CN112300278A - 抗人egfr嵌合抗体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗人EGFR嵌合抗体及其制备方法和用途。所述嵌合抗体包括重链可变区和轻链可变区,所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.15‑17、SEQ ID NO.21‑23、SEQ ID NO.27‑29、SEQ ID NO.33‑35、SEQ ID NO.39‑41、SEQ ID NO.45—47中的任意一条、两条或者三条,所述重链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.18‑20、SEQ ID NO.24‑26、SEQ ID NO.30‑32、SEQ ID NO.36‑38、SEQ ID NO.42‑44或SEQ ID NO.48‑50中的任意一条、两条或者三条。实验证实上述抗人EGFR嵌合抗体与人EGFR结合率高,能够有效的抑制肿瘤细胞的增殖,为肿瘤的治疗提供了新的手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域,特别是涉及一种抗人EGFR嵌合抗体及其制备方法和用 途。
背景技术
EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物,是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血 管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。其可能机制有:EGFR的高表达引起下游 信号传导的增强;突变型EGFR受体或配体表达的增加导致EGFR的持续活化;自分泌环的 作用增强;受体下调机制的破坏;异常信号传导通路的激活等。EGFR的过表达在恶性肿瘤 的演进中起重要作用,胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR 的过表达。
在过去的几十年里,制药公司与生物技术公司一直将表皮生长因子受体(EGFR)作为 肿瘤治疗的主要靶点,因为有研究表明阻断EGFR,就可以使细胞信号传递中断,从而遏制 细胞的生长繁殖。EGFR作为一个有效的肿瘤靶抗原,已有上市的抗体药物被研发生产出来。 西妥昔单抗是全球第一个针对头颈癌的已上市靶向药物,竞争性阻断EGFR和其他配体,从 而抑制癌细胞的增殖,诱导癌细胞的凋亡。
通过调整抗体可变区的氨基酸序列可影响抗体的结合力,从而影响其生物学活性。基于 原有的抗体序列通过相关生物软件的预测分析,针对不改变抗原识别位点的氨基酸序列进行 合适的更换,是一种高效的获得活性、稳定性等更好的抗体序列的方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种抗人EGFR嵌合抗体及其制 备方法和用途,提供一种新的治疗肿瘤的手段。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明的一方面提供了一种抗人EGFR嵌合抗体,所 述嵌合抗体包括重链可变区和轻链可变区,所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQID NO.15-17、SEQ ID NO.21-23、SEQ ID NO.27-29、SEQ ID NO.33-35、SEQ ID NO.39-41、SEQ ID NO.45—47中的任意一条、两条或者三条,所述重链可变区的互补决定区选自:SEQID NO.18-20、SEQ ID NO.24-26、SEQ ID NO.30-32、SEQ ID NO.36-38、SEQ ID NO.42-44或SEQ ID NO.48-50中的任意一条、两条或者三条。
CDR(互补决定区,complementarity determining region)通常指抗体中在空间结构上可 以与抗原决定簇形成互补的区域。抗体中的可变性通常并不均匀地分布在整个抗体的可变区 中,单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区通常均具有3个超变区(hypervariable region, HVR),这些区域在空间结构上通常可以与抗原决定簇形成互补,所以超变区也被称为互补 决定区(complementarity determining region,CDR),即重链可变区通常包括三个互补决定 区,即CDRH1、CDRH2和CDRH3,轻链可变区通常包括三个互补决定区,即CDRL1、CDRL2 和CDRL3。
进一步地,所述抗人EGFR嵌合抗体选自以下任意一组:
a.所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.15-17,所述重链可变区的互补决定 区选自:SEQ ID NO.18-20;
b.所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.21-23,所述重链可变区的互补决定 区选自:SEQ ID NO.24-26;
c.所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.27-29,所述重链可变区的互补决定 区选自:SEQ ID NO.30-32;
d.所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.33-35,所述重链可变区的互补决定 区选自:SEQ ID NO.36-38;
e.所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.39-41,所述重链可变区的互补决定 区选自:SEQ ID NO.42-44
f.所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.45-47,所述重链可变区的互补决定 区选自:SEQ ID NO.48-50。
本发明提供一种抗人EGFR嵌合抗体,所述嵌合抗体选自CET01、CET02、CET03、CET04、 CET05、或CET06中的任意一种,其中,
CET01的重链可变区如SEQ ID NO.1所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQID NO.2所示或其保守型变异序列;
CET02的重链可变区如SEQ ID NO.3所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQID NO.4所示或其保守型变异序列;
CET03的重链可变区如SEQ ID NO.5所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQID NO.6所示或其保守型变异序列;
CET04的重链可变区如SEQ ID NO.7所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQID NO.8所示或其保守型变异序列;
CET05的重链可变区如SEQ ID NO.9所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQID NO.10所示或其保守型变异序列;
CET06的重链可变区如SEQ ID NO.11所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQID NO.12所示或其保守型变异序列。
具体地,抗人EGFR嵌合抗体为鼠抗EGFR抗体与人抗体形成的嵌合抗体。更进一步地, 所述抗人EGFR嵌合抗体为上述每个嵌合抗体的可变区片段与人Ig恒定区形成的嵌合抗体。 所述人Ig恒定区可以是人IgG、IgM、IgA恒定区,所形成的嵌合抗体可以是IgG、IgM、IgA 型嵌合抗体。
本发明的另一方面提供了一种多核苷酸,所述多核苷酸编码上述每个抗体重链和/或轻链 可变区或全长。
本发明的另一方面提供了一种重组表达载体,所述重组表达载体内含有如上所述的多核 苷酸。
具体的,所述重组表达载体由所述多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。
本发明中的表达载体通常指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、 哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。
本发明的另一方面提供了一种生物工程菌,所述生物工程菌内含有如上所述的重组表达 载体或其基因组内整合有所述的多核苷酸。
本发明的另一方面提供了上述每个多核苷酸、重组表达载体或生物工程菌在制备针对人 EGFR嵌合抗体中的用途。
本发明的另一方面提供了一种抗人EGFR嵌合抗体的制备方法,所述方法包括以下步骤:
在适合表达所述嵌合抗体的条件下,培养所述的生物工程菌,从而表达出所述的嵌合抗 体,纯化分离出所述的嵌合抗体。
本发明的另一方面提供了上述抗人EGFR嵌合抗体在制备治疗肿瘤药物中的用途。
进一步地,所述肿瘤包括但不限于头颈癌、人皮肤鳞状上皮癌和人乳腺癌。
本发明的另一方面提供了一种治疗肿瘤的药物,所述药物的有效成份为上述抗人EGFR 嵌合抗体。
进一步地,所述肿瘤包括但不限于头颈癌、人皮肤鳞状上皮癌和人乳腺癌。
本发明的另一方面提供了一种治疗肿瘤的药物组合物,所述药物组合物包括治疗有效量 的上述抗人EGFR嵌合抗体,和至少一种其他肿瘤治疗药物。
进一步地,所述肿瘤包括但不限于头颈癌、人皮肤鳞状上皮癌和人乳腺癌。
如上所述,本发明的抗人EGFR嵌合抗体及其制备方法和用途,具有以下有益效果:
实验证实,本申请所述的抗人EGFR嵌合抗体,与人EGFR结合率高,具有较高的抑制肿瘤细胞增殖的性能,为肿瘤的治疗提供了新的手段。
附图说明
图1a显示为本发明实施例1中纯化后抗体CET01跑胶结果图。
图1b显示为本发明实施例2中纯化后抗体CET02跑胶结果图。
图1c显示为本发明实施例1中纯化后抗体CET03跑胶结果图。
图1d显示为本发明实施例1中纯化后抗体CET04跑胶结果图。
图1e显示为本发明实施例1中纯化后抗体CET05跑胶结果图。
图1f显示为本发明实施例1中纯化后抗体CET06跑胶结果图。
图1g显示为本发明实施例1中纯化后抗体CET07跑胶结果图。
图1h显示为本发明实施例1中纯化后各个抗体跑胶统计结果柱状图。
图2a显示为本发明实施例2中抗体CET01、CET02、CET03以及对照组流式细胞结果图。
图2b显示为本发明实施例2中抗体CET04、CET05、CET06以及CET07流式细胞结果图。
图3显示为本发明实施例3中各个抗体在250ng/ml以及250ng/ml时抑制细胞增殖能力 检测结果柱状图。
图4显示为本发明实施例4中EC50检测结果统计图。
具体实施方式
本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150,000道尔顿的异四聚 糖蛋白,其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二 硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也 有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH),其后是多个恒定区。每条轻链 的一端由可变区(VL),另一端有恒定区:轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对,轻链 的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸在轻链和重链的可变区之间形成界面。
本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成各种特 定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。 它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中 较保守的部分称为架构区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区,它们大致 上呈p一折叠构型,由形成接连环的三个CDR相连,在某些情况下可形成部分p折叠结构。 每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合 部位,恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗 体的依赖于抗体的细胞毒性。
本发明的一方面提供了一种抗人EGFR嵌合抗体,所述嵌合抗体包括重链可变区和轻链 可变区,所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.15-17、SEQ ID NO.21-23、SEQ ID NO.27-29、SEQ ID NO.33-35、SEQ ID NO.39-41、SEQ ID NO.45-47中的任意一条、两条或 者三条,所述重链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.18-20、SEQ ID NO.24-26、SEQ ID NO.30-32、SEQ ID NO.36-38、SEQ ID NO.42-44或SEQ ID NO.48-50中的任意一条、两条或 者三条。
于一实施例中,所述抗人EGFR嵌合抗体选自以下任意一组:
g.所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.15-17,所述重链可变区的互补决定 区选自:SEQ ID NO.18-20;
h.所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.21-23,所述重链可变区的互补决定 区选自:SEQ ID NO.24-26;
i.所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.27-29,所述重链可变区的互补决定 区选自:SEQ ID NO.30-32;
j.所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.33-35,所述重链可变区的互补决定 区选自:SEQ ID NO.36-38;
k.所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.39-41,所述重链可变区的互补决定 区选自:SEQ ID NO.42-44
l.所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.45—47,所述重链可变区的互补决 定区选自:SEQ ID NO.48-50。
本发明提供一种抗人EGFR嵌合抗体,所述嵌合抗体选自CET01、CET02、CET03、CET04、 CET05或CET06中的任意一种,其中,
CET01的重链可变区如SEQ ID NO.1所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQID NO.2所示或其保守型变异序列;
CET02的重链可变区如SEQ ID NO.3所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQID NO.4所示或其保守型变异序列;
CET03的重链可变区如SEQ ID NO.5所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQID NO.6所示或其保守型变异序列;
CET04的重链可变区如SEQ ID NO.7所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQID NO.8所示或其保守型变异序列;
CET05的重链可变区如SEQ ID NO.9所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQID NO.10所示或其保守型变异序列;
CET06的重链可变区如SEQ ID NO.11所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQID NO.12所示或其保守型变异序列。
所述保守型变异序列通常指通过氨基酸保守性替换变化获得的序列,所述保守性替换通 常是指性质相似的另一个氨基酸取代指定的氨基酸,例如,可以被认为是保守型替换(性质相 似)的例子包括但不限于:a)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸;b)谷氨酸和天冬氨酸;c)天冬酰胺和 谷氨酰胺;d)精氨酸和赖氨酸;e)异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和;f)苯丙氨酸,酪氨酸和色氨 酸。
具体地,抗人EGFR嵌合抗体为鼠抗EGFR抗体与人抗体形成的嵌合抗体。更进一步地, 所述抗人EGFR嵌合抗体为上述每个抗体的可变区片段与人Ig恒定区形成的嵌合抗体。所述 人Ig恒定区可以是人IgG、IgM、IgA恒定区,所形成的嵌合抗体可以是IgG、IgM、IgA型嵌合抗体。
所述嵌合抗体中“抗体”以最广泛的意义使用,具体包括但不限于单克隆抗体(包括全 长单克隆抗体)和其抗体片段。对于本领域技术人员而言应当清楚的是,在许多情况下“抗 体片段”可替代抗体,抗体片段的例子包括但不限于:Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段;双特 异抗体;线性抗体;单链抗体分子;纳米抗体(来自Ablynx的技术);结构域抗体(来自Domantis 的技术);和由抗体片段形成的多特异性抗体等。
本发明的第二方面提供了一种多核苷酸,所述多核苷酸编码上述每个抗体重链和/或轻链 可变区或全长。
本发明的第三方面提供了一种重组表达载体,所述重组表达载体内含有如上所述的多核 苷酸。
于一实施例中,所述重组表达载体由所述多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而 成。
本发明中的表达载体通常指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、 哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。
本发明的第四方面提供了一种生物工程菌,所述生物工程菌内含有如上所述的重组表达 载体或其基因组内整合有所述的多核苷酸。
任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞。例如,所述宿主细胞可以是 原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物 细胞。
于一实施例中,所述宿主细胞选自人肾上皮细胞系(293F细胞)、中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary(CHO))细胞系,多种COS细胞系,HeLa细胞系,骨髓细胞系如SP2/0细胞系, NS0细胞系,YB2/0细胞系等,以及转化的B-细胞或杂交瘤细pIRES或pcDNA3.1胞中的一 种或多种的组合。
本发明的第五方面提供了上述每个多核苷酸、重组表达载体或生物工程菌在制备针对人 EGFR嵌合抗体中的用途。
本发明的第六方面提供了一种抗人EGFR嵌合抗体的制备方法,所述方法包括以下步骤:
在适合表达所述嵌合抗体的条件下,培养所述的生物工程菌,从而表达出所述的嵌合抗 体,纯化分离出所述的嵌合抗体。
本发明中所用的宿主细胞均为现有技术,可通过商业途径直接获取,培养中所用的培养 基亦为各种常规培养基,本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基,在适于宿主细胞生 长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化 学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、 或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过 各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例 子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超 处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和 其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的第七方面提供了上述抗人EGFR嵌合抗体在制备治疗肿瘤药物中的用途。
于一实施例中,所述肿瘤包括但不限于头颈癌、人皮肤鳞状上皮癌和人乳腺癌。
本发明的第八方面提供了一种治疗肿瘤的药物,所述药物的有效成份为上述抗人EGFR 嵌合抗体。
于一实施例中,所述肿瘤包括但不限于头颈癌、人皮肤鳞状上皮癌和人乳腺癌。
所述治疗肿瘤的药物,挥前述功用的有效成分可以仅仅包含嵌合抗体,也可以可包含其 他可起到类似功用的分子。
亦即,所述嵌合抗体为所述治疗肿瘤的药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述治疗肿瘤的药物可以为单成分物质,亦可为多成分物质。
所述治疗肿瘤的药物的形式无特殊限制,可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各 种物质形式。
所述治疗肿瘤的药物主要针对的对象为哺乳动物,如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第九方面提供了一种治疗肿瘤的药物组合物,所述药物组合物包括治疗有效量 的上述抗人EGFR嵌合抗体,和至少一种其他肿瘤治疗药物。
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种:
一)将所述嵌合抗体和其他治疗肿瘤药物分别制成独立的制剂,制剂的剂型可相同或不 同,给药途径亦可相同或不同。
当其他治疗肿瘤药物为抗体时,一般采用胃肠外给药型。当其他治疗肿瘤药物为化学药 物时,给药形式可以比较丰富,可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各 化学药物的已知给药途径给药。
二)将所述嵌合抗体和其他治疗肿瘤药物配置成复方制剂,在所述嵌合抗体和其他治疗 肿瘤药物采用相同给药途径给药并同时施加时,可采用将两者配置成复方制剂的形式。
于一实施例中,所述肿瘤包括但不限于头颈癌、人皮肤鳞状上皮癌和人乳腺癌。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定 的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案, 而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指 出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以 及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术 语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外, 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例 中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常 规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关 领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates;theseries METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS INENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
实施例1构建7种抗人EGFR嵌合抗体真核表达载体及表达纯化
1.1 PCR扩增目的基因
基因合成原始抗体的可变区重链轻链及3条新的重链序列和2条新的轻链序列(上海生 工生物公司)。
CET01序列
轻链可变区(SEQ ID NO.1):
DISLTQSPTFQSVTPKEKVESSCRASQSIGTNIHWYQQLVNFSPKLLIKYASESI SGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKR TV
其中,CDR1为QSIGTN(SEQ ID NO.15);CDR2为YAS(SEQ ID NO.16);CDR3 为QQNNNWP(SEQ ID NO.17)。
重链可变区(SEQ ID NO.2):
QVQLTQSGPGLVSPSQTLSYTCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIW SGGNTDYNTPFTSRLTISKDTSKNQVSLKDWSVTSNDTAVYYCARALTYYDY EFAYWGQGTLVTVSA
其中,CDR1为GFSLTNYG(SEQ ID NO.18);CDR2为IWSGGNT(SEQ ID NO.19);CDR3为AR(SEQ ID NO.20)。
CET02序列
轻链可变区(SEQ ID NO.3):
DISLTQSPTFQSVTPKEKVESSCRASQSIGTNIHWYQQLVNFSPKLLIKYASESI SGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKR TV
其中,CDR1为QSIGTN(SEQ ID NO.21);CDR2为YAS(SEQ ID NO.22);CDR3 为QQNNNWP(SEQ ID NO.23)。
重链可变区(SEQ ID NO.4):
QVQLTQSGPGLVKPSQTLSYTCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVI WSGGNTDYNTPFTSRLGISVDTSKNQVSLKDWSVTSNDTAVYYCARALTYY DYEFAYWGQGTLVTVSA
其中,CDR1为GFSLTNYG(SEQ ID NO.24);CDR2为IWS(SEQ ID NO.25);CDR3 为AR(SEQ ID NO.26)。
CET03序列
轻链可变区(SEQ ID NO.5):
DISLTQSPTFQSVTPKEKVESSCRASQSIGTNIHWYQQLVNFSPKLLIKYASESI SGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKR TV
其中,CDR1为QSIGTN(SEQ ID NO.27);CDR2为YAS(SEQ ID NO.28);CDR3 为QQNNNWP(SEQ ID NO.29)。
重链可变区(SEQ ID NO.6):
QVQLTQSGPGLVKPSETLSQTCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIW SGGNTDYNTPFTSRLTISVDTSKNQVSLKLSSVTSNDTAVYYCARALTYYDYE FAYWGQGTLVTVSA
其中,CDR1为GFSLTNYG(SEQ ID NO.30);CDR2为IWS(SEQ ID NO.31);CDR3 为AR(SEQ ID NO.32)。
CET04序列
轻链可变区(SEQ ID NO.7):
DISLTQSPVFLSVTPGEKVESECRASQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASESI SGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKR TV
其中,CDR1为QSIGTN(SEQ ID NO.33);CDR2为YAS(SEQ ID NO.34);CDR3 为QQNNNWP(SEQ ID NO.35)。
重链可变区(SEQ ID NO.8):
QVQLTQSGPGLVSPSQTLSYTCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIW SGGNTDYNTPFTSRLTISKDTSKNQVSLKDWSVTSNDTAVYYCARALTYYDY EFAYWGQGTLVTVSA
其中,CDR1为GFSLTNYG(SEQ ID NO.36);CDR2为IWS(SEQ ID NO.37);CDR3 为AR(SEQ ID NO.38)。
CET05序列
轻链可变区(SEQ ID NO.9):
DISLTQSPVFLSVTPGEKVESECRASQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASESI SGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKR TV
其中,CDR1为QSIGTN(SEQ ID NO.39);CDR2为YAS(SEQ ID NO.40);CDR3 为QQNNNWP(SEQ ID NO.41)。
重链可变区(SEQ ID NO.10):
QVQLTQSGPGLVKPSQTLSYTCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVI WSGGNTDYNTPFTSRLGISVDTSKNQVSLKDWSVTSNDTAVYYCARALTYY DYEFAYWGQGTLVTVSA
其中,CDR1为GFSLTNYG(SEQ ID NO.42);CDR2为IWS(SEQ ID NO.43);CDR3 为AR(SEQ ID NO.44)。
CET06序列
轻链可变区(SEQ ID NO.11):
DISLTQSPVFLSVTPGEKVESECRASQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASESI SGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKR TV
其中,CDR1为QSIGTN(SEQ ID NO.45);CDR2为YAS(SEQ ID NO.46);CDR3 为QQNNNWP(SEQ ID NO.47)。
重链可变区(SEQ ID NO.12):
QVQLTQSGPGLVKPSETLSQTCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIW SGGNTDYNTPFTSRLTISVDTSKNQVSLKLSSVTSNDTAVYYCARALTYYDYE FAYWGQGTLVTVSA
其中,CDR1为GFSLTNYG(SEQ ID NO.48);CDR2为IWS(SEQ ID NO.49);CDR3 为AR(SEQ ID NO.50)。
CET07序列
轻链可变区(SEQ ID NO.13):
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESIS GIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRT V
重链可变区(SEQ ID NO.14):
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIW SGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDY EFAYWGQGTLVTVSA
设计各自引物,分别以合成的序列为模板,利用KOD酶进行PCR扩增。反应体系和程序如下:
表1反应体系
试剂 | 体积(ul) |
KOD酶 | 1 |
MgSO4 | 3 |
dNTP | 5 |
10xbuffer | 5 |
上游引物 | 1 |
下游引物 | 1 |
模板 | 1 |
ddH2O | 33 |
Total | 50 |
表2反应程序
1.2构建表达载体
检测PCR产物,配制1%浓度的琼脂糖胶,点样2ul,120V电压,20min。再按照试剂盒说明书操作,快速纯化PCR产物。利用BglII内切酶线性化载体pvitro-hygro-mcs质粒,按照试剂盒HD Cloning Kit(takara)操作手册利用同源重组的原理,将轻链插入载体 的BglII内切酶位点,菌落PCR检测。测序正确后按照同样的方法,用BamH1内切酶线性化已构建入轻链的载体pvitro-hygro-mcs,如上所述将重链也插入载体中,测序正确后即可转染 细胞进行表达。
1.3转染宿主细胞和培养
宿主细胞选用293F细胞,转染方法选用PEI法。以优化后的转染条件操作,以六孔板为 例(其他培养皿按照培养基体积/面积等比例换算),具体步骤如下:
1)转染前1天或前2天分别稀释细胞至5x105个/ml(24h前)或2.5x105个/ml(48h前);
2)转染当天将opti-MEM预热至25℃—37℃,以溶解DNA和PEI;
3)台盼蓝染色后细胞计数,调整细胞密度在0.8—1.2x106个/ml,活力>95%;
4)取1.8ml细胞悬液至6孔板中,置于培养箱暂存;
5)取一支1.5ml无菌EP管,加200ul预热的opti-MEM,加入3ug质粒,轻轻混匀后,再加入9ul 1mg/ml的PEI溶液,立即轻弹混匀(此时按照1∶3条件转染);
6)室温静置15min;
7)从培养箱中取出6孔板,加入DNA-PEI混合物,混匀后放置培养箱;
8)在转染后24h-48h,收集上清,WB检测表达。
9)一周后收集上清,准备纯化。
1.4目的产物纯化
proG纯化培养基上清的方法:
1)样品的准备:为了确保结合时合适的离子强度和PH,培养基上清需要至少1:1的用 结合buffer稀释,或者使用结合buffer透析过夜。
2)柱子的准备:轻轻地颠倒几次proG的瓶子,混合悬浮液直到树脂完全悬浮起来。吸 取1ml proG柱料至预先加有1ml bingding buffer的柱子中,待柱料沉淀下来,原有的Binding buffer排走后,再用5ml体积的binding buffer平衡柱子。
3)抗体纯化:将样品轻轻地加入柱料中,维持1ml/min的流速,再用30ml bindingbuffer 洗涤柱子。
4)用10~15ml的elution buffer洗脱抗体,立即用1M的tris-HCl中和抗体至pH8.5~7.4。
5)再生柱子:先用10ml elution buffer洗柱子,再用5ml的binding buffer平衡柱子,柱 子可以反复再生10次,结合能力不会下降太多。
6)柱料保存:保存proG柱料于含有20%乙醇的binding buffer中,置于2~8度,勿冻 存。其中Binding/wash buffer:NaCl 0.15M,Na2HPO4 20mM,pH 7.4;Elution buffer:Citric acid 0.1M,pH 2.5-3.0。
取10ul 4x loading buffer加入到30ul收集的抗体溶液中,涡旋后99℃煮样10min,配 制10%的SDS-PAGE胶,每孔加20ul样品,80v跑胶30min后,120v跑胶60min。考马斯 亮蓝染色脱色后检测抗体纯度,统计结果如表3。
表3 20ml培养基上清抗体产量统计
实验结果如图1a-1h所示。实验结果表明:CET04和CET05表达量显著高于其他抗体的 表达量。
实施例2流式细胞术检测抗体的结合试验
为了检测表达抗体与抗原的结合能力,选用靶细胞为人乳腺癌细胞系MAD-MB-231, (ATCC HTB-26)其表面高表达EGFR分子。具体方法如下:
常规方法培养MAD-MB-231细胞至生长期,保证细胞状态良好。弃掉细胞培养基上清, PBS漂洗一遍,加1ml 2.5%胰酶溶液,置于37度细胞培养箱消化3-5min,加5ml细胞完全 培养基终止消化,轻柔吹打细胞后转移至15ml离心管。500g离心5min后,弃上清。再用含1%BSA的PBS溶液重悬细胞,计数后分别将细胞分到8个流式管中,每管细胞量为2x105。 再500g离心5min中弃上清,将这8管细胞分别用7种抗体的293F细胞表达上清及阴性对照 单纯培养基上清重悬,体积大约为200ul,大约含20ug抗体。冰上避光孵育15min。然后加 1ml预冷的PBS稀释后,离心弃上清。余大约50ul溶液,加2.5ulFITC标记的驴抗人IgG孵 育20min,4度避光。再加1mlPBS重悬,漂洗一遍,离心后弃上清。最后加200ulPBS重悬 后,做流式检测。
实验结果如图2a-2b所示。结果表明各个抗体与细胞的结合能力依次为:CET04>CET05> CET02>CET06>CET01>CET03>CET07。
实施例3抗EGFR抗体抑制细胞增殖能力MTS检测试验
MTS是一种旨在通过四氮唑和电子偶联化合物在代谢旺盛细胞中的脱氢酶的作用下,产 生水溶性蓝紫色甲簪产物,作为检测信号来比色定量测定活体细胞繁殖的权威而经典的技术 方法。作为细胞染色剂之一的四氮唑和电子偶联化合物染料可以自由地进入活细胞中。细胞 繁殖快,其代谢旺盛,脱氢酶的活性增强,从而还原细胞浆中的染料为无毒性、水溶性、蓝 紫色产物而留存在细胞内,在490-500nm波长下产生吸收峰:吸收值与细胞量成线性正相关。 利细胞膜表面高表达EGFR分子的人皮肤鳞状上皮癌细胞系A431(ATCCCRL-1555)
1)收集对数生长期细胞,调整至1X105个/ml,每孔100ul铺孔于96孔板每孔补加100ul完全培养基,培养过夜。
2)待细胞达80%的汇合度,每组抗体有两个工作浓度,每个样品设置3个复孔,加入抗体孵育24h后,加MTS。
3)继续培养4h后,离心(可用1500rpm,5min)后吸掉上清,每孔加100ul DMSO (分析级纯度即可),板子置于水平摇床低速震荡10min,待孔内紫色甲瓒充分溶解,用酶标 仪测490nm下的OD值。
实验结果如图3所示,结果显示,当抗体浓度为250ng/ml时,抗体抑制细胞增殖能力 CET05>CET02>CET04>CET06>CET01>CET03>CET07;当抗体浓度为125ng/ml时,抗体 抑制细胞增殖能力CET04>CET05>CET02>CET01>CET06>CET03>CET07。
实施例4基于MAD-MB-231细胞结合EGFR抗体特性检测EC50试验
取指数生长期的MAD-MB-231细胞,用胰蛋白酶消化收集离心处理后,加培养液调整细 胞密度至3.0X 105个/ml,按照100μl/孔,加入96孔培养板中,37℃,5%CO2孵箱 中培养过夜;弃培养基上清,每孔加100μl 0.25%戊二醛,固定20min;PBS漂洗3次,每 孔加入200μl 5%脱脂奶粉,37℃封闭2h;PBS洗涤4次;将抗体样品用稀释液稀释至3.3 μg/ml,再在96孔板中进行逐级稀释,共10个稀释度,100μl/孔,每个样品稀释度至少作 双复孔,37℃孵育1h;PBS洗涤4次,加入HRP标记的羊抗人IgG(1∶5 000稀释),100 μl/孔,37℃反应1h;PBS洗涤4次,加入底物显色液,100μl/孔,37℃显色15min;加 入2mol/L H2SO4,50μl/孔,终止反应,于波长450/620nm处测定吸光度值。采用SoftMax Pro V5.2软件,选择4-Parameter绘制曲线,以样品浓度为横坐标,A450/620为纵坐标, 并计算EC50值。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案,并不能理解为对本发明的限制。此外, 本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化,在不脱离本发明的范围和精神的前 提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对 本发明进行了具体的描述,但应当理解,本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上,各种 如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围 内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 抗人EGFR嵌合抗体及其制备方法和用途
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Ser Leu Thr Gln Ser Pro Thr Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Glu Ser Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Val Asn Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Thr Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ser Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Tyr Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Asp Trp Ser Val Thr Ser Asn Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 3
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ile Ser Leu Thr Gln Ser Pro Thr Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Glu Ser Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Val Asn Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Thr Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Tyr Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Gly Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Asp Trp Ser Val Thr Ser Asn Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 5
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Ser Leu Thr Gln Ser Pro Thr Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Glu Ser Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Val Asn Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Thr Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Gln Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ser Asn Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 7
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asp Ile Ser Leu Thr Gln Ser Pro Val Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Glu Ser Glu Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Thr Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ser Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Tyr Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Asp Trp Ser Val Thr Ser Asn Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 9
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Ile Ser Leu Thr Gln Ser Pro Val Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Glu Ser Glu Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 10
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Thr Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Tyr Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Gly Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Asp Trp Ser Val Thr Ser Asn Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 11
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Ile Ser Leu Thr Gln Ser Pro Val Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Glu Ser Glu Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Thr Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Gln Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ser Asn Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 13
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 14
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Ser Ile Gly Thr Asn
1 5
<210> 16
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Tyr Ala Ser
1
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr
1 5
<210> 20
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ala Arg
1
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gln Ser Ile Gly Thr Asn
1 5
<210> 22
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Tyr Ala Ser
1
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 25
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Ile Trp Ser
1
<210> 26
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Ala Arg
1
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Gln Ser Ile Gly Thr Asn
1 5
<210> 28
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Tyr Ala Ser
1
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 31
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Ile Trp Ser
1
<210> 32
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Ala Arg
1
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Gln Ser Ile Gly Thr Asn
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<210> 34
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Tyr Ala Ser
1
<210> 35
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Ile Trp Ser
1
<210> 38
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Ala Arg
1
<210> 39
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Gln Ser Ile Gly Thr Asn
1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Tyr Ala Ser
1
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Ile Trp Ser
1
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<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Ala Arg
1
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Gln Ser Ile Gly Thr Asn
1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Tyr Ala Ser
1
<210> 47
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro
1 5
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly
1 5
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<212> PRT
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<400> 49
Ile Trp Ser
1
<210> 50
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Ala Arg
1
Claims (11)
1.一种抗人EGFR嵌合抗体,所述嵌合抗体包括重链可变区和轻链可变区,所述轻链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.15-17、SEQ ID NO.21-23、SEQ ID NO.27-29、SEQ IDNO.33-35、SEQ ID NO.39-41、SEQ ID NO.45-47中的任意一条、两条或者三条,所述重链可变区的互补决定区选自:SEQ ID NO.18-20、SEQ ID NO.24-26、SEQ ID NO.30-32、SEQ IDNO.36-38、SEQ ID NO.42-44或SEQ ID NO.48-50中的任意一条、两条或者三条。
2.一种抗人EGFR嵌合抗体,其特征在于:所述嵌合抗体选自CET01、CET02、CET03、CET04、CET05或CET06中的任意一种,其中,
CET01的重链可变区如SEQ ID NO.1所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQ IDNO.2所示或其保守型变异序列;
CET02的重链可变区如SEQ ID NO.3所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQ IDNO.4所示或其保守型变异序列;
CET03的重链可变区如SEQ ID NO.5所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQ IDNO.6所示或其保守型变异序列;
CET04的重链可变区如SEQ ID NO.7所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQ IDNO.8所示或其保守型变异序列;
CET05的重链可变区如SEQ ID NO.9所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQ IDNO.10所示或其保守型变异序列;
CET06的重链可变区如SEQ ID NO.11所示或其保守型变异序列,轻链可变区如SEQ IDNO.12所示或其保守型变异序列。
3.根据权利要求1所述的抗人EGFR嵌合抗体,其特征在于:所述抗人EGFR嵌合抗体为每个抗体的可变区片段与人Ig恒定区形成的嵌合抗体。
4.一种多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸编码如权利要求2中每个抗体重链和/或轻链可变区或全长。
5.一种重组表达载体,其特征在于:所述重组表达载体内含有如权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种生物工程菌,其特征在于:所述生物工程菌内含有如权利要求5所述的重组表达载体或其基因组内整合有如权利要求3所述的多核苷酸。
7.如权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述的重组表达载体或如权利要求6所述的生物工程菌在制备针对人EGFR嵌合抗体中的用途。
8.一种抗人EGFR嵌合抗体的制备方法,所述方法包括以下步骤:
在适合表达所述嵌合抗体的条件下,培养所述的生物工程菌,从而表达出所述的嵌合抗体,纯化分离出所述的嵌合抗体。
9.如权利要求1-3任意一项所述抗人EGFR嵌合抗体在制备治疗肿瘤药物中的用途。
10.一种肿瘤治疗药物,其特征在于:所述药物的有效成份为如权利要1-3任意一项所述抗人EGFR嵌合抗体。
11.一种治疗肿瘤的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包括治疗有效量的如权利要求1-3任意一项所述抗人EGFR嵌合抗体,和至少一种其他肿瘤治疗药物。
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- 2019-07-25 CN CN201910677505.4A patent/CN112300278A/zh active Pending
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