KR101971246B1 - 폴리도파민과 단백질 g의 혼합용액으로 개질된 코팅층을 포함하는 바이오센서 및 상기 바이오센서를 이용한 생물시료의 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 평면 또는 입체 구조의 고체 기판; 상기 기판의 표면에 폴리도파민과 단백질 G의 혼합용액으로 개질된 코팅층; 및 상기 코팅층에 고정된 바이오리셉터;를 포함하는 바이오센서, 폴리도파민과 단백질 G의 혼합용액을 기판의 표면에 도포하여 표면개질하는 단계; 및 상기 표면개질된 기판에 바이오리셉터를 고정화하는 단계;를 포함하는 바이오센서의 제조방법 및 상기 바이오센서를 이용한 생물시료의 검출 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 폴리도파민과 단백질 G의 혼합용액으로 개질된 코팅층을 포함하는 바이오센서 및 상기 바이오센서를 이용한 생물시료의 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폴리도파민과 단백질 G의 혼합용액을 이용해 기판 표면을 개질하고, 개질된 기판 표면에 바이오리셉터를 균일하게 고정화하여 제조된 바이오센서 및 상기 바이오센서를 이용한 생물시료의 검출 방법에 관한 것이다.
도파민(dopamine)이란 카테콜(cathecol)기와 아민(amine)기를 포함하는 카테콜아민 신경전달물질로, 홍합 유래 접착 단백질에서 많이 발견된다. 도파민은 염기성 pH 조건에서 자가중합(self-polymerization)하여 다양한 물체의 표면 개질이 가능하도록 한다. 폴리도파민(polydopamine)이 코팅된 물체의 표면은 추가적으로 다른 화학적/생물학적(chemical/biological) 분자와의 결합을 통해, 물체 표면의 2차 코팅이 가능해진다.
폴리도파민의 이러한 성질을 이용하여 항체로 대표되는 다양한 바이오리셉터(bioreceptor)를 기판(substrate) 표면에 고정화(immobilization)시키면 다양한 종류의 생체분자를 검출하는 바이오센서에 응용할 수 있다. 폴리도파민을 이용하면, 현재 바이오리셉터의 고정화에 사용되는 복잡한 화학적 링커(chemical linker)의 결합반응을 생략할 수 있고, 동시에 다양한 기판의 표면 개질이 가능한 장점이 있다.
한편, 단백질 G(protein G)란 항체의 Fc 도메인에 결합함으로써 항체의 배향성(orientation)을 향상시켜, 바이오센서의 검체에 대한 민감도(sensitivity)와 선택성(selectivity)을 높이는 용도로 많이 활용되고 있다.
현재 바이오센서 분야에서 기판의 종류에 따라 바이오리셉터 고정화 방법이 달라 바이오센서의 검출 선택성 및 감도의 재현성이 떨어지는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 폴리도파민과 단백질 G의 혼합용액으로 다양한 기판의 표면을 개질한 후 항체 고정화를 시도하여 검체를 검출한 결과, 모든 종류의 기판에서 검체가 검출되는 것을 확인하였다.
한편, 한국등록특허 제1542138호에는 '폴리도파민계 나노입자, 불수용성 약물이 표면에 코팅된 폴리도파민계 나노입자 및 이들의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1300187호에는 '융합 단백질 및 이를 포함하는 바이오센서'가 개시되어 있으나, 본 발명의 폴리도파민과 단백질 G의 혼합용액으로 개질된 코팅층을 포함하는 바이오센서 및 상기 바이오센서를 이용한 생물시료의 검출 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 유리 기판의 표면을 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액으로 코팅한 경우에 폴리도파민 단독 코팅 및 폴리도파민과 단백질 G의 순차적 코팅의 경우보다, 목적하는 검체의 검출이 가장 잘 이루어지는 것을 확인하였으며, 폴리도파민과 단백질 G의 혼합용액을 이용하여 다양한 기판의 표면을 개질하고 항체를 고정한 결과, 기판의 종류에 상관없이 균일하게 항체를 고정화할 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은, 평면 또는 입체 구조의 고체 기판; 상기 기판의 표면에 폴리도파민과 단백질 G의 혼합용액으로 개질된 코팅층; 및 상기 코팅층에 고정된 바이오리셉터;를 포함하는 바이오센서를 제공한다.
또한, 본 발명은 폴리도파민과 단백질 G의 혼합용액을 제조하는 단계; 상기 혼합용액을 기판의 표면에 도포하여 표면개질하는 단계; 및 상기 표면개질된 기판에 바이오리셉터를 고정화하는 단계;를 포함하는 바이오센서의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 이용한 생물시료의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 폴리도파민과 단백질 G의 혼합용액은 다양한 특성을 가지는 기판의 표면에 바이오리셉터의 고정화가 간편하게 이루어지도록 함으로써, 바이오센서로 활용할 수 있는 물질의 범위를 넓힐 수 있는 장점이 있다. 또한, 대부분의 기판에 동일한 방법으로 바이오리셉터를 고정화시키는 본 발명은 궁극적으로 바이오센서의 검출 재현성, 선택성을 크게 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액을 이용하여 물체 표면을 개질하고, 항체를 고정화하며, 비특이적 결합을 방지하기 위해 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)을 이용하여 블록킹(blocking)시키는 단계를 보여주는 모식도이다.
도 2는 상기 도 1에서 제작된 항체가 고정화된 센서에 검출 대상(pH1N1)을 검출하는 단계를 보여주는 모식도이다.
도 3은 유리 기판 표면을 각각 폴리도파민 단독 코팅, 폴리도파민 코팅 후 단백질 G 코팅 및 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액으로 코팅하고 항체를 고정화한 후에 pH1N1 바이러스를 검출한 결과이다.
도 4는 최적의 항체 고정화 조건을 찾기 위해, 폴리도파민과 혼합하는 단백질 G의 농도를 변경하여, pH1N1 바이러스를 검출한 결과로, (A)는 유리 기판 표면에서 육안으로 관찰되는 검출 결과의 사진이고, (B)는 grayscale 세기를 수치화한 그래프이다.
도 5는 검출 대상체인 pH1N1 바이러스의 농도별 검출능을 확인한 결과로, (A)는 유리 기판 표면에서 육안으로 관찰되는 검출 결과의 사진이고, (B)는 grayscale 세기를 수치화한 그래프이다.
도 6은 각기 다른 소재의 기판을 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액을 이용하여 표면 개질하고 항체를 고정한 후 pH1N1 바이러스를 검출한 결과이다. Glass, 유리; Plastic, 플라스틱; Vinyl, 비닐; Sapphire, 사파이어; Paper, 종이; Si, 실리콘; SiO2, 실리카.
도 7은 SOG(spin on glass) 나노구조체 표면을 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액 및 다양한 종류의 화학적 링커로 개질하고, GFP(green fluorescent protein)에 대한 항체를 고정화한 후, GFP 단백질을 반응시켜 측정한 형광이미지를 보여주는 사진이다. contact angle, 접촉각; FL image, 형광이미지; Bare SOG NP, 화학적 링커 무처리 SOG; APTMS, (3-aminopropyl)trimethoxysilane; GPTMS, (3-glycidoxypropyl)trimethoxysilane; Epoxy, 에폭시, Polydopamine + Protein G, 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액.
도 8은 도 7 형광이미지의 형광세기를 수치화한 그래프이다.
도 9는 SOG 나노구조체 표면을 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액으로 개질하고 pH1N1을 검출한 결과로, (A)는 실험의 모식도이고, (B)는 바이러스 검출 결과이다.
도 2는 상기 도 1에서 제작된 항체가 고정화된 센서에 검출 대상(pH1N1)을 검출하는 단계를 보여주는 모식도이다.
도 3은 유리 기판 표면을 각각 폴리도파민 단독 코팅, 폴리도파민 코팅 후 단백질 G 코팅 및 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액으로 코팅하고 항체를 고정화한 후에 pH1N1 바이러스를 검출한 결과이다.
도 4는 최적의 항체 고정화 조건을 찾기 위해, 폴리도파민과 혼합하는 단백질 G의 농도를 변경하여, pH1N1 바이러스를 검출한 결과로, (A)는 유리 기판 표면에서 육안으로 관찰되는 검출 결과의 사진이고, (B)는 grayscale 세기를 수치화한 그래프이다.
도 5는 검출 대상체인 pH1N1 바이러스의 농도별 검출능을 확인한 결과로, (A)는 유리 기판 표면에서 육안으로 관찰되는 검출 결과의 사진이고, (B)는 grayscale 세기를 수치화한 그래프이다.
도 6은 각기 다른 소재의 기판을 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액을 이용하여 표면 개질하고 항체를 고정한 후 pH1N1 바이러스를 검출한 결과이다. Glass, 유리; Plastic, 플라스틱; Vinyl, 비닐; Sapphire, 사파이어; Paper, 종이; Si, 실리콘; SiO2, 실리카.
도 7은 SOG(spin on glass) 나노구조체 표면을 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액 및 다양한 종류의 화학적 링커로 개질하고, GFP(green fluorescent protein)에 대한 항체를 고정화한 후, GFP 단백질을 반응시켜 측정한 형광이미지를 보여주는 사진이다. contact angle, 접촉각; FL image, 형광이미지; Bare SOG NP, 화학적 링커 무처리 SOG; APTMS, (3-aminopropyl)trimethoxysilane; GPTMS, (3-glycidoxypropyl)trimethoxysilane; Epoxy, 에폭시, Polydopamine + Protein G, 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액.
도 8은 도 7 형광이미지의 형광세기를 수치화한 그래프이다.
도 9는 SOG 나노구조체 표면을 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액으로 개질하고 pH1N1을 검출한 결과로, (A)는 실험의 모식도이고, (B)는 바이러스 검출 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
평면 또는 입체 구조의 고체 기판;
상기 기판의 표면에 폴리도파민과 단백질 G의 혼합용액으로 개질된 코팅층; 및
상기 코팅층에 고정된 바이오리셉터;를 포함하는 바이오센서를 제공한다.
용어 '바이오센서(biosensor)'는 복잡한 시료전처리 없이도 기질 및 기질 유사체, 항원, 세포, 보결분자단(prosthetic group), 저해제(inhibitor), 보조인자(cofactor) 등과 같이 시료 중에 존재하는 특정성분을 선택적으로 신속히 측정할 수 있는 장치로서, 밀집된 구조와 편의성을 지닌다. 바이오센서는 크게 보아 고정화된 바이오리셉터와 분석대상물질간의 결합현상을 이용하는 bioaffinity 센서와, 효소나 미생물이 분석대상물질과 반응시 생성되는 반응산물을 측정하는 enzymatic/metabolic 센서로 분류할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 바이오센서에 있어서, 상기 기판은 금, 은, 백금, 구리, 팔라듐, 니티놀, 스테인리스 강 등의 금속; 실리카, 이산화티타늄, 산화알루미늄, 산화니오븀 등의 산화물; 갈륨비소, 질화규소 등의 반도체; 수산화인회석 등의 세라믹; 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리디메틸실록산, 폴리에티르에티르케톤, 폴리염화비닐 등의 합성 폴리머; 및 종이로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 소재로 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 그 형태가 평면 또는 3D의 입체구조일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 바이오센서에 있어서, 상기 바이오리셉터는 측정하고자 하는 생물시료 물질과 선택적으로 결합할 수 있는 생물학적 인식요소로, 항체, 효소, 항원, 압타머, 렉틴, 핵산, 단백질, 지질, 당 또는 호르몬 수용체일 수 있고, 바람직하게는 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한,
폴리도파민과 단백질 G의 혼합용액을 제조하는 단계;
상기 혼합용액을 기판의 표면에 도포하여 표면개질하는 단계; 및
상기 표면개질된 기판에 바이오리셉터를 고정화하는 단계;를 포함하는 바이오센서의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 혼합용액 중의 폴리도파민은 0.5~1.2 mg/ml의 농도일 수 있고, 바람직하게는 0.9~1.1mg/ml의 농도일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 혼합용액 중의 단백질 G는 6~18 mg/ml의 농도일 수 있으며, 바람직하게는 8~15 mg/ml의 농도일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 혼합용액 내 단백질 G의 농도가 6 mg/ml 미만 또는 18 mg/ml 초과일 때에는 바이오리셉터의 음성 대조구에서 양성의 신호가 확인되어, 정확한 검체의 분석이 불가능하게 된다.
본 발명의 바이오센서는 상기와 같이 폴리도파민과 단백질 G의 혼합용액으로 표면 개질된 기판에 바이오리셉터가 고정화된 것으로, 상기 혼합용액은 폴리도파민 단독 및 폴리도파민과 단백질 G의 순차적 처리에 의한 표면 개질의 방법보다 바이오리셉터의 고정화가 보다 잘 이루어져, 목적하는 검체의 검출이 보다 용이한 장점이 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 기판은 전술한 바와 같다. 본 발명의 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액의 기판 표면개질 방법은 이에 한정되지는 않으나, 상기 혼합용액을 기판의 표면에 도포한 후, 상온에서 1~3시간 동안 반응시킨 후, 반응하지 않고 잔존하는 혼합용액을 제거하기 위해 수회 세척하는 과정으로 이루어질 수 있으나, 기판의 특성 및 고정하고자 하는 바이오리셉터의 종류 등을 고려하여 당업계에 공지된 방법을 통해 다양한 온도 및 시간 조건으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 바이오리셉터는 바이오센서를 통해 검출하고자 하는 생물시료 물질에 따라 선택되어 질 수 있고, 그 종류는 전술한 바와 같다.
본 발명의 상기 바이오센서 제조방법은, 비특이적인 결합을 방지하기 위해, 항체가 고정화되지 않은 영역을 블록킹하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 블록킹은 소혈청알부민 단백질을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 본 발명의 바이오센서를 이용한 생물시료의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 '생물시료'는 바이오리셉터와 선택적으로 결합할 수 있는 생물학적 시료를 의미하며, 상기 생물시료는 세포, 미생물, 바이러스, 단백질, 핵산, 당, 지질 또는 화학물질(예, 중금속, 신경전달물질 등)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 검출 방법에 있어서, 상기 생물시료는 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 검출 방법은,
본 발명의 바이오센서에 바이오리셉터와 선택적으로 반응 또는 결합하는 생물시료가 함유된 것으로 의심되는 검체를 접촉시키는 단계; 및
상기 바이오리셉터와 생물시료의 결합을 측정하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 바이오리셉터와 생물시료의 결합을 측정하는 단계는, 바이오리셉터와 생물시료간의 결합을 전기화학(electrochemical), 열(thermal), 광학(optical) 또는 역학적(mechanical) 방법을 이용하여 신호로 변환하여 측정하는 것일 수 있다.
상기 바이오리셉터와 생물시료간의 결합을 신호로 변환하기 위해서, 본 발명의 검출 방법은 상기 바이오센서와 검체의 접촉 단계 후에, 생물시료와 결합할 수 있는 프로브(probe)를 추가로 접촉시켜 반응시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 프로브는 검출하고자 하는 목적 생물시료와 결합함과 동시에, 화학적인 신호 변환을 위한 단백질 또는 화합물이 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 검출 방법에 있어서, 상기 프로브는 항-바이러스 항체가 결합된 금 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 폴리도파민과 단백질 G를 이용한 표면 개질 조건 비교 분석
폴리도파민과 단백질 G 혼합용액을 이용한 표면 코팅과, 폴리도파민 단독 사용한 표면 코팅, 폴리도파민과 단백질 G를 순차적으로 표면 코팅한 조건에서의 pH1N1 바이러스 검출 효율을 비교하였다.
1) 폴리도파민 단독 코팅
도파민 염산염(dopamine hydrochloride)을 10mM Tris-HCl(pH 8.5) 용액에 녹여 2 mg/ml 농도의 폴리도파민 용액을 만들고, 유리 표면에 도포하여 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼(1X PBS + 0.1% Tween 20)로 3회 세척한 후, 0.1 mg/ml 다클론 항-pH1N1 항체를 폴리도파민 용액으로 코팅시킨 유리 표면 상에 스포팅(spotting)하여 2시간 동안 반응시킨 후, 상기 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 그 후, 0.1 mg/ml 소혈청알부민 용액(blocking buffer)으로 1시간 반응시킨 후, 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 107 pfu/ml 농도의 pH1N1 바이러스를 2시간 동안 반응시키고 세척 버퍼로 3회 세척하였다.
2) 폴리도파민 코팅 후 단백질 G를 순차적으로 코팅 처리
상기 2 mg/ml 농도의 폴리도파민 용액을 유리 표면에 도포하여 2시간 동안 반응시킨 후, 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 그 후, 20 mg/ml 농도의 단백질 G 용액을 만들어, 폴리도파민이 코팅된 유리 표면상에 스포팅하고 1시간 동안 반응시켰다. 0.1 mg/ml 다클론 항-pH1N1 항체를 폴리도파민과 단백질 G로 코팅시킨 유리 표면 상에 스포팅하여 2시간 동안 반응시킨 후, 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 0.1 mg/ml 소혈청알부민 용액을 1시간 반응시킨 후, 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 107 pfu/ml 농도의 pH1N1 바이러스를 2시간 반응시키고, 세척 버퍼로 3회 세척하였다.
3) 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액을 이용한 코팅
상기와 같이 2 mg/ml 농도의 폴리도파민 용액과 20 mg/ml 농도의 단백질 G 용액을 만들어, 두 용액을 동량으로 섞어 혼합 용액을 만들었다. 유리 표면에 폴리도파민과 단백질 G의 혼합용액을 도포하여 2시간 동안 반응시킨 후, 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 0.1 mg/ml 다클론 항-pH1N1 항체를 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액으로 코팅시킨 유리 표면 상에 스포팅하여 2시간 동안 반응시키고, 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 0.1 mg/ml 소혈청알부민 용액을 1시간 반응시킨 후, 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 그 후, 107 pfu/ml 농도의 pH1N1 바이러스를 2시간 반응시키고, 세척 버퍼로 3회 세척하였다.
상기 1), 2) 및 3)의 세 가지 방법으로 표면을 개질하는 동시에, 금 나노입자에 GBP-단백질 G를 0.1 mg/ml 농도로 4℃에서 밤새 반응시킨 후, 원심분리하여 펠렛을 회수하고, 회수된 펠렛을 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 세척한 금 나노입자에 0.01 mg/ml 농도의 단클론 항-pH1N1 항체를 2시간 동안 반응시켜, 면역분석 프로브(immunoassay probe)를 만들었다. 상기 pH1N1 바이러스와 반응시킨 세가지 조건의 유리에 면역분석 프로브를 1시간 동안 반응시켰다. 증류수로 세척 후, silver enhancement solution A와 B를 1:1 비율로 혼합한 용액을 20분간 반응시켜 silver enhancement 반응을 진행하고 pH1N1 바이러스를 육안으로 검출하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 폴리도파민 단독 코팅 및 폴리도파민과 단백질 G의 순차적 코팅 조건과 비교하여, 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액으로 표면을 코팅한 유리에서 pH1N1의 검출 결과가 가장 명확하게 나타나는 것을 확인할 수 있었고, 상기의 결과를 통해 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액을 이용한 표면 개질 방법이 바이오센서와 같은 응용 시스템에 적용하기에 적합하다는 것을 확인하였다.
실시예 2. 항체 고정화를 위한 혼합용액 조건 최적화
항체 고정화를 위한 최적의 조건을 얻기 위하여, 폴리도파민과 혼합하는 단백질 G의 농도를 다양하게 변화시키면서 pH1N1 바이러스 검출을 분석하였다.
실시예 1에서 전술한 방법에 따라 2 mg/ml 농도의 폴리도파민 용액을 만들고, 단백질 G를 0, 10, 20, 30, 40, 50 mg/ml의 농도별로 준비한 후, 폴리도파민 용액과 각 농도별 단백질 G 용액을 1:1 비율로 섞어 혼합용액을 만든 후, 유리 표면에 각 혼합용액을 도포하여 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 세척 버퍼로 3회 세척한 후, 0.1 mg/ml 다클론 항-pH1N1 항체를 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액으로 코팅시킨 유리 표면 상에 스포팅하여 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척한 후, 0.1 mg/ml 소혈청알부민 용액으로 1시간 반응시켰다. 다시 3회 세척한 후, 107 pfu/ml 농도의 pH1N1 바이러스를 2시간 동안 반응시키고, 세척 버퍼로 3회 세척하였다.
동시에, 실시예 1에서 전술한 방법으로 면역분석 프로브를 만들고, 동일한 조건으로 상기 pH1N1 바이러스와 반응시킨 유리에 반응시켜 pH1N1 바이러스를 육안으로 검출하였다. 또한, 검출 결과를 광학 평판 스캐너(optical flatbed scanner)로 이미지 촬영하고, 촬영 이미지의 grayscale 히스토그램을 Bethesda 프로그램을 통해 수치화하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 pH1N1의 검출 결과가 단백질 G의 농도에 따라 분명한 차이를 보이는 것을 육안으로 확인하였고, 대조구에서는 반응이 거의 나타나지 않으며, 실험구에서만 명확한 반응을 보이는 20 mg/ml 및 30 mg/ml 농도의 단백질 G가 혼합된 혼합용액(각각 최종농도 10 mg/ml 및 15 mg/ml)이 표면 개질 및 바이오센서의 응용 시스템에 적용하기에 최적의 조건임을 확인할 수 있었다.
또한, 검출 대상체인 pH1N1 바이러스의 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107 pfu/ml 농도별 검출능을 확인한 결과, 1x104 pfu/ml 농도 이상의 바이러스 시료부터 대조구와 대비하여 확연한 양성 신호를 확인할 수 있었다(도 5).
실시예 3. 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액의 다양한 기판의 표면 개질 분석
다양한 표면을 가지는 기판에 대하여, 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액을 통한 표면 개질 효과 및 항체 고정화 방법을 이용하여 pH1N1 검출을 분석하였다.
실시예 1에서 기술한 방법에 따라, 2 mg/ml 농도의 폴리도파민 용액과 20 mg/ml 농도의 단백질 G 용액을 만들고, 두 용액을 1:1 비율로 섞어 혼합용액을 만든 후, 유리, 플라스틱, 비닐, 사파이어, 종이, 실리콘 및 실리카의 표면에 혼합 용액을 도포하여 2시간 동안 반응시킨 후, 전술한 방법과 동일한 과정으로 pH1N1 바이러스 검출을 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 유리(glass), 플라스틱(plastic), 비닐(vinyl), 사파이어(sapphire), 종이(paper), 실리콘(Si) 및 실리카(SiO2)와 같이 다양한 물체의 표면 상에서 pH1N1 바이러스의 육안 검출이 가능한 것을 확인하였으며, 본 발명의 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액이 다양한 기판의 표면 개질이 가능케 함을 알 수 있었다.
실시예 4. 3D 나노구조체 표면 상에서 다양한 화학적 링커를 이용한 단백질 고정화 효율 비교
SOG(spin on glass) 필라 나노구조체(지름 300 nm) 위에 각각 0.2% APTMS((3-aminopropyl)trimethoxysilane), 0.2% GPTMS((3-glycidoxypropyl)trimethoxysilane), 10 nm 에폭시(epoxy) 기상장착, 그리고 2 mg/ml 폴리도파민 용액과 20 mg/ml 단백질 G 용액의 1:1 혼합용액을 처리하여 표면개질시켰다. 이때 표면개질을 하지 않은 bare SOG 필라 나노구조체면을 포함하여 접촉각(contact angle)을 측정하여 각 표면의 친수성(hydrophilicity)을 비교하였다. 그 결과 아무것도 처리하지 않은 표면의 접촉각(108.24°)과 비교하여 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액을 처리한 표면의 접촉각(19.11°)이 가장 작은 접촉각을 나타내어 다른 화학적 링커들 보다 높은 친수성을 보여주었다(도 7).
또한, 상기 다양한 물질들로 표면 개질한 기판에 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 추가로 처리한 뒤, 항-GFP 항체(0.1 ㎍/ml)를 1.5 시간 동안 처리하여 고정화시킨 뒤 1% BSA로 30분동안 표면을 블록킹시킨 후 GFP(0.2 mg/ml)를 1시간 처리하였다. 이 후, 형광현미경으로 형광 수준을 관찰하였다.
그 결과, 도 8에서 확인할 수 있듯이 다른 표면개질 방법에 비해 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액을 이용한 표면개질 방법을 사용한 기판의 형광 수준이 아무것도 처리하지 않은 대조구에 비해 약 3배 가량 높음을 확인하였다. 상기의 결과를 통해 본 발명의 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액을 이용한 항체 고정화 효율이 3D 나노구조체 표면에서도 우수함을 알 수 있었다.
실시예 5. 표면 개질한 3D 나노구조체 바이오센서의 바이러스 검출능 분석
SOG 필라 나노구조체는 백색광을 조사하면 특정파장의 빛을 반사하는 특성이 있다. 이에 본 발명자들은 금 나노입자와 같은 별도의 프로브를 사용하지 않고, 나노구조체 표면을 개질하고 항체를 고정화하여 제작한 바이오센서에, 인플루엔자 바이러스를 반응시킨 후, SOG 필라 나노구조체 표면에 백색광을 조사하여 반사되는 빛의 파장 변화(△λ)를 측정 및 분석하였다. 빛의 파장 변화는 불꽃 분광계(Flame Spectrometer, Ocean Optics, 미국)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 처리한 바이러스 농도 의존적으로 빛의 파장 변화가 증가되는 것이 확인되었고(도 9B), 이를 통해 본 발명의 폴리도파민과 단백질 G 혼합용액을 이용한 항체 고정화 효율이 3D 나노구조체 표면에서도 우수함을 다시 한번 확인하였으며, 단순 육안 검출(도 5)과 비교하여 빛의 파장 변화를 측정 및 분석한 경우에 보다 더 민감하게 검출이 가능함을 알 수 있었다.
Claims (9)
- 평면 또는 입체 구조의 고체 기판;
상기 기판의 표면에 최종농도가 0.5~1.2 mg/ml인 폴리도파민과 최종농도가 10~15 mg/ml인 단백질 G의 혼합용액으로 개질된 코팅층; 및
상기 코팅층에 고정된 바이오리셉터;를 포함하는 바이오센서. - 제1항에 있어서, 상기 기판은 유리, 사파이어, 금, 은, 백금, 구리, 팔라듐, 니티놀, 스테인리스 강, 실리카, 이산화티타늄, 산화알루미늄, 산화니오븀, 갈륨비소, 질화규소, 수산화인회석, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리디메틸실록산, 폴리에티르에티르케톤, 폴리염화비닐 및 종이로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 소재로 제조되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
- 제1항에 있어서, 상기 바이오리셉터는 항체, 효소, 항원, 압타머, 렉틴, 핵산, 단백질, 지질, 당 또는 호르몬 수용체인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
- 최종농도가 0.5~1.2 mg/ml인 폴리도파민과 최종농도가 10~15 mg/ml인 단백질 G의 혼합용액을 제조하는 단계;
상기 혼합용액을 기판의 표면에 도포하여 표면개질하는 단계; 및
상기 표면개질된 기판에 바이오리셉터를 고정화하는 단계;를 포함하는 바이오센서의 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 바이오센서를 이용한 생물시료의 검출 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 생물시료는 세포, 미생물, 바이러스, 단백질, 핵산, 당, 지질 또는 화학물질인 것을 특징으로 하는 생물시료의 검출 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 바이오센서에 바이오리셉터와 선택적으로 반응 또는 결합하는 생물시료가 함유된 것으로 의심되는 검체를 접촉시키는 단계; 및
상기 바이오리셉터와 생물시료의 결합을 측정하는 단계;를 포함하는 생물시료의 검출 방법.
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