KR102073650B1 - 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법 및 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드 - Google Patents

섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법 및 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드 Download PDF

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Abstract

본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법 및 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에서, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법은 내부에 하이드로겔 주입 가능한 니들이 배치된 관형(tublar)의 섬유 구조체의 내부 공간에 상기 니들을 통해 줄기 세포 함유 하이드로겔을 주입하는 단계를 포함한다.

Description

섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법 및 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드{MANUFACTURING METHOD OF FIBROUS/HYDROGEL COMPLEX SCAFFOLD AND FIBROUS/HYDROGEL COMPLEX SCAFFOLD}
본 발명은 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 섬유 구조체 및 줄기 세포 함유 하이드로겔을 포함하는 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
스캐폴드(scaffolds)는 세포외기질(extracellular matrix, ECM)과 같은 역할을 하는 3차원 세포 지지체이다. 세포외기질은 주로 동물의 구조 적지지 등을 담당하고, 조직 내 또는 세포외의 공간을 채우고 있는 생체고분자의 복잡한 집합체로, 특히 결합 조직에 다량으로 존재한다. ECM과 같은 역할을 하는 스캐폴드는 조직을 구축하거나 세포 기능을 제어하는 역할을 할 수 있어, 이를 이용한 조직 재생 및 보강에 대한 관심이 점차 높아지고 있다. 스캐폴드는 다양한 소재로 제조되고 있으며, 최근에는 스캐폴드 소재로서 사용이 용이한 하이드로겔(hydrogels)이 주목 받고 있다. 하이드로겔은 주로 생체적합성 및 조정 가능한 기계적 특성들을 갖는 고분자들로 이루어지며, 3D 세포 프린팅 및 세포 성장을 위한 3D 스캐폴드와 같은 생의학적 어플리케이션(applications)에서 널리 이용되고 있다. 다만, 하이드로겔은 조직이 갖는 것과 유사한 3D 마이크환경의 생성하도록 하고, 세포의 분화 및 성숙을 자극함에도 불구하고, in vivo 위치 및 형태를 유지할 수 없는 약한 기계적 강도를 갖고, 이로 인해 그들의 기능을 유지하기 어렵다는 단점이 있다. 또한, 하이드로겔에서 정렬(alignment)과 같은 세포의 생장 방향을 제어하고 줄기세포의 분화 계통(differentiation lineage)을 가이드 하는 일부 특정 마이크로구조가 반복 발생(recaptulate)되기 어렵다는 문제가 있다.
한편, 섬유로 형성된 스캐폴드는 ECM-모방 구조 및 기계적으로 안정한 환경을 세포들에 제공할 수 있다는 장점을 있다. 그러나, 섬유 스캐폴드가 세포에 세포 분화를 자극할 수 있는 ECM-유사 구조를 제공함에도 불구하고, 섬유 스캐폴드는 초기 세포 정착 및 세포의 균등 분배를 방해하는 낮은 세포 침투를 나타낸다는 문제가 있다.
때문에, 세포 기능의 강화 및 구조적 안정성을 제공할 수 있는 새로운 스캐폴드에 대한 연구 개발이 더 필요한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 섬유 구조체 및 줄기 세포 함유 하이드로겔을 포함하는 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 섬유 구조체 및 줄기 세포 함유 하이드로겔을 포함하는 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적을 위한 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법은 내부에 하이드로겔 주입 가능한 니들이 배치된 관형(tublar)의 섬유 구조체의 내부 공간에 상기 니들을 통해 줄기 세포 함유 하이드로겔을 주입하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 줄기 세포 함유 하이드로겔을 주입하는 단계에서, 상기 섬유 구조체로부터 상기 니들을 제거하면서 상기 니들을 통해 줄기 세포 함유 하이드로겔을 주입할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 줄기 세포 함유 하이드로겔을 주입하는 단계 이전에, 상기 내부에 하이드로겔 주입 가능한 니들이 배치된 관형의 섬유 구조체를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 섬유 구조체를 형성하는 단계는, 섬유 전기방사용 용액을 전기 방사하여, 섬유 매트를 형성하는 단계; 및 상기 섬유 매트가 관 형태를 갖도록, 상기 섬유 매트를 하이드로겔 주입 가능한 니들 표면에 감는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 섬유 매트는 나노섬유 및 마이크로섬유를 포함하고, 상기 섬유 매트를 형성하는 단계에서, 나노섬유 전기방사용 용액 및 마이크로섬유 전기방사용 용액을 각각 적어도 1회 교대로 전기 방사하여, 나노섬유 층 및 마이크로섬유 층이 교대로 반복 배치된 다층 구조를 갖는 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트를 형성할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 전기 방사는 회전 드럼 집적(collection) 기반의 전기 방사기를 이용하여 수행할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 섬유 매트를 형성하는 단계에서, 상기 나노섬유 전기방사용 용액은 상기 마이크로섬유 전기방사용 용액 보다 빠른 속도로 전기 방사하고, 상기 나노섬유 전기방사용 용액의 전기 방사 시 드럼의 회전 속도를 상기 마이크로섬유 전기방사용 용액의 전기 방사 시 드럼 회전 속도 보다 빠르게 제어하여, 상기 나노섬유 전기방사용 용액의 전기 방사를 통해 일 방향으로 정렬된 나노섬유를 포함하는 나노섬유 층을 형성하고, 상기 마이크로섬유 전기방사용 용액의 전기 방사를 통해 비정렬된 마이크로섬유를 포함하는 마이크로섬유 층을 형성할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 섬유 구조체를 형성하는 단계에서, 상기 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트의 다층 구조가 적층되도록 상기 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트를 상기 니들 표면에 감을 수 있다.
일 실시예에서, 상기 나노섬유 전기방사용 용액은 실크 피브로인(silk fibroin)을 포함하고, 상기 마이크로섬유 전기방사용 용액은 폴리카프로락톤(polycaprolactone)을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 섬유 매트를 하이드로겔 주입 가능한 니들 표면에 감는 단계에서, 상기 섬유 매트가 단일 또는 적층된 튜브형 또는 롤 형태를 형성하도록, 상기 섬유 매트를 상기 니들 표면에 감을 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 위한 섬유/하이드로겔 스캐폴드는 관형의 섬유 구조체 및 상기 관형의 섬유 구조체의 내부 공간에 담지된 줄기 세포 함유 하이드로겔을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 하이드로겔은 하이드로겔 주입 가능한 니들과 결합된 관형의 섬유 구조체로부터 상기 니들을 제거하면서, 상기 니들을 통해 상기 줄기 세포 함유 하이드로겔을 상기 관형의 섬유 구조체의 내부 공간에 주입하여 담지될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 섬유 구조체는 일 방향으로 정렬된 나노섬유를 포함하는 나노섬유 층 및 비정렬된 마이크로섬유를 포함하는 마이크로섬유 층을 포함하고, 적어도 하나의 상기 나노섬유 층 및 상기 마이크로섬유 층이 교대로 반복 배치된 다층 구조를 갖는, 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체일 수 있다.
일 실시예에서, 줄기 세포 배양 시, 상기 줄기 세포는 상기 하이드로겔로부터 상기 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체의 나노섬유의 정렬 방향을 따라 증식할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 나노섬유는 실크 피브로인으로 형성된 실크 피브로인 나노섬유이고, 상기 마이크로섬유는 폴리카프로락톤으로 형성된 폴리카프로락톤 마이크로섬유일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 인대, 힘줄, 혈관 또는 근육 재생용 스캐폴드일 수 있다.
일 실시에에서, 상기 줄기 세포는 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, hBMMSC)를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 하이드로겔은 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor)를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 하이드로겔은 생체적합성 고분자로 형성된 하이드로겔일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 생체적합성 고분자는 알지네이트 또는 콜라겐을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 하이드로겔은 칼슘에 의해 가교 결합될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적을 위한 스캐폴드는 일 방향으로 정렬된 나노섬유를 포함하는 나노섬유 층 및 비정렬된 마이크로섬유를 포함하는 마이크로섬유 층을 포함하고, 적어도 하나의 상기 나노섬유 층 및 상기 마이크로섬유 층이 교대로 반복 배치된 다층 구조를 갖는, 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체 및 상기 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체에 담지된, 줄기 세포 함유 하이드로겔을 포함한다.
본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법 및 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에 따르면, 관형의 섬유 구조체의 내부 공간에 니들을 통해 줄기 세포 함유 하이드로겔을 주입하여, 관형의 섬유 구조체 및 이의 내부 공간에 담지된 줄기 세포 함유 하이드로겔을 포함하는 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드를 제공할 수 있다. 때문에, 손실 없이 높은 압력으로 섬유 구조체 내부로 하이드로겔을 주입할 수 있고, 이에 기인하여, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 우수한 세포 부착 및 침투성을 나타낼 수 있으며, 줄기 세포 배양 시 섬유 구조체 중심부에 담지된 하이드로겔로부터 줄기 세포가 구조체 내부로부터 외부를 향해 침투되어, 섬유 구조체에 전반적으로 고르게 분포할 수 있다. 또한, 본 발명의 스캐폴드는 섬유 구조체와 하이드로겔을 포함함으로써 우수한 기계적 물성을 나타낼 수 있다. 일례로, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 섬유 구조체는 나노섬유 용액 및 마이크로섬유 용액을 전기 방사하여 정렬된 나노섬유 및 비정렬된 마이크로섬유가 교대로 반복 배치된 다층구조를 갖는 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체일 수 있고, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 정렬된 나노섬유를 포함하고 있어 강도 및 강성의 증가와 함께, 특히, 세포 부착 및 성장 방향성을 부여할 수 있으며, 이에, 길이 방향으로의 세포 성장이 요구되는 인대나 근육, 혈관, 힘줄과 같은 조직을 재생하는데 적합할 수 있다. 또한, 비정렬된 마이크로섬유를 포함하고 있어 충분한 공극도를 가질 수 있으며, 보다 큰 힘을 견딜 수 있어, 이로부터 향상된 기계적 특성들과 세포 침투력을 나타낼 수 있다. 즉, 본 발명에 따르면, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 섬유 구조체와 하이드로겔을 포함함으로써, 우수한 기계적 강도, 세포 전달력 및 세포 침투력을 나타낼 수 있으며, 세포에 안정적인 환경을 제공하여 세포 생존력과 증식 향상, 아울러, 분화를 증진시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 정렬된 나노섬유와 함께 비정렬된 마이크로섬유를 포함함으로써 고도로 정렬되면서 높은 기계적 강도가 요구되는 인대나 힘줄, 혈관, 근육과 같은 조직 재생용 스캐폴드로서 이용할 수 있으며, 특히, 인대 재생용 스캐폴드로서 이용하는 경우 보다 큰 직경을 갖는 인대의 제작이 가능하다.
도 1은 본 발명의 전기 방사 장치 및 이에 의한 전기 방사를 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드 및 이의 제조 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 발명의 나노/마이크로 하이드리드 섬유 구조체를 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 본 발명의 나노/마이크로 하이드리드 섬유 구조체를 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 기계적 특성을 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드를 설명하기 위한 도면이다.
도 7은 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드를 설명하기 위한 도면이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명에서 "/"는 " 및"과 같은 의미로 사용될 수 있으며, 예를 들어, "섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드"는 섬유 및 하이드로겔을 모두 포함하는 복합 스캐폴드를 의미한다.
본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법은 내부에 하이드로겔 주입 가능한 니들(needle)이 배치된 관형(tublar)의 섬유 구조체의 내부 공간에 상기 니들을 통해 줄기 세포 함유 하이드로겔을 주입하는 단계를 포함한다.
이때, 관형의 섬유 구조체로부터 상기 니들을 제거하면서, 상기 하이드로겔을 상기 섬유 구조체 내부 빈 공간에 주입할 수 있다. 종래에는 주로 하이드로겔을 지지체에 세포를 함침시키거나 외부에 부착하는 방법을 주로 이용하였기 때문에, 하이드로겔이 지지체로 세포가 충분히 침투될 수 없었고, 이에 세포 함량이나 스캐폴드로서의 성능이 낮아, 사실상 상품성이 없다는 문제가 있었다. 그러나, 본 발명에 따르면, 니들을 이용하여 상기 섬유 구조체 내부로 하이드로겔을 주입함으로써, 구조체 내부로 하이드로겔을 충분히 주입 가능하고 하이드로겔의 손실이 거의 발생하지 않으며 이로부터 향상된 세포 침투력을 나타낼 수 있기 때문에 우수한 상품성을 나타낼 수 있다. 또한, 관 형태의 상기 섬유 구조체 내부로 상기 하이드로겔을 높은 압력으로 주입할 수 있다. 따라서, 이들로부터 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 우수한 세포 부착 및 침투를 나타낼 수 있다.
상기 니들은 하이드로겔을 주입 가능한 내관 직경을 갖는 바늘로, 일례로, 상기 니들은 주사기(syringe)와 결합되어 상기 하이드로겔을 상기 관형의 섬유 구조체 내부로 주입할 수 있다. 이때, 주사기는 유리 용기나 플라스틱 용기와 같은 하이드로겔을 저장 및 보관 가능한 용기를 나타내고, 일례로, 니들은 금속으로 형성된 니들일 수 있다.
상기 내부에 하이드로겔 주입 가능한 니들이 배치된 관형의 섬유 구조체는, 섬유 전기방사용 용액을 전기 방사하여 섬유 매트를 형성하고, 상기 섬유 매트가 관 형태를 갖도록, 하이드로겔 주입 가능한 니들 표면에 상기 섬유 매트를 감아 형성할 수 있다. 이때, 일례로, 관형의 섬유 구조체를 고정시키기 위해 별도의 실이나 튜브를 이용할 수도 있다.
상기 섬유 매트는 상기 섬유 매트가 단일 또는 적층된 튜브형 또는 롤(roll) 형태를 형성하도록 상기 니들 표면에 감을 수 있다. 구체적으로, 상기 섬유 구조체는 상기 섬유 매트의 양단이 접촉하도록 상기 매트를 상기 니들 표면에 감아 형성된 튜브 형태의 관형 구조일 수 있고, 이때, 적어도 하나의 상기 섬유 매트가 감아져, 단층 또는 적층된 튜브 형태를 가질 수 있다. 이와 달리, 상기 섬유 구조체는 섬유 매트가 중첩되어 상기 매트의 다층 구조가 적어도 일부분이 적층되도록 상기 섬유 매트를 상기 니들에 감아 형성된 롤과 같은 형태의 관형 구조일 수 있다. 이때, 하나의 상기 섬유 매트를 니들 표면에 수회 감아 상기 섬유 매트를 중첩시킬 수 있다. 이와 달리, 둘 이상의 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트를 상기 니들 표면에 감아 상기 섬유 매트가 중첩된 튜브 또는 롤 형태의 관형 구조를 형성할 수도 있다.
이때, 본 발명의 관형의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 일반적인 체내 삽입용 스캐폴드가 갖는 직경 2 mm 내지 8 mm, 길이 50 mm 내지 200 mm의 크기로 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 상기 섬유 매트를 적절히 가공(절단 등)하고 이를 니들 표면에 감아 직경 2 mm 내지 8 mm, 길이 50 mm 내지 200 mm의 크기를 갖는 상기 섬유 구조체를 제조하는 것이 바람직할 수 있다.
또한, 상기 섬유 매트는 나노섬유 및 마이크로섬유 중 적어도 어느 하나로 형성된 섬유 매트일 수 있다. 이때, 상기 섬유 매트가 나노섬유 및 마이크로섬유를 포함하는 경우, 상기 섬유 매트를 형성하는 단계에서, 나노섬유 전기방사용 용액 및 마이크로섬유 전기방사용 용액을 각각 적어도 1회 교대로 전기 방사하여, 나노섬유 층 및 마이크로섬유 층이 교대로 반복 배치된 다층 구조를 갖는 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트를 형성할 수 있다.
이때, 전기 방사는 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트가 목적하는 두께나 층수를 갖도록 제어할 수 있다. 일례로, 나노섬유 전기방사용 용액 및 마이크로섬유 전기방사용 용액은 각각 1회 내지 수회 반복 전기 방사할 수 있다. 이때, 전기방사 횟수에 따라 목적하는 두께나 층수를 갖도록 상기 섬유 매트를 감는 횟수를 조절할 수 있다. 일례로, 나노섬유 전기방사용 용액 및 마이크로섬유 전기방사용 용액을 각각 1회 전기 방사하여 나노/하이브리드 섬유 매트를 형성한 후 이를 수차례 감아 목적하는 두께나 층수를 갖도록 할 수 있고, 이와 달리, 나노섬유 전기방사용 용액 및 마이크로섬유 전기방사용 용액을 각각 수회 반복 전기 방사하여 나노/하이브리드 섬유 매트를 형성한 후 상기 섬유 매트의 감는 횟수를 제어하여 목적하는 두께나 층수를 갖도록 할 수 있다. 예를 들어, 상기 나노섬유 전기방사용 용액 및 마이크로섬유 전기방사용 용액을 각각 4회씩 전기 방사하는 경우, 4개의 상기 나노섬유 층 및 4개의 상기 마이크로섬유 층이 교대로 반복 배치된 총 8층 섬유 다층 구조를 갖는 매트를 형성할 수 있다.
전기 방사법은 특정 공극 크기, 공극도 및 섬유 형태를 갖는 섬유 구조체를 생성하도록 할 수 있고, 이로부터 in vivo 조직-유사 구조를 형성할 수 있다. 때문에, 본 발명에 따르면, 전기 방사법을 이용하여 목적하는 조직 표현형으로 세포를 분화시키기 위한 세포외기질(ECM)-유사 구조체를 세포들에 제공할 수 있다.
일례로, 상기 전기 방사는 회전 드럼 집적 기반의 전기 방사기를 이용하여 수행할 수 있고, 상기 나노섬유 전기방사용 용액은 상기 마이크로섬유 전기방사용 용액 보다 빠른 속도로 전기 방사하고, 상기 나노섬유 전기방사용 용액의 전기 방사 시 드럼의 회전 속도를 상기 마이크로섬유 전기방사용 용액의 전기 방사 시 드럼 회전 속도 보다 빠르게 제어하여, 상기 나노섬유 전기방사용 용액의 전기 방사를 통해 일 방향으로 정렬된 나노섬유를 포함하는 나노섬유 층을 형성하고, 상기 마이크로섬유 전기방사용 용액의 전기 방사를 통해 비정렬된 마이크로섬유를 포함하는 마이크로섬유 층을 형성할 수 있다.
상기 나노섬유 전기방사용 용액은 실크 피브로인(silk fibroin, SF)을 포함할 수 있고, 이때, 상기 나노섬유 전기방사용 용액은 실크 피브로인을 포름산(formic acid)과 같은 용매에 용해하여 준비할 수 있다. 또한, 상기 마이크로섬유 전기방사용 용액은 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL)을 포함할 수 있고, 이때, 상기 나노섬유 전기방사용 용액은 폴리카프로락톤을 클로로포름과 같은 용매에 용해하여 준비할 수 있다.
상기 하이드로겔은 니들을 통해 주입 가능할 정도의 점도를 갖고 세포를 캡슐화 가능한 하이드로겔이고, 일례로, 상기 하이드로겔은 상기와 같은 특성을 갖는 생체적합하고 생분해 가능한 고분자로 형성될 수 있다, 상기 생체적합하고 생분해 가능한 고분자의 예로는, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐 등이 있다. 일례로, 상기 하이드로겔은 알지네이트나 콜라겐으로 형성되는 것이 바람직할 수 있다. 또는, 본 발명의 생체적합성 고분자는 알지네이트 및 콜라겐을 모두 포함할 수도 있다. 알지네이트와 콜라겐은 생체 적합한 천연 고분자로서, 세포가 쉽게 캡슐화되고 목적하는 치료 효과를 생산할 수 있는 목적 영역으로 전달되도록 하는 충분한 점도를 갖는다. 때문에, 알지네이트와 콜라겐은 니들을 통해 주입 가능하다. 일례로, 알지네이트 하이드로겔을 이용하는 경우, 상기 하이드로겔을 상기 섬유 구조체 내에 주입한 후, 칼슘을 포함하는 용액(예를 들어, 칼슘 클로라이드)에 침지시켜 가교시킬 수 있다.
이하, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법을 참조하여, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드를 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 관형의 섬유 구조체 및 상기 관형의 섬유 구조체의 내부 공간에 담지된 줄기 세포 함유 하이드로겔을 포함한다.
이때, 상기 하이드로겔은 하이드로겔 주입 가능한 니들과 결합된 관형의 섬유 구조체로부터 상기 니들을 제거하면서 상기 줄기 세포 함유 하이드로겔을 상기 니들을 통해 상기 관형의 섬유 구조체의 내부 공간에 주입하여 담지될 수 있다.
상기 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에서 관형의 섬유 구조체의 횡단면은 원형이고, 횡단면 상에서 상기 하이드로겔이 담지되는 상기 섬유 구조체의 내부 빈 공간은 중심부, 즉, 코어(core)로 표현하고, 상기 섬유 구조체는 쉘(shell)과 같이 표현할 수 있다.
상기 섬유 구조체는 일 방향으로 정렬된 나노섬유를 포함하는 나노섬유 층 및 비정렬된 마이크로섬유를 포함하는 마이크로섬유 층을 포함하고, 적어도 하나의 상기 나노섬유 층 및 상기 마이크로섬유 층이 교대로 반복 배치된 다층 구조를 가질 수 있다. 본 발명에서 나노섬유 및 마이크로섬유는 각각 나노미터(nano meter, nm) 및 마이크로미터(micro meter, μm) 단위의 직경을 갖는 섬유를 의미하고, 본 발명의 나노섬유 및 마이크로섬유는 각각 1 내지 수백 nm, 1 내지 수십 μm의 직경을 가질 수 있다. 일례로, 본 발명의 나노섬유는 200 nm 내지 600 nm의 직경 크기, 본 발명의 마이크로섬유는 3 μm 내지 10 μm의 직경 크기를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 일례로, 상기 나노섬유는 실크 피브로인으로 형성된 실크 피브로인 나노섬유일 수 있고, 상기 마이크로섬유는 폴리카프로락톤으로 형성된 폴리카프로락톤 마이크로섬유일 수 있다.
본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 섬유 구조체를 포함함으로써 우수한 기계적 안정성을 나타낼 수 있고, 본 발명의 상기 섬유 구조체에 담지된 상기 하이드로겔은 세포를 캡슐화하고 사람의 조직을 모방하는 세포외기질 유사 환경을 제공할 수 있어 상기 하이드로겔이 함유하고 있는 세포에 안정한 환경을 제공할 수 있다. 또한, 상기 섬유 구조체 내부로 니들을 이용하여 하이드로겔을 주입함으로써, 상기 섬유 구조체에 충분히 하이드로겔이 침투하도록 할 수 있는 동시에, 상기 섬유 구조체에 세포가 용이하게 부착될 수 있으며, 아울러, 세포 배양 시 세포가 상기 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에 전반적으로 고르게 증식, 성장할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 하이드로겔을 포함함으로써 향상된 세포의 부착, 생존, 성장 및 성숙(maturation)을 나타낼 수 있다.
즉, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 섬유 구조체 및 하이드로겔을 모두 포함하고 있어, 강인한 구조적 안정성을 제공할 뿐만 아니라, 세포의 증식, 분화, 조직 형성 및 성숙을 가속할 수 있는 3D 마이크로환경 및 지형학적 신호(topographical cues)를 제공할 수 있다. 때문에, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 조직을 구축하거나 세포 기능을 제어하는 역할을 할 수 있고, 줄기 세포의 지지대 역할과 동시에 줄기 세포가 잘 부착되어 있도록 하는 접착유도물질로서 작용할 수 있으며, 결함 자리(defect site)에 줄기 세포를 전달하는 캐리어로서 역할을 할 수 있다.
이때, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드가 특히 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체를 포함하는 경우, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 인대, 힘줄, 혈관 또는 근육과 같은 우수한 기계적 특성과 유연성, 탄성 등이 요구되는 조직의 재생용 스캐폴드로서 우수한 특성을 나타낼 수 있다. 구체적으로, 종래의 3차원적인 땋거나 편물한(braided or knitted) 스캐폴드는 인대나 힘줄 같은 조직의 재건의 초기 단계에서 높지 않은 중간 정도의 기계적 안정성을 제공하고, 특히, 복합 3D 마이크로환경과 정렬된 세포 형태 및 세포 분화에 영향을 미치는 지형학적 신호가 반복 발생되기 어렵다. 때문에, 장기간 이식을 위해 인대나 힘줄, 혈관 또는 근육과 같은 고도로 정렬되면서 탄성이 요구되는 조직의 높은 기계적 강도를 견디기 위한 충분한 구조를 생성할 수 없다는 문제가 있었다. 그러나, 본 발명의 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체는 정렬된 나노섬유 층과 비정렬된 마이크로섬유 층이 교대로 반복된 다층 구조를 갖기 때문에, 정렬된 나노섬유로부터 세포 배양 시 세포의 부착 및 성장 방향성을 부여할 수 있다. 즉, 정렬된 나노섬유는 세포 정렬, 분화 및 성숙을 위한 지형학적 신호를 제공할 수 있다. 한편, 비정렬된 마이크로섬유 층은 마이크로 직경 크기의 섬유들이 무작위적으로 존재하므로, 상기 나노섬유 층과 비교하여 상대적으로 큰 공극을 형성할 수 있고, 이에 따라, 세포가 용이하게 침투될 수 있으며, 세포 배양 시 세포 성장에 요구되는 산소나 영양분을 공급하는 역할을 할 수 있다. 또한, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 마이크로섬유 층을 포함함으로써, 우수한 기계적 강성(stiffness) 그리고 강도(strength)를 나타낼 수 있다.
이상적인 스캐폴드는 효과적인 재생 능력을 위해 초기 제공된 세포의 양을 유지할 수 있으면서 그 구조를 통해 세포들을 균일하게 분포할 수 있어야 하는데, 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체를 포함하는 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 일 방향으로 정렬된 나노섬유 층과 비정렬된 마이크로섬유 층이 교대로 반복됨으로써 세포 성장의 방향성을 부여할 수 있을 뿐만 아니라, 용이한 세포 침투 및 확산 증식을 위한 충분한 공극도를 가지므로, 상기 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에 전반적으로 고르게 세포가 확산 성장되어 세포를 전달할 수 있다. 따라서, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 스캐폴드로서 우수한 특성을 나타낼 수 있고, 특히, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 정렬된 나노섬유로부터 세포 성장에 방향성을 부여할 수 있으므로, 이에 기인하여, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드를 길이 방향으로 세포 성장이 요구되는 혈관, 근육, 힘줄(tendon)이나 인대와 같은 고도로 정렬된 결합 조직의 재생에 더 효과적일 수 있다.
특히, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 관형의 섬유 구조체를 포함하기 때문에 인대에 더 적합할 수 있다. 뼈 사이의 섬유성 결합 조직인 인대는 복합 점탄성 특성을 갖고 매우 강인하며, 관절 운동의 안정성을 유지하기 위한 인체의 가장 중요한 부분 중 하나이다. 그러나, 인대는 빈번하게 손상되는 부위로서 인대의 파열(rupture) 및 찢어짐(tear)은 갑작스러운 심한 부종, 기능 장애 및 관절 불안정성을 야기할 수 있고, 특히, 손상된 인대는 치료나 재생이 어렵다는 문제가 있다. 종래의 손상된 인대를 재건하거나 치료하기 위한 일반적인 방법으로서 자가 및 동종 이식편(auto- and allografts)의 이식이 있기는 하지만, 자가 이식편의 경우는 조직 체취 부위의 통증 및 근력 약화 소견이 있고 채취로 인한 수술시간이 길어지는 단점이 있다. 동종 이식편의 경우는 이식건의 면역학적 거부반응, 드물게 에이즈등의 감염 가능성 등이 단점이다. 그러나, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 인대와 유사한 구조를 가지면서 상기 설명한 것과 같이, 우수한 기계적 특성을 갖고, 세포의 부착 및 성장과 세포를 효율적으로 증식 및 분화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 특히 세포 성장에 방향성을 부여할 수 있으므로, 인대 재건용 스캐폴드로서 우수한 특성을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)일 수 있고, 일례로, 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 또한, 본 발명의 하이드로겔은 상기 줄기 세포의 분화를 증진시키는 성장 인자(growth factor)를 포함할 수도 있다. 일례로, 상기 섬유/하이드로겔 복합체가 인대 재건용 스캐폴드인 경우, 상기 하이드로겔은 인대 분화 및 성숙을 가속하기 위해 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor)를 포함할 수 있다.
본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 세포 배양액에 침지시켜, 상기 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드 내에 존재하는 줄기 세포를 배양할 수 있다. 이때, 상기 섬유 구조체 중심부에 담지된 하이드로겔로부터 줄기 세포가 상기 섬유 구조체의 내부로부터 외부로 용이하게 침투 및 확산 증식될 수 있고, 이에 따라, 세포가 상기 섬유 구조체에 전반적으로 균일하게 성장 및 분포할 수 있으며, 이를 통해, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 세포를 균일하게 분배할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 일 방향으로 정렬된 나노섬유를 포함하는 나노섬유 층 및 비정렬된 마이크로섬유를 포함하는 마이크로섬유 층을 포함하고, 적어도 하나의 상기 나노섬유 층 및 상기 마이크로섬유 층이 교대로 반복 배치된 다층 구조를 갖는, 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체 및 상기 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체에 담지된, 줄기 세포 함유 하이드로겔을 포함한다.
이때, 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체는 상기에서 설명한 것과 같이 원통형일 수 있고, 이와 달리, 사각 기둥, 삼각 기둥, 매트 등의 다양한 형태일 수 있다.
나노섬유, 마이크로섬유, 및 하이드로겔은 상기에서 설명한 것과 실질적으로 동일하고, 상기 섬유 구조체 또한 원통형으로 제한하는 것 외에 실질적으로 상기에서 설명한 섬유 구조체와 동일하므로, 이에 중복되는 상세한 설명은 생략하기로 한다.
이하에서는, 구체적인 실시예를 들어, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드와 이를 제조하는 방법을 보다 상세히 설명하기로 한다.
(1) 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트의 제조
마이크로 섬유를 위한 폴리머로서 평균 70,000 내지 90,000의 분자량(Mw)을 갖는 폴리카프로락톤(PCL)을 사용하였고, PCL을 99.5%의 클로로포름(chloroform)에 10 wt%의 농도로 용해하여 PCL 전기 방사 용액(이하, PCL 용액)을 준비하였다.
나노 섬유로서는 Bombyx mori 실크를 사용하였다. 먼저, 실크 섬유 원료를 0.02 M의 소듐 카보네이트(sodium carbonate, Na2CO3)를 포함하는 증류수(distilled water, dH2O)에서 100℃에서 30분 동안 정련(degummed)한 후, 30분 동안 dH2O로 3회 세척하였다. 이어서, 정련한 실크인, 실크 피브로인(SF)을 9.3 M의 리튬 브로마이드(lithium bromide, LiBr) 수용액에 60℃에서 4시간 동안 용해한 다음, 용액을 셀룰로오스 튜브형 멤브레인을 이용하여 dH2O에서 투석하였다(48시간 동안 6회 교환). 그 다음, SF 스폰지를 얻기 위해 SF 수용액을 냉동건조하였다(lyophilized). SF 스폰지를 4℃에서 12시간 동안 포름산(formic acid)에 용해하여, 전기 방사를 위한 SF 전기 방사 용액(이하, SF 용액)을 제조하였다. 이때, SF 용액의 농도는 약 10 wt%이었다.
전기 방사 장치는 도 1의 도시한 바와 같이, 90 mm의 직경을 갖는 알루미늄 드럼 콜렉터(collector), 고전압 전원 장치, 시린지 펌프(syringe pump) 및 210 μm의 내부 직경을 갖는 방사 노즐(spinneret nozzle)로 구성된다. 노즐 팁(tip)과 콜렉터 사이의 거리 및 전위(electrical potential)는 약 100 mm 및 13 kV로 각각 유지하였다. PCL 용액 및 SF 용액의 유속(flow rate)는 각각 0.5 ml·h-1 및 0.2 ml·h-1로 설정하였고, 시린지 펌프에 의해 제어되었다. 드럼 콜렉터의 회전 속도는 PCL 용액 및 SF 용액에 대하여 각각 약 50 rpm 및 3,000 rpm이었다. 노즐은 드럼 표면 상에서 섬유들의 균일한 두께와 밀도를 위해, 드럼 축을 따라 1 mm·s-1의 속도와 약 80 mm의 범위로 주행 운동시켰다. PCL 용액 및 SF 용액은 나노 및 마이크로 섬유들의 교번 층(alternate layer)을 갖는 SF/PCL 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트(이하, SF/PCL 매트)를 제조하기 위해, 교대로 방사하였다. 이때, 전기 방사는 각각 4회 수행하였고, 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트의 층들의 총 수는 8층이었다. 전기 방사 동안, 온도 및 상대 습도는 각각 20 - 22℃와 48 - 52%를 유지하였고, SF 나노섬유 및 PCL 마이크로섬유를 위한 자세한 전기방사 조건들은 표 1에 요약하였다.
파라미터(단위) 값(value)
SF 나노섬유 PCL 마이크로섬유
온도(℃) 20 - 22
상대 습도(%) 48 - 52
전계(kV) 13
팁에서 콜렉터까지의 거리(mm) 100
드럼 속도(mm·s-1) 3,000 50
유속(ml·h-1) 0.2 0.5
용매 포름산 클로로포름
용액 농도(wt%) 10
(2) 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체의 제조
전기 방사 후, 제조된 SF/PCL 매트를 SF 나노섬유 층들에서 β-시트 형태 전이(conformational transition)를 위해 비정질을 유도하도록 dH2O를 포함하는 진공 건조기(desiccator)에서 37℃로 10시간 동안 건조하였다. 그 다음, SF/PCL 매트를 10 × 8 mm2의 넓이를 갖는 정사각형 조각으로 자른 후, 상기 조각을 직접적인 하이드로겔 주입에 참여하는 0.91 mm의 외부 직경을 갖는 스테인리스 스틸 니들에 SF 나노섬유의 정렬 방향이 니들 축에 정렬되도록 감고, 니들의 횡축(transverse) 방향을 따라 봉합사(sutures)를 이용하여 고정시켰다. 이때, 니들을 둘러싼 SF/PCL 매트의 외부 직경 및 길이는 각각 3 및 10 mm이었다. 그 다음, 조립된 SF/PCL 매트 및 니들을 3.18 mm의 내부 직경을 갖는 Tygon 튜브에 삽입하여, 3차원 튜브형 구조를 갖는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체(이하, SF/PCL 섬유 구조체)를 형성하였다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드 및 이의 제조 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 2의 (A)는 니들을 둘러싸고 봉합사로 고정된 SF/PCL 매트를 나타내고, (B)는 Tygon 튜브에 삽입된 SF/CPL 매트 및 니들의 조립체를 나타낸다.
(3) 세포 함유 하이드로겔의 제조
먼저, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, hBMMSC)를 하이드로겔에 캡슐화하기 위해 배양하였다. 배양 배지는 10% (v/v) 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 고포도당을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's mediem)을 사용하였다. 세포는 배양 배지에서 37℃, 5% CO2의 습한 대기(humidified atmosphere)에서 배양하였다. 배지는 2일마다 교환하였다.
3차 계대 배양된(third passaged) 세포를 스캐폴드로 시딩(seeding)하기 위해 수확하였다. 주입 가능한 세포 함유 하이드로겔을 제조하기 위해, 갈조류로부터의 소듐 알지네이트(sodium alginate)를 인산 완충 식염수(phosphate buffer saline, PBS)에 4% (w/v)의 농도로 용해한 후, 4% 알지네이트 용액에 약 7 × 106 세포·ml-1의 농도로 hBMMSC를 캡슐화하여, SF/PCL 섬유 구조체 주입용 세포 함유 알지네이트 하이드로겔(이하, 알지네이트 하이드로겔)을 준비하였다. 추가적으로, 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF)를 100 ng·ml-1의 농도로 세포 함유 하이드로겔에 첨가하였다.
(4) 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조
주입 가능한 세포 함유 알지네이트 하이드로겔은 SF/PCL 섬유 구조체로 주입하기 위해 1 ml 시린지로 이동시켰고, SF/PCL 섬유 구조체 당 주입된 알지네이트 하이드로겔의 용량(volume)은 도 2의 B에서 도시한 것과 같이 조립된 SF/PCL 매트 및 Tygon 튜브(SF/PCL 섬유 구조체)의 총 용량을 고려하여 계산하였고, SF/PCL 매트의 용량은 90%의 공극도를 가정하여 추정하였다. 총 72 μl의 알지네이트 하이드로겔(인장력 테스를 위한 샘플에서는 360 μl)을 시린지를 이용하여 각각의 SF/PCL 섬유 구조체로 주입하였다. 각각의 SF/PCL 구조체에서 세포의 총 수는 대략 5 × 105이었다. 주입 동안, 니들은 알지네이트 하이드로겔이 SF/PCL 섬유 구조체 코어의 빈 공간을 채우도록 SF/PCL 섬유 구조체로부터 3.5 μl·s-1의 속도로 천천히 뒤로 당겨 제거하였다. 주입 후, 외부 Tygon 튜브를 조심스럽게 제거하였고, 그 다음 세포 주입한 SF/PCL 구조체를 100 mM 칼슘 클로라이드(calcium chloride) 용액에서 37℃에서 15분 동안 침지시켜, 알지네이트를 가교시켰다. 구조체를 용액에서 꺼낸 후 PBS에서 3최 세척하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드를 제조하였다.
(5) 세포 배양
섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 세포 배양을 위해, 10% (v/v) FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 고포도당을 포함하는 DMEM에서 37℃, 5% CO2의 습한 대기에서 14일 동안 배양하였다. 배지는 2일마다 교환하였다.
이하, bFGF 함유 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 GF+, 비함유 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 GF-라 하기로 한다.
기하학적 분석(Geometric analysis)
주사 전자 현미경(SEM, SU4200, Hitachi, Japan)을 이용하여 전기 방사 SF 섬유 및 PCL 섬유의 표면 형태를 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3은 본 발명의 나노/마이크로 하이드리드 섬유 구조체를 설명하기 위한 도면으로, SF 및 PCL 섬유의 SEM 이미지 및 섬유 직경 분포를 나타내는 도면이다.
도 3의 A는 비정렬된 PCL 마이크로 섬유의 SEM 이미지 및 직경 분포를 나타내고, B는 정렬된 SF 나노 섬유의 SEM 이미지 및 직경 분포를 나타내며, C는 SF/PCL 하이브리드 섬유 매트의 첫 번째(첫 번째(top) 층은 SF 나노섬유로 이루어지고, 두 번째 층은 PCL 마이크로섬유로 이루어짐) 표면의 SEM 이미지를 나타낸다.
도 3을 참조하면, 전기 방사된 PCL 섬유는 정렬되지 않고 무작위적으로 존재하는 것을 확인할 수 있다. 반면, 전기 방사된 SF 섬유는 일 방향으로 곧게 정렬되어 있는 것을 확인할 수 있다. 또한, 직경 분포를 보면, PCL 섬유의 직경은 주로 3 내지 5 μm의 범위이고, 대략 4 μm에서 피크를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 반면, SF 섬유의 직경은 주로 200 내지 600 nm의 범위이고, 약 500 nm에서 피크를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
즉, 본 발명에 따라 전기 방사된 PCL 섬유는 마이크로 크기를 갖고 랜덤하게 배열되는 반면, SF 섬유는 나노 크기를 갖고 일 방향으로 곧게 정렬된 것을 확인할 수 있다. 비정렬된 PCL 마이크로 섬유는 정렬된 SF 나노 섬유 보다 큰 공극(pores)을 형성할 수 있고, 이것은 PCL 마이크로 섬유가 더 나은 세포 침투를 제공할 것임을 의미한다.
또한, 나노/마이크로 하이드리드 섬유 구조체의 횡단면을 도 4에 나타낸다.
도 4는 본 발명의 나노/마이크로 하이드리드 섬유 구조체를 설명하기 위한 도면으로, 나노/마이크로 하이드리드 섬유 구조체의 SEM 이미지를 나타낸다.
도 4의 A는 SF/PCL 섬유 구조체의 횡단면 SEM 이미지를 나타내고, B는 SF 나노섬유 및 PCL 마이크로섬유 교번 층의 SEM 이미지를 나타낸다.
도 4를 참조하면, 3차원 관형의 SF/PCL 섬유 구조체는 나노 및 마이크로 섬유 층이 교대로 반복된 구조를 갖는 것을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 나노/마이크로 하이드리드 섬유 구조체는 정렬된 SF 나노섬유층과 비정렬된 PCL 마이크로섬유층이 교대로 반복 배치된, 다층 구조를 갖는 것을 확인할 수 있다.
기계적 특성 확인
기계적 특성은 만능 시험기(universal testing machine, UTM)을 이용하여 완전 습윤 상태 하에서 인장력 테스트를 통해 확인하였다. 특히, 기계적 특성에서 SF/PCL 매트의 SF 나노섬유 함량에 따른 효과를 확인하였다. 또한, 알지네이트 하이드로겔 및 SF/PCL 매트의 결합 효과를 확인하기 위해, 본 발명의 SF/PCL 섬유 구조체에 알지네이트 하이드로겔 봉입된 튜브형의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 기계적 특성 또한 확인하였다. 구체적으로, 다른 SF 나노 섬유 함량에 따른 특성을 확인하기 위해, 상기 (1) 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트의 제조에서, SF 나노섬유의 전기 방사 (또는 주행 운동) 시간을 SF/PCL 매트 내의 SF 나노섬유 함량을 확인하기 위해 변화시켜, 약 25%, 14% 및 10%의 다른 SF 나노섬유 함유량을 갖는 하이브리드 섬유 매트(이하, 각각 25% SF 매트, 14% SF 매트 및 10% SF 매트)를 준비하였다. 이때, 25% SF 매트, 14% SF 매트 및 10% SF 매트의 두께는 각각 약 204 ± 9 μm, 168 ± 5 μm 및 164 ± 6 μm이었다. 이 중 14% SF 매트를 선택하여 세포 함유 알지네이트 하이드로겔을 주입하고 배양하였고, 14% SF 매트 및 알지네이트 하이드로겔 주입된 14% SF 매트의 기계적 특성을 비교하였다. 이 실험에서, 준비된 샘플들은 25 mm의 게이지(gauge) 길이 및 15 mm의 게이지 폭의 조건 하에서 UTM에 설치하였다. 10 N의 용량(capacity)을 갖는 로드 세포(load cell)를 사용하였고, 크로스헤드(crosshead) 속도는 5 mm·min-1이었다. 각 유형의 샘플에 대한 테스트는 통계학적 정보를 얻기 위해 5회 반복하였다. 실험 데이터는 평균 ± 표준 편차(standard deviation)로 표시된다. 통계 비교를 위해, 2 그룹 이상을 비교할 때 분산 분석(ANOVA)를 수행하였고, ANOVA 테스트의 F 값이 영가설(null hypothesis)에 부합되지 않을 때 Bonferroni post-hoc 테스트를 수행하였다. 차이는 p < 0.05에서 유의한 것으로 간주하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.
도 5는 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 기계적 특성을 설명하기 위한 도면으로, 구체적으로, 25% SF 매트, 14% SF 매트, 10% SF 매트 및 알지네이트 하이드로겔 봉입된 14% SF 매트의 기계적 특성을 설명하기 위한 도면이다.
도 5의 A는 힘-변위 곡선(force-displacement curve)을 나타내는 그래프이고, B는 SF 나노 섬유의 함량에 따른 샘플들의 족지부 이전 그들의 파괴점에서 최대 힘 및 탄성력 강성(elastic stiffness)을 나타내는 그래프이다.
도 5를 참조하면, 25% SF 매트, 14% SF 매트, 10% SF 매트 및 알지네이트 하이드로겔 주입된 14% SF 매트, 4개의 유형의 샘플들에 대한 인장력 테스트 결과, 더 많은 양의 정렬된 SF 나노섬유가 더 강한 기계적 특성을 유도함을 확인할 수 있다.
특히, 도 5의 A를 참조하면, 샘플들 모두에서 인간 골격 연조직의 일반적인 힘-변위 곡선을 나타냄을 확인할 수 있다. 특히, 하중이 약 1 N 보다 작을 때(즉, 족지부(toe region) 이전) SF 함량이 증가함에 따라 신장(elongation)이 더 작아지는 것을 확인할 수 있고, 이것은 정렬된 SF 나노섬유들이 작은 하중 보다 높은(a small load higher) 구조적 강성을 형성함을 의미한다. 족지부 이후, 곡선은 선형관계(linear relationships)를 따르고, 그 다음 이들의 경사가 점점 낮아짐을 확인할 수 있다. 이것은 물체에 작용하는 응력이 어느 일정한 값에 이르면 소성 변형 혹은 점소성 변형이 개시하여 변형이 급격히 증가하는 현상인 '항복(yielding)'으로, 하중이 파괴점(failure point)에서 이의 최대에 다다르는 것을 확인할 수 있다. 한편, 10% SF 매트 및 14% SF 매트 곡선 사이에서는 작은 차이가 나타나는 것을 확인할 수 있으나, 반면, 25% SF 매트에서는 다른 것들과 비교하여 큰 차이가 나타나는 것을 확인할 수 있다.
도 5의 B를 참조하면, 도 5의 A에서 나타나는 것과 같이, 10% SF 매트 및 14% SF 매트 사이에서 최대 힘 및 탄성력 강성의 명확한 차이가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있다. 한편, SF 함량이 14%에서 25%로 증가함에 따라, 각각 약 33% 및 100%의 큰 증가가 발생하는 것을 확인할 수 있다.
뿐만 아니라, 알지네이트 하이드로겔 주입의 효과를 설명하면, 먼저, 곡선 프로파일, 최대 힘 및 탄성력 강성 모두에서 알지네이트 하이드로겔 주입된 14% SF 매트에 유도된 유의한 변화가 나타나는 것을 확인할 수 있다. 대표적으로 점탄성 거동에 관하여, 경사(강성)에서 큰 변화가 억제되었고, 이것은 더 강해졌음을 나타낸다(stiffer). 뿐만 아니라, 알지네이트 하이드로겔 주입된 14% SF 매트 샘플의 최대 힘은 25% SF의 매트의 것에 근접함을 확인할 수 있다. 이러한 결과들로부터, 알지네이트 하이드로겔 주입된 14% SF 매트는 알지네이트 하이드로겔을 주입함에 따라 섬유 구조의 기계적 특성이 향상되었음을 확인할 수 있다.
즉, 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체 및 하이드로겔을 포함하는 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드가 우수한 기계적 특성을 가짐을 확인할 수 있다.
hBMMSC 생존력 및 증식의 평가
섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에서 hBMMSC의 생존력은 Live 및 Dead 생존 능력 키트 (LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit, Invitrogen)를 사용하여 1, 4, 7 및 14일에 확인하였다. 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 칼세인 AM(calcein AM) 및 에티디움 호모다이머(Ethidium homodimer) 함유 PBS에서 37℃에서 30분 동안 배양하였고, 칼세인 AM은 살아있는 세포, 에티디움 호모다이머는 죽은 세포를 표지하였다(label). 세포는 공초점 레이저 현미경(confocal laser scanning microscope) (LSM800 w/Airyscan, CarlZeiss)를 사용하여 관찰하였다. 생존력은 세포의 총 수에 대한 생존 세포의 비율을 계산하여 결정하였다. 세초의 수는 NIH Image J 소프트웨어를 이용하여 세었다. 각 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에서 세포의 증식은 DNA 함량 분을 사용하여 평가하였다. 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에서 총 DNA는 제조업체의 지침에 따라 PicoGreen dsDNA 정량 분석 (Invitrogen)을 이용하여 정량화하였다. 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 1 및 14일차에 회수하였고, 각 샘플은 냉동건조하고 중량을 측정하였으며, 이어서 파파인 소화(papin digestion) 용액 (pH 6.5에서 5 mM의 Na2-EDTA 및 5 mM의 시스테인-HCl(cysteine-HCl) 함유하는 0.1M의 소듐 포스페이트(sodium phosphate) 중 125 μg·ml- 1 의 파파인)에서 60℃로 18시간 동안 배양하였다. 파파인 소화된 샘플들은 TE 버퍼로 희석하였고, PicoGreen 염료와 혼합하였다. DNA 함량은 480 nm의 여기 파장(excitation wavelength) 및 520 nm의 방출 파장을 갖는 형광 플레이트 리더(fluorescence plate reader) (Synergy Mx, BioTek)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.
도 6은 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드를 설명하기 위한 도면으로, 구체적으로, 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에서 hBMMSC의 침투, 생존, 및 증식을 설명하기 위한 도면이다.
먼저, 도 6의 A는 생장인자 포함 및 미포함 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드(GF+ 및 GF-)의 횡단면 이미지이고, 도 6의 A에서 세포 핵(nuclei)은 DAPI로 염색하였고 블루(blue)로 나타내며, 점선은 코어 영역 및 쉘 영역 사이의 경계를 나타내고, 스케일 바는 200 μm이다(scale bar = 200 μm).
도 6의 B는 생장인자 포함 및 미포함 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드(GF+ 및 GF-)의 1, 4, 7 및 14일에서 생존/사멸 염색 결과를 나타내고, 도 6의 B에서 그린(green)은 생존 세포, 레드(red)는 사멸 세포를 나타내고, 스케일 바는 200 μm이다. 옐로우(yellow) 화살표들은 SF 나노섬유 정렬 방향 및 그 결과로 일어나는 세포 정렬을 나타낸다.
도 6의 C는 생장인자 포함 및 미포함 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드(GF+ 및 GF-)의 1, 4, 7 및 14일에서의 세포 생존력을 나타내는 그래프이다(n=3).
도 6의 D는 생장인자 포함 및 미포함 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드(GF+ 및 GF-)의 1일 및 14일에서의 DNA 함량을 나타내는 그래프이다(n=3)(***p<0.001).
도 6의 A를 참조하면, 도 6의 A의 형광 이미지로부터 hBMMSC가 3차원 관형의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 코어(중심부) 및 쉘(SF/PCL 매트(구조체))에서 모두 검출됨을 확인할 수 있다. 이것은 나노 및 마이크로 섬유들의 조합이 세포가 각 섬유 층들을 통과하도록 하는 충분한 공극도를 제공하고, 세포가 균일하게 분포되도록 하였음을 나타낸다. 한편, bFGF를 포함하는 경우에 더 많은 세포가 관찰됨을 확인할 수 있다.
도 6의 B 내지 D를 참조하면, 먼저, 생존 사멸 분석 결과, 생장인자 포함 및 미포함 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드(GF+ 및 GF-) 모두에서 최소한의 세포 사멸과 함께 높은 세포 생존력을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 이것은 SF/PCL 섬유 구조체로 세포가 기계적으로 주입되는 동안 낮은 전단응력(shear stress)일 발생하고 뿐만 아니라, 세포 손상이 없음을 의미한다(도 6의 B 및 C 참조). 또한, DNA 함량 결과로부터 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에서 14일 동안 hBMMSC가 증식하였음 확인할 수 있다(도 6의 D 참조). 즉, 장기간 배양(14일까지) 동안 증식과 높은 세포 생존력을 유지하였음을 확인할 수 있고, 이것은 제조된 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드가 적절한 영양분과 산소를 세포에 제공할 수 있음을 나타낸다. 뿐만 아니라, GF+ 구조체는 더 높은 세포 생존력 및 증식을 나타내고, 이 결과로부터, 인대 관련 세포의 세포 증식에서 bFGF가 주요한 자극제로서 역할을 할 수 있음을 확인할 수 있다.
또한, 세포는 SF 나노섬유의 정렬방향을 따라 신장 및 정렬되기 시작하였고(도 6의 B 참조), 4일 차, 세포가 무작위적으로 정렬 및 신장하였으나, 7일 차 다시 SF 나노섬유 정렬 방향을 따라 정렬하기 시작함을 확인할 수 있다. 이것은 세포가 초기 배양 기간에 알지네이트 하이드로겔 환경의 작용을 받음을 나타낸다. 14일 차, SF 나노섬유 정렬 방향을 따라 증가된 세포 정렬이 나타나고, 이러한 결과로부터 세포가 주변 나노섬유에 의해 자극되고 나노섬유의 방향을 따라 신장함을 확인할 수 있다. 이것은 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드가 나노섬유를 통해 세포 신장 및 정렬을 가이드하는 나노-지형학적 신호를 세포에 제공함을 나타낸다.
형광항체법(Immunofluorescence staining)
1형 콜라겐(collagen type I) 및 테나신-C(tenascin-C)의 발현은 형광항체법을 이용하여 확인하였다. 구조체는 4℃에서 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 하룻밤동안 고정시키고 파라핀으로 블락하였다(blocked). 샘플들은 겹쳐진 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 횡축을 따라 크라이요마이크로톰(cryomicrotome) (Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 10 μm 두께의 슬라이스(slice) 로 절개하였다(sectioned). 절개된 조각들은 PBS로 3회 세척하였고, PBS에서 0.1% Triton-X 100로 실온에서 30분 동안 투과시켰다. 절개된 조각들을 PBS에서 1시간 동안 5%의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin (Affymetrix-USB))으로 블락시켰고, 이어서 1형 콜라겐 항체(1:100 희석, Abcam) 및 테나신-C 항체(1:50 희석, Abcam)로 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 그 다음, 절개된 조각들을 실온에서 1시간 동안 Alexa 488-공액(conjugated) 이차 항체 (1:100 희석, Invitrogen) 및 Alexa 594-공액 이차 항체 (1:100 희석, Invitrogen) 그리고 DAPI로 배양하였다. 이미지들은 공초점 현미경을 이용하여 수득하였다.
유전자 발현 분석
배양 1일 및 14일 후, 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드로부터 벤더의 프로토콜에 따라, TRIzol 시약 (Takara)을 이용하여 전체 RNA를 분리하였다. RNA 함량은 NanoDrop (Thermo Scientific)을 사용하여 결정하였다. cDNA는 제조업체의 지침에 따라 cDNA 합성 키트 (Thermo Scientific)로 합성하였다. 시드된 hbMMSC의 인대 분화를 평가하기 위해, 1형 콜라겐(collagen type I (COL1A1)), 디코린(decorin (DCN)), 스클레락시스(scleraxis (SCX)), 테나신-C(tenascin-C (TNC)), 및 테노모둘린(tenomodulin (TNMD))과 같은 인대 세포외기질 관련 단백질들의 상대적인 발현을 LightCycler 480® II (Roche)를 사용하여 SYBR-그린(SYBR-green)으로 분석하였다. 프라이머 시퀀스(primer sequences)는 표 2에 요약하였다. 목적 유전자의 폴드 변화(fold changes)는 2- ΔΔCt 방법을 이용하여 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, (GAPDH))의 발현에 대해 표준화하였다(normalized).
상기 형광항체법 및 상기 유전자 발현 분석 결과를 도 7에 나타낸다.
도 7은 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드를 설명하기 위한 도면으로, 구체적으로, 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에서 인대 관련 세포외기질 단백질의 발현을 설명하기 위한 도면이다.
도 7의 (A)는 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에서 1일 및 14일에서의 인대 관련 유전자 발현을 설명하기 위한 도면이다. *, #, 및 †은 각각 p < 0.05 대 1일 및 14일에서 GF- 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드 및 1일에서 GF+ 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드를 나타낸다. 도 7의 (B)는 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에서 1형 콜라겐 및 테나신-C의 발현의 형광항체 이미지들을 나타낸다(횡단면). 스케일 바는 200 μm이다.
도 7을 참조하면, 1일 및 14일 차에서, GF- 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에서 배양된 hBMMSC과 비교하여, GF+ 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에서 배양된 hBMMSC에서 인대 ECM 단백질에 대한 상당히 상향 조절된 유전자 발현을 확인할 수 있다(도 7의 A 참조). 대부분의 성장 인자들이 매우 짧은 반감기를 갖고 치료 효과를 유도하기 전에 빠르게 비활성화되는데 반해, GF+ 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 1일 차에서 가장 높은 유전자 발현을 나타내고, 또한 14일 차에서 가장 상향 조절된 유전자 발현을 나타냄을 확인할 수 있다. 이것은 알지네이트 하이드로겔이 bFGF의 비활성화를 방지하고, 이에 따라, 인대 표현형으로 hBMMSC의 분화를 보장할 수 있음을 의미한다.
즉, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 성장인자의 비활성화를 방지하면서 성장인자를 서방성 방출하여 장기간 세포의 분화를 유도할 수 있음을 확인할 수 있다.
또한, 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 형광항체법으로부터, 14일 차에서 GF- 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드와 비교하여 GF+ 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에서 더 높은 1형 콜라겐 및 테나신-C의 발현이 나타나는 것을 확인할 수 있다. 뿐만 아니라, 1형 콜라겐 및 테나신-C을 포함하는 인대 관련 ECM 단백질이 GF+ 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 코어 및 쉘 영역 모두, 즉, 복합체 전체에서 존재함을 확인할 수 있다. 이것은 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드가 bFGF를 포함함으로써, 상대적으로 균일하고 향상된 인대 관련 ECM 단백질 발현을 나타낼 수 있음을 의미한다. 아울러, 도 7의 B에서 도시한 바와 같이, bFGF는 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드에서 강하게 hbMMSC의 성장을 자극함을 확인할 수 있다.
즉, 이러한 결과들로부터 bFGF가 세포 증식의 상호작용을 향상시켜 인대 관련 ECM 단백질의 생산을 더 증진시킬 수 있음을 확인할 수 있고, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 성장인자를 포함하지 않아도 우수한 세포 침투, 생존, 및 분화를 나타낼 수 있으나, 성장 인자를 포함하는 것이 더 바람직할 수 있음을 확인할 수 있다.
따라서, 상기에서 확인한 바와 같이, 기하학적 분석을 통해, 전기 방사된 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트 및 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트를 니들 표면에 감아 형성된 튜브형의 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체에서 정렬된 SF 나노섬유와 무작위적으로 비정렬된 PCL 마이크로섬유가 존재함을 확인할 수 있고, SF 나노섬유 및 PCL 마이크로섬유가 교대로 배치된 다층 구조를 포함하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 상기 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트는 PCL 마이크로섬유로부터 기인하는 큰 공극을 포함함을 확인할 수 있다. 뿐만 아니라, 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트를 니들 표면에 감아 형성된 튜브형의 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체 내에 주입된 알지네이트 하이드로겔은 복합 구조의 기계적 특성을 강화하는데 기여하고, 이에, 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 세포 침투 및 영양분 공급을 위한 충분한 공극도 및 적절한 기계적 강도를 제공할 수 있음을 확인할 수 있다.
또한, hBMMSC를 이용한 세포 테스트에서, 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드 내의 세포는 구조체를 통해 균일하게 분배되고 고도의 세포 생존력 및 증식력을 나타냄을 확인할 수 있다. 또한, 장기간 보존된 bFGF이 방출되고 인대 표현형으로 hBMMSC 분화를 자극하며, 이로부터 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드 내에 인대 관련 ECM 단백질을 퇴적시킬 수 있음을 확인할 수 있다. 즉, 다층 구조의 섬유 구조체 및 이에 봉입된 하이드로겔을 포함하는 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 인대 유사 원통형의 형태를 갖고, 향상된 기계적 특성 및 분화와 ECM 생산을 가속시키는 지형학적, 생물학적 신호들을 갖는 3D 마이크로환경을 제공함으로써, 인대 재건에 시너지 효과를 나타낼 수 있음을 확인할 수 있다.
이에, 종합적으로, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드가 섬유 구조체 및 이의 중심부에 담지된 하이드로겔을 포함함으로써, 세포 기능의 강화 및 구조적 안정성을 나타낼 수 있고, 유연한 구조를 제공할 수 있으며 조직 재생을 위한 충분한 기계적 특성 및 생의학적 요구를 충족시킬 수 있음을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드가 향상된 세포 침투, 지형항적 신호 및 기계적 특성들뿐만 아니라, 세포 생존력과 증식력을 나타낼 수 있음을 확인할 수 있다. 뿐만 아니라, 이러한 특성에 기인하여, 조직 재생용 스캐폴드로서 우수한 특성을 나타낼 수 있음을 확인할 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (21)

  1. 관형(tublar)의 섬유 구조체 내부에 니들을 배치시키고,
    상기 섬유 구조체의 내부 공간에 상기 니들을 통해 줄기세포 함유 하이드로겔을 주입하는 단계를 포함하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기 세포 함유 하이드로겔을 주입하는 단계에서,
    상기 섬유 구조체로부터 상기 니들을 제거하면서 상기 니들을 통해 줄기 세포 함유 하이드로겔을 주입하는 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 줄기 세포 함유 하이드로겔을 주입하는 단계 이전에, 상기 내부에 하이드로겔 주입 가능한 니들이 배치된 관형의 섬유 구조체를 형성하는 단계를 포함하고,
    상기 섬유 구조체를 형성하는 단계는,
    섬유 전기방사용 용액을 전기 방사하여, 섬유 매트를 형성하는 단계; 및
    상기 섬유 매트가 관 형태를 갖도록, 상기 섬유 매트를 하이드로겔 주입 가능한 니들 표면에 감는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 섬유 매트는 나노섬유 및 마이크로섬유를 포함하고,
    상기 섬유 매트를 형성하는 단계에서, 나노섬유 전기방사용 용액 및 마이크로섬유 전기방사용 용액을 각각 적어도 2회 교대로 전기 방사하여, 나노섬유 층 및 마이크로섬유 층이 교대로 반복 배치된 다층 구조를 갖는 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트를 형성하는 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 전기 방사는 회전 드럼 집적 기반의 전기 방사기를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 섬유 매트를 형성하는 단계에서,
    상기 나노섬유 전기방사용 용액은 상기 마이크로섬유 전기방사용 용액 보다 빠른 속도로 전기 방사하고, 상기 나노섬유 전기방사용 용액의 전기 방사 시 드럼의 회전 속도를 상기 마이크로섬유 전기방사용 용액의 전기 방사 시 드럼 회전 속도 보다 빠르게 제어하여,
    상기 나노섬유 전기방사용 용액의 전기 방사를 통해 일 방향으로 정렬된 나노섬유를 포함하는 나노섬유 층을 형성하고, 상기 마이크로섬유 전기방사용 용액의 전기 방사를 통해 비정렬된 마이크로섬유를 포함하는 마이크로섬유 층을 형성하는 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 섬유 구조체를 형성하는 단계에서,
    상기 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트의 다층 구조가 적층되도록 상기 나노/마이크로 하이브리드 섬유 매트를 상기 니들 표면에 감는 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 나노섬유 전기방사용 용액은 실크 피브로인(silk fibroin)을 포함하고,
    상기 마이크로섬유 전기방사용 용액은 폴리카프로락톤(polycaprolactone)을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 섬유 매트를 하이드로겔 주입 가능한 니들 표면에 감는 단계에서,
    상기 섬유 매트가 단일 또는 적층된 튜브형 또는 롤 형태를 형성하도록, 상기 섬유 매트를 상기 니들 표면에 감는 것을 특징으로 하는,
    섬유 하이드로겔 복합 스캐폴드의 제조 방법.
  10. 일 방향으로 정렬된 나노섬유를 포함하는 나노섬유 층 및 비정렬된 마이크로 섬유를 포함하는 마이크로섬유 층을 포함하고, 2 이상의 상기 나노섬유 층 및 상기 마이크로섬유 층이 교대로 반복 배치된 다층 구조를 갖는, 관형의 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체; 및
    상기 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체에 담지된, 줄기 세포 함유 하이드로겔을 포함하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 하이드로겔은,
    상기 관형의 섬유 구조체 내부에 배치된 니들과 결합된 관형의 섬유 구조체로부터 상기 니들을 제거하면서, 상기 니들을 통해 상기 줄기 세포 함유 하이드로겔을 상기 관형의 섬유 구조체의 내부 공간에 주입하여 담지된 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서,
    줄기 세포 배양 시, 상기 줄기 세포는 상기 하이드로겔로부터 상기 나노/마이크로 하이브리드 섬유 구조체의 나노섬유의 정렬 방향을 따라 증식하는 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 나노섬유는 실크 피브로인으로 형성된 실크 피브로인 나노섬유이고,
    상기 마이크로섬유는 폴리카프로락톤으로 형성된 폴리카프로락톤 마이크로섬유인 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드는 인대, 힘줄, 혈관 또는 근육 재생용 스캐폴드인 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 줄기 세포는 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, hBMMSC)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드.
  18. 제10항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 생체적합성 고분자로 형성된 하이드로겔인 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 생체적합성 고분자는 알지네이트 또는 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 칼슘에 의해 가교 결합된 것을 특징으로 하는,
    섬유/하이드로겔 복합 스캐폴드.
  21. 삭제
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