KR20080007800A

KR20080007800A - 씨디34 음성 및 씨디45 양성의 제대혈 유래 줄기세포를이용한 척수 손상 세포 치료제 조성물

Info

Publication number: KR20080007800A
Application number: KR1020060066909A
Authority: KR
Inventors: 한훈
Original assignee: 한훈
Priority date: 2006-07-18
Filing date: 2006-07-18
Publication date: 2008-01-23

Abstract

본 발명은 래트 척수 외상 동물모델과 개 척수 마비 동물모델을 이용하여 과학적 분석을 통해 척수 손상을 치료할 수 있는 CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성, 그리고 CD117 양성 인간 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 세포치료제 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 세포 치료제 조성물을 사용하면 척수 손상을 개선 및 치료할 수 있으며, 본 발명으로 인해 대체치료법이 없는 난치병 환자인 척수마비 환자들에게 새로운 희망을 안겨줄 것으로 기대된다.

척수 마비, 줄기세포, 세포 치료제, CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성, CD117 양성, 제대혈, 조직 적합성, DR 일치.

Description

씨디34 음성 및 씨디45 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 척수 손상 세포 치료제 조성물{COMPOSITION FOR CELL THERAPY OF SPINAL CORD INJURY WITH STEM CELL DERIVED FROM UMBILICAL CORD BLOOD OF CD34 NEGATIVE AND CD45 POSITIVE}

도 1은 본 발명의 세포 치료제 조성물인 CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성 제대혈 줄기세포의 특성을 나타낸 그래프,

도 2는 본 발명의 세포 치료제 조성물의 현미경 사진,

도 3은 본 발명의 세포 치료제 조성물 이식 후 래트의 BBB 점수가 향상되는 것을 보여주는 그래프,

도 4는 본 발명의 세포 치료제 조성물 이식 후 척수 손상을 받은 래트의 기능 회복 정도를 보여주는 그래프,

도 5는 본 발명의 세포 치료제 조성물 이식 후 래트의 발자국 분석 결과를 보여주는 사진 및 그래프,

도 6a 및 6b는 본 발명의 세포 치료제 조성물 이식 전후의 상처 공간을 측정한 사진 및 그래프,

도 7은 실험 견에서 척수 손상을 유발시키는 방법을 보여주는 사진,

도 8은 척수손상을 받은 개에게 본 발명의 세포 치료제 조성물을 X-선 투시기를 이용하여 비수술적인, 비감염적인 방법으로 이식하는 것을 보여주는 사진,

도 9는 본 발명의 세포 치료제 조성물을 개에게 이식한 전후의 신경학적인 검사 결과를 나타낸 그래프,

도 10a 및 10b는 본 발명의 세포 치료제 조성물을 척수손상 개에게 이식하기 전후의 운동 유발 전위의 변화를 나타낸 결과를 보여주는 도면.

본 발명은 래트 척수 외상 동물모델과 개 척수 마비 동물모델을 이용하여 과학적 분석을 통해 척수 손상을 치료할 수 있는 CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성, 그리고 CD117 양성 인간 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 세포치료제 조성물에 관한 것이다.

척수마비는 선천적이기보다 거의 대부분 후천적인 질병으로 영구적인 신체 기능의 마비를 초래한다. 현재까지 척수마비를 치료하거나 개선시킬 수 있는 치료제는 전무한 상태이며, 이로 인한 사회적 손실과 경제적인 문제는 모두 환자 본인과 가족에게 큰 부담으로 남는다. 더우기, 척수마비는 사회적 삶의 질적 향상에 따른 레저나 교통사고 등에 기인하여 주로 젊은 연령대에 발생되므로 더욱 큰 사회적인 손실을 동반한다.

외상 등으로 인해 척수 신경이 손상을 받게 되면 인체기능의 마비를 초래한다. 척수 신경 조직은 뇌와 비교할 때 단순한 구조를 갖지만, 신경 재생이 매우 어렵다는 문제가 있다. 척수 손상을 받으면 상처부위의 세포만 퇴화되는 것이 아니라 시간이 지남에 따라 주변 뉴런과 희소돌기아교세포의 서행적 세포사멸이 일어나 척수 내부의 손상 부위는 점차 넓어지며 섬유화 과정이 진행된다. 또한 신경 신호의 이동 통로인 척수 백질을 구성하는 축삭은 재생할 능력이 있으나, 재생하는 축삭이 통과해야 하는 주위 환경이 재생을 저해하는 조건을 형성하기 때문에 결국 영구적인 기능 소실을 맞이하게 된다.

척수 손상은 비가역적이고, 영구적인 신경의 결핍이 결과로써 종종 나타난다. 척수 신경의 손상 후에 즉시 발생하는 척수 신경 세포 퇴화는 물론, 장시간 후에 발생하여 신경세포 재활에 방해가 되는 반응성 신경교증(reactive gliosis)의 형성, 지연성 뉴런 및 희소돌기아교세포 사멸(delayed neuron & oligodendrocyte death)(apoptosis), 그리고 세포사멸(apoptosis)과 연계된 액손 축퇴(axonal degeneration, demyelization)가 신경세포 재생을 특별히 어렵게 하는 원인으로 작용하는 것으로 알려졌다. 즉, 척수 손상 후 괴사에 의한 즉각적인 세포사멸과 함께 서행적으로 일어나는 세포사멸(apoptosis)이 신경세포와 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)의 계속적인 사멸을 야기하여, 결국 영구적인 신체기능의 마비를 초래하게 되는 것이다.

지난 십여 년 동안 척수신경 외상 후 일어나는 병리작용에 대한 원인 규명과 재생에 관한 연구를 통하여, 척수 손상으로 인한 영구적 기능 마비를 억제하거나 완화시키려는 연구가 진행되어왔다. 특히, 척수 손상의 초기 기전은 워낙 빠르게 일어나 약물학적인 치료로 다루기 어렵기 때문에, 이차적인 기전을 다루는 약물학적 전략이 치료제 개발에서 중요한 부분이 된다. 이와 관련하여, 현재까지 스테로 이드, 항산화제, 글루타메이트 수용체 억제제, 이온 채널 억제제, 강글리오사이드(ganglioside), 축삭돌기 재생 억제제에 대한 항체, 항염증제, 신경영양인자 등 다양한 가능성 있는 약물을 이용한 치료가 시도되어왔다. 현재로서는, 이들 중 메틸프레드니솔론만이 척수 손상 후의 유일한 치료제로서 사용되고 있지만, 그 치료 효과가 불분명하고, 과량의 투여량으로 인한 부작용 등 많은 문제점을 안고 있어, 새로운 치료제 개발이 매우 절실한 실정이다.

현재, 약이나 물리치료(physiotherapy)로 척수 손상을 치료하는 것은 한계에 도달한 상태이고, 세포의 이식에 의한 치료에 초점을 맞춘 많은 실험적인 연구가 진행되고 있다. 특히 줄기세포(stem cell)는 불명확한 periods를 위해 유기체의 삶 동안 내내 분화하는(self replicate) 능력을 갖는 세포로서, 적절한 조건 또는 적절한 신호(right conditions, or right signals) 하에서, 유기체를 만드는 많은 다른 세포 타입으로 분화될 수 있는 능력이 있다. 그러나, 줄기세포에 의한 치료는 그 방법이 현재까지 확립되어 있지 않으며, 이를 이용한 치료의 부작용에 대한 자료도 부족한 실정이다.

척수 손상 후 손상부위에 분화능을 갖는 세포를 이식하는 것은, 영구적으로 소실된 신경세포를 대체하여 손상부위에 새로운 신경세포를 제공하고, 이로 인해 신경 재생을 촉진시키기 위한 치료전략으로 이용되고 있다. 줄기세포 중 가장 분화능이 뛰어나다고 알려져 있는 것은 배아 줄기세포지만, 낙태한 사생아의 조직을 사용해야 하므로 사회적, 윤리적 문제로 인해 실제 사용에는 많은 제약이 따른다. 따라서, 현재 배아 줄기세포가 아닌 다른 줄기세포 즉, 골수 줄기세포나 제대혈 줄기 세포를 이용한 치료 시도가 일부 난치병 환자들에게 사용되고 있다.

본 발명은 줄기세포 논란이 활발하게 이루어지고 있는 현 상황에서, 새로운 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 척수 손상 세포 치료제 조성물을 제공하고, 동물실험에서 이 세포 치료제의 운동기능에 대한 현저한 회복효과를 검증하고자 하였으며, 이에 따라 새로운 척수 마비 세포 치료제의 유효성 평가 방법을 제시함으로써, 향후 임상의 빠른 적용을 앞당길 수 있는 기준점을 마련하였다.

본 발명의 목적은 제대혈 유래 줄기세포를 이용하여, 근본적인 치료법이 없는 척수마비를 개선 또는 치료할 수 있는 세포치료제 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

또한, 사람에게 적용될 경우 동물과 달리 세포수의 한계를 극복하기 위하여 제대혈 조직적합성 유전자 중 DR이 적어도 1개 이상 일치하는 두 유닛의 제대혈에서 분리한 CD34 음성 줄기세포를 동물에 이식하여 안전함을 증명하는 데에 본 발명의 다른 목적이 있다.

그리고, 래트 척수 외상 동물모델과 개 척수 마비 동물모델을 이용, 과학적인 기준으로 본 발명에 따른 세포치료제 조성물의 효과와 안전성을 검증하며 척수마비 치료를 위한 유효성 평가 모델을 확립하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 척 수 마비(spinal cord injury) 치료 및 개선을 위한 세포 치료제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에 따른 세포 치료제 조성물은,

출산 24시간 이내의 순수 제대혈로, 1 유닛(unit) 당 부피가 45 ㎖ 이상인 CD34 음성 제대혈에 항응고제를 가하고;

항응고제가 혼합된 제대혈을 저-포도당 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Media) 배지로 희석하고 원심분리하여 단핵구를 수확하고; 그리고,

얻어진 단핵구를 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함된 저-포도당 DMEM 배지에 20 일 동안 배양하여 얻어진 CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 세포 치료제 조성물은,

냉동보관된 제대혈을 해동하여 저-포도당 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Media) 배지로 희석하고 원심분리하여 단핵구를 수확하고; 그리고,

또한, 본 발명에 따른 세포 치료제 조성물은,

냉동보관된 제대혈에서 조직적합성 유전자 A, B, DR 검사를 미리 시행하고;

조직적합성 유전자가 적어도 DR이 1 개 이상 일치하는 제대혈 두 유닛 이상에서 각각 해동하여 저-포도당 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Media) 배지로 각각 희석하고 원심분리하여 단핵구를 수확하고;

얻어진 단핵구를 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함된 저-포도당 DMEM 배지에 각각 20 일 동안 배양하여 얻어진 두 유닛 이상의 CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함한다.

본 발명의 세포 치료제 조성물은 제대혈 유래 줄기세포만으로 한정되는 것이 아니며, 골수 및 각종 장기(지방 등 모든 인체 장기)를 포함하는 것이 바람직하다.

제대혈 안에 대표적으로 존재하는 줄기세포는 조혈모세포(CD34 양성, CD45 양성)와 중간엽 줄기세포(CD34 음성, CD45 음성)로 알려져 있다. 그러나, 본 발명의 줄기세포를 이용한 세포치료제 조성물은 CD34 음성, CD45 양성으로 기존의 줄기세포와 다른 특성을 갖고 있으며, 본 발명에 따른 유효성 평가 방법인 래트와 개의 동물모델에서 척수마비에 대하여 유의적인 효과가 있음이 증명 및 확인되었다. 제대혈 줄기세포는 다른 배아 줄기세포처럼 인체 내에 기형종이나 기형암을 발생시킬 가능성이 없다는 장점이 있으므로, 대중화 요법에 유리하다.

척수마비는 후천적인 원인이 대부분으로, 사람과 가장 유사한 질병 형태를 갖는 동물모델로서만 세포 치료제를 정확히 평가할 수 있다. 본 발명에 따른 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 세포 치료제는, 기본적으로 사람에게서 조직적합성 유전자가 일치하는 제대혈을 사용한다. 즉, 본 발명에서는 동물에게서 사용되는 2 유닛 이상의 줄기세포를 사용할 경우, 각각의 줄기세포의 면역 반응을 피하기 위해 제대혈의 조직적합성 유전자 중 DR이 1 개 이상 일치하는 제대혈을 사용하여 분리한 각각의 최대량의 줄기세포를 개에게 이식하여 안전성을 시험해 보았다. 그 결 과, DR이 1 개 이상 일치하는 줄기세포를 사용하였을 경우 어떠한 부작용의 소견도 보이지 않았으며, 극대량의 세포수로 인한 어떠한 쇼크 반응도 보이지 않았다. 그러므로, 사람에 있어서도 조직적합성 유전자 중 DR이 적어도 1 개 이상 일치하는 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다.

제대혈로부터 얻어지는 척수마비 치료 및 개선용 세포 치료제 조성물을 사람에게 적용하기 위해서는, 척수마비를 치료할 수 있는 적절한 기준의 생체 내 능력을 검증할 필요가 있다. 본 발명에서는, 인간에서 발생하는 척수신경 손상과 유사한 동물 외상 모델을 래트에 도입하여 뒷다리의 마비를 유도한 후, 세포 치료제가 뒷다리 기능의 회복을 현저하게 향상시키는 것을 다양한 운동기능 측정 지표를 사용하여 확인하였다. 또한, 이러한 세포 치료제를 사람에게 유용하게 사용하기 위해서는 래트보다 더 고등화된 동물을 사용하여 검증하는 것이 바람직하며, 본 발명에서는 개를 이용하여 척수마비 세포치료제의 효능을 검색하였다. 즉, 사람과 유사한 척수마비 모델을 구현하기 위해서는 래트나 마우스 보다 더 고등화되고 개체가 큰 척추동물들이 요구되고, 이 점이 유효성 평가시 더 유리하게 작용될 수 있다.

이를 구체적으로 살펴보면, 래트의 경우 성체 수컷 래트의 척수 T8-T10 부분에 10 g 무게의 추를 일정 높이에서 떨어뜨려 인간 척수 손상과 유사한 외상을 주고, 외상 이후 10 일째에 본 발명에 따른 제대혈 유래 줄기세포(2x10⁵ 세포/래트) 및 대조군으로서 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media)을 상처 부위에 주입한다. 척수 외상으로 인해 마비된 래트의 뒷다리 운동기능의 회복 정도를 알아보기 플라 스틱 오픈 필드 상자에 래트를 올려놓고 상자 안에서 자유롭게 돌아다니도록 유도하여 쥐의 자유 운동 기능을 측정하는 BBB 테스트를 도입하였다. 그 결과, 척수 신경 외상 이후 30 일, 즉 제대혈 유래 줄기세포를 이식한지 20 일이 지난 후부터, 이를 이식한 그룹에서 배지만 넣어준 래트에 비해 현저한 뒷다리 운동기능의 향상을 확인할 수 있었다.

척수 손상을 받은 래트의 운동기능 회복 정도를 좀 더 세밀하게 관찰하기 위하여 앞다리와 뒷다리가 리듬 있게 교차하는 능력과 정확하게 뒷발을 디딜 수 있는지 여부를 그리드워크 테스트의 도입을 통하여 평가한다. 1 m 길이의 금속 격자판에 쥐를 통과하게 하여 발이 격자 아래로 떨어지는 빈도를 퍼센트(%)로 나타내어 분석하는 이 테스트를 통해, 제대혈 줄기세포 이식 그룹이 배지만 이식한 대조군 그룹에 비해 더 정확하게 뒷발을 디디고, 리듬감 있게 걸을 수 있는 능력이 높다는 결과를 얻었다.

또한, 발바닥에 잉크를 묻혀, 발걸음의 패턴 분석 및 발자국 모양을 통한 발걸음의 정확도 등을 좀더 세밀하게 분석할 수 있는 발자국 분석 방법을 도입하였으며, 외상 이후 뒷발을 끄는 빈도와 정도에 있어서 본 발명의 제대혈 유래 줄기세포가 주입된 래트가 훨씬 향상된 것을 확인할 수 있었다.

이러한 뒷다리 운동기능의 회복에 있어서 본 발명의 제대혈 유래 줄기세포의 효과를 직접적으로 확인하기 위해, 외상 6 주째에 래트의 척수 조직을 절편하고 크레실 바이올렛으로 염색하여 손상 이후 세포사멸에 의해 발생되는 상처 공간의 크기를 분석하였다. 그 결과, 배지만 주입한 대조군에 비해 본 발명에 따른 제대혈 유래 줄기세포의 주입에 의해 상처 공간의 크기를 상당히 줄일 수 있음을 확인하였다.

사람과 유사한 척수 마비 모델인 개를 이용하여, 본 발명에 따른 제대혈 유래 줄기세포의 척수마비에 대한 효과를 검증하고자 하였으며, 여기에 15 마리의 정상적인 수컷 비글견이 사용되었다. 척수 손상은 Purdy et al(Philip D. Purdy et al, 2004, AJNR 25: 1435∼1442쪽; Philip D. Purdy et al, 2003, AJNR 24: 177∼184쪽)에 보고된 혈관성형 풍선 도관(angioplasty balloon catheter)를 이용한 방법을 변형하여 실시하였다. 풍선의 압축(compression) 시간은 30 분(n=3)과 1 시간(n=12)으로 두 그룹으로 나누었으며, 줄기세포는 총 척수 손상이 유발된 9 마리의 개에서 SCI 이후 7 일째에 직접 척수 내로 이식하였으며, 1 유닛(30 분, n=1; 1 ㅅ시간, n=4) 또는 2 유닛(30 분, n=2; 1 시간, n=2)를 이식하였다.

SCI 후 8 주 동안 생존한 음성 대조군(SCI 60 분, n=4)에는 BBB score 가 "0"에서 회복되지 않았으며, 통각 반응(deep pain, nociception reflux)의 완전한 소실을 보였다. 여기에서 중요한 것은, 줄기세포를 이식하지 않은 군에서는 절대로 BBB 스코어가 1 이상으로 회복되면 안된다는 것이고, 적어도 척수 마비를 평가하기 위해서는 척수 마비 압축(compression) 시간을 적어도 30분 이상을 주어야 완벽한 척수마비를 유도할 수 있다.

CD34 음성 제대혈 줄기세포를 이식하고 8주 동안 생존한 개체 7마리 중 3마리(SCI 30 분 & 2 유닛, n=1; SCI 60 분 & 1 유닛, n=2)에서, 이식 후 1주일 이후부터 BBB 스코어 상승을 보였으며, 8주차에 18∼19로 기록되었다. 한 마리에서 BBB 스코어는 8주까지 "2"만 상승하였으나, 줄기세포 이식 후 5일부터 통각반응을 회복하였다. 나머지 3마리(SCI 30 분 & 2 유닛, n=1; SCI 1 시간 & 1 유닛, n=2)은 BBB 스코어가 "0"으로 8주 동안 지속 유지되었으며, 통각 반응도 지속적으로 소실되었다.

여기에서 중요한 것은, 개에게는 제대혈 1 유닛으로도 세포수가 충분하지만 사람에게 적용하기 위해서는 더 많은 세포수가 요구된다는 것으로, 1 유닛 세포를 준 군과 2 유닛을 주는 군을 설정하여 안전성 여부를 시험하도록 하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 래트의 척수 신경 외상

척수 외상 동물 모델로서, 10 g 무게의 추를 일정 높이에서 떨어뜨려 인간 척수 손상과 유사한 외상을 주고, 외상 강도를 컴퓨터에서 수치화할 수 있게 고안된 NYU 충격기(NYU impactor)를 사용하였다. 성체 수컷 래트(230∼250 g)에 클로랄하이드레이트(500 ㎎/㎏)를 복강 주입하여 마취한 후 척수 T8-T10 부분을 노출시켰다. NYU 충격기의 클램프에 래트를 고정시킨 다음, 25 ㎜ 높이에서 10 g의 추를 자유낙하시켜 척수 T9 부위에 손상을 주었다. 컴퓨터에 나타나는 손상 강도에 대한 데이터를 통하여 정해진 오차 범위 내에 일정한 손상이 가해진 것을 확인한 후 상처부위를 봉합하였다. 상처부위를 포비딘 액으로 소독한 후 2 마리씩 케이지에 넣어 사육하였고, 하루 3 회 인위적으로 방광을 마사지하여 배뇨를 도왔다.

실시예 2. 래트에 사람 CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포의 세포이식

도 1은 본 발명의 세포 치료제 조성물인 CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성 제대혈 줄기세포의 특성을 나타낸 그래프이고, 도 2는 본 발명의 세포 치료제 조성물의 현미경 사진이다.

척수신경 외상을 준 후 10 일째 되는 래트에 클로랄하이드레이트(500 ㎎/㎏)를 복강 주입하여 마취시킨 후 수술 부위를 노출시키고, 스테레오텍식(Kopf Model 5000, Tujunga, Califonia)에 고정하였다. CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포(2x10⁵ 세포/래트)와, 대조군으로서 세포배양에 사용되었던 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신(v/v)을 첨가한 것이 투여되었다. 직경이 약 100 ㎛ 되는 유리 마이크로파이펫에 자동투여기를 이용하여, 세포 및 배지 5 ㎕에 해당되는 양을 5분 동안 상처부위에 바로 주입하였다. 주입이 끝난 후 다시 순서대로 봉합하고 포비딘 액으로 소독처리한 후, 다시 2 마리씩 케이지에 넣어, 50% 습도, 20∼23 ℃ 온도가 유지되는 환경에서 사육하였다.

실시예 3. 래트의 비비비 오픈필드 스코어(BBB open field score)

척수 외상으로 인해 마비된 래트의 뒷다리 운동기능의 회복 정도를 알아보기 위해 척수 외상 모델에서 일반적으로 사용하고 있는 BBB 테스트를 도입하였다. BBB 테스트는 0부터 21까지 점수를 나누어 뒷다리를 전혀 사용하지 못하는 경우 0점, 정상 래트의 경우 21점을 주어, 점수가 높아질수록 운동기능이 향상되는 것을 나타낸다.

척수 외상을 주기 3 일 전부터 하루에 한번, 한 마리당 4 분씩 가로 90㎝ x 세로 90㎝ x 높이 7㎝의 플라스틱 오픈 필드 상자에 래트를 올려놓고 상자 안에서 자유롭게 돌아다니도록 하여 실험 환경에 대한 사전 적응 훈련을 실시하였다. 척수 외상을 준 후 1 일부터 일주일에 2 회씩 5 명의 훈련된 실험자들이 각 래트의 뒷다리 움직임을 관찰하여 BBB 점수를 매기고, 이들 5명의 BBB 점수의 평균값을 해당 쥐의 최종 BBB 점수로 결정하였다. 동물실험에 대한 개인의 편견을 배제하기 위하여 테스트에 임하는 실험자들은 각 래트에 대한 정보를 알지 못하게 하였고, 각 쥐에 대해 4 분씩 관찰하여 점수를 내었다.

척수 외상을 받은 모든 래트는 뒷다리의 움직임이 전혀 없이 앞다리에 의존하여 하반신을 끄는 현상을 보였다. 척수 외상 후 3주까지는 CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포를 이식한 래트와 배지만 이식한 래트의 BBB 점수가 거의 비슷하였지만, 척수 외상 후 30 일, 즉 CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포 세포를 이식한지 20 일이 지난 후 BBB 점수를 확인한 결과, 대조군인 배지만 넣어준 래트의 BBB 점수는 10.3±0.2점으로 대부분 걸을 때 발등을 이용하여 걸으며 간헐적으로 발 바닥을 땅에 디딜 수 있는 정도의 회복을 나타낸 반면, CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포를 이식한 그룹의 BBB 점수는 11.8±0.23점으로 지속적으로 발바닥으로 몸을 지탱하여 걷고, 걷는 동안에 대략 50%의 빈도로 앞다리와 뒷다리가 리듬 있게 교차하게 되는 회복 수준을 보여, 대조군과 비교했을 때 약 1.5 점이 높게 나타났다.

도 3은 본 발명의 세포 치료제 조성물 이식 후 래트의 BBB 점수가 향상되는 것을 보여주는 그래프이다. 여기에서 보듯이, CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포를 이식하는 시점에서 상대적으로 CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포 그룹의 BBB 평균 점수가 대조군보다 낮았음에도 불구하고 이식 후 20일이 지난 시점에서는 대조군보다 높은 점수를 보였다. 이러한 결과는 이식된 CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포로 인해 척수 외상 후 뒷다리 운동기능 회복이 증진되었음을 시사한다. 도 3에서 ** 는 0.05% 오차범위 이내임을 의미한다.

실시예 4. 래트의 그리드 워크 테스트(grid walk test)

척수 손상 받은 래트의 운동기능 회복 정도를 좀 더 세밀하게 관찰하기 위하여 앞다리와 뒷다리가 리듬 있게 교차하는 능력과 정확하게 뒷발을 디딜 수 있는지를 평가하였다. 평가의 기준으로는 1 m 길이의 금속 격자 판에 쥐를 통과하게 하여 발이 격자 아래로 떨어지는 빈도를 퍼센트(%)로 나타내었다.

테스트 시작하기 5 일 전부터 1 m의 금속 격자를 각 래트당 하루 3 회씩 지나가게 함으로써 실험 환경에 적응하도록 하였고, CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포를 이식한지 30 일째에 테스트를 실시하였다. 금속 격자판에 래트를 통과시키는데, 중간에 멈추는 것은 무효로 하고 자발적으로 쉬지 않고 끝까지 지나가는 경우만 인정하여 래트 한 마리당 3회 격자를 통과하게 하였다. 쥐의 움직임은 비디오 카메라로 녹화하여 각 래트가 어느 그룹에 속하는지 알지 못하는 2명의 실험자가 실험 결과를 분석하였다. 실험 결과는 래트가 걸은 총 걸음 수 중에서 격자 아래로 뒷발이 빠진 걸음 수가 차지하는 비율을 퍼센트(%)로 나타내어, CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포 이식 그룹과 대조군 배지 이식 그룹의 평균값을 비교하였다.

도 4는 본 발명의 세포 치료제 조성물 이식 후 척수 손상을 받은 래트의 기능 회복 정도를 보여주는 그래프이다. 도 4에서 보는 바와 같이, 배지만 이식한 그룹 의 래트는 평균 33%의 에러율을 보였고, CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포 이식 그룹의 래트는 평균 25%의 에러율을 보여, CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포 이식 그룹이 더 정확하게 뒷발을 디디고, 리듬감 있게 걸을 수 있는 능력이 높다는 결과를 얻었다. ** 는 0.05% 오차범위 이내임을 의미한다.

실시예 5. 발자국분석(foot print analysis)

CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포 이식 후 5 주, 및 6 주째에 각 그룹의 대표적인 래트 3 마리씩을 선별하여 발자국 분석을 실시하였다. 테스트 시작하기 5일 전부터 하루에 한 차례씩 좁은 통로를 지나가게 함으로써 실험 환경에 적응하도록 하였다. 래트의 앞다리에는 적색 잉크를 묻히고, 뒷다리는 청색 또는 흑색 잉크를 묻혔으며, 하얀 종이가 바닥에 깔리고 내부가 어두운 좁은 통로(1 m 길이, 7 ㎝ 너비)로 지나가게 하면서 발자국을 내게 하였다. 만일 래트가 5 초 이내에 통로를 통과하지 못하거나 중간에 멈추면 그 때의 결과는 분석에서 제외하였으며, 한 동물당 8번의 테스트를 수행하였다. 흰 종이에 찍힌 뒷발의 발자국 모양과, 뒷발이 질질 끌린 횟수, 끌린 길이, 앞발과의 조화, 간격, 뒷발의 회전 정도 및 뒷발 사이의 보폭, 양발 사이의 간격 등이 뒷다리의 기능을 측정하는 지표로서 사용되었다.

도 5는 본 발명의 세포 치료제 조성물 이식 후 래트의 발자국 분석 결과를 보여주는 그림 및 그래프이다. 일반적으로 척수신경 외상 이후, 래트는 뒷다리가 마비되어 뒷발을 바닥에 대며 제대로 걸음을 걷지 못하고, 발을 그저 질질 끌고 다니게 된다. 이후 설치류에 해당되는 래트는 다른 개체에 비해 어느 정도 자발적인 회복을 하여, 25 ㎝·g의 상처 이후 발등으로 걸으며 간헐적으로 발바닥을 딛는 정도 까지 회복되는데, CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포가 주입된 래트는 이 회복 정도가 훨씬 향상되는 것을 발자국 모양을 통해서 알 수 있다. 정량적인 분석 결과, 뒷발 끌림 빈도를 나타내는 풋 프린트 테스트와 뒷발 끌림 길이를 자로 재어 분석한 결과, CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포가 주입된 래트에서 현저한 향상을 나타낸 것을 볼 수 있다. 풋 프린트 테스트의 경우, 값 1은 모든 걸음에서 뒷발 끌림 현상을 나타내었다는 의미이며, 0의 경우 한번도 끌지 않았다는 의미이다. 대조군의 경우 92 %의 발끌림 현상을 나타낸 반면, CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포를 이식한 경우에서는 67% 정도의 발끌림 현상을 나타내었다. 또한 발을 끄는 길이를 재어 보았을 때도, CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포를 이식한 래트는 오른발과 왼발을 각각 비교하였을 때 모두 끌림 길이가 줄었음을 확인할 수 있다(CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포는 오른발 4.2±0.8, 왼발 4.8±0.95; 대조군은 오른발 8.8±1.44, 왼발 8.9±1.59). ** 는 0.05% 오차범위 이내임을 의미한다.

실시예 6. 래트의 CD34 음성 줄기세포 치료 전후의 상처공간 측정

CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포 이식 이후 6주 째에, 샌트럴 커넬을 지나가는 연속적인 4장의 척수조직(10 ㎛)을 척수신경 외상 이후 세포사멸에 의해 발생되는 상처공간의 크기 측정을 위한 크레슬 바이올렛 염색에 사용하였다. 1.25 배율의 대물렌즈를 이용하여 사진을 찍었고, 현미경에 부착된 카메라 및 연결된 소프트웨어인 메타모프 프로그램을 이용하여 구멍 크기를 측정하였다.

도 6a 및 6b는 본 발명의 세포 치료제 조성물 이식 전후의 상처 공간을 측정한 사진 및 그래프이다. 염색 이후 현미경 상에서 관찰한 결과, CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포의 주입에 의해 6주 이후의 상처구멍 정도가 배지 대조군에 비해 상당히 줄어있음을 확인할 수 있었다. 정량적인 측정 결과, 대조군의 경우 상처공간이 1.63±0.15 ㎟인데 반하여, CD34 음성 제대혈 유래 줄기세포 이식의 경우에는 1.06±0.11 ㎟로 상처공간이 현저하게 감소되었음을 알 수 있다. ** 는 0.05% 오차범위 이내임을 의미한다.

실시예 7. 사람의 척수 손상과 유사한 개의 척수 손상 유발

실험 견(비글견)들은 척수 손상 유발 시술 12 시간 전부터 절식시켰다. 마취는 기관튜브(Endotracheal Tube, Rusch Inc., USA)를 사용하여 전신 마취하였다. 호흡 회로는 용적조절 인공호흡기가 부착된 흡입 마취기(Delta-88X, Royal medical Co., Ltd., Korea)의 기화기를 사용하였다. 마취 도입에 Propofol(Hana Pharam Co. Ltd., Korea)를 6 ㎎/㎏ 정맥주사하고, 이소플루란(isoflurane, Rhodia Orgranique Fine Ltd., Korea)을 압박 손상 전까지는 1.5 % 농도로 유지하다가, 압박 손상을 주기 직전부터 손상 동안 2.5 %로 유지하였다.

전신 마취 후에, 실험 견을 우측 횡와위 자세로 보정한 후, X-선 투시기(Mobile C-ARM system, MCA-6100, MedisonXray Co., Ltd., Korea) 유도 하에서 Tuohy type spinal needle(Perifix® Soft 500 Filer Set, G18x3¼, B. Braun Melsungen AG)을, 7 번째 요추와 천추 사이 공간으로 접근하여 척추강 내로 투입하였다. 여기에 유도철사(guide wire, Size 5Fr; Check Flo® Preformer® Introducer set, Cook®, USA)를 spinal needle을 통해서 척수강 내에 경막외층(epidural space)으로 넣었다. 그리고 나서 유도철사는 남겨놓고, Thohy type spinal needle을 제거하였다. 남아 있는 유도 철사를 이용하여 유도관 (introducer, Size 5Fr; Check Flo® Preformer® Introducer set, Cook®, USA)을 넣었다. 그 후 유도 철사를 제거한 다음, 혈관성형 풍선 도관(Angioplasty balloon catheter; Size 5F, Arterial Embolectomy Catheters, Edwards Lifesciences LLC, USA)를 척수강 내의 경막 외층으로 삽입하였다. 혈관성형 풍선 도관의 풍선(balloon)은 생리식염수와 조영제(Omnipaque, Amersham Health, Cork, Ireland)를 1:1로 섞어서 부풀렸으며, X-선 투시기 유도 하에 척수 손상을 주고자 하는 부위인 요추 2번과 3번 사이에 위치시켰다. 풍선은 0.7∼0.8 ㎖의 부피를 주었고, 풍선을 부풀린 후 30 분(n=3) 또는 60 분(n=12) 후에 제거하였다.

도 7은 실험 견에서 척수 손상을 유발시키는 방법을 보여주는 사진으로, 좌측 상단은 조영제와 생리식염수를 1:1로 섞어서 0.8 ㎖를 채워 넣은 혈관성형 풍선 도관의 외형을 보여주는 것이고, 우측 상단은 경막외 바늘(epidural needle)을 요천추 공간으로 삽입하여 척수강에 접근한 투시기 영상, 좌측 하단은 경막외 바늘(epidural needle) 제거 후, 유도 철사가 척수강 안으로 들어가 있는 투시기 영상, 그리고 우측 하단은 L2∼L3 사이에서 혈관성형 풍선 도관을 0.8 ㎖의 조영제(half-strength)로 부풀려, 척수를 압박하고 있는 투시기 영상이다.

수술 후 통증 관리를 위해서, Medetomine 5 ㎍/㎏(Domitor, Orion Pharma, Finland)와 Bupivacaine 0.5 ㎎/㎏(MyungMoon Pharm. Co., Ltd., Korea)을 경막외 주사하였고, Buprenorphine 10 ㎍/㎏(Renolphan, Hanlim Pharm. Co., Ltd., Korea)을 근육주사 하였다.

실시예 8. 척수 손상 유발 후 관리(Post-procedure (SCI) care)

배뇨 곤란을 치료하기 위하여, 압박 배뇨를 하루 두 번 12 시간 간격으로 실시하였고, 항생제로 세팔렉신(Cephalexin)을 30 ㎎/㎏(Il-Dong Pharm. Co., Ltd., Korea)의 용량으로 하루 두 번 경구투여 하였다. 욕창을 방지하기 위해서 Soft bad와, Sling을 실시하였다.

실시예 9. 자기 공명 영상 검사(Magnetic resonance imaging evaluation)

척수손상을 확인하기 위해서, 척수손상 후 3 일째 되는 날 자기 공명 영상 검사(MRI)를 실시하였다. 3-T MR imaging system(Oxford instruments, Oxford)가 사용되었으며, 검사를 위한 마취로는 Acepromazine(Sedaject® Sam-Woo-median Co., Ltd., Korea)을 6 ㎎/㎏의 용량으로 근육주사 하고, 10 분 후에 Medetomidine 을 10 ㎍/㎏의 용량으로 근육주사 하였다. 그 후 펜토바르비탈(Pentobarbital, Entobar®, Hanlim Pharm. Co., Ltd., Korea)을 8 ㎎/㎏ 용량으로 정맥주사 하였다.

검사를 위해, 실험 견을 복와위로 위치시키고, 척수 부위에 영상을 T1 강조 영상(500/13 [TR/TE]; section thickness 4 ㎜)과 T2 강조 영상(4000/96 [TR/TE]; section thickness 4 ㎜)을 획득하였다.

실시예 10. CD34 음성 제대혈 줄기세포의 이식(Human umbilical cord blood stem cell transplantation)

줄기세포의 주사는 척수 손상을 유발하고 7 일째에 실시하였다. 마취는 Profopol을 6 ㎎/㎏의 용량으로 정맥주사 하여 유도하였으며, Isoflurane의 농도는 1.5 %로 유지하여 전신 호흡마취를 실시하였다.

줄기세포의 이식은 X-선 투시기 유도 하에, 척수바늘(Spinal needle, 23G)을 척수 내의 복측에 위치시킨 후, 혈관 조영제(Iohexol)에 의해 척수 내로 들어간 바늘을 확인하였고, 요추 척수 손상 부위 앞(요추 1번과 2번 사이), 손상 부위(요추 2번과 3번 사이), 손상 부위 뒤(요추 3번과 4번 사이)로 3 군데로 나누어서 주입하였다.

제대혈 줄기세포는 1 유닛을 사용한 군과 2 유닛을 사용한 군으로 각각 나누었다. CD34 음성 2 유닛 줄기세포는 냉동 보관된 제대혈에서 미리 조직적합성 유전자를 판독한 세포에서 적어도 DR이 한 개 이상 일치하는 냉동 제대혈에서 분리된 CD34 음성 줄기세포를 사용하였다.

줄기세포 1 유닛(1x10⁶)을 생리식염수에 섞어 300 ㎕의 부피로 만들고, 척수 손상을 유발한 개 중 9 마리에 대하여 척수 내에 직접 1 유닛(300 ㎕) 또는 2 유닛(600 ㎕)을 주입하였다. 세포의 이식 부위는 3곳으로 나누어 손상 부위의 앞(요추 1번과 2번 사이), 손상부위의 뒤(요추 3번과 4번 사이)와 손상 부위(요추 2번과 3번 사이)에 이식하였다. 2 유닛을 이식할 경우 손상 전후에 각 200 ㎕ 이식 후, 손상 부위에서 다른 유닛의 세포를 100 ㎕씩 나누어 두 차례에 걸쳐 다른 주사기로 주입하였다. 세포 주입 시에는 100 ㎕ 당 1 분에 걸쳐서 이식하였으며, 이식이 끝나고 나서, 3 분 동안 바늘을 고정시켜 놓았다가 제거하였다.

표 1은 척수마비 개의 모델에서 척수마비 유발 시간, CD34 음성 제대혈 줄 기세포 유닛 수, 개의 무게, 그리고 풍선 용적을 나타낸 표이다.

모델 번호	SCI 시간 (분)	제대혈 줄기세포 유닛 수	BW (㎏)	풍선 용적 (ml)
1	30	1	7.30	0.80
2	30	2	7.20	0.70
3	30	2	8.90	0.80
4	60	1	11.20	0.80
5	60	1	10.90	0.80
6	60	1	8.50	0.80
7	60	1	10.50	0.80
8	60	2	9.90	0.80
9	60	ND*	9.80	0.70
10	60	2	9.80	0.70
11	60	ND	7.80	0.70
12	60	ND	9.90	0.80
13	60	ND	7.80	0.80
14	60	ND	9.00	0.80
15	60	ND	9.50	0.80

*ND: 줄기세포를 주입하지 않은 대조군

줄기세포 유닛수에 따른 개의 안전성 평가

위 표 1에서, 척수 마비에 효과가 있는 3, 4 및 7번 개의 경우 3번은 제대혈 줄기세포 2 유닛을 이식한 경우이며, 4 및 7번은 모두 제대혈 줄기세포 1 유닛을 이식한 결과이다. 2 유닛을 이식한 경우는 개에게 있어서 최대량의 세포 수를 실험한 경우로, 최대량의 세포 수가 개에게 이식되어 어떠한 면역거부 반응이나 쇼크의 반응도 없이 생존한 것을 볼 수 있다. 이에 따라, 사람에서도 줄기세포를 2 유닛 이상 사용할 경우, 적어도 조직적합성 유전자 중 DR이 1 개 이상 일치하는 제대혈을 사용하는 것이 바람직하며, 안전함을 확인할 수 있다.

실시예 11. 신경학적 평가(Neurological evaluation)

척수 손상 유발과 CD34 음성 제대혈 줄기세포 이식 이후 운동성을 평가하기 위해서, Basso, Beattie, and Bresnahan(BBB) locomotor rating scale을 사용하였다. Video record로 촬영하였으며, 척수 손상 유발 후 1일, 7일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일 및 48일에 BBB 스코어와 deep pain(Nociception reflex, 통각 반사)에 대하여 평가하였다. 기록은 두 명의 연구자가 보행과 통증에 대하여 평가하였다.

신경학적 평가 (Neurological evaluation) 결과

척수 손상 유발 후 모든 개체에서 통증 반응(nociception reflex)의 완전 소실과 완전한 후지 마비가 유발되었다.

CD34 음성 제대혈 줄기세포를 이식하지 않은 개체는 6 마리이며, 모두 한 시간 동안 척수 압박을 주었는데, 생존한 4마리에서 BBB 스코어의 회복이나 통증 반응의 회복이 전혀 이루어지지 않았다.

한편, CD34 음성 제대혈 줄기세포를 이식한 9 마리 중에서 2 마리가 각각 23일째, 30일째 폐사하였고, CD34 음성 제대혈 줄기세포를 이식한 나머지 7 마리 중 척수 손상 30 분에 2 유닛(SCI 30 분 & 2 유닛)을 이식한 한 마리(3 번)와, 척수 손상 한 시간에 1 유닛(SCI 60 분 & 1 유닛)을 이식한 두 마리(4번 및 7번)에서 이식 후 7 일째 검사부터 운동신경의 회복을 보였으며, 8 주까지 BBB 스코어가 18∼19까지 상승하였다. 운동의 회복이 있는 세 마리의 개에서 두 마리(3번 및 4번)가 SCI 후 5 주차(세포이식 후 4주)부터, 한 마리(7번)가 SCI 후 8 주차(세포 이식 후 7주)부터, deep pain reflex(nociception reflex)을 보였다.

한 마리(2번)의 개의 경우 이식 후 감각에서 1 주차(5 일째부터)에 반응을 보였으나, 운동성은 거의 증가하지 않았다. 8 주까지 2개 관절의 경미한 움직임(BBB 스코어: 2)을 지속적으로 보였다.

도 8은 척수손상을 받은 개에게 본 발명의 세포 치료제 조성물을 X-선 투시기를 이용하여 비수술적인, 비감염적인 방법으로 이식하는 것을 보여주는 사진으로, 좌측은 척수 바늘(spinal needle)을 통해서 줄기세포를 이식하는 것, 우측은 L1∼L2 부위에서 척수바늘이 척수 내에 있음을 확인하기 위해 투시기 상에서 조영제를 투여하는 것을 보여준다.

도 9는 본 발명의 세포 치료제 조성물을 개에게 이식한 전후의 신경학적인 검사 결과를 나타낸 그래프이다. 1주차 기록 후 CD34 음성 제대혈 줄기세포를 이식하였으며, 2번, 5번 및 10번 개에서는 8주까지 BBB 스코어의 회복이 없었으며, 6번 개에서는 줄기세포 이식 후 5일부터, deep pain에 대한 반응이 있고, 5주까지 BBB 스코어가 "1"로 유지되다가 6주부터 "2"를 기록하였다. 줄기세포 이식 후 반응이 있는 개는 3번, 4번 및 7번이고, SCI 후 2주(세포 이식 1주)부터 지속적으로 증가한 것을 볼 수 있다.

도 10a 및 10b는 본 발명의 세포 치료제 조성물을 척수손상 개에게 이식하기 전후의 운동 유발 전위의 변화를 나타낸 결과로, 도 10a는 척수 손상만 시행한 대조군, 도 10b는 척수 손상 후 CD34 음성 제대혈 줄기세포를 이식한 실험군의 결과이다. 여기에서 보면, 대조군에서는 상지 유발전위가 우 11.7 msec, 좌 13.9 msec이고, 하지 유발전위는 좌, 우 모두에서 관찰되지 않았다. 그리고 실험군에서는 상지 유발전위가 우 12.0 msec, 좌 11.3 msec, 하지 유발전위가 우 24.4 msec, 좌 23.4 msec였다.

이상의 결과에서 보듯이, 본 발명에 따른 CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 조성물을 척수 손상 받은 래트에 이식하였을 때, 외상으로 인해 기능을 잃고 마비된 뒷다리의 운동 능력 회복을 현저히 향상시켰다. 또한, 척수 손상 이후 생기는 척수 내부 빈 공간의 크기를 줄여 신경의 퇴화를 막고, 재생의 가능성을 증진시켰다.

그리고, 사람과 유사한 척수마비 모델인 개의 모델을 이용하여 본 발명의 세포 치료제 조성물을 투여한 경우, 보행 및 뛰어다닐 수 있을 정도로 기능을 향상시켰다.

또한, 개에게 사람의 조직적합성 유전자 DR이 한 개 이상 일치하는 줄기세포를 사용하여 안전함을 증명함으로써, 사람에서 줄기세포의 세포 수의 한계를 극복할 수 있는 귀중한 결과를 제공하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 조성물의 척수 신경 외상에서의 치료 효과를 객관적이고 과학적인 방법으로 증명함으로써, 척수 손상에 대한 임상 치료제로서의 가능성을 제시하였다. 따라서, 본 발명의 세포 치료제 조성물을 사용하면 척수 손상을 개선 및 치료할 수 있으며, 본 발명으로 인해 대체치료법이 없는 난치병 환자인 척수마비 환자들에게 새로운 희망을 안겨줄 것으로 기대된다. 또한 본 발명은 세포치료제라는 새로운 분 야에서 그 효과를 측정할 수 있는 새로운 유효성 방법을 제시함으로 척수마비 세포치료제의 역할과 의학적 발전을 도모할 수 있다.

Claims

CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 척수 마비(spinal cord injury) 치료 및 개선을 위한 세포 치료제 조성물.
출산 24시간 이내의 순수 제대혈로, 1 유닛(unit) 당 부피가 45 ㎖ 이상인 CD34 음성 제대혈에 항응고제를 가하고;

항응고제가 혼합된 제대혈을 저-포도당 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Media) 배지로 희석하고 원심분리하여 단핵구를 수확하고; 그리고,

얻어진 단핵구를 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함된 저-포도당 DMEM 배지에 20 일 동안 배양하여 얻어진 CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 조성물.
냉동보관된 제대혈을 해동하여 저-포도당 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Media) 배지로 희석하고 원심분리하여 단핵구를 수확하고; 그리고,

얻어진 단핵구를 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함된 저-포도당 DMEM 배지에 20 일 동안 배양하여 얻어진 CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 조성물.
냉동보관된 제대혈에서 조직적합성 유전자 A, B, DR 검사를 미리 시행하고;

조직적합성 유전자가 적어도 DR이 1 개 이상 일치하는 제대혈 두 유닛 이상에서 각각 해동하여 저-포도당 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Media) 배지로 각각 희석하고 원심분리하여 단핵구를 수확하고;

얻어진 단핵구를 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함된 저-포도당 DMEM 배지에 각각 20 일 동안 배양하여 얻어진 두 유닛 이상의 CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 조성물.
래트에서의 척수신경 외상 이후, 이식에 따른 비비비 오픈 필드 스코어에서 뒷다리 운동기능의 향상을 유도하는, CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 조성물.
래트에서의 척수신경 외상 이후, 이식에 따른 그리드 워크 테스트에서 뒷다리 운동기능의 향상을 유도하는, CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 조성물.
래트에서의 척수신경 외상 이후, 이식에 따른 발자국 분석에서 뒷다리 운동기능의 향상을 유도하는, CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 조성물.
래트에서의 척수신경 외상 이후, 상처공간 감소 효과가 있는, CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 조성물.
제대혈의 유전자 형태 중 HLA-DR이 일치하는 두 개 이상의 제대혈을 사용하여 분리한, CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 조성물.
래트, 개 및 척추동물의 완전한 척수손상 모델에서 척수 마비(spinal cord injury) 치료 및 개선 효과를 갖는, CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 조성물.
척추동물의 신경학적 평가 결과를 향상시키는, CD34 음성, CD45 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD90 양성 및 CD117 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 조성물.
제 1 항의 척수 마비(spinal cord injury) 치료 및 개선을 위한 세포 치료제 조성물을 면역 억제제 없이 단독으로 사용하는 방법.
척수 마비(spinal cord injury) 치료 및 개선을 위해, 제대혈의 유전자 형태 중 HLA-DR이 일치하는 두 개 이상의 제대혈을 사용하는 방법.
투시기(fluoroscopy) 하에서 요추와 천추 사이 공간에 경막외 주사바늘(epidural needle)을 삽입하고;

경막외 주사바늘에 유도철사(guide wire)를 삽입한 후 경막외 주사바늘을 제거하고;

유도철사를 통해 안내도관(introducer)을 장착한 후 유도철사를 제거하고;

안내도관을 통해 혈관성형풍선도관(angioplasty balloon catheter)을 삽입하고;

혈관성형풍선도관의 풍선을 부풀려 척수 손상을 유발하는 단계를 포함하는,

실험용 척추동물에서 비침습적으로 척수손상을 유발하는 방법에 있어서,

혈관성형 풍선 도관의 압박 시간을 30분 이상 유지시키는 방법.
수술적 요법이 아닌, 비침습적, 비수술적, 비감염적 방법으로 X선-투시기 유도 하에 척수 손상이 유발된 부위 전, 후, 그리고 손상부위에 23 게이지 이상의 척수 바늘을 척수로 곧바로 이식하는 줄기세포 이식 방법.