WO2020027336A1 - 培養上清製剤の製造方法 - Google Patents

培養上清製剤の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2020027336A1
WO2020027336A1 PCT/JP2019/030608 JP2019030608W WO2020027336A1 WO 2020027336 A1 WO2020027336 A1 WO 2020027336A1 JP 2019030608 W JP2019030608 W JP 2019030608W WO 2020027336 A1 WO2020027336 A1 WO 2020027336A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture supernatant
medium
cells
culture
culturing
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/030608
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
井上　肇
千春 藤田
Original Assignee
株式会社細胞応用技術研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社細胞応用技術研究所 filed Critical 株式会社細胞応用技術研究所
Priority to SG11202011845XA priority Critical patent/SG11202011845XA/en
Priority to CN201980041197.4A priority patent/CN112334144A/zh
Priority to JP2020534786A priority patent/JP7386539B2/ja
Priority to US17/252,272 priority patent/US20210260135A1/en
Publication of WO2020027336A1 publication Critical patent/WO2020027336A1/ja
Priority to JP2023189703A priority patent/JP2024012530A/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/09—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C12N2502/1364—Dental pulp stem cells, dental follicle stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C12N2502/1382—Adipose-derived stem cells [ADSC], adipose stromal stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a culture supernatant preparation and the like. Specifically, a culture supernatant obtained by culturing cells using an electrolyte solution such as an infusion solution used for injection or infusion is used. It relates to a manufacturing method.
  • the culture supernatant contains substances (secretions) secreted from the cells when the cells are cultured. Therefore, a composition (culture supernatant preparation) for treating or preventing various diseases contained in the culture supernatant is considered to be effective in improving various diseases and the like.
  • Japanese Patent No. 6296622 describes a method for producing a composition for treating a damaged part containing a culture supernatant.
  • Japanese Patent No. 6152205 describes a composition for antiallergic treatment containing a culture supernatant.
  • these culture supernatant preparations contain the culture medium of the final culture step.
  • Some types of media have reduced components derived from non-human organisms, such as serum-free media and animal-free media.
  • the medium itself has been adjusted for the purpose of culturing cells. Therefore, when the culture supernatant is administered into a living body, various problems may be caused. Therefore, an object of the present invention is to provide a culture supernatant preparation having excellent biocompatibility.
  • the medium is mainly intended for culturing cells, and is not necessarily intended to administer cell supernatants to patients. Therefore, a preferred example of the present invention aims to provide a culture supernatant preparation containing a large amount of a specific gene or protein.
  • a culture supernatant preparation having excellent biocompatibility can be obtained by using the medium in the final culture stage as an electrolyte solution such as an infusion solution used for injections or infusions. Based on the knowledge that it can be done.
  • an infusion solution in which a certain kind of gene or protein is contained in the culture supernatant is larger than in the case of a normal culture medium for cell culture. Based on the finding that prevention and improvement effects may be high.
  • the first invention disclosed herein relates to a method for producing a culture supernatant preparation.
  • This method includes a first culture step, a second culture step, and a culture supernatant preparation obtaining step.
  • the first culturing step is a step of culturing the cells using the first medium until they become confluent.
  • the cells are preferably mesenchymal stromal cells derived from adipose tissue, epithelial cells derived from epidermis, or mesenchymal stem cells derived from dental pulp.
  • the second culture step is a step of, after the first culture step, culturing cells using a second medium different from the first medium as a medium.
  • the second medium is an electrolyte solution containing calcium ions and a buffer.
  • the second medium may be an infusion for injection or an infusion for infusion. It is preferable that the second culture step does not use a CO2 incubator and does not perform CO2 culture.
  • the second culture step is preferably a step of culturing cells for 5 hours or more and 5 days or less.
  • the second medium preferably further contains a prostaglandin.
  • the culture supernatant preparation obtaining step is a step of obtaining a culture supernatant preparation containing the second medium after the second culture step. It is preferable that the culture supernatant preparation contains the second medium after the second culturing step in an amount of 50% by weight or more and 100% by weight or less.
  • the step of obtaining the culture supernatant preparation preferably includes a step of adding trehalose.
  • the above method comprises, after the second culture step, a culture supernatant collection step of collecting a culture supernatant, A freezing step of freezing the culture supernatant collected in the culture supernatant collection step, Is preferable.
  • the culture supernatant preparation is a raw material for cosmetics, pharmaceuticals, foodstuffs, or beverages.
  • This culture supernatant preparation is a culture supernatant preparation produced by any of the above methods.
  • this culture supernatant preparation A first culturing step of culturing the cells to confluence using a first medium; A second culture step of culturing cells after the first culture step using a second medium different from the first culture medium as a culture medium.
  • the culture supernatant preparation contains 50% by weight or more and 100% by weight or less of the second medium after the second culturing step, and the second medium contains calcium ions and a buffer.
  • ⁇ ⁇ Another invention disclosed in the present specification is a drug solution that functions as a cell culture medium and an infusion, and the drug solution is a drug solution containing calcium ions, prostaglandin, and a buffer.
  • a culture supernatant preparation having excellent biocompatibility can be provided.
  • the first invention disclosed herein relates to a method for producing a culture supernatant preparation.
  • the culture supernatant preparation is a composition, a medicine, a cosmetic or a dietary supplement containing the culture supernatant as an active ingredient in an effective amount.
  • This method includes a first culture step, a second culture step, and a culture supernatant preparation obtaining step.
  • the first culturing step is a step of culturing the cells using the first medium until they become confluent.
  • the cell may be derived from a human or non-human mammal, may be derived from an insect, may be derived from a bird, or may be derived from a plant.
  • the cells are preferably mesenchymal stromal cells derived from adipose tissue or epithelial cells derived from epidermis.
  • a known culturing method may be appropriately adopted.
  • the culture method may be appropriately adjusted according to the target cells.
  • ⁇ -MEM or DMEM supplemented with 10 to 15% autoserum or fetal bovine serum (FBS) and antibiotics can be used.
  • FBS fetal bovine serum
  • a medium containing no human or animal-derived components may be used.
  • a growth factor such as fibroblast growth factor (bFGF) or adrenomedullin may be added.
  • Culturing can be carried out under any conditions suitable for culturing mammalian cells. Generally, culturing is performed at 37 ° C. and 5% CO 2 for several days, and the medium may be replaced as needed.
  • the second culture step is a step of, after the first culture step, culturing cells using a second medium different from the first medium as a medium.
  • the second medium is an electrolyte solution containing calcium ions and a buffer.
  • the second medium is preferably low in saccharides, and the saccharide (eg, glucose) content is preferably 1 g / l or less, may be 0.8 g / l or less, and may be 0.5 g / l.
  • 0.1 g / L to 1.5 g / L, from 0.1 g / L to 1.2 g / L, from 0.1 g / L to 1 g / L, It may be from 0.5 g / L to 1.2 g / L, or from 0.8 g / L to 1.1 g / L.
  • the calcium ion contained in the second medium is preferably from 0.045 mM to 1.802 mM, and may be from 0.074 mM to 1.505 mM, from 0.045 mM to 2 mM, or from 0.180 mM to 2 mM. Good, 1 mM or more and 2 mM or less, 1.3 mM or more and 1.8 mM or less, 1.2 mM or more and 1.6 mM or less, 1 mM or more and 1.6 mM or less, 0.045 mM or more and 1 or less. It may be .352 mM or less, 0.180 mM to 0.901 mM or less, or 20 mg / l to 100 mg / l.
  • salts contained in the second medium are NaCl, KCl, and CaCl 2 , which may be contained in an amount of 1 g / L to 30 g / L, or may be contained in a content of 4 g / L to 30 g / L, 6 g / L or more and 11 g / L or less may be contained.
  • buffers MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, Na 2 HPO 4, KH 2 PO 4, and hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid. These may be used in combination with other salts (eg, sodium bicarbonate, sodium carbonate, pyruvic acid, citric acid, and salts thereof).
  • the content of these buffers is preferably from 1 mg / l to 5 g / l, from 2 mg / l to 500 mg / l, or from 10 mg / l to 300 mg / l.
  • the acidity of the second medium is, for example, pH 5.5 or more and pH 9 or less, and may be pH 7.2 or more and pH 7.8 or less.
  • the second medium is preferably low in amino acids or contains no amino acids, and preferably has an amino acid content of 1 mg / ml or less, preferably 0.8 mg / l or less, more preferably 0.5 mg / l or less.
  • the second medium is preferably low in vitamins or contains no vitamins, and preferably has a vitamin content of 1 mg / ml or less, preferably 0.8 mg / l or less, and preferably 0.5 mg / l or less. More preferred.
  • the second medium is preferably free of antibiotics (eg, penicillin), growth factors and cytokines.
  • the second medium preferably contains little or no heavy metal elements such as iron, copper and lead or trace elements. Since there are few such elements, the synthesis of metal-containing proteins can be suppressed, and the synthesis of growth factors can be promoted. It is preferable that the second medium does not contain a carcinogen such as polyamine (for example, Putrescine 2HCl). Preferably, the second medium does not contain a purine base. If the second medium does not contain a purine base, the nucleic acid salvage pathway can be activated.
  • a carcinogen such as polyamine (for example, Putrescine 2HCl).
  • the second medium does not contain a purine base. If the second medium does not contain a purine base, the nucleic acid salvage pathway can be activated.
  • the second medium contains no or little vitamins and amino acids, which can promote autophagy and increase growth factor synthesis.
  • the second medium can maintain a constant environment during culturing in a general culturing environment (for example, it can suppress fluctuations in acidity and has a buffering capacity during culturing, so that CO2 culturing is performed. No longer needed).
  • the second medium has a higher water content than a normal medium.
  • the water content is preferably 95% by weight to 99.99% by weight, more preferably 96% by weight to 99.9% by weight, and 97% by weight to 99.9% by weight.
  • the following may be used.
  • the osmotic pressure can be reduced by the large amount of water in the medium.
  • the cells are usually removed from the culture vessel using an animal-derived digestive enzyme such as trypsin, but the use of the second medium eliminates the need for the use of the digestive enzyme.
  • side effects such as infection by an animal-derived component can be reduced.
  • the second medium contains carbohydrates (eg, glucose), salts (comprising a source of calcium ions, eg, consisting of only NaCl, KCl and CaCl 2 or containing them as the main salts), and buffers (eg, MgSO 4. H 2 O, Na 2 HPO 4 .2H 2 O, KH 2 PO 4 , NaHCO 3 , and HEPES, or those containing these as the main buffer) and the remainder consisting only of a solvent (eg, water).
  • carbohydrates eg, glucose
  • salts comprising a source of calcium ions, eg, consisting of only NaCl, KCl and CaCl 2 or containing them as the main salts
  • buffers eg, MgSO 4. H 2 O, Na 2 HPO 4 .2H 2 O, KH 2 PO 4 , NaHCO 3 , and HEPES, or those containing these as the main buffer
  • a solvent eg, water
  • the second medium may be an infusion for injection or an infusion for infusion.
  • infusions for injection include sugar solutions, extracellular fluid replenishers (physiological saline, Ringer's solution, Ringer's lactate, extracellular fluid replenishers, acetate Ringer's solution, Ringer's bicarbonate), hypotonic electrolyte solutions, amino acid preparations (high Concentrated amino acid solution, amino acid solution for renal failure, amino acid solution for liver failure, amino acid solution for children), PPN (peripheral parenteral infusion), TPN (high-calorie infusion), fat emulsion, and substitute plasma expander.
  • extracellular fluid replenishers physiological saline, Ringer's solution, Ringer's lactate, extracellular fluid replenishers, acetate Ringer's solution, Ringer's bicarbonate
  • hypotonic electrolyte solutions amino acid preparations (high Concentrated amino acid solution, amino acid solution for renal failure, amino acid solution for liver failure, amino acid solution for children), PPN (peripheral parenter
  • extracellular fluid replenishers physiological saline, Ringer's solution, Ringer's lactate, extracellular fluid replenisher, Ringer's acetate, and Ringer's bicarbonate
  • isotonic electrolytes are preferred.
  • a specific infusion is Pareplus (registered trademark).
  • the second medium Since the second medium has a low amino acid content, it can prevent the interaction with the synthetic secreted growth factor (mainly oxidation / reduction) and the polymerization reaction, prevent the deterioration of the components, and absorb moisture by the contaminating amino acids. And can prevent deterioration. In addition, since the second medium has a low amino acid content, which reduces the risk of bacterial growth when used as a cosmetic raw material, product stability can be ensured without adding preservatives and antioxidants. . When the second medium does not contain an amino acid, a deamino acid step for use in the affected area is not required, and the second medium does not become a nutrient for growing bacteria and the like resident in the affected area. This means that it does not cause odor when used on the wound surface.
  • the agent containing the second medium since it does not cause taste disturbance or body odor when the agent containing the second medium is instilled after being formulated, it is highly convenient when used as cosmetics or medicine.
  • the second medium does not contain an amino acid, desalting is easily performed. Therefore, when a large amount of cells are cultured, a high-density growth factor dried product can be easily obtained by freeze-drying. In the case of normal medium, the medium must be changed in any case between 48 and 72 hours.
  • the second medium is not an amino acid-containing medium, by suppressing the metabolic activity of the cultured cells, a long-term (for example, about 7 days) survival environment can be maintained if stored in a cool place at 4 ° C. This allows the cells to grow again.
  • the second medium is a medium containing calcium ions and a buffer, and preferably has a simple composition. Therefore, the second medium has high versatility and is suitable for all animal cells (including ES cells, iPS cells and stem cells) and plant cells ( In particular, it can be applied to callus culture of plants and maintenance of plant stem cells.
  • the CO2 culturing is not performed without using a CO2 incubator. That is, it is preferable to perform cultivation using a culture vessel without CO2 incubation.
  • the second culture step is preferably a step of culturing cells for 5 hours to 5 days (10 hours to 2 days, or 5 hours to 3 days).
  • the culture may be adhesion culture or suspension culture depending on the cells to be cultured, and when removing the cells, the cells may be cultured by a method in which the cells are easily removed.
  • the culture supernatant preparation obtaining step is a step of obtaining a culture supernatant preparation containing the second medium after the second culture step. It is preferable that the culture supernatant preparation contains the second medium after the second culturing step in an amount of 50% by weight or more and 100% by weight or less.
  • the culture supernatant preparation may contain the second medium (including the culture supernatant) after the second culture step in an amount of 60% by weight or more and 100% by weight or less, 70% by weight or more and 99% by weight or less, and 70% by weight or more and 90% by weight or less. % By weight, 80 to 99% by weight, 90 to 100% by weight, 90 to 95% by weight.
  • a supernatant component obtained by solid-liquid separation of the culture supernatant by centrifugation is used as the culture supernatant of stem cells and the like.
  • the medium obtained after the second culture step may be simply filtered.
  • the culture supernatant preparation is a processed product obtained by removing the water from the culture supernatant obtained as described above by freeze-drying, a processed product obtained by concentrating the culture supernatant under reduced pressure using an evaporator, etc., A treated product obtained by concentrating the culture supernatant using an ultrafiltration membrane or the like, a treated product obtained by solid-liquid separation of the culture supernatant using a filter, or a culture prior to the above treatment It may be a stock solution of the supernatant.
  • the supernatant obtained by culturing the cells is centrifuged (for example, 1,000 ⁇ g, 10 minutes), fractionated with ammonium sulfate (for example, 65% saturated ammonium sulfate), and the precipitate is washed with an appropriate buffer. After suspension, dialysis treatment may be performed, and filtration may be performed with a syringe filter (for example, 0.2 ⁇ m) to obtain a sterile culture supernatant.
  • the collected culture supernatant can be used as it is, or can be stored frozen and thawed at the time of use.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be added and the solution may be dispensed into a sterile container so as to have an easily handled liquid volume, for example, 0.2 ml or 0.5 ml.
  • the culture supernatant may be treated with a virus clearance filter or gamma irradiation.
  • the method may include a culture supernatant collection step of collecting the culture supernatant, and a freezing step of freezing the culture supernatant collected in the culture supernatant collection step.
  • the culture supernatant may be kept at ⁇ 200 ° C. or more and 0 ° C. or less, or may be kept at ⁇ 100 ° C. or more and ⁇ 5 ° C. or less.
  • the culture supernatant preparation may be obtained by crushing the cells after the second culturing step, centrifuging, and then filtering using a filter, or may be obtained by freezing and drying the filtrate.
  • the culture supernatant preparation may be produced by a method known to those skilled in the art.
  • the agent of the present invention can be produced as an oral preparation and a parenteral preparation, but is preferably a parenteral preparation.
  • a parenteral preparation may be a liquid preparation (aqueous liquid preparation, non-aqueous liquid preparation, suspension liquid preparation, emulsion liquid preparation, etc.) or a solid preparation (powder-filled preparation, lyophilized preparation, etc.).
  • the agent of the present invention may be a sustained-release preparation.
  • a liquid formulation is preferable, and when using a partial component of cells or whole dead cells as an agent, either a liquid agent or a solid agent can be selected.
  • An agent containing a culture supernatant as an active ingredient is known as disclosed in, for example, JP-A-2013-18756, Japanese Patent No. 5139294, and Japanese Patent No. 5526320. Therefore, the agent containing the culture supernatant of the present invention can be produced by a known method.
  • both a liquid preparation and a solid preparation can be selected.
  • powdering with excellent storage stability is often selected due to stability problems.
  • the culture supernatant of the present invention is also produced as a solid preparation in order to improve the stability and the storage period.
  • Agents containing the culture supernatant of the present invention include intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, intranasal administration, spinal cord lumen administration, intraarticular administration, intragingival administration, application, etc. Can be administered using a known administration method.
  • the agent of the present invention may be administered directly to the affected area or the target site, or the agent of the present invention may be administered by opening the affected area by surgical operation, and administered non-invasively through an endoscope or a catheter. It is also possible. All optimal administration methods are possible depending on the disease to be treated.
  • the transplantation method it is preferable to administer the culture supernatant in a dosage unit of 0.1 mL or more and 1,000 mL or less, and more preferably 30 mL or more and 300 mL or less.
  • the method for producing the liquid preparation can be a known method.
  • it can be produced by mixing mesenchymal stem cells with a pharmaceutically acceptable solvent and filling in a sterilized solution container.
  • the pharmaceutically acceptable solvent include water for injection, distilled water, physiological saline, an electrolyte solution, or a solution having a composition similar to that of a culture solution, and it is preferable to use a sterilized solvent.
  • containers for sterilized solutions are ampules, vials, syringes, and bags. Known containers such as glass and plastic can be used for these containers.
  • examples of the plastic container are those using materials such as polyvinyl chloride, polyethylene, polypropylene, and ethylene / vinyl acetate / copolymer.
  • sterilization methods for these containers and solvents include heating methods (flame method, drying method, high-temperature steam method, flowing steam method, boiling method, etc.), filtration methods, irradiation methods (radiation method, ultraviolet method, high-frequency method, etc.), The gas method and the chemical solution method.
  • Such a sterilization method can be appropriately selected and used by those skilled in the art according to the material of the container and the properties of the solvent.
  • the present specification also discloses a preparation containing a cultured cell.
  • intravenous injection is most often used as a transplantation method.
  • the solution it is preferable to adjust the solution to a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / mL or more and 5 ⁇ 10 7 cells / mL or less, and 1 ⁇ 10 6 cells / mL or more and 1 ⁇ 10 7 cells / mL. mL is more preferred.
  • the mesenchymal stem cell preparation adjusted as one administration unit for intravenous injection in human is preferably 1 ⁇ 10 5 cells or more and 1 ⁇ 10 9 cells, more preferably 2 ⁇ 10 7 cells or more and 2 ⁇ 10 8 cells. It is.
  • Other routes of administration can be used within the range of the volume that can be transplanted into the tissue and the maximum number of cells that can be suspended in the volume.
  • a method for producing a solid preparation for example, a freeze-drying method, a spray-drying method, and an aseptic recrystallization method can be used.
  • Agents containing cells are administered using known administration methods such as intravenous, intraarterial, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intraspinal, intraarticular, and gingival administration. Can be administered. A preferable example of the administration form is administration by injection. In the case of intravenous administration, the agent of the present invention may be infused by drip.
  • the cells may be prepared with a pharmaceutically acceptable carrier or vehicle.
  • Pharmaceutically acceptable carriers or vehicles include, for example, excipients, stabilizers, solubilizers, emulsifiers, suspending agents, buffers, isotonic agents, antioxidants, or preservatives. Substances that are acceptable. Further, a polymer material such as polyethylene glycol (PEG) or a conjugation inhibitor such as cyclodextrin can also be used. Examples of excipients are those which themselves have no pharmacological action, such as starch or lactose. Examples of stabilizers are albumin, gelatin, sorbitol, mannitol, lactose, sucrose, trehalose, maltose, and glucose.
  • sucrose or trehalose is preferred.
  • solubilizers are ethanol, glycerin, propylene glycol, and polyethylene glycol.
  • emulsifiers are lecithin, aluminum stearate, or sorbitan sesquioleate.
  • suspending agents are macrogol, polyvinylpyrrolidone (PVP), or carmellose (CMC).
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • CMC carmellose
  • tonicity agents sodium chloride and glucose.
  • buffers are citrate, acetate, boric acid, and phosphate.
  • aqueous medium for suspending the cells for example, an aqueous solution for injection in which the osmotic pressure and pH are adjusted to near the blood value and the salt concentration and the like may be appropriately used may be used.
  • Ringer's solution such as acetic acid-ringer solution or other infusions, physiological saline, glucose solution, or the like can be used, but is not limited thereto.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • HSA human serum albumin
  • antioxidants are ascorbic acid, sodium bisulfite, and sodium pyrosulfite.
  • preservatives are phenol, thimerosal, and benzalkonium chloride.
  • the present invention includes a step of administering a culture supernatant (or a cultured cell, or a purified product derived from a cultured cell) to a subject in order to treat various diseases of the subject (human or non-human mammal) and improve various abilities. , Also provide a method.
  • ⁇ ⁇ Another invention disclosed in the present specification is a drug solution that functions as a cell culture medium and an infusion, and the drug solution is a drug solution containing calcium ions, prostaglandin, and a buffer.
  • the above-described second medium may be appropriately used as this chemical.
  • the culture supernatant functions as an eicosanoid production promoter.
  • This agent is preferably a therapeutic agent for arteriosclerosis or diabetes.
  • Patent No. 6250196 describes that a PPAR agonist is a therapeutic agent for diabetes.
  • Japanese Patent No. 4515026 shows that activating PPAR ⁇ is effective for treating diabetes.
  • Japanese Patent No. 6157041 discloses that a PPAR ⁇ activator is effective for treating arteriosclerosis and diabetes. Since the agent of the present invention activates PPAR ⁇ , it is effective for treating arteriosclerosis and diabetes.
  • This agent is preferably a therapeutic agent for rheumatoid arthritis.
  • 15-deoxy-delta-12,14-prostaglandin J2 is known to suppress rheumatic clinical score, pain, and edema (Mediators Inflamm. 2016; 2016: 9626427. Epub 2016) Oct 31.).
  • the agent of the present invention promotes the production of eicosanoid which is an activator of PPAR ⁇ from macrophages.
  • the agent promotes the production of 15-deoxy-delta-12,14-prostaglandin J2. It is effective for treating rheumatism.
  • This agent is preferably a prophylactic or therapeutic agent for prostate cancer, cerebral infarction, or cerebral dysfunction. For example, Cancer Res. 2001 2001 Jan 15; 61 (2): 497-503.
  • 15-HETE suppresses the growth of prostate cancer cell line (PC3) and suppresses multiple carcinomas. Have been.
  • J-Lipid Res. 2015 Mar; 56 (3): 502-14 shows that administration of 15-HETE suppresses brain tissue injury level after cerebral ischemia and inflammatory response in the brain in a cerebral infarction model. It has been reported.
  • the agent of the present invention promotes the production of eicosanoid which is an activator of PPAR ⁇ from macrophages.
  • the agent of the present invention promotes the production of 15-hydroxyeicosatetraenoic acid (15-HETE). It is effective for the treatment of.
  • a peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR ⁇ ) activator can prevent and improve at least one of hypertension, insulin resistance disease, cerebral infarction, Alzheimer's disease, and neurological disease.
  • PPAR ⁇ peroxisome proliferator-activated receptor gamma
  • the agent of the present invention activates PPAR ⁇ , it is effective for prevention and treatment of cerebral infarction and cerebral dysfunction.
  • This agent is preferably a prophylactic or therapeutic agent for pain.
  • Exp. Ther. ⁇ Med. In 2016 ⁇ Oct; 12 (4): 2644--2650. ⁇ Administration of pioglitazone, an activator of PPAR ⁇ , suppresses activated microglia in neuropathic pain and consequently reduces pain threshold for mechanical stimulation It is shown.
  • the agent of the present invention promotes the production of eicosanoid which is an activator of PPAR ⁇ from macrophages. For example, it promotes the production of 15-deoxy-delta-12,14-prostaglandin J2, and It is effective for prevention or treatment of
  • ⁇ Patent No. 6132459 ⁇ describes a prophylactic / therapeutic agent for enteritis containing a culture supernatant of mesenchymal stem cells. Therefore, the agent containing the culture supernatant of the present invention is effective for the prevention and treatment of enteritis.
  • the medium was removed, and the cell surface was washed with PBS (Dulbecco's phosphate buffer manufactured by DS Pharma Biomedical).
  • the cells after washing were replaced with FBS-free DME medium or HBSS (Hank's balanced salt solution manufactured by Sigma-Aldrich) -HEPES.
  • the 12 wells were divided into 4 groups of 3 wells, and the FBS-free DME medium was cultured in a 5% CO2 incubator (Reference Example), and the HBSS-HEPES was cultured in an incubator (Example).
  • the replacement (0 hour), 3 hours, 6 hours, 24 hours, and 48 hours, the culture supernatant in each well was collected.
  • the FBS-free DME medium is a Dulbecco's modified Eagle medium without FBS.
  • the DME medium contains various components such as glucose and L-glutamine.
  • HBSS Hort's balanced salt solution
  • HEPES is hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid, a buffer or pH adjuster.
  • the amount of carbohydrate contained in the FME-free DME medium was 4.5 g / L, the total amount of amino acids (L-glutamic acid and the like) was 1.6 g / L, and the amount of calcium ions was 1.8 mM.
  • the amount of carbohydrate contained in the HBSS-HEPES medium is 1.0 g / L
  • NaCl is 8.0 g / L
  • KCl is 0.4 g / L
  • CaCl 2 is 0.14g / L
  • MgSO 4 ⁇ H 2 O is, 0.2g / L
  • Na 2 HPO 4 ⁇ 2H 2 O is, 0.06g / L
  • KH 2 PO 4 are, 0.06g / L
  • NaHCO 3 Was 0.35 g / L, 20 mM HEPES pH 7.4, the total amount of amino acids (L-glutamic acid, etc.) was 0 g / L, and calcium ion was 1.5 mM.
  • RNA extract ISOGEN Nippon Gene No. 319-90211
  • RNA was extracted, and the precipitate of total RNA obtained using ethatin mate (Nippon Gene No. 312-117991) was dissolved in nuclease-free water.
  • concentration of total RNA was measured by nanodrop (Thermo Scientific).
  • Complementary DNA was synthesized from 100 nanograms of the obtained total RNA using an Iscript cDNA synthesis kit (BIO RAD No. 1708891) and used for quantification of each gene expression level by real-time PCR (Rotor Gene Q manufactured by QIAGEN). .
  • Quantification of gene expression by real-time PCR The synthesized DNA, primers specific to the gene to be detected and quantified (Quantitect Primer Assay, QIAGEN), and real-time PCR reagents (RotorGene SYBR Green, QIAGEN) are mixed, and a RotorGeneQ system (QIAGEN) is mixed. Real-time PCR was performed to amplify the gene fragments to be detected and quantified. At this time, a primer specific for ⁇ -Actin, which is a housekeeping gene, was similarly amplified, and the quantitative value of the gene to be detected and quantified was calculated relatively using the amplification curve as an index. The following primer mixtures from QIAGEN were used as primers specific to each gene.
  • results of real-time PCR Hanks-HEPES solution had the highest expression level of VEGF gene in cells.
  • the Hanks-HEPES solution had the highest expression level of the FGF-2 gene in the cells.
  • the Hanks-HEPES solution had the largest amount of VEGF in the culture supernatant.
  • the amount of FGF-2 in the culture supernatant was highest in the DME medium.
  • both the gene expression level and the protein level in the culture supernatant tended to increase over time.
  • the Hanks-HEPES solution (Example) had the largest expression amount of VEGF gene and the amount of protein in the culture supernatant.
  • the Hanks-HEPES solution had the largest amount of FGF-2 gene expression, but the DME (H) (Reference Example) had a larger amount of protein in the culture supernatant.
  • the keratinocytes obtained by enzymatically treating and extracting normal human skin tissue were non-coated using a serum-free cell culture medium (Gibco No. MEPI500CA) containing supplement S7 (Gibco No. S0175).
  • a serum-free cell culture medium Gibco No. MEPI500CA
  • S7 Gibco No. S0175
  • the primary cultured cells immediately before confluence were collected by enzyme treatment, and then seeded on the same medium in a non-coated 12-well plate for culture (manufactured by Sumitomo Bakelite) and cultured until they became confluent.
  • the medium was removed, the cell surface was washed with PBS (Dulbecco's phosphate buffer manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.), and a medium for serum-free cells without supplement 7 (EpiLife: Reference Example) , Or HBSS-HEPES pH 7.4 solution (Example). Thereafter, the 12 wells were divided into four groups of 3 wells, and immediately after replacement (0 hour), 3 hours, 6 hours, and 24 hours later, the culture supernatant in each well was collected.
  • PBS Dulbecco's phosphate buffer manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.
  • a medium for serum-free cells without supplement 7 EpiLife: Reference Example
  • HBSS-HEPES pH 7.4 solution Example
  • the amount of carbohydrate contained in the serum-free cell culture medium without supplement 7 was 1.0 mg / L, the total amount of amino acids (L-glutamic acid, etc.) was 1.5 g / L, and calcium ions were It was 8.4 mg / L.
  • RNA extract ISOGEN Nippon Gene No. 319-90211
  • RNA was extracted, and a precipitate of total RNA obtained using etachin mate (Nippon Gene No. 312-11791) was dissolved in nuclease-free water.
  • concentration of total RNA was measured by nanodrop (Thermo Scientific).
  • Complementary DNA was synthesized from 100 nanograms of the obtained total RNA using iScript cDNA Synthesis Kit (BIO RAD No. 1708891), and used for quantification of the expression level of each gene by real-time PCR (Rotor Gene Q manufactured by QIAGEN).
  • Quantification of gene expression by real-time PCR method A primer specific to the gene to be quantified (QuantitTact Primer Assay, QIAGEN) and a real-time PCR reagent (Rotor-Gene SYBR Green, QIAGEN) are mixed, and a Rotor-GeneQ system ( QIAGEN), real-time PCR was performed to amplify the gene fragments to be detected and quantified.
  • QIAGEN Rotor-GeneQ system
  • a primer specific for ⁇ -Actin which is a housekeeping gene, was similarly amplified, and the amplification curve was used as an index to relatively calculate the quantitative value of the gene to be detected and quantified.
  • the following primer mixtures from QIAGEN were used as primers specific to each gene.
  • the expression level of the EGF gene in the cells was greater in the Hanks-HEPES solution (Example) than in the EpiLife medium (Reference Example).
  • the FGF-2 gene expression level in the cells was larger in the Hanks-HEPES solution than in EpiLife.
  • the expression level of VEGF gene in cells was larger in Hanks-HEPES solution than in EpiLife.
  • the amount of VEGF in the culture supernatant was larger in Hanks-HEPES.
  • Paleplus means Pareplus infusion, glucose, sodium chloride, sodium L-lactate, calcium chloride hydrate, magnesium sulfate hydrate, zinc sulfate hydrate, thiamine chloride hydrochloride, pyridoxine hydrochloride, cyanocobalamin, bread Contains tenol, glacial acetic acid, amino acids, electrolytes, stabilizers, and pH regulators.
  • KN2 indicates KN2 infusion.
  • KN2 infusion contains sodium chloride, potassium chloride, sodium L-lactate, magnesium chloride, sodium dihydrogen phosphate hydrate, dipotassium phosphate and glucose.
  • the culture supernatant after 48 hours in the second culture step is collected in a 50 mL centrifuge tube (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), and centrifuged (740 G, 5 minutes).
  • the mixture was passed through a filtration filter (Kurashiki Boseki Co., Ltd.) having a membrane pore size of 0.2 ⁇ m and dispensed into a syringe (Termo Co., Ltd.).
  • the syringe was sealed in a sterile bag, frozen in a freezer at ⁇ 80 ° C., transferred to a freeze-drying apparatus (Yamato Scientific Co., Ltd.), and freeze-dried. After the freeze-drying was completed, it was sealed with a lure cap for syringe (Termo Corporation).
  • Example 2 After confirming that the adipose tissue-derived stromal cells became confluent as in Example 1, the medium was removed, and the cell surface was washed with PBS. The washed cells were replaced with HBSS-HEPES. Thereafter, the 12 wells were divided into 6 groups of 2 wells, and HBSS-HEPES was cultured in an incubator (Example). Immediately after the replacement (0 hour), 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, and 6 days after, total RNA was extracted from cells in each well using ISOGEN (manufactured by Nippon Gene), and VEGF was subjected to real-time PCR. Relative quantification of gene expression was performed. Table 9 shows the results. As shown in Table 9, it was revealed that gene expression was maintained until 5 days later.
  • ISOGEN manufactured by Nippon Gene
  • Example 2 After confirming that the adipose tissue-derived stromal cells became confluent as in Example 1, the medium was removed, and the cell surface was washed with PBS. The cells after washing were replaced with HBSS-HEPES pH 6.5, HBSS-HEPES pH 7.0, HBSS-HEPES pH 7.4, HBSS-HEPES pH 7.8, and HBSS-HEPES pH 9.0. Immediately after replacement (0 hour) and 48 hours later, total RNA was extracted from cells in each well using ISOGEN (manufactured by Nippon Gene), and the relative expression of VEGF gene expression was determined by real-time PCR. Table 10 shows the results. As shown in Table 10, it was revealed that gene expression was maintained from HBSS-HEPES pH 7.0 to HBSS-HEPES pH 7.8.
  • adipose tissue-derived stromal cells were cultured in a 12-well plate, and after confirming that they had become confluent, the medium was removed and the cell surface was washed with PBS.
  • the washed cells were divided into four groups of three wells each, and HBSS-HEPES to which PGE1 (Prostandin Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd.) was added at a concentration of 0 ng / mL, 4 ng / mL, 40 ng / mL, and 400 ng / mL, respectively. And the cells were cultured in an incubator (Example).
  • Adipose tissue-derived stromal cells (ASC) extracted by enzymatic treatment of normal human adipose tissue were cultured in a DME medium (Gibco Dulbecco's modified Eagle medium, high glucose) containing 20% FBS (fetal bovine serum). The cells were cultured in a flask T75 (manufactured by BD FALCON) and used as primary culture. Primary culture cells immediately before confluence were collected by enzyme treatment, diluted appropriately, and an appropriate amount of cells were seeded in the same medium on one 6-well culture plate (manufactured by Sumitomo Bakelite) and cultured until confluence.
  • DME medium Gibco Dulbecco's modified Eagle medium, high glucose
  • FBS fetal bovine serum
  • the confluent cells in each well were divided into two groups of three wells, each medium was removed, and the cell surface of each well was washed with PBS (Dulbecco's phosphate buffer manufactured by DS Pharma Biomedical). After washing, DME high glucose medium was added to the first group, HBSS (Hank's balanced salt solution manufactured by Sigma-Aldrich) adjusted to a final concentration of 10 mM HEPES pH 7.4 was added to the second group, and the third group was used. , HBSS prepared to a final concentration of 20 mM HEPES pH 7.4 was added.
  • PBS Dynabecco's phosphate buffer manufactured by DS Pharma Biomedical
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • FGF2 basic vascular endothelial growth factor
  • MMP1 EFNA3, BMP1, and WNT5A genes
  • WNT5A WNT5A genes
  • Tables 12 to 17 The relative quantitative value was calculated between the samples using beta-actin as an internal standard, and the value in the DME high glucose medium was calculated as a reference value.
  • each mRNA in the cells tended to be expressed more in the cells cultured in HBSS-10 mM HEPES pH 7.4 than in the DME medium, and the HEPES concentration was 20 mM. Turned out to be more.
  • adipose tissue-derived stromal cells were seeded on five 6-well plates for culture (manufactured by Sumitomo Bakelite) and cultured until they became confluent.
  • human dental pulp stem cells SHED
  • the cells in each well were divided into three groups of 2 wells, each medium was removed, and the cell surface of each well was washed with PBS (Dulbecco's phosphate buffer manufactured by DS Pharma Biomedical). And washed.
  • HBSS Hormon's balanced salt solution manufactured by Sigma-Aldrich
  • VEGF gene expression level was quantified relative to the amount of VEGF gene by real-time PCR (Rota Gene Q, manufactured by QIAGEN). The relative quantitative value was corrected between samples using beta-actin as an internal standard, and was calculated using a standard value of 2 mL of the medium as a reference value.
  • the amount of VEGF protein contained in the culture supernatant was smaller when the volume of the culture supernatant was large, and was larger when the volume of the culture supernatant was small. From this, it was found that a culture supernatant containing more growth factors can be obtained by using a smaller amount of medium than the volume of a medium that is usually used.
  • Example 5 the culture supernatant after the elapse of 48 hours in the second culture step was collected, and the culture supernatant obtained by centrifugation (740 G, 5 minutes) was added to a non-added group, 250 mM A group to which trehalose (manufactured by Hayashibara) was added was divided into two groups. Thereafter, the solution was passed through a filtration filter having a membrane pore size of 0.2 ⁇ m (Kurashiki Spinning Co., Ltd.) and dispensed into a syringe (Termo Corporation).
  • a filtration filter having a membrane pore size of 0.2 ⁇ m (Kurashiki Spinning Co., Ltd.) and dispensed into a syringe (Termo Corporation).
  • the syringe was sealed in a sterile bag, frozen in a freezer at ⁇ 80 ° C., transferred to a freeze-drying apparatus (Yamato Scientific Co., Ltd.), and freeze-dried. After the freeze-drying was completed, the syringe was sealed with a lure cap for syringes (Termo Corporation). In a sealed state, each was stored for three weeks under three temperature conditions of -80 ° C, 4 ° C, and 25 ° C.
  • Adipose tissue-derived stromal cells extracted by enzymatic treatment of normal human adipose tissue were cultured in a culture flask (FALCON) using a DME medium containing 20% FBS (fetal bovine serum) (Dulbecco's modified Eagle medium, Gibco, high glucose). And the primary culture.
  • FBS fetal bovine serum
  • the primary culture cells immediately before confluence were collected by enzyme treatment, and then seeded on the same medium in five culture flasks T75 (manufactured by BD FALCON) and cultured until they became confluent. After confirming that the cells were confluent, the medium was removed, and the cell surface was washed with PBS (Dulbecco's phosphate buffer manufactured by DS Pharma Biomedical).
  • one of the exosomes was isolated and extracted from the culture supernatant using an Exosome Isolation Kit (manufactured by Fujifilm Wako) according to a standard method (sample 1).
  • the amount of the extracted Exome extract was 0.1 mL.
  • the other one was stored as it was in a 1.5 mL tube (manufactured by Eppendorf) (sample 2).
  • the Exomesome Kit manufactured by Fujifilm Wako Co.
  • the Exome was isolated and extracted from the sample 1 from which Exosomen was isolated and extracted and the culture supernatant sample 2 which was only subjected to the enrichment according to a standard method. Quantitatively.
  • the quantitative value was obtained by calculating the difference between the absorbance at 450 nm and the absorbance at 650 nm, correcting with the blank value, and expressing the value of the absorbance as the integrated value of the absorbance contained in 15 mL of the culture supernatant.
  • Table 21 shows the results. As shown in Table 21, from the comparison of the absorbance values of the two, it was found that the culture supernatant obtained by the present production method contained Exome, and that a considerable amount of Exome could be utilized without the need to isolate and extract it. Was.
  • Adipose tissue-derived stromal cells (ASC) extracted by enzymatic treatment of normal human adipose tissue were cultured in a DME medium (Gibco Dulbecco's modified Eagle medium, high glucose) containing 20% FBS (fetal bovine serum). The cells were cultured in a flask T75 (manufactured by BD FALCON) and used as primary culture. The primary culture cells immediately before confluence were collected by enzyme treatment, and then seeded on the same medium in two 6-well plates for culture (manufactured by Sumitomo Bakelite) and cultured until they became confluent.
  • DME medium Gibco Dulbecco's modified Eagle medium, high glucose
  • FBS fetal bovine serum
  • the confluent cells in each well were divided into two groups of three wells, each medium was removed, and the cell surface of each well was washed with PBS (Dulbecco's phosphate buffer manufactured by DS Pharma Biomedical). After washing, 2 mL of HBSS (Hank's balanced salt solution manufactured by Sigma-Aldrich) -HEPES pH 7.4 was added to the two groups, and the cells were cultured in an incubator (Example) for 24 hours or 48 hours. After 24 hours or 48 hours, for the first group, the culture supernatant was collected in a 5 mL tube (manufactured by BD FALCON) as usual.
  • HBSS Horbecco's phosphate buffer manufactured by DS Pharma Biomedical
  • the adherent cells were collected together with the culture supernatant into a 5 mL tube using a cell scraper (manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.), and the cells were disrupted using a Hiscotron (manufactured by Nichion Medical Science Instrument Co., Ltd.). , As a measurement sample.
  • Each sample was quantified for VEGF protein using QUANTIKINE ELISA Human VEGF (manufactured by R & D SYSTEMS).
  • the relative quantitative value of VEGF protein contained in the cell-containing culture supernatant was calculated based on the quantitative value of VEGF protein obtained from the first group (culture supernatant). The results are shown in Tables 22 and 23.
  • the relative quantitative value is a value obtained by calculating the relative quantitative value of VEGF protein contained in each sample after 48 hours of culture, based on the quantitative value of VEGF protein obtained from the culture supernatant after 24 hours of culture. It is. As shown in Tables 22 and 23, it became clear that more growth factors could be utilized by using the cell-containing culture supernatant.
  • ⁇ ⁇ Fibroblasts were selectively cultured from epidermis cells derived from healthy human skin tissue by an ordinary method. The obtained primary culture was maintained and cultured, and the fourth passage was seeded on five 6-well plates (manufactured by Sumitomo Bakelite) and cultured until confluent. The confluent cells in each well were divided into two groups of three wells, each medium was removed, and the cell surface of each well was washed with PBS (Dulbecco's phosphate buffer manufactured by DS Pharma Biomedical).
  • PBS Dulbecco's phosphate buffer manufactured by DS Pharma Biomedical
  • HBSS Hormon's balanced salt solution manufactured by Sigma-Aldrich
  • the second and third groups were replaced with the same amount of HBSS-HEPES pH 7.4.
  • the culture supernatants (ASCsup.) Derived from adipose tissue stem cells shown in the above were replaced with solutions added to a final concentration of 10% and 50%, respectively. Thereafter, the cells were cultured in an incubator for 3, 6, 24 or 48 hours.
  • Gene Q manufactured by QIAGEN was used for relative quantification of FGFbasic and VEGF gene expression levels. The relative quantification value was corrected between samples using beta-actin as an internal standard, and the value of each gene expression level of the cells at the time of confluence was calculated as a reference value. The results are shown in Tables 24 and 25.
  • the FGF-basic gene As shown in Tables 24 and 25, regarding the FGF-basic gene, ASC-sup.
  • the expression tended to increase with the lapse of time up to 24 hours after the medium replacement, but stopped after 48 hours.
  • the addition group the expression increased over time up to 48 hours after replacement, and the increase rate increased depending on the amount of addition.
  • the VEGF gene the expression of the non-added group and the added group tended to increase with the lapse of time until 48 hours after replacement, and ASC-sup. The rate of increase increased remarkably depending on the amount of addition of. It was suggested that the addition of adipose tissue-derived stromal cell culture supernatant to fibroblasts promoted the expression of growth factors of the cells themselves and was effective for tissue regeneration.
  • Epidermal cells derived from normal human skin tissue were extracted by a conventional method and seeded on a 6-well plate. At that time, the culture was divided into two groups, an EpiLife medium, and a culture medium derived from the adipose tissue stem cells shown in Example 1 added to the EpiLife medium, and cultured until confluent. After confirming that the cells became confluent, L-DOPA staining was performed according to a conventional method, and the color tone of the pigment stem cells contained in the epidermal cells was quantified. The quantitative value was obtained from the ratio of the area of the black portion of the dye stem cells stained with L-DOPA using the image software ImageJ. The results are shown in Table 26.
  • the medium to which the culture supernatant derived from adipose tissue stem cells was added had a lower quantitative value of the color tone by L-DOPA staining of the pigment stem cells present in the epidermal cells. It was suggested that the culture supernatant of (1) has a function of suppressing the proliferation of pigment stem cells and differentiation into pigment cells. Therefore, it became clear that it was effective as a whitening component.
  • Example 5 A freeze-dried product of Example 5 and the culture supernatant was produced.
  • the lyophilized culture supernatant prepared from 1 ml of the culture supernatant was thawed into 1 ml of two types of hyaluronic acid preparations, namely, styrene sulfide (manufactured by GALDETRAMA) and verotello (manufactured by MERZ).
  • the lyophilized culture supernatant was found to thaw into hyaluronic acid. Therefore, when the hyaluronic acid is administered subcutaneously or intra-articularly, the lyophilized culture supernatant can be administered together with the hyaluronic acid, so that it could be used as a raw material of a pharmaceutical.
  • Example 5 A freeze-dried product of Example 5 and the culture supernatant was produced.
  • the lyophilized culture supernatant prepared from 1 ml of the culture supernatant was thawed in 1 ml of distilled water and used as a lotion, food, and beverage.
  • 1 g of Hirudoid soft ointment (manufactured by Maruho Co., Ltd.) as a hydrophilic ointment was melted and used as an ointment. Therefore, it could be used as a raw material for cosmetics, pharmaceuticals, foods, and beverages.
  • the invention can be used in the pharmaceutical industry.

Abstract

【解決課題】　生体親和性に優れ，特定の遺伝子又はタンパク質を多く含む培養上清製剤を提供することを目的とする。 【解決手段】　細胞を，第１培地を用いてコンフルエントとなるまで培養する第１培養工程と，　第１培養工程の後に，第１培地と異なる第２培地を培地として，前記細胞を培養する第２培養工程と，　第２培養工程の後に，第２培地を含む培養上清製剤を得る培養上清製剤取得工程を含み，　第２培地は，カルシウムイオン及び緩衝剤を含む，　培養上清製剤の製造方法。

Description

培養上清製剤の製造方法
　本発明は，培養上清製剤の製造方法などに関する。具体的に説明すると，注射や点滴に用いられる輸液などの電解質溶液を用いて，細胞を培養して得られた培養上清を用い，細胞培養用の培地の混入が少ない，培養上清製剤の製造方法に関する。
　培養上清は，細胞を培養する際に細胞から分泌された物質（分泌物）を含む。このため，培養上清に含まれる各種疾患の治療又は予防用の組成物（培養上清製剤）は，様々な疾患などの改善に有効であると考えられている。例えば，特許第６２９６６２２号公報には， 培養上清を含む損傷部治療用組成物の製造方法が記載されている。特許第６１５２２０５号公報には，培養上清を含有する抗アレルギー治療用組成物が記載されている。
特許第６２９６６２２号公報 特許第６１５２２０５号公報
　一方，これらの培養上清製剤は，最終的な培養工程の培地を含む。培地の種類には，無血清培地やアニマルフリー培地といった，ヒト以外生物由来の成分を軽減したものもある。しかし，培地自体は，細胞を培養する目的で調整されたものである。このため，培養上清を生体内に投与する場合，様々な問題を引き起こす可能性があった。そこで，本発明は，生体親和性に優れた培養上清製剤を提供することを目的とする。また，培地は，細胞を培養することを主目的としており，必ずしも細胞上清を患者に投与することを目的としていない。このため，本発明の好ましい例は，特定の遺伝子又はタンパク質を多く含む培養上清製剤を提供することを目的とする。
　本発明は，基本的には，最終培養段階の培地を，注射剤や点滴などに用いられている輸液などの電解質溶液とすることで，生体親和性に優れた培養上清製剤を得ることができるという知見に基づく。また，後述する実施例により実証された通り，通常の細胞培養用の培地に比べて，輸液を用いた方が，ある種の遺伝子やタンパク質が培養上清中に多く含まれており，各種治療，予防，改善効果も高い場合があるという知見に基づく。
　本明細書に開示される最初の発明は，培養上清製剤の製造方法に関する。
　この方法は，第１培養工程と，第２培養工程と，培養上清製剤取得工程を含む。
　第１培養工程は，細胞を，第１培地を用いてコンフルエントとなるまで培養する工程である。細胞は，脂肪組織由来間葉系間質細胞，表皮由来上皮系細胞又は歯髄由来間葉系幹細胞であることが好ましい。
　第２培養工程は，第１培養工程の後に，第１培地と異なる第２培地を培地として，細胞を培養する工程である。
　第２培地は，カルシウムイオン及び緩衝剤を含む電解質溶液である。第２培地は，注射用の輸液又は点滴用の輸液であってもよい。第２培養工程は，ＣＯ２培養器を用いず，ＣＯ２培養を行わないものが好ましい。第２培養工程は，５時間以上５日以下細胞を培養する工程であることが好ましい。第２培地はさらにプロスタグランジンを含むものが好ましい。
　培養上清製剤取得工程は，第２培養工程の後に，第２培地を含む培養上清製剤を得る工程である。培養上清製剤は，第２培養工程後の第２培地を５０重量％以上１００重量％以下含むことが好ましい。培養上清製剤取得工程はトレハロースを添加する工程を含むことが好ましい。
　上記の方法は，第２培養工程の後に，培養上清を回収する培養上清回収工程と，
　培養上清回収工程で回収した培養上清を凍結する凍結工程と，
　をさらに含むものが好ましい。培養上清製剤が，化粧品，医薬品，食料品，又は飲料の原料であるものが好ましい。
　本明細書に開示される上記とは別の発明は，培養上清製剤に関する。この培養上清製剤は，上記のいずれかの方法により製造された培養上清製剤である。
　つまり，この培養上清製剤は，
　細胞を，第１培地を用いてコンフルエントとなるまで培養する第１培養工程と，
　第１培養工程の後に，第１培地と異なる第２培地を培地として，細胞を培養する第２培養工程とを含む培養上清製剤の製造方法により製造されたものである。そして，培養上清製剤は，第２培養工程後の第２培地を５０重量％以上１００重量％以下含み第２培地は，カルシウムイオン及び緩衝剤を含む。
　本明細書に開示される上記とは別の発明は，細胞培養用培地及び輸液として機能する薬液であって，薬液は，カルシウムイオン，プロスタグランジン及び緩衝剤を含む，薬液である。
　本発明によれば，生体親和性に優れた培養上清製剤を提供できる。　
　以下，本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
本明細書に開示される最初の発明は，培養上清製剤の製造方法に関する。培養上清製剤とは，培養上清を有効成分として有効量含む組成物，医薬，化粧品又は栄養補助食品である。この方法は，第１培養工程と，第２培養工程と，培養上清製剤取得工程を含む。
　第１培養工程は，細胞を，第１培地を用いてコンフルエントとなるまで培養する工程である。細胞は，ヒト又は非ヒト哺乳動物由来であってもよいし，昆虫由来であってもよいし，鳥類由来であってもよいし，植物由来であっても良い。細胞は，脂肪組織由来間葉系間質細胞又は表皮由来上皮系細胞であることが好ましい。第１培養工程は，公知の培養方法を適宜採用すればよい。
　培養方法は，対象となる細胞に応じて適宜調整すればよい。培養液の例は，１０～１５%の自己血清または牛胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質を補充したα-ＭＥＭやＤＭＥＭを用いることができる。ヒト又は動物由来の成分を含まない培地を用いてもよい。必要に応じて線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）やアドレノメデユリンなどの成長因子を加えてもよい。培養は，哺乳動物の細胞の培養に適する任意の条件で実施することができるが，一般的には３７℃，５％ ＣＯ２で数日間培養し，必要に応じて培地を交換すればよい。
　第２培養工程は，第１培養工程の後に，第１培地と異なる第２培地を培地として，細胞を培養する工程である。
　第２培地は，カルシウムイオン及び緩衝剤などを含む電解質溶液である。また，第２培地は，糖質が少ないものが好ましく，糖質（例えばグルコース）の含有量が，１ｇ／ｌ以下であることが好ましく，０．８ｇ／ｌ以下でもよく，０．５ｇ／ｌ以下でもよいし，０．１ｇ／Ｌ以上１．５ｇ／Ｌでもよく，０．１ｇ／Ｌ以上１.２ｇ／Ｌ以下でもよいし，０．１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下でもよいし，０．５ｇ／Ｌ以上１.２ｇ／Ｌ以下でもよいし，０．８ｇ／Ｌ以上１.１ｇ／Ｌ以下でもよい。
　第２培地に含まれるカルシウムイオンは，０．０４５ｍＭ以上１．８０２ｍＭ以下が好ましく，０．０７４ｍＭ以上１．５０５ｍＭ以下でもよいし，０.０４５ｍＭ以上２ｍＭ以下でもよいし，０.１８０ｍＭ以上２ｍＭ以下でもよいし，１ｍＭ以上２ｍＭ以下でもよいし，１．３ｍＭ以上１．８ｍＭ以下でもよいし，１．２ｍＭ以上１．６ｍＭ以下でもよいし，１ｍＭ以上１．６ｍＭ以下でもよいし，０.０４５ｍＭ以上１.３５２ｍＭ以下でもよいし，０.１８０ｍＭ以上０.９０１ｍＭ以下でもよいし，２０ｍｇ／ｌ以上１００ｍｇ／ｌ以下でもよい。第２培地に含まれる塩類の例は，ＮａＣｌ，ＫＣｌ，及びＣａＣｌ２であり，１ｇ／Ｌ以上３０ｇ／Ｌ以下含まれてもよいし，４ｇ／Ｌ以上３０ｇ／Ｌ以下含まれてもよく，６ｇ／Ｌ以上１１ｇ／Ｌ以下含まれてもよい。
　緩衝剤の例は，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，Ｎａ２ＨＰＯ４，ＫＨ２ＰＯ４，及びヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸である。これらは，他の塩（例えば炭酸水素ナトリウム，炭酸ナトリウム，ピルビン酸，クエン酸，並びにその塩類など）と併せて用いられてもよい。これらの緩衝剤の含有量は，１ｍｇ／ｌ以上５ｇ／ｌ以下であることが好ましく，２ｍｇ／ｌ以上５００ｍｇ／ｌ以下でもよいし，１０ｍｇ／ｌ以上３００ｍｇ／ｌ以下でもよい。
　第２培地の酸性度は，例えばｐH５．５以上ｐH９以下であり，ｐH７．２以上ｐH７．８以下でもよい。また，第２培地は，アミノ酸が少ないか，アミノ酸を全く含まないことが好ましく，アミノ酸含有量が１ｍｇ／ｍｌ以下が好ましく，０．８ｍｇ／ｌ以下が好ましく，０．５ｍｇ／ｌ以下がさらに好ましい。第２培地は，ビタミン類が少ないか，ビタミン類を全く含まないことが好ましく，ビタミン類の含有量が１ｍｇ／ｍｌ以下が好ましく，０．８ｍｇ／ｌ以下が好ましく，０．５ｍｇ／ｌ以下がさらに好ましい。第２培地は，抗生物質（例えばペニシリン），成長因子やサイトカインを含まないことが好ましい。第２培地は，鉄，銅，鉛といった重金属元素や，微量元素を少ししか含まないか，全く含まないことが好ましい。このような元素が少ないので，金属含有たんぱく質の合成を抑え，増殖因子の合成を促すことができる。第２培地は，ポリアミン（例えば，Putrescine 2HCl）といった発がん性物質を含まないことが好ましい。第２培地は，プリン塩基を含まないことが好ましい．第２培地がプリン塩基を含まない場合，核酸のサルベージ経路を活性化できる。
　第２培地は，ビタミンやアミノ酸を含まないか，わずかしか含まないので，オートファジーを促進して増殖因子の合成を増やすことができる。
　第２培地は，一般的な培養環境において，培養中の環境を一定に保つことができる（例えば，酸性度の変動を抑えることができ，培養中，緩衝能を持つので，ＣＯ２培養などを行う必要がなくなる。）。
　第２培地は，通常の培地に比べ水分量が多いことが好ましい。例えば第２培地を１００重量％とした場合，水分量は９５重量％以上９９．９９重量％以下が好ましく，９６重量％以上９９．９重量％以下でもよく，９７重量％以上９９．９重量％以下でもよい。培地の水分量が多いことで浸透圧を下げることができる。すると，例えば，細胞を接着培養した場合，通常トリプシンといった動物由来の消化酵素を用いて培養容器から細胞をはがすものの，第２培地を用いると，消化酵素を用いる必要がなくなる。すると，第２培地を含む剤を患者に投与した際に，動物由来成分による感染等の副作用を軽減することができる。
　第２培地は，糖質（例えば，グルコース），塩類（カルシウムイオン源を含み，例えばＮａＣｌ，ＫＣｌ及びＣａＣｌ２のみからなるか主な塩類としてこれらを含むもの），及び緩衝剤（例えばＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ，Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ，ＫＨ２ＰＯ４，ＮａＨＣＯ３，及びＨＥＰＥＳのみからなるか主な緩衝剤としてこれらを含むもの）と残部が溶媒（例えば水）のみからなるものであってもよい。このような組成であれば，後述する実施例でその有効性が確認された通り，特定の遺伝子やタンパク質を高発現するとともに，生体親和性に優れた培地かつ輸液として機能する。
　第２培地は，注射用の輸液又は点滴用の輸液であってもよい。この場合，注射用の輸液又は点滴用の輸液として製造販売されているものを適宜用いることができる。注射用の輸液の例は，糖液剤，細胞外液補充液（生理食塩液，リンゲル液，乳酸リンゲル液，細胞外液補充液，酢酸リンゲル液，重炭酸リンゲル液），低張性電解質液，アミノ酸製剤（高濃度アミノ酸液，腎不全用アミノ酸液，肝不全用アミノ酸液，小児用アミノ酸液），PPN（末梢静脈栄養輸液），TPN（高カロリー輸液），脂肪乳剤及び代用血漿増量剤である。これらの中では，細胞外液補充液（生理食塩液，リンゲル液，乳酸リンゲル液，細胞外液補充液，酢酸リンゲル液，重炭酸リンゲル液），及び等張性電解質液が好ましい。具体的な輸液は，パレプラス（登録商標）である。
　第２培地は，アミノ酸含有量が少ないことで，合成分泌された増殖因子との相互作用を（主に酸化・還元）及び重合反応が回避され，成分の変質を防げるとともに，混入するアミノ酸による吸湿と変質を防げることができる。また，第２培地は，アミノ酸含有量が少ないことで，化粧品原料とした時に細菌の繁殖リスクが軽減されるため，防腐剤・酸化防止剤を添加しなくても，製品の安定性が担保できる。第２培地が，アミノ酸を含まない場合，患部に使うための脱アミノ酸工程が不要となり，患部に常在する細菌などの増殖のための栄養とはならない。このことは，創傷面に利用した際に，悪臭の原因とならないことを意味する。また，製剤化した後に，第２培地を含む剤を点滴投与した際の味覚障害，体臭の原因にならないので，化粧品や医薬として用いる際に利便性が高い。第２培地が，アミノ酸を含まない場合，脱塩が行いやすい。そのため，細胞を大量培養した際に簡便に凍結乾燥化による高濃度増殖因子乾燥物を得ることができる。通常の培地の場合，どのような場合でも４８～７２時間で培地を交換しなければならない。第２培地がアミノ酸含有培地ではない場合，培養細胞の代謝活性を抑えることで，４℃冷所に保管しておけば長期間（例えば7日間程度）生存環境を維持でき，その後に培地に交換することで細胞を再び増殖できる。第２培地は，カルシウムイオン及び緩衝剤を含む培地であり，好ましくはシンプルな組成を有するものであるため，汎用性が高く全ての動物細胞（ ES細胞，iPS細胞・幹細胞含む）及び植物細胞（特に植物のカルス培養や，植物幹細胞の維持）に適用できる。
　第２培養工程は，ＣＯ２培養器を用いず，ＣＯ２培養を行わないものが好ましい。つまり，培養容器を用い，ＣＯ２インキュベートせずに，培養を行うことが好ましい。第２培養工程は，５時間以上５日以下（１０時間以上２日以下，又は５時間以上３日以下）細胞を培養する工程であることが好ましい。培養は，培養される細胞に応じて接着培養でも浮遊培養でもよいし，細胞を取り除く場合は，細胞が取り除かれやすい方法で培養すればよい。
　培養上清製剤取得工程は，第２培養工程の後に，第２培地を含む培養上清製剤を得る工程である。培養上清製剤は，第２培養工程後の第２培地を５０重量％以上１００重量％以下含むことが好ましい。培養上清製剤は，第２培養工程後の第２培地（培養上清を含む）を６０重量％以上１００重量％以下含んでもよいし，７０重量％以上９９重量％以下，７０重量％以上９０重量％以下，８０重量％以上９９重量％以下，９０重量％以上１００重量％以下，９０重量％以上９５重量％以下含むことが好ましい。通常，幹細胞などの培養上清は，通常，遠心分離により培養上清を固液分離して得られる上清成分を用いる。この明細書に記載される方法は，第２培地を積極的に製剤に含めることができるので，単に，第２培養工程後の培地をろ過したものを用いてもよい。
　培養上清製剤は，上記のようにして得られた培養上清を，凍結乾燥により水分を除去して得られる処理物，エバポレーター等を用いて培養上清を減圧濃縮して得られる処理物，限外ろ過膜等を用いて培養上清を濃縮して得られる処理物，又はフィルターを用いて培養上澄みを固液分離して得られる処理物，もしくは，上述のような処理をする前の培養上清の原液であってもよい。また，例えば，細胞を培養した上澄みを,遠心分離（例えば，１，０００×ｇ，１０分）した後，硫安（例えば，６５％飽和硫安）で分画し，沈殿物を適切な緩衝液で懸濁した後に透析処理を行い,シリンジフィルター（例えば，０．２μｍ）で濾過し，無菌的な培養上清を得てもよい。採取した培養上清を，そのまま用いても，また凍結保存しておき使用時に解凍して用いることもできる。また薬剤学的に許容される担体を加えて，取り扱いやすい液量，例えば０．２ｍｌ又は０．５ｍｌ等となるように滅菌容器に分注してもよい。さらに,感染性病原体リスクの対策として,培養上清をウイルスクリアランスフィルターやγ線照射により処理してもよい。
　上記の通り，第２培養工程の後に，培養上清を回収する培養上清回収工程と，培養上清回収工程で回収した培養上清を凍結する凍結工程とを含んでもよい。培養上清を凍結するためには，例えば，培養上清を－２００℃以上０℃以下にすればよく，－１００℃以上－５℃以下にしてもよい。
　なお，培養上清製剤は，第２培養工程後の細胞を破砕し，遠心分離後，フィルターを用いてろ過したものであっても，さらにろ過物を凍結・乾燥したものであってもよい。
　培養上清製剤（本発明の剤）は，当業者に公知の方法で製造すればよい。本発明の剤は，経口用製剤および非経口用製剤として製造することができるが，好ましくは非経口用製剤である。このような非経口用製剤は，液剤（水性液剤，非水性液剤，懸濁性液剤，乳濁性液剤など）としてもよいし,固形剤（粉末充填製剤，凍結乾燥製剤など）としてもよい。また，本発明の剤は，徐放製剤としてもよい。生きた細胞を剤とする場合の剤形としては液剤が好ましく，細胞の部分成分もしくは死細胞全体を剤とする場合の剤形としては，液剤も固形剤も選択できる。
　培養上清を有効成分として含む剤は，例えば，特開２０１３－１８７５６号公報，特許第５１３９２９４号，及び特許第５５２６３２０号公報に開示されるとおり公知である。したがって，本発明の培養上清を含む剤を，公知の方法を用いて製造することができる。
　本発明による培養上清の剤型としては，液剤と固形剤の両方を選択できる。タンパク質を主剤とするバイオ医薬品においては，安定性の問題から，保存性に優れる粉体化がしばしば選択される。本発明の培養上清もまた，安定性と保存期間の向上のために，固形剤として製造されることが望ましい。
　本発明の培養上清を含む剤は，静脈内投与，動脈内投与，筋肉内投与，皮下投与，腹腔内投与，鼻腔内投与，脊髄管腔内投与，関節内投与，歯肉内投与，塗布などの公知の投与方法を用いて投与することができる。本発明の剤は，患部や対象部位に直接投与してもよく，また外科手術により患部を開口し本発明の剤を投与しても良く，内視鏡並びにカテーテル下に非観血的に投与することも可能である。対象となる疾患によって最適なあらゆる投与方法が可能である。移植法として静脈内注射を選択する場合においては，培養上清を１投与単位として０．１ｍＬ以上１，０００ｍＬ以下で投与することが好ましく，さらに好ましくは，３０ｍＬ以上３００ｍＬ以下で投与される。
　液剤を製造する方法は，公知の方法で製造することができる。例えば，間葉系幹細胞を薬学的に許容された溶媒に混合し，滅菌された液剤用の容器に充填することで製造することができる。薬学的に許容された溶媒の例は，注射用水，蒸留水，生理食塩水，電解質溶液剤，若しくは培養液に準ずる組成の液剤であり，滅菌された溶媒を用いることが好ましい。滅菌された液剤用の容器の例は，アンプル，バイアル，シリンジ，及びバッグである。これら容器は，ガラス製やプラスチック製など公知の容器を用いることができる。具体的には，プラスチック製容器の例は，ポリ塩化ビニル，ポリエチレン，ポリプロピレン，エチレン・酢酸ビニル・コポリマーなどの材質を用いたものである。これら容器や溶剤の滅菌法の例は，加熱法（火炎法，乾燥法，高温蒸気法，流通蒸気法，煮沸法など），濾過法，照射法（放射線法，紫外線法，高周波法など），ガス法，及び薬液法である。このような滅菌法は，容器の材質，溶剤の性質に応じて，当業者であれば適宜選択して用いることができる。
　なお，本明細書は，培養細胞を含む，製剤をも開示する。細胞を液剤として治療に用いる場合，移植法として静脈内注射が最も多用され得る。例として，静脈内注射の場合においては，１×１０５細胞／ｍＬ以上５×１０7細胞／ｍＬ以下で液剤として調整することが好ましく，１×１０６細胞／ｍＬ以上１×１０7細胞／ｍＬがさらに好適である。また，ヒトにおいて静脈内注射１投与単位として調整される間葉系幹細胞剤としては，１×１０５細胞以上１×１０9細胞が好ましく，２×１０７細胞以上２×１０８細胞がさらに好適である。その他の投与ルートについては，組織へ移植可能な液量と，その液量に懸濁可能な最大の細胞数以下の範囲において，用いることができる。
　固形剤を製造する方法として，例えば，凍結乾燥法，スプレードライ（噴霧乾燥）法，及び無菌再結晶法を用いることができる。
　細胞を含む剤は，静脈内投与，動脈内投与，筋肉内投与，皮下投与，腹腔内投与，鼻腔内投与，脊髄管腔内投与，関節内投与，歯肉内投与などの公知の投与方法を用いて投与することができる。投与形態の好ましい例は，注射による投与であり，静脈内投与の場合は，点滴によって本発明の剤を注入することもよい。
　細胞が，薬学的に許容される担体又は媒体とともに調整されてもよい。薬学的に許容される担体又は媒体は，例えば，賦形剤，安定化剤，溶解補助剤，乳化剤，懸濁化剤，緩衝剤，等張化剤，抗酸化剤，又は保存剤など薬学的に許容される物質があげられる。また，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子材料やシクロデキストリン等の抱合化防物を使用することもできる。賦形剤の例は，デンプンや乳糖などそれ自体が薬理作用を有さないものである。安定化剤の例は，アルブミン,ゼラチン，ソルビトール，マンニトール，乳糖，ショ糖，トレハロース，マルトース，及びグルコースである。これらのうちでは，ショ糖又はトレハロースが好ましい。溶解補助剤の例は，エタノール，グリセリン，プロピレングリコール，及びポリエチレングリコールである。乳化剤の例は，レシチン，ステアリン酸アルミニウム，またはセスキオレイン酸ソルビタンである。懸濁化剤の例は，マクロゴール，ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），またはカルメロース（ＣＭＣ）である。等張化剤の例は，塩化ナトリウム，及びグルコースである。緩衝剤の例は，クエン酸塩，酢酸塩，ホウ酸，及びリン酸塩である。細胞を懸濁させるための水性媒質としては，例えば，浸透圧やｐＨを血液の値付近に調整し，塩類濃度等を調整した注射用の水溶液等を適宜用いればよく，例えば，酢酸リンゲル液，糖加酢酸リンゲル液等のリンゲル液その他の輸液，生理食塩水，またはブドウ糖液等を用いることができるが，これらに限定されない。例えば輸液用リンゲル液を用いる場合，これに許容量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加してもよい。抗酸化剤の例は，アスコルビン酸，亜硫酸水素ナトリウム，及びピロ亜硫酸ナトリウムである。保存剤の例は，フェノール，チメロサール，及び塩化ベンザルコニウムである。
　本発明は，対象（ヒト又はヒト以外の哺乳動物）の各種疾患を治療し，各種能力を向上させるため，対象に培養上清（又は培養細胞，培養細胞由来精製物）を投与する工程を含む，方法をも提供する。
　本明細書に開示される上記とは別の発明は，細胞培養用培地及び輸液として機能する薬液であって，薬液は，カルシウムイオン，プロスタグランジン及び緩衝剤を含む，薬液である。この薬液は，上記した第２培地を適宜採用すればよい。
　特許6497827号公報に記載される通り，培養上清は，エイコサノイド産生促進剤として機能する。この剤は，動脈硬化，又は糖尿病の治療剤であることが好ましい。特許第6250196号公報には，ＰＰＡＲアゴニストが糖尿病の治療剤であることが記載されている。特許第4515026号には，ＰＰＡＲγを活性化することが，糖尿病の治療に有効であることが示されている。特許第6157041号には，ＰＰＡＲγ活性化剤が動脈硬化，及び糖尿病の治療に有効であることが示されている。本発明の剤は，ＰＰＡＲγを活性化するので，動脈硬化，及び糖尿病の治療に有効である。この剤は，関節リウマチの治療剤であることが好ましい。関節リウマチモデルにおいて，１５－デオキシ－デルタ－１２，１４－プロスタグランジンＪ２が，リウマチ臨床スコア，痛み，及び浮腫を抑制することが知られている（Mediators Inflamm. 2016;2016:9626427. Epub 2016 Oct 31.）。本発明の剤は，マクロファージからのＰＰＡＲγの活性化剤であるエイコサノイドの産生を促進するものであり，例えば，１５－デオキシ－デルタ－１２，１４－プロスタグランジンＪ２の産生を促進するので，関節リウマチの治療に有効である。この剤は，前立腺癌，脳梗塞，又は脳機能障害の予防剤又は治療剤であることが好ましい。例えば，Cancer Res. 2001 Jan 15;61(2):497－503.では，15－HETEが，前立腺癌細胞株（PC3）の増殖を抑制することや，複数の癌腫において抑制的な作用が報告されている。また，J Lipid Res. 2015 Mar;56(3):502－14では，15－HETEの投与が，脳梗塞モデルの脳虚血後の脳組織障害レベルや，脳における炎症反応を抑制することが報告されている。本発明の剤は，マクロファージからのＰＰＡＲγの活性化剤であるエイコサノイドの産生を促進するものであり，例えば１５－ハイドロキシエイコサテトラエノイックアシッド（１５－ＨＥＴＥ）の産生を促進するので，前立腺癌の治療に有効である。特許第5940261号公報には，ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ（ＰＰＡＲγ）活性化剤が，高血圧症，インスリン抵抗性疾患，脳梗塞，アルツハイマー病，神経疾患の少なくともひとつを予防及び改善することが記載されている。本発明の剤は，ＰＰＡＲγを活性化するので，脳梗塞，及び脳機能障害の予防及び治療に有効である。この剤は，疼痛の予防剤又は治療剤であることが好ましい。例えば，Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  Ｍｅｄ．2016 Oct;12(4):2644－2650. では，ＰＰＡＲγの活性化剤であるピオグリタゾンの投与が，神経障害性疼痛における活性化ミクログリアを抑制し，その結果，機械刺激に対する疼痛閾値を緩和することが示されている。本発明の剤は，マクロファージからのＰＰＡＲγの活性化剤であるエイコサノイドの産生を促進するものであり，例えば，１５－デオキシ－デルタ－１２，１４－プロスタグランジンＪ２の産生を促進するので，疼痛の予防又は治療に有効である。
　特許6132459 号公報には，間葉系幹細胞の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤が記載されている。このため，本発明の培養上清を含む剤は，腸炎の予防・治療に有効である。
細胞培養，培養上清回収
正常ヒト脂肪組織を酵素処理して抽出した脂肪組織由来間質細胞を，２０％FBS（ウシ胎児血清）含有DME培地（ギブコ社製ダルベッコ改変イーグル培地，高グルコース）を用いノンコートの培養フラスコ（FALCON社製）で培養し，初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後，同培地でノンコート培養用１２ウェルプレート（住友ベークライト社製）に播種し，コンフルエントになるまで培養した。
 コンフルエントになったことを確認した後，培地を除去し，細胞表面をＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄した。
　洗浄後の細胞を，ＦＢＳ不含ＤＭＥ培地，又はＨＢＳＳ(シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液)－ＨＥＰＥＳに置換した。その後１２ウェルを３ウェルずつ４つの群に分け，ＦＢＳ不含ＤＭＥ培地は５％CO２培養器内（参考例），ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳは培養器内（実施例）で培養した。置換した直後（０時間），３時間後，６時間後，２４時間後，４８時間後に各ウェル内の培養上清を回収した。
　ＦＢＳ不含ＤＭＥ培地は，ＦＢＳを含まないダルベッコ改変イーグル培地である。ＤＭＥ培地は，グルコース，Ｌ－グルタミンといった各種成分を含む。　
　ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）は，（１）等張液である炭酸水素ナトリウム溶液，（２）ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，Ｎａ２ＨＰＯ４，グルコース，及びＫＨ２ＰＯ４を含む緩衝液及び（３）ＣａＣｌ２溶液及び緩衝液である。
　HEPESは，ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸であり，緩衝剤又はｐＨ調整剤である。
　ＦＢＳ不含ＤＭＥ培地に含まれる糖質の量は，４.５ｇ／Ｌ，アミノ酸（Ｌ－グルタミン酸他）の総量は１.６ｇ／Ｌ，カルシウムイオンは１．８ｍＭであった。
　一方，ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳ培地（ｈａｎｋｓ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４）に含まれる糖質の量は，１.０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌは，８.０ｇ／Ｌ，ＫＣｌは，０.４ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ２は，０．１４ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏは，０.２ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏは，０．０６ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４は，０．０６ｇ／Ｌ，ＮａＨＣＯ３は，０．３５ｇ／Ｌ，２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳｐＨ７．４であり，アミノ酸（Ｌ－グルタミン酸他）の総量は０ｇ／Ｌ，カルシウムイオンは１．５ｍＭであった。
　遺伝子発現量の測定方法
　上記に示したように培養上清を回収後，そのウェルにそれぞれ４００マイクロリットルのＲＮＡ抽出液ISOGEN（ニッポン・ジーンＮｏ．３１９－９０２１１）を添加し，定法に従い細胞から全ＲＮＡを抽出，エタチンメイト（ニッポン・ジーンＮｏ．３１２－０１７９１）を用いて得られた全ＲＮＡの沈殿物をヌクレアーゼフリー水に溶解させた。このうちの１．５マイクロリットルを用いてナノドロップ（サーモサイエンテフィック社）により全ＲＮＡ の濃度を測定した。得られた全ＲＮＡ 100ナノグラムからアイスクリプトｃＤＮＡ合成キット(ＢＩＯ　ＲＡＤＮｏ．１７０８８９１)を用いて相補的DNAを合成し，リアルタイムPCR(QIAGEN社製ローター・ジーンQ)による各遺伝子発現量の定量に用いた。
　リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子発現の定量化
　合成したＤＮＡ，検出・定量化する遺伝子に特異的なプライマー(ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ,ＱＩＡＧＥＮ)，リアルタイムＰＣＲ試薬(ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ，ＱＩＡＧＥＮ )を混合し，ＲｏｔｏｒＧｅｎｅＱシステム（ＱＩＡＧＥＮ社）にて，リアルタイムＰＣＲを行い，検出・定量化する遺伝子の断片を増幅した。この際，ハウスキーピング遺伝子であるβ―Ａｃｔｉｎ特異的なプライマーを同様に増幅し，その増幅曲線を指標として検出・定量化したい遺伝子の定量値を相対的に算出した。
各遺伝子に特異的なプライマーとしてＱＩＡＧＥＮ社の以下のプライマー混合液を用いた。
　ヒトβ―Actin
　　　Hs＿ACTB＿１＿SG　　カタログ番号ＱＴ０００９５４３１
ヒトＦＧＦ２
　　　Ｈｓ＿ＦＧＦ２＿１＿ＳＧ　　カタログ番号ＱＴ０００４７５７９
　ヒトＶＥＧＦＡ
　　　Ｈｓ＿ＶＥＧＦＡ＿１＿ＳＧ　　カタログ番号ＱＴ０１０１０１８４
　培養上清に含まれるタンパク質の定量化方法
　細胞培養,培養上清回収で示したように回収した培養上清を０．２２マイクロメートル径のフィルターに通し，タンパク質定量用のサンプルとした。
　サンプルのタンパク質定量にはＲ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳR社のＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ　ＥＬＩＳＡ （Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ，ＦＧＦ－２）キットを用い，そのプロトコールに従って，各タンパク質の定量値を得た。
　その結果を表１及び表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　リアルタイムPCRの結果
　細胞内のVEGF遺伝子の発現量はHanks－HEPES溶液が一番多かった。
　細胞内のFGF－2遺伝子の発現量はHanks－HEPES溶液が一番多かった。
　タンパク定量の結果
培養上清中のVEGFの量はHanks－HEPES溶液が一番多かった。
培養上清中のFGF－2の量はDME培地が一番多かった。
　考察
0,6,24,48時間，経時的に遺伝子の発現量，培養上清中のタンパク質の量，ともに増加傾向にあった。VEGF遺伝子の発現量，培養上清中のタンパク質の量はHanks－HEPES溶液（実施例）が一番多かった。FGF－2の遺伝子発現量はHanks－HEPES溶液が一番多かったが培養上清中のタンパク質の量に関してはDME(H)（参考例）の方が多かった。
　細胞培養，培養上清回収
正常ヒト皮膚組織を酵素処理し抽出した表皮角化細胞を，サプリメントＳ７（ギブコ社製Ｎｏ．Ｓ０１７５）含有無血清細胞用培地（ギブコ社製Ｎｏ．ＭＥＰＩ５００ＣＡ）を用いノンコートの培養フラスコ（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養し，初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後，同培地でノンコート培養用１２ウェルプレート（住友ベークライト社製）に播種し，コンフルエントになるまで培養した。
コンフルエントになったことを確認後，培地を除去し，細胞表面をPBS（DSファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄し，サプリメント７不含無血清細胞用培地（ＥｐｉＬｉｆｅ：参考例），またはＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４溶液（実施例）に置換した。その後１２ウェルを３ウェルずつ４つの群に分け，置換した直後（０時間），３時間後，６時間後，２４時間後に各ウェル内の培養上清を回収した。
　サプリメント７不含無血清細胞用培地（ＥｐｉＬｉｆｅ：参考例）に含まれる糖質の量は，１.０　ｇ／Ｌ，アミノ酸（Ｌ－グルタミン酸他）の総量は１.５ｇ／Ｌ，カルシウムイオンは８．４ｍｇ／Ｌであった。
　遺伝子発現量の測定方法
　上記に示したように培養上清を回収後，そのウェルにそれぞれ４００マイクロリットルのＲＮＡ抽出液ＩＳＯＧＥＮ（ニッポン・ジーンＮｏ．３１９－９０２１１）を添加し，定法に従い細胞から全RNAを抽出，エタチンメイト（ニッポン・ジーンＮｏ．３１２－０１７９１）を用いて得られた全RNAの沈殿物をｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ水に溶解させた。このうちの１．５マイクロリットルを用いてナノドロップ（サーモサイエンテフィック社）により全ＲＮＡ の濃度を測定した。得られた全ＲＮＡ 100ナノグラムからｉＳｃｒｉｐｔ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ(ＢＩＯ　ＲＡＤＮｏ．１７０８８９１)を用いて相補的DNAを合成し，リアルタイムPCR(QIAGEN社製ローター・ジーンQ)による各遺伝子発現量の定量に用いた。
　リアルタイムPCR法による遺伝子発現の定量化
　合成したＤＮＡ定量化する遺伝子に特異的なプライマー(ＱｕａｎｔｉＴａｃｔ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａｓｓａｙ，ＱＩＡＧＥＮ)，リアルタイムＰＣＲ試薬(Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ，ＱＩＡＧＥＮ)を混合し，Ｒｏｔｏｒ－ＧｅｎｅＱシステム（ＱＩＡＧＥＮ社）にて，リアルタイムPCRを行い，検出・定量化する遺伝子の断片を増幅した。この際，ハウスキーピング遺伝子であるβ―Actin特異的なプライマーを同様に増幅し，その増幅曲線を指標として検出・定量化したい遺伝子の定量値を相対的に算出した。
各遺伝子に特異的なプライマーとしてQIAGEN社の以下のプライマー混合液を用いた。
ヒトβ―Actin
　　　Hs＿ACTB＿１＿SG　　カタログ番号ＱＴ０００９５４３１
ヒトＥＧＦ
    Ｈｓ＿ＥＧＦ＿１＿ＳＧ　　カタログ番号ＱＴ０００５１６４６
  ヒトＶＥＧＦＡ
　　　Ｈｓ＿ＶＥＧＦＡ＿１＿ＳＧ　　カタログ番号ＱＴ０１０１０１８４
ヒトＦＧＦ２
　　　Ｈｓ＿ＦＧＦ２＿１＿ＳＧ　　カタログ番号ＱＴ０００４７５７９
　培養上清に含まれるタンパク質の定量化方法
　細胞培養，培養上清回収で示したように回収した培養上清を０．２２マイクロメートル径のフィルターに通し，タンパク質定量用のサンプルとした。
　サンプルのタンパク質定量にはＲ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳR社のＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ　ＥＬＩＳＡ （Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ）キットを用い，そのプロトコールに従って，各タンパク質の定量値を得た。その結果を表３～表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　リアルタムPCR結果
 細胞内のEGF遺伝子の発現量はEpiLife培地（参考例）よりもHanks－HEPES溶液（実施例）の方が多かった。 細胞内のFGF－2遺伝子発現量はEpiLifeよりもHanks－HEPES溶液の方が多かった。
 細胞内のVEGF遺伝子発現量はEpiLifeよりもHanks－HEPES溶液の方が多かった。タンパク定量の結果，培養上清中のVEGFの量はHanks－HEPESの方が多かった。
　　コンフルエントになった脂肪組織由来間質細胞の培養液を３種類の溶液で置換し，４８時間後の細胞内各mRNAの発現量を定量した。置換した溶液は，ＦＢＳ不含有ＤＭＥ培地，ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳ培地及びパレプラス輸液であった。mRNAの発現量を定量した結果を表６に示す。
　　パレプラスは，パレプラス輸液を意味し，ブドウ糖，塩化ナトリウム，Ｌ－乳酸ナトリウム，塩化カルシウム水和物，硫酸マグネシウム水和物，硫酸亜鉛水和物，チアミン塩化物塩酸塩，ピリドキシン塩酸塩，シアノコバラミン，パンテノール，氷酢酸，アミノ酸，電解質，安定剤，及びpH調節剤含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　　表６から培地（ＤＭＥ（Ｈ））よりも，電解質溶液（Ｈａｎｋｓ－ＨＥＰＥＳ，パレプラス）の方が遺伝子の発現量は多いことが分かる。電解質溶液では，Ｈａｎｋｓ－ＨＥＰＥＳがより好ましいことが分かる。
　　コンフルエントになった脂肪組織由来間質細胞の培養液を下記の溶液で置換し，４８時間後の細胞内各mRNAの発現量を定量した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　ＫＮ２号は，ＫＮ２号輸液を示す。ＫＮ２号輸液は，塩化ナトリウム，塩化カリウム，Ｌ－乳酸ナトリウム，塩化マグネシウム，リン酸二水素ナトリウム水和物，リン酸二カリウム及びブドウ糖を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　　HBSS－HEPESｐH7.4とHBSSを比較した場合，HEPESｐH7.4が添加されていることによって，PHが酸性になる速度が緩やかになることで，遺伝子発現が促進されることがわかる。
　　培養上清の回収，凍結乾燥
　第二培養工程にて４８時間経過後の培養上清を５０ｍＬ遠沈管（住友ベークライト株式会社）に回収後，遠心分離（７４０Ｇ，５分間）し，その上清を，膜孔径０.２マイクロメートルの濾過フィルター（倉敷紡績株式会社）に通し，シリンジ（テルモ株式会社）に分注した。シリンジを滅菌バックに封入し，－８０℃のフリーザー内で凍結させた後，凍結乾燥装置（ヤマト科学株式会社）内に移し，凍結乾燥を行った。凍結乾燥終了後，シリンジ用ルアーキャップ（テルモ株式会社）で密閉した。
　実施例１と同様に脂肪組織由来間質細胞がコンフルエントになったことを確認した後，培地を除去し，細胞表面をＰＢＳで洗浄した。
　洗浄後の細胞を，ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳに置換した。その後１２ウェルを２ウェルずつ６つの群に分け，ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳは培養器内（実施例）で培養した。置換した直後（０時間），１日後，２日後，３日後，４日後，５日後，６日後に各ウェルの細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いトータルＲＮＡを抽出し，リアルアイムＰＣＲによりＶＥＧＦ遺伝子の発現の相対定量を行った。その結果を表９に示す。表９に示される通り，５日後まで遺伝子発現が維持されていることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　実施例１と同様に脂肪組織由来間質細胞がコンフルエントになったことを確認した後，培地を除去し，細胞表面をＰＢＳで洗浄した。
　洗浄後の細胞を，ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ６．５，ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．０，ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４，ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．８，ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ９．０に置換した。置換した直後（０時間），４８時間後に各ウェルの細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いトータルＲＮＡを抽出し，リアルアイムＰＣＲによりＶＥＧＦ遺伝子の発現の相対定量を行った。その結果を表１０に示す。表１０に示されるように，ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．０からＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．８まで遺伝子発現が維持されていることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　実施例１と同様に，１２ウェルプレートに脂肪組織由来間質細胞を培養し，コンフルエントになったことを確認した後，培地を除去し，細胞表面をＰＢＳで洗浄した。
　洗浄後の細胞を３ウェルずつ４つの群に分け，それぞれ０ｎｇ／ｍＬ，４ｎｇ／ｍＬ，４０ｎｇ／ｍＬ，４００ｎｇ／ｍＬの濃度のＰＧＥ１（プロスタンディン 丸石製薬株式会社製）を添加したＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳに置換し，培養器内（実施例）で培養した。置換してから４８時間後，各ウェルから培養上清を回収しＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ　ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社製）でタンパク定量を行なった。また，培養上清回収後の各ウェルより，ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いトータルＲＮＡを抽出後アイスクリプトｃＤＮＡ合成キット（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製）を用いて相補的ＤＮＡを合成し，それをリアルタイムＰＣＲ(ローター・ジーンＱ，ＱＩＡＧＥＮ社製)によるＶＥＧＦ遺伝子発現量の相対定量に用いた。その結果を表１１に示す。表１１に示されるように，ｍＲＮＡの発現量の相対定量値はＰＧＥ１の添加量に依らずほぼ同程度であった。タンパク量に関してはＰＧＥ１の添加量に応じ，増加傾向にあることが明らかとなった。このことから，培地をＰＧＥ１含有ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳに置換し４８時間培養することで，より高濃度のＶＥＧＦを含む培養上清が得られることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
正常ヒト脂肪組織を酵素処理して抽出した脂肪組織由来間質細胞（ＡＳＣ）を，２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥ培地（ギブコ社製ダルベッコ改変イーグル培地，高グルコース）を用いて，培養フラスコＴ７５（ＢＤ　ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養し，初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後，適宜希釈し，適量細胞数を同培地で培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社製）１枚に播種し，コンフルエントになるまで培養した。
　コンフルエントになった各ウェルの細胞を３ウェルずつ２つの群に分け，それぞれの培地を除去し，各ウェルの細胞表面をＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄した。
　洗浄後，１つ目の群にＤＭＥ高グルコース培地を，２つ目の群に終濃度１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４となるように調製したＨＢＳＳ（シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液）を，３つ目の群には終濃度２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４となるように調製したＨＢＳＳを添加した。培養器内（実施例）で４８時間培養した後，培養上清をそれぞれ５ｍＬ容量のチューブ（ＢＤ　ＦＡＬＣＯＮ社製）に回収し，ＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ　ＥＬＩＳＡ　Ｈｕｍａｎ　ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社製）にてＶＥＧＦタンパク質の定量を行った。更に各ウェルの細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いトータルＲＮＡを抽出，濃縮し，アイスクリプトｃＤＮＡ合成キット（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製）を用いて相補的ＤＮＡを得た。そしてそれを用いてリアルアイムＰＣＲ（ロータージーンＱ，ＱＩＡＧＥＮ社製）によりＶＥＧＦ，ＦＧＦ２ｂａｓｉｃ，ＭＭＰ１，ＥＦＮＡ３，ＢＭＰ１，ＷＮＴ５Ａ遺伝子の各発現量の相対定量を行った。その結果を表１２～表１７に示す。相対定量値は、ベータアクチンを内部標準としサンプル間の補正を行い、ＤＭＥ高グルコース培地での値を基準値として算出した。表１２～表１７に示される通り，細胞内の各ｍＲＮＡは，ＤＭＥ培地よりもＨＢＳＳ-１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４で培養した細胞内により多く発現する傾向が見られ，さらにＨＥＰＥＳの濃度は２０ｍＭである方がより多いことがわかった。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　実施例４と同様に，脂肪組織由来間質細胞（ＡＳＣ）を培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社製）５枚に播種し，コンフルエントになるまで培養した。
同様に，ヒト歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）を６ウェルプレート５枚に播種し，コンフルエントになるまで培養した。
　コンフルエントになったＡＳＣとＳＨＥＤについて，各ウェルの細胞を２ウェルずつ３つの群に分け，それぞれの培地を除去し，各ウェルの細胞表面をＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄した。
　洗浄後，３つの群にＨＢＳＳ（シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液）－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４をそれぞれ３ｍＬ，２ｍＬ，１ｍＬ添加し，培養器内（実施例）で４８時間培養した後，培養上清をそれぞれ５ｍＬ容量のチューブ（ＢＤ　ＦＡＬＣＯＮ社製）に回収し，ＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ　ＥＬＩＳＡ　Ｈｕｍａｎ　ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社製）にてＶＥＧＦタンパク質の定量を行った。更に各ウェルの細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いトータルＲＮＡを抽出，濃縮し，アイスクリプトｃＤＮＡ合成キット（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製）を用いて相補的ＤＮＡを得た。そしてそれを用いてリアルアイムＰＣＲ（ロータージーンＱ，ＱＩＡＧＥＮ社製）によりＶＥＧＦ遺伝子発現量の相対定量を行った。
　相対定量値はベータアクチンを内部標準としサンプル間の補正を行い、通常の培地量２ｍＬの値を基準値として算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
 　細胞内のｍＲＮＡの発現量に関しては培養上清の量による変化は見られなかった。培養上清中に含まれるＶＥＧＦタンパク質の量は，培養上清の容積が多い方が少なく，培養上清の容積が少ない方がより多くなっていた。このことから，通常使用する培地の容積よりも少ない量の培地を用いることでより多くの成長因子を含む培養上清が得られることがわかった。
　実施例５と同様にして，第二培養工程にて４８時間経過後の培養上清を回収し，遠心分離（７４０Ｇ，５分間）して得られた培養上清を，無添加の群，２５０ｍＭトレハロース（林原社製）を加えた群，の２つの群に分けた。その後，膜孔径０．２マイクロメートルの濾過フィルター（倉敷紡績株式会社）に通し，シリンジ（テルモ株式会社）に分注した。シリンジを滅菌バックに封入し，－８０℃のフリーザー内で凍結させた後，凍結乾燥装置（ヤマト科学株式会社）内に移し，凍結乾燥を行った。凍結乾燥終了後，シリンジ用ルアーキャップ（テルモ株式会社）で密栓した。密栓した状態で，-８０℃，４℃，２５℃，の３つの温度条件でそれぞれを３週間，保管した。３週間経過後，凍結乾燥試料を注射用水（大塚製薬株式会社製）で再懸濁し，ＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ　ＥＬＩＳＡ　Ｈｕｍａｎ　ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社製）でタンパク定量を行なった。定量値は－８０℃で３週間保管後の培養上清に含まれるＶＥＧＦタンパク質の定量値を基準とし，各保管温度におけるＶＥＧＦタンパク質の相対定量値を算出した。その結果を表２０に示す。表２０に示される通り，無添加の凍結乾燥培養上清では，２５℃環境下での保管により，顕著なＶＥＧＦタンパク質の減少が確認できた。これは吸湿や光酸化に伴うタンパク質の分解を示唆している。一方で終濃度２５０ｍＭのトレハロースを添加するとＶＥＧＦタンパク質の減少は抑制されることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
正常ヒト脂肪組織を酵素処理して抽出した脂肪組織由来間質細胞を，２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥ培地（ギブコ社製ダルベッコ改変イーグル培地，高グルコース）を用いて，培養フラスコ（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養し，初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後，同培地で培養用フラスコＴ７５（ＢＤ　ＦＡＬＣＯＮ社製）５枚に播種し，コンフルエントになるまで培養した。
　コンフルエントになったことを確認した後，培地を除去し，細胞表面をＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄した。
　洗浄後の細胞を，ＨＢＳＳ（シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液）－ＨＥＰＥＳに置換し，培養器内（実施例）で４８時間培養した後，培養上清をそれぞれ２０ｍＬ容量のシリンジ（テルモ社製）に１５ｍＬずつ回収した。
　回収した培養上清を凍結乾燥させた。
　２０ｍＬシリンジにて凍結乾燥させた培養上清２本をそれぞれ注射用水１５ｍＬに懸濁し，ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０，ＶＳ２０４１（ザルトリウス社製）と遠心分離機ＫＵＢＯＴＡ２８００（クボタ社製）を用いて０．６ｍＬとなるまで濃縮操作を行った。
　濃縮操作後，１本について，Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（富士フィルム和光社製）を用い，定法に従い培養上清中のＥｘｏｓｏｍｅを単離抽出した（サンプル１）。抽出したＥｘｏｓｏｍｅ抽出液は０．１ｍＬであった。残りの１本についてはそのまま１．５ｍＬチューブ（エッペンドルフ社製）に保管した（サンプル２）。
　濃縮操作を行い，Ｅｘｏｓｏｍｅｎを単離抽出したサンプル１と，濃縮操作を行っただけの培養上清サンプル２に関し，ＥｘｏｓｏｍｅＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（富士フィルム和光社製）を用い，定法に従いそれらに含まれるＥｘｏｓｏｍｅを相対的に定量した。定量値は４５０ｎｍの吸光度と６５０ｎｍの吸光度の差を求め，ブランクの値で補正を行い，その吸光度の値をもとに培養上清１５ｍＬに含まれる吸光度の積算値として表した。その結果を表２１に示す。表２１に示される通り，両者の吸光度の値の比較より，本製造方法による培養上清にはＥｘｏｓｏｍｅが含まれており，あえてそれを単離抽出せずとも相当量のＥｘｏｓｏｍｅを活用できることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
正常ヒト脂肪組織を酵素処理して抽出した脂肪組織由来間質細胞（ＡＳＣ）を，２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥ培地（ギブコ社製ダルベッコ改変イーグル培地，高グルコース）を用いて，培養フラスコＴ７５（ＢＤ　ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養し，初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後，同培地で培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社製）２枚に播種し，コンフルエントになるまで培養した。
　コンフルエントになった各ウェルの細胞を３ウェルずつ２つの群に分け，それぞれの培地を除去し，各ウェルの細胞表面をＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄した。
　洗浄後，２つの群にＨＢＳＳ（シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液）－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４を２ｍＬ添加し，培養器内（実施例）で２４時間または４８時間培養した。２４時間または４８時間経過後，１つ目の群については通常通り培養上清を５ｍＬ容量のチューブ（ＢＤ　ＦＡＬＣＯＮ社製）に回収した。２つ目の群に関してはセルスクレイパー（旭硝子社製）を用い，接着細胞を培養上清をと共に５ｍＬ容量のチューブに回収し，ヒスコトロン（日音医理科器械製作所社製）を用い細胞を破砕し，測定試料とした。それぞれの試料をＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ　ＥＬＩＳＡ　Ｈｕｍａｎ　ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用い，ＶＥＧＦタンパク質の定量を行った。１つ目の群（培養上清）から得られたＶＥＧＦタンパク質の定量値を基準として，細胞含有培養上清に含まれるＶＥＧＦタンパク質の相対定量値を算出した。その結果を表２２及び表２３に示す。表２３において，相対定量値は，２４時間培養後の培養上清から得られたＶＥＧＦタンパク質の定量値を基準として，４８時間培養後の各試料に含まれるＶＥＧＦタンパク質の相対定量値を算出したものである。表２２及び表２３に示される通り，　細胞含有培養上清を用いることで、より多くの増殖因子を活用できることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　　健常人皮膚組織由来表皮細胞から、常法により線維芽細胞を選択培養した。得られた初代培養を維持培養し、その４継代目を６ウェルプレート（住友ベークライト社製）５枚に播種、コンフルエントになるまで培養した。コンフルエントになった各ウェルの細胞を３ウェルずつ２つの群に分け、それぞれの培地を除去し、各ウェルの細胞表面をＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄した。洗浄後、１群目はＨＢＳＳ（シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液）－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４、各２ｍＬで置換し、２群目、３群目には同量のＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳｐＨ７．４に実施例１で示した脂肪組織幹細胞由来培養上清（ＡＳＣｓｕｐ．）をそれぞれ終濃度１０％、５０％となるように添加した溶液で置換した。その後培養器内で３、６、２４または４８時間培養した。それぞれの時間経過後、各ウェルより、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いトータルＲＮＡを抽出後アイスクリプトｃＤＮＡ合成キット（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製）を用いて相補的ＤＮＡを合成し、それをリアルタイムＰＣＲ（ローター・ジーンＱ、ＱＩＡＧＥＮ社製）によるＦＧＦｂａｓｉｃ，ＶＥＧＦ遺伝子発現量の相対定量に用いた。相対定量値は、ベータアクチンを内部標準としサンプル間の補正を行い、コンフルエントになった時点での細胞の各遺伝子発現量の値を基準値として算出した。その結果を表２４及び表２５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　表２４及び表２５に示されるように，ＦＧＦ-ｂａｓｉｃ遺伝子に関して、ＡＳＣ-ｓｕｐ．無添加群においては培地置換後２４時間までは時間経過に伴い発現が増加傾向であったが、４８時間後には停滞した。一方で添加群においては置換後４８時間まで、時間経過とともに発現の増加が見られ、その添加量に依存し増加率は高くなった。
　ＶＥＧＦ遺伝子に関しては無添加群、添加群ともに置換後４８時間まで、時間経過に伴い発現が増加傾向となり、ＡＳＣ-ｓｕｐ．の添加量依存的にその増加率は顕著に高くなった。
　線維芽細胞に脂肪組織由来間質細胞培養上清を添加することでその細胞自体の増殖因子の発現を促進させ、組織再生に有効であることが示唆された。
 
　健常人皮膚組織由来表皮細胞を常法により抽出し、６ウェルプレートに播種した。その際、EpiLife培地、EpiLife培地に実施例１で示した脂肪組織幹細胞由来培養上清を添加したもの、の２群に分け、コンフルエントになるまで培養した。コンフルエントになったことを確認した後、常法に従い、L-DOPA染色を施し、表皮細胞に含まれる色素幹細胞の色調を定量した。定量値は画像ソフトウェアImageJを用い、L-DOPA染色を施した色素幹細胞の黒色部分の面積の割合から得た。その結果を表２６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
  
　表２６に示される通り，脂肪組織幹細胞由来の培養上清を添加した培地の方が、表皮細胞中に存在する色素幹細胞のL-DOPA染色による色調の定量値が低いことから、脂肪組織幹細胞由来の培養上清には色素幹細胞の増殖、色素細胞への分化を抑える働きがあることが示唆された。そのため、美白成分として有効であることが明らかとなった。
　実施例５と培養上清の凍結乾燥品を製造した。１ｍｌ分の培養上清から製造した凍結乾燥培養上清を２種類のヒアルロン酸製剤であるレスチレンリド（ＧＡＬＤＥＴＲＡＭＡ社製）及びベロテロ（ＭＥＲＺ社）１ｍｌに融解させた。凍結乾燥培養上清は、ヒアルロン酸に融解することが明らかとなった。そのため、ヒアルロン酸を皮下や関節内などに投与する際に、ヒアルロン酸とともに凍結乾燥培養上清を投与することができるため、医薬品の原料として使用することができた。
　実施例５と培養上清の凍結乾燥品を製造した。１ｍｌ分の培養上清から製造した凍結乾燥培養上清を蒸留水１ｍｌに融解し、化粧水及び食料品、飲料として使用した。また、親水軟膏であるヒルドイドソフト軟膏（マルホ社製）１ｇに融解させ、軟膏として使用した。そのため、化粧品、医薬品、食料品、飲料の原料として使用することができた。
　本発明は，医薬産業において利用されうる。

 

Claims (11)

  1. 　培養上清製剤の製造方法であって，
    　細胞を，第１培地を用いてコンフルエントとなるまで培養する第１培養工程と，
    　第１培養工程の後に，第１培地と異なる第２培地を培地として，前記細胞を培養する第２培養工程と，
    　第２培養工程の後に，第２培地を含む培養上清製剤を得る培養上清製剤取得工程を含み，
    　第２培地は，カルシウムイオン及び緩衝剤を含む，
    　培養上清製剤の製造方法。
  2. 　請求項１に記載の培養上清製剤の製造方法であって，第２培地はさらにプロスタグランジンを含む，方法。
  3. 　請求項１に記載の培養上清製剤の製造方法であって，培養上清製剤取得工程はトレハロースを添加する工程を含む，方法。
  4. 　請求項１に記載の培養上清製剤の製造方法であって，
    　前記培養上清製剤は，第２培養工程後の第２培地を５０重量％以上１００重量％以下含む，方法。
  5. 　請求項１に記載の培養上清製剤の製造方法であって，
    　前記細胞は，脂肪組織由来間葉系間質細胞，表皮由来上皮系細胞又は歯髄由来間葉系幹細胞である，方法。
  6. 　請求項１に記載の培養上清製剤の製造方法であって，
    　前記第２培地は，注射用の輸液又は点滴用の輸液である，方法。
  7. 　請求項１に記載の培養上清製剤の製造方法であって，
    　第２培養工程は，５時間以上５日以下前記細胞を培養する工程である，方法。
  8. 　請求項１に記載の培養上清製剤の製造方法であって，
    　第２培養工程の後に，培養上清を回収する培養上清回収工程と，
    　前記培養上清回収工程で回収した培養上清を凍結する凍結工程と，
    　をさらに含む，方法。
  9. 　請求項１に記載の培養上清製剤の製造方法であって，
    　前記培養上清製剤が，化粧品，医薬品，食料品，又は飲料の原料である，
    　方法。
  10. 　培養上清製剤であって，
    　細胞を，第１培地を用いてコンフルエントとなるまで培養する第１培養工程と，
    　第１培養工程の後に，第１培地と異なる第２培地を培地として，前記細胞を培養する第２培養工程とを含む培養上清製剤の製造方法により製造され，
    　第２培養工程後の第２培地を５０重量％以上１００重量％以下含む培養上清製剤。
  11. 　細胞培養用培地及び輸液として機能する薬液であって，
    　前記薬液は，カルシウムイオン，プロスタグランジン及び緩衝剤を含む，薬液。

     
PCT/JP2019/030608 2018-08-03 2019-08-02 培養上清製剤の製造方法 WO2020027336A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SG11202011845XA SG11202011845XA (en) 2018-08-03 2019-08-02 Production method for culture supernatant preparation
CN201980041197.4A CN112334144A (zh) 2018-08-03 2019-08-02 培养上清液制剂的制造方法
JP2020534786A JP7386539B2 (ja) 2018-08-03 2019-08-02 培養上清製剤の製造方法
US17/252,272 US20210260135A1 (en) 2018-08-03 2019-08-02 Production Method for Culture Supernatant Preparation
JP2023189703A JP2024012530A (ja) 2018-08-03 2023-11-07 培養上清製剤の製造方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-146349 2018-08-03
JP2018146349 2018-08-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020027336A1 true WO2020027336A1 (ja) 2020-02-06

Family

ID=69232228

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/030608 WO2020027336A1 (ja) 2018-08-03 2019-08-02 培養上清製剤の製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210260135A1 (ja)
JP (2) JP7386539B2 (ja)
CN (1) CN112334144A (ja)
SG (1) SG11202011845XA (ja)
WO (1) WO2020027336A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021116303A (ja) * 2020-01-23 2021-08-10 医療法人社団サカイクリニック６２ 歯周組織用製剤
WO2022220179A1 (ja) * 2021-04-12 2022-10-20 万里 坂井 歯周組織用製剤及びそれを含むキット

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987003284A1 (en) * 1985-11-22 1987-06-04 Teijin Limited Vascularization factor and process for its preparation
JP2011510662A (ja) * 2008-01-30 2011-04-07 ヒストジェン インコーポレイテッド 細胞外マトリックス組成物
WO2017110425A1 (ja) * 2015-12-22 2017-06-29 ロート製薬株式会社 肝疾患治療剤及び肝疾患を治療する方法
JP2017214321A (ja) * 2016-05-31 2017-12-07 学校法人愛知学院 糖尿病における筋肉を増強する組成物及びその利用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2554175B1 (en) * 2010-03-26 2018-02-28 Tokushima University Composition for treatment of damaged part
GB201103600D0 (en) * 2011-03-01 2011-04-13 Isis Innovation Dendritic cells
SG11201404603SA (en) * 2012-02-10 2014-10-30 Japanic Corp Cosmetic product or skin regeneration promoter comprising nonhuman stem cell culture supernatant as starting material, and method for ion introduction for protein
DK3313982T3 (da) * 2015-06-23 2023-12-11 Univ Texas Fremgangsmåder og indretning til konditionering af cellepopulationer til celleterapier
CN105434468A (zh) * 2015-12-15 2016-03-30 天津市康婷生物工程有限公司 一种皮肤细胞损伤修复试剂的制备方法
CN105886457A (zh) * 2016-05-16 2016-08-24 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987003284A1 (en) * 1985-11-22 1987-06-04 Teijin Limited Vascularization factor and process for its preparation
JP2011510662A (ja) * 2008-01-30 2011-04-07 ヒストジェン インコーポレイテッド 細胞外マトリックス組成物
WO2017110425A1 (ja) * 2015-12-22 2017-06-29 ロート製薬株式会社 肝疾患治療剤及び肝疾患を治療する方法
JP2017214321A (ja) * 2016-05-31 2017-12-07 学校法人愛知学院 糖尿病における筋肉を増強する組成物及びその利用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NTAI A ET AL.: "Trehalose to cryopreserve human pluripotent stem cells", STEM CELL RES., vol. 31, 1 August 2018 (2018-08-01), pages 102 - 112, XP055684608, ISSN: 1873-5061, DOI: 10.1016/j.scr.2018.07.021 *
SIGMA-ALDRICH, DMEM, 24 September 2019 (2019-09-24), Retrieved from the Internet <URL:https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/SAJ/Formulation/l/j_dmemfor.pdf> *
SIGMA-ALDRICH, MEM, 25 September 2019 (2019-09-25), Retrieved from the Internet <URL:https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/SAJ/Brochure/l/j_recipemediummem.pdf> *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021116303A (ja) * 2020-01-23 2021-08-10 医療法人社団サカイクリニック６２ 歯周組織用製剤
WO2022220179A1 (ja) * 2021-04-12 2022-10-20 万里 坂井 歯周組織用製剤及びそれを含むキット

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024012530A (ja) 2024-01-30
US20210260135A1 (en) 2021-08-26
SG11202011845XA (en) 2020-12-30
JPWO2020027336A1 (ja) 2021-08-12
JP7386539B2 (ja) 2023-11-27
CN112334144A (zh) 2021-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2024012530A (ja) 培養上清製剤の製造方法
EP2628484B1 (en) Platelet-rich plasma compositions
KR101810385B1 (ko) Gdf11을 포함하는 조성물 및 그의 용도
AU2013259255B2 (en) Trehalose-containing mammalian cell suspension for prevention of pulmonary embolism formation
JP2021509675A (ja) 神経損傷を治療するための組成物および方法
CN113943701A (zh) 一种可扩增间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法
EP2602310B1 (en) Autoserum-containing bone marrow cell culture system, autoserum-containing bone marrow cell culture method, and method for producing medicinal composition comprising autoserum-containing cultured bone marrow cells as active ingredient
CN114269362A (zh) 促进血管生成的方法
JP2020137518A (ja) 添加剤
JP6497827B1 (ja) エイコサノイド産生促進剤
TW201406402A (zh) 含有聚葡糖之預防肺栓塞用哺乳動物細胞懸浮液
US20200087626A1 (en) Wnt-activated adipose-derived stem cell apparatuses, methods and systems
US20190255117A1 (en) Synoviolin expression inhibitor containing mesenchymal stem cell or culture supernatant thereof
JP7195677B2 (ja) 歯周組織用製剤
WO2018066531A1 (ja) 抗体産生力を上げる培養上清製剤
Yan et al. Research progress in clinical trials of stem cell therapy for stroke and neurodegenerative diseases
WO2023143519A1 (zh) 一种细胞修复蛋白提取物及其制备方法和其应用
EP4349347A1 (en) Composition for promoting angiogenesis comprising extracellular vesicles derived from three-dimensional spheroid-type cell aggregate
KR102526447B1 (ko) 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 조성물
KR20090119428A (ko) 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물
KR20170115009A (ko) 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19843607

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2020534786

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19843607

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1