WO2022220179A1 - 歯周組織用製剤及びそれを含むキット - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a preparation for periodontal tissue containing self-adjusted serum, a kit containing the same, and a surgical method using the preparation.
  • Periodontal tissue is affected by periodontal disease. As periodontal disease progresses, so-called periodontal pockets develop between the teeth and the gums, causing the gums to recede. As the periodontal disease progresses, the alveolar bone dissolves and the teeth become movable, eventually requiring tooth extraction. Periodontal tissue may also be affected by orthodontic treatment.
  • Regroth a periodontal tissue regeneration agent called Regroth (trademark) has been on the market.
  • Regroth contains a protein called fibroblast growth factor as a main component, and is said to be able to promote proliferation and differentiation of bone, muscle, adipocytes, and the like.
  • fibroblast growth factor a protein called fibroblast growth factor as a main component
  • it since it has a strong angiogenic effect, it is said that it can regenerate periodontal tissue.
  • the treatment requires periodontal surgery and is very expensive.
  • Hyaluronic acid is also injected for gum regeneration. Injection of hyaluronic acid is effective for gingival regeneration if it is performed in an appropriate manner, but depending on the patient's physical condition and/or constitution, the effect may be difficult to appear, and it is not effective for alveolar bone regeneration. I didn't.
  • An object of the present invention is to provide a novel preparation for periodontal tissue that can be treated by a simple operation, is highly safe and has high performance in regenerating periodontal tissue, and a kit containing the same.
  • ⁇ Aspect 1>> A preparation for periodontal tissue comprising a self-adjusting serum.
  • ⁇ Aspect 7>> A periodontal preparation according to aspect 6, wherein the Good's buffer is HEPES.
  • the autologous serum is a step of enriching cytokines and/or growth factors in the blood by warming blood collected from a patient using the periodontal preparation;
  • a method for producing a preparation for periodontal tissue containing self-adjusted serum and culture supernatant is A first culturing step of culturing cells using a first medium; After the first culturing step, a second culturing step of culturing the cells using a second medium different from the first medium as a medium; Obtained by a method comprising the step of obtaining a culture supernatant containing a second medium after the second culture step,
  • the autologous serum is a step of enriching cytokines and/or growth factors in the blood by warming blood collected from a patient using the periodontal preparation; and separating.
  • FIG. 1a shows a panoramic radiograph of a patient with alveolar bone defects due to periodontal disease and bruxism.
  • FIG. 1b shows a panoramic radiograph of the patient of FIG. 1a after multiple injections of the formulation of the invention.
  • the alveolar bone of the maxillary anterior teeth in the area indicated by the arrow increased, and the preoperative mild sway (M1) was also improved.
  • Figure 2a shows a panoramic radiograph of a patient with a maxillary anterior tooth thump and mild movement (degree II) of both left and right anterior teeth and palpable pain.
  • Figure 2b shows a panoramic radiograph of the patient of Figure 2a after multiple injections of the formulation of the present invention.
  • FIG. 3a shows a panoramic radiograph of a patient with evidence of bone resorption and loss mesial to the left lower molar (lower left 7th) due to smoking-induced periodontal disease.
  • Figure 3b shows a panoramic radiograph of the patient of Figure 3a after multiple injections of the formulation of the invention. In the portion indicated by the arrow, new bone begins to form, the white portion increases, and the alveolar bone line is formed.
  • Figure 4a shows the state of the periodontal tissue of a patient with gingival recession.
  • FIG. 4b shows the condition of the patient's gums after multiple injections of the formulation of Example 2 into the patient's gums of Figure 4a.
  • the gingiva in the maxillary gingiva and mandibular gingiva indicated by the arrows recovered, and the black triangle disappeared or improved.
  • Figure 5a shows an en face photograph of a patient's periodontal tissue with gingival recession.
  • the gingiva of the maxillary anterior teeth and the gingiva of the mandibular anterior teeth indicated by arrows have receded, resulting in a black triangle.
  • Figure 5b shows the condition of the patient's gums after multiple injections of the formulation of Example 2 into the patient's gums of Figure 5a.
  • the gingiva in the maxillary gingiva and mandibular gingiva indicated by the arrows recovered, and the black triangle disappeared or improved.
  • Fig. 5b is a photograph taken from the right side of the patient of Fig. 5a;
  • Fig. 5b is a photograph of the patient of Fig. 5b taken from the right side;
  • Fig. 5b is a photograph taken from the left side of the patient of Fig. 5a;
  • Fig. 5b is a photograph taken from the left side of the patient of Fig. 5b;
  • Figure 8a shows the state of the periodontal tissue of a patient with gingival recession.
  • FIG. 8b shows the condition of the patient's gums after multiple injections of a formulation of hyaluronic acid into the patient's gums of FIG.
  • the gingiva in the maxillary gingiva and mandibular gingiva indicated by the arrows recovered, and the black triangle disappeared or improved.
  • Figure 9a shows the state of the periodontal tissue of a patient with gingival recession.
  • Figure 9b shows the condition of the patient's alveolar bone after multiple injections of the formulation containing only the culture supernatant into the gingiva of the patient of Figure 59; FIG.
  • FIG. 10a shows the state of the periodontal tissue of a patient with alveolar bone loss due to severe periodontal disease.
  • the left arrow in the figure indicates the alveolar bone with defects.
  • the right arrow in the figure indicates the apical bone of the canine tooth.
  • Figure 10b shows the condition of the alveolar bone of the patient of Figure 10a after multiple injections of a formulation containing only the culture supernatant into the patient's alveolar bone.
  • the arrow on the left side of the figure indicates that the alveolar bone is regenerating in the depressed portion that was missing.
  • the right arrow in the figure indicates that the bone at the apical portion of the canine tooth is regenerated.
  • FIG. 11a shows the state of the periodontal tissue of a patient whose periodontal tissue has been destroyed by severe periodontal disease.
  • the arrows in the left panel of FIG. 11a indicate depressions resulting from alveolar bone defects.
  • the arrow in FIG. 11a right shows the thinned canine apical bone.
  • FIG. 11b shows the state of the patient's alveolar bone after multiple injections of the formulation containing only the culture supernatant into the gingiva of the patient of FIG. 11a.
  • the arrows in the left diagram of FIG. 11b indicate that the alveolar bone was regenerated and the depression was alleviated.
  • the arrows on the right side of FIG. 11b indicate that the apical bone of the canine tooth is regenerated.
  • the preparation for periodontal tissue of the present invention contains self-adjusted serum as an active ingredient.
  • a preparation for periodontal tissue means, for example, a preparation for regeneration of periodontal tissue.
  • periodontal tissue includes teeth and surrounding tissues, such as crown portions such as enamel, dentin, pulp, and gums, and root portions such as cementum, alveolar bone, blood vessels, and nerves.
  • the preparation for periodontal tissue of the present invention particularly relates to a preparation for regeneration of the gingiva of the crown portion and the alveolar bone of the root portion.
  • the periodontal tissue formulation may be a formulation for the treatment of periodontal disease or alveolar pyorrhea.
  • periodontal tissue affected by periodontal disease or the like can be regenerated very effectively and easily with a preparation containing self-adjusted serum.
  • the conventional regeneration method had problems such as periodontal surgery being required, effects differing depending on the operator, and safety being lowered depending on the operator.
  • the preparation of No. 2 it is only necessary to inject the preparation for periodontal tissue around the periodontal tissue to be regenerated, and it has been found that the regeneration effect is very high.
  • alveolar bone was not substantially regenerated by conventional regeneration methods, but the preparation of the present invention can regenerate alveolar bone very effectively. turned out to be This effect was found to be particularly pronounced when both autologous serum and culture supernatant were included.
  • Autologous serum is serum obtained by preparing and isolating the blood drawn from the patient to whom the preparation is to be used, and the cytokines and/or growth factors are usually much higher than in the blood.
  • cytokine and/or growth factor concentrations contained in autologous serum are usually two or more times, or three or more times, and sometimes as much as five times the blood concentration.
  • Self-adjusted serum is highly safe because it is made from blood collected from the patient, and has high concentrations of cytokines and/or growth factors. Therefore, it is very useful for regeneration of periodontal tissue, especially regeneration of alveolar bone. I found out.
  • Autologous sera are prepared, for example, by incubating blood drawn from a patient to enrich the blood with cytokines and/or growth factors, and separating the serum from the cytokines and/or growth factors-enriched blood. It can be manufactured by a method including steps.
  • self-adjusted serum the self-adjusted serum described in Patent Documents 1 and 2 above can be used.
  • Kits for producing self-adjusted sera are also available on the market, and examples of such products include SanakinTM.
  • Examples of cytokines include IL-1Ra, IL-4, IL-6, IL-10, TNF- ⁇ and the like.
  • Growth factors include epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF). At least one of these cytokines may be enriched in autologous serum two or more, three or more times, or five or more times as compared to normal serum.
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • the step of incubating the blood collected from the patient using the periodontal preparation to enrich the cytokines and/or growth factors in the blood includes the step of collecting blood from the patient and incubating the collected blood. , enriching the blood with cytokines and/or growth factors.
  • the step of collecting blood from a patient is a step of collecting the patient's own blood using the periodontal preparation, and about 10 ml of blood, for example, can be collected with an ordinary syringe.
  • the temperature is kept at, for example, 30°C to 45°C, 35°C to 40°C, or 36°C to 38°C, It can be carried out for 30 minutes or more, 1 hour or more, or 2 hours or more, and the heat retention time may be 1 day or less, half a day or less, or 5 hours or less.
  • the blood When keeping blood warm, the blood is preferably brought into contact with a solid surface such as glass or polymer (especially glass). By doing so, the production of cytokines and/or growth factors can be promoted. For this reason, it is preferable not only to use a container for storing blood, but also to increase the contact surface with blood by putting solid articles such as particles such as glass beads and fibers such as glass wool in the container.
  • a solid surface such as glass or polymer (especially glass).
  • the container for storing blood may be the syringe used to collect the blood, or it may be a container separate from the syringe.
  • the material that constitutes the solid particles to be put into the container can be a material different from the material that constitutes the container body.
  • the container can be composed of a polymer and the solid article can be, for example, glass beads.
  • the particle diameter can range from 0.5 to 10 mm, or from 1 to 5 mm, and according to preferred embodiments, the solid article contained in the syringe is less than 70% or 50% of the internal volume of the syringe. It can be less than volume %.
  • the container can have a volume of, for example, 10-100 ml.
  • the container and the solid article are made of glass, quartz glass, corundum, quartz, plastics such as polystyrene, polyethylene, polyvinyl chloride, polypropylene, etc., or are made of these materials or of these materials. It may substantially contain a mixture.
  • the IL-6 receptor antibody has a very strong effect of producing cytokines and/or growth factors, and also has a very strong effect on the regeneration of periodontal tissue. It was found to produce a particularly large amount. Therefore, it was found that the self-adjusted serum produced in this way is very effective when used as a preparation for periodontal tissue.
  • the step of separating serum from blood enriched with cytokines and/or growth factors can be performed by centrifugation. Centrifugation may be performed at normal speeds used to obtain serum, eg centrifugation at 500-2000 g for several minutes. For example, if 10 ml of blood is collected, about 3 to 5 ml of cytokine- and/or growth factor-enriched serum can be collected after centrifugation. It is preferable to remove platelets and blood cell components from the collected serum with a cell filtration filter.
  • the culture supernatant is a culture medium obtained by culturing cells, and usually substantially free of cells.
  • the mesenchymal cells or stem cells used to obtain the culture supernatant may be derived from humans or non-human mammals, may be derived from insects, may be derived from birds, or may be derived from plants.
  • the cells are preferably human-derived cells, and particularly mesenchymal or epithelial cells or stem cells, from the viewpoint of not causing an immune reaction.
  • the cells are adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells, umbilical cord blood stem cells, epidermis-derived epithelial cells, or dental pulp-derived mesenchymal stem cells. Stromal cells or cord blood stem cells.
  • the culture method may be appropriately adjusted depending on the target cells. For example, when mammalian - derived cells are used, culturing can be carried out under any conditions suitable for culturing mammalian cells. , the medium can be changed as needed.
  • the medium is not particularly limited, but examples include ⁇ -MEM, DMEM, etc. supplemented with 10-15% autologous serum or fetal bovine serum (FBS) and antibiotics.
  • FBS fetal bovine serum
  • a medium that does not contain human- or animal-derived components may be used. If necessary, growth factors such as fibroblast growth factor (bFGF) and adrenomedullin may be added to the medium.
  • bFGF fibroblast growth factor
  • adrenomedullin may be added to the medium.
  • the medium those listed below as the second medium can also be used.
  • the culture supernatant is a first culture step of culturing cells using a first medium, and a second culture step of culturing cells using a second medium different from the first medium after the first culture step, obtaining a culture supernatant containing a second medium after the second culture step.
  • a known culture method can be appropriately adopted for the first culture step.
  • the primary purpose of the first culturing step is to grow the cells, and the cells can be cultured until subconfluent or confluent.
  • any medium can be used as the first medium as long as it is a medium that allows the cells to be used to proliferate.
  • Examples include ⁇ -MEM, DMEM, etc. supplemented with 10-15% autologous serum or fetal bovine serum (FBS) and antibiotics.
  • FBS fetal bovine serum
  • a medium that does not contain human- or animal-derived components may be used. If necessary, growth factors such as fibroblast growth factor (bFGF) and adrenomedullin may be added to the medium.
  • bFGF fibroblast growth factor
  • adrenomedullin may be added to the medium.
  • the cells can be collected and washed as appropriate.
  • the harvested cells are then cultured in a second medium different from the first medium.
  • the second culturing step preferably does not use a CO 2 incubator and does not carry out CO 2 culturing.
  • the composition of the culture supernatant eliminates the need for CO2 culture. That is, it is preferable to culture at around 37° C. using a culture vessel without CO 2 incubation.
  • the second culturing step is preferably a step of culturing the cells for 5 hours or more and 5 days or less (10 hours or more and 2 days or less, or 5 hours or more and 3 days or less). Cultivation may be either adherent culture or suspension culture depending on the cells to be cultured. When removing cells, the culture may be performed by a method that facilitates the removal of cells.
  • the second medium the medium mentioned as usable as the first medium and other well-known mediums can be used, and from the viewpoint of not causing an immune reaction, it is preferable to use a serum-free medium.
  • the second medium may be prepared by further adding a calcium ion source and/or a buffer.
  • the second medium is an electrolyte solution containing calcium ions and a buffer, and optionally containing prostaglandins. It has been found that a particularly advantageous effect is obtained if prostaglandins are additionally included.
  • the calcium ion source is not particularly limited as long as it is a water-soluble and bio-acceptable calcium salt, and examples include calcium chloride.
  • the second medium may contain an infusion solution for injection or an infusion solution for infusion.
  • the second medium contains an infusion solution for injection or an infusion solution for drip infusion, one that is manufactured and sold as an infusion solution for injection or infusion for infusion can be used as appropriate.
  • infusion solutions for injection examples include sugar solutions, extracellular fluid replenishers (physiological saline, Ringer's solution, lactated Ringer's solution, extracellular fluid replenisher, acetated Ringer's solution, bicarbonate Ringer's solution), hypotonic electrolyte solutions, amino acid preparations (high concentration amino acid solution, renal failure amino acid solution, liver failure amino acid solution, pediatric amino acid solution), PPN (peripheral parenteral nutrition solution), TPN (high calorie infusion), lipid emulsion and plasma expander substitute.
  • extracellular fluid replenishers physiological saline, Ringer's solution, lactated Ringer's solution, extracellular fluid replenisher, acetated Ringer's solution, bicarbonate Ringer's solution
  • hypotonic electrolyte solutions amino acid preparations (high concentration amino acid solution, renal failure amino acid solution, liver failure amino acid solution, pediatric amino acid solution), PPN (peripheral parenteral nutrition solution), TPN (high calorie infusion), lipid emulsion
  • extracellular fluid replenishers physiological saline, Ringer's solution, lactated Ringer's solution, extracellular fluid replenisher, acetated Ringer's solution, bicarbonate Ringer's solution
  • isotonic electrolyte solutions are preferred.
  • a particular infusion solution is Pareplus®. These infusion solutions may be used by adding the above-mentioned calcium sources, buffers, prostaglandins, and the like.
  • the calcium ions are preferably 0.045 mM or more and 1.802 mM or less, may be 0.074 mM or more and 1.505 mM or less, may be 0.045 mM or more and 2 mM or less, or may be 0.045 mM or more and 1.505 mM or less.
  • 180 mM or more and 2 mM or less 1 mM or more and 2 mM or less, 1.3 mM or more and 1.8 mM or less, 1.2 mM or more and 1.6 mM or less, or 1 mM or more and 1.6 mM or less, It may be 0.045 mM or more and 1.352 mM or less, 0.180 mM or more and 0.901 mM or less, or 20 mg/l or more and 100 mg/l or less.
  • salts contained in the second medium are NaCl, KCl, and CaCl 2 , which may contain 1 g/L or more and 30 g/L or less, or 4 g/L or more and 30 g/L or less, 6 g/L or more and 11 g/L or less may be contained.
  • buffering agents include inorganic buffers such as MgSO 4 .7H 2 O, Na 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 and NaHCO 3 , and organic buffers such as Good's buffers. Buffers can also be used. Good buffers include MES, bistrismethane, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, colamin hydrochloride, MOPS, BES, TES, HEPES, DIPSO, MOBS, acetamidoglycine, TAPSO, TEA, POPSO, HEPPSO, EPS, HEPPS, Tricine, Tris, glycinamide, glycylglycine, HEPBS, bicine, TAPS, AMPB, CHES, AMP, AMPSO, CAPSO, CAPS, CABS, etc., and among these, HEPES (hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid) is particularly preferred.
  • HEPES hydroxyethylpiperazineethan
  • These may be used in combination with other salts (eg, sodium hydrogen carbonate, sodium carbonate, pyruvic acid, citric acid, salts thereof, etc.).
  • the content of these buffers may be adjusted according to the range of pH to be adjusted, for example, it may be 1 mg/l or more and 5 g/l or less, or it may be 2 mg/l or more and 500 mg/l or less. It may be 10 mg/l or more and 300 mg/l or less.
  • the acidity of the second medium is, for example, pH 5.5 or higher and pH 9 or lower, or may be pH 7.2 or higher and pH 7.8 or lower.
  • the second medium preferably contains little sugar, preferably contains substantially no sugar or does not contain sugar at all, and preferably has a sugar content (e.g., glucose) of 1 g/l or less.
  • a sugar content e.g., glucose
  • the second medium preferably contains less amino acids, substantially no amino acids, or no amino acids, and preferably has an amino acid content of 1 mg/ml or less, preferably 0.8 mg/l or less, and 0.5 mg/ml. l or less is more preferable.
  • the second medium preferably contains few vitamins, contains substantially no vitamins, or does not contain vitamins at all, and the content of vitamins is preferably 1 mg/ml or less, preferably 0.8 mg/l or less, 0.5 mg/l or less is more preferable.
  • the second medium preferably does not contain antibiotics (eg penicillin), growth factors or cytokines.
  • the second medium contains little or no heavy metal elements such as iron, copper, and lead, and trace elements. Since such elements are scarce, it is possible to suppress the synthesis of metalloproteins and promote the synthesis of growth factors.
  • the second medium preferably does not contain carcinogenic substances such as polyamines (eg, Putrescine 2HCl).
  • the second medium preferably does not contain purine bases. If the second medium does not contain purine bases, the nucleic acid salvage pathway can be activated.
  • the second medium contains little or no vitamins and amino acids, which can promote autophagy and increase growth factor synthesis.
  • the second medium can maintain a constant environment during culture in a general culture environment (for example, it can suppress fluctuations in acidity and has a buffering capacity during culture, so CO 2 culture, etc.) no longer need to be done).
  • the second medium has a higher water content than the normal medium.
  • the water content is preferably 95% by weight or more and 99.99% by weight or less, may be 96% by weight or more and 99.9% by weight or less, or 97% by weight or more and 99.9% by weight. It can be below.
  • Osmotic pressure can be lowered by increasing the water content of the medium.
  • the cells are usually separated from the culture vessel using an animal-derived digestive enzyme such as trypsin, but the use of the second medium eliminates the need to use a digestive enzyme. Then, side effects such as infection due to animal-derived components can be reduced when a drug containing the second medium is administered to a patient.
  • the second medium contains carbohydrates (e.g. glucose), salts (including a source of calcium ions, e.g. consisting solely of or containing these as the main salts, e.g. NaCl, KCl and CaCl2), and buffers (e.g. MgSO4. H 2 O, Na 2 HPO 4 .2H 2 O, KH 2 PO 4 , NaHCO 3 , and Good's buffer (especially HEPES) or containing these as the main buffer) and the remainder a solvent (e.g. water). ) may consist of only.
  • carbohydrates e.g. glucose
  • salts including a source of calcium ions, e.g. consisting solely of or containing these as the main salts, e.g. NaCl, KCl and CaCl2
  • buffers e.g. MgSO4. H 2 O, Na 2 HPO 4 .2H 2 O, KH 2 PO 4 , NaHCO 3 , and Good's buffer (especially HEPES
  • the second medium Since the second medium has a low amino acid content, it avoids interactions (mainly oxidation/reduction) and polymerization reactions with synthetically secreted growth factors, thereby preventing deterioration of components and moisture absorption due to contaminating amino acids. and can prevent deterioration. In addition, since the second medium has a low amino acid content, the risk of bacterial growth is reduced when it is used as a cosmetic raw material, so the stability of the product can be ensured without adding preservatives or antioxidants. . When the second medium does not contain amino acids, it does not require a deamino acid step for use on the affected area, and does not provide nutrients for the growth of bacteria and the like residing in the affected area. This means that it does not cause malodor when applied to the wound surface.
  • the second medium is preferably a medium containing calcium ions and a buffer, and preferably has a simple composition. It can be applied to plant cells (particularly plant callus culture and maintenance of plant stem cells).
  • the step of obtaining the culture supernatant containing the second medium is performed after the second culture step.
  • This step preferably further includes the step of adding trehalose.
  • the formulation containing the culture supernatant preferably contains 50% by weight or more and 100% by weight or less of the second medium after the second culture step.
  • the formulation containing the culture supernatant may contain 60% by weight or more and 100% by weight or less of the second medium (including the culture supernatant) after the second culture step, or 70% by weight or more and 99% by weight or less, 70% by weight 90% by weight or more, 80% by weight or more and 99% by weight or less, 90% by weight or more and 100% by weight or less, or 90% by weight or more and 95% by weight or less.
  • the culture supernatant of stem cells and the like is usually a supernatant component obtained by solid-liquid separation of the culture supernatant by centrifugation. Since the method described herein can actively include the second medium in the formulation, one may simply use the filtered medium after the second culture step.
  • the formulation is a processed product obtained by removing water from the culture supernatant obtained as described above by freeze-drying, a processed product obtained by concentrating the culture supernatant under reduced pressure using an evaporator, etc., and an ultrafiltration
  • a processed product obtained by concentrating the culture supernatant using a membrane or the like, or a processed product obtained by solid-liquid separation of the culture supernatant using a filter, or the culture supernatant before the above treatment It may be a stock solution.
  • the cell culture supernatant is centrifuged (e.g., 1,000 x g, 10 minutes), then fractionated with ammonium sulfate (e.g., 65% saturated ammonium sulfate), and the precipitate is treated with an appropriate buffer. After suspension, dialysis treatment may be performed and filtered through a syringe filter (eg, 0.2 ⁇ m) to obtain a sterile culture supernatant.
  • the collected culture supernatant can be used as it is, or it can be stored frozen and thawed before use.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be added to dispense into sterilized containers so that the liquid volume is easy to handle, such as 0.2 ml or 0.5 ml.
  • the culture supernatant may be treated with a virus clearance filter or ⁇ -ray irradiation.
  • a freezing step of freezing the collected culture supernatant may be included after the second culture step and the step of obtaining the culture supernatant.
  • the temperature of the culture supernatant may be -200°C or higher and 0°C or lower, or -100°C or higher and -5°C or lower.
  • the preparation containing the culture supernatant is obtained by crushing the cells after the second culture step, centrifuging, and filtering using a filter, or by freezing and drying the filtrate. good.
  • the preparation for periodontal tissue of the present invention can be produced using a known method, and can be administered using a known administration method such as injection or application to periodontal tissue.
  • a known administration method such as injection or application to periodontal tissue.
  • One example is intragingival or intraalveolar administration, where administration can be at one or more sites.
  • a particularly preferred culture supernatant is the culture supernatant as described in International Publication No. WO2020/027336A1.
  • the preparation for periodontal tissue of the present invention can constitute a preparation for periodontal tissue further containing hyaluronic acid and a kit for periodontal tissue.
  • the preparation for periodontal tissue of the present invention preferably contains self-adjusted serum, culture supernatant and hyaluronic acid.
  • hyaluronic acid refers to all variants of hyaluronic acid, hyaluronate or hyaluronan, including various chain lengths and charge states, and various chemical modifications including cross-linking, and variants thereof. including combinations of
  • Preparations containing self-adjusted serum are very expensive, but it may take time for the effect to appear, so it is assumed that some patients will stop treatment before the effect appears.
  • hyaluronic acid in combination with the formulation of , the effect can be realized at an early stage.
  • the fact that the effect can be felt at an early stage is very important for continuation of treatment, and the kit containing the preparation of the present invention was a preparation with a very high degree of satisfaction for the patient.
  • hyaluronic acid can eliminate the black triangle caused by thinning of the gums by swelling the hyaluronic acid-injected area.
  • Hyaluronic acid is absorbed over time, but it does not return to its original position after absorption. This is because the administration of hyaluronic acid swells the gingiva, imparts a stretching stimulus to gingival cells, and enhances the activity of fibroblasts, such as the ability to synthesize collagen and proliferate, thereby promoting regeneration of the gingiva.
  • continuous administration is required for such effects to be exhibited.
  • hyaluronic acid is a type of glycosaminoglycan mainly composed of glucuronic acid and N-acetylglucosamine.
  • hyaluronic acid includes all variants and modifications thereof of hyaluronic acid, hyaluronate or hyaluronan, including various chain lengths and charge states, and various chemical modifications including cross-linking. Including body combinations.
  • the term also includes different hyaluronate salts of hyaluronic acid with different counterions, such as sodium hyaluronate.
  • hyaluronic acid also include oxidation (eg, oxidation of —CH 2 OH to —CHO and/or —COOH); periodate oxidation of vicinal hydroxyl groups, optionally followed by reduction (eg, — reduction of CHO to —CH 2 OH), or coupling with an amine to form an imine and reduction to a secondary amine; sulfation; terms such as amide formation; esterification; cross-linking; substitution by various compounds, such as using cross-linking agents or carbodiimide-assisted coupling; subsumed by Other examples of modifications are isourea, hydrazide, bromoyan, monoepoxide and monosulfone couplings.
  • oxidation eg, oxidation of —CH 2 OH to —CHO and/or —COOH
  • periodate oxidation of vicinal hydroxyl groups optionally followed by reduction (eg, — reduction of CHO to —CH 2 OH),
  • Hyaluronic acid can be obtained from various sources of animal and non-animal sources.
  • Sources of non-animal origin include yeast, preferably bacteria.
  • the molecular weight of a single hyaluronic acid molecule typically ranges from 0.1 to 10 MDa, although other molecular weights are possible.
  • the concentration of hyaluronic acid ranges from 1-100 mg/ml. In some embodiments, the concentration of hyaluronic acid ranges from 2-50 mg/ml. In certain embodiments, the concentration of hyaluronic acid is in the range of 5-30 mg/ml, or in the range of 10-30 mg/ml.
  • hyaluronic acid is crosslinked. Cross-linked hyaluronic acid is a combination of hyaluronic acid molecules held together by covalent cross-linking, physical entanglement of hyaluronic acid chains, and various interactions such as electrostatic interactions, hydrogen bonding and van der Waals forces. It contains cross-links between hyaluronic acid chains that create a continuous network.
  • Crosslinking of hyaluronic acid may be achieved by modification using a chemical crosslinker.
  • Chemical crosslinkers may, for example, be selected from the group consisting of divinyl sulfones, multiepoxides and diepoxides.
  • the chemical crosslinker is selected from the group consisting of 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE), 1,2-ethanediol diglycidyl ether (EDDE) and diepoxyoctane.
  • the chemical crosslinker is 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE).
  • the crosslinked hyaluronic acid product is preferably biocompatible. This implies that no or very mild immune response occurs in the treated individual. That is, no or only mild undesirable local or systemic effects occur in treated individuals.
  • a crosslinked hyaluronic acid product according to the present invention may be a gel or a hydrogel. That is, although it may be considered water insoluble, it can substantially dilute the crosslinked system of hyaluronic acid molecules when subjected to liquids, typically aqueous liquids.
  • Gels are mostly liquid by weight and can contain, for example, 90-99.9% water and behave like solids due to the three-dimensional crosslinked hyaluronic acid network in the liquid. Due to its significant liquid content, the gel is structurally flexible and resembles natural tissue making it very useful for tissue augmentation as a scaffold in tissue engineering.
  • cross-linking of hyaluronic acid to form a cross-linked hyaluronic acid gel can be achieved by modification with a chemical cross-linking agent such as BDDE (1,4-butanediol diglycidyl ether, etc.).
  • BDDE 1,4-butanediol diglycidyl ether, etc.
  • Hyaluronic acid concentration and degree of cross-linking affect mechanical properties, such as the elastic modulus G' and stability of the gel.
  • Crosslinked hyaluronic acid gels are often characterized in terms of "degree of modification".
  • the degree of modification of hyaluronic acid gels generally ranges between 0.1 and 15 mol %.
  • the degree of modification of the hyaluronic acid gel is advantageously less than or equal to 2 mol %, such as less than or equal to 1.5 mol %, such as less than or equal to 1.25 mol %, such as less than or equal to 0.25 mol %, compared to more crosslinked hyaluronic acid gels. It is in the range of 1 to 2 mol % or less, for example in the range of 0.2 to 1.5 mol %, for example in the range of 0.3 mol to 1.25 mol %.
  • the degree of modification (mole %) is the amount of crosslinker(s) bound to HA relative to the total molar amount of repeating disaccharide units of HA, i.e. the molar amount of bound crosslinker(s) indicates The degree of modification reflects how much HA has been chemically modified by the chemical crosslinker. All reaction conditions for cross-linking techniques and suitable analytical techniques for determining the degree of modification are well known to those skilled in the art who can readily adjust these and other relevant factors to provide the appropriate conditions. , a degree of modification ranging from 0.1 to 2% can be obtained to alter the resulting product characteristics with respect to the degree of modification.
  • BDDE (1,4-butanediol diglycidyl ether) crosslinked hyaluronic acid gels may be prepared, for example, according to the methods described in Examples 1 and 2 of WO 97/04012A.
  • hyaluronic acid is present in the form of a crosslinked hyaluronic acid gel crosslinked by a chemical crosslinker, wherein the concentration of said hyaluronic acid is in the range of 10-30 mg/ml, and said chemical crosslinker is The degree of modification with agents is in the range of 0.1 to 2 mol %.
  • the hyaluronic acid gel can also contain portions of hyaluronic acid that are not crosslinked, ie, not bound to a three-dimensional crosslinked hyaluronic acid network.
  • hyaluronic acid Preferably, however, at least 50% by weight, preferably at least 60% by weight, more preferably 70% by weight, most preferably at least 80% by weight of hyaluronic acid form part of a crosslinked hyaluronic acid network.
  • hyaluronic acid to be used can be changed depending on the site of the periodontal tissue where the preparation of the present invention is used. For example, it is preferable to use Restylane Vital Skin Boosters (registered trademark).
  • the liquid formulation can be produced by a known method.
  • autologous serum, optionally lyophilized culture supernatant powder, and a pharmaceutically acceptable solvent are mixed and filled into a sterile liquid drug container.
  • Optional hyaluronic acid can then be added to the container.
  • pharmaceutically acceptable solvents are water for injection, distilled water, physiological saline, electrolyte solutions, or liquids with compositions similar to culture media, and sterilized solvents are preferably used.
  • containers for sterile solutions are ampoules, vials, syringes, and bags. As these containers, known containers such as those made of glass or plastic can be used.
  • plastic containers are those using materials such as polyvinyl chloride, polyethylene, polypropylene, and ethylene-vinyl acetate copolymer.
  • sterilization methods for these containers and solvents include heating methods (flame method, drying method, high-temperature steam method, circulation steam method, boiling method, etc.), filtration methods, irradiation methods (radiation method, ultraviolet method, high-frequency method, etc.), They are the gas method and the chemical method.
  • heating methods flame method, drying method, high-temperature steam method, circulation steam method, boiling method, etc.
  • filtration methods irradiation methods (radiation method, ultraviolet method, high-frequency method, etc.)
  • irradiation methods radiation method, ultraviolet method, high-frequency method, etc.
  • Such a sterilization method can be appropriately selected and used by those skilled in the art according to the material of the container and the properties of the solvent.
  • the culture supernatant when the formulation of the present invention and the kit containing the same contain a culture supernatant, the culture supernatant is usually substantially free of cells, but may contain cultured cells.
  • cultured cells When cultured cells are included, they are preferably allogeneic human cells or autologous cells, more preferably autologous cells.
  • periodontal injection is most frequently used as a transplantation method.
  • intra-periodontal injection it is preferably prepared as a liquid formulation at 1 ⁇ 10 5 cells/mL or more and 5 ⁇ 10 7 cells/mL or less, and 1 ⁇ 10 6 cells/mL or more and 1 ⁇ 10 7 cells/mL or less. Cells/mL is more preferred.
  • the mesenchymal stem cell agent prepared as one dosage unit for periodontal injection is preferably 1 ⁇ 10 5 cells or more and 1 ⁇ 10 9 cells, and 2 ⁇ 10 7 cells or more and 2 ⁇ 10 8 cells. It is even more preferable.
  • Other administration routes can be used within the range of the amount of liquid that can be transplanted into a tissue and the maximum number of cells that can be suspended in that amount.
  • the formulation of the present invention and kits containing it may be prepared with a pharmaceutically acceptable carrier or vehicle.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or vehicle is a pharmaceutically acceptable substance such as, for example, a stabilizer, a solubilizer, a suspending agent, a buffer, a tonicity agent, an antioxidant, or a preservative. can give.
  • tonicity agents are sodium chloride and glucose.
  • buffering agents are citrates, acetates, boric acids, and phosphates.
  • As the aqueous medium for suspending the cells for example, an aqueous solution for injection in which the osmotic pressure and pH are adjusted to the values of blood, and the salt concentration and the like are adjusted may be appropriately used.
  • Ringer's solution such as acetic acid Ringer's solution and other infusion solutions, physiological saline, glucose solution, and the like can be used, but are not limited to these.
  • Ringer's solution for infusion it may be supplemented with acceptable amounts of dimethylsulfoxide (DMSO) or human serum albumin (HSA).
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • HSA human serum albumin
  • antioxidants are ascorbic acid, sodium bisulfite, and sodium pyrosulfite.
  • the preparation of the present invention and the kit containing it are very effective for women and men in their 20s to 50s, and particularly effective for women in their 20s to 40s.
  • the effect on women in their 20s to 40s was extremely remarkable in the case of preparations containing self-adjusted sera and culture supernatants and kits containing the same.
  • the present specification describes a treatment method for the periodontal tissue of a subject (human or non-human mammal) using the periodontal tissue preparation containing the self-adjusted serum as described above and a kit containing the same. also disclose. When this is used for treatment, it can be administered to the affected area by injection or the like.
  • the collected blood was transferred from the syringe to a Sanakin (trademark) tube, mixed by inverting the tube 3 to 4 times, and then stored in a storage kept at 37°C for 3 hours.
  • the Sanakin (trademark) tube was transferred to a centrifuge and centrifuged at 3000 rpm (1200 G) for 5 minutes, thereby sedimenting platelets and blood cell components floating in the serum.
  • the culture supernatant used in the formulation of the present invention was produced in the same manner as described in International Publication No. WO2020/027336A1. That is, it was manufactured as follows.
  • Adipose tissue-derived stromal cells extracted by enzymatically treating normal human adipose tissue were placed in a non-coated culture flask (FALCON company) and used as primary culture.
  • Primary cultured cells just before confluency were collected by enzyme treatment, seeded in the same medium on a 12-well plate for uncoated culture (manufactured by Sumitomo Bakelite), and cultured until confluent.
  • ⁇ Second culture step> After washing, the cells were replaced with HBSS (Hank's Balanced Salt Solution, Sigma-Aldrich)-HEPES. The 12 wells were then divided into 4 groups of 3 wells and cultured in an incubator without CO2 .
  • HBSS Hort's Balanced Salt Solution, Sigma-Aldrich
  • HBSS Hank's Balanced Salt Solution
  • HBSS Hank's Balanced Salt Solution
  • HEPES is hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid and is a buffering agent or pH adjuster.
  • the amount of sugar contained in HBSS-HEPES medium is 1.0 g/L, NaCl is 8.0 g/L, KCl is 0.4 g/L, and CaCl 2 is 0.14 g/L.
  • L, MgSO4.H2O is 0.2 g/L, Na2HPO4.2H2O is 0.06 g/L, KH2PO4 is 0.06 g/L , NaHCO3 is 0.06 g/L. 35 g/L, 20 mM HEPES pH 7.4, total amount of amino acids (L-glutamic acid, etc.) was 0 g/L, and calcium ion was 1.5 mM.
  • ⁇ Preparation of formulation>> 2 ml of autologous serum was used as the formulation for injection of Example 1.
  • the freeze-dried culture supernatant prepared from 1 ml of the above culture supernatant was dissolved in 1 ml of physiological saline and mixed with 1 ml of self-adjusted serum to prepare the injection preparation of Example 2.
  • a preparation for injection was also prepared by dissolving the freeze-dried culture supernatant prepared from 1 ml of the above culture supernatant in 1 ml of physiological saline.
  • FIG. 1a is a panoramic radiograph of the alveolar bone of a 47-year-old woman with alveolar bone defects due to periodontal disease and bruxism. This woman's maxillary anterior alveolar bone was reduced, and she also had mild mobility (M1). In FIG. 1a, the bone has decreased and many parts appear black. The alveolar bone line is also obscured due to osteopenia.
  • Example 2 2 ml of the above preparation of Example 1 was injected into the patient's maxillary anterior tooth bone 6 times once a month.
  • Fig. 1b is a photograph after 6 injections.
  • the alveolar bone of the maxillary anterior teeth increased, and the mild sway (M1) that had existed before the operation was improved.
  • M1 mild sway
  • the density of the bones has increased, and the black parts in the image have decreased, and the white parts with new bones have increased. You can see that the bone at the top of the alveolar bone, which had disappeared, is newly formed and appears white.
  • This patient had receding gums, but after 6 injections, the receding gums had recovered to some extent.
  • FIG. 2a is a panoramic radiograph of the alveolar bone of a 52-year-old female with a maxillary anterior tooth bang and mild movement (degree II) of the left and right anterior teeth and palpable pain.
  • the patient's alveolar bone and periodontal ligament were injected with 2 ml of the above preparation of Example 1 four times once a month.
  • Fig. 2b is a photograph after 4 injections. It can be seen that the bone density of the maxillary anterior teeth has increased and the position of the alveolar bone crest has become higher. In addition, it can be seen that the white portion of the adjacent bone has increased, and the thickness of the bone has increased. The agitation and percussion pain disappeared with the second injection.
  • FIG. 3a is a panoramic radiograph of the alveolar bone of a 47-year-old female with bone resorption and loss mesial to the left lower molar (lower left 7th) due to periodontal disease exacerbation due to smoking.
  • the mesial bone is reduced and appears black, and the alveolar bone line is also unclear due to bone loss.
  • Example 2 2 ml of the above preparation of Example 1 was injected into the patient's left lower molar bone 6 times once a month.
  • Fig. 3b is a photograph after 4 injections. New bone is starting to form, the white part is increasing, and the alveolar bone line is starting to form.
  • Figure 4a is a photograph of the periodontal tissue of a 26-year-old female with gingival recession due to periodontal disease and bruxism. Gingival recession is observed in the mandibular and maxillary anterior teeth. There is a large interdental space in the maxillary anterior teeth and a large black triangle in the mandibular anterior teeth. The patient himself was also particularly concerned about aesthetics.
  • Example 2 2 ml of the above preparation of Example 2 was injected into the gingiva of the patient's mandibular anterior teeth and maxillary anterior teeth at a rate of about once a month for 6 times.
  • Fig. 4b is a photograph after 6 injections.
  • the attached gingiva increased and the papilla became thicker, which reduced the interdental space and made the black triangle less noticeable.
  • the gingiva in the interdental papilla between the central teeth of the mandible increased significantly.
  • the gingiva in the papilla of the anterior teeth of the upper jaw has increased and become thicker, making the interdental space less conspicuous. The patient himself was aware of the effect and was very satisfied.
  • Figures 5a, 6a and 7a are photographs of the periodontal tissue of a 47-year-old female with gingival recession due to periodontal disease and malocclusion, taken from the front, right and left, respectively.
  • Example 2 2 ml of the preparation of Example 2 above was injected into the gingiva of the patient's mandibular anterior teeth and maxillary anterior teeth five times at a rate of about once a month.
  • Figures 5b, 6b, and 7b are photographs of the periodontal tissue after five injections taken from the front, right, and left sides, respectively.
  • the mandibular anterior teeth of "1" and “2” in the figure the attached gingiva increased and the papilla became thicker, so the interdental space decreased and the black triangle became less conspicuous.
  • the gingiva of the maxillary anterior tooth papilla of "3" and "4" has increased and become thicker, and the black triangle has disappeared. The patient himself was aware of the effect and was very satisfied.
  • Figure 8a is a photograph of the periodontal tissue of a 29 year old woman with gingival recession after orthodontics. Gingival recession is observed in the mandibular and maxillary anterior teeth. There is an interdental space in the maxillary anterior teeth, and a black triangle has occurred.
  • a 1 ml preparation containing only the above culture supernatant was injected into the gingiva of the patient's mandibular anterior teeth and maxillary anterior teeth three times once every 3 to 4 weeks.
  • Fig. 8b is a photograph of the periodontal tissue after three injections. Compared to before the treatment, it is clear that the gingiva of the maxillary anterior teeth has increased and is thicker, and the black triangle is less noticeable. In the mandibular anterior teeth, the gingiva increased and the papilla became thicker.
  • Figure 9a is a photograph of the periodontal tissue of a 28-year-old woman with periodontal disease and post-orthodontic gingival recession. Gingival recession and reduction of attached gingiva are observed in the mandibular anterior teeth and maxillary anterior teeth, and the gingiva is thin. In the mandibular anterior teeth, the interdental papilla is reduced and a black triangle is formed due to gingival recession.
  • Fig. 9b is a photograph of the periodontal tissue after 9 injections. It can be seen that the gingiva of the maxillary anterior teeth and the mandibular anterior teeth increased and became thicker than before the treatment. Especially in the mandibular anterior teeth, it can be clearly seen that the interdental space has decreased and the black triangle has become less conspicuous due to the increased attached gingiva and the thicker papilla. As for the mandibular anterior teeth, the black triangle became smaller due to the increased gingiva and thicker papilla.
  • Figure 10a is a panoramic X-ray image of the periodontal tissue of a 35-year-old male with alveolar bone loss due to severe periodontal disease. At the time of the first visit, due to severe periodontal disease, the recessed part of the tooth was remarkably uneven, and the bone at the apical part of the canine tooth was also thin.
  • Fig. 10b is a panoramic X-ray image of periodontal tissue after four injections. It can be seen that the alveolar bone increased and the bone was regenerated in the depressed portion that had been missing compared to before the operation. In addition, it can be seen that the bone is also regenerated in the apical portion of the canine tooth, and the area of the portion shown in white has increased. However, it cannot be said that the alveolar bone regeneration performance is high compared to the preparation containing self-adjusted serum.
  • FIG. 11a is a photograph of the periodontal tissue of a man with alveolar bone loss due to severe periodontal disease.
  • the gingiva in the recessed part of the tooth and the gingiva behind the canine were reduced due to severe periodontal disease.
  • the canine teeth were touched, they moved wobbly.
  • a 1 ml preparation containing only the above culture supernatant was injected into the patient's alveolar bone 3 times once every 3 to 4 weeks.
  • Fig. 11b is a photograph of the periodontal tissue after three injections. Compared to before the treatment, the gingiva in the recessed part was regenerated, and the thickness of the gingiva behind the canine was increased. As a result, the wobble of the canine teeth was relieved to a considerable degree. However, it cannot be said that the alveolar bone regeneration performance is high compared to the preparation containing self-adjusted serum.
  • preparations containing self-adjusted serum makes it possible to regenerate alveolar bone, which was impossible with conventional techniques, with a very high effect, and also with regard to gingival regeneration, a high effect is obtained from the initial stage of treatment.
  • preparations containing self-adjusted serum and culture supernatant were found to have extremely high periodontal tissue regeneration performance.
  • Example 1 or 2 When the formulation of Example 1 or 2 was additionally injected multiple times into the site where hyaluron was injected, it was found that a higher periodontal tissue regeneration effect was obtained. This is because the administration of hyaluronic acid swells the gingiva, imparts a stretching stimulus to gingival cells, and enhances the activity of fibroblasts, such as the ability to synthesize collagen and proliferate, thereby promoting regeneration of the gingiva. In addition, it is considered that the tissue regeneration ability of the preparation of Example 1 or 2 was effectively exhibited around the tissue stretched by hyaluronic acid, and a synergistic effect was obtained.

Abstract

【課題】　本発明は、簡単な操作によって処置することができ、歯周組織の再生性能が高く、治療初期から高い再生効果を実感できる、新規な歯周組織用製剤を提供する。 【解決手段】　本発明は、培養上清及びヒアルロン酸を含む歯周組織用製剤に関する。特に、本発明の歯周組織用製剤は、培養上清が、第１培地を用いて細胞を培養する第１培養工程と、第１培養工程の後に、第１培地と異なる第２培地を培地として、前記細胞を培養する第２培養工程と、第２培養工程の後に、第２培地を含む培養上清を得る工程とを含む方法によって得ることができ、第２培地は、カルシウムイオン及び緩衝剤を含むことができ、緩衝剤は、グッド緩衝剤、特にＨＥＰＥＳから選択することができる。

Description

歯周組織用製剤及びそれを含むキット
　本発明は、自己調整血清を含む歯周組織用製剤、それを含むキット及びその製剤を用いた手術方法に関する。
　歯周組織は、歯周病によって冒される。歯周病が進行すると、歯と歯肉との間に、いわゆる歯周ポケットが発生し、歯肉が退縮してくる。さらに歯周病が進行すると、歯槽骨が溶けて歯が動くようになり、最後は抜歯の必要性が生じる。また、歯周組織は、歯の矯正によっても冒される場合がある。
　歯周病等によって冒された歯周組織の再生については、従来から様々な方法が検討されてきた。例えば、骨移植術、ＧＴＲ法、エナメル基質蛋白による歯周組織再生療法が、従来から行われてきた。
　近年、リグロス（商標）という歯周組織再生剤が販売されている。リグロスは、線維芽細胞増殖因子と呼ばれるたんぱくを主成分として含み、骨、筋肉、脂肪細胞等の増殖及び分化を促進することができるとされている。また、これは強力な血管新生作用があるため、歯周組織を再生させることができるとされている。しかしながら、その処置にあたっては、歯周外科手術が必要であり、また非常に高価である。
　歯肉の再生にあたっては、ヒアルロン酸の注入も行われている。ヒアルロン酸の注入は、適切な方法で行われれば歯肉の再生に効果的であるものの、患者の体調及び／又は体質によっては、効果が現れにくい場合もあり、また歯槽骨の再生には効果がなかった。
　また、従来から、自己調整血清（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｓｅｒｕｍ）が、変形性関節症の治療に用いられているが（特許文献１）、このような自己調整血清が、近年、アンチエイジングの分野においても注目されている（特許文献２）。
特表２００２－５４０８１８号公報 特表２０１９－５２８２８１号公報
　本発明は、簡単な操作によって処置することができ、安全性及び歯周組織の再生性能が高い新規な歯周組織用製剤及びそれを含むキットを提供することを目的とする。
　本発明者らは、以下の態様を有する本発明により、上記課題を解決できることを見出した。
《態様１》
　自己調整血清を含む、歯周組織用製剤。
《態様２》
　培養上清をさらに含む、態様１に記載の歯周組織用製剤。
《態様３》
　前記培養上清が、
　　第１培地を用いて細胞を培養する第１培養工程と、
　　第１培養工程の後に、第１培地と異なる第２培地を培地として、前記細胞を培養する第２培養工程と、
　　第２培養工程の後に、第２培地を含む培養上清を得る工程と
を含む方法によって得られる、態様２に記載の歯周組織用製剤。
《態様４》
　第２培養工程が、非ＣＯ２雰囲気下で行われる、態様３に記載の歯周組織用製剤。
《態様５》
　第２培地が、カルシウムイオン及び緩衝剤を含む、態様３又は４に記載の歯周組織用製剤。
《態様６》
　前記緩衝剤が、グッド緩衝剤から選択される、態様５に記載の歯周組織用製剤。
《態様７》
　前記グッド緩衝剤が、ＨＥＰＥＳである、態様６に記載の歯周組織用製剤。
《態様８》
　態様２～７のいずれか一項に記載の歯周組織用製剤と、ヒアルロン酸を含む歯周組織用製剤とを含む、歯周組織用キット。
《態様９》
　前記自己調整血清が、
　　前記歯周組織用製剤を使用する患者から採血された血液を保温して、血中のサイトカイン及び／又は成長因子を富化させる工程と
　　前記サイトカイン及び／又は成長因子が富化した血液から血清を分離する工程と
を含む方法によって得られる、態様１～８のいずれか一項に記載の歯周組織用製剤。
《態様１０》
　前記サイトカイン及び／又は成長因子を富化する工程が、前記血液とガラスとを接触させて行われる、態様９に記載の歯周組織用製剤。
《態様１１》
　自己調整血清及び培養上清を含む歯周組織用製剤の製造方法であって、
　前記培養上清が、
　　第１培地を用いて細胞を培養する第１培養工程と、
　　第１培養工程の後に、第１培地と異なる第２培地を培地として、前記細胞を培養する第２培養工程と、
　　第２培養工程の後に、第２培地を含む培養上清を得る工程と
を含む方法によって得られており、
　前記自己調整血清は、
　　前記歯周組織用製剤を使用する患者から採血された血液を保温して、血中のサイトカイン及び／又は成長因子を富化させる工程と
　　前記サイトカイン及び／又は成長因子が富化した血液から血清を分離する工程と
を含む方法によって得られる、方法。
図１ａは、歯周病及びブラキシズムによって歯槽骨欠損がある患者のパノラマＸ線写真を示している。 図１ｂは、図１ａの患者に本発明の製剤を複数回注射した後の患者のパノラマＸ線写真を示している。矢印で示す部分の上顎前歯の歯槽骨が増え、術前にあった軽度動揺（Ｍ１）も改善された。 図２ａは、上顎前歯部を強打し、左右前歯に軽度動揺（ＩＩ度）及び触診痛がある患者のパノラマＸ線写真を示している。 図２ｂは、図２ａの患者に本発明の製剤を複数回注射した後の患者のパノラマＸ線写真を示している。矢印で示す部分の上顎前歯の骨密度が増え、歯槽骨頂部の位置が高くなっているのが分かる。 図３ａは、喫煙による歯周病悪化により左下大臼歯（左下７番）近心に骨吸収と減少が見られる患者のパノラマＸ線写真を示している。 図３ｂは、図３ａの患者に本発明の製剤を複数回注射した後の患者のパノラマＸ線写真を示している。矢印で示す部分において新しい骨が出来始め白い部分が増え、歯槽骨のラインが出来てきている。 図４ａは、歯肉退縮が生じている患者の歯周組織の状態を示している。矢印で示す上顎前歯部の歯肉および下顎前歯部の歯肉が退縮し、大きなブラックトライアングルが生じている。 図４ｂは、図４ａの患者の歯肉に実施例２の製剤を複数回注射した後の患者の歯肉の状態を示している。矢印で示す上顎歯肉部及び下顎歯肉部の歯肉が回復し、ブラックトライアングルが消失又は改善した。 図５ａは、歯肉退縮が生じている患者の歯周組織の正面写真を示している。矢印で示す上顎前歯部の歯肉および下顎前歯部の歯肉が退縮し、ブラックトライアングルが生じている。 図５ｂは、図５ａの患者の歯肉に実施例２の製剤を複数回注射した後の患者の歯肉の状態を示している。矢印で示す上顎歯肉部及び下顎歯肉部の歯肉が回復し、ブラックトライアングルが消失又は改善した。 図５ａの患者を右側から撮影した写真である。 図５ｂの患者を右側から撮影した写真である。 図５ａの患者を左側から撮影した写真である。 図５ｂの患者を左側から撮影した写真である。 図８ａは、歯肉退縮が生じている患者の歯周組織の状態を示している。矢印で示す上顎前歯部の歯肉および下顎前歯部の歯肉が退縮し、ブラックトライアングルが生じている。 図８ｂは、図４８の患者の歯肉にヒアルロン酸の製剤を複数回注射した後の患者の歯肉の状態を示している。矢印で示す上顎歯肉部及び下顎歯肉部の歯肉が回復し、ブラックトライアングルが消失又は改善した。 図９ａは、歯肉退縮が生じている患者の歯周組織の状態を示している。 図９ｂは、図５９の患者の歯肉に培養上清のみを含む製剤を複数回注射した後の患者の歯槽骨の状態を示している。 図１０ａは、重度歯周病によって歯槽骨欠損が生じている患者の歯周組織の状態を示している。図中の左の矢印は、欠損がみられる歯槽骨を示す。図中の右矢印は、犬歯の根尖部の骨を示す。 図１０ｂは、図１０ａの患者の歯槽骨に、培養上清のみを含む製剤を複数回注射した後の患者の歯槽骨の状態を示している。図中の左の矢印は、欠損していた陥没部に歯槽骨が再生していることを示す。図中の右矢印は犬歯の根尖部の骨が再生されていることを示す。 図１１ａは、重度歯周病によって歯周組織が破壊されている患者の歯周組織の状態を示している。図１１ａ左図の矢印は、歯槽骨が欠損した結果生じた陥没を示す。図１１ａ右図の矢印は、菲薄化した犬歯の根尖部の骨を示す。 図１１ｂは、図１１ａの患者の歯肉に、培養上清のみを含む製剤を複数回注射した後の患者の歯槽骨の状態を示している。図１１ｂ左図の矢印は、歯槽骨が再生し、陥没が軽減されたことを示す。図１１ｂ右図の矢印は、犬歯の根尖部の骨が再生されていることを示す。
　本発明の歯周組織用製剤は、自己調整血清を有効成分として含む。歯周組織用製剤とは、一例では歯周組織の再生用製剤を意味する。
　本明細書において、歯周組織とは、歯及びその周囲組織を含み、例えばエナメル質、象牙質、歯髄、歯肉等の歯冠部分、及びセメント質、歯槽骨、血管、神経等の歯根部分を含む。本発明の歯周組織用製剤は、特に歯冠部分の歯肉及び歯根部分の歯槽骨の再生用製剤に関する。一例では、歯周組織用製剤は、歯周病又は歯槽膿漏の治療用製剤であってもよい。
　本発明者は、歯周病等によって冒された歯周組織が、自己調整血清を含む製剤によって、非常に効果的かつ容易に再生できることを見出した。すなわち、従来の再生方法では、歯周外科手術が必要であったり、処置者によって効果に差が出たり、処置者によって安全性が低くなったりするという課題があったのに対して、本発明の製剤によれば、再生させたい歯周組織の周囲に歯周組織用製剤を注射すればよいだけであり、またその再生の効果も非常に高いことが分かった。特に、歯槽骨に対しては、従来の再生方法では実質的に再生がされていなかったのに対して、本発明の製剤によれば、歯槽骨に対しても非常に効果的に再生が可能になることが分かった。この効果は、自己調整血清と培養上清との両方を含む場合に特に顕著であることがわかった。
〈自己調整血清〉
　自己調整血清は、製剤を使用する患者本人から採血した血液を調整し、それを分離して得られる血清であり、サイトカイン及び／又は成長因子が、通常血中濃度よりも非常に高い。例えば、自己調整血清が含むサイトカイン及び／又は成長因子濃度は、通常血中濃度の２倍以上又は３倍以上であり、５倍程度となることもある。自己調整血清は、患者本人から採取した血液を原料としているため安全性が高く、かつサイトカイン及び／又は成長因子濃度が高いため、歯周組織の再生、特に歯槽骨の再生に非常に有用となることが分かった。
　自己調整血清は、例えば、患者から採血された血液を保温して、血中のサイトカイン及び／又は成長因子を富化させる工程と、サイトカイン及び／又は成長因子が富化した血液から血清を分離する工程とを含む方法によって製造することができる。そのような自己調整血清としては、上記の特許文献１及び２に記載のような自己調整血清を用いることができる。また、自己調整血清を作製するためのキットも販売されており、そのような商品としては、例えばＳａｎａｋｉｎ（商標）を挙げることができる。サイトカインとしては、一例としてＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－αなどが挙げられる。成長因子としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）があげられる。自己調整血清では、これらのサイトカインのうちの少なくとも１つが、通常の血清と比較し、２倍以上、３倍以上、又は５倍以上に富化されうる。
　歯周組織用製剤を使用する患者から採血された血液を保温して、血中のサイトカイン及び／又は成長因子を富化させる工程は、患者から採血する工程と、採血された血液を保温して、血中のサイトカイン及び／又は成長因子を富化させる工程とに別れていてもよい。患者から採血する工程は、歯周組織用製剤を用いる患者本人の血液を採取する工程であり、通常の注射器で、例えば１０ｍｌ程度の血液を採取することができる。
　採血した血液を保温して、血中のサイトカイン及び／又は成長因子を富化させる工程において、保温は、例えば３０℃～４５℃、３５℃～４０℃、又は３６℃～３８℃の範囲で、３０分以上、１時間以上、又は２時間以上行うことができ、保温する時間は、１日以下、半日以下、５時間以下であってもよい。また、この工程の前に、採取した血液を、容器に移す工程があってもよい。
　血液を保温する際には、好ましくは血液をガラス、ポリマー等の固体表面（特に、ガラス）に接触させる。このようにすることで、サイトカイン及び／又は成長因子の産生を促進させることができる。このために、血液を保管する容器だけではなく、その容器に、ガラスビーズ等の粒子、グラスウール等の繊維等の固体物品を入れて、血液との接触表面を増やすことが好ましい。
　血液を保管する容器としては、採血をした注射器であってもよく、又は注射器とは別の容器であってもよい。容器に入れる固体粒子を構成する材料は、容器本体を構成する材料とは別の材料とすることができる。例えば容器を、ポリマーで構成することができ、またその固体物品を、例えばガラスビーズとすることができる。例えば、粒子の直径は、０．５～１０ｍｍ、又は１～５ｍｍの範囲とすることができ、好ましい実施形態によれば、注射器に含まれる固体物品は、注射器の内部容積の７０％未満又は５０体積％未満とすることができる。容器は、例えば１０～１００ｍｌの容積とすることができる。
　本発明の特に有利な構成では、容器及び固体物品が、ガラス、石英ガラス、コランダム、石英、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン等のプラスチック等から製造されており、又はこれらの物質若しくはそれらの混合物を実質的に含有していてもよい。
　特に、血液と接触する固体表面がガラスである場合に、サイトカイン及び／又は成長因子を産生する作用が非常に強く、また歯周組織の再生に非常に強力に作用するＩＬ－６受容体抗体を特に多く産生することがわかった。したがって、このように製造された自己調整血清は、歯周組織用の製剤として用いた場合に非常に効果が高いことがわかった。
　サイトカイン及び／又は成長因子が富化した血液から血清を分離する工程は、遠心分離によって行うことができる。遠心分離は、血清を得るために使用する通常の速度で遠心すればよく、例えば５００～２０００ｇで数分間遠心分離が行われる。例えば、１０ｍｌの血液を採取した場合、遠心分離後に、サイトカイン及び／又は成長因子が富化した血清を３～５ｍｌ程度採取することができる。採取した血清は、血小板、血球成分が含まれないように、細胞ろ過フィルターでこれらを除去することが好ましい。
〈培養上清〉
　本明細書において、培養上清とは、細胞を培養して得られる培養液であり、通常は細胞を実質的に含まない。培養上清を得るために使用される間葉系細胞又は幹細胞は、ヒト又は非ヒト哺乳動物由来であってもよく、昆虫由来であってもよく、鳥類由来であってもよいし、植物由来であってもよい。免疫反応を生じさせない観点から、細胞は、ヒト由来の細胞が好ましく、特に間葉系又は上皮系の細胞又は幹細胞が用いられる。さらに好ましくは、細胞は、脂肪組織由来間葉系間質細胞、臍帯血幹細胞、表皮由来上皮系細胞、又は歯髄由来間葉系幹細胞であり、特に好ましくは、細胞は、脂肪組織由来間葉系間質細胞又は臍帯血幹細胞である。
　培養方法は、対象となる細胞に応じて適宜調整すればよい。例えば、哺乳動物由来の細胞を用いる場合、培養は、哺乳動物の細胞の培養に適する任意の条件で実施することができるが、一般的には３７℃前後、５％ＣＯ２で数日間培養し、必要に応じて培地を交換すればよい。
　培地としては、特に限定されないが、例えば１０～１５%の自己血清又は牛胎児血清（ＦＢＳ）及び抗生物質を補充したα-ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等を挙げることができる。ヒト又は動物由来の成分を含まない培地を用いてもよい。必要に応じて線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アドレノメデユリン等の成長因子を培地に加えてもよい。また、培地として、第２培地として以下に挙げたものを使用することもできる。
　培養上清は、第１培地を用いて細胞を培養する第１培養工程と、第１培養工程の後に、第１培地と異なる第２培地を培地として、細胞を培養する第２培養工程と、第２培養工程の後に、第２培地を含む培養上清を得る工程とを含む方法によって得ることができる。
　第１培養工程は、公知の培養方法を適宜採用することができる。第１培養工程は、細胞を増殖させることを主な目的としており、サブコンフルエント又はコンフルエントとなるまで培養することができる。
　第１培地としては、使用する細胞を増殖させることができる培地であれば、任意の培地を使用することができる。一例として、１０～１５%の自己血清又は牛胎児血清（ＦＢＳ）及び抗生物質を補充したα-ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等を挙げることができる。ヒト又は動物由来の成分を含まない培地を用いてもよい。必要に応じて線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アドレノメデユリン等の成長因子を培地に加えてもよい。
　第１培養工程の後、細胞を回収して、適宜洗浄を行うことができる。その後、回収した細胞を、第１培地と異なる第２培地において培養する。
　第２培養工程は、ＣＯ２培養器を用いず、ＣＯ２培養を行わないものが好ましい。好ましい態様において、培養上清の組成としてＣＯ２培養の必要がない。つまり、培養容器を用い、ＣＯ２インキュベートせずに、３７℃前後で培養を行うことが好ましい。第２培養工程は、５時間以上５日以下（１０時間以上２日以下、又は５時間以上３日以下）細胞を培養する工程であることが好ましい。培養は、培養される細胞に応じて接着培養でも浮遊培養でもよいし、細胞を取り除く場合は、細胞が取り除かれやすい方法で培養すればよい。
　第２培地は、第１培地として用いることができるとして挙げた培地及び他の周知の培地を用いることができ、特に免疫反応を生じさせない観点から、無血清培地を用いることが好ましい。また、第２培地は、さらにカルシウムイオン源及び／又は緩衝剤を添加して調製されていてもよい。第２培地は、カルシウムイオン及び緩衝剤を含み、さらにプロスタグランジンを随意に含む電解質溶液であることが好ましい。プロスタグランジンをさらに含む場合には、特に有利な効果が得られることが分かった。カルシウムイオン源としては、水溶性かつ生体許容性のカルシウム塩であれば特に限定されないが、例えば塩化カルシウムを挙げることができる。
　また、第２培地は、注射用の輸液又は点滴用の輸液を含んでいてもよい。第２培地が注射用の輸液又は点滴用の輸液を含む場合、注射用の輸液又は点滴用の輸液として製造販売されているものを適宜用いることができる。注射用の輸液の例は、糖液剤、細胞外液補充液（生理食塩液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、細胞外液補充液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液）、低張性電解質液、アミノ酸製剤（高濃度アミノ酸液、腎不全用アミノ酸液、肝不全用アミノ酸液、小児用アミノ酸液）、ＰＰＮ（末梢静脈栄養輸液）、ＴＰＮ（高カロリー輸液）、脂肪乳剤及び代用血漿増量剤である。これらの中では、細胞外液補充液（生理食塩液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、細胞外液補充液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液）、及び等張性電解質液が好ましい。具体的な輸液は、パレプラス（登録商標）である。これらの輸液に、上述のカルシウム源、緩衝剤、プロスタグランジン等を添加して用いてもよい。
　第２培地にカルシウムイオンが含まれる場合、カルシウムイオンは、０．０４５ｍＭ以上１．８０２ｍＭ以下が好ましく、０．０７４ｍＭ以上１．５０５ｍＭ以下でもよいし、０．０４５ｍＭ以上２ｍＭ以下でもよいし、０．１８０ｍＭ以上２ｍＭ以下でもよいし、１ｍＭ以上２ｍＭ以下でもよいし、１．３ｍＭ以上１．８ｍＭ以下でもよいし、１．２ｍＭ以上１．６ｍＭ以下でもよいし、１ｍＭ以上１．６ｍＭ以下でもよいし、０．０４５ｍＭ以上１．３５２ｍＭ以下でもよいし、０．１８０ｍＭ以上０．９０１ｍＭ以下でもよいし、２０ｍｇ／ｌ以上１００ｍｇ／ｌ以下でもよい。第２培地に含まれる塩類の例は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びＣａＣｌ２であり、１ｇ／Ｌ以上３０ｇ／Ｌ以下含まれてもよいし、４ｇ／Ｌ以上３０ｇ／Ｌ以下含まれてもよく、６ｇ／Ｌ以上１１ｇ／Ｌ以下含まれてもよい。
　緩衝剤としては、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３等の無機系緩衝剤を挙げることができ、またグッド緩衝剤（Ｇｏｏｄ’ｓ　ｂｕｆｆｅｒｓ）等の有機系緩衝剤を用いることもできる。グッド緩衝剤としては、ＭＥＳ、ビストリスメタン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミン塩酸、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、Ｔｒｉｓ、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、ＣＡＢＳ等を挙げることができ、この中でも特にＨＥＰＥＳ（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸）を用いることが好ましい。これらは、他の塩（例えば炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、ピルビン酸、クエン酸、並びにその塩類など）と併せて用いられてもよい。これらの緩衝剤の含有量は、調節するｐＨの範囲等に応じて調整すればよく、例えば１ｍｇ／ｌ以上５ｇ／ｌ以下であってもよく、２ｍｇ／ｌ以上５００ｍｇ／ｌ以下であってもよく、１０ｍｇ／ｌ以上３００ｍｇ／ｌ以下であってもよい。
　第２培地の酸性度は、例えばｐＨ５．５以上ｐＨ９以下であり、ｐＨ７．２以上ｐＨ７．８以下でもよい。
　第２培地は、糖質が少ないものが好ましく、糖質を実質的に含まないか又は全く含まないことが好ましく、糖質（例えばグルコース）の含有量が、１ｇ／ｌ以下であることが好ましく、０．８ｇ／ｌ以下でもよく、０．５ｇ／ｌ以下でもよいし、０．１ｇ／Ｌ以上１．５ｇ／Ｌでもよく、０．１ｇ／Ｌ以上１．２ｇ／Ｌ以下でもよいし、０．１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下でもよいし、０．５ｇ／Ｌ以上１．２ｇ／Ｌ以下でもよいし、０．８ｇ／Ｌ以上１．１ｇ／Ｌ以下でもよい。
　第２培地は、アミノ酸が少ないか、アミノ酸を実質的に含まないか又は全く含まないことが好ましく、アミノ酸含有量が１ｍｇ／ｍｌ以下が好ましく、０．８ｍｇ／ｌ以下が好ましく、０．５ｍｇ／ｌ以下がさらに好ましい。
　第２培地は、ビタミン類が少ないか、ビタミン類を実質的に含まないか又は全く含まないことが好ましく、ビタミン類の含有量が１ｍｇ／ｍｌ以下が好ましく、０．８ｍｇ／ｌ以下が好ましく、０．５ｍｇ／ｌ以下がさらに好ましい。第２培地は、抗生物質（例えばペニシリン）、成長因子やサイトカインを含まないことが好ましい。
　第２培地は、鉄、銅、鉛といった重金属元素や、微量元素を少ししか含まないか、全く含まないことが好ましい。このような元素が少ないので、金属含有たんぱく質の合成を抑え、増殖因子の合成を促すことができる。第２培地は、ポリアミン（例えば、Ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ　２ＨＣｌ）といった発がん性物質を含まないことが好ましい。第２培地は、プリン塩基を含まないことが好ましい．第２培地がプリン塩基を含まない場合、核酸のサルベージ経路を活性化できる。
　第２培地は、ビタミンやアミノ酸を含まないか、わずかしか含まないため、オートファジーを促進して増殖因子の合成を増やすことができる。第２培地は、一般的な培養環境において、培養中の環境を一定に保つことができる（例えば、酸性度の変動を抑えることができ、培養中、緩衝能を持つので、ＣＯ２培養などを行う必要がなくなる。）。
　第２培地は、通常の培地に比べ水分量が多いことが好ましい。例えば第２培地を１００重量％とした場合、水分量は９５重量％以上９９．９９重量％以下が好ましく、９６重量％以上９９．９重量％以下でもよく、９７重量％以上９９．９重量％以下でもよい。培地の水分量が多いことで浸透圧を下げることができる。すると、例えば、細胞を接着培養した場合、通常トリプシンといった動物由来の消化酵素を用いて培養容器から細胞をはがすものの、第２培地を用いると、消化酵素を用いる必要がなくなる。すると、第２培地を含む剤を患者に投与した際に、動物由来成分による感染等の副作用を軽減することができる。
　第２培地は、糖質（例えば、グルコース）、塩類（カルシウムイオン源を含み、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＣａＣｌ２のみからなるか主な塩類としてこれらを含むもの）、及び緩衝剤（例えばＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、及びグッド緩衝剤（特にＨＥＰＥＳ）のみからなるか主な緩衝剤としてこれらを含むもの）と残部が溶媒（例えば水）のみからなるものであってもよい。このような組成であれば、後述する実施例でその有効性が確認された通り、特定の遺伝子やタンパク質を高発現するとともに、生体親和性に優れた培地かつ輸液として機能する。
　第２培地は、アミノ酸含有量が少ないことで、合成分泌された増殖因子との相互作用を（主に酸化・還元）及び重合反応が回避され、成分の変質を防げるとともに、混入するアミノ酸による吸湿と変質を防げることができる。また、第２培地は、アミノ酸含有量が少ないことで、化粧品原料とした時に細菌の繁殖リスクが軽減されるため、防腐剤・酸化防止剤を添加しなくても、製品の安定性が担保できる。第２培地が、アミノ酸を含まない場合、患部に使うための脱アミノ酸工程が不要となり、患部に常在する細菌などの増殖のための栄養とはならない。このことは、創傷面に利用した際に、悪臭の原因とならないことを意味する。また、製剤化した後に、第２培地を含む剤を注射等によって投与した際の味覚障害、体臭の原因にならないので、医薬として用いる際に利便性が高い。第２培地が、アミノ酸を含まない場合、脱塩が行いやすい。そのため、細胞を大量培養した際に簡便に凍結乾燥化による高濃度増殖因子乾燥物を得ることができる。通常の培地の場合、どのような場合でも４８～７２時間で培地を交換しなければならない。第２培地がアミノ酸含有培地ではない場合、培養細胞の代謝活性を抑えることで、４℃冷所に保管しておけば長期間（例えば７日間程度）生存環境を維持でき、その後に培地に交換することで細胞を再び増殖できる。第２培地は、カルシウムイオン及び緩衝剤を含む培地であることが好ましく、好ましくはシンプルな組成を有するものであるため、汎用性が高く全ての動物細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞・幹細胞含む）及び植物細胞（特に植物のカルス培養や、植物幹細胞の維持）に適用できる。
　第２培地を含む培養上清を得る工程は、第２培養工程の後に行われる。この工程は、さらにトレハロースを添加する工程を含むことが好ましい。培養上清を含む製剤は、第２培養工程後の第２培地を５０重量％以上１００重量％以下含むことが好ましい。培養上清を含む製剤は、第２培養工程後の第２培地（培養上清を含む）を６０重量％以上１００重量％以下含んでもよいし、７０重量％以上９９重量％以下、７０重量％以上９０重量％以下、８０重量％以上９９重量％以下、９０重量％以上１００重量％以下、９０重量％以上９５重量％以下含むことが好ましい。通常、幹細胞などの培養上清は、通常、遠心分離により培養上清を固液分離して得られる上清成分を用いる。この明細書に記載される方法は、第２培地を積極的に製剤に含めることができるので、単に、第２培養工程後の培地をろ過したものを用いてもよい。
　製剤は、上記のようにして得られた培養上清を、凍結乾燥により水分を除去して得られる処理物、エバポレーター等を用いて培養上清を減圧濃縮して得られる処理物、限外ろ過膜等を用いて培養上清を濃縮して得られる処理物、又はフィルターを用いて培養上澄みを固液分離して得られる処理物、もしくは、上述のような処理をする前の培養上清の原液であってもよい。また、例えば、細胞を培養した上澄みを、遠心分離（例えば、１、０００×ｇ、１０分）した後、硫安（例えば、６５％飽和硫安）で分画し、沈殿物を適切な緩衝液で懸濁した後に透析処理を行い、シリンジフィルター（例えば、０．２μｍ）で濾過し、無菌的な培養上清を得てもよい。採取した培養上清を、そのまま用いても、また凍結保存しておき使用時に解凍して用いることもできる。また薬剤学的に許容される担体を加えて、取り扱いやすい液量、例えば０．２ｍｌ又は０．５ｍｌ等となるように滅菌容器に分注してもよい。さらに、感染性病原体リスクの対策として、培養上清をウイルスクリアランスフィルターやγ線照射により処理してもよい。
　上記の通り、第２培養工程及び培養上清を得る工程の後に、回収した培養上清を凍結する凍結工程を含んでもよい。培養上清を凍結するためには、例えば、培養上清を－２００℃以上０℃以下にすればよく、－１００℃以上－５℃以下にしてもよい。なお、培養上清を含む製剤は、第２培養工程後の細胞を破砕し、遠心分離後、フィルターを用いてろ過したものであっても、さらにろ過物を凍結・乾燥したものであってもよい。
　本発明の歯周組織用製剤は、公知の方法を用いて製造することができ、歯周組織への注射、塗布等の公知の投与方法を用いて投与することができる。一例として、歯肉内投与又は歯槽骨内投与があげられ、この場合１か所又は複数個所に投与されうる。本発明の製剤を１投与単位として０．１ｍＬ以上３．０ｍＬ以下で投与することが好ましく、より好ましくは０．２ｍＬ以上２．０ｍＬ以下、０．３ｍＬ以上１．５ｍＬ以下、又は０．５ｍＬ以上１．２ｍＬ以下で投与される。
　特に好ましい培養上清は、国際公開第ＷＯ２０２０／０２７３３６Ａ１号に記載のような培養上清である。
〈ヒアルロン酸〉
　本発明の歯周組織用製剤は、さらにヒアルロン酸を含む歯周組織用製剤と、歯周組織用キットを構成することができる。特に、本発明の歯周組織用製剤が、自己調整血清、培養上清及びヒアルロン酸を含むことが好ましい。本明細書において、ヒアルロン酸とは、種々の鎖長及び荷電状態の、並びに架橋を含む種々の化学的修飾を含む、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はヒアルロナンの全ての改変体、及びそれらの改変体の組み合わせを包含する。
　自己調整血清を含む製剤は、非常に高額であるが、効果が現れるのに時間がかかる場合があるため、効果が現れる前に治療を止めてしまう患者が現れることが想定されるが、本発明の製剤にヒアルロン酸を併用することによって、効果を早期に実感させることができる。効果が早期に実感できるという点は、治療を継続する上で非常に重要であり、本発明の製剤を含むキットは、患者にとって非常に満足度の高い製剤となった。
　理論に拘束されないが、ヒアルロン酸を用いると、ヒアルロン酸注入部分が膨潤することで、歯茎の菲薄化により生じるブラックトライアングルを解消することができる。ヒアルロン酸は、時間をかけて吸収されてしまうが、吸収後に元の位置に戻ってしまうことはない。これは、ヒアルロン酸の投与により、歯肉を膨潤させることで歯肉の細胞に伸展刺激を付与し、線維芽細胞の活性、例えばコラーゲン合成能や増殖能を高めて歯肉の再生を促すことができるからと考えられているが、かかる効果が発揮されるためには継続的な投与を必要とする。一方で、自己調整血清及び随意の培養上清は、即効性はないものの、歯肉および歯槽骨に作用し、歯周組織の再生を促すことができ、ヒアルロン酸によって伸展された組織周辺において、これらの組織再生能力が効果的に発揮され、相乗的な効果が得られると考えられる。
　用語「ヒアルロン酸」は、グルクロン酸とＮ‐アセチルグルコサミンから主に構成されるグリコサミノグリカンの一種である。上述のように、「ヒアルロン酸」は、種々の鎖長及び荷電状態の、並びに架橋を含む種々の化学的修飾を含む、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はヒアルロナンの全ての改変体、及びそれらの改変体の組み合わせを包含する。即ち、この用語はまた、種々の対イオンを有するヒアルロン酸の種々のヒアルロン酸塩、例えば、ヒアルロン酸ナトリウムを包含する。また、ヒアルロン酸の種々の修飾は、酸化（例えば、－ＣＨ２ＯＨの－ＣＨＯ及び／又は－ＣＯＯＨへの酸化）；近接のヒドロキシル基の過ヨウ素酸塩酸化、場合により続く還元（例えば、－ＣＨＯの－ＣＨ２ＯＨへの還元）、又はアミンによってカップリングさせ、イミンを形成し、第２級アミンへの還元；硫酸化；脱アミド酸、場合により続く新しい酸を用いた脱アミノ化又はアミド形成；エステル化；架橋；種々の化合物による置換、例えば架橋剤又はカルボジイミド支援カップリングを用いる；ヒアルロン酸への、タンパク質、ペプチド及び活性薬剤成分などの異なる分子のカップリングを伴うもの等の用語によって包含される。修飾の他の例は、イソウレア、ヒドラジド、ブロモヤン、モノエポキシド及びモノスルホンカップリングである。
　ヒアルロン酸は、動物及び非動物源の種々の供給源から得ることができる。非動物源の供給源は酵母を含み、好ましくは細菌を含む。単一のヒアルロン酸分子の分子量は、典型的には、０．１～１０ＭＤａの範囲であるが、他の分子量も可能である。
　ある種の実施形態において、該ヒアルロン酸の濃度は、１～１００ｍｇ／ｍｌの範囲にある。いくつかの実施形態において、該ヒアルロン酸の濃度は、２～５０ｍｇ／ｍｌの範囲にある。特定の実施形態において、該ヒアルロン酸の濃度は、５～３０ｍｇ／ｍｌの範囲、又は１０～３０ｍｇ／ｍｌの範囲にある。ある種の実施形態において、ヒアルロン酸は架橋される。架橋されたヒアルロン酸は、共有架橋、ヒアルロン酸鎖の物理的巻き込み、及び静電相互作用、水素結合及びファン・デル・ワールス力などの種々の相互作用によって、一緒に保持されるヒアルロン酸分子の連続的なネットワークを作製するヒアルロン酸鎖間の架橋を含む。
　ヒアルロン酸の架橋は、化学的架橋剤を用いた修飾によって達成されてもよい。化学的架橋剤は、例えば、ジビニルスルホン、マルチエポキシド及びジエポキシドからなる群から選択されてもよい。実施形態によれば、化学的架橋剤は、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２－エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）及びジエポキシオクタンからなる群から選択される。好ましい実施形態によれば、化学的架橋剤は１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である。
　架橋されたヒアルロン酸製造物は、好ましくは生体適合性である。これは全くないか、またはごく軽度の免疫応答が処置された個体に生じることを暗に意味する。即ち、全くないか、ごく軽度の望ましくない局所又は全身の効果が処置された個体で発生する。
　本発明に係る架橋されたヒアルロン酸製造物は、ゲル又はヒドロゲルであってもよい。すなわち、それは、水不溶性とみなされ得るが、液体、典型的には水性液体に供された場合、ヒアルロン酸分子の架橋系を実質的に希釈することができる。
　ゲルは、重量でほとんど液体が含まれており、例えば９０～９９．９％の水を含むことができ、液体中の３次元の架橋ヒアルロン酸ネットワークに起因して、固体のように挙動する。その重要な液体含量により、ゲルは、構造的にフレキシブルであり、組織工学における足場として、組織増強のために非常に有用にする自然な組織と類似している。
　前述のように、架橋ヒアルロン酸ゲルを形成するヒアルロン酸の架橋は、化学架橋剤、例えばＢＤＤＥ（１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテルなど）による修飾によって達成することができる。ヒアルロン酸濃度及び架橋の程度は、機械的特性、例えば、ゲルの弾性係数Ｇ’及び安定性に影響を与える。
　架橋ヒアルロン酸ゲルは、しばしば、「修飾度」という点で特徴付けられる。ヒアルロン酸ゲルの修飾度は、一般的に０．１～１５モル％の間の範囲である。ヒアルロン酸ゲルの修飾度は、有利には、より架橋されたヒアルロン酸ゲルと比較して２モル％以下の修飾度、例えば１．５モル％以下、例えば１．２５モル％以下、例えば０．１～２モル％以下の範囲、例えば０．２～１．５モル％の範囲、例えば０．３モル～１．２５モル％の範囲である。修飾度（モル％）は、ＨＡの二糖単位を繰り返す総モル量に対して、ＨＡに結合する架橋剤（単数又は複数）の量、即ち、結合した架橋剤（単数又は複数）のモル量を示す。修飾度は、ＨＡがどの程度、化学架橋剤によって化学的に修飾されたかを反映している。修飾度を決定するための架橋技術及び適切な分析技術に関する反応条件はすべて、これら及び他の関連する因子を容易に調整することができる当業者に周知であり、それにより、適切な条件を与え、０．１～２％の範囲の修飾度を得て、修飾度に関する得られた製造物特徴を変更することができる。ＢＤＤＥ（１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル）架橋されたヒアルロン酸ゲルは、例えば、国際公開ＷＯ９７／０４０１２Ａの実施例１及び２に記載された方法に従って調製されてもよい。
　好ましい実施形態では、ヒアルロン酸は、化学的架橋剤によって架橋された架橋ヒアルロン酸ゲルの形態で存在し、ここで、該ヒアルロン酸の濃度は１０～３０ｍｇ／ｍｌの範囲にあり、該化学的架橋剤による修飾度は０．１～２モル％の範囲にある。
　ヒアルロン酸ゲルはまた、架橋していない、すなわち、三次元の架橋ヒアルロン酸ネットワークに結合していないヒアルロン酸の部分を含むことができる。しかしながら、好ましくは、少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも６０重量％、より好ましくは７０重量％、最も好ましくは少なくとも８０重量％のヒアルロン酸は、架橋されたヒアルロン酸ネットワークの一部を形成する。
　なお、用いるヒアルロン酸の種類は、本発明の製剤を用いる歯周組織の部位によって変えることができるが、例えば、歯肉に注射をする場合には、ヒアルロン酸ゲルの粒子が比較的小さくて柔らかいもの、例えばレスチレン・ヴィタール　スキンブースターズ（登録商標）を用いることが好ましい。
〈その他〉
　製剤を液剤として用いる場合、液剤を製造する方法は、公知の方法で製造することができる。例えば、自己調整血清と、随意の凍結乾燥した培養上清の粉末と、薬学的に許容された溶媒とを混合し、滅菌された液剤用の容器に充填する。そして、その容器にさらに随意のヒアルロン酸を添加することができる。薬学的に許容された溶媒の例は、注射用水、蒸留水、生理食塩水、電解質溶液剤、若しくは培養液に準ずる組成の液剤であり、滅菌された溶媒を用いることが好ましい。滅菌された液剤用の容器の例は、アンプル、バイアル、シリンジ、及びバッグである。これら容器は、ガラス製やプラスチック製など公知の容器を用いることができる。具体的には、プラスチック製容器の例は、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン・酢酸ビニル・コポリマーなどの材質を用いたものである。これら容器や溶剤の滅菌法の例は、加熱法（火炎法、乾燥法、高温蒸気法、流通蒸気法、煮沸法など）、濾過法、照射法（放射線法、紫外線法、高周波法など）、ガス法、及び薬液法である。このような滅菌法は、容器の材質、溶剤の性質に応じて、当業者であれば適宜選択して用いることができる。
　一つの態様において、本発明の製剤及びそれを含むキットが培養上清を含む場合、培養上清は通常は細胞を実質的に含まないが、培養細胞を含んでいてもよい。培養細胞を含む場合、他家ヒト細胞又は自家細胞であることが好ましく、より好ましくは自家細胞である。細胞を液剤として治療に用いる場合、移植法として歯周組織内注射が最も多用され得る。例として、歯周組織内注射の場合においては、１×１０５細胞／ｍＬ以上５×１０7細胞／ｍＬ以下で液剤として調整することが好ましく、１×１０６細胞／ｍＬ以上１×１０7細胞／ｍＬがさらに好適である。また、ヒトにおいて歯周組織内注射１投与単位として調整される間葉系幹細胞剤としては、１×１０５細胞以上１×１０9細胞が好ましく、２×１０７細胞以上２×１０８細胞がさらに好適である。その他の投与ルートについては、組織へ移植可能な液量と、その液量に懸濁可能な最大の細胞数以下の範囲において、用いることができる。
　本発明の製剤及びそれを含むキットを、薬学的に許容される担体又は媒体とともに調製してもよい。薬学的に許容される担体又は媒体は、例えば、安定化剤、溶解補助剤、懸濁化剤、緩衝剤、等張化剤、抗酸化剤、又は保存剤など薬学的に許容される物質があげられる。等張化剤の例は、塩化ナトリウム、及びグルコースである。緩衝剤の例は、クエン酸塩、酢酸塩、ホウ酸、及びリン酸塩である。細胞を懸濁させるための水性媒質としては、例えば、浸透圧やｐＨを血液の値付近に調整し、塩類濃度等を調整した注射用の水溶液等を適宜用いればよく、例えば、酢酸リンゲル液、糖加酢酸リンゲル液等のリンゲル液その他の輸液、生理食塩水、またはブドウ糖液等を用いることができるが、これらに限定されない。例えば輸液用リンゲル液を用いる場合、これに許容量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加してもよい。抗酸化剤の例は、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、及びピロ亜硫酸ナトリウムである。
　本発明の製剤及びそれを含むキットは、２０代～５０代の女性及び男性に対して非常に有効であり、特に２０代～４０代の女性に特に有効であることがわかった。２０代～４０代の女性に対する効果は、自己調整血清及び培養上清を含む製剤及びそれを含むキットである場合に極めて顕著であった。
　なお、本明細書は、上述のような自己調整血清を含む歯周組織用製剤及びそれを含むキットを用いた、対象（ヒト又はヒト以外の哺乳動物）の歯周組織のための治療方法をも開示する。これを用いて治療を行う場合、注射等によって患部に投与することができる。
　本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明をするが、本発明はこれによって限定されるものではない。　　
《自己調整血清の調製》
　本発明の製剤に用いる自己調整血清を製造するために、各患者から１０ｍｌの血液を注射器で採取した。
　採取した血液を注射器からＳａｎａｋｉｎ（商標）チューブに移し、チューブを３～４回転倒混和させた後、３７℃に維持した保管庫に３時間保管した。
　その後、Ｓａｎａｋｉｎ（商標）チューブを遠心分離機に移し、３０００回転（１２００Ｇ）で５分間遠心分離を行い、これによって血清中に浮遊している血小板及び血球成分を沈降させた。
　遠心分離をして分離した上澄み部分の血清を、カテラン針を取り付けたルアーロックシリンジで３～５ｍｌ程度で採取をして、その後、細胞ろ過フィルターで僅かに含まれうる血小板及び血球成分を除去し、自己調整血清を得た。
《培養上清の調製》
　また、本発明の製剤に用いる培養上清を、国際公開第ＷＯ２０２０／０２７３３６Ａ１号に記載の方法と同様にして製造した。すなわち、以下のとおりに製造をした。
〈第１培養工程〉
　正常ヒト脂肪組織を酵素処理して抽出した脂肪組織由来間質細胞を、２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥ培地（ギブコ社製ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース）を用いノンコートの培養フラスコ（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養し、初代培養とした。コンフルエント直前の初代培養細胞を酵素処理により回収後、同培地でノンコート培養用１２ウェルプレート（住友ベークライト社製）に播種し、コンフルエントになるまで培養した。
 コンフルエントになったことを確認した後、培地を除去し、細胞表面をＰＢＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製ダルベッコリン酸緩衝液）で洗浄した。
〈第２培養工程〉
　洗浄後の細胞を、ＨＢＳＳ(シグマアルドリッチ社製ハンクス平衡塩溶液)－ＨＥＰＥＳに置換した。その後１２ウェルを３ウェルずつ４つの群に分け、ＣＯ２を使用せずに培養器内で培養した。
〈培養上清の回収〉
　置換した４８時間後にウェル内の培養上清を回収した。
　ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）は、（１）等張液である炭酸水素ナトリウム溶液、（２）ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＨＰＯ４、グルコース、及びＫＨ２ＰＯ４を含む緩衝液及び（３）ＣａＣｌ２溶液を混合した溶液である。
　ＨＥＰＥＳは、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸であり、緩衝剤又はｐＨ調整剤である。
　ＨＢＳＳ－ＨＥＰＥＳ培地（ｈａｎｋｓ－ＨＥＰＥＳ）に含まれる糖質の量は、１.０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌは、８.０ｇ／Ｌ、ＫＣｌは、０.４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２は、０．１４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏは、０.２ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏは、０．０６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４は、０．０６ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３は、０．３５ｇ／Ｌであり、また２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳｐＨ７．４であり、アミノ酸（Ｌ－グルタミン酸他）の総量は０ｇ／Ｌ、カルシウムイオンは１．５ｍＭであった。
《製剤の調製》
　自己調整血清２ｍｌを実施例１の注射用の製剤とした。また、上記の１ｍｌ分の培養上清から製造した凍結乾燥培養上清を１ｍｌの生理食塩水に溶解し、これに自己調整血清１ｍｌを混合したものを実施例２の注射用の製剤とした。そして、比較例の製剤として、上記の１ｍｌ分の培養上清から製造した凍結乾燥培養上清を、１ｍｌの生理食塩水に溶解しただけの注射用の製剤も製造した。
《歯周組織に対する製剤の薬理効果》
〈被験者１〉（実施例）
　図１ａは、歯周病及びブラキシズムによって歯槽骨欠損がある４７歳の女性の歯槽骨のパノラマＸ線写真である。この女性の上顎前歯部歯槽骨は減少しており、軽度の動揺（Ｍ１）も見られた。図１ａでは、骨が減り黒く写っている部分が多く、歯槽骨頂部が吸収しなくなっていて、黒く写っている。歯槽骨ラインも骨減少のため不明瞭となっている。
　その患者の上顎前歯部の骨に対して、上記の実施例１の製剤２ｍｌを１ヶ月に１回の割合で６回注射して投与した。
　図１ｂは、６回注射後の写真である。施術前と比較して、上顎前歯の歯槽骨が増え、術前にあった軽度動揺（Ｍ１）も改善された。また、骨密度が増し黒く写っていた部分が減り、新しく骨のできた白い部分が増えている。なくなっていた歯槽骨頂部の骨が新しくできて、白く写っていることが分かる。この患者は、歯肉が退縮していたが、６回の注射後には、歯肉退縮が一定程度回復していた。
〈被験者２〉（実施例）
　図２ａは、上顎前歯部を強打し、左右前歯に軽度動揺（ＩＩ度）及び触診痛がある５２歳の女性の歯槽骨のパノラマＸ線写真である。
　その患者の歯槽骨及び歯根膜に対して、上記の実施例１の製剤２ｍｌを１ヶ月に１回の割合で４回注射して投与した。
　図２ｂは、４回注射後の写真である。上顎前歯の骨密度が増え、歯槽骨頂部の位置が高くなっているのが分かる。また、隣接部の骨も白い部分が増え、骨に厚みが出たことが分かる。動揺と打診痛は、２回目の注射で消失した。
〈被験者３〉（実施例）
　図３ａは、喫煙による歯周病悪化により左下大臼歯（左下７番）近心に骨吸収と減少が見られる４７歳の女性の歯槽骨のパノラマＸ線写真である。この写真では、近心骨が減って黒く写っており、歯槽骨ラインも骨減少のため不明瞭である。
　その患者の左下大臼歯部の骨に対して、上記の実施例１の製剤２ｍｌを１ヶ月に１回の割合で６回注射して投与した。
　図３ｂは、４回注射後の写真である。新しい骨が出来始め白い部分が増え、歯槽骨のラインが出来てきている。
　〈被験者４〉（実施例）
　図４ａは、歯周病及びブラキシズムによって歯肉退縮が生じている２６歳の女性の歯周組織の写真である。下顎前歯部及び上顎前歯部に歯肉退縮が見られる。上顎前歯部に、大きな歯間空隙があり、下顎前歯部にも大きなブラックトライアングルが生じている。患者本人も審美的に特に気にしていた。
　その患者の下顎前歯部と上顎前歯部の歯肉に対して、上記の実施例２の製剤２ｍｌを１ヶ月に１回程度の割合で６回注射して投与した。
　図４ｂは、６回注射後の写真である。下顎前歯部では、付着歯肉が増えて乳頭部も厚みが出たことで、歯間空隙が減少しブラックトライアングルが目立たなくなった。また、下顎中央１番間の歯間乳頭部の歯肉が顕著に増えたことがわかる。さらに、上顎前歯部乳頭部の歯肉が増え、厚みが出て歯間空隙が目立たなくなっていることがわかる。患者本人も、効果を自覚しており、非常に満足していた。
　〈被験者５〉（実施例）
　図５ａ、図６ａ及び図７ａは、歯周病及び不正咬合によって歯肉退縮が生じている４７歳の女性の歯周組織を、それぞれ正面、右側及び左側から写した写真である。特に下顎前歯部にも大きなブラックトライアングルが生じており、患者本人も審美的に特に気にしていた。
　その患者の下顎前歯部と上顎前歯部の歯肉に対して、上記の実施例２の製剤２ｍｌを１ヶ月に１回程度の割合で５回注射して投与した。
　図５ｂ、図６ｂ及び図７ｂは、５回注射後の歯周組織を、それぞれ正面、右側及び左側から写した写真である。図中「１」及び「２」の下顎前歯部では、付着歯肉が増えて乳頭部も厚みが出たことで、歯間空隙が減少しブラックトライアングルが目立たなくなった。図中「３」及び「４」の上顎前歯部乳頭部の歯肉が増え、厚みが出てブラックトライアングル消失していることが分かる。患者本人も、効果を自覚しており、非常に満足していた。
〈被験者６〉（参考例）
　歯科矯正後に歯肉退縮した２６歳の女性に対して、３～４週間に１回の割合で３回、ヒアルロン酸（レスチレン・ヴィタール　スキンブースターズ（登録商標））１ｍｌの注入を通常の方法で注射によって行った。処置の際に強い痛みが生じていたものの、歯肉がある程度再生されていた。
〈被験者７〉（参考例）
　図８ａは、歯科矯正後に歯肉退縮した２９歳の女性の歯周組織の写真である。下顎前歯部及び上顎前歯部に歯肉退縮が見られる。上顎前歯部に、歯間空隙があり、ブラックトライアングルが生じている。
　その患者の下顎前歯部及び上顎前歯部の歯肉に対して、上記の培養上清のみを含む製剤１ｍｌを３～４週間に１回の割合で３回注射して投与した。
　図８ｂは、３回注射後の歯周組織の写真である。施術前と比較して、上顎前歯部の歯肉が増えて厚みが出ており、ブラックトライアングルが目立たなくなっていることが明確に分かる。下顎前歯部についても、歯肉が増えて乳頭部も厚みが出ていた。
〈被験者８〉（参考例）
　図９ａは、歯周病及び歯科矯正後に歯肉退縮した２８歳の女性の歯周組織の写真である。下顎前歯部及び上顎前歯部に歯肉退縮及び付着歯肉の減少が見られ、歯肉が薄くなっている。下顎前歯部では歯肉退縮による歯間乳頭部の減少、及びブラックトライアングルが生じている。
　その患者の下顎前歯部及び上顎前歯部の歯肉に対して、上記の培養上清のみを含む製剤１ｍｌを３～４週間に１回の割合で９回注射して投与した。
　図９ｂは、９回注射後の歯周組織の写真である。施術前と比較して、上顎前歯部と下顎前歯部の歯肉が増えて厚みが出ていることがわかる。特に下顎前歯部は、付着歯肉が増えて乳頭部も厚みが出たことによって明らかに歯間空隙が減少し、ブラックトライアングルが目立たなくなっていることが明確に分かる。下顎前歯部についても、歯肉が増えて乳頭部も厚みが出たことで、ブラックトライアングルが小さくなった。
〈被験者９〉（参考例）
　図１０ａは、重度歯周病によって歯槽骨が欠損している３５歳の男性の歯周組織のパノラマＸ線画像である。初診時には、重度の歯周病のため、歯の陥没部の凹凸も著しく見られ、また犬歯の根尖部の骨も薄くなっていた。
　その患者の歯槽骨に対して、上記の培養上清のみを含む製剤１ｍｌを３～４週間に１回の割合で４回注射して投与した。
　図１０ｂは、４回注射後の歯周組織のパノラマＸ線画像である。施術前と比較して、欠損していた陥没部に歯槽骨が増えて骨が再生していることが分かる。また、犬歯の歯の根尖部にも骨が再生されて、白く写った部分の面積が増えていることが分かる。ただし、自己調整血清を含む製剤と比較した場合と比較すると、歯槽骨の再生性能は高いとは言えなかった。
〈被験者１０〉（参考例）
　図１１ａは、重度歯周病によって歯槽骨が欠損している男性の歯周組織の写真である。初診時には、重度の歯周病のため、歯の陥没部の歯肉及び犬歯の後方の歯肉が減少していた。その結果、犬歯を触るとグラグラと動く状態であった。
　その患者の歯槽骨に対して、上記の培養上清のみを含む製剤１ｍｌを３～４週間に１回の割合で３回注射して投与した。
　図１１ｂは、３回注射後の歯周組織の写真である。施術前と比較して、陥没部の歯肉が再生されており、また犬歯後方の歯肉の厚みが増えていた。その結果、犬歯のグラつきはかなりの程度で治まった。ただし、自己調整血清を含む製剤と比較した場合と比較すると、歯槽骨の再生性能は高いとは言えなかった。
〈まとめ〉
　各患者の個人差もあるものの、従来技術のヒアルロン酸製剤、培養上清製剤、及び本発明の製剤を用いた歯周組織の再生の効果及び患者の満足度をまとめると、概ね以下の表１のようにまとめることができる。なお、再生性能の効果については歯科医師が判断を行った。ここで、「０」は効果なし、「１」は効果あり又はやや満足、「２」は効果高い又は満足、「３」は非常に効果が高い又は大満足を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　すなわち、自己調整血清を含む製剤を用いると、従来技術では不可能であった歯槽骨の再生を、非常に高い効果で可能にし、また歯肉の再生についても、高い効果が治療の初期のうちから得られた。特に、自己調整血清と培養上清とを含む製剤については、非常に高い歯周組織再生性能を有することが分かった。
《実施例の製剤とヒアルロン酸製剤とのキットによる薬理効果》
　歯肉退縮及び／又は歯槽骨が欠損している複数の患者に対して、実施例１又は２の製剤を３～４週間に１回の割合で複数回注射して投与した。その後、ヒアルロン酸を含む製剤を、歯槽骨周囲の歯肉に注射をした。
　
　その結果、上記実施例１及び２のような高い歯周組織再生効果を得られるとともに、歯肉のブラックトライアングル及び歯のグラつきがほぼ完全になくなり、患者全員が非常に満足していた。
　ヒアルロンを注射した部位に、追加して実施例１又は２の製剤を複数回注射して投与したところ、さらに高い歯周組織再生効果を得られることが分かった。これは、ヒアルロン酸の投与により、歯肉を膨潤させることで歯肉の細胞に伸展刺激を付与し、線維芽細胞の活性、例えばコラーゲン合成能や増殖能を高めて歯肉の再生を促すことができるからと考えられ、またヒアルロン酸によって伸展された組織周辺において、実施例１又は２の製剤による組織再生能力が効果的に発揮され、相乗的な効果が得られたと考えられる。

Claims (11)

  1. 　自己調整血清を含む、歯周組織用製剤。
  2. 　培養上清をさらに含む、請求項１に記載の歯周組織用製剤。
  3. 　前記培養上清が、
    　　第１培地を用いて細胞を培養する第１培養工程と、
    　　第１培養工程の後に、第１培地と異なる第２培地を培地として、前記細胞を培養する第２培養工程と、
    　　第２培養工程の後に、第２培地を含む培養上清を得る工程と
    を含む方法によって得られる、請求項２に記載の歯周組織用製剤。
  4. 　第２培養工程が、非ＣＯ２雰囲気下で行われる、請求項３に記載の歯周組織用製剤。
  5. 　第２培地が、カルシウムイオン及び緩衝剤を含む、請求項３又は４に記載の歯周組織用製剤。
  6. 　前記緩衝剤が、グッド緩衝剤から選択される、請求項５に記載の歯周組織用製剤。
  7. 　前記グッド緩衝剤が、ＨＥＰＥＳである、請求項６に記載の歯周組織用製剤。
  8. 　請求項２～７のいずれか一項に記載の歯周組織用製剤と、ヒアルロン酸を含む歯周組織用製剤とを含む、歯周組織用キット。
  9. 　前記自己調整血清が、
    　　前記歯周組織用製剤を使用する患者から採血された血液を保温して、血中のサイトカインを富化させる工程と
    　　前記サイトカインが富化した血液から血清を分離する工程と
    を含む方法によって得られる、請求項１～８のいずれか一項に記載の歯周組織用製剤。
  10. 　前記サイトカインを富化する工程が、前記血液とガラスとを接触させて行われる、請求項９に記載の歯周組織用製剤。
  11. 　自己調整血清及び培養上清を含む歯周組織用製剤の製造方法であって、
    　前記培養上清が、
    　　第１培地を用いて細胞を培養する第１培養工程と、
    　　第１培養工程の後に、第１培地と異なる第２培地を培地として、前記細胞を培養する第２培養工程と、
    　　第２培養工程の後に、第２培地を含む培養上清を得る工程と
    を含む方法によって得られており、
    　前記自己調整血清は、
    　　前記歯周組織用製剤を使用する患者から採血された血液を保温して、血中のサイトカインを富化させる工程と
    　　前記サイトカインが富化した血液から血清を分離する工程と
    を含む方法によって得られる、方法。
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