KR102360742B1 - Egfr 및 her2 를 표적하는 이특이적 항체 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 EGFR 및 HER2 를 표적으로 삼는 이중특이적 항체, 및 이들 항체의 생성 방법에 관한 것이다. 이중특이적 항체는 2 개의 VH-VL 사슬이 항체의 VH 사슬 양자 모두의 각 N-말단 영역에 링커를 통해 부착된 하나의 완전한 항체로 이루어진다. 구축된 이중특이적 항체는 EGFR 및 HER2 를 표적으로 하는 두 모노클로날 항체, 즉 각각 세툭시마브 및 트라스투주마브의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 가변 영역의 아미노산 서열을 이용한다.
Description
본 발명은 EGFR 및 HER2 를 표적화하는 이중특이적 항체, 이 항체의 생성 방법, 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
4 개의 티로신 키나아제 수용체 (EGFR/HER1, HER2, HER3 및 HER4) 를 포함하는 HER 패밀리는, 예를 들어 MAPK 및 PI3K/AKT 경로와 같이 세포 증식에 관여하는 다수의, 부분적으로 중복되는 상호연결된 다운스트림 시그널링 연쇄반응 (downstream signaling cascade) 을 활성화한다. HER 비정상 시그널링은 많은 수의 고형 종양 (폐, 결장직장, 췌장, 등) 에서 관찰된 바 있다. EGFR 및 HER2 는 HER 패밀리 수용체와의 호모이량체화 (homodimerization) 및 헤테로이량체화 (heterodimerization) 를 통해 성장 시그널을 전달하는 세포 표면 수용체 티로신 키나아제 (TK) 이다. EGFR 의 HER2 와의 헤테로이량체는 EGFR 또는 HER2 호모이량체화보다 TK 시그널링의 보다 강력한 활성화를 유도한다. 종양 세포가 EGFR 과 HER2 양자 모두를 과발현할 때, 이들은 EGFR/HER2 헤테로이량체화 및 시그널링의 증대된 잠재력으로 인해 공격적인 종양 세포 성장을 나타낸다.
췌장암은 예후가 매우 나쁜 EGFR 및 HER2 수용체를 발현하는 고형 종양의 예이다. 췌장 종양에서, EGFR 은 췌장암의 45-95% 에서 발현되며, 발현은 일반적으로 절제된 췌장암에서 더 나쁜 결과와 상관 관계가 있다. HER2 의 과발현은 또한 췌장암의 7-58% 에서 형성되어 있으며, HER2-증폭된 췌장암은 비정형 전이성 패턴을 보이는데, 이는 HER2 이 또한 췌장암에서 종양형성의 중요한 동인이 될 가능성이 있음을 시사한다. 나아가, EGFR+ 인 췌장 암종의 약 4 분의 1 이 또한 부가적으로 HER2+ 이어서 (Dancer et al (2007) Oncology Reports 18, p.151) 이들이 이중 양성 EGFR+/HER2 표현형을 나타내는 것으로 보고되어 있다.
췌장암은 유럽에서 네 번째로 흔한 암 사망의 원인으로, 매년 그 사례 수가 증가하고 있다 (남성에서는 + 2%, 여성에서는 + 10%). 이는 조기에 진단받았을 경우에도, 예후가 매우 나쁘다. 이는 과거 40 년 동안 생존률이 거의 개선되지 않은 유일한 암 중 하나이다: 생존은 1 년 및 5 년 후에 각각 20% 및 5% 보다 떨어진다. 췌장암이 2012 년 세계적으로 230,000 명을 초과하는 사망의 원인이었음에도 불구하고, 유효한 치료법의 부족으로 인해, 새로 진단받은 환자들만큼 많은 사망자가 발생하는 희귀병으로 남아있다. 현재, 췌장 선암종 (췌장암의 90%) 은 외과적으로, 화학요법으로써, 또는 방사선요법과 화학요법의 병용으로 치료되나, 제한된 결과를 얻는다. 1996 년 1차 치료제로서 겜시타빈 (gemcitabine) 의 출시로 중간 생존을 재발 없이 1.3 개월 개선했고, 1 년에서의 전체 생존 (overall survival; OS) 을 2% 에서 18% 로 개선하였다. 2005 년 이래로, Tarceva® (에를로티니브 (erlotinib)) 및 Abraxane® (납-팍리탁셀 (nab-paclitaxel)) 의 두 가지 약물만이, 혁신은 거의 없으나 주로 병용을 포함하는 각종 임상 시도에도 불구하고, 췌장암에 대해 승인을 받았다. 최초의 표적 치료제였던 에를로티니브는 겜시타빈과 연계했을 때 재발 없이 중간 생존을 단지 1 개월 개선했다.
HER 수용체를 직접적으로 또는 다운스트림 키나아제를 표적화하는 치료제에 의한 치료는 종종 획득된 저항에 직면하거나 또는 시그널 전달 네트워크의 고유한 견고성에 의해 제한된다.
이러한 경우, 병용 치료요법이 자연스러운 대책으로서 등장하였으나, 그의 최적의 설계는 간단하지 않고 종양 또는 그의 아형에 따라 좌우될 수 있으므로, 그로 인해 이전의 환자 계층화가 요구되었다 (Fitzgerald JB, Schoeberl B, Nielsen UB, Sorger PK. Systems biology and combination therapy in the quest for clinical efficacy. Nat Chem Biol. 2006; 2:458-66.). HER 시그널링을 저해하는데 이용가능한 현재의 병기에는 소분자 티로신 키나아제 저해제 (TKI), 예를 들어 라파티니브 (lapatinib) 또는 에를로티니브, 및 치료 항체, 예를 들어 세툭시마브 (cetuximab) 또는 트라스투주마브 (trastuzumab) 가 포함된다. 항체는 실제로 시그널링 조절에만 국한된 TKI 와는 대조적으로 종양을 제거하는 것을 돕기 위해 시그널링 감소 외에 면역학적 효과를 유도하는 강력한 접근법을 제시한다.
조합된 항체를 기반으로 하는 치료법은 수많은 저자들에 의해 제안되어 왔다. HER 이량체, 특히 EGFR/HER2 헤테로이량체를 mAb 조합에 의해 표적화하는 것은 췌장 종양 성장의 저해에 유리한 것으로 입증되었다.
2 개의 mAb 의 표적을 조합하는 이중특이적 항체 (BsAb) 가 추가로 설계된 바 있다. 몇몇의 이중특이적 항-EGFR/항-HER2 항체가 보다 구체적으로 기재되어 있다. 그러나, 이들은 통상 열악한 제조가능성 및 안정성을 초래하는 복잡한 설계로 고생하고 있으며, 생체 내 췌장암 모델에서 종양은 이중특이적 항체로 치료를 받는 동안 조차도 계속해서 자라고 있기 때문에 이들 항체의 효능은 여전히 개선될 수 있다.
예를 들어, Liu 및 동료들 (Liu et al. A Novel Antibody Engineering Strategy for Making Monovalent Bispecific Heterodimeric IgG Antibodies by Electrostatic Steering Mechanism. J Biol. Chem. 2015; 290(12):7535-62) 은 파니투무마브 (panitumumab) 및 트라스투주마브 서열 각각이 이용된 이중특이적 항-EGFR 및 항-HER2 항체의 구축 및 특성규명을 기재한 바 있다. 상기 항체는 시험관 내 및 생체 내에서 EGFR+/HER2+ 세포주에 대해 개선된 활성을 입증했지만, 이 항체의 활성은 여전히 개선될 필요가 있다. Lewis 및 동료들 (Lewis et al. Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nature Biotechnology. 2014; 32; 191-198) 도 또한 이중특이적 항-EGFR 및 항-HER2 항체를 기재한 바 있으나, 이 경우에서는 상이한 항체 서열인 마투주마브 (matuzumab) 및 퍼투주마브 (pertuzumab) 서열 각각 및 상이한 조작 설계를 이용했다.
국제 특허 출원 WO2014/001324 에는, 소르타아제 (Sortase) A 와 같은 트랜스펩티다아제를 이용함으로써 다중특이적 개체를 선택 및 생성하는 방법과 신규 맞춤 제작된 다중특이적 항체의 제조를 위한 상기 방법의 용도가 보고되어 있다. 퍼투주마브 및 트라스투주마브를 함유하는 이중특이적 항체가 예시되어 있다. 국제 특허 출원 WO2014/124326 에는 예를 들어 트라스투주마브 및 세툭시마브를 함유하는 다중특이적 항체 구축물, 및 다중특이적 항체 약물 컨쥬게이트가 기재되어 있다.
이중특이적 HER2/EGFR 항체가 또한 유럽 특허 출원 EP2727940 (여기서 항체는 헤테로이량체 짝지음 (pairing) 을 달성하기 위해 중쇄에서 6 개의 돌연변이를 갖고 있음) 뿐 아니라, 유럽 특허 출원 EP2035456 에도 기재되어 있다. 그러나, 이들 항체의 구조는 불안정화 및 면역원성을 초래할 수 있다.
Wang S et al. (Cancer Lett 2012 Dec 28; 325(2):214-9) 는 트라스투주마브 및 세툭시마브를 이용하여 항-EGFR/HER2 이중특이적 항체를 조작하였다. 그러나, 두 항원에 대한 결합은 1가이며, 천연 항체에서와 같이 2가가 아니었기 때문에, 그에 따라 EGFR 및 HER2 저해의 완전한 잠재력은 달성되지 않았을 수 있었다.
이러한 견지에서, 종양을 치료하기 위한 개선된 이중특이적 항체 구축물의 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명의 개요
본 발명자들은 이제 다양한 암 치료에 유용한 EGFR 및 HER2 를 표적화하는 신규한 이중특이적 항체를 고안하였다.
본 발명은 보다 구체적으로 2 개의 중쇄 및 4 개의 경쇄를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하였는데,
이때, 각각의 중쇄는
a. 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하고,
b. 상기 Fc 영역은 상기 힌지 도메인에 의해 항체 1 (Ab1) 의 Fab 중쇄 CH1-VH 에 연결되고,
c. 이는 차례로 폴리펩티드 링커 서열에 의해 항체 2 (Ab2) 의 Fab 중쇄 CH1-VH 에 연결되고, 이때 폴리펩티드 링커 서열은 Ab1 의 상기 Fab 중쇄 VH 도메인의 N-말단을 Ab2 의 상기 CH1 도메인의 C-말단과 연결시키고,
4 개의 경쇄는 그들의 동족 (cognate) 중쇄 도메인과 연관된 Ab1 의 Fab 경쇄 및 Ab2 의 Fab 경쇄를 포함하고;
이때, Ab1 및 Ab2 는 상이한 것으로서, 한편으로는 세툭시마브 또는 그의 돌연변이된 유도체, 및 다른 한편으로는 트라스투주마브 또는 그의 돌연변이된 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
제 1 구현예에서, Ab1 은 세툭시마브 또는 그의 돌연변이된 유도체이고, Ab2 는 트라스투주마브, 또는 그의 돌연변이된 유도체이다.
또 다른 구현예에서, Ab1 은 트라스투주마브 또는 그의 돌연변이된 유도체이고, Ab2 는 세툭시마브, 또는 그의 돌연변이된 유도체이다.
Ab1 또는 Ab2 가 세툭시마브 또는 그의 돌연변이된 유도체인, 하기를 포함하는 이중특이적 항체가 보다 특히 기재되어 있다:
o SEQ ID NO:4 로 이루어진 VH 도메인,
o SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22 로 이루어진 군으로부터 선택된 CH1 도메인,
o SEQ ID NO: 13 으로 이루어진 VL 도메인,
o SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25 로 이루어진 군으로부터 선택된 CL 도메인,
이때, CH1 및 CL 도메인은 하기와 같이 연관됨:
- SEQ ID NO: 2 와, SEQ ID NO: 11,
- SEQ ID NO: 5 와, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23,
- SEQ ID NO: 20 과, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23,
- SEQ ID NO: 21 과, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25,
- SEQ ID NO: 22 와, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25.
또 다른 구현예에서, Ab1 또는 Ab2 가 트라스투주마브 또는 그의 돌연변이된 유도체인, 하기를 포함하는 이중특이적 항체가 기재된다:
o 서열 SEQ ID NO:1 로 이루어진 VH 도메인
o SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22 로 이루어진 군으로부터 선택된 CH1 도메인,
o 서열 SEQ ID NO: 10 으로 이루어진 VL 도메인,
o SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25 로 이루어진 군으로부터 선택된 CL 도메인,
이때, CH1 및 CL 도메인은 하기와 같이 연관됨:
- SEQ ID NO: 2 와, SEQ ID NO: 11,
- SEQ ID NO: 5 와, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23,
- SEQ ID NO: 20 과, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23,
- SEQ ID NO: 21 과, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25,
- SEQ ID NO: 22 와, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25.
바람직하게, Ab1 의 CH1 및 CL 도메인은 Ab2 의 CH1 및 CL 도메인과 상이한 서열의 조합을 갖는다.
유리한 구현예에서, 폴리펩티드 링커 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO:34 로 이루어진다.
하기로 이루어진 특정 항체가 제공된다:
a) 2 개의 중쇄로서, 각각은 N 에서 C 말단 순서로 하기를 포함하는 연속적인 서열로 이루어짐:
ㆍ SEQ ID NO: 1 로 이루어진 트라스투주마브 중쇄 VH,
ㆍ SEQ ID NO: 2 로 이루어진 CH1 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:16 또는 SEQ ID NO:34 로 이루어진 폴리펩티드 링커,
ㆍ SEQ ID NO: 4 로 이루어진 세툭시마브 중쇄 VH
ㆍ SEQ ID NO: 5 로 이루어진 CH1 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 6 으로 이루어진 힌지 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 7 로 이루어진 CH2 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 8 로 이루어진 CH3 도메인,
b) 2 개의 트라스투주마브 경쇄로서, 각각은 하기를 포함함:
ㆍ SEQ ID NO: 10 으로 이루어진 VL 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 11 로 이루어진 CL 도메인,
c) 2 개의 세툭시마브 경쇄로서, 각각은 하기를 포함함:
ㆍ SEQ ID NO: 13 으로 이루어진 VL 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 14 로 이루어진 CL 도메인.
하기로 이루어진 또 다른 특정 항체가 제공된다:
a) 2 개의 중쇄로서, 각각은 N 에서 C 말단 순서로, 하기를 포함하는 연속적인 서열로 이루어짐:
ㆍ SEQ ID NO: 4 로 이루어진 세툭시마브 중쇄 VH,
ㆍ SEQ ID NO: 5 로 이루어진 CH1 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:34 로 이루어진 폴리펩티드 링커,
ㆍ SEQ ID NO: 1 로 이루어진 트라스투주마브 중쇄 VH
ㆍ SEQ ID NO: 2 로 이루어진 CH1 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 6 으로 이루어진 힌지 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 7 로 이루어진 CH2 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 8 로 이루어진 CH3 도메인,
b) 2 개의 트라스투주마브 경쇄로서, 각각은 SEQ ID NO: 12 를 포함함,
c) 2 개의 세툭시마브 경쇄로서, 각각은 SEQ ID NO: 15 를 포함함.
바람직한 본 발명의 이중특이적 항체는 서열 SEQ ID NO: 4,:SEQ ID NO: 26 및 SEQ ID NO: 27 로 이루어진 세툭시마브 VH 서열을 갖는 항체이다.
본 발명은 세툭시마브의 경쇄 및/또는 중쇄의 인간화 버젼을 함유하는 이중특이적 항체를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 트라스투주마브의 돌연변이된 VH 및 VL 서열을 함유한다.
또한 본원에서는 본 발명의 단백질 사슬을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 기재된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 추가적인 서열을 포함할 수도 있다: 특히, 이것은 유리하게도 상기 단백질 사슬의 분비를 허용하는 시그널 펩티드 또는 리더 (leader) 서열을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주 세포를 포함한다.
상기 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 중쇄로 이루어진 폴리펩티드뿐 아니라, 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 추가로 기재되어 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포가 또한 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 이중특이적 항체를 제조하는 방법이다.
본 발명의 이중특이적 항체의 생성 방법이 그에 따라 제공되고, 이 방법은 하기의 단계를 포함한다: a) 상기 정의한 바와 같은 항체 중쇄, 및 상기 정의한 바와 같은 항체 경쇄를 발현하는 숙주 세포를 적합한 배지 및 배양 조건에서 배양하는 단계; 및 b) 배양 배지 또는 상기 배양된 세포로부터 상기 생성된 항체를 회수하는 단계.
도 1 은 본 발명의 이중특이적 항체의 개략도이다.
도 2a 는 환원 및 미환원 (non-reducing) 조건 하에서, 이중특이적 항체 BiXAb-3732SS 및 BiXAb-3489 의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 나타낸다.
도 2b 는 환원 및 미환원 조건 하에서, 이중특이적 항체 BiXAb-3486 의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 나타낸다.
도 2c 는 환원 및 미환원 조건 하에서 이중특이적 항체 BiXAb-E06528 의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 나타낸다.
도 3a 는 BiXAb-3489 의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 나타낸다.
도 3b 는 BiXAb-3732SS 의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 나타낸다.
도 3c 는 BiXAb-E06528 의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 나타낸다.
도 4 는 디지털 주사 열량측정에 의해 측정된 바와 같은 2 개의 부모 항체 (항-HER2 및 항-EGFR) 및 BiXAb-3489 의 용융 프로파일을 나타낸다.
도 5 는 이중 (dual) 항원 (HER2 및 EGFR) 결합 ELISA 에서의 BiXAb-3486 및 BiXAb-3489 의 결합 프로파일을 나타낸다.
도 6a 는 표적 세포로서 인간 췌장암 세포주, BxPC-3 및 효과기 세포로서 미분획 (unfractionated) 비사전활성화 (non-pre-activated) 단핵 세포를 활용하는 ADCC 검정에서, 2 개의 부모 항체 (항-HER2 및 항-EGFR), 이들의 1:1 혼합물, BiXAb-3486, BiXAb-3489, BiXAb-3732SS, BiXAb-E06528, 및 음성 대조군 항체, 항-CD20 의 세포독성 활성 프로파일을 나타낸다.
도 6b 는 표적 세포로서 인간 피부 편평세포 암종 세포주, A431 및 효과기 세포로서 미분획 비사전활성화 단핵 세포를 활용하는 ADCC 검정에서, 2 개의 부모 항체 (항-HER2 및 항-EGFR), 이들의 1:1 혼합물, BiXAb-3486, BiXAb-3489, BiXAb-3732SS, BiXAb-E06528, 및 음성 대조군 항체, 항-CD20 의 세포독성 활성 프로파일을 나타낸다.
도 6c 는 표적 세포로서 인간 난소암 세포주, SKOV3 및 효과기 세포로서 미분획 비사전활성화 단핵 세포를 활용하는 ADCC 검정에서, 2 개의 부모 항체 (항-HER2 및 항-EGFR), 이들의 1:1 혼합물, BiXAb-3486, BiXAb-3489, BiXAb-3732SS, BiXAb-E06528 및 음성 대조군 항체, 항-CD20 의 세포독성 활성 프로파일을 나타낸다.
도 7a 는 BxPC-3 를 보유하는 누드 마우스에서, 상이한 투여량 (2 mg/kg 및 10 mg/kg) 으로의 BiXab-3486, BiXab-3489, 및 4 mg/kg 의 총 농도를 갖는 부모 항-EGFR 및 항-HER2 의 조합물, 및 대조군의 효과 (선형 스케일) 를 나타낸다.
도 7b 는 상이한 투여량 (2 mg/kg 및 10 mg/kg) 의 BiXAb-3486 및 BiXAb-3489, 4 mg/kg 의 총 농도를 갖는 항-HER2 및 항-EGFR 항체의 조합물, 또는 대조군을 수여받은 6 가지의 상이한 마우스 코호트의 종양 성장 저해 (T/C%) 를 나타낸다. 종양 성장 저해 (T/C %) 는 치료군 대 대조군에 대한 중간 종양 부피의 비로서 정의되고, T/C % = [(제 X 일에서 치료군의 중간 종양 부피)/(제 X 일에서 대조군의 중간 종양 부피)] x 100 로서 산출된다.
도 7c 는 상이한 투여량 (2 mg/kg 및 10 mg/kg) 의 BiXAb-3486 및 BiXAb-3489, 4 mg/kg 의 총 농도를 갖는 항-HER2 및 항-EGFR 항체의 조합물, 및 대조군으로 치료된 마우스를 비교하는 Kaplan-Meier 생존 곡선.
도 7d 는 치료 받지 않은 마우스 (대조군) 에 비해 BiXAb들 또는 부모 항-HER2- 및 항-EGFR 의 조합물로 치료 받은 마우스에서 관찰되는 치료 효과를 나타낸다. 치료 효과는 치료군의 중간 생존 - 대조군의 중간 생존으로서 정의된다.
도 2a 는 환원 및 미환원 (non-reducing) 조건 하에서, 이중특이적 항체 BiXAb-3732SS 및 BiXAb-3489 의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 나타낸다.
도 2b 는 환원 및 미환원 조건 하에서, 이중특이적 항체 BiXAb-3486 의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 나타낸다.
도 2c 는 환원 및 미환원 조건 하에서 이중특이적 항체 BiXAb-E06528 의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 나타낸다.
도 3a 는 BiXAb-3489 의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 나타낸다.
도 3b 는 BiXAb-3732SS 의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 나타낸다.
도 3c 는 BiXAb-E06528 의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 나타낸다.
도 4 는 디지털 주사 열량측정에 의해 측정된 바와 같은 2 개의 부모 항체 (항-HER2 및 항-EGFR) 및 BiXAb-3489 의 용융 프로파일을 나타낸다.
도 5 는 이중 (dual) 항원 (HER2 및 EGFR) 결합 ELISA 에서의 BiXAb-3486 및 BiXAb-3489 의 결합 프로파일을 나타낸다.
도 6a 는 표적 세포로서 인간 췌장암 세포주, BxPC-3 및 효과기 세포로서 미분획 (unfractionated) 비사전활성화 (non-pre-activated) 단핵 세포를 활용하는 ADCC 검정에서, 2 개의 부모 항체 (항-HER2 및 항-EGFR), 이들의 1:1 혼합물, BiXAb-3486, BiXAb-3489, BiXAb-3732SS, BiXAb-E06528, 및 음성 대조군 항체, 항-CD20 의 세포독성 활성 프로파일을 나타낸다.
도 6b 는 표적 세포로서 인간 피부 편평세포 암종 세포주, A431 및 효과기 세포로서 미분획 비사전활성화 단핵 세포를 활용하는 ADCC 검정에서, 2 개의 부모 항체 (항-HER2 및 항-EGFR), 이들의 1:1 혼합물, BiXAb-3486, BiXAb-3489, BiXAb-3732SS, BiXAb-E06528, 및 음성 대조군 항체, 항-CD20 의 세포독성 활성 프로파일을 나타낸다.
도 6c 는 표적 세포로서 인간 난소암 세포주, SKOV3 및 효과기 세포로서 미분획 비사전활성화 단핵 세포를 활용하는 ADCC 검정에서, 2 개의 부모 항체 (항-HER2 및 항-EGFR), 이들의 1:1 혼합물, BiXAb-3486, BiXAb-3489, BiXAb-3732SS, BiXAb-E06528 및 음성 대조군 항체, 항-CD20 의 세포독성 활성 프로파일을 나타낸다.
도 7a 는 BxPC-3 를 보유하는 누드 마우스에서, 상이한 투여량 (2 mg/kg 및 10 mg/kg) 으로의 BiXab-3486, BiXab-3489, 및 4 mg/kg 의 총 농도를 갖는 부모 항-EGFR 및 항-HER2 의 조합물, 및 대조군의 효과 (선형 스케일) 를 나타낸다.
도 7b 는 상이한 투여량 (2 mg/kg 및 10 mg/kg) 의 BiXAb-3486 및 BiXAb-3489, 4 mg/kg 의 총 농도를 갖는 항-HER2 및 항-EGFR 항체의 조합물, 또는 대조군을 수여받은 6 가지의 상이한 마우스 코호트의 종양 성장 저해 (T/C%) 를 나타낸다. 종양 성장 저해 (T/C %) 는 치료군 대 대조군에 대한 중간 종양 부피의 비로서 정의되고, T/C % = [(제 X 일에서 치료군의 중간 종양 부피)/(제 X 일에서 대조군의 중간 종양 부피)] x 100 로서 산출된다.
도 7c 는 상이한 투여량 (2 mg/kg 및 10 mg/kg) 의 BiXAb-3486 및 BiXAb-3489, 4 mg/kg 의 총 농도를 갖는 항-HER2 및 항-EGFR 항체의 조합물, 및 대조군으로 치료된 마우스를 비교하는 Kaplan-Meier 생존 곡선.
도 7d 는 치료 받지 않은 마우스 (대조군) 에 비해 BiXAb들 또는 부모 항-HER2- 및 항-EGFR 의 조합물로 치료 받은 마우스에서 관찰되는 치료 효과를 나타낸다. 치료 효과는 치료군의 중간 생존 - 대조군의 중간 생존으로서 정의된다.
본 발명의 상세한 설명
정의
자연 발생 항체 분자의 기본 구조는, 비-공유 상호작용 및 사슬간 디술파이드 결합에 의해 함께 고정된 2 개의 동일한 중쇄 및 2 개의 동일한 경쇄로 이루어지는 Y-형상의 사량체 4차 구조이다.
포유동물 종에서, 5 가지 유형의 중쇄: α, δ, ε, γ 및 μ 가 존재하고, 이는 각각 면역글로불린의 부류 (아이소타입): IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 을 결정한다. 중쇄 N-말단 가변 도메인 (VH) 에는 뒤이어, 중쇄 γ, α 및 δ 에서 3 개의 도메인 (N-말단에서 C-말단으로 CH1, CH2 및 CH3 으로 번호화됨) 을 함유하는 불변 영역이 존재하는 한편, 중쇄 μ 및 ε 의 불변 영역은 4 개의 도메인 (N-말단에서 C-말단으로 CH1, CH2, CH3 및 CH4 로 번호화됨) 으로 구성된다. IgA, IgG 및 IgD 의 CH1 및 CH2 도메인은 가요성 힌지에 의해 분리되는데, 상기 힌지는 상이한 부류 사이에 길이가 가변적이며, IgA 및 lgG 의 경우, 상이한 하위유형 사이에 길이가 가변적이다: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 는 각각 15, 12, 62 (또는 77) 및 12 개 아미노산의 힌지를 갖고, IgA1 및 IgA2 는 각각 20 및 7 개 아미노산의 힌지를 갖는다.
2 개 유형의 경쇄가 존재한다: 임의의 중쇄 아이소타입과 연관될 수 있으나, 주어진 항체 분자에서 둘 모두 동일한 유형의 것인, λ 및 κ. 두 경쇄 모두는 기능적으로 동일한 것으로 나타난다. 그의 N-말단 가변 도메인 (VL) 에는 뒤이어, CL 로 지칭되는 단일 도메인으로 이루어지는 불변 영역이 존재한다.
중쇄 및 경쇄는 CH1 및 CL 도메인 사이의 단백질/단백질 상호작용에 의해, 그리고 VH/VL 상호작용을 통해 쌍을 이루며 2 개의 중쇄는 그의 CH3 도메인 사이의 단백질/단백질 상호작용에 의해 연관된다. 면역글로불린 분자의 구조는 일반적으로, CH1 과 CL 도메인 사이 및 힌지 사이의 사슬간 디술파이드 결합에 의해 안정화된다.
항원-결합 부위는, 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 쌍을 이룬 완전한 경쇄 각각으로 이루어지며 Fab 단편 (항원 결합 단편에 대함) 이라고 지칭되는, Y-형상 구조의 암 (arm) 에 상응한다. Fab 단편은 먼저 힌지 영역에서, 사슬간 디술파이드 결합의 아미노-말단측 상에서, 항체 분자를 절단하여 그에 따라 2 개의 동일한 항원-결합 암을 방출해내는 파파인 소화에 의해, 자연적 면역글로불린 분자로부터 생성된다. 펩신과 같은 다른 프로테아제는 또한, 힌지 영역에서, 그러나 사슬간 디술파이드 결합의 카르복시-말단측 상에서 항체 분자를 절단하여, 2 개의 동일한 Fab 단편으로 이루어지는 단편을 방출해내고 디술파이드 결합을 통해 연결되게 남아 있으며; F(ab')2 단편에서의 디술파이드 결합의 환원이 Fab' 단편을 생성시킨다.
VH 및 VL 도메인에 상응하는 항원 결합 영역의 일부는 Fv 단편 (가변적 단편에 대함) 으로 지칭되고; 이는 항원-결합 위치 (파라토프로도 지칭) 를 형성하는 CDR (상보성 결정 영역) 을 함유한다.
효과기 분자 또는 세포에 대한 결합을 담당하는 항체의 효과기 영역은 Y-형상 구조의 줄기에 상응하며, 중쇄의 쌍을 이룬 CH2 및 CH3 도메인 (또는 항체 부류에 따라 CH2, CH3 및 CH4 도메인) 을 함유하고, Fc (결정화가능 단편에 대함) 부위로 지칭된다.
2 개 중쇄 및 2 개 경쇄의 동일성으로 인해, 자연 발생 항체 분자는 2 개의 동일한 항원-결합 위치를 가지며 따라서 2 개의 동일한 에피토프에 동시에 결합한다.
다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합활성으로, 보다 쉽게, 및/또는 더 큰 지속기간으로 결합한다면, 항체는 표적 항원에 "특이적으로 결합한다". "특이적 결합" 또는 "우선적 결합" 은 (포함할 수 있음에도 불구하고) 배타적 결합을 반드시 필요로 하지는 않는다. 일반적으로, 반드시 그렇지는 않지만, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다.
세툭시마브 (Erbitux®; ImClone/Lilly, Merck-Serono) 는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 를 표적화하는 키메라 마우스-인간 모노클로날 항체 (ATCC HB-9764 & ATCC-97-63) 이다. 또한, 문헌 EP0359282, EP0667165, 및 US6217866 을 참조한다. 세툭시마브는 결장직장암 및 두경부의 편평 세포 암종의 치료제로서 사용이 승인되어 있다.
트라스투주마브 (Herceptin®; Genentech/Roche) 는 HER2/neu 수용체를 방해하는 인간화 IgG1 이다. 또한, 문헌 EP0590058, US5821337, US8075890, US6407213, US6054297, US5772997, US6165464, US6399063 및 US6639055 를 참조한다. 이것의 표기는 보조 및 전이성 유방 및 전이성 위암의 치료제이다.
본 발명의 문맥 하에서, 용어 "폴리펩티드 링커 서열"은 약 20 내지 80 개의 아미노산, 바람직하게는 30 내지 60 개의 아미노산, 보다 바람직하게는 30 내지 40 개의 아미노산의 폴리펩티드이다. 유리하게는, 링커 서열은 "힌지-유래"이고, 이는 폴리펩티드 링커가 바람직하게는 인간 기원의, IgA, IgG, 및 IgD 중에서 선택된 하나 이상의 면역글로불린(들)의 힌지 영역의 서열 전부 또는 일부를 포함한다는 것을 의미한다. 상기 폴리펩티드 링커는 오직 하나의 면역글로불린의 힌지 영역의 서열 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 면역글로불린은 인접한 CH1 도메인이 유래된 면역글로불린과 동일한 아이소타입 및 하위부류, 또는 상이한 아이소타입 또는 하위부류에 속할 수 있다.
다르게는, 상기 폴리펩티드 링커는 상이한 아이소타입 또는 하위부류의 적어도 2 개의 면역글로불린의 힌지 영역의 서열 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 이 경우, CH1 도메인에 직접 후속하는 폴리펩티드 링커의 N-말단 부분은 바람직하게 상기 CH1 도메인이 유래된 면역글로불린과 동일한 아이소타입 및 하위부류에 속하는 면역글로불린의 힌지 영역의 전부 또는 일부로 이루어진다.
임의로는, 상기 폴리펩티드 링커는 면역글로불린의 CH2 도메인의 2 내지 15 개의 N-말단 아미노산, 바람직하게는 5 내지 10 개의 N-말단 아미노산의 서열을 추가로 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 자연적 (native) 힌지 영역의 서열이 이용될 수 있다; 다른 경우에서, 점 돌연변이가 이들 서열에 도입될 수 있는데, 특히 자연적 IgG1, IgG2 또는 IgG3 힌지 서열에서의 하나 이상의 시스테인 잔기의 알라닌 또는 세린으로의 대체가 원하지 않는 사슬 내 또는 사슬 간 디술파이드 결합을 피하기 위해 도입될 수 있다.
본 발명의 이중특이적 항체에 사용될 수 있는 폴리펩티드 링커의 비제한적인 예는 하기 서열을 갖는 폴리펩티드이다:
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO:3).
상기 폴리펩티드는 인간 IgG1 힌지의 전장 서열, 이어서 인간 IgG1 CH2 의 9 개의 N-말단 아미노산 (APELLGGPS (SEQ ID NO: 28)), 이어서 인간 IgA1 힌지의 서열 일부 (TPPTPSPS (SEQ ID NO: 29)), 및 이어서 디펩티드 GG (링커의 추가의 유연성을 제공하기 위해 부가됨) 로 이루어진다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 힌지-유래 폴리펩티드 링커 서열은 SEQ ID NO:16 또는 SEQ ID NO:34 이다.
용어 "대상", "개인" 및 "환자" 는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 치료를 위해 평가하고/하거나 치료하는 포유동물을 지칭한다. 대상은 인간일 수 있으며 또한 다른 포유동물, 특히 인간 질환을 위한 실험실 모델로서 유용한 포유동물, 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼, 개 등을 포함한다.
용어 "치료" 또는 "치료하는" 은 인간을 포함하는 대상이 대상의 병태를 직간접적으로 개선시키기 위해 의료 지원을 받는 조치, 적용 또는 치료요법을 지칭한다. 특히, 상기 용어는 일부 구현예에서 발병률을 감소시키는 것, 또는 증상을 경감시키는 것, 재발을 없애는 것, 재발을 방지하는 것, 발병을 방지하는 것, 증상을 개선시키는 것, 예후를 개선시키는 것 또는 이의 조합을 지칭한다. 숙련가는 치료가 증상의 완전한 부재 또는 제거를 반드시 초래하지는 않는다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 암과 관련하여, "치료" 또는 "치료하는" 은 신생물성 또는 악성 세포 성장, 증식, 또는 전이를 둔화시키는 것, 신생물성 또는 악성 세포 성장, 증식, 또는 전이의 발전을 방지하거나 지연시키는 것, 또는 이들의 일부 조합을 지칭할 수 있다.
이중특이적 항체의 설계:
본 발명자들은 이제 각각의 그의 표적에 대한 2 개 결합 위치, 및 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 식균작용 및 보체-의존적 세포독성 (CDC) 과 같은 효과기 기능의 활성화를 가능하게 하는 기능적 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 4가 항체를 제공한다.
본 발명은 구체적으로 EGFR 및 HER2 를 표적화하는 2 개의 모노클로날 항체, 즉 각각 세툭시마브 및 트라스투주마브의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 가변 영역의 아미노산 서열을 이용하여 구축된 이중특이적 항체에 관한 것이다.
본 발명의 항체는 전장 항체이다. 이들은 바람직하게는 인간 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 더욱 바람직하게는 IgG1 로부터의 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
경쇄는 바람직하게는 카파 경쇄이다.
IgG-유사 구조를 갖는 본 발명의 항체의 예를 도 1 에 예시한다.
본 발명의 이중특이적 항체는 통상
- Fc (힌지-CH2-CH3),
- 뒤이어, 항체 1 Fab 중쇄 (CH1-VH) 및 항체 2 의 연이은 Fab 중쇄 (CH1-VH) (후자는 힌지-유래 폴리펩티드 링커 서열에 의해 연결됨) 로 구축된 연속적인 중쇄를 포함하고,
- 단백질 발현 동안 생성 중쇄는 이량체로 조립되는 한편 동시-발현된 항체 1 및 항체 2 경쇄 (VL-CL) 가 그들의 동족 중쇄와 연관되어 최종 탠덤 F(ab)'2-Fc 분자를 형성하고,
이때 항체 1 (Ab1) 및 항체 2 (Ab2) 는 상이하며, 세툭시마브, 트라스투주마브, 및 이들의 돌연변이된 또는 인간화된 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는
- Fc (힌지-CH2-CH3),
- 뒤이어, 트라스투주마브 Fab 중쇄 (CH1-VH) 및 세툭시마브의 연이은 Fab 중쇄 (CH1-VH) (후자는 힌지-유래된 폴리펩티드 링커 서열에 의해 연결됨) 로 구축된 연속적인 중쇄를 포함하고,
- 단백질 발현 동안, 생성 중쇄가 이량체로 조립되는 한편 야생형 또는 돌연변이된 트라스투주마브 및 야생형 또는 돌연변이된 또는 인간화된 세툭시마브의 동시 발현된 경쇄 (VL-CL) 가 그들의 동족 중쇄와 연관되어 최종 탠덤 F(ab)’2-Fc 분자를 형성한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는
- Fc (힌지-CH2-CH3),
- 뒤이어 세툭시마브 Fab 중쇄 (CH1-VH) 및 트라스투주마브의 연이은 Fab 중쇄 (CH1-VH) (후자는 힌지-유래된 폴리펩티드 링커 서열에 의해 연결됨) 로 구축된 연속적인 중쇄를 포함하고,
- 단백질 발현 동안 생성 중쇄는 이량체로 조립되는 한편, 야생형 또는 돌연변이된 세툭시마브 및 야생형 또는 돌연변이된 트라스투주마브의 동시-발현된 경쇄 (VL-CL) 가 그들의 동족 중쇄와 연관되어 최종 탠덤 F(ab)'2-Fc 분자를 형성한다.
바람직한 구현예에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항체가 기재되어 있다:
· 하기로 이루어지는 상이한 CH1 및 CL 도메인을 갖는 2 개의 Fab 단편:
a) 인간 IgG1/카파에서 유래한 CH1 및 C-카파 도메인, 및 Ab1 의 VH 및 VL 도메인을 갖는 Fab 단편,
b) 인간 IgG1/카파에서 유래한 CH1 및 C-카파 도메인, 및 Ab2 의 VH 및 VL 도메인을 갖는 Fab 단편,
c) 인간 카파 불변 도메인에서 유래한 돌연변이된 경쇄 불변 도메인,
이때, Fab 단편은 하기 순서로 나란히 배열됨:
- 폴리펩티드 링커를 통해 Ab2 Fab 단편의 VH 도메인의 N-말단에 연결에 연결된 Ab1 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단,
- Ab2 단편의 CH1 도메인의 C-말단을 CH2 도메인의 N-말단에 연결하는 인간 IgG1 의 힌지 영역,
- 인간 IgG1 의 이량체화된 CH2 및 CH3 도메인.
나아가 바람직한 구현예에서,
- Ab1 은
o 서열 SEQ ID NO:1 에 상응하는 VH 영역
o SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열들 중 하나에 상응하는 CH1 영역
o 서열 SEQ ID NO: 10 에 상응하는 VL 영역
o SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열들 중 하나에 상응하는 C-카파 영역
o 오직 하기의 조합으로 연관될 수 있는 CH1 및 C-카파 영역:
- SEQ ID NO: 2 와 SEQ ID NO: 11
- SEQ ID NO: 5 와, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23
- SEQ ID NO: 20 과, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23
- SEQ ID NO: 21 과, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25
- SEQ ID NO: 22 와, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25
을 갖는 트라스투주마브이고,
- Ab2 는
o 서열 SEQ ID NO:4 에 상응하는 VH 영역,
o SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열들 중 하나에 상응하는 CH1 영역,
o 서열 SEQ ID NO: 13 에 상응하는 VL 영역,
o SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열들 중 하나에 상응하는 C-카파 영역,
o 오직 하기의 조합으로 연관될 수 있는 CH1 및 C-카파 영역:
- SEQ ID NO: 2 와 SEQ ID NO: 11,
- SEQ ID NO: 5 와, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23,
- SEQ ID NO: 20 과, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23,
- SEQ ID NO: 21 과, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25,
- SEQ ID NO: 22 와, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25
을 갖는 세툭시마브이고,
- Ab1 및 Ab2 는 각각 CH1 및 C-카파의 상이한 서열 조합을 갖는다.
또 다른 양태에서,
Ab1 은
o 서열 SEQ ID NO: 4 에 상응하는 VH 영역,
o SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열들 중 하나에 상응하는 CH1 영역,
o 서열 SEQ ID NO: 13 에 상응하는 VL 영역,
o SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열들 중 하나에 상응하는 C-카파 영역,
o 오직 하기의 조합으로 연관될 수 있는 CH1 및 C-카파 영역:
- SEQ ID NO: 2 와 SEQ ID NO: 11,
- SEQ ID NO: 5 와, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23,
- SEQ ID NO: 20 과, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23,
- SEQ ID NO: 21 과, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25,
- SEQ ID NO: 22 와, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25
를 갖는 세툭시마브이고,
Ab2 는
o 서열 SEQ ID NO:1 에 상응하는 VH 영역,
o SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열들 중 하나에 상응하는 CH1 영역,
o 서열 SEQ ID NO: 10 에 상응하는 VL 영역,
o SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열들 중 하나에 상응하는 C-카파 영역,
o 오직 하기의 조합으로 연관될 수 있는 CH1 및 C-카파 영역:
- SEQ ID NO: 2 와 SEQ ID NO: 11,
- SEQ ID NO: 5 와, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23,
- SEQ ID NO: 20 과, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23,
- SEQ ID NO: 21 과, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25
- SEQ ID NO: 22 와, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25
를 갖는 트라스투주마브이고,
- Ab1 및 Ab2 는 각각 상이한 CH1 및 C-카파 서열 조합을 갖는다.
본 설명 전체에 걸쳐, 아미노산 서열은 [Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 에 따라 정의된다.
특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 하기의 구조를 가진다:
a) 하기로 이루어진 연속적인 중쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 1 에 상응하는 트라스투주마브 중쇄 가변 영역 (VH),
ㆍ SEQ ID NO: 2 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌, T 임),
ㆍ SEQ ID NO: 3 에 상응하는 2 개의 Fab 중쇄를 연결하는 폴리펩티드 링커,
ㆍ SEQ ID NO: 4 에 상응하는 세툭시마브 중쇄 가변 영역 (VH),
ㆍ SEQ ID NO: 5 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌에서 글루탐산, E 로 돌연변이되어 있음),
ㆍ SEQ ID NO: 6 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 힌지 영역,
ㆍ SEQ ID NO: 7 에 상응하는 인간 IgG1 의 야생형 CH2 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 8 에 상응하는 인간 IgG1 동종이인자형 G1m(3) 의 야생형 CH3 도메인,
b) 하기로 이루어진 트라스투주마브 경쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 10 에 상응하는 야생형 가변 영역 (VL),
ㆍ SEQ ID NO: 11 에 상응하는 야생형 인간 카파 불변 도메인 (Kabat 위치 114 및 137 에서의 잔기는 각각 세린 (S) 및 아스파라긴 (N) 임),
c) 하기로 이루어진 세툭시마브 경쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 13 에 상응하는 야생형 가변 영역 (VL),
ㆍ SEQ ID NO: 14 에 상응하는 돌연변이된 인간 카파 불변 도메인 (Kabat 위치 114 및 137 에서의 잔기는 각각 알라닌 (A) 및 리신 (K) 임).
또 다른 구현예에서, 이중특이적 항체는 하기의 구조를 갖는다:
a) 하기로 이루어진 연속적인 중쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 1 에 상응하는 트라스투주마브 중쇄 가변 영역 (VH),
ㆍ SEQ ID NO: 2 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌, T 임),
ㆍ SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO:34 에 상응하는 2 개의 Fab 중쇄를 연결하는 폴리펩티드 링커,
ㆍ SEQ ID NO: 4 에 상응하는 세툭시마브 중쇄 가변 영역 (VH),
ㆍ SEQ ID NO: 5 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인 (위치 192 에서의 잔기는 트레오닌에서 글루탐산, E 로 돌연변이되어 있음),
ㆍ SEQ ID NO: 6 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 힌지 영역,
ㆍ SEQ ID NO: 7 에 상응하는 인간 IgG1 의 야생형 CH2 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 8 에 상응하는 인간 IgG1 동종이인자형 G1m(3) 의 야생형 CH3 도메인,
b) SEQ ID NO: 12 에 상응하는 야생형 트라스투주마브 경쇄의 아미노산 서열,
c) SEQ ID NO: 15 에 상응하는 돌연변이된 세툭시마브 경쇄의 아미노산 서열.
추가 양태에서, 이중특이적 항체는 하기의 구조를 가질 수 있다:
a) 하기로 이루어진 연속적인 중쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 4 에 상응하는 세툭시마브 중쇄 가변 영역 (VH),
ㆍ SEQ ID NO: 5 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌에서 글루탐산, E 로 돌연변이되어 있음),
ㆍ SEQ ID NO: 3 에 상응하는 2 개의 Fab 중쇄를 연결하는 폴리펩티드 링커,
ㆍ SEQ ID NO: 1 에 상응하는 트라스투주마브 중쇄 가변 영역 (VH),
ㆍ SEQ ID NO: 2 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌, T 임),
ㆍ SEQ ID NO: 6 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 힌지 영역,
ㆍ SEQ ID NO: 7 에 상응하는 인간 IgG1 의 야생형 CH2 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 8 에 상응하는 인간 IgG1 동종이인자형 G1m(3) 의 야생형 CH3 도메인,
b) SEQ ID NO: 12 에 상응하는 야생형 트라스투주마브 경쇄의 아미노산 서열,
c) SEQ ID NO: 15 에 상응하는 돌연변이된 세툭시마브 경쇄의 아미노산 서열.
또한 추가 양태에서, 이중특이적 항체는 하기의 구조를 가질 수 있다:
a) 하기로 이루어진 연속적인 중쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 4 에 상응하는 세툭시마브 중쇄 가변 영역 (VH),
ㆍ SEQ ID NO: 5 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌에서 글루탐산, E 로 돌연변이되어 있음),
ㆍ SEQ ID NO: 16 에 상응하는 2 개의 Fab 중쇄를 연결하는 폴리펩티드 링커,
ㆍ SEQ ID NO: 1 에 상응하는 트라스투주마브 중쇄 가변 영역 (VH),
ㆍ SEQ ID NO: 2 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌, T 임),
ㆍ SEQ ID NO: 6 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 힌지 영역,
ㆍ SEQ ID NO: 7 에 상응하는 인간 IgG1 의 야생형 CH2 도메인
ㆍ SEQ ID NO: 8 에 상응하는 인간 IgG1 동종이인자형 G1m(3) 의 야생형 CH3 도메인,
b) SEQ ID NO: 12 에 상응하는 야생형 트라스투주마브 경쇄의 아미노산 서열,
c) SEQ ID NO: 15 에 상응하는 돌연변이된 세툭시마브 경쇄의 아미노산 서열.
이중특이적 항체는 하기의 돌연변이들 중 적어도 하나를 함유할 수 있다:
- SEQ ID NO: 20 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인,
- SEQ ID NO: 21 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인,
- SEQ ID NO: 22 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인,
- SEQ ID NO: 23 에 상응하는 돌연변이된 인간 카파 불변
- SEQ ID NO: 24 에 상응하는 돌연변이된 인간 카파 불변
- SEQ ID NO: 25 에 상응하는 돌연변이된 인간 카파 불변 도메인.
추가 양태에서, 이중특이적 항체는 표 1 및 표 2 에 열거된 조합에 따라 VH 영역, CH1 도메인, VL 영역 및 C-카파 도메인을 갖고, 이로써 본 발명의 항체의 다양한 가능 포맷을 보여준다.
이중특이적 항체는 바람직하게 EGFR 및/또는 HER2 에 대해 더 높은 결합 친화성을 보인다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 EGFR 및/또는 HER2 에 관하여 1 x 10-7 M, 10-8 M 미만, 바람직하게 1 x 10-9 또는 1 x 10-10 M 의 Kd 를 나타낼 수 있다.
표 1
표 2
링커의 설계
"힌지-유래 폴리펩티드 링커 서열" 또는 "슈도 (pseudo) 힌지 링커" 로도 지정되는 폴리펩티드 링커는, 바람직하게는 인간 기원의, IgA, IgG 및 IgD 중에서 선택된 하나 이상의 면역글로불린(들) 의 힌지 영역의 서열의 전부 또는 일부를 포함한다. 상기 폴리펩티드 링커는 단 하나의 면역글로불린의 힌지 영역의 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 상기 면역글로불린은 인접한 CH1 도메인이 유래하는 면역글로불린과 동일한 아이소타입 및 하위부류, 또는 상이한 아이소타입 또는 하위부류에 속할 수 있다. 대안적으로, 상기 폴리펩티드 링커는 상이한 아이소타입 또는 하위부류의 적어도 2 개의 면역글로불린의 힌지 영역의 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 이러한 경우, CH1 도메인에 바로 뒤따르는 폴리펩티드 링커의 N-말단부는, 바람직하게는 상기 CH1 도메인이 유래하는 면역글로불린과 동일한 아이소타입 및 하위부류에 속하는 면역글로불린의 힌지 영역의 전부 또는 일부로 이루어진다.
임의로는, 상기 폴리펩티드 링커는 면역글로불린의 CH2 도메인의 2 내지 15 개, 바람직하게는 5 내지 10 개의 N-말단 아미노산의 서열을 추가로 포함할 수 있다.
폴리펩티드 링커 서열은 통상, 80 개 미만의 아미노산, 바람직하게는 60 개 미만의 아미노산, 더욱 바람직하게는 40 개 미만의 아미노산으로 이루어진다.
일부 경우, 자연적 힌지 영역으로부터의 서열이 사용될 수 있고; 다른 경우에 점 돌연변이가 이들 서열에 도입되어 (특히 알라닌 또는 세린에 의한 자연적 IgG1, IgG2 또는 IgG3 힌지 서열에서의 하나 이상의 시스테인 잔기의 대체), 원치않는 사슬내 또는 사슬간 디술파이드 결합을 방지할 수 있다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드 링커 서열은 아미노산 서열 EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG (SEQ ID NO:36) 를 포함하거나 이것으로 이루어지며, 여기서 동일하거나 상이한 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10 은 임의의 아미노산이다. 특히, 폴리펩티드 링커 서열은 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 서열을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다:
본 발명의 다중특이적 항원-결합 단편에서 사용될 수 있는 힌지-유래 폴리펩티드 링커의 비제한적 예는 SEQ ID NO: 3 을 갖는 폴리펩티드이다. 상기 폴리펩티드는 인간 IgG1 힌지의 전장 서열, 뒤이어 인간 IgG1 CH2 의 9 개의 N-말단 아미노산 (APELLGGPS, SEQ ID NO: 28), 인간 IgA1 힌지의 서열의 일부 (TPPTPSPS, SEQ ID NO: 29), 그런 다음 링커에 대한 추가 가요성을 제공하기 위해 첨가된 디펩티드 GG 로 이루어진다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 힌지-유래 폴리펩티드 링커 서열은 SEQ ID NO: 34 또는 SEQ ID NO: 16 이다.
특정 구현예에서, 동일하거나 상이한 X1, X2 및 X3 은 트레오닌 (T) 또는 세린 (S) 이다.
또 다른 특정 구현예에서, 동일하거나 상이한 X1, X2 및 X3 은 Ala (A), Gly (G), Val (V), Asn (N), Asp (D) 및 Ile (I) 로 이루어지는 군에서 선택되고, 더욱 바람직하게는 동일하거나 상이한 X1, X2 및 X3 은 Ala (A) 또는 Gly (G) 일 수 있다.
대안적으로, 동일하거나 상이한 X1, X2 및 X3 은 Leu (L), Glu (E), Gln (Q), Met (M), Lys (K), Arg (R), Phe (F), Tyr (T), His (H), Trp (W), 바람직하게는 Leu (L), Glu (E), 또는 Gln (Q) 일 수 있다.
특정 구현예에서, 동일하거나 상이한 X4 및 X5 는 세린 (S), 시스테인 (C), 알라닌 (A) 및 글리신 (G) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 임의의 아미노산이다.
바람직한 구현예에서, X4 는 세린 (S) 또는 시스테인 (C) 이다.
바람직한 양태에서, X5 는 알라닌 (A) 또는 시스테인 (C) 이다.
특정 구현예에서, 동일하거나 상이한 X6, X7, X8, X9, X10 은 트레오닌 (T) 또는 세린 (S) 외의 임의의 아미노산이다. 바람직하게는 동일하거나 상이한 X6, X7, X8, X9, X10 은 Ala (A), Gly (G), Val (V), Asn (N), Asp (D) 및 Ile (I) 로 이루어지는 군에서 선택된다.
대안적으로, 동일하거나 상이한 X6, X7, X8, X9, X10 은 Leu (L), Glu (E), Gln (Q), Met (M), Lys (K), Arg (R), Phe (F), Tyr (T), His (H), Trp (W), 바람직하게는 Leu (L), Glu (E), 또는 Gln (Q) 일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 동일하거나 상이한 X6, X7, X8, X9, X10 은 Ala (A) 및 Gly (G) 로 이루어지는 군에서 선택된다.
더 바람직한 구현예에서, X6 및 X7 은 동일하며 바람직하게는 Ala (A) 및 Gly (G) 로 이루어지는 군에서 선택된다.
바람직한 구현예에서, 폴리펩티드 링커 서열은 서열 SEQ ID NO: 36 을 포함하거나 이것으로 이루어지며, 여기서:
동일하거나 상이한 X1, X2 및 X3 은 트레오닌 (T), 세린 (S) 이고;
X4 는 세린 (S) 또는 시스테인 (C) 이고;
X5 는 알라닌 (A) 또는 시스테인 (C) 이고;
동일하거나 상이한 X6, X7, X8, X9, X10 은 Ala (A) 및 Gly (G) 로 이루어지는 군에서 선택된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드 링커 서열은 서열 SEQ ID NO: 36 을 포함하거나 이것으로 이루어지며, 여기서:
동일하거나 상이한 X1, X2 및 X3 은 Ala (A) 또는 Gly (G) 이고;
X4 는 세린 (S) 또는 시스테인 (C) 이고;
X5 는 알라닌 (A) 또는 시스테인 (C) 이고;
동일하거나 상이한 X6, X7, X8, X9, X10 은 Ala (A) 및 Gly (G) 로 이루어지는 군에서 선택된다.
바람직한 이중특이적 항체
몇몇의 이중특이적 항체 (BiXAb-3486, BiXAb-3489, BiXAb-3732SS, 및 BiXAb-E06528 로 지정) 의 제조가 실시예에 기재되어 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 이중특이적 항체 (BiXAb-3486) 는 하기의 구조를 갖는다:
i) 하기를 포함하는 연속적인 중쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 1 에 상응하는 트라스투주마브 중쇄 가변 영역 (VH)
ㆍ SEQ ID NO: 2 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌, T 임)
ㆍ SEQ ID NO: 3 에 상응하는 2 개의 Fab 중쇄를 연결하는 폴리펩티드 링커
ㆍ SEQ ID NO: 4 에 상응하는 세툭시마브 중쇄 가변 영역 (VH)
ㆍ SEQ ID NO: 5 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌에서 글루탐산, E 로 돌연변이되어 있음)
ㆍ SEQ ID NO: 6 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 힌지 영역,
ㆍ SEQ ID NO: 7 에 상응하는 인간 IgG1 의 야생형 CH2 도메인
ㆍ SEQ ID NO: 8 에 상응하는 인간 IgG1 동종이인자형 G1m(3) 의 야생형 CH3 도메인,
그러므로, 본 발명의 이중특이적 항체는 SEQ ID NO: 9 의 연속적인 중쇄 (701 개의 잔기) 를 가짐
ii) 하기를 포함하는 야생형 트라스투주마브 경쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 10 에 상응하는 야생형 가변 영역 (VL)
ㆍ SEQ ID NO: 11 에 상응하는 야생형 인간 카파 불변 도메인 (Kabat 위치 114 및 137 에서의 잔기는 각각 세린 (S) 및 아스파라긴 (N) 임)
그러므로, 트라스투주마브 경쇄는 SEQ ID NO: 12 에 상응함
iii) 하기를 포함하는 세툭시마브 경쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 13 에 상응하는 야생형 가변 영역 (VL)
ㆍ SEQ ID NO: 14 에 상응하는 돌연변이된 인간 카파 불변 도메인 (Kabat 위치 114 및 137 에서의 잔기는 각각 알라닌 (A) 및 리신 (K) 임)
그러므로, 세툭시마브 경쇄는 SEQ ID NO: 15 에 상응함.
또 다른 본 발명의 바람직한 이중특이적 항체 (BiXAb-3489) 는 하기 구조를 갖는 항체이다:
i) 하기를 포함하는 연속적인 중쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 1 에 상응하는 트라스투주마브 중쇄 가변 영역 (VH)
ㆍ SEQ ID NO: 2 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌, T 임)
ㆍ SEQ ID NO: 16 에 상응하는 2 개의 Fab 중쇄를 연결하는 폴리펩티드 링커
ㆍ SEQ ID NO: 4 에 상응하는 세툭시마브 중쇄 가변 영역 (VH)
ㆍ SEQ ID NO: 5 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌에서 글루탐산, E 로 돌연변이되어 있음)
ㆍ SEQ ID NO: 6 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 힌지 영역
ㆍ SEQ ID NO: 7 에 상응하는 인간 IgG1 의 야생형 CH2 도메인
ㆍ SEQ ID NO: 8 에 상응하는 인간 IgG1 동종이인자형 G1m(3) 의 야생형 CH3 도메인
그러므로, 본 발명의 이중특이적 항체는 SEQ ID NO: 17 의 연속적인 중쇄 (701 개의 잔기) 를 가짐
ii) SEQ ID NO: 12 로 이루어진 야생형 트라스투주마브 경쇄
iii) SEQ ID NO: 15 로 이루어진 세툭시마브 경쇄.
본 발명의 또 다른 바람직한 이중특이적 항체 (BiXAb-E06528) 는 하기의 구조를 갖는 항체이다:
i) 하기를 포함하는 연속적인 중쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 1 에 상응하는 트라스투주마브 중쇄 가변 영역 (VH)
ㆍ SEQ ID NO: 2 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌, T 임)
ㆍ SEQ ID NO: 34 에 상응하는 2 개의 Fab 중쇄를 연결하는 폴리펩티드 링커
ㆍ SEQ ID NO: 4 에 상응하는 세툭시마브 중쇄 가변 영역 (VH)
ㆍ SEQ ID NO: 5 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌에서 글루탐산, E 로 돌연변이되어 있음)
ㆍ SEQ ID NO: 6 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 힌지 영역
ㆍ SEQ ID NO: 7 에 상응하는 인간 IgG1 의 야생형 CH2 도메인
ㆍ SEQ ID NO: 8 에 상응하는 인간 IgG1 동종이인자형 G1m(3) 의 야생형 CH3 도메인
그러므로, 본 발명의 이중특이적 항체는 SEQ ID NO: 35 의 연속적인 중쇄 (701 개의 잔기) 를 가짐
ii) SEQ ID NO: 12 로 이루어진 야생형 트라스투주마브 경쇄
iii) SEQ ID NO: 15 로 이루어진 세툭시마브 경쇄.
본 발명의 또 다른 바람직한 이중특이적 항체는 하기의 구조를 갖는다:
i) 하기를 포함하는 연속적인 중쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 4 에 상응하는 세툭시마브 중쇄 가변 영역 (VH)
ㆍ SEQ ID NO: 5 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌에서 글루탐산, E 로 돌연변이되어 있음)
ㆍ SEQ ID NO: 3 에 상응하는 2 개의 Fab 중쇄를 연결하는 폴리펩티드 링커
ㆍ SEQ ID NO: 1 에 상응하는 트라스투주마브 중쇄 가변 영역 (VH)
ㆍ SEQ ID NO: 2 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌, T 임)
ㆍ SEQ ID NO: 6 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 힌지 영역
ㆍ SEQ ID NO: 7 에 상응하는 인간 IgG1 의 야생형 CH2 도메인
ㆍ SEQ ID NO: 8 에 상응하는 인간 IgG1 동종이인자형 G1m(3) 의 야생형 CH3 도메인
그러므로, 본 발명의 이중특이적 항체는 SEQ ID NO: 18 의 연속적인 중쇄 (701 개의 잔기) 를 가짐
ii) SEQ ID NO: 12 로 이루어진 야생형 트라스투주마브 경쇄
iii) SEQ ID NO: 15 로 이루어진 세툭시마브 경쇄.
본 발명의 나아가 또 다른 바람직한 이중특이적 항체 (BiXab 3732SS) 는 하기의 구조를 갖는다:
i) 하기를 포함하는 연속적인 중쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 4 에 상응하는 세툭시마브 중쇄 가변 영역 (VH)
ㆍ SEQ ID NO: 5 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌에서 글루탐산, E 로 돌연변이되어 있음)
- SEQ ID NO: 16 에 상응하는 2 개의 Fab 중쇄를 연결하는 폴리펩티드 링커
ㆍ SEQ ID NO: 1 에 상응하는 트라스투주마브 중쇄 가변 영역 (VH)
ㆍ SEQ ID NO: 2 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌, T 임)
ㆍ SEQ ID NO: 6 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 야생형 힌지 영역
ㆍ SEQ ID NO: 7 에 상응하는 인간 IgG1 의 야생형 CH2 도메인
ㆍ SEQ ID NO: 8 에 상응하는 인간 IgG1 동종이인자형 G1m(3) 의 야생형 CH3 도메인
그러므로, 본 발명의 이중특이적 항체는 SEQ ID NO: 19 의 연속적인 중쇄 (701 개의 잔기) 를 가짐
ii) SEQ ID NO: 12 로 이루어진 야생형 트라스투주마브 경쇄
iii) SEQ ID NO: 15 로 이루어진 세툭시마브 경쇄.
돌연변이된 유도체
본 발명은 (세툭시마브 또는 트라스투주마브의) 야생형 서열, 또는 이의 돌연변이된 유도체를 이용한다.
용어 "돌연변이된 유도체", "돌연변이체", 또는 "기능적 변이체" 는 하나 또는 여러 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입에 의해 나타내어지는 부모 서열과 상이한 서열을 지정한다. 바람직하게는, 돌연변이체는 자연적 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 상동성 서열을 바람직하게 나타낸다. 특정 구현예에서, 돌연변이는 항체의 기능에 실질적으로 영향을 주지 않는다.
돌연변이된 유도체, 또는 기능적 변이체는 본원에 인용된 임의의 참조 서열과 적어도 85% (예를 들어, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬, 본원에 인용된 임의의 참조 서열과 적어도 85% (예를 들어, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 사슬, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 이들 변이체는 EGFR 및 HER2 에 결합할 수 있다. 일부 예에서, 변이체는 상기 기재한 참조 항체에 관하여 유사한 항원-결합 친화성을 갖는다 (예를 들어, 1 x 10-8 M 미만, 바람직하게는 1 x 10-9 M 또는 1 x 10-10 M 미만의 Kd 를 가짐).
결합의 친화성은 용어 ka (결합 속도 상수), kd (해리 속도 상수), 또는 KD (평형 해리) 에 의해 정의된다. 통상, 항체에 관하여 사용되는 경우, 특이적으로 결합한다는 것은 10-8 M 미만, 예를 들어, 10-9 M 또는 10-10 M 미만의 친화성 (KD) 값으로 그의 표적(들) 에 특이적으로 결합하는 (이를 "인지하는") 항체를 지칭한다. 더 낮은 KD 값은 더 높은 결합 친화성 (즉, 더 강한 결합) 을 나타내어, 10-9 의 KD 값은 10-8 의 KD 값보다 더 높은 결합 친화성을 나타낸다.
2 개 아미노산 서열의 "동일성 퍼센트" 는 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993] 에서와 같이 변형된, [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990] 의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 [Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990] 의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0) 에 통합된다. BLAST 단백질 탐색이 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어 길이=3 으로 수행되어, 관심 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 2 개 서열 사이에 갭 (gap) 이 존재하는 경우, Gapped BLAST 를 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997] 에서 기재한 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST) 의 디폴트 매개변수를 사용할 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에서 기재한 기능적 변이체는, 하나 이상의 CDR 과 상호작용하는 것으로 예측되는 잔기에서 바람직하게는 발생하지 않는 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 보존적 치환) 를 함유할 수 있다.
참조 항체와 실질적으로 동일한 돌연변이된 유도체, 또는 기능적 변이체가 본원에 기재된다.
용어 "실질적으로 동일한" 또는 "미약한" 은 변이체의 관련 아미노산 서열 (예를 들어, 프레임워크 영역 (FR), CDR, VH 또는 VL 도메인에서의) 이 참조 항체와 비교하여 미약하게 상이 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환 포함) 하여, 변이체가 참조 항체에 관하여 실질적으로 유사한 결합 활성 (예를 들어 친화성, 특이성, 또는 둘 모두) 및 생체활성을 갖는 것을 의미한다. 이러한 변이체는 중대하지 않은 (minor) 아미노산 변화, 예를 들어 지정된 영역의 5 개 아미노산 서열에서 1 또는 2 개 치환을 포함할 수 있다. 일반적으로, 항체의 결합 기능에 부정적으로 영향 (예컨대 본래 항체와 비교하여 50% 초과로 결합 친화성을 감소시킴) 을 주지 않는 한, CDR 영역과 대조적으로, 더 많은 치환이 FR 부위에서 만들어질 수 있다. 일부 구현예에서, 서열 동일성은 본래 항체와 변형된 항체 사이에서 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 항체는 동일한 결합 특이성을 가지며 본래 항체의 친화성의 적어도 50% 를 갖는다.
보존적 치환은 이러한 변형이 만들어지는 분자의 기능적 및 화학적 특징과 유사한 기능적 및 화학적 특징을 갖는 분자를 생성시킬 것이다. 예를 들어, "보존적 아미노산 치환" 은 자연적 아미노산 잔기의 또 다른 잔기로의 치환을 포함할 수 있는데, 그 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 약간의 영향이 있거나 영향이 없다. 원하는 아미노산 치환 (보존적 또는 비-보존적) 은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 분자 서열의 중요한 잔기를 확인하거나, 본원에 기재된 분자의 친화성을 증가 또는 감소시키는데 사용될 수 있다. 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 변이체는, 이러한 방법을 정리하는 참고문헌, 예를 들어 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989], 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York] 에서 발견되는 바와 같은, 당업자에게 공지된 폴리펩티드 서열 변경 방법에 따라 제조될 수 있다. 아미노산의 보존적 치환은 하기 군 내의 아미노산 중에서 만들어진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D.
본 개시물은 또한, 항체의 개선된 생물학적 특성, 예컨대 더 높은 또는 더 낮은 결합 친화성, 또는 변경된 ADCC 특성, 또는 EGFR 및/또는 HER2 발현 세포의 생존성 저해의 변경된 효과를 갖는 항체 변이체를 제공한다.
항체의 아미노산 서열 변이체는 항체 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써, 또는 펩티드 합성을 통해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 잔기로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 단, 최종 구축물이 원하는 특징을 갖는다면, 최종 구축물이 달성되도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어진다. 항체의 아미노산 서열 변이체를 인코딩하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법은 비제한적으로, 항체의 조기 제조된 변이체 또는 비-변이체 (천연) 버전의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 위치-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발을 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 항체의 평형 해리 상수 (KD) 값은 10-8 M 미만, 특히 10-9 M 또는 10-10 M 미만이다. 결합 친화성은 당해 분야에 공지된 기법, 예컨대 ELISA 또는 생체특이적 상호작용 분석, 또는 당해 분야에 공지된 다른 기법을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 항체는 그의 특성, 예컨대 항원-결합 활성, 항원-결합 특이성, 및 생물학적 기능을 측정하기 위해 일상적 방법에 따라 검사될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 항체는 예를 들어, 페길화, 과당화, 톡신의 컨쥬게이션, 방사성 라벨 등에 의해, 당해 분야에 공지되어 있으며 쉽게 이용가능한 추가적인 비단백질성 모이어티 (moiety) 를 함유하도록 변형될 수 있다. 혈청 반감기를 향상시킬 수 있는 변형이 관심 대상의 것이다.
돌연변이된 유도체의 예는 하기에 기재된다.
본 발명에 따르면, 하기를 포함하는 이중특이적 항체가 기재된다:
- SEQ ID NO: 20 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌에서 아스파르트산, D 로 돌연변이되어 있음)
- SEQ ID NO: 21 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌에서 리신, K 로 돌연변이되어 있음)
- SEQ ID NO: 22 에 상응하는 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 에서의 잔기는 트레오닌에서 아르기닌, R 로 돌연변이되어 있음)
- SEQ ID NO: 23 에 상응하는 돌연변이된 인간 카파 불변 도메인 (Kabat 위치 114 및 137 에서의 잔기는 각각 알라닌 (A) 및 아르기닌 (R) 임)
- SEQ ID NO: 24 에 상응하는 돌연변이된 인간 카파 불변 도메인 (Kabat 위치 114 및 137 에서의 잔기는 각각 알라닌 (A) 및 글루탐산 (E) 임)
- 또는 SEQ ID NO: 25 에 상응하는 돌연변이된 인간 카파 불변 도메인 (Kabat 위치 114 및 137 에서의 잔기는 각각 알라닌 (A) 및 아스파르트산 (D) 임).
또 다른 구현예에서, 하기 Kabat 위치에서의 잔기는 트라스투주마브의 VH 및 VL 서열에서 돌연변이될 수 있다:
VH 에서, Kabat 위치 31 에서, Asp 가 Glu 또는 Ser 로
VH 에서, Kabat 위치 32 에서, Thr 가 Ser, Asn 또는 Tyr 로
VH 에서, Kabat 위치 54 에서, Asn 가 Gln, His, Lys, Arg, Gly 또는 Ser 로
VH 에서, Kabat 위치 55 에서, Gly 가 Pro, Ala 및 Ser 로
VH 에서, Kabat 위치 61 에서, Asp 가 Glu 로
VH 에서, Kabat 위치 62 에서, Ser 가 Thr 로
VH 에서, Kabat 위치 95 에서, Trp 가 Tyr 또는 Phe 로
VH 에서, Kabat 위치 98 에서, Asp 가 Glu 로
VH 에서, Kabat 위치 99 에서, Gly 가 Pro 또는 Ala 로
VL 에서, Kabat 위치 28 에서, Asp 가 Glu 또는 Gly 로
VL 에서, Kabat 위치 29 에서, Val 가 Ile 또는 Leu 로
VL 에서, Kabat 위치 30 에서, Asn 가 Gln, His, Lys, Arg 또는 Ser 로
VL 에서, Kabat 위치 31 에서, Thr 가 Ser 로.
본 발명의 항체는 당화 (glycosylation) 될 수 있거나 그렇지 않을 수 있거나, 또는 다양한 당화 프로파일을 나타낼 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에서 비당화되지만 Fc 영역에서는 당화된다.
예를 들어, 세툭시마브의 VH 도메인에서 N-당화 부위를 제거하기 위해서, Kabat 위치 H85 에서의 Asn 은 서열 SEQ ID NO: 26 에 따라 아스파르트산 (D) 로 돌연변이되거나, 또는 Kabat 위치 H85 에서의 Asn 은 서열 SEQ ID NO: 27 에 따라 글루탐산 (E) 으로 돌연변이된다.
특정 돌연변이된 유도체는 그의 본래 형태로 쥣과동물 기원의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 가진 키메라 항체인 참조 세툭시마브 항체의 인간화된 형태를 사용할 수 있다. 인간화 접근방식에서, 공여체 마우스 가변 영역으로부터의 특정한 기타 아미노산 및 상보성 결정 영역 (CDR) 이 인간 가변성 수용체 영역에 그래프팅된 다음, 인간 불변 영역에 연결된다. 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); U.S. Pat. No. 5,225,539] 를 참조한다.
일부 예에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항체가 기재되어 있다:
- IMGT/Gene 데이타베이스에서 정의된 바와 같은 인간 면역글로불린 유전자 카파 가변성 6-11 대립유전자 02 (IGKV6-11*02) 를 기반으로 하는 세툭시마브의 경쇄 인간화 버젼,
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASESISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQNNNWPTTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:30)
여기서, 하기의 Kabat 위치에서 아미노산 잔기는 하기임:
Kabat 위치 L31, Thr 또는 Ser
Kabat 위치 L32, Asn 또는 Ser
Kabat 위치 L33, Ile 또는 Leu
Kabat 위치 L53, Glu 또는 Gln
Kabat 위치 L89, Gln 또는 His
Kabat 위치 L91, Asn, Ser, His, Lys 또는 Arg
Kabat 위치 L92, Asn, Ser, His, Lys 또는 Arg
Kabat 위치 L93, Asn, Ser, His, Lys 또는 Arg
Kabat 위치 L94, Trp, Tyr 또는 Phe
Kabat 위치 L96, Thr 또는 Tyr.
- IMGT/Gene 데이타베이스에서 정의된 바와 같은 인간 면역글로불린 유전자 카파 가변성 3-11 대립유전자 01 (IGKV3-11*01) 을 기반으로 하는 세툭시마브의 경쇄 인간화 버젼,
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSIGTNIHWYQQKPGQAPRLLIKYASESISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNNNWPTTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:31)
여기서, 하기의 Kabat 위치에서 아미노산 잔기는 하기임:
Kabat 위치 L29, Ile 또는 Val
Kabat 위치 L30, Gly 또는 Ser
Kabat 위치 L31, Thr 또는 Ser
Kabat 위치 L32, Asn 또는 Tyr
Kabat 위치 L33, Ile 또는 Leu
Kabat 위치 L34, His 또는 Ala
Kabat 위치 L49, Lys 또는 Tyr
Kabat 위치 L50, Tyr 또는 Asp
Kabat 위치 L53, Glu 또는 Asn
Kabat 위치 L54, Ser 또는 Arg
Kabat 위치 L55, Ile 또는 Ala
Kabat 위치 L56, Ser 또는 Thr
Kabat 위치 L91, Asn, Arg, His, 또는 Lys
Kabat 위치 L92, Asn, Ser, His, Lys 또는 Arg
Kabat 위치 L94, Trp, Tyr 또는 Phe
Kabat 위치 L96, Thr 또는 Tyr.
- IMGT/Gene 데이터베이스에서 정의된 바와 같은 인간 면역글로불린 유전자 중쇄 가변성 4-59 대립유전자 01 (IGHV4-59*01) 를 기반으로 하는 세툭시마브 mAb 의 중쇄 인간화 버젼
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTNYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPLTSRLTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:32)
여기서, 하기 Kabat 위치에서 아미노산 잔기는 하기임:
Kabat 위치 H29, Leu 또는 Ile
Kabat 위치 H30, Thr 또는 Ser
Kabat 위치 H31, Asn 또는 Ser
Kabat 위치 H33, Gly 또는 Tyr
Kabat 위치 H35, His 또는 Ser
Kabat 위치 H37, Val 또는 Ile
Kabat 위치 H48, Leu 또는 Ile
Kabat 위치 H50, Val 또는 Tyr
Kabat 위치 H52, Trp, Tyr 또는 Phe
Kabat 위치 H53, Ser 또는 Tyr
Kabat 위치 H54, Gly 또는 Ser
Kabat 위치 H56, Asn 또는 Ser
Kabat 위치 H58, Asp 또는 Asn
Kabat 위치 H61, Thr 또는 Pro
Kabat 위치 H62, Pro 또는 Ser
Kabat 위치 H64, Thr 또는 Lys
Kabat 위치 H67, Leu 또는 Val
Kabat 위치 H73, Asn 또는 Thr
Kabat 위치 H78, Val 또는 Phe.
- IMGT/Gene 데이타베이스에서 정의된 바와 같은 인간 면역글로불린 유전자 중쇄 가변성 3-33 대립유전자 01 (IGHV3-33*01) 를 기반으로 하는 세툭시마브 mAb 의 중쇄 인간화 버젼
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAVSGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPVTSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:33)
여기서, 하기 Kabat 위치에서 아미노산 잔기는 하기임:
Kabat 위치 H28, Ser 또는 Thr
Kabat 위치 H30, Thr 또는 Ser
Kabat 위치 H48, Leu 또는 Val
Kabat 위치 H49, Gly 또는 Ala
Kabat 위치 H53, Ser 또는 Asp
Kabat 위치 H55, Gly 또는 Ser
Kabat 위치 H57, Lys 또는 Thr
Kabat 위치 H58, Asp 또는 Tyr
Kabat 위치 H60, Asn 또는 Ala
Kabat 위치 H61, Thr 또는 Asp
Kabat 위치 H62, Pro 또는 Ser
Kabat 위치 H64, Thr 또는 Lys
Kabat 위치 H65, Ser 또는 Gly
Kabat 위치 H78, Val 또는 Leu.
항체의 생성
본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산은 발현 벡터 내에 삽입된다. 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터에서 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 사슬을 인코딩하는 DNA 조각은, 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들) 에서의 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 이러한 조절 서열은 신호 서열, 프로모터, 인핸서 및 전사 종결 서열을 포함한다. 발현 벡터는 통상, 숙주 염색체 DNA 의 필수 부분으로서 또는 에피솜으로서 숙주 유기체에서 복제가능하다. 흔히, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출이 가능하도록 선택 마커, 예를 들어, 테트라사이클린 또는 네오마이신을 함유할 것이다.
한 예에서, 중쇄 및 경쇄-코딩 서열 (예를 들어, VH 및 VL, VH-CH1 및 VL-CL, 또는 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 인코딩하는 서열) 둘 모두는 하나의 발현 벡터에 포함된다. 또 다른 예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄 각각은 개별 벡터에 클로닝된다. 후자의 경우, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 발현 벡터는 두 사슬 모두의 발현을 위해 하나의 숙주 세포에 동시-트랜스펙션될 수 있는데, 이는 조립되어 생체내 또는 시험관내에서 온전한 항체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 중쇄를 인코딩하는 발현 벡터 및 경쇄를 인코딩하는 발현 벡터는 각각의 중쇄 및 경쇄의 발현을 위해 상이한 숙주 세포 내에 도입될 수 있는데, 이는 그런 다음 정제 및 조립되어 시험관내에서 온전한 항체를 형성할 수 있다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 3 개의 독립적인 발현 벡터, 예컨대 플라스미드로 동시-트랜스팩션되어, 모든 3 개의 사슬 (즉 각각 중쇄 HC, 및 2 개의 경쇄 LC1 및 LC2) 의 동시생성, 및 이중특이적 항체의 분비를 초래한다.
더욱 특히 3 개의 벡터는 2:1:1 의 분자비 (HC : LC1 : LC2) 로 유리하게 사용될 수 있다.
본원에 기재된 항체의 발현을 위한 재조합 벡터는 통상, 구성적 또는 유도성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 항체 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 함유한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물, 또는 둘 모두에서 복제 및 혼입에 적합할 수 있다. 통상적인 벡터는 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 항체를 인코딩하는 핵산의 발현 제어에 유용한 프로모터를 함유한다. 벡터는 임의로는, 적어도 하나의 독립적인 종결자 서열, 진핵생물 및 원핵생물 둘 모두에서 카세트의 복제를 허용하는 서열 (즉, 셔틀 벡터), 및 원핵 및 진핵 시스템 둘 모두에 대한 선택 마커를 함유하는 일반 발현 카세트를 함유한다.
본원에서 기재한 바와 같은 이중특이적 항체는 원핵 또는 진핵 발현 시스템, 예컨대 박테리아, 효모, 사상균, 곤충 및 포유동물 세포에서 생성될 수 있다. 본 발명의 재조합 항체를 진핵 세포에서 당화 또는 발현시킬 필요는 없으나; 포유동물 세포에서의 발현이 일반적으로 바람직하다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 인간 배아 신장주 (293 세포), 어린 햄스터 신장 세포 (BHK 세포), 중국 햄스터 난소 세포/- 또는 + DHFR (CHO, CHO-S, CHO-DG44, Flp-in CHO 세포), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO 세포), 및 인간 간 세포 (Hep G2 세포) 이다.
온전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 수많은 적합한 숙주 세포주가 당해 분야에서 개발되었으므로, 포유동물 조직 세포 배양은 폴리펩티드를 발현 및 생성시키기에 바람직하며, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는 골수종 세포주, 또는 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마를 포함한다.
가장 바람직한 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 CHO 세포주, 가장 유리하게는 CHO-S 또는 CHO-DG-44 세포주 또는 그의 유도체를 사용하여 생성된다.
이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대 복제 기원, 프로모터 및 인핸서, 및 필요한 프로세싱 정보 위치, 예컨대 리보솜 결합 위치, RNA 스플라이스 위치, 폴리아데닐화 위치, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등에서 유래한 프로모터이다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 중쇄 및 경쇄 인코딩 서열 및 발현 조절 서열) 을 함유하는 벡터는, 세포 숙주 유형에 따라 가변적인 공지된 방법에 의해 숙주 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어 인산칼슘 처리 또는 전기천공을 다른 세포 숙주에 대해 사용할 수 있다 (일반적으로, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989) 참조). 중쇄 및 경쇄가 별개의 발현 벡터에서 클로닝되는 경우, 벡터는 동시-트랜스펙션되어 온전한 면역글로불린의 발현 및 조립이 수득된다.
숙주 세포는 (예를 들어, 화학적 트랜스펙션 또는 전기천공 방법에 의해) 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션되며, 프로모터 유도, 형질전환체 선택, 또는 원하는 서열 인코딩 유전자의 증폭을 위해 종래의 영양 배지 (또는 적절하게 변형된 배지) 에서 배양된다.
항체의 발현은 일시적이거나 안정할 수 있다.
바람직하게는 이중특이적 항체는, BiXAb-3486, BiXAb-3489, BiXAb-3732SS 및 BiXAb-E06528 과 같은 이중특이적 항체의 모든 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 DNA 로 안정적으로 트랜스펙션된 세포주가 지속 발현할 수 있어, 치료제 제조를 가능하게 하는, 안정 발현의 방법에 의해 생성된다. 예를 들어 CHO 세포주에서의 안정 발현이 특히 유리하다.
발현되고 나면, 본 발명의 전체 항체, 그의 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄, 또는 다른 면역글로불린 형태는 추가 검정 및 적용을 위해 실질적으로 균질한 제조물이 수득되도록 추가 단리 또는 정제될 수 있다. 당해 분야에서 공지된 표준 단백질 정제 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 정제 절차는 면역친화성 또는 이온교환 컬럼 상의 분별화, 에탄올 침전, 고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE), 황산암모늄 침전, 및 겔 여과를 포함할 수 있다 (일반적으로, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982) 참조). 약학적 용도를 위해, 적어도 약 90 내지 95% 균질성의 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하고, 98 내지 99% 이상 균질성의 실질적으로 순수한 면역글로불린이 가장 바람직하다.
시험관내 생성은 다량의 본 발명의 원하는 이중특이적 항체가 제공되도록 규모 확대 (scale-up) 를 허용한다. 이러한 방법은 예를 들어 에어리프트 (airlift) 반응기 또는 연속 교반기 반응기에서 균질한 현탁 배양, 또는 예를 들어 중공 섬유, 마이크로캡슐에서, 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에서 고정 또는 포획된 세포 배양을 이용할 수 있다.
치료적 용도:
본 발명의 이중특이적 항체는 종양 성장 저해를 유도하는 것으로 나타나져 있다.
본 발명의 이중특이적 항체는 특히 암을 치료하는데 있어서 약제로서 유용하다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "암" 은 임의의 암, 특히 췌장암, 및 EGFR 또는 HER2 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 임의의 다른 암, 및 특히 EGFR 과 HER2 양자 모두의 동시-발현을 특징으로 하는 이들 암을 포함한다.
일부 구현예에서 암은 야생형 KRAS 유전자를 갖는 세포를 포함한다.
암의 예는 고형 종양, 예컨대 췌장암, 평편세포 암종을 비롯한 두경부암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 위암, 난소암이다.
따라서, 암으로 고통받는 환자의 치료 방법으로서, 본 발명에 따른 항체를 이러한 치료를 필요로 하는 상기 환자에게 투여함에 의한 치료 방법이 기재된다. 본 발명의 또 다른 양태는 따라서, 암 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 용도이다.
본 발명의 한 양태는, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물이다. 본 발명의 또 다른 양태는, 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다. 본 발명의 추가 양태는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 약학적 담체와 함께 제형화된, 본원에서 정의한 바와 같은 항체를 함유하는 조성물, 예를 들어 약학 조성물을 제공한다.
본원에서 사용하는 바와 같이, "약학적 담체"는 생리학적으로 양립가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여 (예를 들어 주사 또는 주입에 의함) 에 적합하다.
본 발명의 조성물은 당해 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 경로 및/또는 투여 방식은 원하는 결과에 따라 가변적일 것이다.
특정한 투여 경로에 의해 본 발명의 이중특이적 항체를 투여하기 위해, 본 발명의 이중특이적 항체를 그의 불활성화를 방지하도록 하는 물질로 코팅하거나, 본 발명의 이중특이적 항체를 그의 불활성화를 방지하도록 하는 물질과 동시-투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체는 적절한 담체, 예를 들어 리포좀, 또는 희석제 중 대상에게 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제는 염수 및 완충 수용액을 포함한다. 약학적 담체는 멸균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말 및 멸균 수용액 또는 분산액을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 용도는 당해 분야에 공지되어 있다.
이들 조성물은 또한, 아쥬반트 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 멸균 절차, 및 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함 둘 모두에 의해 보장될 수 있다. 또한, 등장제, 예컨대 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 작용제의 포함에 의해 주사가능 약학적 형태의 연장된 흡수가 초래될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이 없이, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양이 수득되도록 가변적일 수 있다.
선택된 투여량 수준은, 이용한 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 치료 지속기간, 이용한 특정 조성물과 조합으로 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료하는 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반적인 건강 및 이전 병력 및 의술에서 널리 공지된 기타 인자를 포함하는 다양한 약동학적 인자에 따라 의존적일 것이다. 예를 들어 본 발명의 이중특이적 항체는 3 회/주 내지 1 회/개월로 0.2-20 mg/kg 의 투여량으로 투여될 수 있다.
따라서, 상기 일반적으로 기재된 본 발명은, 예시로서 제공되며 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 하기 실시예를 참조로 하여 보다 용이하게 이해될 것이다. 실시예는 하기의 실험이 모두 또는 유일한 수행된 실험이라는 것을 나타내려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 본 발명의 이중특이적 항체 BiXAb-3486, BiXAb-3489 및 BiXAb-3732SS 의 제조
유전자 합성
항-HER2 (트라스투주마브, 클론 humAb4D5-8) ((Carter P., Presta L., Gorman C.M., Ridgway J.B., Henner D., Wong W.L., Rowland A.M., Kotts C., Carver M.E., Shepard H.M. (1992) Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 15, 4285-4289) 및 항-EGFR (세툭시마브) ((Humblet Y. (2004). Cetuximab: an IgG1 monoclonal antibody for the treatment of epidermal growth factor receptor expressing tumors. Expert Opin Pharmacother 5: 1621-1633.) 의 아미노산 서열을, GeneScript 프로그램을 사용하여 포유동물 발현에 대한 코돈 최적화 후 DNA 서열을 설계하는데 사용하였다. 중쇄에 대해, 신호 펩티드, Fab1 의 가변 영역 및 불변 CH1 도메인, 뒤이어 슈도 힌지 링커 및 Fab2 의 가변 영역 및 불변 CH1 도메인 (제한 효소 소화를 위한 측면위치 서열 가짐) 을 인코딩하는 DNA 를 GeneScript 에 의해 합성하였다. 경쇄에 대해, 신호 펩티드 및 가변 및 불변 카파 영역을 인코딩하는 DNA 를 GeneScript 에 의해 합성하였다.
PfuTurbo Hot Start 를 사용하는 PCR 반응을 실행하여, 중쇄 및 경쇄 각각에 대해서 NotI + ApaI 및 NotI + HindIII 에 의해 소화된 삽입물을 증폭하였다. 이중 소화된 중쇄 단편을, 인간 IgG1 CH1 + 힌지 + CH2 + CH3 도메인이 이미 삽입된, NotI + ApaI 처리된 pcDNA3.1 발현 벡터 (Invitrogen) 와 라이게이션하였다. 이중 소화된 경쇄 단편을 NotI + HindIII 처리된 pcDNA3.1 발현 벡터 (Invitrogen) 와 라이게이션하였다. 플라스미드 DNA 를 이중 가닥 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
변이체의 발현 및 정제
본 발명의 이중특이적 항체 (또한 "BiXAb" 분자로서도 지칭) 을, 현탁액 중 무혈청 배지 (CHO SFM-II 배지, Life Technologies™) 에 적합화된 CHO-S 세포에서 2:1:1 = HC:LC1:LC2 분자비로 별개의 벡터 상 코딩된 3 개 유전자 (1 개의 연속적인 중쇄 (HC) 및 2 개의 경쇄 (LC)) 를 동시-트랜스펙션시킴으로써 일시적 유전자 발현으로 생성시켰다. 통상, 50 ㎖ 배지 스케일 발현 시험을 위해, 총 50 ㎍ 의 플라스미드 DNA (25 ㎍ 중쇄1, 12.5 ㎍ 의 트라스투주마브 (항-HER2) 경쇄 및 12.5 ㎍ 의 세툭시마브 (항-EGFR) 경쇄) 를 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에서 혼합하고, 25 ㎕ 의 3 mg/㎖ PEI 트랜스펙션 시약 (Polyplus) 을 함유하는 1 ㎖ 의 CHO SFM 배지를 첨가하였고, 실온에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. DNA-PEI 의 혼합물을 125 ㎖ 진탕 플라스크 내 1~2 x 106/㎖ 에서 49 ㎖ 의 Life Technologies 의 Invitrogen FreeStyleTM CHO-S 세포에 로딩하였다. 세포를 6 일 더 진탕하였다. 세포를 3,000 rpm 에서 15 분 동안 원심분리하여 상청액을 수확하였다. 상청액 중 BiXAb 의 발현 역가를 ForteBio 의 단백질 A 바이오센서 (Octet® Systems) 를 이용하여 측정하였다. 이어서 이중특이적 모노클로날 항체 (BiXAb) 를 MabSelect SuRe (GE Healthcare Life Sciences) 를 이용하여 단백질 A 친화성 배지 상에서 정제하였다. 항체를 0.1 M 글리신 pH 3.5 를 사용하여 단백질 A 로부터 용리하고, 1 M TRIS 에서 중화하였다. Dulbecco PBS (Lonza BE17-512Q) 중 정제된 항체를 멸균-여과 (0.2 μM 멸균 필터, Techno Plastic Products AG) 하고, Eppendorf BioSpectrometer® 를 이용해 280 nm 에서 OD 판독함으로써 최종 농도를 측정하였다.
SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석
정제된 BiXAb-3486, BiXAb-3489, 및 BiXAb-3732SS 항체의 SDS-PAGE 분석을 BioRad 의 Experion™ 자동화 전기영동 시스템을 이용하여 수행하였다. 완충제 중 나트륨 라우릴술페이트 (SDS) 의 존재 하에서, 항체가 겔에서 이동하는 속도는 주로 분자량 결정을 가능하게 하는 그의 크기에 따라 좌우된다.
SDS-PAGE 프로파일을 도 2a 및 2b 에 제시한다. 도 2a 에서 레인 1 및 2 는 각각 BiXAb-3732SS 및 BiXAb-3489 에 대한 미환원 (좌) 및 환원 (우) 조건 하에서 수득된 프로파일을 나타낸다. 도 2b 는 BiXAb-3486 에 대한 SDS-PAGE 프로파일 (환원 및 미환원) 을 나타낸다.
미환원 조건 하에서, 항체의 4차 구조는 유지되고, 관찰된 분자 질량은 상이한 중쇄 및 경쇄의 분자량의 합계를 나타내어야 한다.
본 발명의 이중특이적 항체 포맷은 6 개의 사슬: 2 개의 중쇄 및 4 개의 경쇄로 이루어진다. 번역후 변형 (PTM), 예를 들어 N-당화를 고려하지 않고, BiXAb-3486, BiXAb-3489, 및 BiXAb-3732SS 에 대한 이론적인 분자 질량은 각각 245.50, 245.44 및 245.451 kDa 이다. 미환원 겔 (도 2a 및 2B) 을 공지된 분자 질량의 표준을 이용하여 보정하였다. 레인 1 및 2 (도 2a) 에서 수득한 프로파일 및 레인 1 에서 수득한 프로파일 (도 2b) 은 260 kDa 표준 분자량 이상에서 주된 광범위한 밴드를 나타내고, 이는 PTM 없이 245 kDa 의 산출된 분자량에 따르는 것이다. BiXAb-3489, BiXAb-3732SS, 및 BiXAb-3486 은 이들의 중쇄 내에 4 개의 N-당화 부위, 즉 N297 에서 모든 통상적인 모노클로날 항체에서 발견되는 바와 같이 Fc 영역에서 2 개 (각 중쇄에 하나씩) 및 각 Fab 에서 2 개 (N88 에서 세툭시마브의 가변 영역에서 각 중쇄에 하나씩) 를 갖는다.
미환원 조건 하에, 환원제 디티오트레이톨 (DTT) 은 디술파이드 연결을 환원시킴으로써 BiXAb 단백질을 추가로 변성시키고, BiXAb 분자의 4차 구조를 파괴한다.
6 개의 폴리펩티드 사슬은 그들의 상대 분자 질량에 따라 겔에서 개별적으로 이동한다; 정확히 동일한 분자 질량을 갖는 2 개의 중쇄 및 항-EGFR 및 항-HER2 Fab 도메인으로부터의 2 쌍의 경쇄.
환원된 겔에서 수득된 프로파일은 분자량 표준의 이동도에 기초하여 2 그룹의 주요 밴드, 하나는 약 75 kDa 및 다른 하나는 약 25 kDa 의 존재를 입증한다. 상기 섹션에서 논의된 바와 같이, 각각의 중쇄는 2 개의 N-당화 부위를 지니는데, 이는 당화된 단백질의 전형적인 표지인 밴드의 광범위함 및 계산된 질량보다 더 큰 이의 겉보기 분자 질량을 설명한다.
항-EGFR (23.425 kDa) 및 항-HER2 (23.443 kDa) 경쇄의 계산된 분자 질량이 유사하지만, 이들은 각 경쇄의 유체역학 특성 차이로 인해 아마도 겔 상에서의 분리가 가능하다.
모든 분자, BiXAb-3486, BiXAb-3489, 및 BiXAb-3732SS 는 CHO 세포에서 일시적 발현을 통해 양호한 발현 수준 (~ 200 mg/L) 을 지닌다. 상기 발현 수준은 부모 항체 중 하나, 항-EGFR 의 것과 같이 종래의 모노클로날 항체에서 관찰되는 발현 수준과 비슷하다.
결론적으로, BiXAb-3486, BiXAb-3489, 및 BiXAb-3732SS 에 대한 SDS-PAGE 분석으로 수득한 프로파일은 매우 유사하고, 계산된 이론 분자량과 일치한다. 분자 질량 차이는 아마도 PTM 의 존재, 특히 2 개의 중쇄에서 4 개의 N-당화 부위의 존재에 기인한다.
크기 배제 크로마토그래피 분석
조작된 단백질 분자에서 단백질 응집이 빈번하게 관찰된다. 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 를 수행하여, 단일-단계 친화성-정제된 BiXAb-3489 및 BiXAb-3732SS 제조물의 고분자량 종류 함량을 검정하였다. SEC-s3000 (300 x 7.8 mm) 컬럼 (BioSep) 및 Aktapurifier 10 시스템 (GE Healthcare) 을 이용하였고; PBS 완충액 pH 7.4 를 사용하여 1 ㎖/분의 유속으로 검정을 수행하였다.
도 3a 및 3b 에 나타낸 SEC 크로마토그램은 각각 총 샘플의 96.4% 및 97.4% 를 나타내는 두 크로마토그램에서의 주요 피크가 단량체성 BiXAb-3489 및 BiXAb-3732SS 의 예상된 크기에 상응하였다는 것을 입증하였다. 또한, 더 높은 분자량 종류 (가능하게는 이량체) 에 상응하는 작은 피크가 BiXAb-3489 및 BiXAb-3732SS 에 대해서 관찰되었으며; 이러한 피크는 각각 총 샘플의 3.6% 및 2.6% 를 나타내었다. 따라서, 더 높은 분자량 종류의 백분율 함량이 주요하지 않으며, CHO 발현 시스템에서 생성된 종래의 모노클로날 항체와 유사하다고 결론내려졌다. 단량체성 피크의 좁고 대칭인 형상은, BiXAb-3489 및 BiXAb-3732SS 양자 모두가 올바르게 조립되었으며 단일 종류를 나타내었다는 것을 시사하였다.
실시예 2. 본 발명의 이중특이적 항체 BiXAb-E06528 의 제조
유전자 합성
GeneScript 프로그램을 사용하여, 포유동물 발현에 대한 코돈 최적화 후, 항-EGFR (세툭시마브) 및 항-HER2 (트라스투주마브) 의 아미노산 서열을 사용하여 DNA 서열을 설계하였다. 이들 항체를 "부모" 항-EGFR 및 "부모" 항-HER2 mAb 로서 지칭한다.
중쇄의 DNA 구축물을 이와 같이 설계하였다: 신호 펩티드, 뒤이어 가변 영역, 이후 Fab1 의 불변 CH1 도메인 (항-HER2), 뒤이어 AP 링커, 이후 가변 영역, 이어서 Fab2 의 불변 CH1 도메인 (항-EGFR) (여기서 Kabat 위치 192 에서 돌연변이 Thr 에서 Glu 가 도입됨) 으로 이루어진 서열; 제한 효소 소화를 위한 측면위치 서열이 중쇄 DNA 구축물의 양 말단에 도입됨. 경쇄에 대한 DNA 구축물을 이와 같이 설계하였다: 신호 펩티드, 뒤이어 가변 영역, 이후 불변 카파 영역. 항-EGFR 경쇄에 대해, 불변 카파 도메인에서 Kabat 위치 137 (Asn 에서 Lys) 및 114 (Ser 에서 Ala) 에 돌연변이가 도입되었다. 모든 DNA 구축물을 Gene Art 에 의해 합성하였다.
PfuTurbo Hot Start 을 사용하는 PCR 반응을 실행하여, 각각 중쇄 및 경쇄에 대해 NotI 및 ApaI, 및 NotI 및 HindIII 로 소화된 삽입물을 증폭하였다. 이중 소화된 중쇄 단편을, 인간 IgG1 힌지 이후 CH2-CH3 도메인이 이미 삽입된, NotI 및 ApaI 처리된 pcDNA3.1 발현 벡터 (Invitrogen) 와 라이게이션하였다. 이중-소화된 경쇄 단편을 NotI 및 HindIII 처리된 pcDNA3.1 발현 벡터 (Invitrogen) 와 라이게이션하였다. 플라스미드 DNA 를 이중 가닥 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
발현 및 정제
이중특이적 항체 BiXAb-E06528 을, 현탁액 중 무혈청 배지 (CHO SFM-II 배지, Life TechnologiesTM) 에 적합화된 CHO-S 세포에서 2:1:1 = HC:LC1:LC2 분자 비로 별개의 벡터 상 코딩된 3 개 유전자 (1 개의 연속적인 중쇄 (HC) 및 2 개의 경쇄 (LC)) 를 동시-트랜스펙션시킴으로써 일시적 유전자 발현을 이용하여 생성시켰다. 통상, 50 ㎖ 스케일 발현을 위해, 총 50 ㎍ 의 플라스미드 DNA (25 ㎍ 중쇄, 12.5 ㎍ 의 항-HER2 경쇄 및 12.5 ㎍ 의 항-EGFR 경쇄) 를 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에서 혼합한 후, 25 ㎕ 의 3 mg/㎖ PEI 트랜스펙션 시약 pH7.0 (Polyplus) 을 함유하는 1 ㎖ 의 CHO SFM 배지를 첨가하고, 반응물을 실온에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. DNA-PEI 혼합물을 이후 125 ㎖ 진탕 플라스크에서 1~2x 106/㎖ 에서 49 ㎖ 의 Life Technologies 의 Invitrogen FreeStyleTM CHO-S 세포에 첨가하였다. 세포를 6 일 동안 진탕하였다. 3,000 rpm 에서 15 분 동안 원심분리하여, 상청액을 수확하였다. 상청액 중 BiXAb-E06528 의 발현 역가를, ForteBio 의 단백질 A 바이오센서 (Octet® Systems) 를 사용하여 측정하였다. 이어서, BiXAb-E06528 을 단백질 A 친화성 수지 (MabSelect SuRe, GE Healthcare Life Sciences) 상에서 정제하였다. 항체를 0.1 M 글리신 pH 3.5 를 사용하여 단백질 A 로부터 용리하고, 용리물을 1 M TRIS 에 의해 중화하였다. Dubecco PBS (Lonza) 중 정제된 항체를 멸균-여과 (0.2 μM 멸균 필터, Techno Plastic Products AG) 하고, 280 nm 에서 광학 밀도 (OD) 를 판독하여 최종 농도를 측정하였다 (Eppendorf BioSpectrometer®).
BiXAab-E06528 은 일시적 CHO 발현에서 통상 양호한 발현 역가 (> 180 mg / 리터) 를 나타내었다. 이러한 발현 수준은 종래의 모노클로날 항체에서 관찰된 발현 수준과 비슷하다.
SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
정제된 BiXAb-E06528 의 품질을 평가하기 위해, SDS-PAGE 를 수행하였다. 작동 완충액 중 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 의 존재 하에, 항체가 겔에서 이동하는 속도는 주로 분자량 결정을 가능하게 하는 그의 크기에 따라 좌우된다. 이러한 검정을 미-환원 조건 및 환원 조건 하에 수행하였고; 후자는 디술파이드 결합을 파괴하게 하여, 그에 따라 개별 폴리펩티드 사슬 (경쇄 및 중쇄) 을 육안으로 관찰 가능하게 한다.
SDS-PAGE 데이터를 도 2c 에서 나타낸다. 미-환원 조건 하에, 항체의 4차 구조가 유지되며, 관찰된 분자량은 상이한 중쇄 및 경쇄의 분자량의 합계를 나타내어야 한다. 본 발명의 이중특이적 항체 (BiXAb-E06528) 는 6 개의 사슬: 2 개의 중쇄 및 4 개의 경쇄로 이루어진다. 번역후 변형 (PTM), 예를 들어 아스파라긴 297 에서 Fc 에서의 N-당화를 고려하지 않고, BiXab-E06528 의 이론적 분자량은 245.139 kDa 이다. 공지된 분자량의 표준물의 혼합물을 사용하여 겔을 보정하였다. 미-환원 데이터는 Fc 도메인 내 위치 297 에서의 2 개 아스파라긴의 예상된 당화 및 계산된 분자량에 부합되는 250 kDa 분자량 표준물에 근접하게 흐르는 주요 밴드를 나타낸다. 환원 조건 하에, 디티오트레이톨 (DTT) 은 디술파이드 연결을 환원시키고 4차 구조를 파괴함으로써 BiXAb-E06528 을 추가로 변성시키고, 따라서 6 개의 폴리펩티드 사슬이 그의 분자량에 따라 겔에서 개별적으로 이동하게 된다. BiXAb-E06528 의 2 개의 동일한 중쇄는 단일 밴드로서 동시 이동하고, 경쇄의 2 개 쌍은, 그의 거의 동일한 분자량으로 인해, 두 번째 밴드로서 동시 이동한다. 따라서 데이터는, 분자량 표준물의 이동성을 기준으로, 대략 75 kDa 및 25 kDa 에서 2 개의 주요 밴드 그룹을 나타낸다. 각각의 중쇄는 아스파라긴 297 에서 1 개의 N-당화 위치를 갖는데, 이는 더 높은 분자량 밴드의 광범위함 및 계산된 것보다 약간 더 높은 관찰된 분자량 (75.701 kDa) 을 설명하는 것이며; 이러한 광범위함은 당화된 단백질에 대해 전형적인 것이다. 항-HER2 (23.443 kDa) 및 항-EGFR (23.425 kDa) 의 경쇄의 계산된 분자량은 유사하며, 이들은 아마도 각 경쇄의 유체역학 특성 차이로 인해 겔 상에서 분리를 허용한다.
결론적으로, BiXAb-E06528 의 SDS-PAGE 는 미환원 및 환원 조건 둘 모두 하에서 예상된 프로파일을 나타내었고, 중쇄에서 N-당화 위치의 존재를 고려시, 계산된 이론적 분자량과 일치하였다.
크기 배제 크로마토그래피 분석
조작된 단백질 분자에서 단백질 응집이 빈번하게 관찰된다. 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 를 수행하여, 단일-단계 친화성-정제된 BiXAb-6567 제조물의 고분자량 종류 함량을 검정하였다 (변이체의 발현 및 정제 참조). SEC-s3000 (300 x 7.8 mm) 컬럼 (BioSep) 및 Aktapurifier 10 시스템 (GE Healthcare) 을 이용하였고; PBS 완충액 pH 7.4 를 사용하여 1 ㎖/분의 유속으로 검정을 수행하였다.
도 3c 에 나타낸 SEC 크로마토그램은 주요 피크가 단량체성 BiXAb-E06528 의 예상된 크기에 상응하였다는 것을 입증하였으며; 이러한 피크는 총 샘플의 99.9% 를 나타내었다. 따라서, BiXAb-E06528 은 응집체 또는 고분자량의 종을 나타내지 않고, 단일의 단계 친화성 크로마토그래피 후 균질 항체로서 생성될 수 있다. 단량체성 피크의 좁고 대칭인 형상은, BiXAb-E06528 이 올바르게 조립되었으며 단일 종류를 나타내었다는 것을 시사하였다.
실시예 3. 시차 주사 열량측정에 의한 특성규명
시차 주사 열량측정 (DSC) 을 사용하여, BiXAb-3489, 부모 항-HER2 mAb 및 부모 항-EGFR mAb 의 열 안정성을 비교하였다. MicrocalTM VP-Capillary DSC 시스템 (Malvern Instruments) 을 사용하여 시차 주사 열량측정 실험을 수행하였다.
모든 샘플을 원심분리하고 (20,000x g, 5 분, 4℃), IgG 분석 프로그램을 이용하는 Nanodrop ND-1000 분광측정기 (Thermo Scientific) 를 사용하여 DSC 분석 전에 그의 단백질 함량을 정량하였다. 검정을 위해, 모든 샘플을 1 mg/㎖ 의 최종 농도로 PBS 중 희석하였다.
예비-평형 시간은 3 분이었고, 20 내지 110℃ 에서 60℃/시간의 스캔 속도, 25 초의 필터링 기간 및 미듐 피드백에서, 생성 온도기록도를 획득하였다. 샘플 분석 전에, 5회 완충액/완충액 스캔을 측정하여 기기를 안정화하고, 각각의 단백질/완충액 스캔 사이에 완충액/완충액 스캔을 수행하였다. 사전- 및 후-전이를 기준선을 제하여 조정하여, 데이터를 비-2-상태 미폴딩 (non-2-state unfolding) 모델에 피팅하였다.
도 4 에서 나타낸 DSC 곡선 (50 내지 100℃ 범위 커버) 은 개별 Fv 영역이 상이한 Fab 미폴딩 프로파일을 초래할 수 있는 방식을 입증하였으며; 이러한 실험은 또한 Fv 영역이 Fab 의 겉보기 안정성을 좌우한다는 것을 입증하였다.
항-HER2 mAb 의 DSC 프로파일은 2 개 전이를 나타내었는데: 작은 피크는 27 Kcal/몰/℃ 의 Cp max 및 70.4℃ 의 Tm1 을 가지며 CH2 도메인의 미폴딩에 상응하고, 큰 피크는 152 Kcal/몰/℃ 의 Cp max 및 80.4℃ 의 Tm2 를 가지며 CH3 도메인과 Fab 도메인 양자의 미폴딩에 상응한다. 항-EGFR mAb 의 DSC 프로파일은 2 개 전이를 나타내었는데: 큰 피크는 95 Kcal/몰/℃ 의 Cp max 및 71.9℃ 의 Tm1 을 가지며 CH2 및 Fab 도메인 둘 모두의 미폴딩에 상응하고, 작은 피크는 22 Kcal/몰/℃ 의 Cp max 및 82.4℃ 의 Tm2 를 가지며 CH3 도메인의 미폴딩에 상응한다.
BiXAb-3489 의 DSC 프로파일은 또한 2 개의 큰 피크를 갖는 2 개 전이를 나타내었다. 첫 번째 피크는 70 Kcal/몰/℃ 의 Cp max 및 71.7℃ 의 Tm1 을 가졌으며 항-EGFR mAb 의 CH2 및 Fab 도메인의 미폴딩에 상응하였고; 두 번째 피크는 161 Kcal/몰/℃ 의 Cp max 및 80.9℃ 의 Tm2 를 가졌으며 항-HER2 mAb 의 CH3 및 Fab 도메인의 미폴딩에 상응하였다. 따라서, BiXAb-3489 의 DSC 프로파일은 2 개 부모 mAb 의 2 개 DSC 프로파일의 중첩과 유사하였으며, BiXAb-3489 의 우수한 조립 및 안정성을 보여주었다. BiXAb-3489 의 Tonset (개시 온도) (60.0℃) 는 부모 mAb 의 개시 온도 (항-HER2 Tonset=63.1℃ 및 항-EGFR Tonset=61.5℃) 와 유사하였는데, 이는 BiXAb-3489 이 부모 항체와 유사한 안정성 특성을 가졌다는 것을 나타낸다.
정의:
Tm 또는 변성/용융 온도는 미폴딩 및 폴딩된 종류의 농도가 동일한 지점이며, 미폴딩 전이의 중간 지점이다. 매개변수로서, 이는 열 변성에 대한 단백질의 민감성을 설명하며, 따라서 단백질의 안정성에 관한 것이다. Tm 이 더 높을수록 단백질이 더 안정하다.
Tonset 은 미폴딩 전이가 시작되는 온도이다. 이 매개변수에 대한 값은 통상 Tm 보다 5 내지 10℃ 더 낮다. 이는 또한 단백질 안정성을 설명하지만, 열 변성에 대한 저항성에 관련된 매개변수이다.
실시예 4. 무세포 결합 특성
이중 (dual) 항원-결합 ELISA 검정
1x PBS pH7.4 로 희석하여 제조한 2 ㎍/㎖ 의 재조합 인간 Fc-태깅된 (tagged) HER2 (Bio-techne) 100 ㎕ 을 이용하여 Maxisorp 플레이트를 4℃ 에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 1x PBST 로 5 회 세척한 다음, 실온에서 2 시간 동안 1x PBS 중 200 ㎕/웰 1% BSA 로 블로킹하였다. 플레이트를 1 x PBST 로 5 회 세척하였다. BiXAb-3486 및 BiXAb-3489 (2 ㎍/㎖ 에서 출발) 의 1x PBS 중 8-포인트 3배 단계 희석물을 제조하고, 100 ㎕ 의 각 단계 희석물을 검정 웰 당 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 후속해서 1x PBST 로 5 회 세척했다. 1x PBS 중 1 ㎍/㎖ 비오티닐화 인간 EGFR (AcroBiosystems) 100 ㎕/웰을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 1 x PBST 로 5 회 세척 후, 1x PBS 로 희석하여 제조한 0.1 ㎍/㎖ 의 스트렙타비딘-컨쥬게이션된 HRP (Bio-techne) 100 ㎕/웰을 첨가했다. 플레이트를 실온에서 1 시간 인큐베이션하였다. 5 회 1x PBST 로 세척 후, 1x PBS 중 TMB 기질 100 ㎕/웰을 발색 판독을 위해 첨가하고, 플레이트를 10 분 동안 실온에서 발색을 위해 인큐베이션하였다. 검정 데이터를 Victor2 마이크로플레이트 판독기 (Perkin Elmer) 를 650 nm 에서 이용하여 수집하였다.
BiXAb-3486 및 BiXAb-3489 는 이중 ELISA 포맷에서 중복된 용량-의존적 결합 곡선을 나타내었는데, 이는 이들이 올바르게 조립된 항-HER2 및 항-EGFR Fab 도메인을 가졌다는 점을 시사한다 (도 5). 이것은 BiXAb-3486 와 BiXAb-3489 양자 모두가 각각 100 ng/㎖ 및 106 ng/㎖ 의 EC50 으로 동시에 HER2 및 EGFR 에 결합할 수 있는 이중특이적 항체인 것을 입증하였다. 부모 항-HER2 는 상기 이중 ELISA 포맷에서 예상대로 결합을 나타내지 않았다.
실시예 5. SPR 에 의한 결합 매개변수의 측정
SPR 분광을 T200GxP 기기 (Biacore, GE Healthcare) 에서 수행했다. 작동 완충액으로서 HBS-EP+ pH7.4 (GE Healthcare 에서 공급한 10x HBS-EP+ 로부터 희석) 을 이용하였다. 측정은 25℃ 에서 제작자가 권고한 대로 수행했다. 모든 실험은 30 ㎕/분의 유속으로 실행했다. 단백질 A 포획은 트라스투주마브의 경우 손상된 리간드 결합 친화도를 초래할 수 있기 때문에, 인간 Fab-특이적 포획을 선택하였다. 따라서, Amine Coupling Kit (GE Healthcare) 을 이용하는 EDC-NHS 화학에 의해 제작자 지침 (Rimmob ~ 10 000 RU) 에 따라 Human Fab Capture Kit (GE Healthcare) 을 이용하여 CM5-S-Series 센서 칩 (GE Healthcare) 을 항체 포획에 이용하였다. 플로우 셀 1 (Fc 1) 을 활성화 및 불활성화하여 블랭크 감산을 위한 참조로서 이용했다. 권장되는 재생 완충액 (Human Fab Capture Kit 내에서 공급된 10 mM 글리신-HCl pH 2.1) 으로 45 초간 펄스로써 측정 주기 사이에 표면을 재생하였다. 이중 참조를 위해 완충액 주입을 이용하였다.
BiXAb-3489 및 BiXAb-3732SS, 및 이들의 부모 항-EGFR 및 항-HER2 mAb 의 hEGFR (EGR-H5222, Acro Biosystems) 및 hHER2 (HE2-H5225, Acro Biosystems) 에 대한 결합 매개변수를 측정하기 위해, 약 100 RU 의 분석물 (mAb 또는 BiXAb) 을, 180 초 동안 작동 완충제에 각 분자의 적절한 희석물을 주입한 후, 180 초 동안 hEGFR (20nM) 또는 hHER2 (20nM) 을 주입한 다음, 300 초 해리 단계로 포획하였다. Biocore T200 평가 소프트웨어를 이용하여 이중-참조를 수행한 후 BiacoreEval 3.0 소프트웨어로 수득한 센서그램을 피팅하여 친화도 상수를 측정했다. 1:1 결합 모델을 고정 매개변수로서 실험적으로 결정된 RMax 와 함께 이용하여 결합 속도 상수 (ka), 해리 속도 상수 (kd), 및 평형 해리 속도 (KD) 를 결정하였다.
항-EGFR 및 항-HER2 부모 mAb, 및 BiXAb-3489 및 BiXAb-3732SS 의 동족 리간드인 EGFR 및 HER2 와의 상호작용에 대한 친화도 상수를 1:1 상호작용 모델을 이용하여 단일 농도 곡선에 핏팅시켜 측정했다. 일반적으로 매우 유사한 KD 값이 낮은 나노몰 범위에서 관찰되었다 (표 3). 높은 친화도를 측정할 때 2-배의 편차가 예상되므로, 최대 50% 의 차이는 관련성이 있는 것으로 간주해서는 안된다. BiXAb-3732SS 에서 항-HER2 Fab 는 "리버스 (reverse)" 시리즈에 있어서 약간 더 빠른 kd 를 나타내는 것으로 생각할 수 있지만; 그럼에도 불구하고, 이는 kon 이 감소되었기 때문에 내부 Fab 도메인의 입체적 방해 (steric hindrance) 와 일치하지 않는다.
결론적으로, 항-HER2 및 항-EGFR Fab 도메인의 특성은 BiXAb-3489 및 BiXAb-3732SS 양자 모두에서 이들이 Fc 도메인과 가깝게 또는 멀리 위치하는지 여부와 관계 없이 매우 유사했으며, 대응하는 부모 항체 (항-EGFR 및 항-HER2) 와 유사했다. 따라서, BiXAb 분자에서 동족 항원, EGFR 및 HER2 의 Fab 결합은 입체적으로 방해받지 않는다.
표 3 SPR 분석에 의해 측정된 결합 매개변수
실시예 6. 미분획 비사전활성화 단핵 세포 (MNC) 로의 항체 의존 세포-매개 세포독성 (ADCC)
BxPC3 췌장암 세포, A431 피부 편평 암종, SKOV-3 난소암 세포를 100 ㎍/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 및 10% 소태아혈청으로 보충한 RPMI 1640-Glutamax-I 배지에서 배양했다.
MNC 의 제조를 위해 하기 절차를 이용하였다. 새로이 뽑은 말초 혈액을 시트레이트로 항-응고시켰다. 후속적으로, 5 ㎖ 의 Ficoll-Paque PLUS 용액을 6 ㎖ 항-응고된 전혈로 층 형성시켰다. 샘플을 20 분 동안 2,500 rpm, RT 에서, 후속적인 원심분리 파괴 없이 원심분리하였다. MNC 를 혈장 / Ficoll 계면으로부터 수집하였다. MNC 세포 현탁액을 PBS 중 1:10 희석하고 5 분 동안 1,800 rpm, 실온에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 30 초 동안 45 ㎖ 빙랭 증류수를 세포 현탁액에 첨가하여 적혈구를 용해하고, 그 후 5 ㎖ 의 10x PBS 를 첨가하였다. 세포를 5 분 동안 1800 rpm, 실온에서 원심분리하고 1x PBS 로 3 회 세척하여 혈소판을 제거하였다. 마지막으로 세포를 5 ㎖ 세포 배양 배지에 재현탁하였다. ADCC 검정에서 40:1 = 효과기 세포:종양 세포 비가 얻어지도록 세포 수를 조정하였으며, 이는 MNC 에서 NK 세포의 분획을 기준으로 산출할 때 8:1 = NK 세포:종양 세포비에 상응한다.
ADCC 51크로뮴 방출 검정을 위해, 1x106 표적 세포 (BxPC-3, A541, A431) 를 200 ㎕ PBS 중 100μCi 51크로뮴과 함께 2 시간 동안 37℃ 및 5% CO2 에서 인큐베이션하였다. 2 시간 인큐베이션 후, 세포를 7 ㎖ 의 배지로 3 회 세척하고, 마지막으로 0.1 x 106 세포/㎖ 의 농도에서 재현탁하였다. 항체의 존재 하 표적 세포 (5,000 세포/웰) 및 MNC 를 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (200 ㎕ 검정 부피) 에서 4 시간 동안 37℃ 및 5% CO2 에서 인큐베이션하였다. 최대 표적 세포 용해 (= 최대 cpm) 의 측정을 위해 Triton X-100 을 첨가하였다. 기저 51크로뮴 방출 (= 기저 cpm) 을 측정하기 위해 표적 세포는 추가 조작하지 않았다. 4 시간 인큐베이션 후, 마이크로타이터 플레이트를 5 분 동안 2000 rpm 에서 원심분리하고, 25 ㎕ 상청액을 125 ㎕ 의 Optiphase Supermix (Perkin Elmer) 와 혼합하고, 쉐이크 인큐베이터 (shake incubator) 에서 1 분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 MicroBeta TriLux (Perkin Elmer) 베타-계수기에서 검정하였다. 하기 식을 사용하여 표적 세포 용해를 계산하였다:
용해 % = (실험적 cpm - 기저 cpm)/(최대 cpm - 기저 cpm) x 100.
모든 측정은 삼반복으로 수행하였다. ADCC 검정은 효과기 세포로서 비사전활성화 MNC 를 이용하여 수행했다.
도 6a 에, BxPC-3 세포 상 BiXAb-3486, BiXAb-3489, BiXAb-3732SS, 및 BiXAb-E06528 로의 ADCC 검정을 나타낸다. BiXAb-E06528 (EC50=1.8 nM) 및 BiXAb-3489 (EC50=2.2 nM) 에 있어서 강력한 세포독성이 관찰되었고, 이는 두 부모 항체의 조합, 항-EGFR+항-HER2 (EC50=1.5 nM) 의 것과 유사하였다; 최대 용해는 세 항체 그룹 모두에 있어서 ~ 20% 로 거의 동일하였다. BiXAb-3486 은 <10% 의 훨씬 감소된 총 용해를 갖지만 유사한 사멸 효력 (EC50=2.0 nM) 을 보였다. BiXAb-3732SS 는 부모 항-EGFR 항체의 것과 유사하게 용해를 거의 나타내지 않았다. 부모 항-EGFR 항체는 높은 효력 (EC50=0.8 nM) 을 나타냈지만, BiXAb-E06528, BiXAb-3489, 및 두 부모 항체의 조합, 항-EGFR+항-HER2 에 비해 총 용해는 감소되었다 (15%). 마찬가지로, BiXAb-E06528 (EC50=0.12 nM) 및 BiXAb-3489 (EC50=0.12 nM) 는 부모 항-EGFR+항-HER2 의 조합 (EC50=0.09 nM) 및 항-EGFR 단독 (EC50=0.05 nM) 과 유사한 최대 용해 및 A431 세포에 대한 매우 높은 효력을 나타냈다 (도 6b). BiXAb-3486 및 BiXAb-3732SS 는 감소된 효력 (각각 (EC50=0.26 nM 및 EC50=0.24 nM) 및 감소된 최대 용해를 또다시 보였다. SKOV-3 세포 상 ADCC 는 BiXAb-E06528 (EC50=0.87 nM) 및 BiXAb-3489 (EC50=0.87 nM), 및 부모 항-EGFR+항-HER2 의 조합 (EC50=0.83 nM) 및 항-HER2 (EC50=1.2 nM) 가 암 세포를 강력하게 사멸시킨다는 것을 입증하였으나 (도 6c), 양 BiXAb 분자의 최대 용해는 조합 또는 항-HER2 단독에 비해 약간 감소했다. BiXAb-3486 및 BiXAb-3732SS 는 약간 감소된 세포독성 효력 (EC50=1.2 nM 및 EC50=2.1 nM) 및 최대 용해를 나타냈다. 결론적으로, 모든 BiXAb 는 몇몇 상이한 유형의 EGFR+/HER2+ 암 세포에 대항한 세포독성 활성을 보였으며, BiXAb-E06528 및 BiXAb-3489 는 이들 암 세포주에 대항해 최고의 세포독성 효력 및 최대 용해를 나타냈다.
실시예 7. 암 세포주의 생존력에 대한 영향 평가
NCI-N87 인간 위 암종 및 CAL27 인간 혀 편평 세포 암종 세포주를 37℃ 에서 가습 분위기 (5% CO2, 95% 공기) 에서 이들의 배양 배지 (RPMI1640+10%FBS 및 DMEM+10%FBS, 각각) 중에 단층으로서 성장시켰다. 실험 용도로, 종양 세포를 트립신-베르센으로 5 분 처리함으로써 배양 플라스크에서 떼어 내고 완전 배양 배지 첨가로 중화시켰다. 세포를 혈구계수기 (KOVA 슬라이드) 에서 공급자 지침에 따라 카운트하고 그들의 생존력을 0.25% 트리판 블루 배제로써 평가했다.
암 세포주의 생존력에 대한 항체 영향을 평가하기 위해, 96-웰 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트에서 최적의 세포주 밀도 111 000 세포/㎖ 를 이용하였다. 이들을 10% FBS 로 보충된 약물이 없는 RPMI 1640 배지에서 처리하기 전에 24 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 시딩 (seeding) 을 위한 부피는 90 ㎕ 였다. 화합물을 하나의 독립 실험에서 삼반복으로 시험하였다.
처리 시작시, 부피 10 ㎕ 의 시험 및 대조군 물질 희석물을 웰에 첨가해 하기의 최종 농도에 도달시켰다:
- 시험 및 대조군 물질에 있어서 농도는 190; 100; 50; 25 및 10 ㎍/㎖ 임.
- 항-HER2+항-EGFR 항체의 조합에 있어서, 항-EGFR 및 항-HER2 양자 모두의 농도는 140; 100; 50; 25 및 10 ㎍/㎖ 임.
세포를 37℃ 에서 5% CO2 하에 시험 물질을 함유하는 배양 배지 100 ㎕ 최종 부피에서 96 시간 동안 삼반복으로 인큐베이션하였다.
암 세포의 생존력에 대한 화합물의 영향을 CellTiter-Glo 발광 검정 키트 (Promega) 로써 제작자 지침에 따라 화합물 인큐베이션 96 시간 후 밝혀냈다. 요약하면, 100 ㎕ 의 CellTiter Glo 시약을 준비하고 각 웰에 첨가했다. 이어서, 플레이트를 진탕시켜 발광을 기록하기 전에 세포 용해를 유도하였다.
생존의 용량 반응 저해 (IC) 를 하기와 같이 표시하였다:
IC=100x(OD약물-노출된 웰/OD비히클-노출된 웰)
OD 값은 3 회의 실험 측정의 평균값이었다.
BiXAb-E06528 및 BiXAb-3489 는 각각 102.6 ㎍/㎖ 및 50.2 ㎍/㎖ 의 IC50 으로 NCI-N87 의 생존력을 강력하게 저해했다. 항-EGFR+항-HER2 항체의 조합은 50% 생존력 저해 수준에 미치지 못했고, IC50 은 >140 ㎍/㎖ 로 추정되었다. 부모 항-EGFR 또는 항-HER2 의 개별적인 제조물은 시험된 농도 범위에서 최소 활성이었고, 또한 50% 생존 저해 수준에 미치지 않았으므로; 따라서 두 IC50 은 >190 ㎍/㎖ 인 것으로 추정되었다.
CAL27 은 또한 효율적으로 BiXAb-E06528 및 BiXAb-3489 에 의해 저해되었으며, 이는 ~ 60% 로 최저 농도에서 그 생존력을 저해하였고, 이로써 두 분자의 IC50 이 <10 ㎍/㎖ 인 것으로 추정되었다. 두 부모 항체의 조합, 항-EGFR+항-HER2 는 IC50=10.5 ㎍/㎖ 로 생존력을 저해시켰다. 부모 항-EGFR mAb 의 개별 제조물은 IC50=93.1 ㎍/㎖ 로 훨씬 더 낮은 정도의 저해를 나타냈고; 부모 항-HER2 mAb 의 개별 제조물은 시험된 농도 범위에서 저해를 나타내지 않았다.
결론적으로, BiXAb-E06528 및 BiXAb-3489 양자 모두는 위 및 혀 편평 세포 암종의 생존력의 강력한 저해를 나타냈고, 이는 두 부모 항체들 중 어느 하나 또는 이들의 조합의 것보다 훨씬 더 강력하였다.
실시예 8: 본 발명의 항체의 생물학적 특성의 평가
본래의 방식으로 EGFR 및 HER2 수용체를 동시에 표적으로 하는 본 발명의 본래의 이중특이적 4가 항체를, 췌장 종양 BxPC-3 을 지닌 마우스에서 평가하고, 항-EGFR 및 항-HER2 부모 항체의 조합과 비교하였다.
본 발명의 이중특이적 4가 항체 BiXAb-3486 및 BiXAb-3489 을 검정에 이용했다.
치료 일정
BxPC-3 세포주를 ATCC (Rockville, MD) 에서 얻어, 10% 소태아혈청, 50 U/㎖ 페니실린, 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 에서 배양하였다.
모든 생체 내 실험을 공인된 시설에서 실험 동물 연구를 위한 윤리 지침 및 프랑스 규정을 준수하여 수행하였다.
Harlan (Le Malcourlet, France) 에서 구입한 6 주령 암컷 무흉선 누드마우스를 BxPC-3 (3.5 × 106) 세포로 우측 옆구리에 피하 주사했다.
검출가능한 성장 중인 종양을 보유하는 종양 보유 동물을 이후 각종 그룹에 분포하였다. 종양이 소정 부피인 100 mm3 에 도달한 후 하기의 일정에 따라 동물을 복강내 (ip) 주사로 치료하였다:
ㆍ 동물을 무작위로 추출하여 6 개의 코호트에 등록한 날 (제 0 일) 로부터 일주일에 2 회, 제 28 일까지, 대조군 마우스에 무관련 항체를 수여했다.
ㆍ C+T 마우스에 항-EGFR + 항-HER2 항체를 각각 2 mg/kg 로, 제 0 일부터 일주일에 2 회, 제 28 일까지 수여했다.
ㆍ BiXAb 마우스에 하기의 프로토콜에 따라 이중특이적 항체를 수여했다:
- BiXAb-3486 을 2 mg/kg 로, 제 0 일부터, 1 주일에 2 회, 제 28 일까지
- BiXAb-3486 을 10 mg/kg 로, 제 0 일부터, 1 주일에 2 회, 제 28 일까지
- BiXAb-3489 를 2 mg/kg 로, 제 0 일부터, 1 주일에 2 회, 제 28 일까지
- BiXAb-3489 를 10 mg/kg 로, 제 0 일부터, 1 주일에 2 회, 제 28 일까지
항종양 활성 평가 기준
유효성에 대한 바이오마커로서 안전성 (체중, 생존, 임상 징후 및 행동) 및 종양 성장을 추적 관찰을 위한 주요 종점 (endpoint) 으로서 취하고, 모든 마우스에 대해 실험 과정 내내 일주일에 2 회 기록하였다. 그래프 및 분석은 Newlab Oncology Software 로 수행했다.
종양 부피
종양 치수를 캘리퍼로 측정하였고, 부피는 식 D1 × D2 × D3/2 로 산출하였고, 각종 종점을 평가하여 치료 유효성을 평가하였다.
종양 성장 저해
치료군 대 대조군에 대한 중간 종양 부피의 비로서 정의되는 종양 성장 저해 (T/C %) 를, T/C % = [(제 X 일에 치료군의 중간 종양 부피)/(제 X 일에 대조군의 중간 종양 부피)] × 100 로 계산하였다. 최적의 값은 달성된 최대 종양 성장 저해를 반영하는 최소 T/C % 비이다.
National Cancer Institute 표준 (Bissery MC and Chabot GG History and new development of screening and evaluation methods of anticancer drugs used in vivo and in vitro. 1991. Bull Cancer 78:587-602) 에 따른 T/C % 비에 대한 유효 기준은 <42% 이다. T/C <10% 는 임상 연구할 가치가 있는 매우 높은 활성으로 간주되었다 (B. A. Teicher. Tumor models in cancer research. Science & Business media 2010).
이 실험에서, T/C 는 실험하는 동안 내내 제 1 일에서 제 49 일까지 평가되었다.
ΔT/ΔC
치료군 및 대조군에서의 종양 부피의 기준선으로부터의 변화를 이용하여 치료군 (ΔT) 및 대조군 (ΔC) 의 중간값을 계산하였다. T/C (%) 는 임의의 선택일에서의 중간값의 비이다.
ΔT/ΔC 값이 음수이면, 이것은 종양의 퇴행을 지시한다.
부분 퇴행, 완전 퇴행 및 무종양 생존자
부분 퇴행 (PR) 은 평가일과 상관 없이 종양 부피의 감소가 50% 이상인 것으로 정의하였다. 완전 퇴행 (CR) 은 평가일과 상관 없이 촉지 한계 미만의 종양 부피 (T = 30 mm3) 감소로서 정의된다. 연구 종료 시점에 (제 105 일), 감지할 수 있는 어떠한 종양도 없는 마우스에 해당하는 무종양 생존자 (TFS) 수를 측정했다 (Vrignaud P, Semiond D, Lejeune P, Bouchard H, Calvet L, Combeau C, Riou JF, Commercon A, Lavelle F, Bissery MC. Preclinical antitumor activity of cabazitaxel, a semisynthetic taxane active in taxane-resistant tumors. Clin Cancer Res. 2013; 19 (11):2973-83).
로그 세포 사멸 (LCK)
총 로그 세포 사멸을 식 (T-C) / (3.32xTd) 을 이용해 계산하였다. 이 식에서, 종양 성장 지연 (T-C) 은 소정의 부피 (750-1,000 mm3) 에 도달하기 위한 중간 시간 (일) 에서의 T 군과 C 군의 종양간 차이로서 정의되었다.
종양 배가 시간 (Tumor doubling time; Td) 은 대조군에서 추정되었으며, 이때 일자의 함수로서 종양 부피의 로그 (지수 성장 단계, 즉 100 내지 1000 mm3 범위)는 기울기 "a" 를 가진 선형 모델, Td = log2/a 에 따른다.
이러한 기준을 이용하여, 항종양 활성은 로그 세포 사멸 값 > 0.7 로서 정의된다.
Southern Research Institute (Birmingham, AL, USA) 스코어를 하기와 같이 로그 세포 사멸 값을 기준으로 하여 항종양 활성을 분류하는데 사용했다: <0.7= - (비활성); 0.7-1.2=+;1.3-1.9=++; 2.0-2.8=+++;>2.8=++++ (고 활성) (Schabel FM, Griswold DP, Laster WR, Corbett TH, Lloyd HH. Quantitative evaluation of anticancer agent activity in experimental animals. Pharmacol. Ther 1977; 1:411 - 35).
순 (net) LCK 를 또한 하기 식에 따라 평가했다: n-LCK= [(T-C)- 치료 기간의 지속기간]/(3.32 x Td). 만약 n-LCK-순 값이 양의 값이면, 치료가 끝날 때 시작 시점때보다 존재하는 세포수가 적다. 반면에, 상기 값이 음의 값이면, 치료 중에 종양이 자란다.
중간 생존 및 치료 효과
종양이 2000 mm3 의 결정된 부피에 도달하는데 소요되는 시간을 이용하여, 적합화된 Kaplan-Meier 생존 곡선으로 결과를 또한 표현하였다. 중간 지연은 마우스의 50% 가 결정된 부피에 도달한 종양을 갖는 시간으로서 정의되었다.
Mann-Whitney U 시험
Mann-Whitney 시험은 그 값이 정상 분포한다는 가정 없이 두 그룹 또는 조건 또는 치료를 비교 가능하게 만드는 비모수적 시험이다. 의학에서 이것은 두 약물의 효과 및 동등성 여부를 결정하는데 사용된다. Mann-Whitney U 시험은 Newlab Oncology software® (NewLab, 11 rue d'Amsterdam 54500 Vandœuvre-Les-Nancy FRANCE) 로 평가되었다.
약물 독성
약물-관련 사망 및 상대 평균 순 체중 손실 최대% 도 또한 측정되었다. 체중 손실 최하점 (그룹 평균) > 20% 또는 10% 약물 사망은 과도한 독성 복용을 나타내는 것으로 간주되었다.
췌장 종양 BxPC-3 은 이미 높은 수준의 EGFR 수용체를 발현하는 것으로 관찰되었으며, 이 종양에서, 항 EGFR 모노클로날 Ab 세툭시마브가 유의미하게 활성이 있는 것으로 관찰되었다. 반대로, 이 종양은 매우 낮은 수준의 Her2 를 발현하고 (Larbouret C, et al. In pancreatic carcinoma, dual EGFR/HER2 targeting with cetuximab/trastuzumab is more effective than treatment with trastuzumab/erlotinib or lapatinib alone: implication of receptors' down-regulation and dimers' disruption. Neoplasia. 2012 Feb; 14(2): 121-130) 결과적으로, 항 HER2 모노클로날 항체 트라스투주마브는 유의미하게 활성적이지 않았다.
흥미롭게도, 두 Ab 의 조합은 세툭시마브로 검출된 것보다 유의미하게 더 높은 활성을 일으킨다.
이 실험에서, 본 발명의 이중특이적 4가 항체인 BiXAb-3486 및 BiXAb-3489 의 활성을 BxPC-3 종양을 지닌 마우스에서 부모 항-EGFR 및 항-HER2 항체의 조합과 비교하였고, 연구 내내 어떠한 독성 효과도 검출되지 않았다.
BxPC-3 세포를 보유한 마우스를 1 주일에 2 회 IP 로 항-EGFR 및 항-HER2 항체로 (각 항체에 대해 2 mg/kg/주입) 제 0 일인 무작위 추출일부터 제 28 일까지 치료하였다. 이전 실험에 근거하여 2 mg/kg 투여량이 선택되었다.
본 발명의 두 이중특이적 항체가 또한 동일한 치료 일정으로 2 또는 10 mg/kg/주입으로 제공되었다 (도 7a).
종양은 비히클-치료된 마우스에서 자랐고, 배가 시간은 9 일이었으며, 치료 마지막 날인 제 28 일에 평균값 1859 + / - 459 mm3 에 도달하였다. 그 날, 항-EGFR 및 항-HER2 항체의 조합을 2 mg/kg 투여량으로 치료한 마우스 군의 경우, 종양 평균 부피는 634 mm3 였다. BiXAb-3486 을 2 또는 10 mg/kg 로 치료한 군의 경우에는, 종양 평균 부피는 단지 214 mm3 및 111 mm3 이었고, BiXAb-3489 를 2 또는 10 mg/kg 로 치료한 군의 경우에서는 223 mm3 및 200 mm3 이었다.
T/C 및 ΔT/ΔC 평가 (도 7b) 는 하기를 나타낸다:
- 모든 치료는 NCI 기준에 따르면 T/C < 42% 로 활성이었다.
- BiXAb-3486 또는 BiXAb-3489 로 치료한 마우스 군만이 매우 높은 활성 (T/C < 10%) 을 나타낸 반면, 항-EGFR 및 항-HER2 항체로 치료한 마우스는 중간정도의 활성을 나타냈다.
- 매우 높은 활성이 치료 종료 후 (제 28 일 후) 유지된다.
부분 또는 전체 퇴행 (종양 부피가 50% 이상 감소하거나 종양 부피가 촉지 한계 미만으로 감소한 것으로서 정의됨) 및 치유를 실험하는 동안 내내 모니터링했다 (표 4). 총 6/10 및 3/10 동물이 BiXAb-3486 (10 mg/kg) 으로 치료받은 마우스 군에서 각각 완전 퇴행 및 치유를 경험했는데, 이는 강력한 활성을 지시한다.
표 4: 퇴행 및 치유
지수 성장 및 이와 연관된 배가 시간 개념은 임상적으로 관련이 있다 (Frei E III. Models and the clinical dilemma. In: Fidler IJ, White RJ, editors. Design of models for testing therapeutic agents. New York: Van Nostrand Reinhold; 1982. p. 248-59). 상이한 조직학적 유형의 암은 관찰가능한 종양 크기 범위 내에서 매우 다양한 배가 시간을 보인다 (Shackney SE, McCormack GW, Guchural GJ Jr. Growth rate patterns of solid tumors and their relation to responsiveness to therapy. An analytical review. Ann Intern Med. 1978;89:107).
고환암 및 융모막암종과 같은 가장 치료학적으로 반응성인 인간 암은 1 개월 미만의 배가 시간을 갖는 경향이 있다. 두경부의 편평 세포 암과 같은 덜 반응성인 암은 약 2 개월안에 두 배가 되는 것처럼 보인다. 상대적으로 무반응성인 암, 예컨대 결장 선암종은 3 개월마다 두 배가 되는 경향이 있다. 분명히, 이러한 임상적인 관찰은 증식하는 세포의 높은 화학감수성 (아래 참조) 과 관련이 있을 수 있으며, 즉 종양이 높은 분율의 분열 세포를 가지면, 이것은 더 빠르게 자라는 경향이 있을 것이며, 또한 분열 세포를 사멸하는 약물에 더 반응성인 경향이 있을 것이다. 그 대신에, 세포 손실률이 더 높은 종양은 상대적으로 더 느린 성장 속도 및 나아가 더 높은 약물 내성에 대한 돌연변이 비율을 갖는 경향이 있다.
로그 세포 사멸 모델은 항암 약물이 일차 동역학으로 작용한다고 제시하며, 따라서 약물에 대한 균일한 감도를 가정할 때, 이들은 종양의 초기 크기와 관계 없이 일정한 개수의 종양 세포라기 보다는 종양 세포를 일정한 비율로 제거할 것이다. 다시 말해, 약물 치료가 106 개의 세포를 105 개로 감소시키면, 동일한 치료법으로는 104 개의 세포를 103 개로 감소시킬 것이다.
실험에서, 대조군에서 종양의 배가 시간이 7 일이었음을 관찰했다 (도 7a).
총 로그 세포 사멸 계산 [(T-C)/(3.32xTd)] 및 순 로그 세포 사멸 계산 [(T-C) - 치료 기간의 지속 기간]/(3.32 x Td) (표 5) 에 따르면, 항-EGFR 및 항-HER2 항체의 조합은 전세계적으로 활성이 없었고 종양이 치료 중에도 성장한 것으로 보인다.
반대로, BiXAb-3486 또는 BiXAb-3489 로 치료된 마우스는 유의미한 활성 (++ 또는 +++) 을 겪었으며, 초기 종양 질량의 최대 2 로그 (99%) 가 BiXAb 화합물에 의해 제거되었다. 순 로그 세포 사멸 계산 (양의 값) 은 BiXAb 화합물로의 치료가 유효하고 치료 전 (제 0 일) 과 비교했을 때 치료 종료 때 (제 28 일) 종양 세포 수가 더 적었음을 나타낸다.
표 5: 총 및 순 로그 세포 사멸 평가
중간 생존, 이식 후 경과일, 50% 의 마우스가 2000 mm3 의 부피의 종양을 가질 때 및 치료 효과 (치료군의 중간값 - 대조군의 중간값) (도 7c 및 7d) 는 두 모노클로날 항체의 조합 치료법에 비해 BiXAb 치료법의 명백한 치료상의 이점을 나타낸다.
마지막으로, BiXAb 화합물로 치료한 4 가지의 동물군을 항-EGFR 및 항-HER2 항체의 조합으로 치료한 군과 비교하기 위해 Mann-Whitney U 시험을 수행하였다 (표 6).
표 6: Mann-Whitney U 시험 (BiXAb 군 대 항-EGFR + 항-HER2 군)
다시 한번, BiXAb 화합물로 치료된 군은 항-EGFR 및 항-HER2 항체의 조합으로 치료된 군보다 더 높은 활성을 경험했다는 점이 명백하게 보인다. 이 차이는 치료 종료 후 21 일 후에도 또한 관찰가능했다.
실제로, 세포독성 화합물의 항종양 평가에 고전적으로 사용되는 몇 가지 종점을 이용했다. 2 개의 본 발명의 이중특이적 항체는 항-EGFR 및 항-HER2 항체의 조합보다 더 강력한 것으로 나타났다.
1) 임상 연구 가치가 있는 고 활성 화합물로 분류하기 위한 NCI 에 요구되는 매개변수인 T/C <10% 는 오직 2 개의 본 발명의 이중특이적 항체만으로 획득됨;
2) 로그 세포 사멸 매개변수 (총 및 순) 및 활성 등급으로의 이들의 번역 역시 2 개의 본 발명의 이중특이적 항체가 항-EGFR 및 항-HER2 항체의 조합보다 더 활성이었음을 확인시켜줌;
3) 강력한 활성의 특징인 퇴행은 오직 2 개의 본 발명의 이중특이적 항체로 치료된 군에서만 관찰되었음.
결론: 실시예 6 및 7 에서, 항체의 치료학적 활성과 종종 연관있는 개별적인 작용 메카니즘 (MOA) 을 평가했다. 실시예 6 에서, 3 가지의 상이한 세포주에서의 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 을 시험했다. 2 개의 BiXAb 분자인 BiXAb-E06528 및 BiXAb-3489 는 2 개의 부모 항체의 조합, 항-EGFR+항-HER2 의 것과 유사한 세포-매개 세포독성을 나타내었다. 검정에서 관찰되는 일부의 가변성은 표적 암 세포 상에서의 EGFR/HER2 의 상이한 비율에 기인할 수 있다. 실시예 7 에서, 항체의 "직접적인" 효과, 즉 암 세포주의 생존력을 감소시키는 효과를 갖는, EGFR, HER2 및 이들 수용체와 연관된 이종이량체를 통한 전-증식성 (pro-proliferative) 시그널링을 차단하는 항체의 능력을 시험하였다. 이들 실험은 BiXAb-E06528 및 BiXAb-3489 가 각각의 부모 항체 (항-EGFR, 항-HER2) 와 개별적으로 또는 그들의 조합 (항-EGFR+항-HER2) 과 연관된 것보다 실질적으로 더 높은 항-증식 활성을 나타낸다는 점을 입증하였다. 이는 두 BiXAb 가 부모 항체와 연관된 것보다 증식 및 성장을 저해하는 능력이 훨씬 더 강력하다는 것을 의미한다. 실시예 8 에서, 췌장암의 이종이식 모델에서 생체 내에서 BiXAb-3489 및 BiXAb-3486 을 시험했다. 이 모델은 2 개의 부모 항체의 조합과 비교하여 BiXAb 와 연관된 종양 성장 저해의 놀라운 증가를 입증하였다.
생체 내 모델에서, 약물의 활성과 관련된 모든 MOA 의 합을 평가할 수 있었으며; 이 경우 이는 면역 세포-매개 세포독성과 증식 저해의 직접적인 효과 양자 모두가 이종이식 모델의 결과에 기여한다는 것을 의미한다. 본 발명의 이중특이적 항체는 췌장 종양에서는 드물게 관찰되는 효력을 입증하였다.
생체 내 모델은 BiXAb 의 활성이 두 부모 항체의 조합의 것에 비해 실질적으로 개선된 것을 반영하기 때문에, 종양에서의 전-증식성 시그널링의 직접적인 저해가 종양의 성장을 저해하고 동물의 생존을 연장시키는데 있어서 BiXAb 의 활성에 커다란 기여를 제공한다는 결론을 내렸다 (실시예 8).
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<211> 120
<212> PRT
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<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
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50 55 60
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val
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Gly Gly
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<213> Homo sapiens
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Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
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Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
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Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
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<213> Homo sapiens
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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<213> Homo sapiens
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ala Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Lys Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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<213> Homo sapiens
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<220>
<223> linker sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(11)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(25)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 36
Glu Pro Lys Xaa Cys Asp Lys Xaa His Xaa Xaa Pro Pro Xaa Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Xaa Xaa Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa
20 25 30
Gly Gly
<210> 37
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker sequence
<400> 37
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Gly Pro Gly
20 25 30
Gly Gly
<210> 38
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker sequence
<400> 38
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ala Ala Pro Pro Gly Pro Ala Pro Gly
20 25 30
Gly Gly
Claims (15)
- 2 개의 중쇄 및 4 개의 경쇄를 포함하는 이중특이적 (bispecific) 항체로서,
각각의 중쇄는
a. 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하고,
b. 상기 Fc 영역은 상기 힌지 도메인에 의해 항체 1 (Ab1) 의 Fab 중쇄 CH1-VH 에 연결되고,
c. 이는 차례로 폴리펩티드 링커 서열에 의해 항체 2 (Ab2) 의 Fab 중쇄 CH1-VH 에 연결되고, 이때 폴리펩티드 링커 서열은 Ab1 의 상기 Fab 중쇄 VH 도메인의 N-말단을 Ab2 의 상기 CH1 도메인의 C-말단과 연결시키고,
4 개의 경쇄는 그들의 동족 (cognate) 중쇄 도메인과 연관되어 있는 Ab1 의 Fab 경쇄 및 Ab2 의 Fab 경쇄를 포함하고;
Ab1 및 Ab2 는 상이한 것으로서, 한편으로는 세툭시마브 (cetuximab) 또는 세툭시마브의 자연적 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 그의 돌연변이된 유도체, 및 다른 한편으로는 트라스투주마브 (trastuzumab) 또는 트라스투주마브의 자연적 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 그의 돌연변이된 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 이중특이적 항체. - 제 1 항에 있어서, Ab1 또는 Ab2 는 세툭시마브 또는 세툭시마브의 자연적 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 그의 돌연변이된 유도체인 이중특이적 항체로서,
o SEQ ID NO:4 를 포함하거나, 이로 이루어진 VH 도메인,
o SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CH1 도메인,
o SEQ ID NO: 13 을 포함하거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 및
o SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CL 도메인
을 포함하고,
이때, CH1 및 CL 도메인은 하기와 같이 연관된, 이중특이적 항체:
- SEQ ID NO: 2 와, SEQ ID NO: 11,
- SEQ ID NO: 5 와, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23,
- SEQ ID NO: 20 과, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23,
- SEQ ID NO: 21 과, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25,
- SEQ ID NO: 22 와, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25. - 제 1 항에 있어서, Ab1 또는 Ab2 는 트라스투주마브 또는 트라스투주마브의 자연적 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 그의 돌연변이된 유도체인 이중특이적 항체로서,
o 서열 SEQ ID NO:1 을 포함하거나, 이로 이루어진 VH 도메인,
o SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CH1 도메인,
o 서열 SEQ ID NO: 10 으로 이루어진 서열을 포함하는 VL 도메인, 및
o SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CL 도메인
을 포함하고,
이때, CH1 및 CL 도메인은 하기와 같이 연관된, 이중특이적 항체:
- SEQ ID NO: 2 와, SEQ ID NO: 11,
- SEQ ID NO: 5 와, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23,
- SEQ ID NO: 20 과, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 23,
- SEQ ID NO: 21 과, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25,
- SEQ ID NO: 22 와, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25. - 제 1 항에 있어서, Ab1 의 CH1 및 CL 도메인은 Ab2 의 CH1 및 CL 도메인과 상이한 서열의 조합을 갖는, 이중특이적 항체.
- 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드 링커 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO:34 를 포함하거나, 이로 이루어진, 이중특이적 항체.
- 제 1 항에 있어서, 하기를 포함하거나, 하기로 이루어진, 이중특이적 항체:
a) 각각 N 에서 C 말단 순서로, 하기를 포함하는 연속적인 서열을 포함하거나, 이로 이루어진, 2 개의 중쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 1 을 포함하거나, 이로 이루어진 트라스투주마브 중쇄 VH,
ㆍ SEQ ID NO: 2 를 포함하거나, 이로 이루어진 CH1 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:16 또는 SEQ ID NO:34 를 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩티드 링커,
ㆍ SEQ ID NO: 4 를 포함하거나, 이로 이루어진 세툭시마브 중쇄 VH,
ㆍ SEQ ID NO: 5 를 포함하거나, 이로 이루어진 CH1 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 6 을 포함하거나, 이로 이루어진 힌지 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 7 을 포함하거나, 이로 이루어진 CH2 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 8 을 포함하거나, 이로 이루어진 CH3 도메인,
b) 각각 하기를 포함하는, 2 개의 트라스투주마브 경쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 10 을 포함하거나, 이로 이루어진 VL 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 11 을 포함하거나, 이로 이루어진 CL 도메인,
c) 각각 하기를 포함하는, 2 개의 세툭시마브 경쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 13 을 포함하거나, 이로 이루어진 VL 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 14 를 포함하거나, 이로 이루어진 CL 도메인. - 제 1 항에 있어서, 하기를 포함하거나, 하기로 이루어진, 이중특이적 항체:
a) 각각 N 에서 C 말단 순서로, 하기를 포함하는 연속적인 서열을 포함하거나, 이로 이루어진, 2 개의 중쇄:
ㆍ SEQ ID NO: 4 를 포함하거나, 이로 이루어진 세툭시마브 중쇄 VH,
ㆍ SEQ ID NO: 5 를 포함하거나, 이로 이루어진 CH1 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:34 를 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩티드 링커,
ㆍ SEQ ID NO: 1 을 포함하거나, 이로 이루어진 트라스투주마브 중쇄 VH,
ㆍ SEQ ID NO: 2 를 포함하거나, 이로 이루어진 CH1 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 6 을 포함하거나, 이로 이루어진 힌지 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 7 을 포함하거나, 이로 이루어진 CH2 도메인,
ㆍ SEQ ID NO: 8 을 포함하거나, 이로 이루어진 CH3 도메인,
b) 각각 SEQ ID NO: 12 를 포함하는, 2 개의 트라스투주마브 경쇄,
c) 각각 SEQ ID NO: 15 를 포함하는, 2 개의 세툭시마브 경쇄. - 제 1 항에 있어서, 하기의 돌연변이 중 적어도 하나를 함유하는, 이중특이적 항체:
- SEQ ID NO: 20 을 포함하거나, 이로 이루어진 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인,
- SEQ ID NO: 21 을 포함하거나, 이로 이루어진 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인,
- SEQ ID NO: 22 를 포함하거나, 이로 이루어진 인간 IgG1 로부터의 돌연변이된 CH1 불변 도메인,
- SEQ ID NO: 23 을 포함하거나, 이로 이루어진 돌연변이된 인간 카파 불변 도메인,
- SEQ ID NO: 24 를 포함하거나, 이로 이루어진 돌연변이된 인간 카파 불변 도메인,
- SEQ ID NO: 25 를 포함하거나, 이로 이루어진 돌연변이된 인간 카파 불변 도메인. - 제 1 항에 있어서, 세툭시마브 중쇄 VH 도메인은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 26 또는 SEQ ID NO: 27 로 이루어진, 이중특이적 항체.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 중쇄를 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩티드.
- 제 10 항의 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 11 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 단리된 숙주 세포.
- 하기 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체의 생성 방법:
a) 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 항체 중쇄, 및 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 항체 경쇄를 발현하는 숙주 세포를 적합한 배지 및 배양 조건에서 배양하는 단계; 및
b) 배양 배지 또는 상기 배양된 세포로부터 상기 생성된 항체를 회수하는 단계. - 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한, 이중특이적 항체.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료하는데 사용하기 위한, 이중특이적 항체.
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |