CN103405758B

CN103405758B - 一种应用脐血单状核细胞制备肿瘤特异性dc疫苗的方法

Info

Publication number: CN103405758B
Application number: CN201310310461.4A
Authority: CN
Inventors: 蔡建辉; 邢宏利; 崔乃鹏; 岳翔
Original assignee: Individual
Current assignee: Yuetenong Biotechnology Hebei Co ltd
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2033-07-23
Also published as: CN103405758A

Abstract

本发明一种应用脐血单状核细胞制备肿瘤特异性DC疫苗的方法，所述方法步骤如下：步骤1.自体肿瘤相关全抗原的制备；步骤2.脐血的获取；步骤3.脐带血来源的单状核细胞的获取；步骤4.脐带血来源的单状核细胞前体DC的诱导培养；步骤5.未成熟DC的扩增和培养；步骤6.DC疫苗的制备。

Description

一种应用脐血单状核细胞制备肿瘤特异性DC疫苗的方法

技术领域

本发明涉及一种疫苗的制备方法，特别涉及一种用脐血单状核细胞制备肿瘤特异性DC疫苗的方法。

背景技术

肿瘤的细胞免疫治疗主要依靠DC诱导的T细胞免疫。DC是人体专职的抗原提呈细胞，因而在肿瘤免疫治疗中，承担着摄取和加工肿瘤抗原，将抗原信息提呈给T细胞，从而启动肿瘤特异性T细胞免疫的重要功能。

目前临床应用的DC细胞主要来源于外周血单状核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMC），而且主要应用于个体化细胞免疫治疗。由于PBMC来源DC（PBMC-DC）的个体化特征，限制了临床应用，特别是限制了DC疫苗的大批量生产及DC疫苗制剂的产业化生产。

本发明专利创新性提出，应用脐带血来源的单状核细胞（Umbilical cord blood derived mononuclear cells, UCB-MNCs）分选出DC细胞前体，经过3周扩增，制备成未成熟DC（Imature DC），扩增培养5天负载肿瘤抗原并成熟48小时，制备成肿瘤特异性DC疫苗。

应用UCB-MNCs来源DC细胞所制备肿瘤特异性DC疫苗，具备以下优点：①、脐血（Umbilical Cord Blood，UCB）作为临床废弃物可以大量获得和冻存，能够满足临床应用；②、从UCB-MNCs中诱导培养，可获得未成熟DC（Imature DC）和成熟DC (Mature DC)；③、UCB-MNCs冻存复苏后，其细胞表型、功能、数量不发生明显改变；④、和PBMC来源的DC相比，UCB-MNCs来源的未成熟DC，抗原摄取和加工能力更强；⑤、UCB-MNCs来源DC成熟后，其表面的功能分子表达更高、激活T细胞免疫的能力更强；⑥、UCB-MNCs来源DC的免疫原性极低，用于同种异体ACT治疗（Adoptive cell transfer, ACT），不存在HLA表型限制及免疫排斥反应，因而可广泛应用于不同人体的细胞免疫治疗（Immunotherapy），突破了细胞免疫治疗的个体化瓶颈，使DC疫苗大规模产业化生产成为可能。

发明内容

本发明根据现有技术，提出应用脐带血来源的单状核细胞制备DC疫苗的技术，取得了成功，本发明为此提供一种DC疫苗的制备方法，所述方法，步骤如下：

步骤1、自体肿瘤相关全抗原的制备：

步骤2、脐血的获取：

步骤3、脐带血来源的单状核细胞的获取：

步骤4、脐带血来源的单状核细胞前体DC的诱导培养：

步骤5、未成熟DC的扩增和培养：

步骤6、DC疫苗的制备：

其中各步骤具体操作方法如下：

步骤1、自体肿瘤相关全抗原的制备：

①、手术切除的新鲜肿瘤组织：取肿瘤周边部分组织（避免肿瘤中心的坏死组织）0.3-1.0cm³（可液氮或-80℃冰箱保存备用），剪除周围非肿瘤组织，庆大霉素-生理盐水反复洗涤3-5次，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。

②、胸、腹水获得的肿瘤细胞：取胸、腹水1500-2000ml，1200rpm离心，生理盐水洗涤离心3次，300目钢网过网后获得肿瘤单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。

③、同组织来源细胞株：反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。

取以上自体肿瘤裂解物蛋白和同源细胞株裂解物蛋白各50%，混合制备成自体肿瘤相关全抗原。

步骤2、脐血的获取：

①、产妇选择：选择足月或早产剖腹产健康妇女，应符合以下条件：年龄35岁以下；无恶性肿瘤；无遗传性疾病；无肝炎、梅毒、艾滋等传染性疾病；无严重妊娠并发症；无家族性遗传病；无孕期输血史等。

②、胎儿选择：胎儿体重超过3000g；无先天性疾病或畸形；

③、采血禁忌症：胎盘剥离超过12小时；胎膜早破超过24小时；羊水检测发现染色体异常；生产时产妇有感染、发热；胎儿呼吸窘迫；羊水中有胎粪等。

④、胎儿剖出后5分钟内，距胎儿5-7cm处双重结扎胎儿侧脐带并于两线间切断，75%酒精消毒断端。胎盘侧脐带2-3cm行75%酒精消毒，一次性采血器（含抗凝剂）脐静脉穿刺抽取脐血（约100-120ml）。

⑤、采血完成后，尽快18℃保存箱内输送到GMP实验室，并在6小时内进行细胞分离，最晚不能超过12个小时。

步骤3、UCB-MNCs的获取：

将上述脐血按1:1体积比加入PBS稀释（0.01M，PH=7.4），200目筛网过滤，重悬于含15ml淋巴细胞分离液（密度1.077g/ml）的50ml离心管中，2500r/min梯度密度离心20分钟，仔细抽吸白膜层获取UCB-MNCs。

步骤4、UCB-MNCs来源前体DC的诱导培养：

UCB-MNCs分别生理盐水离心洗涤3次（2000r、1500r、1000r/min），接种于塑料培养瓶，在含有5%自体血清的IMDM培养基中贴壁1.5小时，移除CD14+细胞。收集悬浮细胞，按照10⁶/ml的细胞密度接种于培养瓶，在含有FLT3-L 25ng/ml，TPO 10ng/ml，SCF 20ng/ml，以及5%自体血清的IMDM培养基中，37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养2周，每2-3天换液，80%融合时移瓶，第14天收获前体DC（图 1）。可冻存备用，可继续诱导未成熟DC。

步骤5、未成熟DC的扩增和培养：

前体DC接种于含有5%自体血清的IMDM培养基2ml 的6孔板，细胞密度调整为3×10⁵/well，37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养箱中贴壁培养1.5小时，移除悬浮细胞，贴壁细胞为未成熟DC。加入GM-CSF 50ng/ml，IL-4 20ng/ml，37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养，每2-3天半量换液，第5天完成未成熟DC的扩增（图 2）。可冻存备用，可继续成熟培养。

步骤6、DC成熟培养和DC疫苗的制备：

第5天加入自体肿瘤相关全抗原50μg/ml、TNF-α100ng/ml、及CD40L 100ng/ml，并补充10%的自体血清，培养48小时，诱导DC成熟（图 3, 4）并制备成肿瘤特异性DC疫苗，临床接种治疗或冻存（冻存方法：10⁶/ml个细胞，加入含20%自体血清、10%DMSO的IMDM培养基中，混匀，梯度冻存板-80℃冰箱过夜，转存于液氮）。

本发明上述步骤得到的中间产物和终产物通过以下方法进行了检测，发现其在制备过程中完全符合要求。

①、UCB-MNCs来源的前体DC细胞：UCB-MNCs诱导培养14天所获得的前体DC进行流式细胞检测发现，90%以上的前体DC具有 CD33高表达，说明前体DC属于髓细胞系。冻存1周复苏后检测，细胞标志物没有变化，表明冻存细胞的功能和表型稳定（表1）。

②、UCB-MNCs来源未成熟DC的抗原摄取功能检测：未成熟DC加入20μg/ml FITC-dextran，4℃（对照）和37℃共培养30分钟和60分钟，PBS离心洗涤3次，流式细胞检测发现，30分钟抗原摄取率为49%，60分钟为69%。表明UCB来源未成熟DC具有强大的抗原摄取功能（图 5）。

③、UCB-MNCs来源成熟DC（DC疫苗）：未成熟DC扩增5天加入抗原并成熟培养48小时，高倍镜下可见细胞表面呈典型树突状改变（图 3）。电镜观察可见细胞表面多发细胞突起和树突样改变（图 5）。流式细胞检测发现，细胞表面重要标志物均有大幅升高，且冻存1周复苏后，其表面标志无明显改变（表2）。

④、混合淋巴细胞反应（MLR）检测DC疫苗功能：取健康人外周血T细胞10⁵/well，加入圆底96孔板，与不同比例的成熟DC共培养16小时检测发现，DC能够有效诱导T细胞增殖（图 6）。

表 1. 培养14天时，UCB-MNCs来源前体DC的表面标志

* 新鲜前体DC和冻存前体DC表面各标志物比较，分别P>0.05。

表 2. UCB-MNCs来源成熟DC的表面标志

* 新鲜成熟DCs和冻存成熟DCs各标志物比较，分别P>0.05。

UCB-MNCs来源DC（UCB-DC）和外周血单状核细胞来源DC（PBMC-DC）的对比研究：

①、在PBMC来源的DC（PBMC-DC）和UCB-MNCs来源的DC（UCB-DC）中加入20μg/ml FITC-dextran，37℃、5% CO₂饱和湿度分别培养30分钟和60分钟。PBS离心洗涤3次，流式细胞检测发现，UCB-DC的抗原摄取功能明显高于PBMC-DC（P<0.05; 图 7）。

②、UCB-DC和PBMC-DC分别于培养第5天负载肿瘤细胞裂解物抗原，加入TNF-α培养至第7天ELISA检测发现， PBMC-DC上清中IL-5、IL-12和INF-γ分泌量显著升高（P<0.01），UCB-DC上清中IL-6、IL-10、IL-12及TNF-α分泌量显著升高（P<0.01），UCB-DC的IL-12分泌量明显高于PBMC-DC（P<0.05）。表明UCB-DC功能高于PBMC-DC（图 8）。

③、UCB-DC和PBMC-DC分别负载E7抗原多肽，按照T/DC 3:1的比例，和CD8+T细胞共培养（UCB-DC，A1-A5；PBMC-DC，B1-B5），ELISApot方法检测INF-γ分泌量。发现UCB-DC诱导T细胞活化的能力显著高于PBMC-DC的诱导能力（P<0.01；图9）

④、UCB-DC和PBMC-DC分别诱导胃癌（BGC-823）特异性及结肠癌（HT-29）特异性CTL，行in vitro杀伤试验（Cytotoxicity assay）发现，UCB-DC诱导的CTL具有更强的肿瘤特异性杀伤效应（P<0.05; 图10）。

DC疫苗的临床应用：

接种方式：根据个体化治疗原则，DC疫苗宜采取引流区域淋巴结注射方式进行接种治疗。如：肺癌，采取同侧锁骨上淋巴结区域接种治疗；乳癌，采用同侧锁骨上或腋窝淋巴结区域接种治疗；直肠癌，采用左侧腹股沟淋巴结区域接种治疗。

临床流程：DC疫苗接种治疗前，首先应用CTX 800-1000mg干扰肿瘤微环境、打破肿瘤免疫耐受（有效降低Treg、IL-10、TGF-β水平），然后实施DC疫苗的区域淋巴结接种，每2-3天接种治疗一次，3-5次为一个疗程；或静脉回输治疗（ACT）每日一次或隔日一次。

附图说明：

图1. 培养第14天收获的UCB-MNCs来源前体DC细胞（×200）。

图2. UCB-MNCs来源的前体DC贴壁培养第五天所获得的未成熟DC细胞（×200）。

图3. UCB-MNCs来源的未成熟DC成熟培养48小时所获得的成熟DC细胞（×200）。

图4. UCB-MNCs来源DC成熟后电镜观察，细胞表面具有典型的树突状改变。

图5. UCB-MNCs来源未成熟DC对FITC-dextran的摄取能力明显增强(n=3)。

图6. 混合淋巴细胞反应（MLR）发现，UCB-MNCs来源的DC和

UCB-CD34来源的DC，均能有效激活正常人外周血T细胞。

图7. UCB-MNCs来源未成熟DC的抗原摄取功能明显高于PBMC-DC（P<0.05）。

图8. 培养第6天上清中细胞因子分泌量（ELISA检测）。PBMC-DC的IL-5、IL-12及INF-γ分泌量明显升高（P<0.01），UCB-DC的IL-6、IL-10、IL-12及TNF-α分泌量显著升高（P<0.01）。

图9. UCB-CD34-DC（n=5）和PBMC-DC（n=5）分别负载E7多肽抗原，和CD8+T细胞共培养，ELISApot检测分泌INF-γ的T细胞数。结果发现，UCB-CD34-DC（A1-A5）诱导T细胞活化的能力显著高于PBMC-DC（B1-B5; P<0.01）。

图10. UCB-DC诱导的CTL，和PBMC-DC诱导的CTL相比，具有更强的肿瘤特异性杀伤效应（P<0.05）。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

脐带血来源的单状核细胞制备DC疫苗的制备方法，步骤如下：

步骤1、自体肿瘤相关全抗原的制备：

步骤2、脐血的获取：

②、胎儿选择：胎儿体重超过3000g；无先天性疾病或畸形；

步骤3、UCB-MNCs的获取：

步骤4、UCB-MNCs来源前体DC的诱导培养：

UCB-MNCs分别生理盐水离心洗涤3次（2000r、1500r、1000r/min），接种于塑料培养瓶，在含有5%自体血清的IMDM培养基中贴壁1.5小时，移除CD14+细胞。收集悬浮细胞，按照10⁶/ml的细胞密度接种于培养瓶，在含有FLT3-L 25ng/ml，TPO 10ng/ml，SCF 20ng/ml，以及5%自体血清的IMDM培养基中，37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养2周，每2-3天换液，80%融合时移瓶，第14天收获前体DC（Fig 1）。可冻存备用，可继续诱导未成熟DC。

步骤5、未成熟DC的扩增和培养：

前体DC接种于含有5%自体血清的IMDM培养基2ml 的6孔板，细胞密度调整为3×10⁵/well，37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养箱中贴壁培养1.5小时，移除悬浮细胞，贴壁细胞为未成熟DC。加入GM-CSF 50ng/ml，IL-4 20ng/ml，37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养，每2-3天半量换液，第5天完成未成熟DC的扩增（Fig 2）。可冻存备用，可继续成熟培养。

步骤6、DC成熟培养和DC疫苗的制备：

第5天加入自体肿瘤相关全抗原50μg/ml、TNF-α100ng/ml、及CD40L 100ng/ml，并补充10%的自体血清，培养48小时，诱导DC成熟（Fig 3, 4）并制备成肿瘤特异性DC疫苗，临床接种治疗或冻存（冻存方法：10⁶/ml个细胞，加入含20%自体血清、10%DMSO的IMDM培养基中，混匀，梯度冻存板-80℃冰箱过夜，转存于液氮）。

Claims

1.一种应用脐血单状核细胞制备肿瘤特异性DC疫苗的方法，所述方法，步骤如下：

步骤1、自体肿瘤相关全抗原的制备：

①、手术切除的新鲜肿瘤组织：取肿瘤周边部分组织0.3-1.0cm³，剪除周围非肿瘤组织，庆大霉素-生理盐水反复洗涤3-5次，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用；

②、胸、腹水获得的肿瘤细胞：取胸、腹水1500-2000ml，1200rpm离心，生理盐水洗涤离心3次，300目钢网过网后获得肿瘤单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用；

③、同组织来源细胞株：反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用；

取以上自体肿瘤裂解物蛋白和同源细胞株裂解物蛋白各50%，混合制备成自体肿瘤相关全抗原；

①、产妇选择：选择足月或早产剖腹产健康妇女，应符合以下条件：年龄35岁以下；无恶性肿瘤；无遗传性疾病；无肝炎、梅毒、艾滋等传染性疾病；无严重妊娠并发症；无家族性遗传病；无孕期输血史等；

②、胎儿选择：胎儿体重超过3000g；无先天性疾病或畸形；

③、采血禁忌症：胎盘剥离超过12小时；胎膜早破超过24小时；羊水检测发现染色体异常；生产时产妇有感染、发热；胎儿呼吸窘迫；羊水中有胎粪等；

④、胎儿剖出后5分钟内，距胎儿5-7cm处双重结扎胎儿侧脐带并于两线间切断，75%酒精消毒断端，胎盘侧脐带2-3cm行75%酒精消毒，一次性采血器脐静脉穿刺抽取脐血；

⑤、采血完成后，尽快18℃保存箱内输送到GMP实验室，并在6小时内进行细胞分离，最晚不能超过12个小时；

步骤3、脐带血来源的单状核细胞的获取：

将上述脐血按1:1体积比加入0.01M，PH=7.4的PBS稀释，200目筛网过滤，重悬于含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管中，2500r/min梯度密度离心20分钟，仔细抽吸白膜层获取UCB-MNCs；

步骤4、脐带血来源的单状核细胞前体DC的诱导培养：

UCB-MNCs分别生理盐水离心洗涤3次，接种于塑料培养瓶，在含有5%自体血清的IMDM培养基中贴壁1.5小时，移除CD14+细胞，收集悬浮细胞，按照10⁶/ml的细胞密度接种于培养瓶，在含有FLT3-L 25ng/ml，TPO 10ng/ml，SCF 20ng/ml，以及5%自体血清的IMDM培养基中，37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养2周，每2-3天换液，80%融合时移瓶，第14天收获前体DC，可冻存备用，可继续诱导未成熟DC；

步骤5、未成熟DC的扩增和培养：

前体DC接种于含有5%自体血清的IMDM培养基2ml 的6孔板，细胞密度调整为3×10⁵/well，37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养箱中贴壁培养1.5小时，移除悬浮细胞，贴壁细胞为未成熟DC，加入GM-CSF 50ng/ml，IL-4 20ng/ml，37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养，每2-3天半量换液，第5天完成未成熟DC的扩增，可冻存备用，可继续成熟培养；

步骤6、DC成熟培养和DC疫苗的制备：

第5天加入自体肿瘤相关全抗原50μg/ml、TNF-α100ng/ml、及CD40L 100ng/ml，并补充10%的自体血清，培养48小时，诱导DC成熟并制备成肿瘤特异性DC疫苗，冻存。