CN110777448B - 一种核-壳结构微纳米纤维的制备方法 - Google Patents

一种核-壳结构微纳米纤维的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明的核‑壳结构微纳米纤维的制备方法涉及高分子合成材料/脱细胞基质核‑壳结构微纳米纤维的制备方法，需要借助同轴静电纺丝技术，故本发明的制备方法需要使用同轴针头。此外，本发明需要的材料包括：动物源性脱细胞基质、高分子合成材料和含氟极性溶剂等。本发明一种核‑壳结构微纳米纤维的制备方法，包括：步骤一，制备动物源性脱细胞基质粉末；步骤二，将步骤一中的脱细胞基质粉末、高分子合成材料分别单独溶解，得到脱细胞基质、高分子合成材料静电纺丝溶液；步骤三，使用同轴针头对步骤二中的脱细胞基质、高分子合成材料静电纺丝溶液进行静电纺丝，得到核‑壳结构微纳米纤维。

Description

一种核-壳结构微纳米纤维的制备方法
技术领域
本发明涉及一种核-壳结构微纳米纤维的制备方法。
背景技术
静电纺丝技术是一种简单快捷的微纳米纤维制备技术，而同轴静电纺丝则是在传统静电纺丝技术上发展起来的新方法。传统静电纺丝通常用于制备单一材料的微纳米纤维，所得纤维的缺点是组分和力学性能较单一、表面缺乏功能性和特异性、降解速率难以控制等。同轴静电纺丝技术使用同轴电纺针头和两条溶液流速可控的通道，连续制备具有核-壳结构的微纳米纤维，所得纤维的特点是组分多、综合性能较强和应用范围广等。这使得同轴静电纺丝微纳米纤维在组织工程和药物缓释等领域有着很广阔的应用前景。
应用于组织工程的核-壳结构微纳米纤维多以高分子合成材料或天然聚合物作为核层材料，壳层材料主要是天然聚合物。从已有报道中发现，核层材料分别有PCL、PLLA、PVA、PEG和RSF(再生蚕丝蛋白)等；壳层材料多以明胶、壳聚糖、蚕丝蛋白为主，也有高分子合成材料如PLA、PLGA等。这种复合的核-壳结构微纳米纤维因此具有合成材料优异的力学性能，同时具有生物相容性较好的表面，这种综合性能优异的纤维在组织工程支架领域中具有极大的应用价值。
通过同轴静电纺丝制备组织工程微纳米纤维支架时，除了考虑物理力学结构仿生外，还要考虑纤维表面在成分上的仿生。细胞外基质是天然组织中由细胞分泌到细胞外、存在于细胞之间的大分子。细胞外基质成分复杂，主要包括结构蛋白(胶原、弹性蛋白)、专一蛋白(纤维蛋白等)和蛋白聚糖，并含有多种生长因子。这些成分对细胞维持正常形态、增殖、分化和功能化起到重要的调节作用。由于优异的生物活性和组织特异性，细胞外基质已经通过静电纺丝加工制备出微纳米纤维，成功地模拟了细胞赖以生存的微环境结构。但是，细胞外基质静电纺丝纤维力学强度和模量较低，限制了其在组织工程中的应用。所以，同轴电纺纤维凭借核层的合成材料能够赋予纤维一定的力学强度；从另一种角度来说，合成材料纤维具有细胞外基质表面涂层，亲水性、细胞相容性等性能得以增强。因此，这种性能优异的核-壳结构的构建能拓宽细胞外基质、疏水性高分子合成材料静电纺丝纤维在组织工程中的应用范围。
发明内容
本发明的核-壳结构微纳米纤维的制备方法涉及高分子合成材料/脱细胞基质核-壳结构微纳米纤维的制备方法，需要借助同轴静电纺丝技术，故本发明的制备方法需要使用同轴针头。
此外，本发明需要的材料包括：动物源性脱细胞基质、高分子合成材料和含氟极性溶剂等。
本发明一种核-壳结构微纳米纤维的制备方法，包括：
步骤一，制备动物源性脱细胞基质粉末；
步骤二，将步骤一中的脱细胞基质粉末、高分子合成材料分别单独溶解，得到脱细胞基质、高分子合成材料静电纺丝溶液；
步骤三，使用同轴针头对步骤二中的脱细胞基质、高分子合成材料静电纺丝溶液进行静电纺丝，得到核-壳结构微纳米纤维，其中高分子合成材料注入核芯流道，脱细胞基质注入外壳流道。
优选的，在所述步骤一中，取动物组织器官进行脱细胞，得到脱细胞基质；将脱细胞基质洗净、冻干、脱脂；将脱脂后的脱细胞基质粉碎，得到动物源性脱细胞基质粉末。
优选的，在步骤二中，取脱细胞基质粉末300～600mg，溶于10mL六氟异丙醇中，并于50Hz条件下搅拌4～6天，随后置于实验条件为-10℃、60Hz的球磨机中球磨2次，每次5分钟；球磨完毕的溶液转移到50mL的离心管，放入超高速离心机以8000rpm的转速离心5分钟，吸取上层溶液得到脱细胞基质静电纺丝溶液。
优选的，在步骤二中，取高分子合成材料0.5～1.5g，溶于10ml三氟乙醇中，搅拌1～2天，得到高分子合成材料静电纺丝溶液。
优选的，在步骤三中，高分子合成材料静电纺丝溶液的流速控制在0.6mL/h～1.2mL/h，脱细胞基质静电纺丝溶液速控制在1.0mL/h～4.0mL/h。
以脱细胞基质作为外壳，合成高分子材料为芯部的核-壳结构纤维材料仍没有得到相关报道。芯部材料起到力学增强作用的同时，脱细胞基质外壳以其固有的组织特异性和细胞相容性赋予了复合纤维材料优异的表面性能。脱细胞基质可以作为疏水性纤维材料的亲水性涂层，所以脱细胞基质/合成高分子材料的同轴静电纺丝技术有利于拓宽高分子合成材料在组织工程中的应用范围。
利用同轴静电纺丝技术成功实现了脱细胞基质涂层包裹高分子合成材料的目的，降低了后者的表面能，有利于后者在医用水凝胶内的分散，建立了疏水性材料-脱细胞基质-水凝胶/损伤区微环境的亚稳定结构关系。相比于高分子合成材料通过表面改性以提高亲水性的繁琐步骤，同轴静电纺丝构建脱细胞基质亲水性涂层的办法简单快捷，壳层厚度可控程度高，利于控制复合纤维的降解速率。
本发明通过上述设计进一步改进了脱细胞基质的静电纺丝方法，由于单独对脱细胞基质进行静电纺丝得到的纳米纤维支架力学强度较低，加入高分子合成材料进行同轴电纺后，为脱细胞基质纳米纤维起到力学支撑作用，克服了单纯脱细胞基质纳米纤维强度低的问题，同时又能保持纤维表面微纳米级仿生结构，有利于细胞的黏附，增值和迁移，同时这种核-壳结构微纳米纤维为药物释放体系提供了综合性能优异的载体。
本发明通过上述设计赋予了部分医用高分子材料的亲水性涂层，增强纤维的细胞相容性和生物活性。脱细胞基质作为涂层的静电纺丝微纳米纤维支架，其物理结构高度模仿天然细胞外基质的纳米纤维网络，为细胞提供结构仿生的物理诱导作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图；
图1为本发明实施例一制备的核-壳结构微纳米纤维的结构图；
图2为本发明实施例二制备的核-壳结构微纳米纤维的结构图。
具体实施方式
本发明的核-壳结构微纳米纤维的制备方法涉及高分子合成材料/脱细胞基质核-壳结构微纳米纤维的制备方法，需要借助同轴静电纺丝技术，故本发明的制备方法需要使用同轴针头。
此外，本发明需要的材料包括：动物源性脱细胞基质、高分子合成材料和含氟极性试剂等。
本发明的制备方法如下：
(1)脱细胞基质粉末的制备。
取新鲜的动物组织器官(动物种类可以为猪、牛、羊等家禽，组织器官包括脊髓、外周神经、小肠黏膜、皮肤等)，切成1×1×1mm3～2×2×2mm3正方体，浸泡在含1％青霉素/链霉素的PBS溶液中消毒过夜。次日于去离子水清洗3次，每次5min，然后放入3％的tritonX-100浸泡12h；取出组织，用去离子水清洗3次，每次15min，再放入4％脱氧胆酸钠溶液处理24h，以此制备动物组织的脱细胞基质(DCM)。
将上文制备的动物组织的脱细胞基质(DCM)用去离子水洗净15min×3次，真空冻干2～3天；将冻干的DCM用二氯甲烷/乙醇(2：1)脱脂浸泡12h×2次后，用去离子水洗净15min×3次，真空抽滤过夜，真空冻干2～3天。
脱脂后的DCM放入打粉机粉碎，并将收获的DCM粉末经过40～60目的筛网，以此筛选粒径为0.250～0.425mm的DCM粉末，于在-40℃长期保存。
(2)分别配置脱细胞基质、高分子合成材料静电纺丝溶液。
取(1)制备的脱细胞基质粉末300～600mg，溶于10mL六氟异丙醇中，并于50Hz条件下搅拌4～6天，随后置于实验条件为-10℃、60Hz的球磨机中球磨5分钟，共2次。球磨完毕的溶液转移到50mL的离心管，放入超高速离心机以8000rpm的转速离心5分钟，吸取上层溶液并转移到10mL规格的注射器1中。
取高分子合成材料(PCL、PLLA等)0.5～1.5g，溶于10ml三氟乙醇中，搅拌1～2天，转移到10mL规格的注射器2中。
(3)静电纺丝制备高分子合成材料/脱细胞基质核-壳结构微纳米纤维垫。
注射器1注射速度1.0mL/h～4.0mL/h，对应的是脱细胞基质壳层溶液；注射器2注射速度0.6mL/h～1.2mL/h，对应的是高分子合成材料核层溶液。
采用国际标准同轴针头(内针头国际标准22号，外针头国际标准16或17号)，针头与接收平板之间距离为10～20cm，针头加正电压10～21kV，接收板施加负电压0.5～1.5kV。静电纺丝环境条件保持在20℃～25℃，相对湿度为30％～70％。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下文实施例利用两种脱细胞基质(猪源性上层皮肤脱细胞基质PDSM和脊髓脱细胞基质DSCM)分别和聚己内酯(PCL)进行同轴静电纺丝实验，通过调控静电纺丝的条件(包括接收高度H、电压U、壳层溶液流速VECM、核层溶液流速VPCL等)制备得到核-壳结构纤维，样品的表面形貌和内部结构分别在电子扫描显微镜和电子透射显微镜的表征和分析后讨论得出制备PCL/DCM核-壳结构纤维的最佳条件。
实施例一PCL/PDSM核-壳结构微纳米纤维的制备
(1)猪上层皮肤脱细胞基质粉末的制备。
取新鲜的猪源性上层皮肤，切成2×2×2mm3正方体，浸泡含1％青霉素/链霉素的PBS溶液中消毒过夜；次日于去离子水清洗3次，每次5min，然后放入3％的tritonX-100浸泡12h；取出组织，用去离子水清洗3次，每次15min，再放入4％脱氧胆酸钠溶液处理24h，以此制备动物组织的脱细胞基质(DCM).
将上文制备的动物组织的脱细胞基质(DCM)用去离子水洗净15min×3次，真空冻干2～3天；将冻干的DCM用二氯甲烷/乙醇(2：1)脱脂浸泡12h×2次后，用去离子水洗净15min×3次，真空抽滤过夜，真空冻干2～3天。
脱脂后的DCM放入打粉机粉碎，并将收获的DCM粉末经过40～60目的筛网，以此筛选粒径为0.250～0.425mm的DCM粉末，于在-40℃长期保存。
(2)分别配置脱细胞基质、高分子合成材料静电纺丝溶液。
取(1)制备的猪上层皮肤脱细胞基质粉末500mg，溶于10mL六氟异丙醇中，并于50Hz条件下搅拌4～6天，随后置于实验条件为-10℃、60Hz的球磨机中球磨5分钟，共2次。球磨完毕的溶液转移到2mL的离心管，放入超高速离心机以8000rpm的转速离心5分钟，吸取上层溶液并转移到10mL规格的注射器1中。
取聚己内酯1.2g，溶于10ml三氟乙醇中，搅拌1～2天，转移到10mL规格的注射器2中。
(3)静电纺丝制备高分子合成材料/脱细胞基质核-壳结构微纳米纤维垫。
注射器1注射速度2mL/h～3mL/h，对应的是脱细胞基质壳层溶液，即将脱细胞基质静电纺丝溶液注入外壳流道；注射器2注射速度0.6mL/h～1.2mL/h，对应的是高分子合成材料核层溶液，即将高分子合成材料静电纺丝溶液注入核芯流道。
采用国际标准同轴针头(内针头国际标准22号，外针头国际标准16号)，针头与接收平板之间距离为10cm，针头加正电压18～21kV，接收板施加负电压1.0kV。静电纺丝环境条件保持在20℃～25℃，相对湿度为60％～70％。
本方法展示其中三种静电纺丝条件下制备的微纳米纤维，如图1所示。
实验序号 壳层流速/(mL/h) 核层流速/(mL/h) 接收高度H/cm 电压U/kV
①ABC 2.0 1.0 10 18～21
②DEF 2.0 0.6 10 18～21
③GHI 3.0 0.6 10 18～21
针对图1进行分析，结论如下：
①单组分PCL纤维较多，具有核壳结构的纤维芯层直径相对较大，说明PCL核层流速比较大，出现单独组分静电纺丝现象。
②具有核壳结构的纤维数量较多，结构完整均匀，几乎不存在单组分纤维，说明核层流速与壳层流速比例合理。
③存在单组分PDSM纤维，说明壳层流速过大，复合泰勒锥不稳定，电荷排斥力分布不均匀，电荷排斥力与核壳层溶液间的粘性应力平衡不稳定，导致出现单独组分静电纺丝现象。
对于PCL/PDSM核-壳结构微纳米纤维的制备，控制电压U在18～21kV范围内，接收高度为10cm，最佳流速比VPDSM：VPCL＝2.0：0.6，能得到结构规整的核-壳纤维，单组分纤维极少。
实施例二PCL/DSCM核-壳结构微纳米纤维的制备
(1)猪脊髓脱细胞基质粉末的制备。
取新鲜的猪脊髓组织，切成1×1×1mm3正方体，浸泡含1％青霉素/链霉素的PBS溶液中消毒过夜；次日于去离子水清洗3次，每次5min，然后放入3％的tritonX-100浸泡12h；取出组织，用去离子水清洗3次，每次15min，再放入4％脱氧胆酸钠溶液处理24h，以此制备动物组织的脱细胞基质(DCM)。
将上文制备的动物组织的脱细胞基质(DCM)用去离子水洗净15min×3次，真空冻干2～3天；将冻干的DCM用二氯甲烷/乙醇(2：1)脱脂浸泡12h×2次后，用去离子水洗净15min×3次，真空抽滤过夜，真空冻干2～3天。
脱脂后的DCM放入打粉机粉碎，并将收获的DCM粉末经过40～60目的筛网，以此筛选粒径为0.250～0.425mm的ECM粉末，于在-40℃长期保存。
(2)分别配置脱细胞基质、高分子合成材料静电纺丝溶液。
取(1)制备的猪脊髓脱细胞基质粉末500mg，溶于10mL六氟异丙醇中，并于50Hz条件下搅拌4～6天，随后置于实验条件为-10℃、60Hz的球磨机中球磨5分钟，共2次。球磨完毕的溶液转移到50mL的离心管，放入超高速离心机以8000rpm的转速离心5分钟，吸取上层溶液并转移到10mL规格的注射器1中。
取聚己内酯1.2g，溶于10ml三氟乙醇中搅拌1～2天，转移到10mL规格的注射器2中。
(3)静电纺丝制备高分子合成材料/脱细胞基质核-壳结构微纳米纤维垫。
注射器1注射速度1.0mL/h～4.0mL/h，对应的是脱细胞基质壳层溶液；注射器2注射速度0.6mL/h～1.2mL/h，对应的是高分子合成材料核层溶液。
采用国际标准同轴针头(内针头国际标准22号，外针头国际标准16号)，针头与接收平板之间距离为10cm，针头加正电压18～21kV，接收板施加负电压0.5～1.0kV。静电纺丝环境条件保持在20℃～25℃，相对湿度为60％～70％。
本方法展示其中三种静电纺丝条件下制备的微纳米纤维，如图2所示。
实验序号 壳层流速/(mL/h) 核层流速/(mL/h) 接收高度H/cm 电压U/kV
①ABC 2.5 1.0 10 18～21
②DEF 3.0 1.0 10 18～21
③GHI 3.5 1.0 10 18～21
针对图2进行分析，结论如下：
①和②同时出现了核-壳结构规整的纤维和单组分纤维，但是单组分纤维数量较少；核层纤维直径大小是整纤维直径的1/2左右。这表明在核层流速在1.0mL/h的条件下，选择壳层流速在2.5mL-3.0mL范围内比较合适。
②核-壳结构规整的纤维较少，单组分DSCM纤维较多，表明壳层流速过大。
对于PCL/DSCM核-壳结构微纳米纤维的制备，控制电压U在18～21kV范围内，接收高度为10cm，保持VPCL＝1.0mL/h,选择VDSCM在2.5mL/h～3.0mL/h范围内，能得到结构比较规整的纤维，单组分纤维较少。
总的来说，欲要制备高分子合成材料/脱细胞基质核-壳结构纤维，对于流速比的选择，脱细胞基质壳层溶液流速必须大于高分子合成材料核层流速。在电压U＝18～21kV，接收高度为10cm的条件下，建议核层流速控制在0.6mL/h～1.2mL/h，壳层流速控制在2.0mL/h～3.0mL/h。
组织来源的脱细胞基质(DCM)在去除了免疫原性的前提下保留了胶原、纤连蛋白、弹性蛋白、粘多糖以及生长因子等多种复杂生物活性成分，而成为备受瞩目的组织工程支架材料。
据文献报道，高分子合成材料与脱细胞基质共混溶解成纺丝液，通过静电纺丝制备出复合纤维，利用脱细胞基质增强纤维的生物相容性，例如，以心脏脱细胞基质作为活性剂，与PLCL共混进行静电纺丝用于皮肤创伤修复；用PLLA与肝脱细胞基质进行共混型静电纺丝所得支架用来营造肝脏微环境；还有，PCL与半月板脱细胞基质共混后进行静电纺丝，得到的有序/无序复合纤维垫进行体外细胞实验等。但是，所得的纤维表面只能局部分布脱细胞基质，局部仍是疏水性较高的高分子合成材料，因此，这种纤维对损伤组织区域的表面亲和性不强。
以脱细胞基质作为外壳，合成高分子材料为芯部的核-壳结构纤维材料仍没有得到相关报道。芯部材料起到力学增强作用的同时，脱细胞基质外壳以其固有的组织特异性和细胞相容性赋予了复合纤维材料优异的表面性能。脱细胞基质可以作为疏水性纤维材料的亲水性涂层，所以脱细胞基质/合成高分子材料的同轴静电纺丝技术有利于拓宽高分子合成材料在组织工程中的应用范围。
利用同轴静电纺丝技术成功实现了脱细胞基质涂层包裹高分子合成材料的目的，降低了后者的表面能，有利于后者在医用水凝胶内的分散，建立了疏水性材料-脱细胞基质-水凝胶/损伤区微环境的亚稳定结构关系。相比于高分子合成材料通过表面改性以提高亲水性的繁琐步骤，同轴静电纺丝构建脱细胞基质亲水性涂层的办法简单快捷，壳层厚度可控程度高，利于控制复合纤维的降解速率。
本发明通过上述设计进一步改进了脱细胞基质的静电纺丝方法，由于单独对脱细胞基质进行静电纺丝得到的纳米纤维支架力学强度较低，加入高分子合成材料进行同轴电纺后，为脱细胞基质纳米纤维起到力学支撑作用，克服了单纯脱细胞基质纳米纤维强度低的问题，同时又能保持纤维表面微纳米级仿生结构，有利于细胞的黏附，增值和迁移，同时这种核-壳结构微纳米纤维为药物释放体系提供了综合性能优异的载体。
本发明通过上述设计赋予了部分医用高分子材料的亲水性涂层，增强纤维的细胞相容性和生物活性。脱细胞基质作为涂层的静电纺丝微纳米纤维支架，其物理结构高度模仿天然细胞外基质的纳米纤维网络，为细胞提供结构仿生的物理诱导作用。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种核-壳结构微纳米纤维的制备方法，其特征在于，包括：
步骤一，制备动物源性脱细胞基质粉末；步骤二，将步骤一中的脱细胞基质粉末、高分子合成材料分别单独溶解，得到脱细胞基质、高分子合成材料静电纺丝溶液；步骤三，使用同轴针头对步骤二中的脱细胞基质、高分子合成材料静电纺丝溶液进行静电纺丝，得到核-壳结构微纳米纤维，其中高分子合成材料注入核芯流道，脱细胞基质注入外壳流道；所述的高分子合成材料为：聚己内酯和/或左旋聚乳酸；
在步骤二中，取脱细胞基质粉末300～600mg，溶于10mL六氟异丙醇中，并于50Hz条件下搅拌4～6天，随后置于实验条件为-10℃、60Hz的球磨机中球磨2次，每次5分钟；球磨完毕的溶液转移到50mL
的离心管，放入超高速离心机以8000rpm的转速离心5分钟，吸取上层溶液得到脱细胞基质；静电纺丝溶液取高分子合成材料0 .5～1 .5g，溶于10ml三氟乙醇中，搅拌1～2天，得到高分子合成材料静电纺丝溶液；在步骤三中，高分子合成材料静电纺丝溶液的流速控制在0 .6mL/h～1 .2mL/h，脱细胞基质静电纺丝溶液速控制在2.0mL/h～3.0mL/h。
2.根据权利要求1所述的核-壳结构微纳米纤维的制备方法，其特征在于，在所述步骤一中，取动物组织器官进行脱细胞，得到脱细胞基质；将脱细胞基质洗净、冻干、脱脂；将脱脂后的脱细胞基质粉碎，得到动物源性脱细胞基质粉末。
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