KR20230114316A - 세포 치료를 위해 세포 집단을 조건화하기 위한 방법및 장치 - Google Patents

세포 치료를 위해 세포 집단을 조건화하기 위한 방법및 장치 Download PDF

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Abstract

다능성 세포들 또는 세포 배지를 조건화하기 위한 바이오리액터 시스템이 제공된다. 추가 양상들에서, 그러한 세포들을 제작하기 위한 조건화된 다능성 세포들 및 방법들이 제공된다.

Description

세포 치료를 위해 세포 집단을 조건화하기 위한 방법 및 장치{METHODS AND APPARATUS FOR CONDITIONING CELL POPULATIONS FOR CELL THERAPIES}
본 출원은 2015년 6월 23일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/183,273의 이익을 주장하며, 그 전체는 본 명세서에 참고용으로 병합된다.
본 발명의 실시예들은 치료제로서 사용하기 위해 개선된 특징들에 대한 세포 집단들을 조건화하기 위한 방법들 및 장치에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명의 실시예들은, 줄기 세포들이 배치되는 흐름 챔버의 경계를 따라 배치된 줄기 세포들 상에 제어된 전단 응력을 부과함으로써 줄기 세포들을 조건화하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 분야
혈통 특정 분화 세포 집단들은 질병들 또는 장애를 갖는 환자들에 대한 세포 대체 치료에 사용하기 위해 구상된다. 특수한 세포 유형들(줄기 세포들) 및/또는 비밀 특정 인자들로 차별화할 수 있는 능력을 유지하는 세포 집단들은 다양한 질병들 또는 장애를 갖는 환자를 위한 세포 기반의 치료에 사용하기 위해 구상되어 왔다.
줄기 세포들의 지향된 차별화에 관련하는 조사 및 기술적 개발은 많은 질병들 및 장애에 대한 치료를 제공하도록 요구되었다. 하지만, 기증자 세포 집단들이 치료 활성에서 예측 가능하도록 신뢰성 있게 조건화되는 충분한 기증자 세포 집단들을 얻을 수 있는 능력이 여전히 필요하다. 본 방법들 및 장치는 이들 문제들에 해법을 제공하여, 세포 치료로서 또는 해결 가능한 인자의 소스로서 세포들의 이용을 용이하게 한다.
바이오리액터(bioreactor)는, 줄기 세포 함유 유체와 같은 생리학적 물질들의 성분들이 물질들에 영향을 미치는 인자들의 관리에 의해 조건화될 수 있는 디바이스이다. 줄기 세포 함유 유체의 상태는 pH, 폐기물(waste) 함량, 영양소 함량 및 예를 들어, 산소와 같은 용해된 가스의 유형 및 농도를 포함하는 다수의 인자들에 의해 영향을 받는다. 이들 인자들은 일반적으로 줄기 세포 함유 유체에서 줄기 세포들의 상태에 영향을 미치는 화학적 인자들로서 언급될 수 있다.
바이오리액터는 비-화학적 인자들의 제어에 의해 줄기 세포 함유 유체의 상태의 관리를 가능하게 할 수 있다. 종래의 세포 치료를 위해 세포 집단들을 조건화하는 종래의 장치들 및 방법들은 세포들에 대한 기계적 전단의 정밀한 제어가 조건화되는 것을 가능하게 하는데 실패한다. 그러므로, 대규모의 세포 생산을 할 수 있는 바이오리액터 흐름 챔버 내에서 조건화될 세포들에 전단 응력을 제어 가능하게 인가하기 위한 장치 및 방법들이 바람직하다.
본 발명의 실시예들은 줄기 세포 함유 유체의 상태에 영향을 미치는 적어도 하나의 기계적 인자의 제어를 가능하게 하는 장치를 포함한다. 더 구체적으로, 본 발명의 실시예들은 줄기 세포 함유 유체 내의 줄기 세포들에 인가된 전단 응력의 비율의 제어를 가능하게 하는 장치를 포함한다. 본 발명의 실시예들은 단면 흐름 면적에 대한 흐름 경계 층 둘레의 매우 높은 비율을 제공하도록 성형된(shaped) 하나 이상의 흐름 챔버들을 통해 배지 유체를 흐르는데 사용될 수 있어서, 이를 통해 챔버들에 고유한 줄기 세포들 상에 기계적 힘(전단력)의 조건화 효과를 최대화한다.
대응하는 단면 흐름 면적에 대한 매우 높은 경계 층 둘레는 단면 흐름 면적에 의해 나누어진 흐름 챔버의 둘레로서 주어진 흐름 통로에 대해 계산된다. 예를 들어, 원형 흐름 통로는 대응하는 단면 영역에 대한 최소로 달성 가능한 흐름 경계 층 둘레를 제공하고, 이것은 2πr ÷πr2 = 2/r로서 계산된다. 단면 흐름 면적에 대한 최소의 둘레 비율을 갖는 흐름 통로가 일반적으로 흐름 통로를 통해 흐를 때 유체에 부과된 최소의 전단 응력을 제공하고, 모든 다른 인자들(난류 또는 층류 흐름 방식, 표면 강성도 등)은 동일하다는 것이 다음에 올 것이다.
대응하는 단면 흐름 면적에 대한 최대의 흐름 경계 층 둘레는 예를 들어, 무한히 넓고 극미량으로 얇은 통로에 의해 제공되고, 이로 인해 대응하는 단면 흐름 면적에 대해 달성 가능한 흐름 경계 층 둘레는 이론적으로 ∞에 도달한다. 물론, 무한히 넓고 극미량으로 좁은 통로는 흐름에 대해 무한한 저항을 부과하기 때문에 비실용적이지만, 대응하는 단면 흐름 면적에 대한 매우 높은 흐름 경계 층 둘레는 이를 통해 이동하는 줄기 세포 함유 유체에 흐름 경계 층 둘레를 따르는 전단력의 인가를 촉진하기 위해 넓지만 얇은 흐름 통로들을 제공함으로써 달성된다.
본 발명의 장치의 하나의 실시예는 장치를 제공하며, 이 장치는 제 1 단부, 제 2 단부, 그 사이의 벽, 제 1 단부에 근접한 입구 유체 커넥터, 제 1 단부에 근접한 라이저 보어(riser bore), 및 입구 유체 커넥터와 유체 왕래하는(in fluid communication with) 라이저 보어를 배치하기 위해 입구 유체 커넥터로부터 라이저 보어로 연장하는 공급 통로를 갖는 제 2 캡(cap), 제 1 단부, 제 2 단부, 그 사이의 벽, 제 2 단부에 근접한 출구 유체 커넥터, 출구 유체 커넥터와 유체 왕래하는 라이저 보어를 배치하기 위해 라이저 보어로부터 출구 유체 커넥터로 연장하는 배수 통로를 갖는 제 2 캡, 및 제 1 캡의 벽과 제 2 캡의 벽의 중간에 배치되고 장치의 조립시 제 1 캡 및 제 2 캡 각각과 밀봉된 맞물림 상태로 배치된 적어도 하나의 중간 모듈을 포함하고, 각 중간 모듈은 제 1 단부, 제 2 단부, 제 1 캡의 벽쪽으로 배치된 제 1 측부 및 제 2 캡의 벽쪽으로 배치된 제 2 측부를 갖는 그 사이의 배리어로서, 배리어는 프레임 내부, 및 제 1 단부와 제 2 단부 사이에 배치되어, 제 1 캡의 밀봉 면을 중간 모듈의 제 1 측부의 밀봉 면과 밀봉 가능하게 맞물림시 제 1 캡의 벽과 중간 모듈의 배리어 사이에 제 1 흐름 챔버를 형성하고, 또한 중간 모듈의 제 2 측부의 밀봉 면을 갖는 제 2 캡의 밀봉 면을 중간 모듈을 갖는 제 2 캡의 밀봉 면과 밀봉 가능하게 맞물림시 제 2 캡의 벽과 중간 모듈의 배리어 사이에 제 2 흐름 챔버를 형성하는, 배리어를 갖는 프레임, 장치의 조립시 제 1 캡의 라이저 보어와 밀봉 가능하게 맞물리기 위해 중간 모듈의 제 1 단부에 근접한 프레임에서의 모듈 공급 보어, 중간 모듈의 제 1 단부에 근접한 프레임에서 그리고 모듈 공급 보어로부터 분배 채널에 수용된 유체 흐름을 분배하기 위해 모듈 공급 보어와 유체 왕래하는 분배 채널, 중간 모듈의 제 1 단부에 근접하게 배치되고 제 1 및 제 2 흐름 챔버들에 수용된 유체 흐름을 도입하기 위해 분배 채널과 유체 왕래하게 배치된 복수의 흐름 챔버 공급 포트들, 중간 모듈의 제 2 단부에 근접하게 배치되고 제 1 및 제 2 흐름 챔버들과 유체 왕래하게 배치된 복수의 흐름 챔버 배수 포트들, 중간 모듈의 제 2 단부를 따라 배치되고 흐름 챔버 배수 포트들을 통해 제 1 및 제 2 흐름 챔버들과 유체 왕래하게 배치된 수집 채널, 중간 모듈의 제 2 단부에 근접하고 수집 채널과 유체 왕래하고 장치의 조립시 제 2 캡의 라이저 보어와 밀봉 가능하게 맞물리기 위한 모듈 배수 보어를 포함하고, 하나 이상의 중간 모듈들 상의 제 1 측부 밀봉 표면을 제 1 캡 상의 밀봉 표면과 밀봉 가능하게 맞물리고, 또한 하나 이상의 중간 모듈들 상의 제 2 측부 밀봉 표면을 제 2 캡 상의 밀봉 표면과 밀봉 가능하게 맞물리기 위해 제 1 캡 및 제 2 캡의 중간에 배치된 하나 이상의 중간 모듈들을 갖는 장치의 조립시, 복수의 흐름 챔버 공급 포트들의 적어도 몇몇과 복수의 흐름 챔버 배수 포트들의 적어도 몇몇 중간에 배치되고 적어도 하나의 중간 모듈 제 1 측부 및 제 1 캡의 중간에 배치된 제 1 흐름 챔버, 및 복수의 흐름 챔버 공급 포트들의 적어도 몇몇과 복수의 흐름 챔버 배수 포트들의 적어도 몇몇의 중간에 배치되고 적어도 하나의 중간 모듈 제 2 측부 및 제 2 캡의 중간에 배치된 제 2 흐름 챔버를 포함하는 두갈래(bifurcated) 유체 경로를 제공하기 위해 제 2 캡 상의 출구 유체 커넥터와 밀봉된 맞물림 상태로 제 1 캡의 입구 유체 커넥터를 배치하고, 분배 채널을 따라 분배된 복수의 흐름 챔버 공급 포트들, 및 중간 모듈의 수집 채널을 따라 분배된 복수의 흐름 챔버 배수 포트들은 장치의 입구 유체 커넥터 및 출구 유체 커넥터 양단의 유체 압력 차동을 제공할 때 흐름 챔버들 내에 더 균일한 국부화된(localized) 유체 속도를 제공하고, 제 1 흐름 챔버의 단면 흐름 면적에 대한 제 1 흐름 챔버의 둘레의 비율은 초과한다.
본 발명의 특정한 실시예들은 조건화된 조성물을 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 조건화된 조성물은 기계적 힘의 조건화 효과를 겪은 조성물은 언급한다. 예를 들어, 기계적 힘은 조건화된 조성물을 생성하는데 충분한 힘으로 제어된 전단 응력의 인가일 수 있다. 몇몇 양상들에서, 조건화된 조성물은 조건화된 만능 세포들(예를 들어, MSC)의 집단을 포함한다. 따라서, 특정한 양상들은 조건화된 만능 세포들의 집단의 격리에 관한 것이다. 추가 양상들에서, 조건화된 조성물은 제어된 전단 응력을 겪은 만능 세포들로부터의 분비 인자들을 포함하는 배지(예를 들어, 무세포 배지)이다.
실시예들의 양상들은 세포 접착을 허용하기 위해 기재 상의 줄기 세포들의 배양을 수반한다. 몇몇 경우들에서, 기재는 단층에서 줄기 세포들의 성장을 지원하는 표면이다. 예를 들어, 몇몇 양상들에서, 표면은 세포외 기질 물질들(예를 들어, 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 라미닌 및/또는 비트로넥틴)로 코팅된 표면과 같이 플라스틱 또는 유리 표면이다. 추가 양상들에서, 기재는 증가된 또는 감소된 표면 에너지를 갖는 표면(또는 표면 코팅)을 병합하도록 변형될 수 있다. 표면 또는 표면 코팅으로서 사용될 수 있는 저 에너지 물질들의 예들은 제한 없이, 폴리에틸렌, 또는 폴리프로필렌 및 질화물과 같은 히드로카본 폴리머를 포함한다. 예를 들어, 표면 또는 표면 코팅은 폴리헥사플루오로프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리(비닐리덴 플루오라이드), 폴리(클로로트리플루오로에틸렌), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(메틸메타크릴레이트) - PMMA, 폴리스티렌, 폴리아미드, 나일론-6,6, 폴리(비닐클로라이드), 폴리(비닐리덴 클로라이드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 에폭시(예를 들어, 고무 강화 또는 아민-경화), 페놀-레조치놀 수지, 요소-포름알데히드 수지, 스티렌-부타디엔 고무, 아크릴로니트릴-부타디엔 고무 및/또는 탄소 섬유 강화 플라스틱을 포함할 수 있다. 표면 또는 표면 코팅으로서 사용될 수 있는 고에너지 물질들의 예들은 제한 없이, 금속 및 산화물을 포함한다. 예를 들어, 표면 또는 표면 코팅은 산화 알루미늄, 산화 베릴륨, 구리, 그래파이트, 산화철(Fe 2O 3), 납, 수은, 운모, 니켈, 백금, 이산화 실리콘-실리카 및/또는 은을 포함할 수 있다.
실시예들의 추가 양상들은 조건화된 조성물을 생성하는데 충분한 힘으로 제어된 전단 응력의 인가에 관한 것이다. 특정한 양상들에서, 전단 응력은 유체 층류 전단 응력의 형태로 인가된다. 예를 들어, 전단 응력의 힘은 평방 센티미터당 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 다인이다. 특정한 상태들에서, 전단 응력의 힘은 평방 센티미터당 약 5 내지 20; 5 내지 15; 10 내지 20 또는 10 내지 15 다인과 같이 평방 센티미터당 적어도 5, 10 또는 15 다인이다. 몇몇 양상들에서, 제어된 전단 응력은 약 1분 내지 2일의 기간 동안 인가된다. 예를 들어, 제어된 전단 응력은 5분 내지 24 시간; 10분 내지 24 시간; 0.5 시간 내지 24 시간 또는 1 시간 내지 8 시간의 기간 동안 인가될 수 있다. 추가 양상들에서, 실시예들의 세포들은 상승된 압력에 노출된다.
또 다른 양상들에서, 실시예들의 배양균으로부터의 세포들 또는 배지는 조건화 레벨을 결정하기 위해 주기적으로 테스트된다. 예를 들어, 세포들 또는 배지를 포함하는 샘플은 약 매 10분, 15분, 30분 또는 매시간 배양균으로부터 취해질 수 있다. 그러한 샘플들은 예를 들어, 전사(transcription) 인자들 또는 사이토카인과 같이 항염증 인자들의 발현 레벨을 결정하기 위해 테스트될 수 있다. 특정한 양상들에서, 세포들 또는 배지는 예를 들어, 장치를 통해 유체를 향하게 하도록 구성된 펌프의 입구 근처를 포함하는 낮은 유체 압력의 장소에 위치된 샘플링 포트로부터 취해질 수 있다.
특정한 양상들에서, 줄기 세포들의 시작 집단이 얻어진다. 예를 들어, 시작 줄기 세포 집단은 유도 만능 줄기(iPS) 세포들 또는 중간엽 줄기 세포들(MSCs)을 포함할 수 있다. 몇몇 양상들에서, MSC들은 조직으로부터 격리된다. 예를 들어, 몇몇 양상들에서, 조직은 골수, 제대혈, 말초 혈액, 나팔관, 태아간, 폐, 치수, 태반, 지방 조직, 또는 양수를 포함한다. 추가 양상들에서, 세포들은 인간의 세포들이다. 예를 들어, 세포들은 자가 줄기 세포들일 수 있다. 몇몇 양상들에서, 줄기 세포들은 유전자 이식 세포들이다.
실시예들의 추가 양상들에서, 조건화된 조성물을 생성하는 방법은 제어된 전단 응력의 인가를 위해 줄기 세포들 위로 유체를 통과하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 줄기 세포들 위에 통과된 유체는 세포 성장 배지일 수 있다. 몇몇 양상들에서, 성장 배지는 적어도 제 1 외인성 사이토카인, 성장 인자, 염증의 TLR 작용제(agonist) 또는 촉진제를 포함한다. 예를 들어, 성장 배지는 IL1B, TNF-α, IFNγ, PolyI:C, 리포폴리사카라이드(LPS), 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA) 및/또는 프로스타글란딘을 포함할 수 있다. 특정한 특수 양상들에서, 프로스타글란딘은 16,16'-디메틸 프로스타글란딘 E2(dmPGE2)이다.
특정한 양상들에서, 실시예들의 조건화된 줄기 세포들은 줄기 세포들의 시작 집단에 비해 항염증 유전자의 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6배 더 높은 발현을 갖는다. 예를 들어, 항염증 유전자는 TSG-6, PGE-2, COX-2, IL1Ra, HMOX-1, LIF, 및/또는 KLF2일 수 있다.
추가 실시예들에서, 조건화된 조성물은 조건화된 배지 조성물을 포함한다. 따라서, 특정한 양상들은 전단 응력의 인가 이후에 조건화된 배지의 격리에 관한 것이다. 몇몇 경우들에서, 조건화된 배지는 본질적으로 무세포이다.
실시예들의 추가 양상들은 바이오리액터(예를 들어, 본 명세서에 상세히 기술된 바이오리액터와 같은)에서의 전단 응력의 인가에 관한 것이다. 특정한 양상들에서, 바이오리액터 시스템은 입구 유체 공급 플레이트, 베이스 플레이트, 및 입구 유체 공급 플레이트와 베이스 플레이트 사이에 위치된 복수의 중간 플레이트들을 포함한다. 예를 들어, 중간 플레이트는 제 1 단부, 제 2 단부, 제 1 측부, 및 제 2 측부; 제 1 단부에 근접한 분배 채널; 및 제 2 단부에 근접한 수집 채널을 포함한다. 추가 양상들에서, 분배 채널은 중간 플레이트의 제 1 측부와 제 2 측부 사이로 연장한다. 특정한 양상들에서, 수집 채널은 중간 플레이트의 제 1 측부와 제 2 측부 사이로 연장한다. 몇몇 경우들에서, 바이오리액터 시스템은 용기, 제 1 도관, 및 제 2 도관을 더 포함한다. 특정한 양상들에서, 입구 유체 공급 플레이트는 제 1 유체 입구, 제 1 유체 출구, 제 2 유체 입구 및 제 2 유체 출구를 포함한다. 예를 들어, 용기는 제 1 도관을 통해 제 1 유체 입구에 연결되고, 제 2 도관을 통해 제 2 유체 출구에 연결된다.
실시예들의 추가 양상들에서, 바이오리액터 시스템은 입구 유체 공급 플레이트의 제 1 유체 출구 및 제 2 유체 입구에 연결된 펌프를 포함한다. 특정한 양상들에서, 펌프는 제 1 유체 입구 및 제 1 유체 출구를 통해 용기로부터 유체를 흡인(draw)하고, 복수의 중간 플레이트들을 가로질러 제 2 유체 입구를 통해 유체를 제 2 입구 밖으로, 그리고 다시 용기로 향하게 하도록 구성된다. 몇몇 양상들에서, 제 2 유체 입구를 통하는 유체의 속도는 펌프의 롤링 요소 (rolling element)의 회전 속도에 의해 제어된다. 특정한 양상들에서, 바이오리액터 시스템은 단면 흐름 면적에 대한 흐름 경계 층 둘레의 높은 비율을 제공한다. 몇몇 양상들에서, 바이오리액터 시스템은 대규모 세포 생성을 가능하게 한다. 예를 들어, 조건화된 조성물을 생성하는 방법이 자동화된다.
실시예들의 특정한 양상들은 치료상으로 유효량의 조건화된 줄기 세포들의 조성물을 제공한다. 몇몇 양상들은 치료상으로 유효량의 조건화된 줄기 세포들을 투여하는 것을 포함하는 그러한 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 세포들은 실시예들에 따른 방법에 의해 얻어진 조건화된 조성물(예를 들어, 세포 조성물 또는 조건화된 배지)을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 증명된 바와 같이, 그러한 조건화된 조성물은 몇몇 양상들에서, 환자에서의 줄기 세포들의 개선된 생착(engraftment)을 제공할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 양상들에서, 환자는 만성 또는 급성 염증, 이식편대숙주병(graft-versus-host disease), 신경 손상(예를 들어, 뇌졸중과 같은 국소 빈혈 손상, 또는 외상성 뇌손상), 근골격 외상, 또는 자가 면역 장애를 갖는다. 몇몇 양상들에서, 조건화된 줄기 세포들은 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 투여된다.
또 다른 실시예에서, 유효량의 줄기 세포들(예를 들어, 중간엽 줄기 세포들)을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자의 골수에서 CD105+ 세포들을 증가시키는 방법이 제공된다. 예를 들어, 세포들은 실시예들에 따른 방법에 의해 얻어진 조건화된 조성물(예를 들어, 세포 조성물 또는 조건화된 배지)을 포함할 수 있다. 몇몇 양상들에서, 환자는 국소 빈혈 손상(예를 들어, 뇌졸중으로부터) 또는 외상성 뇌손상과 같은 신경 손상을 갖는다. 특정한 양상들에서, 환자는 세포들의 투여 이전에 24 미만, 18 미만, 12 또는 6 시간 미만에 신경 손상을 겪었다.
특정한 양상들에서, 실시예들은 세포들 및/또는 조건화된 조성물의 투여에 관한 것이다. 몇몇 양상들에서, 투여는 질병에 걸리거나 손상된 조직들에 또는 이에 인접한 것과 같이 국부적일 수 있다. 추가 양상들에서, 투여는 전신적이다. 예를 들어, 투여는 정맥내 주사와 같은 조성물의 주사에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 목적들, 특징들 및 장점들은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 하지만, 상세한 설명 및 특정한 예들이 본 발명의 특정한 실시예들을 나타내면서, 단지 예시에 의해 주어지는데, 이는 본 발명의 사상 및 범주 내에서의 다양한 변화들 및 변형들이 본 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해지기 때문이라는 것이 이해되어야 한다.
본 방법들, 시스템 및 장점의 목적들 및 장점들은 다음의 상세한 설명과 연계하여 그리고 예로서 본 시스템 및 방법들의 바람직한 실시예들을 도시하는 첨부 도면들과 연계하여 고려될 때 더 잘 이해되고 더 쉽게 명백해질 것이다.
도 1은 본 개시에 따른 바이오리액터 케이스의 공급 캡의 평면도.
도 2는 도 1의 공급 캡의 측면도.
도 3은 라이저 보어를 통해 취한 도 1 및 도 2의 공급 캡의 단면 입면도.
도 4는 도 1 내지 도 3의 공급 캡의 단면도.
도 5는 본 개시에 따른 바이오리액터 케이스의 중간 모듈의 평면도.
도 6은 도 5의 중간 모듈의 측면도.
도 7은 도 6의 중간 모듈의 측면도의 제 2 단부에서의 유체 통로들의 확대도.
도 8은 도 5 내지 도 7의 중간 모듈의 제 2 단부의 단면도.
도 9는 본 발명의 바이오리액터 케이스의 배수 캡의 평면도.
도 10은 도 10의 배수 캡의 측면도.
도 11은 라이저 보어를 통해 취한 도 10 및 도 11의 배수 캡의 단면 입면도.
도 12는 도 10 내지 도 12의 배수 캡의 단면도.
도 13은 두갈래 유체 경로가 바이오리액터를 이용하여 조건화될 유체를 함유하는 관(vessel)(미도시)에 연결 가능하고 바이오리액터로부터 유체를 수용하도록 수집기 관(미도시)에 연결 가능한 본 개시의 조립된 바이오리액터 케이스의 단면 입면도.
도 14는 도 13의 바이오리액터 케이스의 입면도.
도 15는 도 13의 바이오리액터 케이스의 사시도.
도 16은 본 개시에 따른 세포 조제 시스템의 일실시예의 분해도.
도 17은 도 16의 세포 조제 시스템의 조립 사시도.
도 18은 복수의 모듈형 세포 조제 장치를 포함하는 세포 조제 시스템의 제 1 사시도.
도 19는 도 18의 세포 조제 시스템의 제 2 사시도.
도 20은, 전사 유도가 유체 전단 응력을 받은 인간 MSC들에서의 COX2, TSG6, HMOX1, 및 IL1RN에 대해 강력하다. hBM MSC, 인간 골수 MSC(각 그래프에서 처음 4개의 바들); hAF MSC, 양수 MSC(각 그래프에서 두 번째 내지 마지막 바); hAD MSC, 배양액 추출된 MSC(각 그래프에서 마지막 바). 쌍을 이룬 t-test, 동일 변이에 의해 계산된 P-값들을 논증하는 그래프.
도 21은 NF-kB 작용제 BAY11-7085(10μM)에 의해 감소되는, 증가된 세포 내 COX2 단백질을 도시한 대표적인 웨스턴 블롯들을 도시한 도면.
도 22는, MSC 면역 제어의 기능 개선을 강조하는 TNF-α 사이토카인 억제 검정을 도시한 도면. 기계적 힘(3시간 동안 15 다인/cm2 전단 응력)에 의해 사전 조건화된 인간의 MSC들은 큰 포식 세포, 호중구, NK, B, 및 T 세포를 포함하는 지질다당질(LPS) 또는 식물 적혈구 응집소(PHA)-활성화 비장 세포를 갖는 정적 공생 배양에 위치된다. 검정의 결과들은 MSC들이 일시적으로 전단 응력으로 조건화될 때 비장 세포에 의한 TNF-α 분비가 10 내지 50%만큼 감소된다는 것을 보여준다. 낮은 값들은 더 큰 항염증 효능에 대응한다. hBM MSC, 인간의 골수 MSC; hAF MSC, 양수 MSC(그래프에서 "*"로 표시됨); hAD MSC, 배양액 추출된 MSC(그래프에서 "^"로 표시됨). 쌍을 이룬 t-test, 동일 변이에 의해 계산된 P-값들을 도시한 도면.
도 23은 COX2(인도메타신, 10μM; NS-398, 10μM) 및 NF-kB(BAY11-7085, 10μM)의 억제가 전단 응력의 긍정적인 효과를 방해하는 반면, 편위 dmPGE2(10μM)은 MSC 억제를 복제하는 것을 도시한 도면. 별표는 정적 운반체에 비해 p<0.001을 나타내고, n=6은 도시된 데이터에 포함된 6개의 상이한 MSC 제공자 라인들을 나타낸다.
도 24는 시동제가 전단 유도된 항염증 신호 발신(signaling)을 보완하는 것을 도시한 도면. 검은색 바들은 전단 응력 및 사이토카인(IFN-γ, 20 ng/ml; TNF-α, 50 ng/ml)에 의해 통로의 상당 유도를 나타내는 치료 조합들을 나타낸다. 이러한 저성은 인간의 양막 MSC 라인에서, TSG6은 전단 응력에 의해서만 유도되었다. IDO는 IFN-γ에 의해서만 유도되었다. hAF MSC, 인간의 양수 MSC.
도 25a 내지 도 25d는, 생쥐에서 외상성 뇌손상에 의해 야기된 골수의 세포 조성물에서의 붕괴가 WSS-사전 조건화된 인간의 MSC들의 정맥내 투여에 의해 방해되는 것을 도시한 도면. (A) CCI에 의해 외상성 뇌손상 이후 24 시간에 골수에서 내생 생쥐 MSC들의 면역 측정법(immunodetection)은 CD105+ 집단의 공핍을 나타낸다{대비 염색은 뉴클리어 패스트 레드법(nuclear fast red)로부터 도출된다}. (B) 더 적은 CD105+ MSC들은 CCI를 뒤따르는 골수에 존재한다. (C) CD105는 손상 이후 72 시간에 검출된다(헤마톡실린 대비 염색). (D) CCI 이후 72 시간에 CD105 MSC 빈도수의 정량화는 CCI 후 24 시간에 정맥내로 투여될 때 MSC 치료법에 의해 골수 세포 조성물의 보호를 나타내다. CD105+ MSC 집단에 대한 보호 효과는 치료상으로 사용된 MSC들의 WSS 사전 조건화에 의해 개선된다(하나의 방식 ANOVA, ***p<0.001).
중간엽 줄기 세포들(MSC들)과 같은 다능성 줄기 세포들을 다룰 때, 차별의 결과를 제어하는 것은 세포 치료법을 개발하는데 있어서 중요한 단계이다. 일관된 결과들을 생성하는 것은 다수의 파라미터들을 포함하는 세포의 환경의 정밀한 제어를 요구한다. 이들은 영양제, 폐기 생성물, pH 및 용해된 가스와 같은 화학적 인자들을 포함한다. 종래의 바이오리액터들의 많은 상태는 이들 화학적 파라미터들을 제어 및 모니터링하도록 설계되고 구축되었다.
하지만, 기계적 환경은 또한 줄기 세포의 결과에서 중요한 역할을 한다. 기계적 환경은 2가지 주요한 요소들에 의존한다: 주변 배지의 동적 상태 및 기재. 기재 강도(stiffness)는 표면 치료 또는 코팅의 주의 깊은 선택을 통해 제어될 수 있고, 이것은 기재에 대한 세포들의 접착 뿐 아니라 차별 결과 모두에 영향을 미칠 수 있다.
세포들의 집단이 기재에 접착된 후에, 이들 세포들은 세포들이 침지되는 배지에 의해 인가된 기계적 힘을 받는다. 종래의 세포 배양에서, 이들 힘은 본질적으로 0인데, 이는 배지의 대량 흐름(bulk flow)이 없기 때문이다. 기존의 바이오리액터 시스템들은 일정하거나 가변적인 유체 흐름(배지)을 갖지만, 흐름의 패턴(층류-단방향 또는 양방향 대 난류) 또는 세포들과 상호 작용하는 전단력의 정도의 설계 제어가 부족하다. 이동 유체는 유체 속도 및 점도에 비례하는 전단 응력을 세포들 상에 가한다. 대부분의 기계 형질 도입(mechanotransduction) 연구는, 전단 응력 작용이 잘 알려져 있고 간단한 수학식을 특징으로 하는 층류 흐름 방식으로 수행되어 왔다. 층류는 흐름 채널의 단면 양단에 비-균일한 속도 프로필을 특징으로 한다. 경계(예를 들어, 벽)에서의 유체 속도는 0인 것으로 간주될 수 있고, 이것은 "미끄럼 방지(no-slip) 상태" 또는 "경계 상태"로서 알려져 있다. 층류에서의 뉴턴 유체에 대한 전단 응력(T)을 기재하는 간단한 수학식은 T = -μ (du/dy)이고, 여기서 μ는 점도이고, u는 채널에서의 특정한 깊이에서 유체의 속도이다. 배지 점도 및 유체 속도를 알면, 인가된 전단 응력이 계산될 수 있다.
다수의 세포 유형들(예를 들어, 줄기 세포)로 차별화할 수 있는 능력을 유지하는 세포 집단들은 다수의 혈통 특정 차별화된 세포 집단들을 개발하는데 유용한 것으로 증명되었다. 중간엽 줄기 세포(MSC)들은 한 가지 그러한 유형의 줄기 세포이고, 다능성 및 자가 재생 모두인 것을 위해 알려져 있다. MSC들은 이에 따라 후보 세포 치료법으로서 드러났고, 생리 활성 면역 조절(bioactive immunomodulatory) 분자들의 지속된 소스를 잠재적으로 제공할 수 있다. 하지만, 현재 MSC의 이용의 임상 효험을 제한하는 방해물들 중 하나는, MSC 기능의 유도가, 다시 MSC의 면역 조절 활성을 개시하는 활성화된 면역 세포들에 의해 생성된 신호 및 사이토카인의 존재에 크게 좌우된다는 것이다. 본 방법들 이전에, 예를 들어, 이러한 가변성은 줄기 세포 조성물의 예측하지 못한 치료 활성으로 전환되었다.
몇몇 양상들에서, 본 명세서에 기재된 바이오리액터 시스템은 증가된 수의 줄기 세포들(예를 들어, MSC들)을 제공하고, 이것은 또한 면역 조절 기능에 관해 생체 외에서 예측 가능하게 및 신뢰성 있게 조건화되어 왔다. 이에 따라 얻어진 줄기 세포들은 면역 조절에 관해 신뢰성 있고 일관되게 조건화되는 치료상으로 유효수의 MSC를 제공한다. 다른 실시예들에서, 시스템은 치료법으로서 사용하기 위해 격리되고 정화된 분비 인자들의 소스를 제공한다.
몇몇 실시예들에서, 그러한 방법들은 치료에 사용하기 위해, 예를 들어, 손상(예를 들어, 신경 손상), 이식편대숙주병, 및 자가 면역과 연관된 만성 또는 급성 염증의 억제를 위해 MSC와 같은 조건화된 세포들을 제공할 수 있다. 그러한 조건화된 조성물은 투여시 세포들에 대한 개선된 생착 잠재성을 제공하기 위해 본 명세서에서 논증되었고, 이것은 치료 방법들의 효험을 크게 개선할 수 있다.
특정한 실시예들은 세포 기반의 치료에 사용하기 위해 MSC와 같지만, 여기에 제한되지 않는 증가하는 수의 치료상으로 예측가능하게 조건화된 세포들을 생성하는데 사용하기 위한 시스템을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 기재된 시스템은 특히, 항염증 및 면역 조절 특성들을 나타내기 위해, 예를 들어 이들이 생성하는 그러한 조건화된 세포들 또는 인자들이 손상 부위에 주입될 때 많은 유형의 근골격 외상 및 염증 상태들을 치료하기 위해 MSC들을 조건화하는데 사용될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 이 시스템은 MSC와 같지만, 여기에 제한되지 않는 세포들의 기계 기반의 조건화에 관련하기 위해 유체 역학 미세 환경의 제어를 일체화하는 모듈형 바이오리액터 시스템을 포함한다.
바이오리액터 케이스는 본 발명에 따라 배지 유체의 스트림 내에서 세포들을 조건화하는데 사용된다(예를 들어, 배지는 인가된 전단력을 제공하기 위해 접착 세포들 위에 통과된다). 바이오리액터 케이스의 실시예는 아래에 논의되는 첨부 도면들에서 예시된다.
도 1은 바이오리액터 케이스의 실시예의 공급 캡(12)의 평면도이다. 공급 캡(12)은 제 1 단부(15)와, 제 2 단부(18)와, 그 사이의 벽(13)을 포함한다. 공급 캡(12)은 공급 통로(16)(점선)를 더 포함하고, 공급 통로(16)는 제 1 단부(15)에 근접하고, 입구 유체 커넥터(11)에서 유래하고, 공급 통로(16)로부터 도 1의 관찰자쪽으로 연장하는 라이저 보어(17)에서 종료한다. 도 1의 공급 캡(12)의 실시예에서 공급 통로(16)의 짧은 부분(19)은 라이저 보어(17)에 연결하기 위해 공급 통로(16)에 수직으로 회전한다. 공급 캡(12)은 벽(13)을 둘러싸는 밀봉 면(14)을 포함한다. 장소(50)에서 공급 캡(12) 상에 제 2 라이저 보어가 존재하지 않는다는 것이 주지되어야 한다. 이러한 부재(absence)를 주지하기 위한 이유는 다음에 오는 본 개시의 고려 이후에 명확해질 것이다.
도 2는 유체의 가압된 소스에 연결된 유체 도관(미도시)과 밀봉 가능하게 맞물리기 위해 입구 유체 커넥터(11) 내부의 밀봉부(16)를 나타내는 도 1의 공급 캡(12)의 입면도이다. 화살표는 공급 캡(12)의 제 1 단부(15)에 근접한 라이저 보어(17)의 장소를 나타낸다. 공급 캡(12)의 벽(13)은 공급 캡(12)의 바닥측 상에 있는 것으로 도시된 공급 캡(12)의 외부(20)와 마주보는 공급 캡(12)의 상부측 상에 있는 것으로 도 2 및 도 3에 도시된다. 본 발명의 장치의 실시예들의 캡들 및 모듈들이 기능에 손상을 주지 않고도 달리 배향(oriented)될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
도 3은 공급 캡(12)의 제 1 단부(15)에 근접한 라이저 보어(17)를 통해 취해진 도 1 및 도 2의 공급 캡(12)의 단면도이다. 라이저 보어(17)는 공급 통로(16)로부터 유체를 수용하고, 유체 흐름을 하나 이상의 중간 모듈들(도 3에는 미도시)에 전달하고, 이들 하나 이상의 중간 모듈들 중 적어도 하나는 밀봉 면(14)에 대해 밀봉 가능하게 수용된다.
도 4는 도 1 내지 도 3의 공급 캡(12)의 단면도이다. 도 4는 공급 캡(12)의 제 1 단부(15)에 근접한 입구 유체 커넥터(11)의 장소를 도시하고, 공급 통로(16)는 입구 유체 커넥터(11)로부터 라이저 보어(17)로 연장한다. 공급 캡(12)의 입구 유체 커넥터(11), 공급 통로(16) 및 라이저 보어(17)가 공급 캡(12)의 제 1 단부(15)에 근접하게 배치된다는 것과, 공급 캡(12)의 제 2 단부(18)에 대응하는 유체 통로들이 근접하게 배치되지 않는다는 것이 주지되어야 한다.
도 5는 공급 캡(12)과 밀봉 가능하게 그리고 동작 가능하게 맞물리기 위해 적응된 본 발명의 바이오리액터 케이스의 중간 모듈(30)의 평면도이다. 중간 모듈(30)은 제 1 측부(31) 및 제 2 측부(32)(도 5에는 미도시)를 포함하고, 각각은 공급 캡(12)의 밀봉 면(14)과 맞물리기 위해 밀봉 면(44)을 갖는다. 중간 모듈(30)은, 중간 모듈(30)을 통과하고 중간 모듈(30)의 제 1 단부(47)에 근접한 제 1 모듈 보어(34)를 더 포함한다. 모듈 보어(34)는 중간 모듈(30)의 제 1 측부(31) 상의 밀봉 면(44)과 공급 캡(12)의 대응하는 밀봉 면(14) 사이의 밀봉 가능한 맞물림시 도 1 내지 도 4의 공급 캡(12)의 라이저 보어(17)와 만나고 동일 선상에 있도록 위치된다. 중간 모듈(30)은 제 2 모듈 보어(134)를 더 포함하고, 제 2 모듈 보어(134)는 중간 모듈(30)의 제 2 단부(48)에 근접하고, 제 2 공급 캡(12)과 동일 선상에 있고 맞물리도록 적소에 있다{제 2 공급 캡(12)은 제 1 공급 캡(12)과 동일할 수 있지만, 도 1의 축(60) 주위에서 180도로 회전된다. 제 2 공급 캡(12)이 중간 모듈(30)의 제 2 측부(32) 상에서 밀봉 면(44)과 맞물릴 것이라는 것과, 제 1 공급 캡(12)이 중간 모듈(30)의 제 1 측부(31)의 밀봉 면(44)과 맞물릴 것이라는 것이 이해될 것이다. 공급 캡(12)의 제 2 단부(18)에 근접한 제 2 라이저 보어(17)의 부재가 공급 캡(12)의 밀봉 면(14)으로 하여금 중간 모듈(30)의 제 2 단부(48)에 근접한 중간 모듈(30)의 제 2 모듈 보어(134)를 밀봉하도록 한다는 것이 추가로 이해될 것이다. 공급 캡(12)은 본 발명의 장치의 일실시예에서, 이에 따라 공급 캡(12)이 중간 모듈(30)의 제 1 측부(31)와 맞물리는 제 1 모드에서, 유체의 흐름을 수용하고 이 흐름을 중간 모듈(30)의 제 1 단부(47)로 전달하는 기능을 하고, 제 2 공급 캡(112)이 중간 모듈(30)의 제 2 측부(32)와 맞물리는 역전된 제 2 모드에서, 역전된 제 2 공급 캡(112)의 밀봉 면(44)과의 제 1 공급 캡(12)의 밀봉 면(14)의 맞물림시 제 1 공급 캡(12)의 벽(13)과 중간 모듈(30)의 배리어(39) 사이에 형성된 적어도 제 1 유체 챔버(38A)와, 역전된 제 2 공급 캡(112)의 밀봉 면(114)과의 제 2 공급 캡(112)의 밀봉 면(14)의 맞물림시 역전된 제 2 공급 캡(112)의 벽(113)과 중간 모듈(30)의 배리어(38) 사이에 형성된 제 2 유체 챔버(38B)를 포함하는 복수의 유체 챔버들로부터 유체의 흐름을 수용하는 기능을 하도록 구성될 수 있다. 제 2 공급 캡(112)의 구조는 도 9 내지 도 12와 연계하여 추가로 논의된다.
도 5의 중간 모듈(30)은 확산기 공급 채널(35)을 더 포함하고, 확산기 공급 채널(35)은 중간 모듈(30)의 제 1 단부(47)에 근접하고, 모듈 보어(34)에서 유래하고, 분배 채널(36)에서 종료한다. 확산기 공급 채널(35)은 일반적으로 중간 모듈(30)의 제 1 단부(47)에 근접한 제 1 모듈 보어(34)의 말단에서 분배 채널(36)로 연장한다. 중간 모듈(30)의 분배 채널(36)은 확산기 공급 채널(35)로부터 유체 흐름을 수용하고, 확산기 채널(35)로부터 중간 모듈(30)의 제 1 에지(57)쪽으로 연장하고, 또한 확산기 채널(35)로부터 중간 모듈(30)의 제 2 에지(58)쪽으로 연장한다. 유사하게, 도 5의 중간 모듈(30)은 주입기 배수 채널(135)을 더 포함하고, 주입기 배수 채널(135)은 중간 모듈(30)의 제 2 단부(48)에 근접하고, 주입기(133)에서 유래하고, 수집 채널(136)에서 종료한다. 주입기 배수 채널(135)은 일반적으로 중간 모듈(30)의 제 2 단부(48)에 근접한 제 2 모듈 보어(134)에 근접하여 수집 채널(136)로 연장한다. 중간 모듈(30)의 수집 채널(136)은 주입기(133)로부터 유체 흐름을 수용하고, 이 유체 흐름을 주입기 배수 채널(135)을 통해 제 2 모듈 보어(134)에 향하게 한다.
도 6은, 제 1 유체 챔버(38A) 내에 배치된 복수의 유체 확산기(33), 제 2 유체 챔버(38B) 내에 배치된 복수의 유체 확산기(33), 제 1 유체 챔버(38A) 내에 배치된 복수의 유체 주입기(133), 및 제 2 유체 챔버(38B) 내에 배치된 복수의 유체 주입기(133)의 위치 지정(positioning)을 나타내는 도 5의 중간 모듈(30)의 입면도이고, 복수의 유체 확산기(33)는 중간 모듈(30)의 제 1 단부(47)에 근접하고, 복수의 유체 주입기(133)는 중간 모듈(30)의 제 2 단부(48)에 근접하다. 본 명세서에 사용된 "확산기"라는 용어가 속도를 감소시키고 유체의 정압력을 증가시키기 위한 디바이스를 의미한다는 것이 이해될 것이다. 본 명세서에 사용된 "주입기"라는 용어가 저속, 고압 흐름을 수용하고 더 높은 속도의 더 낮은 압력 흐름으로 변환하기 위한 디바이스를 의미한다는 것이 이해될 것이다.
도 7은 도 6의 중간 모듈(30)의 입면도의 제 2 단부(48)에서 복수의 연결된 유체 통로들 및 확산기들(133)의 확대도이다. 첨부도에 도시된 본 발명의 장치의 실시예에서 유체 통로들의 배열이 그 기능을 실질적으로 변경하지 않고도 상이한 방식들로 배열될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 도 7은 이를 통과하는 제 2 모듈 보어(34)를 갖는 중간 모듈(30)을 나타낸다. 제 2 모듈 보어(134)는 중비기 배수 채널(135)을 통해 수집 채널(136)에 유동학적으로 연결된다. 수집 채널(136)은 도 7의 관찰자에 의해 보여지듯이, 페이지 안 및 페이지 밖으로 연장하여, 대응하는 복수의 포트 채널(137)을 통해 복수의 확산기(133)와 유동학적으로 연결한다. 유체는 배리어(39)에 의해 서로 분리되는 제 1 유체 챔버(38A) 및 제 2 유체 챔버(38B)에 들어가고, 확산기(133), 포트 채널(137), 수집 채널(136), 제 2 모듈 보어(134)로의 주입기 배수 채널(135)에 들어간다. 도 7이 제 1 및 제 2 유체 챔버들(38A 및 38B)로 연장하는 복수의 포트 채널(137)의 부분(40)을 도시하는 것이 주지될 것이다.
도 8은 제 1 흐름 챔버(38A) 및 제 2 흐름 챔버(38B)로부터 흐름을 수용하는 주입기(133)의 장소들을 나타내는 도 5 내지 도 7의 중간 모듈의 단면도이다. 도 8이 또한 흐름을 제 1 흐름 챔버(38A) 및 제 2 흐름 챔버(38B)에 도입하는 확산기(33)의 장소들을 나타내는 중간 모듈(30)의 단면도로서 보여질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 도 8은 주입기(133){중간 모듈(30)의 제 2 단부(48)에서} 및 확산기(33){중간 모듈(30)의 제 1 단부(47)에서}의 이격(spacing)을 도시한다.
도 9는 본 발명의 바이오리액터 케이스의 실시예의 배수 캡(112)의 평면도이다. 배수 캡(112)은 제 1 단부(115) 및 제 2 단부(118)와, 그 사이의 벽(113)을 포함한다. 배수 캡(112)은 배수 통로(116)(점선)를 더 포함하고, 배수 통로(116)는 제 1 단부(115)에 근접하고, 라이저 보어(117)에서 유래하고, 출구 유체 커넥터(111)에서 종료한다. 라이저 보어(117)는 배수 통로(116)로부터 도 9의 관찰자쪽으로 연장한다. 도 9의 배수 캡(112)의 실시예에서 배수 통로(116)의 짧은 부분(119)은 라이저 보어(117)에 연결하기 위해 배수 통로(116)에 수직으로 회전한다. 배수 캡(112)은 벽(113)을 둘러싸는 밀봉 면(114)을 포함한다.
도 10은 바이오리액터(10)로부터 조건화된 유체를 수용하기 위해 컬렉터에 연결된 유체 도관(미도시)과 밀봉 가능하게 맞물리도록 출구 유체 커넥터(111) 내부의 밀봉부(116)를 나타내는 도 9의 배수 캡(112)의 입면도이다. 화살표는 라이저 보어(117)의 위치를 나타낸다. 배수 캡(112)의 벽(113)은 배수 캡(112)의 바닥측 상에 있는 것으로 도시된 배수 캡(112)의 외부(120)와 마주보는 배수 캡(112)의 상부측 상에 있는 것으로 도시된다. 본 발명의 장치의 실시예들의 캡들 및 모듈들이 기능에 손상을 주지 않고도 달리 배향될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
도 11은 라이저 보어(117)를 통해 취해진 도 9 및 도 10의 배수 캡(112)의 단면 입면도이다. 라이저 보어(117)는 중간 모듈(30)(도 5 내지 도 8을 참조)의 제 2 모듈 보어(134)에 의해 제 1 유체 챔버(38A) 및 제 2 유체 챔버(38B)로부터 유체를 수용하고, 중간 모듈(30)의 제 1 측부(31)의 밀봉 면(44)에 대해 밀봉 가능하게 수용된 밀봉 표면(114)을 갖는 배수 캡(112)에 흐름을 전달한다.
도 12는 도 9 내지 도 11의 배수 캡(112)의 단면 입면도이다. 도 12는 배수 캡(112)의 제 1 단부(115)에 근접한 출구 유체 커넥터(111)와, 출구 유체 커넥터(111)로부터 라이저 보어(117)로 연장하는 배수 통로(116)의 장소를 도시한다. 배수 캡(112)의 출구 유체 커넥터(111), 배수 통로(116) 및 라이저 보어(117)는 배수 캡(112)의 제 1 단부(115)에 근접하게 배치된다는 것과, 대응하는 유체 통로들이 제 2 단부(118)에 근접하게 배치되지 않는다는 것이 주지되어야 한다.
도 13은 본 발명의 조립된 바이오리액터 케이스(10)의 사시도이며, 공급 캡(12) 및 배수 캡(112)의 입구 유체 커넥터(11) 및 출구 유체 커넥터(111) 각각은 도 13으로부터 생략되어, 공급 캡(12)의 라이저 보어(17), 배수 캡(112)의 라이저 보어(117)의 위치 지정을 더 잘 드러내고, 제 1 모듈 보어는 바이오리액터(10)의 흐름 챔버들(38A 및 38B) 내에 배치된 줄기 세포들을 조건화하는데 사용될 유체를 함유하는 베슬(미도시)에 연결 가능하고, 출구 유체 커넥터(111)(미도시)는 바이오리액터로부터 조건화된 유체를 수용하기 위해 베슬에 연결 가능하다.
도 13에 도시된 조립된 바이오리액터 케이스(10)가 공급 캡(12), 배수 캡(112), 및 그 사이의 중간 모듈(30)을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 바이오리액터 케이스(10)를 통하는 유체의 흐름율 및 흐름 방향이 압력 차이{유체 입구 커넥터(11)에서의 압력과 유체 출구 커넥터(111)에서의 압력 사이의 차이}, 바이오리액터(10)를 통하는 유체 흐름에 대한 저항, 유체의 점도 및 다른 인자들에 좌우된다는 것이 추가로 이해될 것이다. 공급 캡(12), 중간 모듈(30) 및 배수 캡(112)은 클램프, 밴드, 타이 등의 이용을 포함하는 다양한 방식들로 도 13의 바이오리액터 케이스(10)의 조립된 구성에 고정될 수 있다.
대안적으로, 공급 캡(12), 중간 모듈(30) 및 배수 캡(112)은 상호 인력(mutual attraction)을 위해 배향된 내장되거나 연결된 자기 부재들을 갖는 중간 모듈(30), 공급 캡(12), 및 배수 캡(112)을 제공함으로써 도 13의 바이오리액터 케이스(10)의 조립된 구성에 고정될 수 있다. 도 14 및 도 15는 공급 캡(12)의 둘레를 따르는 복수의 위치들에 내장된 복수의 희토류 자석(49)을 갖는 바이오리액터 케이스(10)의 실시예를 도시하고, 대응하는 복수의 희토류 자석은 배수 캡(112)의 둘레를 따라 정렬된 위치들에 내장될 수 있다.
이제 도 16 및 도 17을 참조하면, 바이오리액터 케이스(200)의 다른 실시예가 각각 사시도 및 입면도로 도시된다. 명백함을 위해, 모든 요소들이 각 도면에서의 도면 부호들로 라벨이 붙여지는 것은 아니다. 바이오리액터 케이스(200)는 입구 유체 공급 플레이트(212), 복수의 중간 모듈 플레이트(232), 및 베이스 모듈 플레이트(234)를 포함한다. 각 중간 모듈 플레이트(232)는 제 1 단부(233), 제 2 단부(235), 제 1 측부(273), 및 제 2 측부(275)를 포함한다. 더욱이, 중간 모듈 플레이트(232)는 입구 유체 공급 플레이트(212)와 베이스 모듈 플레이트(234) 사이에 수직으로 적층된다.
도 18 및 도 19에 도시된 바와 같이, 바이오리액터 케이스(200)는 모듈형 세포 조제 장치(300)에서 구성 요소로서 조립될 수 있다. 도 18 및 도 19에 도시된 실시예에서, 복수의 모듈형 세포 조제 장치(300)는 세포 조제 시스템(400)에서 구성 요소들로서 조립된다. 세포 조제 시스템(400)은 다중 모듈형 세포 조제 장치(300)를 지원하도록 구성된 베이스(450)를 포함한다. 도시된 실시예에서, 각 세포 조제 시스템은 바이오리액터 케이스(200), 용기(220), 제 1 하우징(271), 제 2 하우징(272) 및 펌프(250)를 포함한다. 용기(220)는 공급 도관(215) 및 복귀 도관(225)을 통해 바이오리액터 케이스(200)와 유체 왕래한다.
이제 특히 도 16 및 도 17을 참조하면, 바이오리액터 케이스(200)는 제 1 유체 입구(211) 및 제 1 유체 출구(221)를 갖는 중앙 채널(217)을 갖는 입구 유체 공급 플레이트(212)를 포함한다. 입구 유체 공급 플레이트(212)는 또한 제 2 유체 입구(231) 및 제 2 유체 출구(241)를 포함한다. 도 18 및 도 19에 도시된 바와 같이, 제 1 유체 입구(211) 및 제 2 유체 출구(241)는 용기(220)에 연결될 수 있는 한편, 제 1 유체 출구(221) 및 제 2 유체 입구(231)는 펌프(250)에 연결될 수 있다. 특정한 실시예들에서, 펌프(250)는 롤러{예를 들어, 연동(peristaltic)} 펌프로서 구성될 수 있다. 펌프(250)는 롤링 요소(252) 및 압축 가능 도관(254)을 포함한다. 동작 동안, 롤링 요소(252)는 전기 모터(260)에 의해 회전된다. 용기(220)로부터의 유체는 도관(215)을 통해 제 1 유체 입구(211)에 유입되고, 중앙 채널(217) 및 제 1 유체 출구(221)를 통해 압축 가능 도관(254)에 유입된다. 유체는 그런 후에 제 2 유체 입구(231)와, 중간 모듈 플레이트(232)와 유체 왕래하는 분배 포트(238)로 향하게 된다.
중간 모듈 플레이트(232) 각각은 분배 포트(238)와 유체 왕래하는 입구 포트(237)를 포함한다. 각 중간 모듈 플레이트(232)는 입구 포트(237)와 유체 왕래하는 분배 채널(253)을 더 포함한다. 각 분배 채널(253) 및 입구 포트(237)는 중간 모듈 플레이트(232)의 제 1 단부(233)에 근접한다. 각 분배 채널(253)은 배양 플레이트(239)를 가로질러 연장하고, 배양 플레이트(239) 위에 유체를 분배한다. 배양 플레이트(239)를 가로질러 흐른 후에, 유체는 각 중간 모듈 플레이트(232)에서 복귀 포트(261)와 유체 왕래하는 수집 채널(263)에 의해 수집된다. 수집 채널(263) 및 복귀 포트(261)는 중간 모듈 플레이트(232)의 제 2 단부(235)에 근접한다. 따라서, 유체는 수집 채널(263)에 들어가기 위해 배양 플레이트(239)를 가로질러 흘러야 한다. 복귀 포트(261)는 복귀 도관(225)을 통해 용기(220)와 유체 왕래하는 제 2 유체 출구(241)와 추가로 유체 왕래한다.
분배 채널(253)로부터 수집 채널(263)로의 유체 배양 플레이트(239)의 흐름은 배양 플레이트(239) 상의 세포들에 전단 응력을 가한다. 용기(220)로부터 펌프(250)를 통해 바이오리액터 케이스(200){다중 중간 모듈 플레이트(232) 및 배양 플레이트(239)를 포함}를 통해 유체를 재순환할 수 있는 능력은 전단 응력이 연장된(이론적으로 제한되지 않은) 시간 기간 동안 인가되도록 한다.
예시적인 실시예들에서, 배양 플레이트(239) 상의 세포들에 인가된 전단 응력의 양을 균일한 레벨로 제어하는 것과, 배양 플레이트(239) 상의 상이한 장소들에서 인가된 전단 응력에서의 차이들을 최소화하는 것이 바람직하다. 세포들에 균일하게 인가된 전단 응력을 유지하는데 있어서 한 가지 인자는 세포들 및 배양 플레이트(239)에 대한 유체 배지의 속도이다. 유체 속도에서의 변동들을 감소하는 것은 더 균일하게 인가된 전단 응력을 유지하는데 도움을 줄 수 있다. 도 16에 도시된 바와 같이, 분배 채널(253) 및 수집 채널(263)은 중간 모듈 플레이트(232)의 표면의 폭(W){예를 들어, 중간 모듈 플레이트(232)의 제 1 측부(273)와 제 2 측부(275) 사이의 치수}을 가로질러 실질적으로 연장한다. 특정한 실시예들에서, 분배 채널(253) 및 수집 채널(263)의 길이(L){예를 들어, 중간 모듈 플레이트(232)의 치수(W)에 평행하게 측정된 채널들의 각 단부 사이의 거리}는 중간 모듈 플레이트(232)의 대부분의 폭(W)을 가로질러 연장한다. 특정한 실시예들에서, 길이(L)는 폭(W)의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%이다. 이 구성은 예를 들어, 대부분의 배양 플레이트(239)를 가로질러 연장하지 않는 입구 및 출구 포트들에 비해 배양 플레이트(239)를 가로지르는 유체 배지의 더 균일한 속도를 제공할 수 있다. 배양 플레이트(239)에 접착된 세포들은 다시 더 균일한 전단 응력을 받을 것이다.
세포들에 인가된 전단 응력의 레벨은 또한 다양한 동작 파라미터들을 조정함으로써 제어될 수 있다. 예를 들어, 펌프(250)를 통해 유체에 인가된 압력은, 롤링 요소(252)가 압축 가능 도관(254)을 압축하는 양을 조정함으로써 변경될 수 있다. 배양 플레이트(239)를 가로질러 흐르는 유체의 부피 및 속도는 또한 전기 모터(260)의 속도를 변경함으로써 조정될 수 있고, 이것은 다시 롤링 요소(252)의 호전 속도를 변경할 것이다. 추가 제어는 표면 마무리(예를 들어, 강성도), 배양 플레이트(239)의 길이 및 폭 뿐 아니라 중간 모듈 플레이트(232) 사이의 거리를 포함하지만, 여기에 제한되지 않는 구성 요소들에 대한 특정한 치수들 및 기하학적 구조들의 선택에 의해 달성될 수 있다.
더욱이, 수직 적층에서 배양 플레이트(239)와 함께 복수의 중간 모듈 플레이트(232)의 이용은 증가된 수의 세포들이 전단 응력을 받게 할 수 있다. 더욱이, 세포 조제 시스템(400)에서 평행하게 동작하는 다중 모듈형 세포 조제 장치(300)의 이용은 추가 처리 또는 분석을 위한 준비시 전단 응력을 받는 세포들의 수를 더 증가시킬 수 있다.
특정한 실시예들에서, 모듈형 세포 조제 장치(300){개별적으로 또는 세포 조제 시스템(400)에서의 구성 요소들로서 동작하는}는 제어된 방식으로 MSC와 같지만, 여기에 제한되지 않는 세포들의 기계 형질 도입 조건화를 지시하기 위해 유체 역학 미세 환경을 제어하도록 동작될 수 있다. 예로서, 본 명세서에 제공된 연구는, 기재된 방법들 및 장치가 면역 조절 인자들의 유도 및 배출을 포함하지만, 여기에 제한되지 않는 특정한 활성을 발현하기 위해 그러한 세포들을 조건화하는데 필요한 바와 같이 균일하고 제어 가능한 전단 응력을 받게 함으로써 예를 들어 MSC를 포함하는 세포 집단들을 조건화한다는 것을 증명한다.
아래의 예들에 제공된 연구는, 인간의 세포 배양, 예를 들어 MSC가 전단 응력을 부여할 수 있는 능력의 규모에서 더욱 더 제한되고 덜 준비되는 디바이스를 이용하여 비록 덜 융통성 있는 시스템을 사용하더라도, 본 장치에 의해 제공된 것과 유사한 유형의 전단 응력을 받는 방법들을 증명한다. 하지만, 이들 연구는, 전단 응력이 면역 조절 인자들의 유도 및 배출과 같지만, 여기에 제한되지 않는 특정한 활성을 발현하기 위해 세포들을 조건화하는데 사용될 수 있다는 것을 예시한다.
본 명세서에 제공된 결과들은, 기능적 MSC들이 항염증 및 면역 조절 인자들을 발현하고 생성하도록 직접 조건화될 수 있다. 세포 치료법의 정황에서, 이러한 기술은 손상 또는 질병과 연관된 염증에 의해 또는 염증에 대한 위험에서 영향을 받는 환자들에게 완화를 제공할 가망이 있다. 이것은, 본 시스템에 의해 제공된 유형의 전단 응력을 이용하는 MSC들의 조건화가 기존의 염증 유발 환경들에서 염증 세포들을 막을 수 있는 능력을 상당히 증가시키고, 염증의 방지 및 소실(resolution)에 도움을 줄 수 있다.
더욱이, 본 명세서에 기재된 시스템을 이용함으로써, 조건화는 예를 들어, 항염증 분자들의 생성을 포함하는 유도 MSC 세포 면역 조절 활성의 대안적으로 이용 가능한 기술들을 이용할 때보다 더 빠르고, 균일하고 신뢰성 있게 완료될 수 있다. 세포들을 조건화하도록 기재된 시스템은, 환자의 자체(자가) 세포들이 치료법으로서 사용되고 세포 확장 및 조건화를 위한 방법이 요구될 때 특히 유리할 수 있다.
조건화의 부재시, 미성숙(naive) MSC들은 다기능 항염증 단백질 TNF-α 자극된 단백질 6(TSG-6), 프로스타글란딘 E2(PGE2), 및 인터루킨 (IL)-1 수용체 작용제(IL1RN)와 같은 면역 억제의 핵심 매개체들을 거의 발현하지 않거나 전혀 발현하지 않는다. 아래의 예들에 상세히 기술된 바와 같이, 3개의 인간의 조직 소스들, 골수, 지방질, 및 양수로부터 도출된 MSC들은 모두 면역 조절 신호 발신의 활성화가 가변 정도로 검출 가능하도록 전단 응력 기반의 조건화의 이러한 시스템에 반응하는 것으로 발견되었다. 특히, 본 시스템에 의해 제공된 유형의 층류 전단 응력을 이용하여 조건화된 인간의 골수-도출된 MSC들의 평가는 MSC 유전자 인코딩 TSG-6, COX-2, IL1Ra, HMOX-1, LIF, 및 KLF2의 전사시 6배 내지 120배 증가를 갖는 유전자 발현의 극심한 상향 조절을 자극했다.
예시적인 실시예들은 조건화된 세포들의 집단을 제공하기 위한 방법들을 포함하며, 방법은 세포들의 집단을 획득하고, 세포들에 제어된 전단 응력을 가하는 단계를 포함한다. 특정한 실시예들은 조건화된 세포들의 집단을 제공하기 위한 방법들을 포함하며, 방법은 세포들의 집단을 획득하는 단계; 세포 배지에서 상기 세포들을 배양하는 단계; 및 세포들을 조건화하기 위해 세포들에 충분한 힘의 제어 가능한 전단 응력을 가하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 세포들은 포유류로부터 원래 획득된다. 몇몇 실시예들에서, 세포들은 반려 동물로부터 원래 획득된다. 바람직한 실시예들에서, 세포들은 인간으로부터 원래 획득된다. 몇몇 실시예들에서, 세포들은 골수로부터 원래 획득된다. 몇몇 실시예들에서, 세포들은 다른 실시예들에서와 동시에 양수로부터 원래 획득된다. 몇몇 실시예들에서와 동시에, 세포들은 지방 조직으로부터 원래 획득된다. 몇몇 실시예들에서, 제어된 전단 응력을 받는 세포들은 MSC이다.
추가 실시예들에서, 치료상으로 유효수의 조건화된 세포들을 획득하는 방법들이 존재한다. 몇몇 실시예들에서, 본 명세서에 기재된 장치 및 방법들을 이용하여 조건화된 치료상으로 유효수의 세포들을 획득하는 방법들이 존재한다. 몇몇 실시예들에서, 방법을 이용하여 조건화된 치료상으로 유효수의 세포들을 획득하는 방법들이 존재하며, 방법은 세포들의 집단을 획득하는 단계; 원하는 대로 작용하기 위해 그러한 세포들을 조건화하는데 충분한 힘의 제어된 전단 응력을 인가하는 단계를 포함한다. 몇몇 다른 실시예들에서, 방법을 이용하여 조건화된 치료상으로 유효수의 세포들을 획득하는 방법들이 존재하며, 방법은 세포들의 집단을 획득하는 단계; 원하는 대로 작용하기 위해 그러한 세포들을 조건화하는데 충분한 힘의 제어된 전단 응력을 인가하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 방법을 이용하여 조건화된 치료상으로 유효수의 세포들을 획득하는 방법들이 존재하며, 방법은 세포들의 집단을 획득하는 단계; 세포 배지에서 제 1 배양 표면 상에 세포들을 배양하여, 세포들이 제 1 배양 표면 상에 접착하는 단계; 및 원하는 대로 작용하기 위해 그러한 세포들을 조건화하는데 충분한 힘의 제어된 전단 응력을 인가하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 방법을 이용하여 조건화된 치료상으로 유효수의 세포들을 획득하는 방법들이 존재하며, 방법은 세포들의 집단을 획득하는 단계; 세포 배지에서의 배양 표면 상에 세포들을 배양하여, 세포들이 배리어 상에 접착하는 단계; 및 원하는 대로 작용하기 위해 그러한 세포들을 조건화하는데 충분한 힘의 제어된 전단 응력을 인가하는 단계를 포함한다.
유사한 실시예들에서, 조건화된 세포들의 집단을 제공하기 위한 방법들이 존재하며, 방법들은 세포들의 집단을 획득하는 단계; 세포 배지에서 배양 시스템에서 세포들을 배양하여, 세포들이 배리어에 접착하는 단계; 상기 세포들을 조건화하는데 충분한 힘의 제어된 유체 층류 전단 응력을 제공하기 위해 상기 세포들 위에 세포 배지를 통과하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 조건화된 세포들은 항염증 활성을 발현한다. 몇몇 실시예들에서, 항염증 활성을 발현한다. 몇몇 실시예들에서, 항염증 활성은 TSG-6, COX-2, IL1RN, HMOX-1, LIF, 또는 KLF2를 인코딩하는 것을 포함하는 그룹으로부터 선택된 유전자의 증가된 발현을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 활성은 조건화된 세포들에 의한 COX2 단백질의 증가된 발현을 포함한다.
추가 실시예들은 청구항 1 내지 10에 기재된 장치에서 제어된 전단 응력을 이용하여 조건화된 세포들을 포함하는 조성물을 포함한다. 몇몇 실시예들은 방법을 이용하여 조건화된 세포들을 포함하는 조성물을 포함하며, 방법은 세포들의 집단을 획득하는 단계; 세포 배지에서 배양 시스템에서 상기 세포들을 배양하여, 세포들이 배리어에 접착하는 단계; 및 상기 세포들을 조건화하는데 충분한 힘의 유체 층류 전단 응력을 인가하는 단계를 포함한다. 유사한 실시예들에서, 조건화된 세포들의 집단을 제공하기 위한 방법을 이용하여 조건화된 세포들을 포함하는 조성물이 존재하며, 방법은 세포들의 집단을 획득하는 단계; 세포 배지에서 배양 시스템에서 세포들을 배양하여, 세포들이 배리어에 접착하는 단계; 상기 세포들을 조건화하는데 충분한 힘의 유체 층류 전단 응력을 제공하기 위해 상기 세포들 위에 상기 세포 배지를 통과하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 조성물은 항염증 활성을 발현하는 조건화된 세포들을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 항염증 활성은 TSG-6, COX-2, IL1RN, HMOX-1, LIF, 또는 KLF2를 인코딩하는 것을 포함하는 그룹으로부터 선택된 유전자의 증가된 발현을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 조성물은 COX2 단백질의 증가된 레벨을 포함하는 조건화된 세포들을 포함한다. 추가 실시예들에서, 기재된 디바이스 및 방법들은 배지로부터 격리될 수 있고 치료법으로서 사용될 수 있는 항염증 인자들의 발현 및 배출을 자극하는데 사용될 수 있다.
추가 실시예들에서, 기재된 방법들에 의해 조건화된 세포들과의 그러한 치료를 필요로 한 환자를 치료하는 방법들이 존재한다. 대안적인 실시예들에서, 그러한 치료를 필요로 한 환자를 치료하는 방법들은 기재된 방법들을 이용하여 조건화된 세포들에 의해 배출된 인자들을 포함할 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 환자를 치료하는 방법들은 기재도니 시스템에 따라 생성된 조건화된 세포들의 집단을 획득하는 단계, 및 치료가 필요한 환자에게 세포들을 투여하는 단계를 포함하지만, 여기에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예들에서, 환자는 항염증 치료법을 필요로 하고, 세포들의 집단은 기재된 시스템을 이용하여 항염증 활성이 유도된 인간의 MSC이다. 몇몇 실시예들에서, 그러한 세포들의 치료 용량은 치료가 필요한 환자에 도입되는 적어도 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 또는 1x106 세포들을 포함할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 조건화된 세포 집단의 항염증 활성은 정형 외과 또는 척수 손상 또는 외상성 뇌손상과 같은 근골 손상과 같지만, 여기에 제한되지 않는 급성 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
세포 배양 조건화 시스템들은 본 명세서에서 다양한 실시예들에 기재되고, 당업자에게 알려진 바와 같이, 세포들의 배양 및 유지를 위한 추가 방법들이 본 실시예들과 함께 사용될 수 있다는 것이 인식된다. 특정한 실시예들에서, 배양을 위해, 다양한 기질 성분들은 인간의 줄기 세포들을 배양, 유지 또는 차별화하는데 사용될 수 있다. 아래의 예들에 기재된 것들 외에도, 예를 들어, 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 라미닌 및 비트로넥틴은 조합하여 다능성 세포 성장을 위한 고체 지지부를 제공하는 수단으로서 배양 표면을 코팅하는데 사용될 수 있다. MatrigelTM은 또한 인간의 다능성 줄기 세포들의 세포 배양 및 유지를 위한 기재를 제공하는데 사용될 수 있다. MatrigelTM은 생쥐 종양 세포들에 의해 분비된 젤라틴 단백질 혼합물이고, BD Biosciences(미국, 뉴 저지)로부터 상업적으로 이용 가능하다. 이러한 혼합물은 많은 조직들에서 발견된 복잡한 세포외 환경을 복제하고, 세포 배양을 위한 기재로서 세포 생물학자에 의해 사용된다.
세포 배양의 몇몇 실시예들에서, 일단 배양 컨테이너가 가득 찼으면{예를 들어, 융합성(confluent)}, 군체(colony)는 해리에 적합한 임의의 방법에 의해 응집된 세포들 또는 심지어 단일 세포들로 분할되고, 이 세포들은 그런 후에 통과를 위한 새로운 배양 컨테이너들에 위치된다. 세포 통과 또는 분할은 연장된 시간 기간 동안 배양된 상태 하에서 세포들이 생존하고 성장하도록 하는 기술이다. 세포들은 일반적으로 약 70% 내지 100% 융합성일 때 통과된다.
특정한 양상들에서, 본 조건화 시스템을 위한 시작 세포들은 적어도 또는 약 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 세포들 또는 그 안에서 도출가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 시작 세포 집단은 적어도 또는 약 10, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 세포/mL, 또는 그 안에서 도출가능한 임의의 범위의 파종 밀도(seeding density)를 가질 수 있다.
기저 배지로서, 아래의 예들에 기재된 것 외에도, 이글의 기저 배지(BME), BGjb, CMRL 1066, Glasgow MEM, 개선된 MEM Zinc Option, Iscove의 변형된 Dulbecco의 배지(IMDM), 배지 199, Eagle MEM, αMEM, DMEM, Ham, RPMI 1640, 및 피셔의 배지와 같은 한정된 배지를 포함하는 범위의 배지가 이용 가능하다. 실시예들에 따라 사용될 수 있는 배지의 추가 예들은 제한 없이, Lonza Therapeak(화학적으로 한정된) 배지, Irvine Scientific Prime-XV(SFM 또는 XSFM), PromoCell MSC 성장 배지(DXF), StemCell Technologies Mesencult(ACF), 또는 인간의 혈소판 또는 혈소판-용해질이 풍부한 배지를 포함한다.
추가 실시예들에서, 배지는 또한 B-27 보충물, 인슐린, 트랜스페린, 및 셀레늄(ITS) 보충물, L-글라타민, NEAA(비-필수 아미노산), P/S(페니실린/스트렙토마이신), N2 보충물(5μg/mL 인슐린, 100μg/mL 트랜스페린, 20 nM 프로제스테론, 30 nM 셀레늄, 100μM 푸트레신 및 β-메르캡토에탄올(β-ME)과 같은 보충물을 함유할 수 있다. 피브로넥틴, 라민, 헤파린, 헤파린 설페이트, 레티녹산을 포함하지만, 여기에 제한되지 않는 추가 인자들이 첨가될 수 있거나, 첨가되지 않을 수 있다는 것이 구상된다.
추가 인자들은 조건화된 세포들의 집단과 같이 조건화된 조성물을 생성하기 위한 전단 응력과 연계하여 사용하기 위한 배지에 첨가될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시예들에서, 조혈의 적어도 하나의 화학적 조정자는 생체 역학적 자극 이전에, 그 동안에, 또는 그 후에 적용될 수 있다. 배지에 첨가될 수 있는 추가 성분들의 예들은 제한 없이, 아테놀올, 디곡신, 독사조신, 독시시클린, 펜딜린, 히드랄라진, 13-히드록시옥타데카디에녹산(13(s)-HODE), 라나토시드 C, NG-모노메틸-L-아르지닌(L-NMMA), 메토프롤롤, 네리폴린, 니카르디핀, 니페디핀, 니트릭 산화물(NO) 또는 NO 신호 발신 경로 작용제, 1H-[1,2,4]옥사디아졸로-[4,3-a]퀴녹살린-1-원(ODQ), 페루보시드, 핀돌올, 프론에탈올, 시냅토소말 단백질(SNAP), 니트로프루시드 나트륨, 스트로판티딘, 토드랄라진, 1,5-펜타메틸렌에테트라졸, 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 메틸 에스테르, PGE2 세리놀 아미드, 11-데옥시-16,16-디메틸 PGE2, 15(R)-15-메틸 PGE2, 15(S)-15-메틸 PGE2, 6,16-디메틸 PGE2, 16,16-디메틸 PGE2 p-(p-아세타미도벤자미도) 페닐 에스테르, 16-페닐 테트라노르 PGE2, 19(R)-히드록시 PGE2, 프로스타글란딘 B2, 프로스타시클린(PGI2, 에포프로스테놀), 4-아미노피리딘, 8-브로모-cAMP, 9-데옥시-9-메틸렌 PGE2, 9-데옥시- 9-메틸렌-16,16-디메틸 PGE2, PGE2 수용체 작용제, 밥타-AM, 벤포티아민, 비쿠클린, (2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심(BIO), 브라디키닌, 부타프로스트, CaylO397, 클로로트리아니센, 클로르프로프아미드, 디아족시드, 에이코사트리엔산, 에폭시에이코사트리엔산, 플루란드렌올리드, 포르스콜린, 가복사돌, 갈라민, 인다닐옥시아세틱산 94(IAA 94), 이미프르아민, 키누레닉산, L-아르지닌, 리놀레산, LY171883, 메드산, 메베베린, 12 메톡시도데세노익산, N-포르밀-Met-Leu-Phe, 프로스타글란딘 E2 수용체 EP2-선택 작용제(ONO-AEl-259), 페루보시드, 피모지드, 핀돌올, 니트루프루시드 나트륨, 바나데이트 나트륨, 스트로판티딘, 설프로스톤, 티아벤다졸, 베사미콜, 1,2-디데카노일-글리세롤(10:0), 11,12 에폭시에이코사트리엔산, 1-헥사데실-2-아라치도노일-글리세롤, 5-히드록시데카노에이트, 6-포르미린돌올[3,2-B] 카르바졸, 아난드아미드(20:3,n-6), 카르바시클린, 카르바밀-플라텔렛-활성 인자(C-PAF), 또는 S-파르네실-L-시스테인 메틸 에스테르를 포함한다.
추가 양상들에서, 배지는 표피 성장 인자 군의 멤버, 예를 들어, EGF, FGF2 및/또는 FGF8을 포함하는 섬유모세포 성장 인자 군(FGF)의 멤버, 플라틀릿 도출된 성장 인자 군(PDGF)의 멤버, 노긴(noggin), 폴리스타틴(follistatin), 초르딘(chordin), 그레믈린(gremlin), 케르베루스/DAN 군 단백질, 벤트로핀 암니온리스를 포함하지만, 여기에 제한되지 않는 변형 성장 인자(TGF)/골 형성 단백질(BMP)/성장 및 차별 인자(GDF) 인자 군 작용제와 같은 하나 이상의 성장 인자들을 포함할 수 있고, TGF, BMP, 및 GDF 작용제는 또한 TGF, BMP, 및 GDF 수용체-Fc 키메라의 형태로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있거나 첨가되지 않을 수 있는 다른 인자들은 델타-형 및 재그형(Jagged) 군의 단백질 뿐 아니라 감마 세크레타제 억제제 및 DAPT와 같은 노치 처리 또는 분할(cleavage)의 다른 억제제를 포함하지만, 여기에 제한되지 않는, 노치 수용체 군을 통해 신호 발신하여 활성화하거나 비활성화할 수 있는 분자를 포함한다. 추가 성장 인자들은 인슐린형 성장 인자 군(IGF), 무익(wingless) 관련(WNT) 인자 군, 및 헤지호그(hedgehog) 인자 군의 멤버들을 포함할 수 있다.
또 다른 양상들에서, 배지는 항염증 사이토카인, LPS, PHA, 폴리 I:C, 및/또는 ConA와 같은 하나 이상의 프라이밍제를 포함할 수 있다. 실시예들에 따라 사용될 수 있는 추가 프라이밍제는 본 명세서에서 참고용으로 병합되는, 2009년, Wagner 등에 상세히 기재된 것을 포함한다. 추가 인자들은 디메틸-프로스타글란딘 E2, 일로프로스트, 아라키돈산 대사의 다른 유사한 생성물을 포함하지만, 여기에 제한되지 않는, 세포 전구 증식 및 생존뿐 아니라 재생 및 차별을 촉진하기 위해 추가 차별 배지에 특히 첨가될 수 있다.
배지는 세륨 함유 또는 무-세륨 배지일 수 있다. 무-세륨 배지는 처리되지 않거나 정화되지 않은 세륨을 갖지 않는 배지를 언급할 수 있고, 이에 따라, 정화된 혈액-도출된 성분들 또는 동물성 조직-도출된 성분들(성장 인자들과 같은)을 갖는 배지를 포함할 수 있다. 비균질 동물-도출된 성분들을 갖는 오염물을 방지하는 양상으로부터, 세륨은 세포(들)의 것과 동일한 동물로부터 도출될 수 있다.
배지는 세륨의 임의의 대안을 포함할 수 있거나, 포함하지 않을 수 있다. 세륨에 대한 대안은 알부민(지질이 풍부한 알부민, 재조합 알부민과 같은 알부민 대체물, 식물성 녹말, 덱스트란 및 단백질 히드로리세이트와 같은), 트랜스페린(또는 다른 철 트랜스포터), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 트레이스 요소, 2-메르캅토에탄올, 3'-티올글리세롤, 또는 이들의 등가물들을 적절히 함유하는 물질들을 포함할 수 있다. 세륨에 대한 대안들은 예를 들어, 국제 공보 번호 WO98/30679에 개시된 방법에 의해 조제될 수 있다. 대안적으로, 임의의 상업적으로 이용 가능한 물질들은 더 많은 편리함을 위해 사용될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 물질들은 녹아웃 세륨 대체물(KSR), 화학적으로 한정된 지질 농축형(Gibco), 및 Glutamax(Gibco)를 포함한다.
배지는 또한 지방산 또는 지질, 아미노산(비필수 아미노산), 비타민(들), 성장 인자들, 사이토카인, 항산화 요소, 2-메르캅토에탄올, 피루브산, 완충제(buffering agents), 및 무기 염을 함유할 수 있다. 2-메르캅토에탄올의 농도는 예를 들어, 약 0.05 내지 1.0 mM일 수 있고, 특히 약 0.1 내지 0.5, 또는 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 0.8, 1, 1.5, 2, 2.5, 5, 7.5, 10 mM 또는 임의의 중간 값들일 수 있지만, 농도는 줄기 세포(들)를 배양하기 위해 적절한 한 특히 이에 제한되지 않는다.
세포들은 배양의 필요에 따라, 적어도 또는 약 0.005, 0.010, 0.015, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 800, 1000, 1500 mL, 또는 그 안에서 도출 가능한 임의의 범위의 부피에서 배양될 수 있다. 바이오리액터는 적어도 또는 약 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 리터의 부피, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 평방 미터, 또는 그 안에서 도출 가능한 임의의 범위를 가질 수 있다.
장치가 조립될 때 공급 캡(12)의 벽(13)과 중간 모듈(30)의 배리어(39) 사이에 형성된 배양 표면 및 챔버는 목적에 따라 세포 접착제로 조제될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 세포 접착 배양 베슬은 세포들로의 베슬 표면의 접착성을 개선하기 위해 세포 접착(예를 들어, 세포외 기질[ECM])에 대한 적합한 기재로 코팅될 수 있다. 세포 접착에 사용된 기재는 줄기 세포들 또는 공급 세포들(사용시)을 부착하도록 의도된 임의의 물질일 수 있다. 세포 접착을 위한 비 제한적인 기재들은 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-리진, 폴리-D-리진, 폴리-D-오르니틴, 라미닌, 비트로넥틴, 및 피브로넥틴 및 이들의 혼합물, 예를 들어 엔젤브레스-홀름-스웜 생쥐 사르코마 세포들(MatrigelTM 또는 Geltrex와 같은) 및 용해한(lysed) 세포 막 조제로부터의 단백질 혼합물을 포함한다. 특정한 실시예들에서, 배양은 폴리-L-리진(또는 폴리-D-리진) 및 라미닌을 포함하는 기질을 포함한다.
다른 배양 상태들이 적절히 한정될 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 약 30 내지 40℃, 예를 들어, 적어도 또는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39℃일 수 있지만, 특히 이에 제한되지 않는다. CO2 농도는 약 1 내지 10%, 예를 들어, 약 2 내지 7%, 또는 그 안에서 도출 가능한 임의의 범위일 수 있다. 산소 분압(oxygen tension)은 적어도 또는 약 1, 5, 8, 10, 20%, 또는 그 안에서 도출 가능한 임의의 범위일 수 있다.
본질적으로 "외부적으로 첨가된" 성분이 없는 것은 배지에서의 세포들 이외의 소스로부터의 규정된 성분을 갖지 않거나, 본질적으로 갖지 않는 배지를 언급한다. FGF 또는 EGF 등과 같이 외부적으로 첨가된 성장 인자들 또는 폴리펩티드가 "본질적으로 없는 것"은 외부적으로 첨가된 성분의 최소량 또는 검출 가능하지 않은 양을 의미할 수 있다. 예를 들어, FGF 또는 EGF 폴리펩티드를 본질적으로 갖지 않는 배지 또는 환경은 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.01, 0.001 ng/mL 미만 또는 그 안에서 도출 가능한 임의의 범위를 함유할 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 기재된 시스템을 사용하여 조건화된 세포들은 다양한 치료 용도를 갖는다. 특히, 세포들이 인간의 MSC이면, 그러한 조건화된 세포들이 치료상으로 사용될 수 있는 질병 또는 질환, 또는 대안적으로 기재된 시스템으로 조건화되게 가해진 MSC를 포함하지만, 여기에 제한되지 않는, 인자들이 배양된 세포들로부터 생성되고 격리된 이들 질병 또는 질환은 자가 면역 질환{류마티스 관절염(RA), 전신 홍반 루프스(SLE)를 포함하지만, 여기에 제한되지 않는}, 이식편 대숙주병, 크론병, 염증성 장 질환, 신경 퇴행성 질환, 신경 장애, 뇌 질환, 중추 신경 계통 질환, 말초 신경 계통 질환, 신경 상태, 기억 및 학습 장애, 심장 부정맥, 파킨슨 병, 눈 질환, 척수 손상, 신경 치료 및 재생을 필요로 하는 질환, 다발성 경화증(MS), 근위축측삭경화증(ALS), 파킨슨병, 뇌졸중, 만성 또는 급성 손상, 뼈 복구, 외상성 뇌손상, 정형 외과 및 척추 상태, 연골 골격 또는 근육 질환, 골관절염, 골괴사증, 심혈관 질환, 심한 사지 허혈, 말초 동맥 질환, 죽상 동맥 경화증과 같이 심장 마비 또는 질병에 연결된 혈관 손상, 및 신혈관화, 상처, 화상 및 궤양으로부터 유리한 것들을 포함한다.
특정한 실시예들에서, 본 개시된 시스템은 세포들을 조건화하고 면역 조절 특성들을 개선하도록 적용될 수 있다. 특정한 실시예들에서, 그러한 조성물은 특히 자가 면역 질병 및 질환의 치료, 관리, 및/또는 방지를 위해 하나 이상의 추가 화합물 또는 약품("추가 작용제")과 조합하여 투여될 수 있다. 그러한 치료법은 특히 면역 조절 질병 또는 질환을 치료하거나 향상시키기 위해 치료상으로 유효 선량에서 환자에게 투여될 수 있다.
그러한 조건화된 세포 또는 인자 조성물의 유독성 및 치료 효험은 예를 들어, 세포 배양 또는 실험 동물을 이용하여 표준 제약 절차들에 의해, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 선량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료상으로 유효한 선량)를 결정하기 위해 결정될 수 있다. 독성과 치료 효험 사이의 선량비는 비율 LD50/ED50으로서 표현된 치료 지수이다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물은 특정한 실시예들에서 사용될 수 있지만, 통상적으로 영향을 받지 않은 세포들에 대한 잠재적인 손상을 최소화하여, 이를 통해 부작용을 감소시키기 위해 그러한 조성물을 우선적으로 영향을 받은 조직의 부위에 타게팅(target)하는 전달 시스템들을 설계하기 위해 주위를 기울여야 한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 획득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 선량의 범위를 공식화하는데 사용될 수 있다. 그러한 조성물의 선량은 바람직하게 유독성이 거의 없거나 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 놓인다. 선량은 이용된 선량 형태와 활용된 투여 루트에 따라 이러한 범위 내에서 변할 수 있다. 임의의 조성물에 대해, 치료상으로 유효 선량은 초기에 세포 배양 검정로부터 추정될 수 있다. 선량은 세포 배양에서 결정된 바와 같이 IC50을 포함하는 순환 플라즈마 농도 범위(즉, 증상의 최대 절반 억제를 달성하는 테스트 조성물의 농도)를 달성하기 위해 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서 유용한 선량을 더 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 플라즈마 레벨은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
특히 자가 면역 질환의 치료법적 치료가 구상될 때, 적절한 선량은 또한 테스트 환자의 킬로그램 중량당 생리 활성제의 최대 허용 가능 선량, 즉 MTD을 결정하기 위해 동물 연구를 이용하여 결정될 수 있다. 일반적으로, 테스트받은 적어도 하나의 동물 종들은 포유류이다. 당업자는 인간을 포함하는 다른 종들에 대한 유독성을 회피하고 효험을 위해 선량을 규칙적으로 추론한다. 효험의 인간 연구가 착수되기 전에, 위상 I 임상 연구는 안전한 선량을 확립하는데 도움을 줄 것이다.
추가적으로, 생리 활성제는 예를 들어, 생리 활성제의 안정성을 개선하거나, 그렇지 않으면 약리 특성들(예를 들어, 생체 내 반감기의 증가, 유독성 감소 등)을 개선하는 다양한 잘 확립된 조성물 또는 구조에 연결되거나 복합체를 형성하게 될 수 있다.
본 시스템을 이용하여 조건화된 세포들 또는 그러한 세포들로부터 배출된 인자들 및 다른 그러한 치료제는 수술 동안의 세포 삽입, 정맥내(I.V.), 복강내(I.P.), 근육내(I.M.), 또는 척수강내 주사, 흡입제, 피하(서브-q)를 포함하지만, 여기에 제한되지 않는 당업자에게 알려진 임의의 수의 방법들에 의해 투여될 수 있거나, 원칙적으로 도포될 수 있다{트랜스덤(transderm), 연고, 크림, 고약, 정안제, 등}.
다음의 예들의 섹션은 다양한 실시예들의 예들에 관해 추가 세부 사항들을 제공한다. 다음에 오는 예들에 개시된 기술들이 잘 기능하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기술들 및/또는 조성물을 나타낸다는 것이 당업자에게 인식되어야 한다. 하지만, 당업자는 본 개시를 고려하여, 본 발명의 사상 및 범주에서 벗어나지 않고도 개시되고 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 획득하는 특정한 실시예들에서 많은 변화들이 이루어질 수 있다는 것을 인식한다. 이들 예들은 본 명세서에 기재된 방법들 및 시스템들의 예시이고, 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다. 이것의 비 제한적인 예들은 아래에 제공된 것들을 포함하지만, 여기에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 그리고 달리 표시되지 않으면, "치료하다(treat)", "치료하는(treating)", "치료(treatment)" 및 "치료법(therapy)"이라는 용어들은, 환자가 그러한 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 효과의 심각도를 감소시키는 질병 또는 질환을 겪는 동안 발생하는 작용을 구상한다. 정황이 허용되는 경우, "치료하다(treat)", "치료하는(treating)", 및 "치료(treatment)"라는 용어들은 또한, 질병 또는 질환의 증가된 위험에 있는 개인이 질병 또는 질환의 시작 이전에 적절한 수술적 및/또는 다른 의료적 중재를 수용할 수 있는 것을 보장하는 쪽으로 취해진 작용을 언급한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 그리고 달리 표시되지 않으면, "방지하다(prevent)", "방지하는(preventing)", 및 "방지(prevention)"라는 용어들은, 환자가 질병 또는 질환을 겪기 시작하기 전에 발생하고, 질병 또는 질환의 심각도의 시작을 지연하고, 및/또는 억제하거나 감소시키는 작용을 구상한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 그리고 달리 표시되지 않으면, "관리하다(manage)", "관리하는", 및 "관리"라는 용어들은 그러환 질병, 질환 또는 상태를 이미 겪은 환자에게 질병 또는 질환의 재발의 심각도를 방지하는 것, 지연하는 것, 또는 감소시키는 것을 내포한다(encompass). 용어들은 질병 또는 질환의 임계치, 전개, 및/또는 지속 기간(duration)을 변조하는 것 또는 환자가 질병 또는 질환에 어떻게 반응하는 지를 변화시키는 것을 내포한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 그리고 달리 표시되지 않으면, "치료상으로 유효 양의 세포들, 인자 또는 화합물은 질병 또는 질환의 치료 또는 관리에서 임의의 치료상 이점을 제공하거나, 질병 또는 질환과 연관된 하나 이상의 증상을 지연하거나 최소화할 정도로 충분한 양이다. 치료상으로 유효 양은 단독으로, 또는 질병 또는 질환의 치료 또는 관리에서 임의의 치료상 이점을 제공하는 하나 이상의 다른 치료법 및/또는 치료제와 조합하여 세포들, 인자 또는 화합물의 양을 의미한다. "치료상으로 유효 양"이라는 용어는 질병 또는 질환을 경감하고, 질병 또는 질환을 개선하거나 감소시키고, 전체 치료법을 개선하거나, 다른 치료제의 치료상 효험을 개선하는 양을 내포할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 그리고 달리 규정되지 않으면, "예방 유효 양"의 세포들, 인자 또는 화합물은 질병 또는 질환, 또는 질병 또는 질환과 연관된 하나 이상의 증상의 시작을 방지하거나 지연하거나, 그 재발을 방지하거나 지연할 정도로 충분한 양이다. 예방 유효 양의 세포들, 인자들 또는 화합물은 단독으로, 또는 질병 또는 질환의 방지에서 예방 이점을 제공하는 하나 이상의 다른 치료 및/또는 예방제와 조합하여 세포들, 인자 또는 화합물의 양을 의미한다. "예방 유효 양"이라는 용어는 질병 또는 질환을 방지하고, 전체 예방을 개선하거나, 다른 예방제의 예방 효험을 개선하는 세포들, 인자 또는 화합물의 양을 내포할 수 있다. "예방 유효 양"은 예를 들어, 질병 또는 질환 이전에 처방될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "환자(patient)" 또는 "환자(subject)"는 인간과 비-인간 포유류, 예를 들어, 설치류, 생쥐, 쥐, 비-인간 영장류와, 개 및 고양이와 같은 반려 동물뿐 아리나 가축, 예를 들어, 양, 소, 말 등과 같지만, 여기에 제한되지 않는 본 명세서에 기재된 질병 또는 질환을 겪을 수 있는 포유류 생물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "MSC"는 중간엽 줄기 세포이고, 그러한 세포들은 또한 중간엽 기질 세포로 언급되었다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "제어된 전단 응력"은 표면을 가로지르는 배지의 흐름율을 조정함으로써 세포들에 인가된 전단 응력의 양을 설정할 수 있는 능력을 언급한다. 응력은 플레이트의 전체 표면적을 가로질러 균일하게 인가된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "조건화된 세포들"이라는 것은 전단 응력에 노출된 결과로서 추가 기능성을 발현하는 세포들을 언급한다.
아래의 청구항에서 모든 수단 또는 단계에 기능 요소를 더한 것의 대응하는 구조들, 물질들, 작용들 및 등가물들은 특별히 청구된 다른 청구된 요소들과 조합하여 기능을 수행하기 위한 임의의 구조, 물질, 또는 작용을 포함하도록 의도된다. 본 발명의 설명은 예시 및 설명을 위해 제공되었지만, 개시된 형태에서 본 발명에 철저하거나 제한되도록 의도되지 않는다. 많은 변형들 및 변경들은 본 발명의 범주 및 사상에서 벗어나지 않고도 당업자에게 명백할 것이다. 실시예는 본 발명 및 실질적인 응용의 원리를 최상으로 설명하기 위해, 그리고 구상된 특정한 응용에 적합한 다양한 변형들을 갖는 다양한 실시예들에 대해 당업자가 본 발명을 이해하도록 하기 위해 선택되고 기재되었다.
추가 손질 없이, 당업자가 본 명세서의 설명을 이용하여, 본 방법들을 완전한 정도로 활용할 수 있다는 것이 생각된다. 본 명세서에 기재된 실시예들은 어쨌든 본 개시의 나머지를 강요하는 것이 아니라 예시적인 것으로 해석될 것이다. 바람직한 실시예들이 도시되고 기재되었지만, 많은 변경들 및 변형들은 본 개시된 방법들의 사상 및 가르침에서 벗어나지 않고도 당업자에 의해 이루어질 수 있다.
따라서, 보호 범주는 위에 설명된 설명에 의해 제한되지 않고, 청구항의 주제의 모든 등가물들을 포함하는 청구항에 의해서만 제한된다. 본 명세서에 인용된 모든 특허들, 특허 출원들 및 공보들의 개시는 이를 통해 본 명세서에 설명된 본 개시와 일관되는 정도로 참고용으로 본 명세서에 병합된다.
예
다음의 예들은 본 발명의 바람직한 실시예들을 증명하도록 포함된다. 다음에 오는 예들에 개시된 기술들이 본 발명의 실시에서 잘 기능하기 위해 본 발명자에 의해 발견된 기술들을 나타내어, 그 실시를 위해 바람직한 모드들을 구성하도록 고려될 수 있다는 것을 당업자는 인식해야 한다. 하지만, 당업자는 본 개시를 고려하여, 본 발명의 사상 및 범주에서 벗어나지 않고도 개시되고 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 획득하는 특정 실시예들에서 많은 변화들이 이루어질 수 있다는 것을 당업자는 인식해야 한다.
예 1
선행 연구는, 유체 전단 응력이 줄기 세포들을 조건화하고, 유전자 발현을 변경하고, 기능적 활성을 개선하는데 사용될 수 있는 원리의 증명을 제공하도록 수행되었다. 훨씬 더 작은 분석 규모 상에서, 본 시스템에 의해 제공된 유형의 전단 응력의 조건화 활성을 예시하기 위해, 힘(전단 응력)은 주문형으로 제조된 슬라이드들 또는 IBIDI, LLC.(미국, 위스콘신, 베로나)로부터 획득된 IBIDIㄾ 소규모 미세 유체 채널 슬라이드들을 이용하여 인가되었다. 인간의 샘플들은 골수(BM), 양수(AF), 또는 지방(AD) 조직으로부터 수확되었고, hMSC의 격리 및 확장을 위해 처리되었고, 동결 상태로 저장되었다. 동결된 hMSC들은 50 ml 최소 필수 배지(MEM-α)(20% FBS, 5% 페닌실린/스트렙토마이신, 5% 글루타민)를 갖는 T225 세포 배양 플라스크에 해동되었고 접종되었다. 배지는 매 3 내지 4일마다 대체되었다. hMSC들은 거의 100% 합쳐질 때까지 배양에서 유지되었다. 세포들은 섬유모세포 표현형을 갖는다. 본 시스템에 의해 제공되는 것보다 더 많이 라임드(limed) 규모로 유사한 유체 층류 전단 응력을 제공하기 위해 디바이스(IBIDIㄾ 미세 유체 채널 슬라이드 또는 주문형으로 제조된 슬라이드) 상에 세포들을 접종하기 전에, 배양 표면들은 37℃에서 30 내지 45분 동안 PBS에서 100 ug/ml 피브루넥틴으로 사전 코팅되었고, 세포들을 접종하기 전에 PBS로 2X로 세척되었고, 세포들이 접종을 위해 준비되는 동안 30 내지 45분 동안 인큐베이터에 놓이게 되었다. 배양된 hMSC는 진공 및 유리 파스퇴르 피펫을 이용하여 T225 플라스크로부터 배지를 제거함으로써 조제되었고, 세포들은 실온 PBS으로 1X로 세척되었고, 이것은 흡인에 의해 제거되었다. 3 ml의 0.25% 트립신 용액이 첨가되었고, 플라스크는 5분 동안 37℃에서 인큐베이팅되었다. 이러한 인큐베이션에 뒤이어, 플라스크는 인큐베이터로부터 제거되었고, 세포들을 축줄하기 위해 격렬하게 태핑(tapped)되었다. 플라스크는, 모든 세포들이 탈착되었고 자유 부유(free-floating)하는 것을 보장하기 위해 절개용 현미경 하에서 검사되었다. 이 시점에서, 9 ml의 MEM-α는 플라스크에 첨가되었고, 총 부피(12 ml)는 제거되었고, 15 ml 원뿔형 튜브에 위치되었다. 튜브는 원심 분리기에 위치되었고, 실온에서 5분 동안 300 RCF에서 회전되었다. 보충물은 흡입되어, 세포 펠릿 위에 소량의 배지를 남기고, 3 ml MEM-α가 첨가되었고, 세포 펠릿은 이 배지에서 재현탁되었다. 존재하는 살아있는 세포들의 수는 트리판 블루 염색 배제(trypan blue dye exclusion)를 이용하여 결정되었다. 살아있는 세포의 계수는 혈구계 상에서 결정되었고, 세포들은 각 검정을 위해 원하는 농도를 획득하도록 재현탁되었다(표 1을 참조). IBIDI 채널들은 본 시스템에 의해 제공된 유형과 유사하지만, 이보다 덜 잘 제어된 유체 층류 전단 응력을 제공하도록 활용되었다. 세포들은 웰(well)당 60 ul 배지로 웰들을 충전하기 전에 30 내지 45분 동안 놓이게 되었다(너무 많은 시간이 경과하면, 배지는 채널들로부터 증발하기 시작할 것이다). 세포들은 12 내지 18 시간 동안 인큐베이팅하도록 되었다. 튜브(tubing)는 그런 후에 깨끗한 3방향 수도꼭지를 갖는 안전 캐비넷에서의 IBIDI® 슬라이드에 부착되었고{이전 모든 고압 멸균(autoclaved)됨 또는 EtO 살균됨, 연동 펌프와 함께 사용하기 위해 요구된 3개의 멈춤 튜브는 EtO 또는 UV 살균될 수 있다}, 그런 후에 인큐베이터로 전달되었다. IBIDI 채널 실험은 6 ml의 총 부피 및 크게 제조된 슬라이드 실험이 재순환된 50 ml 총 부피를 재순환하였다. 연동 또는 하버드 주사기 펌프는 15 다인/cm2에서 배양 표면을 가로질러 배지를 밀어 넣도록 프로그래밍되었다. 유체 전단 응력은 3, 6 또는 8 시간 동안 인가되었다.
검정 세포 농도 (세포/ml) 배양 플랫폼 채널에서의 총 부피 전단 노출의 시간
qRT PCR 3 x 10^6 IBIDI 30 ul 3, 6, 8 시간
웨스턴 블롯 3 x 10^6 IBIDI 30 ul 8 시간
NF-kB 결합 검정 2 x 10^6 Custom 10 ml 8 시간
생체 내 생쥐 실험 2 x 10^6 Custom 10 ml 8 시간
ELISA 검정 2 x 10^5 IBIDI 30 ul 3, 8 시간
IF 염색 2 x 10^5 IBIDI 30 ul 3 시간
유체 층류 전단 응력으로 인한 면역 조절 변화들
미성숙 MSC들은 TNF-α 자극된 단백질 6(TSG-6), 프로스타글란딘 E2(PGE2), 및 인터류킨 (IL)-1 수용체 작용제(IL1RN)와 같은 다기능 항염증 단백질과 같은 면역 억제의 핵심 매개체를 발현하지 않는다. 3가지 인간 조직 소스들, 골수, 지방 및 양수로부터 도출된 MSC들은 모두 가변 정도로 전단 응력에 반응하는 것으로 발견되었다. 예를 들어, 15 다인/cm2의 힘으로 인가된 전단 응력은 다중 인간 조직들로부터 수집된 MSC들에서 신호 발신하는 면역 조절을 활성화하였다. 골수 도출된 MSC, 층류 전단 응력의 평가는 MSC 유전자 인코딩 TSG-6, COX-2, IL1RN, HMOX-1, LIF, 및 KLF2의 전사시 6배 내지 120배 증가와 같은 극심한 상향 조절을 자극하였다. 예를 들어 (도 20)을 참조.
유사하게, 유체 전단 응력을 받은 인간의 MSC들의 배양으로부터의 배지가 또한 프로스타글란딘 E2와 같은 면역 조절 단백질을 포함하였다는 것이 상업적으로 이용 가능한 ELISA를 활용하여 결정되었다. 더욱이, 웨스턴 블로팅은 COX2, TSG6, 및 IL1RN의 상승된 단백질 레벨(전사)을 확인하였다. 일정한 액틴 단백질 발현 레벨은 기본 단백질 발현을 위한 제어로서 사용되었다. 이 연구에서, 유체 전단 응력의 8 시간까지 인간의 MSC(hBM, 인간의 골수 MSC; hAF MSC, 양수 MSC; hAD MSC, 지방 도출된 MSC로부터 도출된)의 노출 이후에, 유체 전단 응력을 받지 않은 MSC로부터 획득된 배지에 비해 COX2 단백질의 발현에서 상당한 증가가 있었다는 것이 결정되었다. 또한 이러한 유도가 10 uM의 NF-카파 B 작용제 BAY11-7085(도 21)의 첨가에 의해 폐기될 수 있다는 것이 결정되었다. 더욱이, 상업적으로 이용 가능한 ELISA를 활용함으로써, 3 시간만큼 적게 유체 전단 응력을 받은 인간의 MSC 배양으로부터의 배지는, 치료된 hMSC가 지라로부터의 활성화된 면역 세포들로 공동 배양되었을 때(도 22) TNF-α에서 10 내지 50% 감소에 의해 증명된 바와 같이 면역 억제 활성을 하였다는 것이 결정되었다. 또한 COX 또는 NF-kB 억제제의 인가가 TNF-α 생성을 억제하기 위해 전단 치료된 MSC의 능력을 폐기하고; 반면에, PGE2(dmPGE2)의 안정화된 합성 형태의 첨가가 전단된 MSC의 존재시 생성된 레벨까지 TNF-α를 감소하였다(도 23)는 것이 사이토카인 억제 검정을 이용하여 결정되었다. 추가 증거는, 전단된 MSC가 IFN-γ의 첨가로 발생된 COX2 및 HMOX1의 더 큰 유도로서 유체 전단 응력을 받지 않은 MSC보다 다른 프라이밍제에 더 많이 반응할 수 있다는 것(도 24)을 추가로 제안한다. 따라서, 인간의 MSC가 유체 전단 응력을 받는다는 것을 표시하는 것은 예를 들어, 조합 치료법으로 제공될 때 사이토카인과 상승 작용으로 작용할 수 있다.
염증 사이토카인에 의해 사전 조건화되지 않으면서, 전단 응력에 노출된 미성숙 MSC가 리포폴리사카라이드(LPS)-활성화된 생쥐 스플레노시트(MSC 기부자 및 소스 변이성에 따라 정적 상태 하에서 배양된 MSC 아래에서 완전 억제로부터 2배 감소의 범위를 갖는)에 의해 TNF-α 분비를 차단할 수 있었다는 것이 추가로 결정되었다.
신경 보호 능력:
연구들은 예를 들어 외상성 뇌 손상(TBI)에 뒤따라 제어된 전단 응력에 노출된 MSC와 같은 세포들이 신경 보호를 제공할 수 있다는 것을 확립하도록 수행되었다. 이를 행하기 위해, 생쥐 모델은 기능적 결과물을 평가하도록 활용되었다. 생쥐에서의 제어된 피질 충격(CCI)은 인간의 머리 외상을 복제하는 형태적 및 뇌혈관 손상 반응을 나타낸다. 따라서, 신경 손상 및 염증을 강력하게 하는 세포 및 분자 변경의 특징은 MSC 사전 조건화의 잠재적인 임상 효험을 측정하기 위해 강력한 도구를 제공한다.
열두(12)마리의 생쥐는 0.05의 알파 에러 레벨에서 80% 전력을 달성하기 위해 상태마다 필요한 것으로 예측되었다(SAS 예측 분석 소프트웨어). 세포 치료법을 위해 투여될 세포들은 골수 도출된 MSC이었다. MSC는 정적 상태 또는 15 다인/cm2의 세기에서의 3 시간 동안 전단 응력, COX2, TSG6, IL1RN 및 HMOX1의 강력한 유도를 생성하고 활성화된 면역 세포들에서의 사이토카인 생성을 억제하기 위해 증명된 유체 흐름율 및 지속 기간에 노출되었다. 큰 용량의 측면 흐름 시스템에 의한 힘이 즉시 후속하여, 10x106 세포/kg MSC는 꼬리 정맥 주사(생쥐마다 2.5 x 106 MSC의 근사 선량)를 통해 수령 생쥐에게 전달되었다.
혈뇌 장벽(BBB) 침투성은 맥관을 가로지르는 누출을 검사하기 위한 표준 방법들(본 명세서에 기재된 바와 같이 현탁액에서 덱스트란 비드를 활용하는)을 이용하여 결정되었다. 우측 정수리 연관 피질에서의 손상은 CCI 디바이스(라이카 임팩터 1)에 의해 암놈의 생쥐(225 내지 250 그램)에서 도입되었다. 이와 동시에, 제어 생쥐는 CCI 단독으로 치료되었거나, 간단히 마취되었다(모의 대조군). 손상 이후에 사십팔(48) 시간에, MSC가 투여되었다. MSC의 주사 이후에 이십사(24) 시간에, 인으로 공액된 알렉사 680-덱스트란 비드(10kDa, 1 mg/ml의 0.5ml)는 꼬리 정맥을 통해 전달되었다. 이러한 염색이 주입된 이후 삼십(30)분에, 동물들은 안락사되었고, 4% 파라포름알데히드로 살포되었다. 고정된 뇌는 1mm 두께로 화관형으로 구분되었다. 맥관 누출은 700 및 800 nm 채널들(800 nm 신호는 배경 공제를 위해 사용되었다)을 이용하여 LI-COR 오디세이 CLx 적외선 레이저 스캐너에서 뇌 구역의 인 세기에 의해 측정되었다. 신경 염증에 반응하여 빠르게 변경되는 것으로 알려진 특정한 면역 및 신경 세포 유형의 주파수의 역사적 분석은 진단의 중요한 표시자이다. 미래의 연구에서, 생쥐의 독립적인 일단(cohort)에서,
8 내지 50 um의 뇌 구역은 미크로글리아(Iba1, ED1 또는 CD63), 호중구 침윤(RP-3), 아스트로글리아(GFAP), 및 신경(NeuN)을 검출하기 위한 항체 뿐 아니라 세포 죽음의 표시자(분열된 카스파제 3)를 이용하여 면역 조직 화학에 의해 CNS에서 염증 표현형에 대해 분석될 것이다. 뇌 구역의 염색은 표준 자유 부유 염색 프로토콜 또는 슬라이드-장착된 동결 절단을 이용하여 이루어질 것이다.
치료된 및 제어 생쥐의 인지 복구는 고전적인 해마-종속 공간 학습 작업, 생쥐가 잔여 미로 큐(cue)에 기초하여 수중 플랫폼에 위치하는 모리스 수중 미로에 의해 평가될 수 있다. 이들 연구에 대해, 손상 이후 2주에, 학습은 속도, 각 사분면에서 소비된 시간, 및 플랫폼을 발견하는데 취해진 경로의 거리에 의해 측정된다. 동일한 개별 존재는 미로에서 동일한 측정에 의해 기억 기능을 위해 손상 후의 4주간 테스트될 것이다. 예상된 결과들은, 전단된 MSC의 전달이 미성숙 정적-배양된 MSC에 대해 뇌에서 BBB 침투성 및 염증 세포 표현형을 감소하고, 또한 개선된 인지 복구를 초래할 것이라는 것이다.
예 2 - 손상은 골수에서의 MSC의 주파수를 변경
외상성 뇌 손상에서의 만성 염증은 선천성 및 적응성 면역 시스템의 단핵구 및 림프구에 의해 영속된다. MSC는 골수로부터 손상 및 염증 부위로 가도록 보고되지만, 본 문맥에서 골수로부터의 MSC 정체(trafficking)의 상세한 분석이 부족하다. 손상에 의해 야기된 MSC 주파수에서의 변화를 모니터링하기 위해, 외상성 뇌 손상의 생쥐 모델이 확립되었고, 이것은 인간의 머리 외상을 복제하는 형태적 및 뇌혈관 손상 반응을 제공한다. 간략하게, 제어된 피질 충격(CCI)은 중간 봉합선에 인접한 노출된 우측 정수리 연관 피질로 전달되었다. 이와 동시에, 모의 대조군은 마취되었고, 손상 없이 절개가 이루어졌다. CD105+ MSC의 주파수는 골수 내에서 검사되었고, CD105+ MSC의 절대수가 손상 이후 24시간에 크게 감소되었다는 것이 발견되었다(도 25a 및 도 25b). 이들 데이터는, MSC가 해마 줄기 또는 간세포에 의해 관찰될 수 있는 것만큼 골수로부터의 떠남에 의해 손상에 반응하여, 이에 따라 MSC가 혈류 내에서 그리고 맥관 벽 상에 존재하는 혈류 힘에 직접 노출될 가능성을 증가시킨다는 것이 발견되었다. 중요하게, 15 다인/cm2 WSS의 3 시간만큼 사전 조건화된 인간의 MSC의 정맥내 투여는 CCI 이후 24 시간에 투여될 때 손상된 생쥐의 골수에서 CD105+ MSC 주파수를 크게 상승하였다(도 25c 및 도 25d). CCI 후 72 시간에, CD105+ 세포 주파수는, 정적 배양되거나 WSS-노출된 MSC가 투여될 때 상당히 더 높아졌고, 골수 상의 보호 효과는 MSC가 WSS에 의해 사전 조건화되었을 때 상당히 더 커졌다.
물질들 및 방법들
세포 배양 - 골수 MSC는 독립적인 인간의 기부자(AllCells)로부터 전체 골수로부터 도출되었다. 간략하게, 단핵 세포들은 Ficoll-Paque에서 상 분리에 의해 전체 골수의 버피(buffy) 층에 가득 찼다. 세포들은 MEM-α(Thermo Scientific), 20% 소태아 혈청(Atlanta Biologicals), 100 유닛/ml 페니실린(Gibco), 100μg/ml 스트렙토마이신(Gibco), 및 2mM L-글루타민(Gibco)으로 구성된 완전한 배양 배지에서 중간 확장을 위해 저온 보존되거나 재현탁되었다. 비부착 세포들은 2일 이후에 제거되었다. 접착 군집(colony)은 추가로 확장되었고, 통로 1로서 동결되었다. 해동된 MSC는 1 x 105 세포/ml에서 도금되었고, 배지는 3일마다 변화되었다. 80% 융합에서, 세포들은 qRT PCR, 면역 블로팅, 및 생쥐 CCI 실험에 대해 3 x 106 세포/ml의 밀도에서, 그리고 ELISA 및 면역 인광 실험에 대해 5 x 105 세포/ml에서 IBIDI 채널들(μ-슬라이드 VI 0.4)에 통과되었다. 배양 표면으로의 부착에 뒤이어, 주사기 펌프(PhD ULTRA 프로그래밍가능, 하버드 장치) 또는 연동 펌프(REGLO 아날로그 MS4/12, 이스마텍)은 15 다인/cm2의 층류 전단 응력을 생성하는데 사용되었다.
제어된 피질 충격(CCI) - CCI 디바이스(라이카 IMPACT ONETM)는 수놈의 생쥐(225 내지 250 그램)에서 노출된 뇌 상에 6 mm 충격기 팁을 이용하여 우측 정수리 연관 피질(브레그마와 람다 사이의 중간 봉합선에 인접한)에서 6 m/sec로 3.1 mm 압축의 단일 충격을 전달하는데 사용되었다. 이와 동시에, 제어 생쥐는 CCI 단독으로 치료되었거나 간단히 마취되었다(모의 대조군). 세포 치료 실험에서, 낮은 통로(P2-5) MSC는 3 시간 동안 15 다인/cm2의 정적 상태 또는 전단 응력 하에 배양되었다. 수령 생쥐는 2 시간의 전단 노출 내에 꼬리 정맥을 통해 MSC(10 x 106 세포/kg)를 수용했다. 희생시, 생쥐는 4% 파라포름알데히드로 살포되었고, 조직들은 수집 이후에 추가로 고정되었다. 모든 실험들은 텍사스대 건강 과학 센터 실험 동물 운영 위원회로부터의 가이드라인에 따라 수행되었다.
생쥐 조직들의 역사적 처리 - 생쥐의 정강이뼈가 수확되었고, 뼈를 둘러싸는 근육이 조심스럽게 제거되었다. 뼈는 4% 파라포름알데히드에 추가로 고정되었고, 10% EDTA를 이용하여 칼슘 제거되었다. 일단 칼슘 제거되었으면, 뼈는 그로싱(grossing), 파라핀 내장, 및 분할을 위해 UT 의대에서의 조직학 핵심부(histology core)에 전달되었다.
골수의 면역 염색 - 파라핀 내장된 구역은 20분 동안 60℃에서 구워졌고, 자일렌 및 가변 등급의 에탄올에서 연속적으로 재수화되었다. 열 유도 에피토프 검색은 DAKO 목표 항원 검색 용액(pH 6.1)을 이용하여 수행되었다. 내생 퍼옥시다제는 0.3% H2O2로 차단되었다. 슬라이드들은 1 시간 동안 2.5% BSA로 차단되었고, 2.5% BSA에서 항-CD105 항체(1:200, SN6, Ab11414)로 밤새 인큐베이팅되었다. 면역 퍼옥시다제 검출은 제조업자 지령에 따라 벡터 ABC 키트 및 DAKO DAB 키트(VECTASTAINㄾ 엘리트 ABC 키트; PK-6102, Dako DAB 키트; K3468)를 이용하여 수행되었고, Nuclear Fast Red 또는 CAT 헤모톡실린(Vector Labs; H-3403, Biocare Medical; 012215)으로 대비 염색되었다. 최적의 세포 대비를 보장하기 위해, 청색 시약은 헤모톡실린(Statlab, SL203)과 함께 사용되었다. 슬라이드들은 공기 건조되었고, Biocare Ecomount(EM897L)로 커버슬립(coverslipped)되었다.
이미지 취득 및 분석 - 면역 조직 화학을 위한 현미경 사진이 올림푸스 BX51P 편광 현미경(DP71 컬러 카메라) 및 DP 제어기 소프트웨어(올림푸스, 버전 3.3.1.292)를 통해 획득되었다. 이미지는 이미지 J(NIH)를 이용하여 정량적으로 분석되었다. CD105+ MSC는 치료 그룹 및 샘플 식별에 블라인드된(blinded) 조사관에 의해 계수되었다. 난수 생성기는 후속하여 통계 분석을 받을 8개의 무작위 이미지 세트들을 선택하는데 사용되었다.
통계 분석 - 모든 데이터는 통계 중요성을 위해 SIGMAPLOTㄾ 12.5 소프트웨어로 분석되었고, 평균 ±SEM으로서 보고된다. 한 방식 ANOVA 및 다중 비교를 위한 홀름-시닥(Holm-Sidak) 방법은 조직 측정에서의 차이를 평가하는데 사용되었다. P < 0.001의 중요성 레벨은 3중 별표(***)에 의해 그래프에 표시된다. 달리 언급하지 않으면, 적어도 3개의 독립적인 생물학적 복제로부터의 대표 결과들이 도시된다. (도 25b 및 도 25d를 참조).
본 명세서에 개시되고 청구된 모든 방법들은 본 개시를 고려하여 과도한 실험 없이 이루어지고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법들이 바람직한 실시예들에 관해 기재되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범주에서 벗어나지 않고도 방법들 및 본 명세서에 기재된 방법의 단계들 또는 단계들의 시퀀스에 변경이 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 더 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 관련되는 특정한 약품이 본 명세서에 기재된 약품으로 치환될 수 있는 한편, 동일하거나 유사한 결과들이 달성된다는 것이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 그러한 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 한정된 바와 같이 본 발명의 사상, 범주 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
본 명세서에 사용된 섹션 머리말은 단지 체계적인 목적을 위한 것이고, 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 특허, 특허 출원, 논문, 서적 및 논문을 포함하지만, 여기에 제한되지 않는 본 출원에 언급된 모든 문헌, 또는 문헌의 부분은 임의의 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에서 참고용으로 명확히 병합된다. 병합된 문서 및 유사한 자료의 하나 이상이 본 출원에서 그러한 용어의 정의를 모순되는 방식으로 용어를 정의하는 경우에, 본 출원은 제어한다.
참조
다음의 인용 문헌은 예시적인 절차적인 또는 본 명세서에 설명된 것에 보충적인 다른 세부 사항을 제공하는 정도까지 다음의 인용 문헌은 특히 본 명세서에 참고용으로 병합된다.
국제 공보 번호 WO98/30679
와그너 등, 중간엽 줄기 세포 기반의 치료법. Curr Opin Biotechnol 20(5):531-536, 2009.

Claims (13)

  1. 세포 조제 시스템으로서,
    베이스;
    상기 베이스에 결합된 복수의 모듈형 세포 조제 장치를 포함하고, 각 모듈형 세포 조제 장치는
    입구 유체 공급 플레이트;
    베이스 플레이트; 및
    상기 입구 유체 공급 플레이트와 상기 베이스 플레이트 사이에 위치된 복수의 중간 플레이트들;
    용기; 및
    펌프를 포함하는, 세포 조제 시스템.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 복수의 모듈형 세포 조제 장치는 적어도 3개의 모듈형 세포 조제 장치를 포함하는, 세포 조제 시스템.
  3. 청구항 1에 있어서, 사용 동안, 상기 복수의 모듈형 세포 조제 장치는 세포들을 조제하는 것과 동시에 동작하도록 구성되는, 세포 조제 시스템.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 복수의 중간 플레이트들은 적어도 3개의 중간 플레이트들을 포함하는, 세포 조제 시스템.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 복수의 중간 플레이트들에서 상기 중간 플레이트들 각각은
    제 1 단부, 제 2 단부, 제 1 측부, 및 제 2 측부;
    상기 제 1 단부에 근접한 분배 채널; 및
    상기 제 2 단부에 근접한 수집 채널을 포함하고,
    상기 분배 채널은 상기 중간 플레이트의 상기 제 1 측부와 상기 제 2 측부 사이로 연장하고,
    상기 수집 채널은 상기 중간 플레이트의 상기 제 1 측부와 상기 제 2 측부 사이로 연장하는, 세포 조제 시스템.
  6. 청구항 5에 있어서,
    각 중간 플레이트의 상기 분배 채널은 제 1 길이를 갖고;
    각 중간 플레이트의 상기 수집 채널은 제 2 길이를 갖고;
    상기 중간 플레이트들 각각은 제 1 측부와 제 2 측부 사이의 폭을 갖고;
    상기 분배 채널의 상기 제 1 길이는 상기 중간 플레이트의 대부분의 상기 폭을 가로질러 연장하고;
    상기 수집 채널의 상기 제 2 길이는 상기 중간 플레이트의 대부분의 길이를 가로질러 연장하는, 세포 조제 시스템.
  7. 청구항 5에 있어서,
    각 중간 플레이트의 상기 분배 채널은 제 1 길이를 갖고;
    각 중간 플레이트의 상기 수집 채널은 제 2 길이를 갖고;
    상기 중간 플레이트들 각각은 제 1 측부와 제 2 측부 사이의 폭을 갖고;
    상기 분배 채널의 상기 제 1 길이는 상기 중간 플레이트의 상기 폭의 적어도 70%를 가로질러 연장하고;
    상기 수집 채널의 상기 제 2 길이는 상기 중간 플레이트의 상기 폭의 적어도 70%를 가로질러 연장하는, 세포 조제 시스템.
  8. 청구항 1에 있어서, 각 모듈형 세포 조제 장치는
    제 1 도관; 및
    제 2 도관을 더 포함하고,
    상기 입구 유체 공급 플레이트는 제 1 유체 입구, 제 1 유체 출구, 제 2 유체 입구 및 제 2 유체 출구를 포함하고;
    상기 용기는 상기 제 1 도관을 통해 상기 제 1 유체 입구에 결합되고;
    상기 용기는 상기 제 2 도관을 통해 상기 제 2 유체 출구에 결합되는, 세포 조제 시스템.
  9. 청구항 8에 있어서, 각 모듈형 세포 조제 장치의 상기 펌프는 상기 입구 유체 공급 플레이트의 상기 제 1 유체 출구 및 상기 제 2 유체 입구에 결합되는, 세포 조제 시스템.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 펌프는
    롤링 요소; 및
    유연한 도관으로서, 상기 유연한 도관은 상기 입구 유체 공급 플레이트의 상기 제 1 유체 출구 및 상기 제 2 유체 입구에 결합되는, 유연한 도관을
    포함하는, 세포 조제 시스템.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 롤링 요소에 결합된 전기 모터를 더 포함하는, 세포 조제 시스템.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 상기 제 2 유체 입구를 통하는 상기 유체의 속도는 상기 펌프의 상기 롤링 요소의 회전 속도에 의해 제어되는, 세포 조제 시스템.
  13. 청구항 10에 있어서, 사용 동안, 상기 펌프는
    상기 제 1 유체 입구 및 상기 제 1 유체 출구를 통해 상기 용기로부터 유체를 유입하고,
    상기 제 2 유체 입구를 통해 상기 유체를 상기 복수의 중간 플레이트들을 가로질러, 상기 제 2 출구 밖으로, 그리고 다시 상기 용기로 향하게 하도록 구성되는, 세포 조제 시스템.
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