており、これら２つの経路は途中からは共通である。すなわち、不活性型凝固酵素（ｐｒｏｃｌｏｔｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）が活性化され、凝固酵素（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）が生成され、この酵素がその基質であるコアグローゲン（ｃｏａｇｕｌｏｇｅｎ）を部分水解させ、その結果、ペプチドＣ（ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ）が遊離し、コアグリン（ｃｏａｇｕｌｉｎ）が生成しゲル化する。
エンドトキシンと特異的に反応しゲル化するカブトガニ血球成分由来の試薬として、現在、和光純薬工業（コード番号：２９８−２２３４１）および生化学工業（エンドスペシー：登録商標）から市販されており、容易に入手することが可能である。前者はカブトガニのライセートをデキストラン硫酸セファロースカラムで分画後、Ｇ因子系の画分を除いて再構成したものである。後者は、ライセートにカルボキシメチル化カードラン（β−Ｄ−グリカン）を大過剰添加し、Ｇ因子系の活性化を逆に抑制させてエンドトキシン特異的にしたものである。一方、グリカン等と特異的に反応しゲル化するカブトガニ血球成分由来の試薬は、生化学工業、マルハ、和光純薬工業（商品名：β−グリカンテストワコー等）から市販されている。その他、特異性はないが、ゲル化する試薬が生化学工業（商品名：エンドトキシントキシンテスト−Ｄ等）から市販されている。
さらに他の好適なゲル化反応として、ペプチドグリカン（細菌の細胞壁成分の１つ）やβ−グリカン（真菌の細胞壁成分の１つ）等のグリカン類によって活性化されるカイコ体液抽出物によるゲル化反応を挙げることができる。また、カイコ体液抽出物は、ＳＬＰ試薬セットとして和光純薬工業から市販されており（コード番号：２９７−５１５００）、容易に入手可能であり好適である。
また、本発明に使用する標識酵素として、活性化される前の不活性型の酵素や、活性型酵素の前駆体を利用することもできる。さらに、本発明に使用できる基質としては、標識酵素が直接的に作用し、ゲル化する基質だけでなく、この基質の前駆体等を利用することができる。すなわち、本発明における「基質」とは、標識酵素が直接的に作用する基質だけでなく、その前駆体をも含む概念である。また、本発明に使用する基質は、１種類の基質だけでもよく、２種類以上の基質の混合物であってもよい。また、本発明においては、種々の活性化物質を基質の他に添加することもできる。例えば、ゲル化反応が、複数の反応を含むカスケード反応である場合、該カスケード反応を活性化させる活性化物質等を反応系に添加することができる。
標的分子の検出および／または定量方法
本発明の標識酵素によって、分子認識素子を利用した分子認識反応により得られた信号を増幅し、標的分子の高感度な検出を達成することができる。本発明の標識酵素は、あらゆる分子認識反応に利用することができ、したがって、本発明の標識酵素は、抗体や核酸等の生体関連物質を利用した分子認識法だけでなく、包接化合物やモレキュラーインプリンティング法等の化学的な分子認識法に利用することもできる。本発明に好適な分子認識方法としては、例えば、抗体、アプタマーを始めとする核酸、タンパク質、ホルモンレセプター、レクチン、包接化合物、生理活性物質受容体、モレキュラーインプリンティング法により形成した鋳型分子等の分子認識素子を利用した分子認識法を挙げることができる。
酵素免疫測定法
本発明は、公知のあらゆる酵素免疫測定法に対して応用することが可能である。また、本発明は、酵素免疫測定法を応用したイムノセンサーに応用することも可能である。さらに、酵素免疫測定法における抗体抗原反応を、分子認識素子とその認識対象物とによる分子認識反応に置き換えた方法に、本発明を利用することも可能である。
本発明において、酵素免疫測定法とは、酵素反応と免疫反応とを利用することにより、標的物質を検出および／または定量する方法をいう。より具体的には、酵素で標識した抗原または抗体を用いて抗原抗体反応を行い、酵素活性を測定することにより抗原抗体反応を検出して、標的物質を検出および／または定量する方法である。また、一般に、酵素免疫測定法には、競合法と非競合法（例えば、サンドイッチ法）が知られている。競合法は、抗原または抗体を標識酵素で標識し、標識した抗原または抗体を試料中の遊離抗原または遊離抗体と競合させて、対応する抗体または抗原と抗原抗体反応を行わせる。その後、基質を添加して、酵素反応によって抗原抗体反応の信号を増幅し、検出および／または定量を行う。一方、非競合法として一般的なサンドイッチ法では、非標識抗体（１次抗体、第１抗体）を試料中の標的物質（抗原）と結合させ、次いで、酵素標識した標識化抗体（２次抗体、第２抗体）を、抗原と１次抗体との複合体に結合させる。その後、基質を添加して、酵素反応によって抗原抗体反応の信号を増幅し、標的物質の検出および／または定量を行うものである。特に、サンドイッチ法は、信号が２次抗体により増幅されるため、検出感度が高く、応用範囲が広い。その他にも、酵素免疫測定法として、ダブルレイヤー法等が知られており、本発明をこれらの測定法に応用することができる。また、サンドイッチ法を始めとする非競合法では、通常、１次抗体と２次抗体とではそれぞれエピドープが異なるが、本発明においては同一であってもよい。また、抗原抗体反応以外の分子認識素子を利用する場合には、１次抗体および２次抗体に対応する第１の分子認識素子および第２の分子認識素子とでは、標的分子に対する認識部位が同じであっても、異なっていてもよいが、第１の分子認識素子と第２の分子認識素子とでは、標的分子に対する認識部位が異なっていることが好ましい。
標的物質
本発明において標的物質とは、本発明を利用した各種測定方法において、その測定の対象（標的）となる物質をいう。また、本発明において、標的物質は、１種類であっても、２種類以上であってもよい。さらに、本発明の１つの態様においては、分子認識素子によって標的物質を特異的に認識する。したがって、本発明の標的物質は、分子認識素子の認識対象物であることができる。例えば、本発明の１態様において、分子認識素子として抗体を採用した場合、標的物質は、該分子認識素子の認識対象物である抗原とすることができる。
分子認識素子
本発明に使用可能な分子認識素子としては、標的物質を認識することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、分子認識の態様に特に制限はなく、例えば、物理吸着、化学吸着等を利用して分子を認識することができる。したがって、本発明の分子認識素子は、例えば、水素結合、分子間力（ファン・デル・ワールス力）、配位結合、イオン結合、共有結合等により、標的物質を認識することができる。
本発明の分子認識素子の具体例としては、上記のように、例えば、抗体、アプタマーを始めとする核酸、タンパク質、ホルモンレセプター、レクチン、包接化合物、生理活性物質受容体等の生体関連物質を好適に挙げることができる。また、モレキュラーインプリンティング法により形成した鋳型分子を分子認識素子として使用することができる。一方、これらの分子認識素子の認識対象物としては、抗体の場合には抗原、核酸の場合には核酸、タンパク質、チューブリン、キチン等、ホルモンレセプターの場合にはホルモン、レクチンの場合には糖等、包接化合物の場合には包接される成分、生理活性物質受容体の場合には生理活性物質を挙げることができる。また、本発明において、分子認識素子とその認識対象物とは、入れ替えることが可能な概念である。すなわち、一般に、分子認識素子とその認識対象物と考えられている組み合わせであっても、ある観点からは、該認識対象物が該分子認識素子を分子認識しているとも考えられるため、分子認識素子を「認識対象物」、認識対象物を「分子認識素子」と考えることが可能である。本発明においては、例えば、抗体と抗原による分子認識においては、抗体を分子認識素子、抗原を認識対象物とすることが可能である一方、抗体を認識対象物、抗原を分子認識素子と考えることも可能である。
抗体
本発明の分子認識素子として使用できる抗体としては、標的抗原（標的物質）と特異的に抗原抗体反応を生じるものであれば特に制限されず、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれも使用することができる。高感度での検出が可能であるため、感度の点からは、モノクローナル抗体を使用することが好ましい。また、本発明をサンドイッチ法のＥＬＩＳＡ法に適用する場合等は、上記のごとく、１次抗体（第１抗体）および２次抗体（第２抗体）は、それぞれエピトープが同じであっても異なっていてもよいが、異なっていることが好ましい。さらに、本発明において、分子認識素子として使用できる抗体は、抗体の一部分であってもよい。
標的物質を認識する抗体は、例えば、モノクローナル抗体の場合は、精製した病原因子すなわち毒素や菌体等を免疫したマウスの脾細胞とミエローマ細胞との融合細胞のクローンを用いてマウス腹水より誘導したものを用いることができる。またポリクローナル抗体は毒素や菌体等の抗原を用いてウサギ、ヤギ、ラット、ヒツジ、ニワトリ、ブタ、ロバ、モルモット、イヌ、ウシ等を免疫して得られる血清より精製したものを用いることができる。
また、本発明においては、抗体として、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧのＦａｂ'、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）2等も使用することができる。一方、標的抗原（標的物質）に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、血漿タンパク、腫瘍マーカー、アポタンパク、ウイルス、自己抗体、凝固・線溶因子、ホルモン、血中薬物、ＨＬＡ抗原等を挙げることができる。
上記血漿タンパクとしては、例えば、免疫グロブリン（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）、補体成分（Ｃ３，Ｃ４，Ｃ５，Ｃ１ｑ）、ＣＲＰ、α1−アンチトリプシン、α1−マイクログロブリン、β2−マイクログロブリン、ハプトグロビン、トランスフェリン、セルロプラスミン、フェリチン等が挙げられる。
上記腫瘍マーカーとしては、例えば、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ抗原、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、γ−セミノプロテイン、ＴＰＡ、エラスターゼＩ、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、免疫抑制酸性タンパク（ＩＡＰ）等が挙げられる。
上記アポタンパクとしては、例えば、アポＡ−Ｉ、アポＡ−ＩＩ、アポＢ、アポＣ−ＩＩ、アポＣ−ＩＩＩ、アポＥ等が挙げられる。
上記ウイルス抗原としては、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）関連抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連抗原、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＩＶ、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、風疹ウイルス等が挙げられる。上記ＨＣＶ関連抗原としては、例えば、ＨＣＶｃ１００−３リコンビナント抗原、ｐＨＣＶ−３１リコンビナント抗原、ｐＨＣＶ−３４リコンビナント抗原等が挙げられ、それらの混合物が好ましく使用できる。上記ＨＩＶ関連抗原としては、ウイルス表面抗原等が挙げられ、例えば、ＨＩＶ−Ｉ ｅｎｖ．ｇｐ４１リコンビナント抗原、ＨＩＶ−Ｉ ｅｎｖ．ｇｐ１２０リコンビナント抗原、ＨＩＶ−Ｉｇａｇ．ｐ２４リコンビナント抗原、ＨＩＶ−ＩＩ ｅｎｖ．ｐ３６リコンビナント抗原等が挙げられる。また、ウイルス以外の感染症としては、例えば、ＭＲＳＡ、ＡＳＯ、トキソプラズマ、マイコプラズマ、ＳＴＤ等が挙げられる。
上記自己抗体としては、例えば、抗マイクロゾーム抗体、抗サイログロブリン抗体、抗核抗体、リュウマチ因子、抗ミトコンドリア抗体、ミエリン抗体等が挙げられる。
上記凝固・線溶因子としては、例えば、フィブリノーゲン、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）、プラスミノゲン、α2−プラスミンインヒビター、アンチトロンビンＩＩＩ、β−トロンボグロブリン、第ＶＩＩＩ因子、プロテインＣ、プロテインＳ等が挙げられる。
上記ホルモンとしては、例えば、下垂体ホルモン（ＬＨ、ＦＳＨ、ＧＨ、ＡＣＴＨ、ＴＳＨ、プロラクチン）、甲状腺ホルモン（Ｔ3、Ｔ4、サイログロブリン）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副腎皮質ホルモン（アルドステロン、コルチゾール）、性腺ホルモン（ｈＣＧ、エストロゲン、テストステロン、ｈＰＬ）、膵・消化管ホルモン（インスリン、Ｃ−ペプチド、グルカゴン、ガストリン）、その他（レニン、アンジオテンシンＩ，ＩＩ、エンケファリン、エリスロポエチン）等が挙げられる。
上記血中薬物としては、例えば、カルバマゼピン、プリミドン、バルプロ酸等の抗てんかん薬、ジゴキシン、キニジン、ジギトキシン、テオフィリン等の循環器疾患薬、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン等の抗生物質等が挙げられる。
核酸
本発明の分子認識素子として、核酸を利用することができる。核酸は、任意の配列を容易に形成することができる点で、本発明の分子認識素子として好ましく、例えば、１本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ等、２本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ等を使用することができる。この場合、核酸の分子認識の様式は、特に制限されず、例えば、２本鎖形成、３本鎖形成等による核酸の認識を挙げることができる。また、特定の核酸やタンパク質と親和性の強いＤＮＡやＲＮＡのアプタマーは、アフィニティーカラム等を利用して比較的容易に取得することが可能であるため、本発明の分子認識素子としてより好ましい。また、インターカレーターを本発明の分子認識素子として利用し、核酸を分子認識することも可能である。
タンパク質
本発明において分子認識素子として使用できるタンパク質は、特に制限されず、標的物質を認識できさえすればよい。したがって、例えば、本発明の分子認識素子として、多くの重金属、特に亜鉛、カドミウム、銅、水銀等に高い親和性を示す低分子量（約６０００〜１３０００）のタンパク質等を挙げることができる。これらは、動物の肝臓、腎臓、その他の組織中に存在し、最近では微生物体内にも存在することが見出されており、また、システイン含有量が多く、芳香族の残基を殆ど含まないアミノ酸分布を呈していることが知られている。
包接化合物
本発明において分子認識素子として使用できる包接化合物としては、分子認識能を有する限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、筒状（一次元）の空洞を有するもの、層状（二次元）の空洞を有するもの、かご状（三次元）の空洞を有するもの等が好適に挙げられる。
筒状（一次元）の空洞を有する包接化合物としては、例えば、尿素、チオ尿素、デオキシコール酸、ジニトロジフェニル、ジオキシトリフェニルメタン、トリフェニルメタン、メチルナフタリン、スピロクロマン、ＰＨＴＰ（ペルヒドロトリフェニレン）、セルロース、アミロース、シクロデキストリン（但し、溶液中では上記空洞がかご状）、シクロデキストリン誘導体、フェニルホウ酸等が挙げられる。この認識対象物としては、例えば、フェノール誘導体、サリチル酸、安息香酸誘導体及びそのエステル、コレステロール等のステロイド、アスコルビン酸、レチノール、トコフェロール等のビタミン、リモネン等の炭化水素類、ブドウ糖等が挙げられる。
層状（二次元）の包接化合物としては、例えば、粘土鉱物、グラファイト、スメクタイト、モンモリロナイト、ゼオライト等が挙げられる。この認識対象物としては、例えば、親水性物質、極性化合物、Ｏ、ＨＳＯ4 -、ハロゲン、ハロゲン化物、アルカリ金属、ブルシン、コデイン、ｏ−フェニレンジアミン、ベンジジン、ピペリジン、アデニン、グイアニン及びこれらのリポシド、Ｈ2Ｏ等が挙げられる。
上記かご状（三次元）の包接化合物としては、例えば、ヒドロキノン、気体水化物、トリ−ｏ−チモチド、オキシフラバン、ジシアノアンミンニッケル、クリプタンド、カリックスアレン、クラウン化合物等が挙げられる。ここで、クラウン化合物としては、電子供与性のドナー原子として酸素を持つクラウンエーテルのみではなく、そのアナログとして窒素、硫黄等のドナー原子を環構造構成原子として持つ大環状化合物を含み、また、クリプタンドを代表する２個以上の環よりなる複環式クラウン化合物も含まれる。かご状包接化合物の認識対象物としては、例えば、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、イソプロピルアルコール、アセトン、メタノール等が挙げられる。
標識酵素による分子認識素子の標識
本発明においては、標識酵素によって分子認識素子を標識する。標識酵素と分子認識素子とを連結する方法は、特に制限されず、化学的手法を用いてもよいし、遺伝子工学的手法を用いてもよい。また、標識酵素を分子認識素子に直接連結してもよいし、間接的に連結させてもよい。
化学的手法により標識酵素を分子認識素子に連結する場合、上記のごとく、直接連結することもできるし、リンカーやスペーサーを介して間接的に連結させることもできる。また、ジゴキシゲニン、アビジン、ビオチン等の特異的結合を利用して、標識酵素と分子認識素子とを連結することができる。例えば、標識酵素としてトロンビン、分子認識素子としてアプタマーを用いる場合、トロンビンをアビジン標識し、アプタマーをビオチン標識した後に、両者を混合することにより、タックポリメライゼーションによってトロンビン標識されたアプタマーを得ることができる。
また、遺伝子工学的手法により標識酵素を分子認識素子に連結する場合、融合タンパク質法を利用して、例えば、融合タンパク質（キメラタンパク質）として酵素標識された抗体等を作製することもできる。
具体的には、標識酵素の分子認識素子への連結は、これに限定されるものではないが、二価架橋剤を使用する方法を始めとする公知の方法を利用することができる。したがって、例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル基等を利用することができる。アミノ基相互間を結合する場合、例えば、イソシアネート法、グルタルアルデヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等を挙げることができる。また、アミノ基とカルボキシル基とを結合する場合、カルボキシル基をサクシニルイミドエステル化する方法の他、カルボジイミド法、ウッドワード試薬法、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）も適用できる。さらに、チオール基を利用する場合には、例えば、一方の側のカルボキシル基をサクシニルイミドエステル化して、これにシステインを反応させてチオール基を導入し、チオール基反応性二価架橋剤を用いて双方を結合させることができる。その他、フェニル基を利用する方法としてはジアゾ化法、アルキル化法等がある。
なお、分子認識素子に酵素と連結させるための適当な官能基がない場合には、これらにアミノ基、カルボキシル基或いはチオール基等を導入してもよい。その際にはスペーサーを介して導入し、酵素と連結し易くしてもよい。
また、分子認識素子と標識酵素との連結比は１：１には限定されず、任意の比率とすることができる。例えば、グルタルアルデビド法や過ヨウ素酸法（Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２， １０８４， １９７４）を利用して、分子認識素子に複数の標識酵素を連結することができる。
基材
本発明の１つの態様において、分子認識素子（例えば、抗体等）または認識対象物（例えば、抗原等）を基材に固定化することができる。例えば、本発明をＥＬＩＳＡ法に適用する場合等では、本発明の分子認識素子が基材に固定化される。本発明において分子認識素子または認識対象物を固定化する基材としては、公知のあらゆる材料を使用することができる。したがって、例えば、多孔性ガラス、シリカゲル、ヒドロキシアパタイト等の無機高分子化合物；および、金、銀、白金等の金属；が基材として利用可能である。さらに、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート等の合成高分子；デンプン、グルテン、キチン、セルロース、天然ゴム等の天然高分子；およびこれらの誘導体を挙げることができる。また、疎水基を有するアガロース誘導体、ニトロセルロース、およびそれらの誘導体等も、本発明に使用する基材として挙げることができる。特に、本発明においては、使用する測定方法に応じて基材の材質を選択することができ、ＩＥＲ法により測定する場合にはガラスを始めとする高反射性基材、また、ＳＰＲ法により測定する場合には金または銀の薄膜を用いることが好ましい。さらに、上記の基材の形状は、特に限定されず、使用方法に応じて、マイクロプレート、ビーズ、フイルム、シート、膜、チューブ、繊維、スティック等の形状とすることができる。また、基材として、多孔性の物質を採用することもできる。
分子認識素子または認識対象物の基材への固定化
本発明において、抗原または抗体を基材に固定化する場合、固定化の方法は、特に限定されず、公知のあらゆる方法を使用することができる。したがって、分子認識素子または認識対象物、ならびに基材に応じて、物理吸着、包括固定、そして化学的な連結反応による固定化を利用することができる。物理吸着としては、疎水性樹脂表面へのタンパク質の吸着を挙げることができる。包括固定は、ゲルやポリマー等の支持体に固定化すべき物質を包括させることによって固定化を達成する方法である。また、化学的な連結反応に基づく固定化方法は、支持体表面に導入された官能基を、固定化すべき物質の官能基と化学的に連結させる方法である。
化学的な固定化方法としては、例えば、シランカップリング剤、プラズマ重合膜、酸無水物を利用して、分子認識素子または認識対象物を基材へ固定化すること等を挙げることができる。例えば、酸無水物を介した共有結合によって、分子認識素子または認識対象物を基材上に固定化する場合、基材表面に存在する酸無水物基を介して分子認識素子等を固定化してもよいし、基材表面に存在するカルボキシル基、ホルミル基、アミノ基、アジド基、イソシアネート基、クロロホルミル基、エポキシ基等の他の反応性官能基に酸無水物基を導入した後、この酸無水物基を介して分子認識素子等を固定化してもよい。また、酸無水物基、反応性官能基のいずれも高分子材料表面に無い場合には材料表面に直接酸無水物基を導入して分子認識素子等を固定化してもよいし、あるいは反応性官能基を導入した後、酸無水物基を導入して分子認識素子等を固定化してもよい。酸無水物基はスチレン−無水マレイン酸共重合体、エチレン−無水マレイン酸共重合体、メチルビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体等と反応させることにより導入できる他、例えばポリウレタンに無水マレイン酸をγ線や電子線によりグラフト重合させることにより導入することもできる。
高分子材料表面に反応性官能基を導入する方法としては、例えばエチレン−酢酸ビニル共重合体にカルボキシル基を導入する場合は、エチレン−酢酸ビニル共重合体をケン化した後、カルボキシメチル化することにより導入される。また、カルボキシル基はヒドラジル基を経てアジド基に誘導することができる。さらに、カルボキシル基は塩化チオニル、塩化アセチル等によりクロル化することによりクロロホルミル基に変えることもできる。
エチレン−酢酸ビニル共重合体にアミノ基を導入するには、ケン化したエチレン−酢酸ビニル共重合体をアミノアセタール化すればよい。エポキシ基を導入するには、エピクロルヒドリン、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル等と反応させればよい。イソシアネート基はヘキサメチレンジイソシアナート、トリレンジイソシアナート等と反応させることにより導入できる。ホルミル基はグルタルアルデヒド、ジアルデヒドデンプン等と反応させることにより導入できる。
また、原料となるモノマーガスを選択してプラズマ重合を行うことによって、基材表面に多様な官能基を導入する等、種々の化学的な連結に基づく固定化方法を利用することも可能である。ポリスチレン等のように反応性官能基をもたない高分子材料表面にカルボキシル基やアミノ基等の反応性官能基を導入する方法としては、例えばプラズマ処理による方法が知られている。より詳しくは、プラズマ処理として、グロー放電処理、コロナ放電処理等が知られており、用いるガスとして、酸素、窒素、アンモニア等の反応性ガス、ヘリウム、アルゴン等の非反応性ガス、あるいは空気等の混合ガスが知られている。特に、高分子材料表面にカルボキシル基を導入する場合、酸素ガスを用いるのが好ましく、アミノ基を導入する場合、アンモニアガスを用いるのが好ましい。
その他にも、プラズマ重合膜を利用して、分子認識素子等を基材へ固定化することも可能である（特再表０１／０３３２２７）。さらに、限外ろ過膜内部に酵素を保持させ、その表面をプラズマ重合膜でコートする方法（吉村菊子、他，「プラズマ重合法によるセンサー用酵素固定化膜の作成」，分析化学，１９９０，３９：７４９−７５３）や、プラズマ重合膜を利用した包括固定により固定化することもできる（特開平６−１５３９７１）。
膜厚および／または屈折率の測定
本発明においては、標識酵素およびその基質によるゲル化反応に伴う物性（例えば、膜厚、屈折率、密度や重量等）の変化を測定することによって、標的物質の検出および／または定量を行うことができる。しかしながら、上記したように、本発明の方法によれば、標識酵素の働きによって基材上で基質がゲル化され、薄膜を形成し、基材上の膜の膜厚および／または屈折率が変化する。したがって、本発明の標識酵素を利用して標的物質を検出および／または定量する場合、かかる膜厚および／または屈折率の変化を測定する方法を用いることが好ましい。
本発明に好ましい測定方法としては、膜の膜厚および／または屈折率の変化を測定することが可能な方法であれば、あらゆる方法を挙げることができる。より具体的には、本発明において使用できる測定方法として、例えば、干渉増幅反射法（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ：ＩＥＲ法）、表面プラズモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄ：ＳＰＲ法）、エリプソメトリー（Ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ）、光導波路法（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｗａｖｅ−Ｇｕｉｄｅ：ＯＷＧ法）等を挙げることができるが、これに限定されない。光学的な測定方法は比較的簡便かつ迅速な測定が可能なことから、本発明に用いる測定方法としては光学的な方法が好ましい。さらに、ＩＥＲ法やＳＰＲ法は、比較的簡単な測定装置により測定することができるため、より好ましく、特に、汎用性が高く、汎用器の開発が容易な点から、ＩＥＲ法がさらに好ましい。
また、本発明においては、膜の膜厚および／または屈折率の変化を、連続的に測定しても、間欠的に測定してもよく、また、リアルタイムで測定することも可能である。また、本発明においては、標的物質の検出だけでなく、検量線等を作成することにより、標的物質の定量も可能である。
干渉増幅反射法（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ：ＩＥＲ法）
ＩＥＲ法は、ある角度で入射された光の、膜の空気側（又は溶液側）と基材側からの２つの界面からの反射光同士の干渉現象を利用する方法である。例えば、ある膜厚では、２つの界面からの光の位相が強め合うことにより膜厚の増加と共に反射光強度が増加し、また、別の膜厚では、２つの界面からの光の位相が弱め合うことにより膜厚の増加と共に反射光強度が減少する。さらに、反射強度が減少モードから増加モードへ移行する膜厚では、反射強度がゼロとなる無反射状態（Ａｎｔｉ−Ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅ Ｃｏａｔｉｎｇ；ＡＲコート膜）となる。したがって、ＩＥＲ法においては、検出される反射光強度が、膜の光学膜厚（屈折率と膜厚の積）に応じて、サインカーブ状に変化する。よって、本発明の標識酵素の働きによって、膜の膜厚および／または屈折率が変化した場合は、ＩＥＲ法によりその膜厚および／または屈折率の変化を測定することができ、標的物質を検出することができる。例えば、特開平６−２２２００６、特開平７−２６０７７３、特開平６−３４１８９４、特開平８−１８４５６０、特開平９−３２９５５３、特開平１０−１０４１６３、特開２００４−１１７３２５等にＩＥＲ法に関する記載がある。
表面プラズモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄ：ＳＰＲ法）
ＳＰＲ法は、特定の波長の光を、特定の角度から当てると金属の薄膜表面で、光子のエネルギーが金属表面の電子に吸収されて反射されなくなる現象を利用した測定法である。実際の測定では、金属として金、銀、白金を用いることが多く、通常、ガラス等の基材に金の薄膜を貼り付けたチップを用い、金の表面に分子認識素子を連結させることが一般的である。したがって、本発明において膜厚が変化し、金属表面近傍の質量が変動した場合には、ＳＰＲ法によって測定することが可能である。例えば、特開平９−９６６０５、特開平１１−１８３３７２等にＳＰＲ法に関する記載がある。
エリプソメトリー（Ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ）
エリプソメトリーは偏光解析法とも呼ばれ、光の偏光状態の変化を測定して、膜の膜厚や屈折率等を算出することのできる測定法である。
光導波路法（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｗａｖｅ−Ｇｕｉｄｅ：ＯＷＧ法）
ＯＷＧ法は、光導波路内を通過する光により生じるエバネッセント波を利用する測定法で、膜の表面に試料があるとエバネッセント波が吸収されるため、通過する光が減少することを利用した測定法である。例えば、特開平８−１１４５４７、特開平１０−３８８０１等にＯＷＧ法に関する記載がある。
標的物質および試料
本発明の方法により検出および／または定量することのできる標的物質は、特に限定されず、上記のごとく、本発明の分子認識素子によって認識し得る物質であればよい。したがって、本発明によって、例えば、内分泌攪乱物質、農薬、各種薬剤、ホルモン様作用物質、ホルモン、核酸、および、ウイルスや細菌等の微生物を検出および／または定量することができる。より具体的には、内分泌攪乱物質として、例えば、ダイオキシン類、ビスフェノールA、アルキルフェノール、ベンゾピレン、ＰＣＢ、フタル酸エステル等を挙げることができるが、これに限定されない。また、農薬としては、例えば、アミトール、シマジン、パラチオン、ベノミル等を挙げることができるが、これに限定されない。
したがって、本発明の利用分野は、臨床、医薬品、食品、環境分析等、広範囲に渡り、例えば、アトピー性皮膚炎の原因物質特定、スギ花粉の飛散量測定等に、本発明を利用することができる。
また、本発明においては、種々の試料を分析することができる。したがって、本発明によって、土壌、河川の水、上下水道水、大気等の環境試料の他にも、血液（全血、血漿、血清）、リンパ液、唾液、尿、組織病片等の生体からの試料を分析することも可能である。また、出生前診断を行う場合等には、羊水中に存在する胎児の細胞や、試験管内での分裂卵細胞の一部を検体とすることもできる。本発明により分析する試料は、必要に応じて、前処理等の処理を施してもよいことは言うまでもない。例えば、これらの検体は直接、又は必要に応じて遠心分離操作等により沈渣として濃縮した後、例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、超音波処理、或いはこれらの組み合わせ等による細胞破壊処理を予め施したものを使用することができる。したがって、標的物質がダイオキシン類のような有機化合物の場合には、標的物質を有機溶媒で抽出することができる。
図１は、トロンビンを固定化した基板上にフィブリノーゲンを添加した場合のＩＥＲシグナルの変化を示す図である（実施例１）。図中、（１）はトロンビン固定化基材にフィブリノーゲンを添加した場合、（２）はＢＳＡ固定化基材にフィブリノーゲンを添加した場合である。 図２は、ＨＳＡを固定化した基板上にトロンビン標識ＨＳＡ抗体を添加した場合のＩＥＲシグナルの変化を示す図である（実施例３）。図中、（１）はＨＳＡ固定化基材にトロンビン標識ＨＳＡ抗体を添加した場合、（２）はＨＳＡ固定化基材にトロンビン標識ＨＳＡ抗体およびＨＳＡを添加した場合、（３）はＢＳＡ固定化基材にトロンビン標識HＳＡ抗体を添加した場合である。 図３は、ＨＳＡを固定化した基板上に、トロンビン標識ＨＳＡ抗体とＨＳＡとを添加した場合のＩＥＲシグナルを示す図である（実施例３−２）。 図４は、ＨＳＡを固定化した基板上に、トロンビン標識ＨＳＡ抗体とＢＳＡとを添加した場合のＩＥＲシグナルを示す図である（実施例３−２）。 図５は、図３及び図４を基に、縦軸をＩＥＲシグナルの変化、横軸をＨＳＡ又はＢＳＡの添加量とした図である（実施例３−２）。 図６は、洗浄工程を行わずに測定したＩＥＲシグナルを示す図である（実施例４）。
発明を実施するための態様
標識酵素
本発明は、１つの態様において、標識酵素である。本発明のこの標識酵素は、上記したように、基質をゲル化させる反応を触媒する、各種の標識化に用いることができる酵素である。例えば、上記ゲル化反応を触媒することができるプロテアーゼ、ペプチダーゼ等を挙げることができる（この場合の基質としては、タンパク質、ポリペプチド等を挙げることができる）。中でも、血液凝固反応に関与する酵素が好適であり、さらには、トロンビン（この場合の基質はフィブリノーゲン）がより好適である。
標的物質の検出および／または定量方法
本発明は、１つの態様において、標的物質を酵素免疫測定法により検出およびまたは定量する方法である。したがって、例えば、サンドイッチ法に本発明を利用した場合、本発明は、以下の工程を含むことができる：
（ａ）標的物質を含む試料と；該標的物質を特異的に認識し得る抗体（１次抗体）を基材に固定させた固定化抗体と；基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素で標識した、該標的物質を特異的に認識し得る標識化抗体（２次抗体）；とを反応させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で生じた固定化抗体−標的物質−標識化抗体の複合体に、該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質を添加して、該基材上にゲルを生成させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）で生じたゲルによる該基材上の膜の膜厚および／または屈折率の変化を測定する工程。
また、本発明は、競合法による酵素免疫測定法において、例えば、以下の工程を含むことができる：
（ａ）標的物質を含む試料と；基質をゲル化する反応を触媒する標識酵素で標識した抗原を含む試料と；該標的物質および該抗原を特異的に認識し得る抗体を基材に固定させた固定化抗体と；を反応させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で生じた固定化抗体−標的物質の複合体、および固定化抗体−標識化抗原に、該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質を添加して、該基材上にゲルを生成させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）で生じたゲルによる該基材上の膜の膜厚および／または屈折率の変化を測定する工程。
ここで、上記態様においては、標的物質と、基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素で標識した抗原とが１つの試料に含まれていてもよい。
測定キット
本発明は、１つの態様において、標的物質の測定キットを提供する。本発明の標的物質の測定キットは、ある態様において、基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素と、該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質と、標的物質を特異的に認識し得る分子認識素子とを含む。本発明の測定キットは、さらに、分子認識素子または認識対象物（例えば、抗体または抗原）が固定化される基材、標準溶液、ゲル化反応の増感剤、バッファー、使用説明書、パッケージ等を含んでもよい。
また、本発明は、１つの態様において、分子認識素子を標識するためのキットを提供する。本発明のキットは、ある態様において、基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素と；該標識酵素を分子認識素子と連結させるための試薬とを含む。連結させるための試薬は、１種類であっても、２種類以上であってもよい。また、上記キットは、他の要素を含んでいてもよく、例えば、上記標識酵素によって標識した分子認識素子を保存するための溶液（例えば、バッファー等）、分子認識素子または認識対象物（例えば、抗体または抗原）が固定化される基材、標準溶液、ゲル化反応の増感剤、バッファー、使用説明書、パッケージ等を含んでもよい。
バイオセンサー
本発明は、１つの態様において、標的物質を検出および／または定量するためのバイオセンサーを提供する。
本発明のバイオセンサーは、１つの態様において、（ａ）基材に固定化された、標的物質を特異的に認識し得る第１の分子認識素子（例えば１次抗体）と；基質をゲル化する反応を触媒する標識酵素により標識された、標的物質を特異的に認識し得る第２の分子認識素子（例えば２次抗体）と；該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質と；標的物質と；を反応させる反応部、ならびに、（ｂ）前記反応により生じたゲルに起因する、該基材上の膜の膜厚および／または屈折率の変化を測定する測定部とを備える。
また、本発明のバイオセンサーは、１つの態様において、（ａ）標的物質と；基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素により標識された標的物質と；基材に固定化された、該標的物質を特異的に認識し得る固定化分子認識素子と；該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質と；を反応させる反応部、ならびに、（ｂ）前記反応により生じたゲルに起因する、該基材上の膜の膜厚および／または屈折率の変化を測定する測定部とを備える。
［発明の効果］
本発明によれば、共存物質の影響が少なく、標的物質を高感度に検出および／または定量することができる。また、本発明によれば、簡便な装置により、標的物質を高感度に検出および／または定量することが可能になる。
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
トロンビンとフィブリノーゲンとにより生じるゲルをＩＥＲ法により測定した。
実験手順
１．ガラス基板（１４．５ｍｍ×１４．５ｍｍ）を、１０％ ３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（γ−ＡＰＴＥＳ：信越化学工業製）中で９９℃にて一晩インキュベートし、次いで、２％ グルタルアルデヒド（和光純薬工業製）溶液で室温にて３時間処理した。
２．上記基板上にトロンビン溶液（ヒトトロンビン １０μｇ／ｍｌ：和光純薬工業製）を１ｍｌ添加し、室温にて３時間インキュベートして、基板上にトロンビンを固定した。
３．基板を洗浄後、フィブリノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍｌ、Ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ ２００μｌ：和光純薬工業製）を添加し、ＩＥＲシグナルを測定した。
４．対照として、同様の手順でウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を固定化した基板を作成し、ＩＥＲシグナルを測定した。
測定結果
結果を図１に示す。トロンビンを固定化した基板については、フィブリノーゲンを添加すると、フィブリノーゲンのゲル化が起こり、このゲルによる膜厚および／または屈折率の変化をＩＥＲ法により測定できることが確認された。一方、トロンビンを基板上に固定化せず、単にフィブリノーゲンを添加しただけの場合、大きなＩＥＲシグナルの変化を測定することはできなかった。すなわち、基板のごく近傍で薄膜が形成された場合にのみ、大きなＩＥＲシグナルの変化が測定された。一方、ＢＳＡを固定化した基板では、ＩＥＲシグナルの変化は観察されなかった。これは、ＢＳＡによってはフィブリノーゲンのゲル化が起こらないため、ＩＥＲシグナルの変化が測定されなかったものと考えられる。
以上から、標識酵素としてトロンビンを固定化した基板に、基質であるフィブリノーゲンを添加すると、フィブリノーゲンがフィブリンに分解されゲル化し、このゲル化により生じた膜の膜厚および／または屈折率の変化をＩＥＲ法により測定できることが確認された。
［実施例１−２］
トロンビンとフィブリノーゲンとにより生じるゲルをエリプソメトリー法により測定した。
実験手順
トロンビンを固定化した基板をエリプソメトリーにより測定した以外は、実施例１と同様にして、トロンビンとフィブリノーゲンとの反応によるゲル化を測定した。
エリプソメトリーの測定条件は以下の通りである。
自動エリプソメーター：ＤＨＡ−ＸＡ（溝尻光学工業製）
光源：Ｈｅ−Ｎｅレーザー、波長６３２．８ｎｍ
入射角度：７０度
測定結果
測定の結果、トロンビンとフィブリノーゲンとの反応により生じたゲルが確認され、ゲルの膜厚は１１３．５ｎｍであった。
以上から、標識酵素としてトロンビンを固定化した基板に、基質であるフィブリノーゲンを添加すると、フィブリノーゲンがフィブリンに分解されゲル化し、このゲル化により生じた膜の膜厚および／または屈折率の変化をエリプソメトリーによっても測定できることが確認された。また、エリプソメトリーによるゲル膜厚の測定により、基板に固定化されたトロンビンとフィブリノーゲンとによるゲルが、基板の近傍で生じていることが確認された。
［実施例２］
実験手順
１．ガラス基板（１４．５ｍｍ×１４．５ｍｍ）を、１０％ ３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（γ−ＡＰＴＥＳ：信越化学工業製）中で９９℃にて一晩インキュベートし、次いで、２％ グルタルアルデヒド（和光純薬工業製）溶液で室温にて３時間処理した。
２．上記基板上に異なる濃度のトロンビン溶液（ウシトロンビン １０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ：和光純薬工業製）を１ｍｌ添加し、室温にて３時間インキュベートして、基板上にトロンビンを固定した。
３．基板を洗浄後、フィブリノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍｌ、Ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ ２００μｌ：和光純薬工業製）を添加し、ＩＥＲシグナルを測定した。
４．対照として、同様の手順でウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を固定化した基板を作成し、ＩＥＲシグナルを測定した。
測定結果
結果を表１に示す。１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌのウシトロンビン溶液を基板に添加した場合、この基板にフィブリノーゲンを添加した後８分経過時点において、ＩＥＲシグナルの変化が確認された。一方、ＢＳＡを基板に添加した場合は、ＩＥＲシグナルの変化はほとんど検出されなかった。この結果から、トロンビンを固定化した基板上にフィブリノーゲンを添加して、ゲルを生じさせ、それにより生じた膜の膜厚および／または屈折率の変化をＩＥＲ法により測定できることが確認された。
［実施例３］
実験手順
Ａ．抗体のトロンビン標識
以下の手順に従い、マレイミド・ノンヒンジ法により抗体をトロンビン標識した。
１．ＩｇＧへのＳＨ基導入
（１）１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む、５０ｍＭのリン酸カリウムバッファーを調製し、ｐＨ７．０に調整した（以下、バッファーＡとする）。
（２）５００μｌのバッファーＡにＩｇＧを０．５ｍｇ添加し、ＩｇＧ溶液を調製した。
（３）上記ＩｇＧ溶液に、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）のＤＭＳＯ溶液（２０ｍＭ、８０μｌ）を添加し、３０℃にて１０分間インキュベートして、ジスルフィド結合を形成させた。
（４）バッファーＡで透析し、未反応のＳＰＤＰを除去した。
（５）ＩｇＧサンプル１ｍｌあたりジチオスレイトール（ＤＴＴ、和光純薬製）を１２ｍｇ添加し、室温にて３０分間インキュベートし、ＳＨ基を導入する。
（６）インキュベート後、すぐに冷却し、ＰＢＳで透析して、ＤＴＴを除去する。
２．トロンビンへのマレイミド基導入
（１）５０ｍＭのリン酸カルシウムバッファーをｐＨ７．０に調整した（以下、バッファーＢとする）。
（２）１ｍｌのバッファーＢにトロンビンを４００μｇ添加し、トロンビン溶液を調製した。
（３）上記トロンビン溶液に、２５０μｇのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を添加し、３０℃にて１０分間インキュベートした。
（４）インキュベート後、すぐに冷却した。
（５）脱塩カラムＮＡＰ１０で処理し、リン酸バッファー（ＰＢＳ）で処理した。
３．ＩｇＧへのトロンビンの連結
上記１で調製したＳＨ基導入ＩｇＧと、２で調製したマレイミド基導入トロンビンとを混合して、４℃にて４時間以上インキュベートした。
Ｂ．トロンビン標識抗体によるＨＳＡの検出
（１）実施例１と同様にして、ガラス基板上にＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）およびＢＳＡを固定化した。
（２）ＨＳＡ固定化基板上に、トロンビン標識抗体約４００μg/ｍｌを含む溶液２００μｌを添加し、３０分間室温でインキュベートした後、抗体溶液を取り除いてＰＢＳで３回洗浄した。その後２ ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン溶液を２００μl添加して、ＩＥＲシグナルを測定した。
（３）トロンビン標識抗体溶液２００μｌに３．５ ｍｇのＨＳＡ（抗体のモル量の約１００倍のモル量）を添加し、１０分間室温でインキュベートした。その後、ＨＳＡ固定化基板上に、上記のインキュベートした溶液を２００μｌ添加し、３０分間室温でインキュベートした後、抗体溶液を取り除いてＰＢＳで３回洗浄した。その後２ ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン溶液を２００μl添加して、ＩＥＲシグナルを測定した。
（４）ＢＳＡ固定化基板を用い、上記（２）と同様にＩＥＲシグナルを測定した。
測定結果
結果を図２に示す。ＨＳＡ固定化基板にトロンビン標識ＨＳＡ抗体を添加した場合（１）、ＩＥＲシグナルに大きな変化が測定され、トロンビンとフィブリノーゲンとによるゲル化によって生じたＨＳＡ固定化基板上の膜の膜厚等の変化を検出することができた。一方、トロンビン標識ＨＳＡ抗体とＨＳＡとをあらかじめ混合した溶液を、ＨＳＡ固定化基板に添加した場合（２）、ＩＥＲシグナルに変化が見られたが、（１）のシグナル変化よりは小さかった。すなわち、ＨＳＡを固定化した基板に、（１）トロンビン標識ＨＳＡ抗体のみを添加した場合と、（２）トロンビン標識ＨＳＡ抗体とＨＳＡとを競合させて添加した場合とで、ＩＥＲシグナルの変化に有意な差が確認された。一方、ＢＳＡ固定化基板にトロンビン標識ＨＳＡ抗体を添加した場合（３）、ＩＥＲシグナルの変化はほとんどなく、膜の膜厚および／または屈折率の変化がほとんど生じていないことが確認された。この結果から、本発明の方法によって、試料中のＨＳＡを検出できることが示された。
［実施例３−２］
実験手順
［実施例３］の「Ａ．抗体のトロンビン標識」に記載の方法により抗体をトロンビン標識し、「Ｂ．トロンビン標識抗体によるＨＳＡの検出」に記載されたものと同様の方法により基板上に生じたゲルをＩＥＲで測定した。アッセイは、実施例３と同様に競合法で行い、トロンビン標識抗体の添加とともに、５００ｐＭ，５ｎＭ，５０ｎＭ，５００ｎＭ，５μＭのＨＳＡをＨＳＡ固定化基板に添加した。また、コントロールとして、トロンビン標識抗体とともに、５００ｐＭ，５ｎＭ，５０ｎＭ，５００ｎＭ，５μＭのＢＳＡをＨＳＡ固定化基板に添加した。
測定結果
図３に示すように、トロンビン標識ＨＳＡ抗体に加えて、ＨＳＡを添加しなかった場合、トロンビン標識ＨＳＡ抗体と基板上のＨＳＡとの反応が競争阻害されないため、トロンビン標識ＨＳＡ抗体と基板上のＨＳＡとが多く結合し、フィブリノーゲンの添加によって基板上にゲルが生じるため、ＩＥＲシグナルの変化が大きかった。一方、トロンビン標識ＨＳＡ抗体に加えて、ＨＳＡを添加した場合は、トロンビン標識ＨＳＡ抗体と基板上のＨＳＡとの反応が、添加したＨＳＡにより阻害されるため、トロンビン標識ＨＳＡ抗体と基板上のＨＳＡとの反応が少なくなり、フィブリノーゲンを低下しても多くのゲルが生じず、ＩＥＲシグナルの変化は小さくなった。
一方、ＢＳＡを添加した場合を図４に示す。この場合、ＢＳＡは、トロンビン標識ＨＳＡ抗体と基板上のＨＳＡとの反応を阻害できないため、ＩＥＲシグナルは、添加するＢＳＡの濃度が変化しても同じだった。
さらに、縦軸をＩＥＲシグナルの変化、横軸をＨＳＡ又はＢＳＡの添加量とした図を図５に示す。これによれば、ＨＳＡの濃度が５ｎＭ程度であっても、本発明の方法により十分に検出可能であることが示された。
［実施例４］
実験手順
［実施例３］の「Ａ．抗体のトロンビン標識」に記載の方法により抗体をトロンビン標識した。そして、洗浄工程を行わないこと以外は、［実施例３］の「Ｂ．トロンビン標識抗体によるＨＳＡの検出」に記載されたものと同様の方法により基板上に生じたゲルをＩＥＲで測定した。アッセイは、実施例３と同様に競合法で行い、トロンビン標識抗体の添加とともに、５μＭのＨＳＡをＨＳＡ固定化基板に添加する場合、及び、トロンビン標識抗体の添加のみで、ＨＳＡをＨＳＡ固定化基板に添加しない場合について、ＩＥＲを測定した。
測定結果
図６に示すように、トロンビン標識ＨＳＡ抗体に加えて、ＨＳＡを添加しなかった場合、ＩＥＲシグナルの変化は大きく（ΔＩＥＲシグナル＝−０．００１８１Ｖ／ｓｅｃ）、トロンビン標識ＨＳＡ抗体に加えて、ＨＳＡを添加した場合は、ＩＥＲシグナルの変化は小さかった（ΔＩＥＲシグナル＝−０．０００５８Ｖ／ｓｅｃ）。
このように本発明によれば、従来法では必要とされた洗浄工程を行わなくとも、目的物質を高感度で測定できることが示された。これは、本発明の方法では基板近傍のゲルを測定するために特に洗浄工程を行わなくとも目的物質の測定が可能になったものと思われるが、本発明は必ずしもこの理論に拘束されるわけではない。

Claims (13)

  1. 基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素。
  2. 前記標識酵素がプロテアーゼまたはペプチダーゼである、請求項１に記載の標識酵素。
  3. 前記標識酵素が血液凝固反応に関与する酵素である、請求項１または２に記載の標識酵素。
  4. 前記標識酵素がトロンビンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の標識酵素。
  5. 前記基質がタンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の標識酵素。
  6. 前記基質がフィブリノーゲンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標識酵素。
  7. （ａ）標的物質と；該標的物質を特異的に認識し得る分子認識素子を基材に固定させた固定化分子認識素子と；基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素で標識した、該標的物質を特異的に認識し得る標識化分子認識素子；とを反応させる工程、
    （ｂ）工程（ａ）で生じた固定化分子認識素子−標的物質−標識化分子認識素子の複合体に、該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質を添加して、該基材上にゲルを生成させる工程、
    （ｃ）工程（ｂ）で生じたゲルを含む該基材上の膜の膜厚および／または屈折率の変化を測定する工程、
    を含む、標的物質の検出および／または定量方法。
  8. （ａ）標的物質と、基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素で標識した標的物質とを、該標的物質を特異的に認識し得る分子認識素子を基材に固定させた固定化分子認識素子と反応させる工程、
    （ｂ）工程（ａ）で生じた固定化分子認識素子−標的物質の複合体、および固定化分子認識素子−標識化標的物質に、該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質を添加して、該基材上にゲルを生成させる工程、
    （ｃ）工程（ｂ）で生じたゲルを含む該基材上の膜の膜厚および／または屈折率の変化を測定する工程
    を含む、標的物質の検出および／または定量方法。
  9. 干渉増幅反射法または表面プラズモン共鳴法を利用して膜の膜厚および／または屈折率の変化を測定する、請求項７または８に記載の標的物質の検出および／または定量方法。
  10. 基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素と；
    該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質と；
    を含む標的物質の測定キット。
  11. 基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素と；
    標的物質を特異的に認識し得る分子認識素子と該標識酵素とを連結させるための試薬と；
    を含む標的物質の測定キット。
  12. （ａ）基材に固定化された、標的物質を特異的に認識し得る第１の分子認識素子と；基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素により標識された、標的物質を特異的に認識し得る第２の分子認識素子と；該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質と；標的物質と；を反応させる反応部、ならびに
    （ｂ）前記反応により生じたゲルに起因する、該基材上の膜の膜厚および／または屈折率の変化を測定する測定部とを備えた、標的物質を検出および／または定量するためのバイオセンサー。
  13. （ａ）標的物質と；基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素により標識された標的物質と；基材に固定化された、該標的物質を特異的に認識し得る固定化分子認識素子と；該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質と；を反応させる反応部、ならびに
    （ｂ）前記反応により生じたゲルに起因する、該基材上の膜の膜厚および／または屈折率の変化を測定する測定部とを備えた、標的物質を検出および／または定量するためのバイオセンサー。

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