RU2700933C1 - Гидрогель для регенерации пульпы зуба и периодонта - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области медицины, а именно к регенеративной медицине, хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. В состав предлагаемого гидрогеля для регенерации пульпы зуба и периодонта включены альгинат натрия, винилтриэтоксисилан, желатин тип А, культуральная среда DMEM/F-12 без L-глутамина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, хлорида кальция и магния, сульфата магния, фенолового красного и сверхчистая вода, мас.%: альгинат натрия - 2,6; винилтриэтоксисилан - 0,07; желатин тип А - 0,6; сухая культуральная среда DMEM/F-12 без L-глутамина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, хлорида кальция и магния, сульфата магния, фенолового красного - 1,48; сверхчистая вода - 95,25. Использование гидрогеля позволяет повысить эффективность пломбировки корневых каналов и реплантации зубов, а также усовершенствовать технологию девитальной реплантации зубов. 2 пр., 4 ил.

Description

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к регенеративной медицине, хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, и может быть использовано для пломбировки корневых каналов в ходе реплантации зубов.

Хронический периодонтит и его осложнения, а также травмы сопровождающиеся вывихом зуба, являются важнейшими причинами потери зубов (Petersen Р.Е., Bourgeois D., Ogawa H., Estupinan-Day S., Ndiaye C. The global burden of oral diseases and risks to oral health // Bulletin of the World Health Organization. 2005. V. 83. P. 661-669). Потеря зубов является основной причиной развития деформации зубных рядов и прикуса. Зубоальвеолярные деформации вызывают значительные патоморфологические и функциональные нарушения как вблизи дефекта, так и распространяющиеся на весь зубной ряд, а также они оказывают негативное влияние на организм в целом (Craddock H.L. Consequences of tooth loss: 1. The patient perspective - Aesthetic and functional implications // Dental update. 2009. V. 36. №. 10. P. 616-619).

В случае отсутствия эффекта от проведения консервативной терапии, у пациентов с хроническим периодонтитом многокорневых зубов, наличием осложнений возникших во время консервативного лечения хронического периодонтита многокорневых зубов либо при травме сопровождающейся вывихом зуба показано проведение реплантации зубов (Holm-Pedersen Р., Lang N.P.,

F. What are the longevities of teeth and oral implants? // Clinical Oral Implants Research. 2007. V. 18. P. 15-19; Andersson L., Andreasen J.O., Day P. et al. International Association of Dental Traumatology guidelines for the management of traumatic dental injuries: 2. Avulsion of permanent teeth // Dental Traumatology. 2012. V. 28. №. 2. P. 88-96). В связи с наличием воспалительных изменений в области зубной лунки и необходимостью их лечения, а также в случае потери жизнеспособности зубов при их длительном нахождении вне организма у пациентов преимущественно выполняется девитальная реплантация. В ходе данной процедуры с минимальной травмой тканей в области альвеолы удаляют зуб, проводят обработку альвеолы и зуба, выполняют пломбировку корневых каналов и пульпарной камеры коронки, затем зуб снова устанавливают в альвеолу и шинируют. Приживление зуба длится в среднем около 4-х недель. Прогноз жизнеспособности реплантированного зуба зависит от типа его приживления, который в свою очередь определяется сохранностью периодонта и надкостницы. Более благоприятен прогноз при периодонтальном, затем периодонтально-фиброзном, а худший прогноз - при остеоидном типе приживления. Девитальную реплантация относят к органосохраняющим операциям, так функция пересаженного зуба сохраняется от 2 до 10 лет и более (Иващенко A.В., Федяев И.М., Яблоков А.Е., Колганов И.Н., Баландин Е.И., Тлустенко B.П. Множественная реплантация зубов // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2018. №. 3. С. 84-87).

В настоящее время в литературе имеется множество статей о различных методиках девитальной реплантации и применяющихся пломбировочных материалах и герметиках для пломбировки корневых каналов. Однако, несмотря на достигнутый прогресс в данной области, недостатки девитальной реплантации остаются прежними. Вследствие пломбировки зубных каналов традиционными материалами регенерация пульпы зуба становится невозможной, а также из-за повреждения периодонта часто наблюдается остеоидный тип сращения реплантата. В итоге формируются обширные зубо-десневые карманы, корни реплантатов зачастую разрушаются, также разрушается и коронковая часть пересаженного зуба.

Применение витальной реплантации показано преимущественно при травматическом вывихе зубов. При этом проведение данной манипуляции жестко ограничено временем нахождения зуба вне организма, состоянием периодонта и наличием сопутствующих стоматологических заболеваний. Наличие вышеперечисленных особенностей делает витальную реплантацию весьма редко применяемой процедурой, хотя, в сравнении с девитальной реплантацией, прогноз после нее значительно лучше (Andersson L., Andreasen J.O., Day P. et al. International Association of Dental Traumatology guidelines for the management of traumatic dental injuries: 2. Avulsion of permanent teeth // Dental Traumatology. 2012. V. 28. №. 2. P. 88-96).

Консолидировать преимущества девитальной и витальной реплантации и обойти указанные недостатки обоих методов можно с использованием подходов тканевой инженерии. Для разрешения указанных проблем и ограничений реплантации, необходимо внедрение новых материалов для пломбировки зубных каналов способных улучшить приживление зуба и восстановление периодонта. Совершенствование технологий реплантации за счет внедрения новых биодеградируемых материалов природного происхождения, способных выполнять роль скаффолда для регенерации пульпы и периодонта, дает возможность на качественно более высоком научно-практическом уровне решать многие задачи восстановления зубных рядов и улучшить качество жизни пациентов.

В настоящее время известны разработки скаффолдов для регенерации пульпы зуба и периодонта на основе следующих биодеградируемых материалов и их комбинаций: коллаген, фибрин, желатин, гиалуроновая кислота, альгинат натрия, хитозан, фиброин шелка, полигидроксиалканоаты, биокерамика (Sharma S., Srivastava D., Grover S., Sharma V. Biomaterials in tooth tissue engineering: a review // Journal of clinical and diagnostic research: JCDR. 2014. V. 8. №. 1. P. 309-315).

За ближайший аналог принят скаффолд для регенерации пульпы зуба, приготовленный на основе альгината натрия и коллагена, геометрически соответствующий по форме корневому каналу зуба, засеянный стволовыми клетками из апикального сосочка (Devillard R.,

М., Kalisky J., Bourget J.M.,

О., Siadous R., Bareille R., Amedee-Vilamitjana J., Chassande O., Fricain J.C. In vitro assessment of a collagen/alginate composite scaffold for regenerative endodontics // International endodontic journal. 2017. V. 50. №. 1. P. 48-57). Несмотря на такие преимущества аналога, как биосовместимость, биодеградируемость, относительную простоту получения, способность поддерживать регенерацию пульпы зуба, дифференцировку засеянных клеток до одонтобластов и дентиногенез, данный скаффолд обладает рядом недостатков, которые сводят возможность его реального клинического применения практически к нолю. В частности, коллаген, используемый при получении скаффолда, имеет аллогенное происхождение, что значительно удорожает стоимость продукта, усложняет технологию его получения и повышает риск биоконтаминации. При использовании скаффолда возникают технические сложности при его имплантации в корневой канал зуба, а также он практически непригоден для многокорневых зубов. Существующие в РФ законодательные ограничения на использование стволовых клеток в клинической практике (Федеральный закон от 23 июня 2016 г. №180-ФЗ «О биомедицинских клеточных продуктах») практически не допускают возможность серийного производства продукта, ввиду наличия в нем культивированных стволовых клеток.

Задачи:

1) Получить биодеградируемый гидрогель для регенерации пульпы зуба и периодонта пригодный для использования при пломбировке корневых каналов при реплантации зубов.

2) Повысить эффективность пломбировки корневых каналов и реплантации зубов с использованием биодеградируемого гидрогеля для регенерации пульпы зуба и периодонта.

3) Усовершенствовать технологию девитальной реплантации зубов и пломбировки корневых каналов с использованием биодеградируемого гидрогеля для регенерации пульпы зуба и периодонта.

Сущностью предлагаемого изобретения является гидрогель для регенерации пульпы зуба и периодонта, содержащий альгинат натрия, отличающийся тем, что в его состав включены винилтриэтоксисилан, желатин тип А, культуральная среда DMEM/F-12 (без L-глутамина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, хлорида кальция и магния, сульфата магния, фенолового красного) и сверхчистая вода, гидрогель имеет, масс, %:

Альгинат натрия - 2,6

Винилтриэтоксисилан - 0,07

Желатин тип А - 0,6

Сухая культуральная среда DMEM/F-12 (без L-глутамина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, хлорида кальция и магния, сульфата магния, фенолового красного) - 1,48

Сверхчистая вода - 95,25

Комбинация перечисленных ингредиентов позволяет расширить объем решаемых задач. Преимуществом изобретения являются: простота приготовления; дешевизна компонентов; легкость в применении - ввиду жидкой структуры состав легко заполняет пульпарную камеру и корневые каналы, с последующей полимеризацией гидрогеля «in situ» - в месте введения; мелкоячеистая структура гидрогеля, способствует заселению и размножению клеток, а также развитию ангиогенеза. Таким образом, использование гидрогеля для регенерации пульпы зуба и периодонта при пломбировании корневых каналов реплантированных зубов и обработке зубоальвеолярной лунки перспективно для разработки новых способов органосохраняющих операций по сохранению целостности зубного ряда.

Основными компонентами гидрогеля для регенерации пульпы зуба и периодонта являются альгинат натрия, желатин тип А, винилтриэтоксисилан, культуральная среда DMEM/F-12 (без L-глутамина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, хлорида кальция и магния, сульфата магния, фенолового красного), сверхчистая вода.

Альгинат натрия - химическая формула: (C6H7O6Na)n. Представляет собой соль альгиновой кислоты, натуральный полисахарид, добываемый из красных и бурых морских водорослей. В готовом виде он выглядит как светлый с кремовым оттенком порошок, хорошо растворимый в воде. Высокая гигроскопичность альгината натрия позволяет эффективно использовать его в качестве удерживающего влагу агента, а также гелеобразователя, стабилизатора и вещества для капсулирования лекарств. Антимикробные и гемостатические свойства альгината натрия являются важными преимуществами при его использовании в стоматологии. Альгинат натрия является биосовместимым, неиммунногенным, биодеградируемым биополимером (

G., Pfeffermann A., Ryser С.,

P., Kuttler В., Hahn H.J., Zimmermann U. Biocompatibility of mannuronic acid-rich alginates // Biomaterials. 1997. V. 18. №. 10. P. 707-713). Альгинат натрия может быть охарактеризован как анионный сополимер, состоящий из остатков маннуроновой (М-блок) и гулуроновой (G-блок) кислот, которые связаны в виде нерегулярных последовательностей (Matsumoto Т., Kawai М., Masuda Т. Influence of concentration and mannuronate/gluronate ratio on steady flow properties of alginate aqueous systems // Biorheology. 1992. V. 29. №. 4. P. 411-417). Микроструктурные свойства альгинатных гидрогелей и его высокая биосовместимость служат причиной, по которой альгинат натрия широко применяется для иммобилизации клеток в тканевой инженерии (Orive G., Ponce S., Hernandez R.M., Gascon A.R., Igartua M., Pedraz J.L. Biocompatibility of microcapsules for cell immobilization elaborated with different type of alginates // Biomaterials. 2002. V. 23. №. 18. P. 3825-3831; Drury J.L., Mooney D.J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications // Biomaterials. 2003. V. 24. №. 24. P. 4337-4351). Хорошо известно свойство альгината натрия формировать ионотропный гидрогель в присутствии двухвалентных катионов, таких как кальций, за счет которых образуются связи между цепями альгината (Bu Н.,

A.L., Knudsen K.D.,

В. Rheological and structural properties of aqueous alginate during gelation via the Ugi multicomponent condensation reaction // Biomacromolecules. 2004. V. 5. №. 4. P. 1470-1479). Альгинатный гидрогель способен оказывать положительное воздействие на дифференцировку одонтобластоподобных клеток и дентиногенез, что позволяет повысить регенеративный потенциал дентальной пульпы человека (Dobie K., Smith G., Sloan A.J., Smith A.J. Effects of alginate hydrogels and TGF-β1 on human dental pulp repair in vitro // Connective tissue research. 2002. V. 43. №. 2-3. P. 387-390). Молекула альгината имеет множество свободных гидроксильных и карбоксильных групп, что делает ее превосходной мишенью для химической функционализации, в частности, реакции силилирования винилтриэтоксисиланом для получения предлагаемого изобретения. В связи с перечисленными особенностями, альгинатный гидрогель является подходящей основой для разработки скаффолдов и гидрогелей предназначенных для дентальной регенерации.

Винилтриэтоксисилан - H₂C=CHSi(OC₂H₅)₃ - данный реагент широко используется для свободно-радикальной сшивки полиэфиров, каучуков, полиолефинов, стиролов, акрилов и других полимеров. Ключевой ролью винилтриэтоксисилана является силилирование альгината натрия и желатина типа А, что вызывает образование перекрестных сшивок между цепями данных биомолекул, при этом достигается значительное повышение прочности и времени биодеградации конечного продукта.

Желатин тип А - бесцветный или имеющий желтоватый оттенок частично гидролизованный коллаген, прозрачная вязкая масса, продукт переработки (денатурации) соединительной ткани животных. Желатин используется как компонент плазмозамещающих средств, а также как материал для изготовления лекарственных капсул, компонент питательных смесей и сред. Особенностью желатина типа А является технология его получения - производится за счет уксусно-кислого гидролиза коллагенсодержащих тканей. Желатин типа А превосходно желируется, а также имеет в составе полипептидной цепи большое количество RGD-последовательностей, что значительно повышает культуральные свойства конечного продукта.

Сухая культуральная среда DMEM/F-12 (без L-глутамина, L-лейцина, L-лизина,, L-метионина, хлорида кальция и магния, сульфата магния, фенолового красного) - среда DMEM с добавлением среды F12 в соотношении 1:1 применяется для выращивания широкого спектра клеточных культур, используется путем растворения порошка среды из расчета 14,8 г на 1 литр сверхчистой воды. Изначально среда F12 была разработана для бессывороточного культивирования СНО клеток, клеток легких и мышиных L-клеток. В связи с большим содержанием питательных веществ среда DMEM/F12 может быть использована для культивирования широкого спектра клеток с добавлением относительно небольшого количества эмбриональной бычьей сыворотки, либо вообще без нее. Общая характеристика среды: рН - 6,5-7,1; осмоляльность - 276-305 мосмоль/кг; эндотоксины - не более 1 EU/мл; D-глюкоза - 3,15 г/л; феноловый красный х Na - нет; пируват натрия - 0,055 г/л; ХЕПЕС - 3,5745 г/л; гипоксантин - 0,0021 г/л; линолиевая кислота - 0,000042 г/л; путресцин х 2 HCl - 0,000081 г/л; DL-тиоктовая кислота - 0,000105 г/л; тимидин - 0,000365 г/л. Неорганические соли: Молибдат аммония - нет; Перборат аммония - нет; Хлорид кальция - нет; Хлорида кальция 2-водный - нет; Медный купорос - 0,0000013 г/л; Нонагидрат железа - 0,0005 г/л; Железный купорос - 0,000417 г/л; Хлорид магния 6-водный - нет; Сульфат магния - нет; Сульфат марганца - нет; Хлорид никеля - нет; Хлорид калия - 0,3118 г/л; Гидрокарбонат натрия - нет; Хлорид натрия - 6,996 г/л; Натрий кремнекислый 9-водный - нет; Селенит натрия - нет; Гидрофосфат натрия - 0,07102 г/л; Дигидрофосфат натрия - 0,0543 г/л; Хлорид олова 7-водный - нет; Сульфат цинка 7-водный - 0,000432 г/л. Аминокислоты: L-Аланин - 0,00445 г/л; L-Аланин-L-глутамин - нет; L-Аргинин х HCl - 0,1475 г/л; L-Аспарагин х H2O - 0,0075 г/л; L-Аспарагиновая кислота - 0,00665 г/л; L-Цистин х 2 HCl - 0,01756 г/л; L-Цистеин х HCl х H2O - 0,03129 г/л; L-Глутаминовая кислота - 0,00735 г/л; L-Глутамин - нет; Глицин - 0,01875 г/л; L-Гистидин х HCl х H2O - 0,03148 г/л; L-Изолейцин - 0,05447 г/л; L-Лейцин - нет; L-Лизин х HCl - нет; L-Метионин - нет; L-Фенилаланин - 0,03548 г/л; L-Пролин - 0,01725 г/л; L-Серин - 0,02625 г/л; L-Треонин - 0,05345 г/л; L-Триптофан - 0,00902 г/л; L-Тирозин х 2 Na х 2 H2O - 0,05579 г/л; L-Валин - 0,05285 г/л. Витамины: D-Биотин - 0,0000035 г/л; Холина Хлорид - 0,00898 г/л; Фолиевая кислота - 0,00265 г/л; Мио-инозитол - 0,0126 г/л; Ниацинамид - 0,00202 г/л; D-пантотеновая кислота х

Са - 0,00224 г/л; Пиридоксаль х HCl - 0,002 г/л; Пиридоксин х HCl - 0,002031 г/л; Рибофлавин - 0,000219 г/л; Тиамин х HCl - 0,00217 г/л; Витамин В12 - 0,00068 г/л.

Сверхчистая вода - вода реагентного качества, имеет удельное сопротивление 18,2 МОм × см при 25°С и содержит на следовом уровне ионы, механические примеси, микроорганизмы и органические вещества. Качество воды соответствует стандартам ASTM D1193 (Туре 1), ISO 3696 (Grade 1) и ГОСТ Р 52501-2005 «Вода для лабораторного анализа тип 1». Сверхчистая вода применяется для приготовления растворов предназначенных для культивирования клеток и тканевой инженерии. Сверхчистая вода играет роль растворителя для гелеобразователей и прочих компонентов гидрогеля для регенерации пульпы зуба и периодонта.

Для получения гидрогеля для регенерации пульпы зуба и периодонта, в асептических условиях ламинарного шкафа, последовательно растворяют при постоянном перемешивании на верхнеприводной мешалке с подогревом до 40°С в предлагаемом соотношении компонентов порошок культуральной среды DMEM/F-12 (без L-глутамина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, хлорида кальция и магния, сульфата магния, фенолового красного) в сверхчистой воде. Затем полученную жидкость подвергают фильтрованию через стерильный фильтр с размером пор 0,22 мкм. К полученному раствору при непрерывном перемешивании на верхнеприводной мешалке с подогревом до 40°С добавляют альгинат натрия, до получения густой, вязкой мутной с желтоватым оттенком массы с большим количеством мелких пузырьков воздуха. Затем добавляют желатин тип А и снова перемешивают на верхнеприводной мешалке с подогревом до 40°С вплоть до получения однородной густой, вязкой, мутной массы имеющей желтоватый оттенок. В полученную смесь добавляют винилтриэтоксисилан, затем ее снова перемешивают на верхнеприводной мешалке с подогревом до 40°С вплоть до получения однородной густой, прозрачной с желтоватым оттенком массы. Доводят смесь до 100 масс, % добавляя сверхчистую воду, затем снова перемешивают на верхнеприводной мешалке с подогревом до 40°С вплоть до получения густой, однородной, прозрачной, опалесцирующей массы имеющей легкий желтоватый оттенок. Полученную смесь в асептических условиях укупоривают в стерильную емкость и хранят при -80°С вплоть до использования.

Препарат апробирован на 20 белых нелинейных самцах крыс средней массой 281±23 гр., в ходе экспериментальной реплантации нативного зуба. Все оперативные вмешательства выполнены под комбинированным инъекционным наркозом: золетил (тилетамина гидрохлорид и золазепама гидрохлорид) 20 мг/кг в/м («Virbac», Франция) и ксиланит (ксилазина гидрохлорид) 6 мг/кг в/м (ЗАО «НИТА-ФАРМ, Россия, г. Саратов) Проводили интраоперационную антибиотикотерапию путем введения «Бициллин-5» в дозировке 300 тыс. Ед/кг.

Описание операции: у наркотизированных животных проводили отслойку десны, надсечение межзубного сосочка, сепарацию резцов, далее люксирующими и ротационными движениями производили вывихивание зуба, а затем выполняли экстракцию зуба. После экстракции зуба проводили расширение корневого канала со стороны апикального отверстия с помощью Hedstroem file 15 размера по ISO. Затем проводили экстирпацию корневой пульпы пульпоэкстрактором №1 (АО Казанский медико-инструментальный завод, Россия). Далее выполняли препарирование корневого канала ручным методом по технологии step-back с использованием К-file и H-file с размерами 15-40 по ISO. По завершении манипуляций, с помощью шприца заполняли пульпарную камеру и корневой канал зуба гидрогелем для регенерации пульпы зуба и периодонта. Также наносили гидрогель на поверхность зубоальвеолярной лунки задействованного зуба. Устанавливали обработанный зуб в зубоальвеолярную лунку и проводили его фиксацию к соседнему зубу цианоакрилатным клеем, что позволило воспроизвести шинирующий эффект. Также, для лучшего приживления зуба проводили заполнение поддесневого пространства гидрогелем.

В послеоперационном периоде первые 3 дня кормление крыс проводили согласно щадящему протоколу. Также проводили ежедневный осмотр полости рта для наблюдения за динамикой морфофункционального состояния реплантируемых зубов и окружающих структур. На 60 сутки от начала эксперимента произвели эвтаназию животных. Для исследования осуществляли забор нижней челюсти с задействованным зубом, которую затем поместили в 10% нейтральный забуференный фосфатами раствор параформальдегида. Декальцинацию проводили в течение 5 суток с использованием смеси цитрата натрия и муравьиной кислоты по Evans&Krajian. По завершении декальцинации проводили вырезку образцов, проводку через изопропанол с последующей заливкой в парафин. Парафиновые блоки нарезали на срезы толщиной 10 мкм на микротоме МПС-2 (СССР). Окрашивание полученных микропрепаратов проводили гематоксилин-эозином и по Маллори в модификации Слинченко.

При микроскопическом исследовании микропрепаратов реплантированного зуба и прилегающей челюсти, окрашенных гематоксилин-эозином выявлены признаки периодонтального типа сращения зуба. В области корневого канала зуба выявлена обильно васкуляризированная рыхлая соединительная ткань морфологически сходная с пульпой зуба.

Пример 1. Белый нелинейный самец крысы, массой - 296 гр. Под комбинированным инъекционным наркозом: золетил (тилетамина гидрохлорид и золазепама гидрохлорид) 20 мг/кг в/м («Virbac», Франция) и ксиланит (ксилазина гидрохлорид) 6 мг/кг в/м (ЗАО «НИТА-ФАРМ, Россия, г. Саратов) выполнена экспериментальная девитальная реплантация нативного зуба. Наркоз верифицировали по угнетению роговичного рефлекса и исчезновению реакции на болевые раздражители (укол лапы). После наступления наркоза крысу фиксировали на операционном столе для мелких лабораторных животных в положении на спине, затем устанавливали роторасширитель. Операцию проводили в асептических условиях. Проводили интраоперационную антибиотикотерапию путем введения «Бициллин-5» в дозировке 300 тыс. Ед/кг.

Описание операции: у наркотизированной крысы проводили отслойку десны, надсечение межзубного сосочка, сепарацию резцов, далее люксирующими и ротационными движениями проводили вывихивание, а затем - экстракцию зуба. После экстракции зуба проводили расширение корневого канала со стороны апикального отверстия с помощью Hedstroem file 15 размера по ISO. Затем проводили экстирпацию корневой пульпы пульпоэкстрактором №1 (АО Казанский медико-инструментальный завод, Россия). Далее выполняли препарирование корневого канала ручным методом по технологии step-back с использованием K-file и H-file с размерами 15-40 по ISO. По завершении манипуляций, с помощью шприца заполняли пульпарную камеру и корневой канал зуба гидрогелем для регенерации пульпы зуба и периодонта. Также наносили гидрогель на поверхность зубоальвеолярной лунки задействованного зуба. Устанавливали обработанный зуб в зубоальвеолярную лунку и проводили его фиксацию к соседнему зубу цианоакрилатным клеем, что позволило воспроизвести шинирующий эффект. Для лучшего приживления зуба также проводили заполнение поддесневого пространства гидрогелем.

В послеоперационном периоде первые 3 дня кормление крысы проводилось согласно щадящему протоколу. Также проводился ежедневный осмотр полости рта для наблюдения за динамикой состояния реплантируемых зубов и окружающих структур. На 60 сутки от начала эксперимента произвели эвтаназию животного. Для исследования осуществили забор нижней челюсти с задействованным зубом, которую затем поместили в 10% нейтральный забуференный фосфатами раствор параформальдегида. Декальцинация проведена в течение 5 суток с использованием смеси цитрата натрия и муравьиной кислоты по Evans&Krajian. По завершении декальцинации провели вырезку образцов, проводку через изопропанол с последующей заливкой в парафин. Парафиновые блоки нарезали на срезы толщиной 10 мкм на микротоме МПС-2 (СССР). Окрашивание полученных микропрепаратов проводили гематоксилин-эозином и по Маллори в модификации Слинченко.

При микроскопическом исследовании микропрепаратов реплантированного зуба и прилегающей челюсти выявлены признаки периодонтального типа сращения зуба (Фиг. 1 - окраска гематоксилин-эозин, ув. об. Х4; Фиг. 2 - окраска по Маллори в модификации Слинченко, ув. об. Х10). В области корневого канала зуба выявлена обильно васкуляризированная рыхлая соединительная ткань морфологически сходная с пульпой зуба (Фиг. 3 - окраска гематоксилин-эозин, ув. об. Х10; Фиг. 4 - окраска по Маллори в модификации Слинченко, ув. об. Х10).

Пример 2. Для получения гидрогеля для регенерации пульпы зуба и периодонта, в асептических условиях ламинарного шкафа, последовательно растворяли при постоянном перемешивании на верхнеприводной мешалке с подогревом до 40°С в предлагаемом соотношении компонентов 1,48 г. порошка культуральной среды DMEM/F-12 (без L-глутамина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, хлорида кальция и магния, сульфата магния, фенолового красного) в 90 г. сверхчистой воды. Затем полученную жидкость подвергали фильтрованию через стерильный фильтр с размером пор 0,22 мкм. К полученному раствору при непрерывном перемешивании на верхнеприводной мешалке с подогревом до 40°С добавляли 2,6 г. альгината натрия, до получения густой, вязкой мутной с желтоватым оттенком массы с большим количеством мелких пузырьков воздуха. Затем добавляли 0,6 г. желатина тип А и снова перемешивали на верхнеприводной мешалке с подогревом до 40°С вплоть до получения однородной густой, вязкой, мутной массы имеющей желтоватый оттенок. В полученную смесь добавляли 0,07 г. винилтриэтоксисилана, затем ее снова перемешивали на верхнеприводной мешалке с подогревом до 40°С вплоть до получения однородной, густой, прозрачной с желтоватым оттенком массы. Доводили смесь до 100 масс, % добавляя сверхчистую воду, затем снова перемешивали на верхнеприводной мешалке с подогревом до 40°С вплоть до получения густой, однородной, прозрачной, опалесцирующей массы имеющей легкий желтоватый оттенок. Полученную смесь в асептических условиях укупоривали в стерильную емкость и хранили при -80°С вплоть до использования.

Claims (6)

1. Гидрогель для регенерации пульпы зуба и периодонта, содержащий альгинат натрия, отличающийся тем, что в его состав включены винилтриэтоксисилан, желатин тип А, культуральная среда DMEM/F-12 без L-глутамина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, хлорида кальция и магния, сульфата магния, фенолового красного и сверхчистая вода, гидрогель имеет, мас.%:
2. - Альгинат натрия - 2,6
3. - Винилтриэтоксисилан - 0,07
4. - Желатин тип А - 0,6
5. - Сухая культуральная среда DMEM/F-12 без L-глутамина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, хлорида кальция и магния, сульфата магния, фенолового красного - 1,48
6. - Сверхчистая вода - 95,25

Images